DE69631996T2

DE69631996T2 - Verfahren zur Herstellung von acylierten Proteinpuder

Info

Publication number: DE69631996T2
Application number: DE69631996T
Authority: DE
Inventors: Jeffrey Clayton Indianapolis Baker; Brian A. Indianapolis Moser; Warren E. Indianapolis Schrader
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-05-31
Publication date: 2005-01-27
Anticipated expiration: 2016-06-01
Also published as: HUP9900877A2; NO975583L; AU5951396A; JPH11506738A; KR19990022590A; MX9709657A; TR199701528T1; US5700904A; CA2223389A1; AU703032B2; BR9608729A; ATE263185T1; ES2216039T3; IL122460A0; EP0747391B1; CZ388197A3; EA199800042A1; WO1996040730A1; JP3844504B2; DE69631996D1

Description

1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung eines acylierten Proteins als Pulver, insbesondere solche, die einer Gewinnung durch Fällung oder Kristallisation und anschließenden Filtration aus wässrigen Lösungen nicht zugänglich sind und speziell bestimmte acylierte Proinsuline, acylierte Insuline oder acylierte Insulinanalog. Genauer gesagt betrifft die Erfindung die Herstellung eines frei fließenden Pulvers aus bestimmten acylierten Proinsulinen, Insulinen und Insulinanaloga aus ihren wässrigen Lösungen.
2. Beschreibung des Stands der Technik
Es war lange ein Ziel der Insulintherapie, das Muster von endogener Insulinsekretion von normalen Individuen nachzuahmen. Der tägliche physiologische Bedarf für Insulin fluktuiert und kann in zwei Phasen unterteilt werden: (a) Die absorptive Phase, die einen Insulinpuls erfordert, um die Mahlzeitbedingte Blutglucosebelastung abzubauen und (b) die postabsorptive Phase, die eine anhaltende Menge an Insulin erfordert, um den Glucoseausstoß aus der Leber zu regulieren, um eine optimale Blutglucosemenge während den nüchternen Perioden aufrechtzuerhalten. Demnach umfasst eine wirksame Therapie im allgemeinen die kombinierte Verwendung von zwei exogenen Insulinen: Ein schnell wirkendes Mahlzeitinsulin, das durch Bolusinjektionen bereitgestellt wird, und ein langwirksames basales Insulin, das durch eine Injektion ein- oder zweimal am Tag verabreicht wird.
Kürzlich zeigte eine Klasse an acylierten Insulinen vielversprechende Ansätze zur Verwendung als langwirksame Insulinbasaltherapie. Diese acylierten Insuline werden durch selektive Acylierung der freien Aminogruppen von monomerem Insulin, einschließlich Proinsulin, normalem Insulin und bestimmten Insulinanaloga mit einem aktivierten Fettsäurederivat hergestellt. Brauchbare Fettsäurederivate umfassen reaktive Verbindungen vom Fettsäuretyp, die mindestens eine sechs (6) Kohlenstoffatome lange Kette aufweisen und insbesondere die Fettsäurederivate, die 8 bis 21 Kohlenstoffatome in ihrer Kette aufweisen. Monoacyliertes normales Humaninsulin, das mit einem Palmitinsäurederivat acyliert ist, ist ein besonders vielversprechender Kandidat. Insuline, die in diese Kategorie fallen, sind in JP 1-254 699 A beschrieben.
Wie es vom Fachmann gut verstanden wird, sind Wege zur Gewinnung eines Proteins in einer festen Form, vorzugsweise als frei fließendes Pulver bei vielen Anwendungen vorteilhaft, falls nicht sogar essentiell. Die Herstellung eines Proteins als Pulver maximiert beispielsweise die Lagerungs- und Auslieferungsoptionen. Dies trifft insbesondere in Zusammenhang mit Zusammensetzungen zu, die für die Insulintherapie bestimmt sind, wo große Volumina an Produkt hergestellt werden müssen, um den Bedarf zu befriedigen. Glücklicherweise wurde schon lange vorher gefunden, dass normales Insulin, einschließlich Rinderinsulin, Schweineinsulin und Humaninsulin als Pulver durch Fällung oder genauer gesagt Kristallisation des Insulins aus relativ verdünnten wässrigen Insulinlösungen als Zinkkomplex oder als Natriumkristalle gewonnen werden können. Im allgemeinen wird das sogenannte Zinkinsulin aus einer gepufferten wässrigen Lösung kristallisiert, die Zinkionen enthält und kann leicht durch Filtration isoliert werden.
Unglücklicherweise waren Versuche zur Gewinnung von Insulinen durch Filtration, die mit langkettigen Fettsäurederivaten acyliert sind, nicht so erfolgreich. Tatsächlich waren die bekannten Versuche zur Kristallisation der Fettsäure-acylierten Insuline gleichermaßen erfolglos. Es wurde postuliert, dass der hydrophobe Charakter des langkettigen Fettsäurerests auf solchen Insulinmonomeren zu dieser Schwierigkeit beiträgt, indem er unter anderem die Protein-Protein-Wechselwirkungen stört, die für eine zufriedenstellende Kristallbildung erforderlich sind. Daher müssen andere Wege gefunden werden, um diese acylierten Insuline in einer festen, pulverisierten Form herzustellen.
Ein technisch machbarer Ansatz zur Herstellung eines acylierten Proteins, wie eines acylierten Insulins, in einer pulverisierten Form ist es, eine wässrige Lösung des Proteins zu lyophilisieren. Während pulverisierte Präparationen von Fettsäure-acylierten Insulinen auf diese Weise hergestellt werden können, sind die Lyophilisierungstechniken nicht gut auf die Herstellung von großen mengen an im Handel erforderlichem Insulin angepasst. Probleme der Arbeitssicherheit und der Produkthandhabung sind insbesondere für großvolumige Lyophilisierungsverfahren problematisch.
Eine weitere potentielle Strategie umfasst die isoelektrische Fällung. Von Proteinen in einer wässrigen Lösung ist seit langem bekannt, dass sie weniger löslich werden, wenn der pH der Umgebung nahe dem isoelektrischen Punkt des Proteins eingestellt wird. Dieses allgemeine Phänomen wurde lange bei der Proteinreinigung und den Isolierungsverfahren ausgenutzt. Einmal unlöslich gemacht können solche Proteine oft aus der entstehenden wässrigen Suspension durch einfaches Schwerkraftabsetzen oder durch Vakuum-gestützte und Druck-gestützte Filtration gewonnen werden.
Unglücklicherweise bildeten die vorliegenden Versuche zur Gewinnung von Fettsäure-acylierten Insulinen durch einfache Einstellung des pH einer wässrigen Lösung des acylierten Proteins nahe an dessen isoelektrischen Punkt emulsionsartige Zusammensetzungen, die einer leichten fest-flüssig Trennung widerstehen, wie durch Schwerkraftabsetzen oder durch Vakuum-gestützte und Druck-gestützte Filtration. Als Ergebnis musste ein neuer Ansatz zur Gewinnung einer solchen acylierten Insulinspezies in Pulverform gefunden werden.
Die vorliegende Erfindung liefert ein einfaches Verfahren zur Gewinnung von acylierten Proteinen durch Fällung und Filtration als frei fließendes Pulver und speziell bestimmter Fettsäure-acylierter Insuline, die einer solchen Isolierung und Gewinnung durch Fällung und Filtration widerstehen.
Die vorliegende Erfindung liefert daher ein Verfahren zur Gewinnung von Fettsäure-acylierten Insulinen als frei fließendes Pulver aus wässrigen Lösungen. Insbesondere liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung eines pulverisierten, Fettsäure-acylierten Insulins, das bequem an relativ große Produktionstechniken angepasst werden kann. Die vorliegende Erfindung betrifft auch das pulverisierte Protein, das durch dieses Verfahren hergestellt werden kann.
Beschreibung der Erfindung
Alle Aminosäureabkürzungen, die in dieser Beschreibung verwendet werden, sind die, welche vom United States Patent and Trademark Office akzeptiert sind, wie dies in 37 C.F.R. § 1.822 (B)(2) beschrieben ist.
Die Ausdrücke "Insulin" und "normales Insulin", wie sie hierin verwendet werden, meinen humanes Insulin, Schweineinsulin oder Rinderinsulin. Insulin besitzt drei freie Aminogruppen: B¹-Phenylalanin, A¹-Glycin und B²⁹-Lysin. Die freien Aminogruppen an den Positionen A¹ und B¹ sind α-Aminogruppen. Die freie Aminogruppe an der Position B²⁹ ist eine ε-Aminogruppe.
Der Ausdruck "Proinsulin", wie er hierin verwendet wird, ist ein korrekt quervernetztes Protein der Formel: B-C-A worin

A für die A Kette von Insulin oder ein funktionelles Derivat hiervon steht,
B für die B Kette von Insulin oder einem funktionellen Derivat hiervon mit einer ε-Aminogruppe steht, und
C das Verbindungspeptid von Proinsulin ist. Vorzugsweise besteht Proinsulin aus der A Kette von Humaninsulin, der B Kette von Humaninsulin und C steht für das neutrale Verbindungspeptid. Wenn Proinsulin die natürliche Sequenz aufweist, besitzt Proinsulin 3 freie Aminogruppen: Phenylalanin (1) (α-Aminogruppe), Lysin (29) (ε-Aminogruppe) und Lysin (64) (ε-Aminogruppe).

Der Ausdruck "Insulinanalogon" steht, wie er hierin verwendet wird, für ein korrekt quervernetztes Protein der folgenden Formel, das eine Insulinaktivität aufweist: A-B worin

A für die A Kette von Insulin oder ein funktionelles Derivat der A Kette von Insulin steht und
B für die B Kette von Insulin oder ein funktionelles Derivat der B Kette von Insulin mit einer ε-Aminogruppe steht und zumindest eines von A oder B eine Aminosäuremodifikation im Vergleich zur natürlichen Sequenz aufweist.

Bevorzugte Insulinanaloga umfassen Insulin, worin:

der Aminsäurerest an der Position B²⁸ für Asp, Lys, Leu, Val oder Ala steht,
der Aminosäurerest an der Position B²⁹ für Lys oder Pro steht,
der Aminosäurerest an der Position B¹⁰ für His oder Asp steht,
der Aminosäurerest an der Position B¹ für Phe oder Asp steht oder alleine oder in Kombination mit einer Deletion des Rests an der Position B² deletiert ist,
der Aminosäurerest an der Position B³⁰ für Thr oder Ala steht oder deletiert ist, und
der Aminosäurerest an der Position B⁹ für Ser oder Asp steht, mit der Maßgabe, dass entweder die Position B²⁸ oder B²⁹ für Lys steht.

In biologischen Standardausdrücken, die dem Fachmann bekannt sind, sind die bevorzugten Insulinanaloga Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin (B²⁸ steht für Lys, B²⁹ steht für Pro), Asp^B28-Humaninsulin (B²⁸ steht für Asp), Asp^B1-Humaninsulin, Arg^B31,B32-Humaninsulin, Asp^B10-Humaninsulin, Arg^A0-Humaninsulin, Asp^B1,Glu^B13-Humaninsulin, Ala^B26-Humaninsulin und Gly^A21-Humaninsulin.
Der Ausdruck "Acylierung" meint die Einführung einer oder mehrerer Acylgruppen, die an freie Aminogruppen des Proteins kovalent gebunden sind.
Der Ausdruck "Fettsäure" meint eine gesättigte oder ungesättigte C₆–C₂₁ Fettsäure. Der Ausdruck "aktivierter Fettsäureester" meint eine Fettsäure, die mittels der allgemeinen Techniken aktiviert wurde, die in Methods of Enzymology, 25, 494–499 (1972) und Lapidot et al., in J. of Lipid Res. 8: 142–145 (1967) beschrieben wurden, wobei die Beschreibung hiervon hiermit eingeführt ist. Die bevorzugten Fettsäuren sind gesättigt und umfassen Myristinsäure (C14), Pentadecylsäure (C15), Palmitinsäure (C16), Heptadecylsäure (C17) und Stearinsäure (C18). Am bevorzugtesten ist die Fettsäure Palmitinsäure. Aktivierte Fettsäureester umfassen Derivate von Mitteln, wie Hydroxybenzotriazid (HOBT), N-Hydroxysuccinimid und Derivate hiervon. Der bevorzugte aktivierte Ester ist N-Succinimidylpalmitat.
Der Ausdruck "Vernetzung" bezieht sich auf die Bildung von Disulfidbrücken zwischen den Cysteinresten. Ein korrekt vernetztes Proinsulin, Insulin oder Insulinanalogon enthält 3 Disulfidbrücken. Die erste Disulfidbrücke wird zwischen den Cysteinresten an den Positionen 6 und 11 der A-Kette gebildet. Eine zweite Disulfidbrücke verbindet den Cysteinrest an der Position 7 der A-Kette mit dem Cystein an der Position 7 der B-Kette. Die dritte Disulfidbrücke verbindet das Cystein an der Position 20 der A-Kette mit dem Cystein an der Position 19 der B-Kette.
Der Ausdruck "Fällung" bezieht sich auf ein Verfahren, worin leicht filtrierbare Partikel in einer Flüssigkeit gebildet werden und das sich von einer einfachen Veränderung der Löslichkeit eines Soluts in Lösung unterscheidet, die zur Bildung von stabilen Suspensionen und/oder emulsionsartigen Zweiphasengemischen führt. Die filtrierbaren Partikel selbst werden als "Niederschlag" bezeichnet.
Der Ausdruck "leicht filtrierbar" und andere ähnliche Ausdrücke beziehen sich auf einen Zustand, in dem die Partikel eines fest-flüssigen Gemisches oder einer Aufschlämmung durch ein Verfahren der "dead-end" Filtration und verwandten Techniken zu einem handhabbaren Filterkuchen isoliert werden können, das heißt einem Material mit einem restlichen Feuchtigkeitsgehalt, der mit der Handhabung des Kuchens als Feststoff anstelle einer Aufschlämmung nicht stört. Bei der "dead-end" Filtration wird die Aufschlämmung geliefert und die Filtratflüssigkeit läuft im wesentlichen senkrecht zur Ebene des Filters und dies steht im Gegensatz zur "Querstrom" oder "Tangentialstrom"-Filtration, worin der Hauptflüssigkeitsstrom parallel zur Oberfläche des Filtermediums läuft. Bedeutsamerweise liefert das Verfahren der vorliegenden Erfindung eine Aufschlämmung eines acylierten Proteins, das durch "dead-end" Filtration und verwandte Techniken mit einer durchschnittlichen oder mittleren Filtrationsgeschwindigkeit isoliert werden kann, die 5 l/m²/h (LMH) übersteigt und oft mit einer durchschnittlichen oder mittleren Filtrationsgeschwindigkeit von mehr als 20 LMH, wobei der Endpunkt der Filtration normalerweise der Punkt ist, wenn der Kuchen als Feststoff gewonnen werden kann. Solche Filtrationsgeschwindigkeiten sind für die Produktionskosten in einem kommerziellen Produktionsmaßstab entscheidend.
Der Ausdruck "wässrig" umfasst Colösemittelsysteme wie auch die Verwendung von ausschließlich Wasser als Lösemittel.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung eines acylierten Proteins als Pulver aus einem wässrigem Gemisch, speziell den acylierten Proteinen, die einer Isolierung und Gewinnung durch isoelektrische Fällung aus einer wässrigen Lösung des acylierten Proteins widerstehen. Das Vertahren umfasst die Einstellung einer wässrigen Lösung des acylierten Proteins auf einen pH, der das Protein in Lösung unlöslich werden lässt und die Zugabe von ausreichend Alkohol zum wässrigen Gemisch des Proteins, um eine Fällung des Proteins in Form von leicht filtrierbaren Partikeln bei diesem pH zu verursachen.
Proinsuin, Insulin und Insulinanaloga, die zur Herstellung der acylierten Proteine verwendet werden, welche der Hauptfokus der vorliegenden Erfindung sind, können durch eine Vielzahl an bekannten Peptidsynthesetechniken hergestellt werden, einschließlich klassischer Verfahren (in Lösung), Festphasenverfahren, semisynthetischer Verfahren und neuerer rekombinanter DNA Verfahren. Beispielsweise beschreiben Chance et al. US Anmeldung 07/388 201, EP 0 383 472 A , Brange et al., EP 0 214 826 A und Belagaje et al US 5 304 473 A die Herstellung verschiedener Proinsulin- und Insulinanaloga und sind hiermit eingeführt. Die A und B Ketten der erfindungsgemäßen Insulinanaloga können auch über ein Proinsulin-ähnliches Vorläufermolekül mittels rekombinanter DNA Techniken hergestellt werden. Siehe Frank et al., Peptides: Synthesis-Structure-Funktion, Proc. Seventh Am. Pept. Symp., Herausgeber D. Rich und E. Gross (1981), das hiermit eingeführt ist.
Im allgemeinen werden das Proinsulin, das Insulin und die Insulinanaloga durch die Umsetzung mit einem aktivierten Fettsäurederivat acyliert, wie einem aktivierten Fettsäureester. Die Acylierung von normalem Insulin mit Fettsäure wird in JP 1–254 699 beschrieben. Siehe auch Hashimoto et al., Pharmaceutical Research, 6: 171–176 (1989). Diese Beschreibungen sind hiermit eingeführt.
Vorzugsweise wird die Acylierung unter basischen Bedingungen in einem polaren Lösemittel ausgeführt, das heißt bei einem pH von mehr als 9,0 und vorzugsweise etwa 10,5. Während die Umsetzung in einem vollkommen organischen polaren Lösemittel unter Verwendung einer Base mit einem wässrigen pKa von größer oder gleich 10,75 ausgeführt werden kann, wird ein gemischtes organisches und wässriges Lösemittel als Reaktionsmedium bevorzugt. Bevorzugte Basen sind Tetramethylguanidin, Diisopropylethylamin oder Tetrabutylammoniumhydroxid. Ein besonders geeignetes Lösemittel ist Acetonitril und Wasser, das etwa 50 % Acetonitril enthält. Andere polare Lösemittel umfassen Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid und dergleichen. Colösemittelsysteme umfassen auch Aceton und Wasser, Isopropylalkohol und Wasser und Ethanol und Wasser. Die Zeit- und Temperaturbedingungen, die zur Ausführung der Reaktionen geeignet sind, sind nicht eng begrenzt. Eine Temperatur von 0 bis 40°C und eine Umsetzungszeit von 15 Minuten bis 24 Stunden sollten im allgemeinen geeignet sein. Eine besonders bevorzugte Art zur Herstellung von solchen Fettsäure-acylierten Insulinen ist in der anhängigen US 08/341231 vom 17. November 1994 beschrieben, deren Beschreibung hiermit eingeführt ist.
Wenn die Umsetzung vollständig ist, wird das das acylierte Protein enthaltende Reaktionsgemisch typischerweise mit Wasser verdünnt und es wird eine Säure zugegeben, um die Alkalinität zu neutralisieren. Die Säure wird als wässrige Lösung zum acylierten Protein gegeben und dient zur Verringerung des pH der Lösung unter den isoelektrischen Punkt des Proteins. Normalerweise liegt das Protein zu diesem Zeitpunkt in einer geeignet gepufferten wässrigen Lösung zur weiteren Verarbeitung vor. Eine solche Verarbeitung umfasst insbesondere die Reinigung durch Standardchromatographievertahren, wie Umkehrphasenchromatographie oder hydrophobe Chromatographie, die Konzentrierung durch Querstromfiltration, einen Lösemittelwechsel durch Ultrafiltration und dergleichen. Für acyliertes Proinsulin, acyliertes Insulin und acylierte Insulinanaloga, insbesondere N-Plamitoyl-Lys^B29 Humaninsulin, und B28-N-Palmitoyl-Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin sollte der pH normalerweise unter etwa 3,0 und vorzugsweise zwischen etwa 1,5 und 2,5 mit der Säure eingestellt werden, wie dies erforderlich ist. Geeignete Säuren umfassen HCl, Essigsäure, Glycin und speziell Citronensäure. Die Verwendung von Citronensäure mit einer Konzentration von 50 mM hat sich als geeignet herausgestellt. Erforderlichenfalls kann der pH auch mit einer Base zurückgestellt werden, wie Natriumhydroxid, um ihn innerhalb des gewünschten Bereichs zu halten.
Zu diesem Zeitpunkt kann die wässrige Lösung des isolierten und vorzugsweise gereinigten acylierten Proteins, insbesondere eines Fettsäure-acylierten Proinsulins, eines Fettsäure-acylierten Insulins oder eines Fettsäure-acylierten Insulinanalogons gemäß der vorliegenden Erfindung prozessiert werden, um das lösliche Protein als Pulver zu gewinnen. Gemäß der Erfindung wird der pH der wässrigen Proteinlösung durch die Zugabe einer Base, vorzugsweise einer wasserlöslichen Base, wie Natriumhydroxid, in einer ausreichenden Menge eingestellt, um das lösliche Protein unlöslich werden zu lassen. Dies wird durch Einstellen des pH der Lösung nahe dem isoelektrischen Punkt des acylierten Proteins erreicht, der alternativ als isoelektrischer pH bezeichnet wird. Für ein Fettsäure-acyliertes Proinsulin, ein Fettsäureacyliertes Insulin und ein Fettsäure-acyliertes Insulinanalogon, insbesondere N-Palmitoyl-Lys^B29 Humaninsulin hat sich die Einstellung des pH innerhalb eines Bereichs von etwa 4,0 bis 6,0, vorzugsweise etwa 4,5 bis 5,5 als geeignet herausgestellt. Bei diesem pH sollte die Nettoladung des acylierten Proteins an einem Minimum sein und die Löslichkeit des Proteins sollte am geringsten sein. Während der Einstellung des pH sollte die Lösung gerührt werden, um eine vollständige Mischung zu erhalten.
Wässrige Lösungen der acylierten Proteine, die besonders zur Behandlung gemäß der vorliegenden Erfindung bevorzugt sind, bilden eine emulsionsartige Zusammensetzung, wenn der pH nahe am isoelektrischen Punkt eingestellt wird. Dieser Zustand stört die Isolierung des Proteins mittels der fest/flüssig Trenntechniken, wie "dead-end" Filtration, die für eine Verarbeitung im großen Maßstab erwünscht sind. Ein Schlüsselmerkmal der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines Alkohols, speziell Ethanol, der zum wässrigen Proteingemisch zugegeben wird, um bei der Bildung eines leicht filtrierbaren Niederschlags des acylierten Proteins zu helfen.
Die Abfolge für die Einstellung des pH der Lösung und die Zugabe des Alkohols ist nicht entscheidend. Der Alkohol kann zur Proteinlösung vor der pH Einstellung gegeben werden, die zur Proteinlöslichkeitsherabsetzung und schließlichen Niederschlagsbildung erforderlich ist und kann auch nach der pH Einstellung der Proteinlösung zugegeben werden.
Es wurde festgestellt, dass die Menge an Alkohol, die zum acylierten Protein zugegeben werden muss, um einen leicht filtrierbaren Niederschlag zu erhalten, in einem engen Bereich liegt. Insbesondere wurde festgestellt, dass für ein Fettsäure-acyliertes Insulin und speziell N-Palmitoyl-Lys^B29 Humaninsulin, das gewünschte Ergebnis, das heißt die Bildung eines leicht filtrierbaren Niederschlags, nur nach der Zugabe einer Menge an Alkohol, speziell Ethanol, in einem engen Bereich erreicht wird, wobei eine Alkoholendkonzentration von mindestens etwa 20 % und bis zu etwa 35 % und vorzugsweise etwa 25 % bis 30 % in der wässrigen Proteinsuspension oder Aufschlämmung bereitgestellt wird. Während Ethanol klar der Alkohol der Wahl ist, sollten andere Alkohole, wie Methanol und Isopropanol geeignete Ersatzstoffe in bestimmten Umständen sein.
Die Zugabe von zu viel Alkohol zum wässrigen Protein stört die Bildung eines annehmbaren Maßes an Niederschlagsbildung, während die Zugabe einer nicht ausreichenden Menge die emulsionsartige Zusammensetzung, die nach der pH Einstellung des acylierten Proteins gebildet wird, nicht geeignet in eine leicht filtrierbare Aufschlämmung oder Suspension auflöst. Tatsächlich löst sich das Protein bei höheren Mengen an Alkohol als den gewünschten, wieder auf, was zu möglichen Ausbeuteverlusten führt. Die Bestimmung der Menge an Alkohol, wie Ethanol, die zur Vereinfachung der Fällung und Filtration von anderen Fettsäure-acylierten Proteinen erforderlich ist, kann mittels Routineexperimenten ausgeführt werden.
Daher basiert die Erfindung auf der Erkenntnis, dass zur Gewinnung eines acylierten Proteins als frei fließendes Pulver, insbesondere eines, das sonst der Isolierung und Gewinnung durch isoelektische Fällung und Filtration aus wässrigen Lösungen des Proteins widersteht, man die folgende Kombination aus Bedingungen herstellen muss (a) einen pH am oder nahe am isoelektrischen pH des Proteins und (b) eine ausreichende Alkoholkonzentration, um bei der Fällung und Filtration des Proteins durch die Erleichterung der Bildung von leicht filtrierbaren Partikeln zu helfen. Wie oben erwähnt wurde festgestellt, dass im Fall von N-Paamitoyl-Lys^B29 Humaninsulin eine Ethanolkonzentration von etwa 20 bis 35 Volumenprozent der Aufschlämmung und vorzugsweise 25 bis 30 Volumenprozent besonders geeignet ist, um bei der Fällung des Proteins in Form von leicht filtrierbaren Partikeln zu helfen.
Das Verfahren, durch das ein wässriges Proteingemisch hergestellt wird und durch das die erforderliche Alkoholkonzentration (beispielsweise Ethanol) und der isoelektrische Punkt des acylierten Proteins eingestellt werden, ist nicht entscheidend. Beispielsweise kann ein solches Gemisch durch Verdünnen einer pH eingestellten wässrigen Lösung des Proteins mit einer höheren Alkoholkonzentration als der erforderlichen mit Wasser erhalten werden, das heißt im Fall von N-Palmitoyl-LysB²⁹ Humaninsulin durch Verdünnen einer Ethanolkonzentration von über 35 Volumenprozent, das heißt von 40 bis 45 % Ethanol auf eine Alkoholkonzentration im gewünschten Bereich. Vorzugsweise wird die Zusammensetzung sanft gerührt (gemischt), wenn sowohl die Alkoholkonzentration als auch der pH Wert innerhalb der erforderlichen Grenzen sind, um die Niederschlagsbildung zu erleichtern.
Die Konzentration des acylierten Proteins in der Lösung vor der Behandlung gemäß der vorliegenden Erfindung ist nicht entscheidend. Im Fall der acylierten Insuline, einschließlich acyliertem Proinsulin und acylierter Insulinanaloga sollte im allgemeinen eine Konzentration von mindestens 1 mg/ml und vorzugsweise mindestens etwa 5 mg/ml verwendet werden, obwohl eine Proteinkonzentration von bis zu 35 bis 50 mg/ml und höher ein gefälltes Protein bereitstellen sollte, das mit akzeptableren Filtrationsgeschwindigkeiten prozessiert werden kann. Wie oben erwähnt sollte die durch die kombinierte Behandlung aus pH Einstellung und Alkoholzugabe hergestellte Proteinaufschlämmung eine durchschnittliche oder mittlere Filtrationsgeschwindigkeit von mindestens etwa 5 LMH zeigen und vorzugsweise eine mittlere Filtrationsgeschwindigkeit von mindestens etwa 15 LMH aufweisen. Überraschenderweise werden mittlere Filtrationsgeschwindigkeiten von etwa 20 LMH und mehr bei der Behandlung von N-Palmitoyl-LysB²⁹ Humaninsulinlösungen gemäß der vorliegenden Erfindung beobachtet.
Obwohl sie im engeren Sinn nicht entscheidend ist, wird die Temperatur für beste Ergebnisse während der Filtration im Bereich von 20°C bis 30°C gehalten. Temperaturen von 0°C oder darunter sollten jedoch während der Filtration vermieden werden, da solche Temperaturen mit der Ausführung bei den gewünschten hohen Filtrationsgeschwindigkeiten stören. Während die Filtration vorzugsweise im wesentlichen bei Raumtemperatur ausgeführt wird, können die vorangehenden Schritte der pH Einstellung und Ethanolzugabe bei jeder Temperatur über dem Gefrierpunkt der Aufschlämmung ausgeführt werden.
An diesem Punkt ist die wässrige Proteinzusammensetzung fertig, um zur Isolierung des gefällten Proteins filtriert zu werden. In manchen Fällen kann es vorteilhaft sein, eine Schwerkrafteindickung oder Absetzung der wässrigen Proteinzusammensetzung oder Proteinaufschlämmung vor der Filtration auszu führen, um die hydraulische Belastung der Filtrationsausrüstung zu minimieren. Während die Zentrifugalfiltration der wässrigen Proteinzusammensetzung bei größeren Behandlungsmaßstäben vorteilhaft sein kann, beispielsweise bei Produktionsansätzen von mehr als etwa 0,5 kg, kann jedes Mittel für die fest/flüssig Trennung einschließlich einer Vakuum-gestützten oder Druck-gestützten Filtration, verwendet werden, um das gefällte Protein bei der Anwendung der vorliegenden Erfindung zu gewinnen. Im kleineren Maßstab, beispielsweise bei einer Ansatzgröße unter 0,3 bis 0,5 kg, kann eine Druck-gestützte Filtration mittels einer Filtrationsvorrichtung mit einer porösen Frittenfiltrationsoberfläche mit Vorteilen verwendet werden. Die Filtration durch eine poröse Fritte mit einer nominalen Porengröße von 5,0 um hat sich als sehr effektiv herausgestellt. Die zur Filtration der Aufschlämmung verwendete Ausrüstung ist im engeren Sinn nicht entscheidend und es kann jedes einer großen Vielzahl von bekannten Filtrationssystemen verwendet werden, das mit der Verarbeitung von pharmazeutischen Zusammensetzungen kompatibel ist.
Nach der Filtration wird der Kuchen gewonnen und getrocknet, im allgemeinen durch Vakuumgestützte Verdampfung. Bei der allgemeinen Anwendung der vorliegenden Erfindung kann jedes Verfahren zum Trocknen einer eingedickten Paste an Feststoffen verwendet werden, das andererseits für das isolierte Protein nicht schädlich ist. Wege zur Gewinnung des Filterkuchens und andere Wege zur Trocknung des Filterkuchens sollten dem Fachmann bekannt sein und sind nicht entscheidend.
Die acylierten Insulinpulver der vorliegenden Erfindung sind als Bulkarzneimittelsubstanz (BDS) zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen brauchbar, die in der Insulintherapie verwendet werden, das heißt zur Verabreichung an einen Patienten, der dessen bedarf (das heißt einem Patienten, der an Hyperglycämie leidet). Solche pharmazeutischen Zusammensetzungen enthalten eine wirksame Menge des Pulvers in Kombination mit einem oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoffen oder Trägern. Für diese Zwecke können die pharmazeutischen Zusammensetzungen typischerweise so formuliert werden, dass sie etwa 100 Einheiten pro ml oder ähnliche Konzentrationen aufweisen, die eine wirksame Menge des acylierten Insulinpulvers enthalten. Diese Zusammensetzungen sind typischerweise wenn auch nicht notwendigerweise von der Art her parenteral und können durch jede einer Vielzahl an Techniken mittels herkömmlicher Hilfsstoffe oder Träger für parenterale Produkte hergestellt werden, die in der Technik gut bekannt sind. Siehe beispielsweise Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. Ausgabe, Mack Publishing Company, Easton, PA, USA (1985), das hiermit eingeführt ist. Beispielsweise können Dosisformen zur parenteralen Verabreichung durch Suspendieren oder Lösen der gewünschten Menge des Proteinpulvers in einem nicht toxischen flüssigen Träger, der zur Injektion geeignet ist, wie ein wässriges Medium, und der Sterilisierung der Suspension oder Lösung hergestellt werden. Alternativ dazu kann eine abgemessene Menge des Pulvers in ein Gläschen gegeben werden und das Gläschen und deren Inhalt werden sterilisiert und verschlossen. Es kann eine begleitende Ampulle oder ein Träger zum Mischen vor der Verabreichung bereitgestellt werden.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die für eine parenterale Verabreichung vorgesehen sind, verwenden Verdünnungsmittel, Hilfsstoffe und Träger, wie Wasser und wassermischbare organische Lösemittel, wie Glycerin, Sesamöl, Erdnussöl, wässriges Propylenglycol, N,N-Dimethylformamid und dergleichen. Beispiele für solche pharmazeutischen Zusammensetzungen beinhalten sterile, isotonische, wässrige Kochsalzlösungen des Pulvers, die mit einem pharmazeutisch annehmbaren Puffer gepuffert sein können und die pyrogenfrei sind. Zusätzlich kann die parenterale pharmazeutische Formulierung Konservierungsstoffe enthalten, wie meta-Cresol oder andere Mittel zur Einstellung des pH des Endprodukts, wie Natriumhydroxid oder Chlorwasserstoffsäure, und Stabilisationsmittel, wie Zinksalze.
Das folgende Beispiel wird bereitgestellt, um die Erfindung zu erläutern und zu erklären. Wenn die Erfindung in Bezug auf die Gewinnung von N-Palmitoyl-LysB²⁹ Humaninsulin als Pulver erläutert wird, sollte der Umfang der Erfindung nicht auf dieses Beispiel beschränkt werden. Falls nichts anderes angegeben ist, beziehen sich alle Angaben bezüglich Teile und Prozentsätze auf das Gewicht und alle Temperaturen sind in Grad Celsius angegeben.
Beispiel Eine wässrige Lösung (8,8 l) eines Fettsäure-acylierten biosynthetischen Humaninsulins (N-Palmitoyl LysB²⁹ Humaninsulin) mit einer Proteinkonzentration von 50 mg/ml und einem pH von 2,6 wird bei einer Temperatur von 2–8°C mit 530 ml an 10 % Natriumhydroxid behandelt, das den pH auf 5,7 erhöht. Nach dem Rühren der pH-eingestellten Lösung, die durch Mischen gewonnen wurde, wird absolutes Ethanol in einer Menge von 0,46 Liter pro Liter pH-eingestellter Lösung unter sanftem Rühren (auf ein Gesamtvolumen von 13 l) zugegeben, um die Fällung des acylierten Insulins zu erleichtern. Die acylierte Proteinaufschlämmung wird auf einem Druck-gestützten Filter mit einer Edelstahlfritte mit einer nominalen Porengröße von 5,0 μm entwässert. Die beobachtete mittlere Filtrationsgeschwindigkeit beträgt etwa 25 LMH. Das Filtrat wird verworfen. Der Filterkuchen wird dann mit einer wässrigen Lösung gewaschen, die 30 Volumenprozent Ethanol enthält und der gewaschene Filterkuchen wird aus dem Filter entfernt und unter einem Vakuum unter Bildung eines Zink-freien Pulvers getrocknet. Dieses Pulver hat eine ausgezeichnete Lagerstabilität und es ist daher als pharmazeutische Bulksubstanz geeignet. Es wird im wesentlichen das gesamte Protein im Filterkuchen mit sehr geringen Verlusten über das Filtrat gewonnen.
Die Prinzipien, bevorzugten Ausführungsformen und Durchführungsarten der vorliegenden Erfindung wurden im Detail in der vorhergehenden Beschreibung primär in Bezug auf Fettsäure-acyliertes Proinsulin, Insulin und Insulinanaloga, insbesondere N-Palmitoyl Lys^B29 Humaninsulin beschrieben. Die Erfindung, die hiermit geschützt werden soll, soll jedoch nicht auf die bestimmten hierin beschriebenen Formen beschränkt sein, da sie als erläuternd und nicht als beschränkend angesehen werden sollen. Variationen und Veränderungen können durch den Fachmann ausgeführt werden, ohne sich vom Grundgedanken der Erfindung zu entfernen, wie er in den folgenden Patentansprüchen beschrieben ist.

Claims

Verfahren zur Gewinnung eines Proteins, ausgewählt aus einem Fettsäure-acylierten Proinsulin, einem Fettsäureacylierten Insulin und einem Fettsäure-acylierten Insulinanalogon als Pulver aus einem wässrigen Gemisch oder einer wässrigen Lösung, wobei das Verfahren die Einstellung des pH des Gemisches oder der Lösung auf einen pH, der das Protein unlöslich werden lässt, und die Zugabe von ausreichend Alkohol zum wässrigen Gemisch oder der wässrigen Lösung des Proteins umfasst, um bei der Fällung des Proteins in Form von filtrierbaren Partikeln bei diesem pH zu helfen.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die wässrige Lösung auf einen pH von etwa 4,0 bis 6,0 eingestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin im Fettsäure-acylierten Proinsulin, Insulin oder Insulinanalogon der Aminosäurerest an der Position B30 Thr oder Ala ist oder deletiert ist und die Fettsäure Myristinsäure ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin das Protein N-Palmitoyl Lys B29 Humaninsulin ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin der Alkohol Ethanol ist, der in einer Menge zugegeben wird, um eine Alkoholkonzentration von 20 bis 35 Volumenprozent des wässrigen Gemisches zu erreichen.
Verfahren nach Anspruch 5, worin die Alkoholkonzentration 25 bis 30 Volumenprozent beträgt.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, das ferner die Filtration und Trocknung des Proteins umfasst, um ein Pulver zu erhalten.