CZ388197A3

CZ388197A3 - Způsob přípravy acylovaného proteinového prášku

Info

Publication number: CZ388197A3
Application number: CZ973881A
Authority: CZ
Inventors: Jeffrey Clayton Baker; Brian Allen Moser; Warren E. Shrader
Original assignee: Eli Lilly And Company
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-04
Publication date: 1998-05-13
Also published as: IL122460A0; JP3844504B2; TR199701528T1; ATE263185T1; CA2223389A1; EP0747391A2; NO975583L; DE69631996D1; NZ309371A; WO1996040730A1; EA199800042A1; DK0747391T3; JPH11506738A; CN1192218A; MX9709657A; ES2216039T3; KR19990022590A; BR9608729A; EP0747391B1; HUP9900877A2

Description

Způsob přípravy acylováného proteinového prášku

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu přípravy acylovaného proteinového prášku a je obecně zaměřen na způsob získáni acylovaného proteinu ve formě prášku, obzvláště v případě takového proteinu, který je resistentní vůči pokusům o jeho získání precipitací nebo krystalizací a následnou filtrací z vodného roztoku, speciálně určitých acylovaných proinsulinů, acylovaných insulinů nebo acylovaných insulinových analogů. Vynález se zvláště týká způsobu přípravy sypkého prášku jistých acylovaných proinsulinů, insulinů a insulinových analogů z jejich vodného roztoku.

Dosavadní stav techniky

Již dlouho bylo cílem insulinové terapie napodobovat způsob endogenní insulinové sekrece normálních individuí. Denní fyziologický požadavek na insulin kolísá a může být rozdělen do dvou fází: (a) absorpční fáze, vyžadující insulinový puls k odstranění jídlem zprostředkovaného přebytku krevní glukózy a (b) post-absorpční fáze, vyžadující udržované množství insulinu pro regulaci výstupu hepatické glukózy pro udržováni optimální krevní glukózy na lačno. V souladu s tím účinná terapie obecně zahrnuje použití dvou exogenních insulinů: rychle působící insulin v době jídla podávaný jako bolus injekci a dlouhodobě působící bazální insulin, podávaný injekcí jednou nebo dvakrát denně.

• · · ·

V současné době je pro použiti jako dlouhodobě působící bazální insulinová terapie slibná třída acylovaných insulinů. Tyto acylované insuliny jsou získány acylací, selektivně s derivátem aktivované mastné kyseliny, volné aminoskupiny nebo aminoskupin monomerního insulinu, zahrnujícího proinsulin, normální insulin a jisté insulinové analogy. Obvyklé deriváty mastných kyselin zahrnují reaktivní sloučeniny typu mastných kyselin, které mají uhlíkový řetězec tvořený alespoň šesti (6) uhlíkovými atomy a obzvláště ty deriváty mastných kyselin, které mají 8 až 21 uhlíkových atomů v jejich řetězci. Mono-acylovaný normální lidský insulin, acylovaný deriváty kyseliny palmitové, je obzvláště slibným kandidátem. Insuliny spadající do této kategorie jsou podány v japonské přihlášce vynálezu 1254,699.

Jak je dobře známo odborníkům v oboru, způsoby získávání proteinu v pevné formě, výhodně jako sypký prášek, jsou obzvláště výhodné nebo dokonce základní pro mnoho aplikací.

Příprava proteinu jako prášku skladovací a distribuční nároky, kontextu přípravků, určených pro například minimalizuje To platí obzvláště v insulinovou terapii, u kterých musí být vytvářeny velké objemy látky pro uspokojení požadavků. Naštěstí bylo již před dlouhou dobou zjištěno, že normální insulin, v to počítaje hovězí insulin, vepřový insulin a lidský insulin, může být získán ve formě prášku precipitací nebo přesněji krystalizací insulinu z relativně zředěného vodného roztoku insulinu jako zinkový komplex nebo jako sodné krystaly. Obecně je tak zvaný zinkový insulin krystalizován z pufrovaného vodného roztoku, obsahujícího zinkové ionty a může být snadno isolován filtrací.

• ·

Na neštěstí pokusy získat insulin, acylovaný deriváty mastných kyselin s dlouhým řetězcem, filtrací nebyly tak úspěšné.

Známé pokusy krystalizovat insuliny acylované mastnými kyselinami byly ve skutečnosti obecně neúspěšné.

Bylo postulováno, že hydrofobní charakter složky takových insulinů, představované mastnou kyselinou s dlouhým řetězcem, přispívá k obtížnosti získávání působením, inter alia, na interakci protein-protein, vyžadovanou pro uspokojivé vytváření krystalů. Z toho vyplývá, že musí být nalezeny jiné způsoby přípravy těchto acylovaných insulinů ve formě práškovité pevné látky.

Jeden technicky schůdný přístup přípravy acylovaného proteinu v práškovité formě je lyofilizace vodného roztoku proteinu. I když tímto způsobem mohou být získány práškové formy insulinů, acylovaných mastnými kyselinami, lyofilizační techniky nejsou vhodné pro produkci velkých množství insulinu, které jsou komerčně požadovány. Obzvláště požadavky bezpečnosti obsluhy a zpracování produktu jsou při lyofilizaci ve velkých množstvích velmi problematické.

Jiná potenciální strategie zahrnuje isoelektrickou precipitaci. Je již dlouho známo, že protein ve vodném roztoku se stává méně rozpustným, pokud je pH prostředí upraveno na hodnotu blízkou isoelektrickému bodu proteinu. Tento obecný poznatek byl již dlouho používán při purifikaci a získávání proteinů. Pokud jsou jednou insolubilizovány, mohou být takové proteiny získány z výsledné vodné suspense prostým gravitačním zahušťováním nebo vakuovou nebo přetlakovou filtraci.

Naneštěstí naše pokusy získávat insuliny acylované mastnými kyselinami pouhou úpravou pH vodného roztoku acylovaného proteinu na hodnotu blízkou isoelektrickému bodu dávaly kompozice formy emulzí, které byly resistentní vůči jednoduchým separačním metodám tekutiny a pevné látky jako je gravitační zahušťováni nebo vakuová nebo přetlaková filtrace. Jako výsledek vyvstala nutnost nalezení nového způsobu získávání takovýchto druhů acylovaných insulinů ve formě prášku.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se týká jednoduchého způsobu získávání acylovaných formě sypkého prášku insulinů acylovaných proteinů precipitací a filtrací ve a to speciálně v případě jistých mastnými kyselinami, které jsou resistentní vůči takové isolaci při použití precipitace a filtrace. Předkládaný vynález tedy podává způsob získáváni insulinů acylovaných mastnými kyselinami ve formě sypkých prášků z vodného roztoku. Předkládaný vynález se obzvláště týká způsobu získávání práškovitého insulinu acylovaného mastnými kyselinami, který může být snadno přizpůsoben produkčním způsobům výroby relativně velkého množství látky. Předkládaný vynález se také týká práškovitého proteinu, získaného tímto způsobem.

Všechna označení aminokyselin, použitá v této přihlášce vynálezu, jsou označeni akceptovaná United States Patent and

Trademark Office, jak je popsáno v 37 C.F.R. § 1.822 (B) (2) .

·· ····

Výraz „insulin nebo „normální insulin zde představuje obvyklý lidský insulin, vepřový insulin nebo hovězí insulin. Insulin obsahuje tři volné aminoskupiny: B¹ - fenylalanin, A¹- glycin a B²⁹ - lysin. Volné aminoskupiny v polohách A¹ a B¹jsou α-aminoskupiny. Volná aminoskupina v poloze B²⁹ je εaminoskupina.

Výraz „proinsulin, tak jak je zde užíván, je vhodně křížově disulfidově vázaný protein obecného vzorce:

B - C - A kde:

A je A řetězec insulinu nebo jeho funkční derivát,

B je B řetězec insulinu nebo jeho funkční derivát, obsahující ε-aminoskupinu, a

C je spojující peptid proinsulinu. Výhodně je proinsulin tvořen A řetězcem lidského insulinu, B řetězcem lidského insulinu a C je přirozený spojující peptid. Pokud je proinsulin přirozená sekvence, proinsulin obsahuje tři volné aminoskupiny: fenylalanin(1) (α-aminoskupina) , lysin(29) (εaminoskupina) a lysin(64) (ε-aminoskupina) .

Výraz „insulinový analog, tak jak je zde používán, je vhodně křížově vázaný protein, vykazující insulinovou aktivitu a mající obecný vzorec:

A - B • ·· · kde:

A je A řetězec insulinu nebo funkční derivát řetězce A insulinu,

B je B řetězec insulinu nebo funkční derivát řetězce insulinu, obsahující ε-aminoskupinu a alespoň jeden z řetězců A a B obsahuje aminokyselinovou modifikaci přirozené sekvence.

Výhodné insulinové analogy zahrnuji insulin, ve kterém:

aminokyselinový	zbytek	• · 9 O v posici B	je Asp, Lys,	Leu, Val
nebo Ala,
aminokyselinový	zbytek	v posici B²⁹	je	Lys nebo Pro,
aminokyselinový	zbytek	v posici B¹⁰	je	His nebo Asp,
aminokyselinový	zbytek	v posici	B¹	je Phe, Asp	nebo	je
vynechán buď sám nebo	v kombinaci	s vynecháním	zbytku	v
poloze B²,
aminokyselinový	zbytek	v posici	B	³⁰ je Thr,	Ala nebo
vynechán,
aminokyselinový	zbytek	v posici	B⁹	je Ser nebo Asp	za
předpokladu, že	buď B²⁸	nebo B je	Lys

Vyjádřeno standardním biochemickým způsobem, známým odborníkovi v oboru, výhodné insulinové analogy jsou Lys⁶²⁸Pro^B29-lidský insulin (B²⁸ je Lys, B²⁹ je Pro) , Asp^B28-lidský insulin (B²⁸ je Asp), Asp^B1-lidský insulin, Arg^B31,B32-lidský insulin, Asp^B10-lidský insulin, Arg^A0-lidský insulin, Asp^B1Glu^B13-lidský insulin, Ala^B26-lidský insulin a Gly^A21-lidský insulin.

f ····

Výrazem „acylovaný se mini vloženi jedné nebo více acylovaných skupin, kovalentně vázaných k volné aminoskupině proteinu.

Výraz „mastná kyselina znamená nasycenou nebo nenasycenou mastnou kyselinu s šesti až dvaceti jedním atomem uhlíku. Výraz „aktivovaná mastná kyselina znamená mastnou kyselinu, která byla aktivována použitím obecných technik, jako jsou techniky popsané v Methods of Enzymology, 25:494-499 (1972) a Lapidot a kol., v J. of Lipid Res., 8:142-145 (1967), jejichž poznatky jsou v této přihlášce zahrnuty jako reference. Výhodné mastné kyseliny jsou nasycené mastné kyseliny a zahrnují kyselinu myristovou (C₁₄) , kyselinu pentadecylovou (Ci₅) , kyselinu palmitovou (Ci₅) , kyselinu heptadecylovou (Ci₇) a kyselinu stearovou (C_i8) . Obzvláště výhodná mastná kyselina je palmitová kyselina. Estery aktivovaných mastných kyselin zahrnují deriváty činidel jako jsou hydroxybenzotriazid (HOBT), N-hydroxysukcinimid a jejich deriváty. Výhodná aktivovaný ester je Nsukcinimidylpalmitát.

Výraz „křížová vazba znamená vytváření disulfidových vazeb mezi cysteinovými zbytky. Vhodně křížově vázaný proinsulin, insulin nebo insulinový analog obsahuje tři disulfidové můstky. První disulfidový můstek je vytvořen mezi cysteinovými zbytky v polohách 6 a 11 A-řetězce. Druhý disulfidový můstek spojuje cysteinové zbytky v poloze 7 Ařetězce k cysteinu v poloze 7 B-řetězce. Třetí disulfidový můstek spojuje cystein v poloze 20 A-můstku s cysteinem v poloze 19 B-řetězce.

·· ···· ··

- 8 Výraz „precipitace se vztahuje k procesu, ve kterém jsou v tekutině vytvářeny snadno filtrovatelné částice a který by měl být odlišen od prosté změny rozpustnosti rozpuštěné látky v roztoku, vedoucí k vytváření stabilní suspense a/nebo stavu podobného emulsi směsi dvou fází. Filtrovatelné částice samy o sobě jsou nazývány „precipitát.

Výraz „snadno filtrovatelný a podobné výrazy označují stav, ve kterém částice ve směsi pevné a tekuté látky nebo suspense mohou být isolovány procesem koncové filtrace a podobnými technikami na zpracovatelný filtrační koláč, to jest na materiál s residuálním obsahem vlhkosti, který umožňuje zpracování filtračního koláče jako pevné látky a nikoli jako suspense. V koncové filtraci je přiváděna suspense a filtrační tekutina prochází v zásadě kolmo na rovinu filtru, což je třeba odlišit od filtrace s křížovými nebo tangenciálními toky, ve které je hlavní tok tekutiny rovnoběžný s povrchem filtračního média. Je důležité, že způsob podle vynálezu vytváří suspensi acylovaného proteinu, který může být isolován pomocí koncové filtrace a podobnými technikami se středním nebo průměrným filtračním výkonem přesahujícím 5 l/m²/hod (LMH) a často se středním nebo průměrným filtračním výkonem větším než 20 LMH, přičemž fáze koncové filtrace je normálně místo, kde koláč může být zpracován jako pevná látka. Podobné filtrační výkony jsou kritické pro ekonomické zpracování v komerčním produkčním měřítku.

Výraz „vodný zahrnuje systémy s korozpouštědly stejně tak jako použití samotné vody jako rozpouštědla.

Předkládaný vynález se vztahuje ke způsobu získáváni acylovaného proteinu jako prášku z vodné směsi, obzvláště v případech, kdy acylovaný protein je takový, že je resistentní vůči isolaci isoelektrickou precipitací z vodného roztoku acylovaného proteinu. Způsob zahrnuje upravení vodného roztoku acylovaného proteinu na hodnotu pH, která způsobí že se protein stane nerozpustným a přidání dostatečného množství alkoholu do vodné směsi proteinu, což způsobí precipitací proteinu ve formě filtrovatelných částic při uvedeném pH.

Podle dalšího předmětu vynálezu se vynález týká acylovaného proteinu přeměněného na prášek, obzvláště v případech, kdy acylovaný protein je takový, že je resistentní vůči isolaci isoelektrickou precipitací z vodného roztoku. Vynález se obzvláště týká proinsulinu acylovaného mastnou kyselinou, insulinu acylovaného mastnou kyselinou nebo insulinového analogu prášku, proteinu acylovaného získaných na hodnotu mastnou kyselinou, upravením vodného pH, která způsobí které jsou ve formě roztoku acylovaného že se protein stane nerozpustným a přidání dostatečného množství alkoholu do vodného proteinu, což způsobí precipitací proteinu ve formě filtrovatelných částic při uvedeném pH. Protein proto může být získán ve formě zinku prostého práškového acylovaného proteinu filtrací a sušením. Výhodné acylované proteiny získané v práškové formě způsobem podle předkládaného vynálezu zahrnují N-palmitoyl Lys^B29 lidský insulin a Β28-Ν^εpalmitoyl-Lys^B28Pro^B29-lidský insulin (B28 je acylovaný Lys a B29 je Pro) .

- 10 • · • · · ·

Proinsulin, insulin a insulinové analogy použité k přípravě acylovaných proteinů, které představují hlavní cíl předkládaného vynálezu, mohou být získány libovolným z uznávaných způsobů peptidové syntézy, které zahrnují klasické metody (v roztoku), syntézu v pevné fázi, semisyntetické způsoby a v novější době i rekombinantní DNA způsoby. Jako příklad způsobu výroby různých proinsulinů a insulinových patentovou reference:

analogů je literaturu, Chance a možno které kol. ,

EPO publikace číslo

U:S:

07/388,201,

214 826 a Belagaje a kol., uvést j sou

U.S.

následující odkazy na zde zahrnuty jako přihláška kol., EPO A-řetězec patentová

383 472, Brange a

Patent 5,304,473.

a B-řetězec insulinových analogů podle předkládaného vynálezu také mohou být získány z prekursorových molekul podobných proinsulinu použitím rekombinantních DNA technik. Viz Frank a kol., Peptides: Synthesis-Structure-function,

Proč. Seventh Am. Pept. Symp., D. Rich a E. Gros, Ed.

(1981), které je zde zahrnuta jako reference.

Obecně jsou proinsulin, insulin a insulinové analogy acylovány jejich reakcí s aktivovanými deriváty mastných kyselin, jako jsou aktivované estery mastných kyselin. Acylace normálního insulinu mastnou kyselinou je popsána v Japonské patentové přihlášce 1-254,699. Viz též Hashimoto a kol., Pharmaceutical Research, 6:171-176 (1989). Tyto poznatky jsou zde zahrnuty jako reference.

Acylace je výhodně prováděna za bázických podmínek, to jest při pH vyšším než 9,0 a výhodně okolo 10,5, v polárním rozpouštědle. I když je možné, aby reakce byla prováděna v plně organickém polárním rozpouštědle s použitím báze, která • · má vodné pKa vyšší než nebo rovné 10,75, dáváme přednost smíšenému organickému a vodnému rozpouštědlu pro reakční prostředí. Výhodné báze jsou tetramethylguadinin, diisopropylethylamin nebo tetrabutylammonium hydroxid. Obzvláště vhodné rozpouštědlo je acetonitril a voda, obsahující okolo 50 % acetonitrilu. Mezi další polární rozpouštědla patří dimethylsulfoxid, dimethylformamid a další. Systémy korozpouštědel také zahrnují aceton a vodu, isopropylalkohol a vodu a ethanol a vodu. Časové a teplotní podmínky, vhodné pro provádění reakcí nejsou příliš kritické. Reakční teplota od 0 °C do 40 °C a reakční doba od 15 minut do 24 hodin jsou obecně dostačující. Obzvláště výhodný způsob výroby takových insulinů, acylovaných mastnými kyselinami, je popsán v současně podávané U.S. patentové přihlášce sériového čísla 08/341231, podané 17. listopadu 1994, jejíž poznatky jsou zde zahrnuty jako reference.

Jakmile je reakce ukončena, reakční směs obsahující acylované proteiny je typicky zředěna vodou a je přidána kyselina pro neutralizaci alkalického prostředí. Kyselina je přidávána k acylovanému proteinu jako vodný roztok a slouží ke snížení pH roztoku na hodnotu pod isoelektrickým bodem proteinu. Normálně je v tomto bodě protein v odpovídajícím způsobem pufrovaném roztoku pro další zpracování. Takové zpracování obzvláště zahrnuje čištění standardními chromatografickými metodami jako je chromatografie s obrácenou fází nebo hydrofobní chromatografie, koncentrace pomocí filtrace s křížovými proudy, výměna rozpouštědla ultrafiltrací a podobně. V případě acylovaného proinsulinu, acylovaného insulinu a acylovaných insulinových analogů, • · · · • « • ·

- 12 obzvláště N-palmitoyl-Lys^B29-lidského insulinu a Β28-Ν^εpalmitoyl-Lys^B28Pro^B29-lidského insulinu by pH mělo normálně být upraveno pod asi 3,0 a výhodně mezi zhruba 1,5 a 2,5 použitím kyseliny podle potřeby. Vhodné kyseliny zahrnují kyselinu chlorovodíkovou, kyselinu octovou, glycin a obzvláště kyselinu citrónovou. Bylo zjištěno, že je vhodné použití kyseliny citrónové v koncentraci 50 mM. Jestliže je požadováno, pH také může být upraveno použitím báze jako je hydroxid sodný, aby bylo udrženo v požadovaném rozmezí.

V tomto okamžiku může být vodný roztok isolovaného a výhodně i purifikovaného acylovaného proteinu, výhodně proinsulinu acylovaného mastnou kyselinou, insulinu acylovaného mastnou kyselinou nebo insulinového analogu acylovaného mastnou kyselinou, zpracován způsobem podle předkládaného vynálezu s cílem získat rozpustný protein ve formě prášku. Podle předkládaného vynálezu se pH vodného roztoku proteinu upraví přidáním báze, výhodně vodou rozpustné báze jako je hydroxid sodný, v dostatečném množství, které způsobí, že rozpustný protein se stane nerozpustným. Toho je dosaženo upravením pH roztoku na hodnotu blízkou isoelektrickému bodu acylovaného proteinu, který bude dále označován jako isoelektrické pH. V případě acylovaného proinsulinu, acylovaného insulinu a acylovaných insulinových analogů, obzvláště N-palmitoyl Lys^B29 lidského insulinu a B28-N^E-palmitoyl-Lys^B28Pro^B29lidského insulinu se ukázalo, že vhodná úprava pH je jeho úprava do rozmezí zhruba 4,0 až 6,0 a výhodně zhruba od 4,5 do 5,5. Při tomto pH by čistý náboj na acylovaném proteinu měl být minimální a rozpustnost proteinu by měla být nejmenší. V průběhu úpravy pH by roztok měl být míchán, aby se dosáhlo úplného promísení.

• · · ·

- 13 Vodné roztoky acylovaných proteinů, které jsou obzvláště vhodné pro zpracováni postupem podle předkládaného vynálezu, vytvářejí v okamžiku, kdy je jejich pH upraveno na hodnotu blízkou jejich isoelektrickému pH, kompozici typu emulze. Tento stav je zabraňuje isolaci proteinu použitím separačních technik pevné a tekuté fáze, jako je koncová filtrace, které jsou žádoucí pro zpracování ve velkém měřítku. Klíčová stránka předkládaného vynálezu spočívá v použití alkoholu, obzvláště ethanolu, který je přidán do vodné směsi proteinu a napomáhá vytváření snadno filtrovatelného precipitátu acylovaného proteinu.

Pořadí provedení úpravy pH a přidání alkoholu není kritické. Alkohol může být do proteinového roztoku přidán před úpravou pH na hodnotu požadovanou k insolubilizaci proteinu a konečnému vytváření precipitátu a může také být přidán po úpravě pH proteinového roztoku.

Přihlašovatelé zjistili, že množství alkoholu, který musí být přidán k acylovanému proteinu, aby byl získán snadno filtrovatelný precipitát, leží v úzkém rozmezí. Přihlašovatelé obzvláště zjistili, že v případě insulinu acylovaného mastnou kyselinou, obzvláště v případě Npalmitoyl Lys^B29 lidského insulinu je požadovaného výsledku, to jest vytváření snadno filtrovatelného precipitátu, dosaženou pouze po přidání množství alkoholu, obzvláště ethanolu, které leží v úzkém rozmezí, dávajícím koncentraci alkoholu alespoň zhruba 20 % a nejvýše zhruba 35 % a výhodně zhruba 25 % až 30 % ve vodné suspensi proteinu. I když ethanol je jasně nejvýhodnější volba, další alkoholy, jako • · · ·

- 14 je methanol nebo isopropanol by měly být vhodnými náhradami v jistých situacích.

Přidáním příliš velkého množství alkoholu do vodného proteinu zabraňuje získání přijatelné úrovně vytváření precipitátu, zatímco přidání nedostatečného množství alkoholu neumožňuje adekvátně změnit kompozici ve formě emulse, získanou po úpravě pH acylovaného proteinu, na snadno filtrovatelnou suspensi. Pokud je totiž úroveň přidaného alkoholu příliš vysoká, protein se znovu rozpouští, což přináší možné snížení výtěžku. Určení množství alkoholu, jako je ethanol, potřebného k usnadnění precipitace a filtrace jiných proteinů, acylovaných mastnými kyselinami, může být provedeno rutinním experimentováním.

V souhrnu je proto předkládaný vynález založen na poznání, že k získání acylovaného proteinu, obzvláště takového proteinu, který je resistentní vůči isolaci a získání isoelektrickou precipitací a filtrací z vodného roztoku proteinu, ve formě sypkého prášku, je nutné vytvořit následující kombinaci podmínek: (a) pH rovné nebo blízké isoelektrickému pH proteinu a (b) dostatečná koncentrace alkoholu, která napomáhá precipitací a filtraci proteinu usnadněním tvorby snadno filtrovatelných částic. Jak bylo uvedeno výše, v případě N-palmitoyl Lys^B29 lidského insulinu bylo zjištěno, že obzvláště vhodnou koncentrací pro usnadnění precipitace proteinu ve formě snadno filtrovatelných částic je koncentrace alkoholu alespoň zhruba 20 % a nejvýše zhruba 35 % objemových suspense a výhodně zhruba 25 % až 30 %.

- 15 Způsob ve kterém je vodná směs proteinu připravena tak, aby obsahovala požadovanou koncentraci alkoholu (například ethanolu) a měla isoelektrické pH není kritická. Taková směs může být například vytvořena zředěním pomocí vody vodného roztoku proteinu s upraveným pH, ve kterém je vyšší než požadovaná koncentrace alkoholu, to jest v případě Npalmitoyl Lys^B29 lidského insulinu zředěním ethanolové koncentrace vyšší než 35 % objemových, například koncentrace od 40 % do 45 % ethanolu, na koncentraci alkoholu, která leží v požadovaném rozmezí. Výhodně je kompozice jemně míchána za podmínek, při nichž je koncentrace alkoholu i pH v požadovaných mezích, pro usnadnění vytváření precipitátu.

Koncentrace acylovaného proteinu v roztoku před zpracováním podle předkládaného vynálezu není kritická. V případě acylovaného insulinu, v to počítaje i acylovaný proinsulin a acylované koncentrace mg/ml, hodnotách analogy : alespoň když až přecipitováný přijatelnějším být používány alespoň zhruba koncentrací o insulinu by obecně měly zhruba 1 mg/ml a výhodně používání proteinových mg/ml a vyšších by mělo dávat protein, který může být zpracován s filtračním výkonem. Jako bylo uvedeno výše, proteinová suspense, získaná kombinovaným působením úpravy pH a adicí alkoholu by měla poskytovat průměrný nebo střední filtrační výkon alespoň zhruba 5 LMH a výhodně vykazovat střední filtrační výkon alespoň 15 LMH.

Překvapivě byly při zpracování roztoku N-palmitoyl Lys^B29 lidského insulinu postupem podle předkládaného vynálezu pozorovány střední filtrační výkony zhruba 20 LMH a vyšší.

• ·· ·

- 16 Ačkoliv teplota nemusí být udržována v úzkém kritickém rozmezí, pro nej lepší výsledky by měla teplota v průběhu filtrace udržována v rozmezí od 20 °C do 30 °C. Teplota O °C nebo nižší by ovšem v průběhu filtrace neměla nastat, neboť takové teploty se neslučují s průběhem zpracování při požadovaných vysokých filtračních výkonech. I když filtrace je výhodně prováděna při teplotě okolí, předchozí úprava pH a adice ethanolu mohou být provedeny při libovolné teplotě vyšší než je teplota mrazu suspense.

V uvedeném okamžiku je vodná proteinová kompozice připravena k filtraci, jejímž cílem je isolace precipitovaného proteinu. V některých případech může být výhodné provádět gravitační usazování nebo zahušťování vodné proteinové kompozice nebo suspense před filtrací, aby se omezila hydraulická zátěž filtračního zařízení. I když v případě velkých produkčních měřítek může být výhodná centrifugová filtrace, například v případě produkčních dávek větších než 0,5 kg, je možno pro získání precipitovaného proteinu způsobem podle předkládaného vynálezu použít jakýkoliv způsob separace pevné a tekuté fáze, v to počítaje vakuovou nebo přetlakovou filtraci. Při výrobě v menším měřítku, například pokud jsou výrobní dávky menší než zhruba 0,3 až 0,5 kg, může být výhodnější přetlaková filtrace, používající filtrační zařízení, které má porézní fritový filtrační povrch. Filtrace porézní fritou s nominální velikostí pórů zhruba 0,5 pm se ukázala jako velmi účinná. Zařízení, použité pro filtraci suspense není příliš kritické a je možno použít širokou škálu známých filtračních systémů, slučitelných se zpracováním farmaceutických látek.

- 17 • · · · · ···· • ··· 4 ♦ ♦ · · · ·4 ····«· · 4· ···· 44 44 4444 4444

Po filtraci je filtrační koláč odebrán a sušen, obvykle vakuovým odpařováním. Při postupu podle předkládaného vynálezu může být použita libovolná metoda sušeni zahuštěné pasty pevných látek, která není nějakých způsobem škodlivá pro isolovaný protein. Způsoby získávání filtračního koláče a další metody sušení filtračního koláče jsou zřejmé odborníkům v oboru a nejsou kritické pro provádění způsobu podle vynálezu.

Acylovaný insulinový prášek podle předkládaného vynálezu je vhodný jako farmaceutická surovina (bulk drug substance BDS) pro přípravu farmeceutických přípravků, používaných v insulinové terapii, to jest pro jejich podávání pacientům, kteří mají jejich potřebu (například pacienti, trpící hyperglykemii). Takové farmaceutické přípravky obsahují účinné množství prášku v kombinaci s jedním nebo více farmaceutickými excipienty nebo nosiči. Pro tyto účely mohou být farmaceutické přípravky typicky připraveny tak, aby obsahovaly od 100 jednotek na ml nebo podobné koncentrace účinného množství acylovaného proteinového prášku. Tyto přípravky jsou typicky, i když ne nutně, svojí povahou parenterální a mohou být připraveny některou z množství technik a s využitím konvenčních excipientů nebo nosičů pro parenterální produkty, které jsou dobře známy odborníkům v oboru. Viz například Remington^zs Pharmaceutical Sciences, 17. vydání, Mack Publishing Company, Easton, PA, USA (1985), která je zde zahrnuta jako reference. Dávky pro parenterální podávání mohou být například připraveny suspendováním nebo rozpuštěním požadovaného množství proteinového prášku v netoxickém tekutém vehikulu, které je vhodné pro injekci, jako je vodné médium a sterilizací suspense nebo roztoku.

- 18 Alternativně může být změřené množství prášku umístěno v ampulce, která je potom i se svým obsahem sterilizována a uzavřena. Pro účely smíchání před podáváním může být poskytována doprovázející ampulka.

Farmaceutické přípravky upravené pro parenterální podávání používají ředidla, excipienty a nosiče jako je voda a s vodou mísitelná organická rozpouštědla jako je glycerin, sezamový olej, olej podzemnice olejně, vodný propylenglykol, Ν,Ν-dimethylformamid a podobně. Příklady takových farmaceutických přípravků zahrnují sterilní, isotonické vodné solné roztoky prášku, které mohou být pufrovány farmaceuticky přijatelným pufrem a které jsou nepyrogenní. Parenterální farmeceutické přípravky mohou dodatečně obsahovat konzervační činidla jako je meta-kresol, další činidla pro úpravu pH konečného produktu jako je hydroxid sodný nebo kyselina chlorovodíková a stabilizátory jako jsou soli zinku.

Příklady provedeni vynálezu

Následující příklad je uveden pro ilustraci a vysvětlení vynálezu. I když je vynález ilustrován s využitím Npalmitoyl Lys^B29 lidského insulinu jako prášku, rozsah předmětu vynálezu není omezen na tento příklad. Pokud není uvedeno jinak, všechna odvolání na díly nebo procenta se vztahují k hmotnosti a všechny teploty jsou vyjádřeny ve stupních Celsia.

• · • * • ·

- 19 PŘÍKLAD

Na vodný roztok (8,8 1) Biosyntetického Lidského Insulinu (N-palmitoyl Lys^B29 lidského insulinu), acylovaného mastnou kyselinou a majícího proteinovou koncentraci 50 mg/ml a pH rovné 2,6 se působilo přidáním 530 ml 10 % hydroxidu sodného při teplotě 2-8°C, což zvýšilo pH na 5,7. Po míchání roztoku s upraveným pH, aby se zaručilo dokonalé promíchání, byl přidán absolutní ethanol v množství 0,46 litru na jeden litr roztoku s upraveným pH (až do celkového objemu roztoku 13 acylovaného zbavena vody

1), směs byla jemně míchána, čímž se napomohlo precipitaci insulinu. Suspense acylovaného proteinu byla přetlakovou filtrací na fritě z nerezové oceli s nominální velikostí póru filtrační používán.

výkon byl

Filtrační zhruba koláč roztokem, filtrační se získal

5,0 μ. Pozorovaný střední

LMH. Filtrát nebyl dále potom promýván vodným ethanolu a promytý sušen ve vakuu, čímž Bylo pozorováno, že byl % objemových obsahuj ícím koláč byl odebrán z filtru a prášek, neobsahující zinek.

tento prášek má vynikající skladovací stabilitu jako farmaceutická surovina. V podstatě všechen protein byl získán ve filtračním koláči s velmi malými ztrátami ve filtrátu.

Zásady, výhodná provedení a způsoby provádění předkládaného vynálezu byly popsány s tím, že se ve výše uvedeném popisu zaměřovaly především na proinsulin acylovaný mastnou kyselinou, insulin acylovaný mastnou kyselinou a insulinové analogy acylované mastnou kyselinou, obzvláště na Npalmitoyl Lys^B29 lidský insulin. Vynález, jehož ochrana je zde požadována, však není omezen na výše uvedená provedení, • ·

- 20 která je nutno chápat pouze jako ilustraci, která neomezuje předmět vynálezu. Odborníkem v oboru mohou být provedeny změny a variace, aniž by došlo k vybočení z ducha a rozsahu předkládaného vynálezu, jak je definován v následujících patentových nárocích.

Zastupuj e:

Dr. Otakar Švorčík v.r.

JUDr. Otakar Švorčík advokát

120 00 Praha 2, Hálkova 2

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob získáni acylovaného proteinu jako prášku z vodného roztoku, vyznačující se tím, že zahrnuje upravení pH vodného roztoku proteinu na pH, které způsobí, že se protein v roztoku stane nerozpustným a přidání dostatečného množství alkoholu do vodné směsi proteinu pro usnadnění precipitace proteinu ve formě filtrovatelných částic při uvedeném pH.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedený protein byl acylován derivátem mastné kyseliny.
3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že acylovaný protein obsahuje protein, který je resistentní vůči isolaci isoelektrickou precipitací z vodného roztoku proteinu.
4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že uvedený acylovaný protein je zvolen ze souboru, zahrnujícího proinsulin acylovaný mastnou kyselinou, insulin acylovaný mastnou kyselinou a insulinový analog acylovaný mastnou kyselinou.

• · · · · · • ·

- 22 5.

Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že pH vodného roztoku je upraveno na hodnotu zhruba 4,0 až 6,0.

*

6.

Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že acylovaný protein je N-palmitoyl

Lys^B29 lidský insulin.

Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že alkohol je ethanol, přidaný v množství dávajícím koncentraci alkoholu ve vodné směsi od 20 % do 35 % objemových.

8.

Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že koncentrace alkoholu je od 25 % do

30 % objemových.
9. Způsob získání acylovaného proteinu jako prášku z vodného roztoku proteinu, vyznačující se tím, že zahrnuje kombinaci upravení pH uvedeného vodného roztoku proteinu na hodnotu blízkou isoelektrickému pH proteinu a vytvoření vhodné koncentrace alkoholu pro usnadnění precipitaci proteinu ve formě filtrovatelných částic při uvedeném pH.
10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že acylovaný protein je protein, který je resistentní vůči isolaci isoelektrickou precipitaci z uvedeného vodného roztoku.
11.

Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že acylovaný protein je zvolen ze souboru, zahrnuj ícího proinsulin acylovaný mastnou kyselinou, insulin acylovaný ·· ····

- 23 mastnou kyselinou a insulinový kyselinou.

analog acylovaný mastnou
12. Způsob podle nároku vodného roztoku je upraveno na

10, vyznačující se tím, že hodnotu zhruba 4,0 až 6,0.

PH

13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že acylovaný protein je N-palmitoyl Lys ^B29 lidský insulin. 14 . Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že

alkohol je ethanol, přidaný v množství dávajícím koncentraci alkoholu ve vodné směsi od 25 % do 30 % objemových.
15. Práškový acylovaný protein, vyznačující se tím, že je získán kombinací (a) úpravy pH vodného roztoku acylovaného proteinu na hodnotu rovnou nebo blízkou isoelektrickému bodu proteinu a (b) vytvoření vhodné koncentrace alkoholu ve vodné kompozici uvedeného acylovaného proteinu pro usnadnění vytvářeni fiitrovatelných částic proteinu při uvedeném pH s následujícím získáním fiitrovatelných částic jako precipitovaného proteinového prášku filtrací a sušením vodné proteinové kompozice.
16. Práškový acylovaný protein podle nároku 15, vyznačující se tím, že acylovaný protein obsahuje protein, který je resistentní vůči isolaci isoelektrickou precipitací z uvedeného vodného roztoku.

·· ····
17. Práškový acylovaný protein podle nároku 16, vyznačující se tím, že acylovaný protein je zvolen ze souboru, zahrnujícího proinsulin acylovaný mastnou kyselinou, insulin acylovaný mastnou kyselinou a insulinový analog acylovaný mastnou kyselinou.
18. Práškový acylovaný protein podle nároku

17, vyznačující se tím, že pH vodného roztoku je upraveno na hodnotu zhruba 4,0 až 6,0.
19. Práškový acylovaný protein podle nároku 18, vyznačující se tím, že alkohol je ethanol, ethanol je přidán v množství dávajícím koncentraci alkoholu ve vodné směsi od 25 % do 30 % objemových vodné proteinové kompozice.