KR19990022590A - 아실화 단백질 분말의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

단백질 수용액을 단백질 등전 pH로 조정하고, 조정된 pH에서 단백질이 여과가능한 입자 형태로 침전시키는데 적합한 알콜 농도를 제공하는 것을 아실화 단백질을 불말로, 특히 아실화 단백질이 단백질의 수용액으로부터 등전기적 침전화에 의한 단리에 저항을 보이는 경우 회수하는 방법이 제공된다.

Description

아실화 단백질 분말의 제조 방법

정상 개체에서의 내생 인슐린 분비 패턴을 모방하는 인슐린 치료가 오랫동안 연구되어 왔다. 생리학적 1일 인슐린 수요는 변동되며 하기와 같은 두가지 상태로 분리될 수 있다: (a) 식품 관련 혈당 상승을 제거하기 위한 인슐린 증가에 필요한 흡수 상태 및 (b) 최적의 금식 혈당을 유지하기 위해 간장의 당 방출을 제어하는 지속적인 양의 인슐린을 필요로 하는 흡수 후 상태. 따라서, 효과적인 치료는 일반적으로 큰 환약 주입에 의해 제공되는 단기 작용 식사 시간 인슐린과 1일 1회 또는 2회 주입에 의해 투여되는 장기 작용 기초 인슐린의 두가지 외인성 인슐린의 조합된 사용을 포함한다.

근래에 들어, 아실화 인슐린 종류가 장기 작용 기초 인슐린 치료에서의 사용에 유망한 것으로 밝혀졌다. 이들 아실화 인슐린은 활성화 지방산 유도체를 사용하여 프로인슐린, 정상 인슐린 및 특정 인슐린 동족체를 포함하는 단량체 인슐린의 유리 아미노기(들)를 선택적으로 아실화함으로써 제조한다. 유용한 지방산 유도체에는 6 개 이상의 탄소 원자 사슬 길이를 갖는 반응성 지방산 유형 화합물, 특히 사슬 내에 8 내지 21 개의 탄소 원자를 갖는 지방산 유도체가 포함된다. 팔미트산 유도체로 아실화된 모노-아실화 정상 사람 인슐린이 특히 유망하다. 본 카테고리에 포함되는 인슐린은 일본 특허 출원 1-254,699호에 기재되어 있다.

당업자에게 잘 알려진 바와 같이, 단백질을 고체 형태, 바람직하게는 자유 유동성 분말 형태로 회수하는 방법은 많은 용도에서 필수적이지는 않지만 특히 유리하다. 예를 들어, 단백질을 분말로 제조하면 보관 및 분배 조건이 극대화된다. 이는 수요에 부합하기 위해 큰 부피의 제품으로 생산되어야만 하는 인슐린 치료를 위한 조성물의 경우에는 특히 그러하다. 오래 전 우연한 기회에 소 인슐린, 돼지 인슐린 및 사람 인슐린을 포함하는 정상 인슐린을 비교적 희석된 인슐린 수용액으로부터 아연 착물로서 또는 나트륨 결정으로서 침전화 또는 보다 정밀하게는 결정화에 의해 분말로 회수할 수 있음이 발견되었다. 일반적으로, 이른바 아연 인슐린은 아연 이온을 함유한 완충 수용액으로부터 결정화시키며 여과에 의해 쉽게 단리할 수 있다.

장쇄 지방산 유도체로 아실화된 인슐린을 여과에 의해 회수하려는 시도는 유감스럽게도 성공적이지 못했다. 사실상, 지방산 아실화 인슐린을 결정화하는 공지된 시도는 모두 실패하였다. 무엇보다도 인슐린 단량체 상의 장쇄 지방산 잔기의 소수성 특성이 만족스런 결정 형성에 요구되는 단백질-단백질 상호작용을 방해하여 결정 형성을 어렵게 하는 것으로 생각되었다. 따라서, 이들 아실화 인슐린을 고체 분말 형태로 제조하는 다른 방법이 발견되어야만 한다.

아실화 인슐린과 같은 아실화 단백질을 분말 형태로 생성하려는 기술적으로 가능한 시도는 단백질의 수용액을 동결건조시키는 것이다. 지방산 아실화 인슐린의 분말 제제는 이 방법으로 생성할 수 있지만, 동결 기술을 상업적으로 요구되는 다량의 인슐린을 생성하는데 적용하는 것은 쉽지 않다. 작업자의 안전 및 생성물 처리 면에서 특히 대용량 동결 작업은 문제의 소지가 있다.

다른 유력한 방법으로는 등전기적 침전화가 있다. 수용액 내 단백질이 주변 환경의 pH가 단백질의 등전점에 근사한 값으로 조정되면 수용액 내 단백질은 덜 가용성이 되는 것은 오래전부터 알려진 사실이다. 이러한 일반적인 현상은 단백질 정제 및 회수 방법에서 오랫동안 이용되어 왔다. 단백질은 일단 불용성이 되면 종종 단순한 중력 증점화에 의해 또는 진공 보조 및 압력 보조 여과에 의해 결과되는 수성 현탁액으로부터 회수할 수 있다.

불행히도, 단순히 아실화 단백질 수용액의 pH를 그의 등전점 근처로 조정하여 지방산 아실화 인슐린을 회수하려는 시도는 중력 증점화 또는 진공 보조 및 압력 보조 여과와 같은 쉬운 고체 액체 분리에 저항하는 에멀션 형 조성물을 생성하였다. 따라서, 이러한 아실화 인슐린 종을 분말 형태로 회수하는 새로운 방법을 찾아야만 한다.

본 발명은 아실화 단백질, 특히 침전 및 여과에 의한 단리 및 회수에 저항을 보이는 특정 지방산 아실화 인슐린을 자유 유동성 분말로 침전시키고 여과하여 회수하는 간단한 방법을 제공한다. 본 발명은 따라서 지방산 아실화 인슐린을 수용액으로부터 자유 유동성 분말로서 회수하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 비교적 대량 생산 기술에 편리하게 적용될 수 있는, 지방산 아실화 인슐린 분말을 회수하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 본 방법에 의해 제조되는 분말 단백질을 포함한다.

본 발명은 아실화 단백질, 특히 수용액으로부터의 침전화 또는 결정화 및 후속 여과에 의한 회수에 저항을 보이는 아실화 단백질 및 특별히 특정 아실화 프로인슐린, 아실화 인슐린 또는 아실화 인슐린 동족체를 분말로서 회수하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 특정 아실화 프로인슐린, 인슐린 및 인슐린 동족체의 자유 유동성 분말을 그들의 수용액으로부터 제조하는 방법에 관한 것이다.

본원에 사용되는 모든 아미노산 약어는 37 C.F.R. § 1.822(B)(2)에 기재된 United States Patent and Trademark Office가 인정한 것이다.

본원에 사용된 용어 인슐린 및 정상 인슐린은 사람 인슐린, 돼지 인슐린 또는 소 인슐린을 의미한다. 인슐린은 3 개의 유리 아미노기를 갖는다: B¹-페닐알라닌, A¹-글리신 및 B²⁹-라이신. A¹및 B¹위치의 유리 아미노기는 α-아미노기이다. B²⁹위치의 유리 아미노기는 ε-아미노기이다.

본원에 사용된 용어 프로인슐린은 하기 화학식을 갖는 적절히 가교 결합된 단백질이다.

B - C - A

상기 식에서,

A는 인슐린의 A 사슬 또는 그의 관능성 유도체이고;

B는 인슐린의 B 사슬 또는 ε-아미노기를 갖는 그의 관능성 유도체이고;

C는 프로인슐린의 연결 펩티드이다.

프로인슐린은 사람 인슐린의 A 사슬, 사람 인슐린의 B 사슬이고, C는 천연 연결 펩티드인 것이 바람직하다. 프로인슐린이 천연 서열일 때, 프로인슐린은 3 개의 유리 아미노기를 갖는다: 페닐알라닌(1) (α-아미노기), 라이신(29) (ε-아미노기) 및 라이신(64) (ε-아미노기).

본원에 사용된 용어 인슐린 동족체는 하기 화학식의 인슐린 활성을 보이는 적절히 가교 결합된 단백질이다.

A - B

상기 식에서,

A는 인슐린의 A 사슬 또는 인슐린 A 사슬의 관능성 유도체이고;

B는 인슐린의 B 사슬 또는 ε-아미노기를 갖는 인슐린 B 사슬의 관능성 유도체이고 A 또는 B 중 하나 이상이 천연 서열로부터 개질된 아미노산을 함유한다.

바람직한 인슐린 동족체에는 다음과 같은 인슐린이 포함된다.

B²⁸위치의 아미노산 잔기가 Asp, Lys, Leu, Val 또는 ALa이고;

B²⁹위치의 아미노산 잔기가 Lys 또는 Pro이고;

B¹⁰위치의 아미노산 잔기가 His 또는 Asp이고,

B¹위치의 아미노산 잔기가 Phe, Asp 또는 단독으로 또는 B²위치의 잔기와 함께 삭제되어 있고;

B³⁰위치의 아미노산 잔기가 Thr, Ala 또는 삭제되어 있고;

B⁹위치의 아미노산 잔기가 Ser 또는 Asp이며, 단 B²⁸또는 B²⁹위치가 Lys이다.

당업자에게 알려진 표준 생화학 용어에서, 바람직한 인슐린 동족체는 Lys^B28Pro^B29-사람 인슐린(B²⁸이 Lys이고; R²⁹가 Pro임); Asp^B28-사람 인슐린(B²⁸이 Asp임); Asp^B1-사람 인슐린, Arg^B31,B32-사람 인슐린, Asp^B10-사람 인슐린, Arg^A0-사람 인슐린, Asp^B1, Glu^B13-사람 인슐린, Ala^B26-사람 인슐린 및 Gly^A21-사람 인슐린이다.

용어 아실화는 단백질의 유리 아미노기에 공유결합된 하나 이상의 아실기 도입을 의미한다.

용어 지방산은 포화 또는 불포화 C₆-C₂₁지방산을 의미한다. 용어 활성화 지방산 에스테르는 본원에 참고문헌으로 인용된 문헌[Methods of Enzymology, 25:494-499 (1972)] 및 문헌 [라피도트(Lapidot) 일동, J. of Lipid Res., 8:142-145 (1967)]에 기재된 것과 같은 일반적인 기술을 사용하여 활성화된 지방산을 의미한다. 포화된 지방산이 바람직하며 미리스트산(C₁₄), 펜타데실산(C₁₅), 팔미트산(C₁₆), 헵타데실산(C₁₇) 및 스테아르산(C₁₈)이 포함된다. 가장 바람직한 지방산은 팔미트산이다. 활성화 지방산 에스테르는 히드록시벤조트리아지드(HOBT), N-히드록시숙신이미드 및 이들의 유도체와 같은 화합물의 유도체를 포함한다. 바람직한 활성화 에스테르는 N-숙신이미딜 팔미트산염이다.

용어 가교 결합된은 시스테인 잔기 사이에 디술파이드 결합이 형성된 것을 의미한다. 적절히 가교 결합된 프로인슐린, 인슐린 또는 인슐린 동족체는 3 개의 디술파이드 브릿지를 갖는다. 제 1 디술파이드 브릿지는 A-사슬의 6과 11 위치 시스테인 잔기 사이에 형성된다. 제 2 디술파이드 브릿지는 A-사슬의 7 위치 시스테인 잔기를 B-사슬의 7 위치 시스테인에 연결시킨다. 제 3 디술파이드 브릿지는 A-사슬의 20 위치 시스테인을 B-사슬 19 위치 시스테인에 연결시킨다.

용어 침전화는 쉽게 여과될 수 있는 입자를 액체 내에서 생성하고 단순히 용액 내 용질의 용해도를 변화시킴으로써 식별시켜 안정한 현탁액 및(또는) 에멀션 형 이상 혼합물을 형성시키는 절차를 나타낸다. 여과가능한 입자 자체는 침전물이라 한다.

표현 쉽게 여과가능한 및 기타 유사한 표현은 고체-액체 혼합물 또는 슬러리의 입자를 데드-엔드(dead-end) 여과 방법 및 관련 기술에 의해 처리가능한 필터 케이크로 즉, 케이크를 취급하는 것을 방해하지 않는 잔류 수분 함량을 갖는, 슬러리라기 보다는 고체인 물질로 단리할 수 있는 상태를 말한다. 데드-엔드 여과에서는, 슬러리를 운반하고 여액을 실질적으로 필터 평면에 수직하게 통과시켜 주 액체 흐름이 여과 매체의 표면에 평행한 횡방향 흐름 또는 접선방향 흐름 여과와는 반대되게 하는 것이다. 중요한 것은 본 발명의 방법이 5 ℓ/㎡/시(LMG) 보다 큰 평균 여과 속도에서, 종종 20 LMH 보다 큰 평균 여과 속도로 데드-엔드 여과 및 관련 기술에 의해 단리될 수 있는 아실화 단백질의 슬러리를 생성한다는 것이며 이때, 여과 종말점은 통상적으로 케이크를 고체로서 처리할 수 있는 시점이다. 상기와 같은 여과 속도는 대량 생산 규모의 작업에서 경제적으로 중요하다.

용어 수성은 용매로서 뿐만 아니라 보조 용매 시스템으로 물을 사용하는 것도 포함한다.

본 발명은 아실화 단백질, 특히 아실화 단백질 수용액으로부터의 등전기적 침전화에 의한 단리 및 회수에 저항을 보이는 아실화 단백질을 수성 혼합물로부터 분말로 회수하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 아실화 단백질의 수용액의 pH를 용액내 단백질이 불용성이 되게 하는 pH로 조정하고 그 pH에서 단백질이 여과가능한 입자 형태로 침전되도록 단백질의 수성 혼합물에 충분한 알콜을 첨가하는 것을 포함한다.

다른 양면에서, 본 발명은 아실화 단백질 분말, 특히 수용액으로부터의 등전기적 침전화에 의한 단리에 저항을 보이는 아실화 단백질을 포함한다. 특히, 본 발명은 아실화 인슐린 단백질 수용액의 pH를 그 수용액 내 단백질이 불용성이 되도록 조정하고, 그 pH에서 단백질이 여과가능한 입자 형태로 침전되도록 수성 단백질에 충분한 알콜을 첨가하여 제조한 분말 형태의 지방산 아실화 프로인슐린, 지방산 아실화 인슐린 또는 지방산 아실화 인슐린 동족체를 포함한다. 따라서, 단백질이 여과 및 건조에 의해 무아연 아실화 단백질 분말로서 회수될 수 있다. 본 발명의 방법을 사용하여 분말 형태로 제조한 바람직한 아실화 단백질에는 N-팔미토일 Lys^B29사람 인슐린 및 B28-N^ε-팔미토일-Lys^B28Pro^B29-사람 인슐린(이때, B28은 아실화 Lys이고, B2는 Pro임)이 있다.

본 발명의 주 관심사인 아실화 단백질을 제조하는데 사용되는 프로인슐린, 인슐린 및 인슐린 동족체는 전통적인 (용액) 방법, 고체상 방법, 반합성 방법 및 보다 최근의 재조합 DNA 방법을 포함하는 공지된 다양한 펩티드 합성 기술에 의해 제조할 수 있다. 예를 들면, 챈스(Chance) 일동의 미국 특허 출원 제 07/388,201호, EPO 공개 번호 383 472, 브랜지(Brange) 일동의 EPO 214,826 및 벨라가제(Belagaje) 일동의 미국 특허 5,304,473호가 다양한 프로인슐린 및 인슐린 동족체의 제조 방법을 개시하고 있으며 본원에 참고 문헌으로 인용되어 있다. 본 발명의 인슐린 동족체의 A 및 B 사슬은 또한 재조합 DNA 기술을 사용하여 프로인슐린 형 전구체 분자를 통해 제조할 수 있다. 본원에 참고 문헌으로 인용된 프랭크(Frank) 일동의 문헌 [Peptides: Synthesis-Structure-Function, Proc. Seventh Am. Pept. Symp., Eds. D. Rich and E. Gross (1981)]을 참고하기 바람.

일반적으로, 프로인슐린, 인슐린 및 인슐린 동족체는 활성화 지방산 에스테르와 같은 활성화 지방산 유도체와 반응시켜 아실화한다. 지방산을 사용하여 정상 인슐린을 아실화하는 것은 일본 특허 출원 1-254,699에 개시되어 있다. 하시모토(Hashimoto) 일동의 문헌 [Pharmaceutical Research, 6: 171-176 (1989)]를 참고하기 바람. 이 문헌은 본원에 참고 문헌으로 인용되어 있다.

아실화는 염기성 조건, 즉 pH가 9.0 보다 큰, 바람직하게는 약 10.5인 극성 용매 내에서 수행하는 것이 바람직하다. 반응은 수성 pKa가 10.75 이상인 염기를 사용하며 전부 유기 극성 용매 내에서 수행할 수 있지만, 반응 매질로는 혼합 유기 및 수성 용매가 바람직하다. 바람직한 염기는 테트라메틸구아니딘, 디이소프로필에틸아민 또는 테트라부틸암모늄 수산화물이다. 특히 적합한 용매는 아세토니트릴 및 아세토니트릴을 50% 함유한 물이다. 다른 극성 용매에는 디메틸술폭사이드, 디메틸포름아미드 등이 있다. 보조 용매 시스템은 또한 아세톤 및 물, 이소프로필 알콜 및 물 및 에탄올 및 물을 포함한다. 이 반응을 수행하는데 적합한 시간 및 온도 조건은 그리 중요하지는 않다. 0 내지 40℃ 온도 및 15 분 내지 24 시간의 반응 시간이 일반적으로 적합하다. 상기 지방산 아실화 인슐린을 제조하는 특히 바람직한 방법은 본원에 참고 문헌으로 인용된 1994 년 11 월 17 일 출원되고 동시 계류중인 미국 출원 일련 번호 제 08/341231호에 기재되어 있다.

일단 반응이 완결되면, 아실화 단백질을 함유한 반응 혼합물을 물로 희석하고, 산을 첨가하여 알칼리성을 중화시킨다. 산은 수용액으로서 아실화 단백질에 공급되며 용액의 pH를 단백질의 등전점 이하로 낮추는 작용을 한다. 통상적으로, 이 등전점에서 단백질은 추가 가공을 위해 적절히 완충된 수용액 상태이다. 상기 공정은 특히 역상 또는 소수성 크로마토그래피와 같은 표준 크로마토그래피 방법, 횡방향 흐름 여과에 의한 농축, 초여과에 의한 용매 교환 등에 의한 정제를 포함한다. 아실화 프로인슐린, 아실화 인슐린 및 아실화 인슐린 동족체, 특히 N-팔미토일 Lys^B29, 사람 인슐린 및 B^ε28-N-팔미토일-Lys^B28Pro^B29-사람 인슐린의 경우, 필요하다면 통상적으로 산을 사용하여 pH를 약 3.0 아래로, 바람직하게는 약 1.5 내지 2.5로 조정해야 한다. 적합한 산에는 HCl, 아세트산, 글리신 및 특별히 시트르산이 있다. 50 mM 농도의 시트르산을 사용하는 것이 적합한 것으로 밝혀졌다. 필요하다면 수산화나트륨과 같은 염기를 사용하여 pH를 다시 조정함으로써 원하는 범위 내에 유지할 수 있다.

이 시점에서, 단리된, 바람직하게는 정제된 아실화 단백질, 특히 지방산 아실화 프로인슐린, 지방산 아실화 인슐린 또는 지방산 아실화 인슐린 동족체의 수용액은 본 발명에 따라 처리하여 가용성 단백질을 분말로서 회수할 수 있다. 본 발명에 따르면, 가용성 단백질이 불용성이 되도록 하기에 충분한 양으로 염기, 바람직하게는 수산화나트륨과 같은 수용성 염기를 첨가하여 단백질 수용액의 pH를 조정한다. 이는 용액의 pH를 아실화 단백질의 등전점(다른 말로는 등전 pH) 근처로 조정함으로써 수행한다. 지방산 아실화 프로인슐린, 지방산 아실화 인슐린 및 지방산 아실화 인슐린 동족체, 특히 N-팔미토일 Lys^B29사람 인슐린의 경우에는, pH를 약 4.0 내지 6.0, 바람직하게는 약 4.5 내지 5.5 범위로 조정하는 것이 적합한 것으로 증명되었다. 이 pH에서, 아실화 단백질 상의 총 전하는 최소이어야 하고, 단백질의 용해도는 가장 낮아야 한다. pH 조정 중에는 용액을 교반하여 완전히 혼합시켜야만 한다.

특히 본 발명에 따라 처리된 아실화 단백질의 수용액은 pH를 그의 등전 pH 근처로 조정할 때 에멀션 형 조성물을 형성한다. 이 상태는 대량 가공에 바람직한 데드엔드 여과와 같은, 고체/액체 분리 기술을 사용하여 단백질을 단리하는 것을 방해한다. 본 발명의 중요한 특징은 아실화 단백질의 쉽게 여과가능한 침전물의 형성을 돕기 위해 수성 단백질 혼합물에 첨가되는 알콜, 특히 에탄올의 용도에관한 것이다.

용액의 pH를 조정하는 것과 알콜을 첨가하는 순서는 중요하지 않다. 단백질 불용성화하여 궁극적으로 침전물을 형성하는데 필요한 pH 조정에 앞서 알콜을 단백질 용액에 첨가할 수 있으며 단백질의 pH 조정 후에 알콜을 첨가할 수도 있다.

본 발명인은 쉽게 여과가능한 침전물을 얻기 위해 아실화 단백질에 첨가되어야만 하는 알콜의 양이 좁은 범위 내이어야 함을 발견하였다. 특히 본 발명인은 지방산 아실화 인슐린, 특히 N-팔미토일 Lys^B29사람 인슐린의 경우, 수성 단백질 현탁액 또는 슬러리 내의 최종 알콜 농도가 약 20% 이상 내지 약 35% 이하, 바람직하게는 약 25% 내지 30%이도록 하는 좁은 범위의 양으로 알콜, 특히 에탄올을 첨가할 때만이, 원하는 결과, 즉, 쉽게 여과되는 침전물이 형성됨을 발견하였다. 에탄올이 우수한 알콜임이 명백하지만, 메탄올 및 이소프로판올과 같은 다른 알콜이 특정 상황에서는 적합한 대체물이다.

수성 단백질에 너무 많은 알콜을 첨가하면 침전물 형성을 허용가능한 수준으로 얻는 것을 방해하며, 불충분한 양으로 첨가하는 것은 아실화 단백질의 pH를 조정할 때 생성되는 에멀션 형 조성물을 쉽게 여과가능한 슬러리 또는 현탁액으로 용해하는데 불충분하다. 실제, 원하는 수준 보다 높은 알콜 농도에서, 단백질은 재용해되어 수율의 감소에 원인이 된다. 다른 지방산 아실화 단백질의 침전화 및 여과를 촉진하는데 필요한 에탄올과 같은 알콜의 양을 결정하는 것은 잘 알려진 실험을 통해 수행할 수 있다.

그러므로, 사실상, 본 발명은 아실화 단백질, 특히 단백질의 수용액으로부터의 등전기적 침전화 및 여과에 의한 단리 및 정제에 저항을 보이는 단백질을 자유 유동성 분말로서 회수하기 위해 실험자는 (a) 단백질의 등전 pH 또는 그 근처의 pH 및 (b) 쉽게 여과가능한 입자 형성을 촉진함으로써 단백질의 침전화 및 여과를 돕기에 충분한 알콜 농도의 조건을 조합시켜야만 한다. 앞서 지적한 바와 같이, N-팔미토일 Lys^B29사람 인슐린의 경우, 에탄올 농도가 약 20 부피% 내지 35 부피%인, 바람직하게는 25 부피% 내지 30 부피%인 슬러리가 쉽게 여과가능한 입자 형태의 단백질 침전화를 돕는데 특히 적합한 것으로 밝혀졌다.

요구되는 알콜(예, 에탄올) 농도를 갖고 아실화 단백질의 등전 pH를 보이는 수성 단백질 혼합물을 다양하게 제조하는 방법은 중요하지 않다. 예를 들면, 이러한 혼합물은 요구되는 알콜 농도 보다 높은 알콜 농도를 갖는 단백질의 pH 조정된 수용액을 물로 희석하여, 즉, N-팔미토일 Lys^B29사람 인슐린의 경우 약 35 부피% 이상의 에탄올 농도, 즉 40 내지 45% 에탄올 농도를 원하는 범위의 알콜 농도로 희석하여 얻을 수 있다. 알콜 농도 및 pH 모두가 원하는 한계 내일 때는 부드럽게 교반(혼합)하여 침전 형성을 촉진시키는 것이 바람직하다.

본 발명에 따라 처리하기 전 용액 내의 아실화 단백질 농도 역시 중요하지 않다. 아실화 인슐린(역시, 아실화 프로인슐린 및 아실화 인슐린 동족체 포함)의 경우에는, 35 내지 50 ㎎/㎖ 이상이 보다 허용가능한 여과 속도로 가공할 수 있는 침전 단백질을 제공하지만, 일반적으로 약 1 ㎎/㎖ 이상, 바람직하게는 약 5 ㎎/㎖ 이상의 농도를 사용한다. 앞서 지적한 바와 같이, pH 조정 및 알콜 첨가의 조합 처리에 의해 생성된 단백질 슬러리는 약 5 LMH 이상의 평균 여과 속도를 보여야만 하며, 약 15 LMH 이상의 평균 여과 속도를 보이는 것이 바람직하다. 본 발명에 따라 N-팔미토일 Lys^B29사람 인슐린을 처리하면, 놀랍게도, 약 20 LMH 이상의 평균 여과 속도가 관찰되었다.

중요하지는 않지만, 최상의 결과를 위해 여과중의 온도는 20℃ 내지 30℃애 유지한다. 그러나 0℃ 이하의 온도는 여과 중에 피해야 하는데 이 정도의 온도는 원하는 빠른 여과 속도로 작업하는 것을 방해한다. 여과를 반드시 주변 온도에서 수행하는 것이 바람직하지만, pH 조절 및 에탄올 첨가 단계 전에는 슬러리의 빙점 이상의 어느 온도에서나 수행할 수 있다.

이제, 수성 단백질 조성물은 쉽게 여과되어 침전된 단백질을 단리시킨다. 몇몇 경우에서는, 여과 장치 상에서의 수압 하중을 최소화하기 위해 여과 전에 수성 단백질 조성물 또는 슬러리의 중력 증점화 또는 침강을 수행하는 것이 유리할 수 있다. 수성 단백질 조성물의 원심 분리 여과가 대량 처리 규모(예, 약 0.5 ㎏ 보다 큰 생산 배치)에서는 유리하여, 진공 보조 또는 압력 보조 여과를 포함하는 임의의 액체/고체 분리 수단을 사용하여 본 발명의 다양한 실행에서 침전된 단백질을 회수할 수 있다. 소규모(예, 약 0.3 내지 0.5 ㎏ 이하 배치 크기)에서는다공성 백옥유 여과 표면을 갖는 여과 장치를 사용하는 압력 보조 여과를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 공인 공극 크기가 약 5.0 ㎛인 다공성 백옥유를 통해 여과시키는 것이 매우 효과적인 것으로 밝혀졌다. 슬러리를 여과시키는데 사용되는 장치는 그리 중요하지 않고 제약학적 조성물의 가공과 상용될 수 있는 다양한 공지된 여과 시스템을 사용할 수 있다.

여과 후, 필터 케이크를 회수하고, 일반적으로 진공 보조 증발에 의해 건조시킨다. 본 발명의 광범위한 실행에서는, 단리된 단백질에 해롭지 않은 고체의 증점 페이스트를 건조시키는 모든 방법을 사용할 수 있다. 필터 케이크를 회수하는 방법 및 필터 케이크를 건조시키는 다른 방법이 당업자에게 자명할 것이며 중요하지 않다.

본 발명의 아실화 인슐린 분말은 인슐린 치료에 사용되는, 즉, 필요로하는 환자(즉, 과혈당증을 앓고 있는 환자)에게 투여하기 위한 제약학적 조성물을 제조함에 있어서 벌크 약물 기질(BDS)로 유용하다. 이러한 제약학적 조성물은 하나 이상의 제약학적으로 허용되는 보형약 또는 담체와 배합된 유효량의 분말을 함유한다. 이 용도를 위해, 제약학적 조성물은 전형적으로 100 단위/㎖, 또는 아실화 인슐린 분말 유효량을 함유하는 유사한 농도를 함유하도록 제제화될 수 있다. 이러한 조성물은 필수적이지는 않지만 의례적으로 그 자체로는 비경구용이며 당 기술에 잘 알려진 비경구 생성물을 위한 통상적인 보형약 또는 담체를 사용하는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 본원에 참고 문헌으로 인용된 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 제 17 판, Mack Publishing Company, Easton, PA, USA (1985)]을 참고하기 바람. 예를 들면, 비경구 투여용 사용량 형태는 원하는 양의 단백질 분말을 수성 매질과 같은 주사에 적합한 무독성 액체 비히클 내에 현탁시키거나 용해시키고 현탁액 또는 용액을 멸균시켜 제조할 수 있다. 다른 방법으로는, 측정된 양의 분말을 유리병에 넣고, 유리병 및 그 내용물을 멸균시키고 봉하는 방법이 있다. 투여 전에 혼합하기 위해 유리병 또는 비히클이 동봉되어 제공될 수 있다.

비경구 투여용 제약학적 조성물은 희석제, 보형약 및 담체, 예를 들면, 물 및 글리세린, 참기름, 낙화생유, 수성 프로필렌 글리콜, N,N-디메틸포름아미드 등과 같은 수혼화성 유기 용매를 사용한다. 이러한 제약학적 조성물의 예로는 제약학적으로 허용가능한 완충제로 완충될 수 있고 발열 물질을 갖지 않는 분말의 멸균 용액, 등장 용액, 생리 수용액이 있다. 그밖에, 비경구용 제약학적 제제는 메타크레솔과 같은 방부제, 최종 생성물의 pH를 조절하는 기타 시약, 예컨데 수산화나트륨 또는 염산 및 아연 염과 같은 안정화제를 함유할 수 있다.

하기 실시예는 본 발명을 예시하고 설명하기 위해 제시되었다. N-팔미토일 Lys^B29사람 인슐린의 회수를 참고로 하여 예시하지만, 본 발명의 범위가 이 실시예에 제한되는 것으로 보아서는 안된다. 달리 지적이 없다면 부 및 %는 중량을 기준으로하며 모든 온도는 ℃로 나타내었다.

단백질 농도가 50 ㎎/㎖이고 pH 2.6인 지방산 아실화 생합성 사람 인슐린(N-팔미토일 Lys^B29사람 인슐린)의 수용액(8.8 ℓ)을 2 내지 8℃에서 10% 수산화나트륨 530 ㎖로 처리하면 pH가 5.7로 상승된다. pH 조정된 용액을 완전히 혼합하기 위해 교반한 후, pH-조절된 용액 ℓ 당 0.46 ℓ의 양으로 순수 에탄올을 첨가하고, 부드럽게 교반하여 아실화 인슐린을 침전시켰다. 아실화 단백질 슬러리를 스테인레스 강철 백옥유를 갖고 공인 공극 크기 5.0 μ인 압력 보조 필터 상에서 탈수시켰다. 관찰된 평균 여과 속도는 약 25 LMH였다. 여액을 제거하였다. 그리고나서 필터 케이크를 에탄올 30 부피%를 함유한 수용액으로 세척하고, 세척한 필터 케이크를 필터로부터 회수하여 진공 하에 건조시켜 아연을 갖지 않는 분말을 얻었다. 이 분말은 제약학적 벌크 약물 기질로서 적합한 탁월한 저장 안정성을 갖는 것으로 관찰되었다. 실질적으로 모든 단백질을 여액으로부터의 손실 없이 필터 케이크에서 회수하였다.

본 발명의 원리, 바람직한 실시 양태 및 작업 양식은 주로 지방산 아실화 프로인슐린, 인슐린 및 인슐린 동족체, 특히 N-팔미토일 Lys^B29사람 인슐린을 참고로하여 상기 명세서에서 구체적으로 서술하였다. 그러나 본원에서 보호받고자 하는 본 발명은 개시된 특정 형태에 제한되는 것으로 해석되어서는 안되는데, 이는 그들을 한정하기위해서라기 보다는 예시가 목적인 것으로 고려되어야 하기 때문이다. 당업자는 하기 청구의 범위에 정의된 발명의 사상으로부터 벗어남이 없이 변형 및 수정할 수 있다.

Claims (19)

1. 단백질 수용액의 pH를 용액 내 단백질이 불용성이 되게하는 pH로 조정하고, 그 pH에서 단백질이 여과가능한 입자 형태로 침전되는 것을 돕도록 단백질 수성 혼합물에 충분한 알콜을 첨가하는 것을 포함하는, 수성 혼합물로부터 아실화 단백질을 분말 형태로 회수하는 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 단백질이 지방산 유도체로 아실화된 방법.
3. 제 1 항에 있어서, 아실화 단백질이 단백질 수용액으로부터의 등전기적 침전화에 의한 단리에 저항을 보이는 단백질을 포함하는 방법.
4. 제 3 항에 있어서, 아실화 단백질이 지방산 아실화 프로인슐린, 지방산 아실화 인슐린 및 지방산 아실화 인슐린 동족체로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
5. 제 4 항에 있어서, 수용액의 pH를 약 4.0 내지 6.0으로 조정하는 방법.
6. 제 5 항에 있어서, 아실화 단백질이 N-팔미토일 Lys^B29사람 인슐린인 방법.
7. 제 6 항에 있어서, 알콜이 에탄올이고, 알콜 농도가 수성 혼합물의 20 부피% 내지 35 부피%가 되는 양으로 첨가되는 방법.
8. 제 7 항에 있어서, 알콜 농도가 25 부피% 내지 35 부피%인 방법.
9. 단백질 수용액의 pH를 단백질의 등전 pH 근처로 조정하고 그 pH에서 단백질이 여과가능한 입자 형태로 침전되는 것을 돕는데 적합한 알콜 농도를 제공하는 것을 포함하는, 단백질 수용액으로부터 아실화 단백질을 분말로서 회수하는 방법.
10. 제 9 항에 있어서, 아실화 단백질이 단백질 수용액으로부터의 등전기적 침전화에 의한 단리에 저항을 보이는 단백질인 방법.
11. 제 10 항에 있어서, 아실화 단백질이 지방산 아실화 프로인슐린, 지방산 아실화 인슐린 및 지방산 아실화 인슐린 동족체로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
12. 제 10 항에 있어서, 수용액의 pH를 약 4.0 내지 6.0으로 조정하는 방법.
13. 제 12 항에 있어서, 아실화 단백질이 N-팔미토일 Lys^B29사람 인슐린인 방법.
14. 제 13 항에 있어서, 알콜이 에탄올이고 알콜 농도가 수성 혼합물의 25 부피% 내지 30 부피%가 되는 양으로 첨가되는 방법.
15. (a) 아실화 단백질 수용액의 pH를 단백질의 등전 pH로 또는 그 근처로 조정하고, (b) 상기 아실화 단백질의 수성 조성물 내에 그 pH에서 단백질의 여과가능한 입자 형성을 돕는데 적합한 알콜 농도를 제공한 후, 수성 단백질 조성물의 여과 및 건조에 의해 여과가능한 입자를 침전된 분말로서 회수하는 것을 조합하여 제조된 아실화 단백질 분말.
16. 제 15 항에 있어서, 아실화 단백질이 단백질 수용액으로부터의 등전기적 침전화에 의한 단리에 저항을 보이는 단백질을 포함하는 아실화 단백질 분말.
17. 제 16 항에 있어서, 아실화 단백질이 지방산 아실화 프로인슐린, 지방산 아실화 인슐린 및 지방산 아실화 인슐린 동족체로 이루어진 군으로부터 선택되는 아실화 단백질 분말.
18. 제 17 항에 있어서, 수용액의 pH를 약 4.0 내지 6.0으로 조정하여 제조된 아실화 단백질 분말.
19. 제 18 항에 있어서, 알콜이 에탄올이고 에탄올이 알콜 농도가 수성 단백질 조성물의 25 부피% 내지 35 부피%가 되는 양으로 첨가되어 제조된 아실화 단백질 분말.