PT93057B - Processo para a preparacao de analogos da insulina - Google Patents

Description

ELI LILLY AND COMPANY

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE ANALOGOS DA INSULINA

-2HM}

I

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Cadex* A

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MM] ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, em que A21, B3, B9 , ΒΙΟ, B28 e B29 são aminoácidos; BI, B2, B27 e B30 são aminoáci dos ou estão ausentes; Z é -OH, -NH₂ , -OCH₃ ou -OCH₂CH₃; X é Arg, Arg-Arg, Lis, Lis-Lis, Arg-Lis, Lis-Arg, ou está ausente e Y está presente só quando X está ausente e é Glu ou uma sequência de aminoácidos.

O referido processo consiste, por exemplo em se combinar a cadeia A de um composto de Fórmula (I), com a cadeia B de um composto de Fórmula (I), por formar as pontes dissulfureto adequadas.

-3anSlogos da insulina

O presente invento está relacionado com análogos da insulina modificados na posição de aminoáci do 29 da cadeia B da insulina humana nativa e facultativamente noutras posições. Os referidos análogos da insulina são menos propensos à dimerização ou à auto-associação para formas de peso molecular superior possuindo assim um começo de actividade comparativamente mais rápido e mantendo ao mesmo tempo a actividade biológica da insulina humana nativa.

presente invento proporciona análogos da insulina da fórmula

NH₂

I

Gly ¹

I

Ile ² | cadeia A (I)

Vai ³

Glu ⁴|-S-S-1

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-A-OH \ I

\

His-Leu-Cys-Gly-	-B-B—Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 j 19
| 5 6 7	8
Gin 4 1		Gly 20
1 B 3		| Glu 21
1		c a d e i a B |
B 2 |		a 22 Arg |
1 B 1		Z-Y-X-B—B—B-Thr-Tyr-Phe-Phe-Gly 23

29 28 27 26 25 24

NH₂

onde A21 é alamina, asparagina, ácido aspártico, glutamina, ácido glutâmico, glicina, treonina ou serina; Bl é fenilalanina, ácido aspártico ou está ausente; B2 é valina ou pode estar ausente quando Bl estiver ausente; B3 é asparagina ou ácido aspártico; B9 é serina de ácido aspártico; B10 é histidina ou ácido aspártico; B28 é qualquer aminoácido, B29 é L-prolina, D-prolina, D-hidroxiprolina, L-hidroxiprolina, L-(N-metil-lisina), D-lisina, L-(N-metilarginina) ou D-arginina; B30 é alanina; treonina ou está ausente; Z é -OH, -NH₂, -OCH3 ou -OCH^H^; X é Arg, Arg-Arg, Lis, Lis-Lis, Arg-Lis, Lis-Arg ou está ausente; e Y pode estar presente apenas quando X está presente e, se presente, é Glu ou uma sequência de aminoácido que compreende toda ou parte da sequência -Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Glu-Val-Gli-Gln-Val-Glu-Leu-Gli-Gli-Gli-Pro-Gli-Ala-Gli-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gli-Ser-Leu-Gln-Lis-Arg- e que começa nazGlu do extremo N de tal sequência.

É também devulgado e reivindicado um método de tratamento de hiperglicemia através da administração de uma quantidade eficaz de um análogo da insulina da fórmula I a um doente dela necessitado. Ainda, são divulgadas e reivindicadas composições farmacêuticas contendo uma quantidade eficaz de um análogo da insulina da fórmula I em combinação com um ou mais excipientes farmacêuticamente aceitáveis.

As figuras aqui apresentadas não estão desenhadas exactamente à escala.

Figura 1 - Um mapa dos sítios de restrição e funções do plasmídeo pKC283.

Figura 2 - Um mapa dos sítios de restrição e funções do plasmídeo pKC283PX.

Figura 3 - Um mapa dos sítios de restrição e funções do plasmídeo pKC283 -L,.

-5Figura 4 - Um mapa dos sítios de restrição e funções do plasmídeo pKC283-LB.

Figura 5 - Um mapa dos sítios de restrição e funções do plasmídeo pKC283-PRS.

Figura 6 - Um mapa dos sítios de restrição e funções do plasmídeo pL.32.

Figura 7 - Um mapa dos sítios de restrição e funções do plasmídeo pNM789.

Figura 8 - Um esquema do protocolo de construção do plasmídeo 120.

Figura 9 - Um mapa dos sítios de restrição e funções do plasmídeo pL47.

Figura 10 - Um mapa dos sítios de restrição e funções do plasmídeo pPR12.

Figura 11 - Um mapa dos sítios de restrição e funções do plasmídeo pPRl2ARl.

Figura 12 - Um mapa dos sítios de restrição e funções do plasmídeo pLllO.

Figura 13 - Um protocolo esquematizado da construção do plasmídeo pLUOC.

Figura 14 - Um mapa dos sítios de restrição e funções do plasmídeo pCZR126S.

Figura 15 - A sequência de nucleotídeos do gene sintético da proinsulina humana.

Figura 16 - Um mapa dos sítios de restrição e funções do plasmídeo pRBl45.

Figura 17 - Um mapa dos sítios de restrição e funções do plasmídeo pRB164A.

Figura 18 - Um mapa dos sítios de restrição e funções do plasmídeo pRBl76.

Figura 19 - Um mapa dos sítios de restrição e funções do plasmídeo pRBl73.

Figura 20 - Um mapa dos sítios de restrição e funções do plasmídeo pRBl75.

A Fórmula I é uma representação abreviada da sequência de aminoácidos dos análogos da insulina do presente invento. As abreviaturas doa aminosácidos têm os seguintes significados convencionais.

Abreviatura

Aminoácido

Aba

Ala

Arg

Asn

Asp

Cya

Cys

Gin

Ácido (X-aminobutírico

Alanina

Arginina

Asparagina

Ácido aspártico Ácido cisteico

Cisteina

Glutamina

Glu	Ácido Glutâmico
Gly	Glicina
His	Histidina
Ile	Isoleucina
Leu	Leucina
Lys	Lisina
Met	Metionina
Nle	Norleucina
Nva	Norvalina
Orn	Ornitina
Phe	Fenilalanina
Pro	Prolina
Ser	Serina
Thr	Treonina
Trp	Triptofano
Tyr	Tirosina
Vai	Valina

Β28 pode ser qualquer aminoácido natural ou não natural. De preferência, o referido aminoácido é ácido aspártico, valina, leucina, isoleucina, norleucina, prolina, arginina, histidina, citrulina, ornitina, lisina fenilalanina, alanina ou glicina. Dos aminoácidos atrás referidos é particularmente preferido o subgrupo constituído por ácido aspártico, valina, leucina, isoleucina, norleucina, pro lina, arginina, histidina, ormitina ou lisina. Para B28 o ami noácido mais preferido é lisina. B29 é de preferência L-proli na, D-prolina, D-hidroxiprolina ou L-hidroxiprolina. Um análogo da insulina particularmente preferido do presente invento é um em que B28 é lisina e B29 é prolina, i.e., uma inver-8são da sequência de aminoácidos da insulina humana nativa nas posições 28 a 29 da cadeia B.

Numa outra realização, conforme referido atrás quando B28 é L-prolina, então a posição B29 é de preferência L-(N-metil-lisina), D-lisina, L-(N-metilarginina) ou D-arginina. Um análogo preferido desta realização é aquele em que B28 é L-prolina e B29 é L-(N-metil-lisina) ou D-lisina.

Outras modificações dos análogos da insulina do presente invento também são aqui contemplados, i.e., modificações dos análogos da insulina noutras posições além de B28 e B29. Especificamente pode ser desejável substituir facultativamente o resíduo Asn da posição 21 da cadeia A (i.e., o extremo carbonilo) com Ala, Asp, Gin, Glu, Gli, Tre ou Ser e se assim for substituído de preferência Ala. De modo semelhante pode ser desejável substituir o resíduo Asn na posição 3 da cadeia B com ácido aspártico (Asp). Tais substituições facultativas têm o efeito de aumentar a estabilidade dos análogos a pH extremos uma vez que Asn é particularmente sensível a reacções de rearranjo tanto a pH baixo como alto. Os familiarizados com a matéria verão fácilmente que os resíduos glutamina dos análogos da insulina podem de modo semelhante ser sensíveis à desamidação é rearranjo. Assim, a substituição por ácido glutâmico está também dentro do âmbito do presente invento. Em adição, modificações facultativas dos análogos da insulina do presente invento incluem (em qualquer combinação) substituição do resíduo de histidina na posição B10 com o aminoácido ácido aspártico; substituição do resíduo fenilalanina na posição Bl com ácido aspártico, substituição do resíduo treonina na posição B30 com alanina, substituição do resíduo serina na posição B9 com ácido aspártico; deleção dos aminoácidos na posição Bl (des-Bl) sozinha ou sem combinação com uma deleção na posição B2 (des-B2); e delecção da treonina da posição B-30 (des-B30).

Os análogos da insulina deste invento podem também ser modificados no extremo B32 através da adição de qualquer um dos aminoácidos ou dipeptídeos que se seguem: Arg, Arg-Arg, Lis, Lis-Lis, Arg-Lis ou Lis-Arg. Estes quando presentes são designados na Fórmula I pelo grupo X. De preferência, quando tal extensão está presente é Arg-Arg.

Em adição se existir a extensão anterior em B30 , o análogo pode ainda ser modificado através da adição no extremo alongado B30 resultante do ácido glutâmico (Glu) ou de uma sequência de aminoácidos compreendendo toda ou parte da sequência -Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gli-Gln-Val-Glu-Leu-Gli-Gli-Gli-Pro-Gli-Ala-Gli-Ser-Leu-Glu-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gli-Ser-Leu-Gln-Lis-Arg-, cuja sequência começa no seu Glu do extremo N. Este aminoácido ou sequência de aminoácidos quando presente, é designado na Fórmula I pelo grupo Y. Quando a sequência representa apenassuma fracção da anterior, será qualquer uma das fracções que começam no extremo N da sequência, i.e., no resíduo de ácido glutâmico (Glu).

No que foi dito atrás, X ou a com binação de X e Y representa toda ou uma parte do peptídeo de ligação na proinsulina humana, uma molécula que é o precursor biológico na formação da insulina humana nativa.

-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-GluLeu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-AlaLeu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-;

-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-GluLeu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-AlaLeu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-;

-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-GluLeu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-AlaLeu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-;

-10-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-GluLeu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-AlaLeu-Glu-;

-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-GluLeu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-; and

-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-.

Em adição, quando X sozinho ou X e Y em conjunto estão presentes ou ausente, o grupo Z do extremo pode ser qualquer um dos seguintes: -OH, -NH^ , -OCH^ ou

De preferência Z é OH.

Conforme aqui foi mencionado, o invento inclui sais farmaceuticamente aceitáveis dos análogos da insulina. Tais sais preferidos são os de zinco, sódio, potássio, magnésio ou cálcio.

Os análogos da insulina deste invento podem ser preparados por qualquer uma de uma variedade de técnicas de sintese de peptídeos reconhecidas incluindo os métodos clássicos (solução), métodos em fase sólida, métodos semi-sintéticos e os métodos mais recentemente disponíveis de DNA recombinante.

Na técnica de fase sólida, a sequência de aminoácidos é construída sequencialmente a partir de um aminoácido inicial, C-terminal ligado a uma resina insolúvel. As técnicas para o método da fase sólida estão descritas por J. Stewart et al., Solld-Phase Peptide Synthesls Freeman and Co., San Francisco, 1965.

-11Em geral, no método de fase sólida, o aminoácido correspondente ao resíduo aminoácido C-terminal do peptídeo pretendido está ancorado a um suporte de resina insolúvel e a cadeia peptídica é então formada começando no aminoácido C-terminal ancorado â resina. Os aminoácidos individuais são introduzidos sequenciadamente até se obter a sequência de aminoácidos pretendida. Como alternativa, podem ser preparados fragmentos peptídicos pequenos e introduzidos na cadeia peptídica na ordem desejada. A cadeia peptídica permanece ligada à serina ao longo da sintese e guando estiver completada a cadeia, o peptídeo é clivado da resina.

A cadeia peptídica é ligada à resina polistireno através de uma ligação éster formada entre o grupo carbonilo da fracção C-terminal e o grupo metileno específico presente na matrix resina como sítio de tal ligação.

Os aminoácidos são acoplados usando técnicas bem conhecidas para a formação de ligação peptídica. Um método envolve conversão do aminoácido num derivado que tornará o grupo carboxilo mais suscéptivel à reacção com o grupo amina livre N-terminal do fragmento peptídico. Por exemplo, o aminoácido pode ser convertido num anidrido misto através da reacção de um aminoácido protegido com cloroformato de etilo, cloroformato de fenilo, sec-rbutil-clorof ormato ou cloroformato de isobutilo. Como alternativa, o aminoácido pode ser convertido num éster activo como seja um éster de 2,4,5-triclorofenilo, um éster de pentaclorofenilo, um éster de £-nitrofenilo, um éster de N-hidroxi-succinimida ou um éster formado a partir de 1-hidroxibenzotriazol.

Um outro método de acoplamento· envolve a utilização de um agente de acoplamento adequado, tal como Ν,N'-diciclo-hexilcarbodiimida (DCC) ou Ν,N'-diisopropilcarbodiimida (DIC). Outros agentes de acoplamento adequados serão óbvios para os familariazados com a matéria, Ver Schroder e Lubke, The Peptides, Academic Press, 1965, Capítulo III que

-12aqui é incluído como referência.

Deverá ser reconhecido que o grupo ζΛ-amino de cada aminoácido empregue na síntese de peptídeos deve ser protegido durante a reacção de acoplamento para evitar reacções secundárias envolvendo a função reactiva <x-amino. Deverá também ser reconhecido que certos aminoácidos contêm grupos funcionais de cadeias reactivas (e.g. sulfidrilo, £.-amina, p- e ^-carbonilo, imidazolilo, guanido e hidroxilo) e que tais grupos funcionais devem ser também protegidos durante os passos de acoplamento iniciais e subsequentes. Dentro da área são conhecidos grupos protectores adequados. Ver por exemplo, Protective Groups in Organic Chemlstry, M. McOmie Editor, Plenum Press, N.Y., 1973 e Patente U.S. 4.617.149 que aqui é incluido como referência.

Ao seleccionar-se um grupo protector particular devem ser observadas certas condições. Um grupo protector de cX-amina (1) deve tornar inerte a função c<-amina nas condições empregues na reacção de acoplamento, (2) deve ser fácilmente removido após a reacção de acoplamento nas condições que não permitem a remoção de grupos protectores de cadeias laterais e não alteram a estrutura do fragmento peptídico e (3) deve eliminar a possibilidade de racemização quando da activação imediatamente antes do acoplamento. Um grupo protector de cadeia lateral (1) deve tornar iner te o grupo funcional das cadeias laterais nas condições empregues na reacção de acoplamento, (2) deve ser estável nas condições empregues na remoção do grupo protector </-amina e (3) deve ser fácilmente removível após completado a sequência do aminoácido pretendido nas condições de reacção que não alterarão a estrutura da cadeia peptídica.

Será óbvio para os familiarizados com a matéria que os grupos protectores conhecidos como úteis para a síntese de peptídeos variarão na reactividade com os agentes empregues na sua remoção. Por exemplo, certos grupos

protectores tais como trifenil-metilo e 2-(o-bifenil)isopropiloxicarbonilo são muito sensíveis e podem ser clivados em condições ácidas suaves. Outros grupos protectores, tais como t-butiloxicarbonilo , t-aminoxicarbonilo , adamantiloxicarbonilo e £-metoxibenziloxicarbonilo são menos sensíveis e requerem ácidos moderadamente fortes, tais como trifluoroacético, clorídrico ou trifluoreto de bóros em ácido acético, para a sua remoção. Ainda outros grupos protectores, tais como benziloxicarbonilo, halobenziloxicarbonilo, £-nitrobenziloxicarbonilo, cicloalquiloxicarbonilo e isopropiloxicarbonilo são mesmo menos sensíveis e requerem ácidos mais fortes, tais como fluoreto de hidrogénio, brometo de hidrogénio ou trifluo roacetato de bóron em ácido trifluoroacético para a sua remoção .

Após completada e sequência peptídica pretendida, o peptídeo protegido deve ser clivado do suporte de resina e todos os grupos protectores devem ser removidos. A reacção de clivagem e remoção dos grupos protectores pode ser conseguida em simultâneo ou em passos separados. Quando o suporte de resina é uma resina polistireno clorometilada, a ligação de ancoragem do peptídeo à resina é uma ligação éster formada entre o grupo carboxilo livre da fracção C-terminal e um dos muitos grupos clorometilo presentes na matrix de resina. Será reconhecido que a ligação de ancoragem pode ser clivada por reagentes que se sabe serem capazes de quebrarem uma ligação éster e de penetrarem na matrix de resina. Um método especialmente conveniente é por tratamento com fluoreto de hidrogénio líquido anidro. Este reagente não só clivará o peptídeo da resina como também removerá todos os grupos protectores. Portanto, a utilização deste reagente dará directamente o peptídeo totalmente desprotegido. Quando se pretende clivar o peptídeo sem remover os grupos protectores o peptídeo-resina sofrem metanólise para dar o peptídeo protegido em que o grupo carbonilo C-terminal está metilado.

éster de metilo pode então ser hidrolizado em condições alcalinas suaves para dar o carbonilo C-terminal livre. Os gru-14-

pos protectores na cadeia peptídica podem então ser removidos por tratamento com um ácido forte, como seja fluoreto de hidrogénio líquido. Uma técnica particularmente útili na metanólise é a de G. Moore et al., Peptides, Proc. S^r Amer. Pept. Symp., M. Goodman and J. Meienhofer, Eds., Jonh Wiley, N.Y., 1977, pág. 518-521, em que o peptídeo protegido-resina é tratado com metanol e cianeto de potássio na presença de um éter em corsa.

□m outro método para a clivagem do peptídeo protegido da resina é por aminólise ou por tratamento com hidrazina. Caso se pretenda, a amida ou hidrazida C-terminal resultante pode ser hidrolizada para dar o carbonilo C-terminal livre e os grupos protectores podem ser removidos convencionalmente.

Será também reconhecido que o grupo protector presente no grupo (X-amino N-terminal pode ser removido preferencialmente antes ou quando da clivagem do peptídeo protegido do suporte de resina.

As cadeias A e B dos análogos da insulina do presente invento podem ser também preparadas via metodologia de DNA recombinante. Na sua preparação, prepara-se uma sequência de nucleotídeos codificadores do peptídeo pretendido da cadeia A ou B usando técnicas de rotina para tal síntese. Estes métodos geralmente envolvem a preparação de oligonucleotídeos codificadores de ambos os fragmentos da sequência codificadora pretendida e da sua cadeia complementar. Os oligonucleotídeos foram projectados de modo a dar sobreposição de um fragmento da cadeia codificadora com dois fragmentos da sequência complementar e vice-versa. Os aligonucleotídeos foram emparelhados e ligados, dando a sequência de gene pretendida.

A sequência foi inserida num vector de clonagem numa localização que permite a expressão do

produto peptídico que ele codifica. Um vector de clonagem adequado contem pelo menos uma fracção de uma sequência de controle da expressão do gene.

As cadeias A e B dos análogos de insulina do presente invento podem ser também preparadas através de uma molécula precursora tipo pro-insulina usando técnicas de DNA recombiante. Ver Frank et al., Peptides: Synthesis-Structure-Function, Proc. Seventh Am. Pept. Symp., Eds.

D. Rich e E. Gross (1981) que aqui é incluído como referência.

O passo de combinação das cadeias A e B individuais pode ser conseguido pelo método de Chance et al., Peptides: Synthesis, Structure and Function: Proc. of Seventh American Peptide Symposium (1981) que aqui é incluído como referência.

Os exemplos que se seguem são proporcionados como um meio de ilustrar o presente invento e não são encarados como uma limitação dele.

EXEMPLO 1

Insulina Humana Lis(B28), Pro(B29)

A. Preparação da cadeia A recombinante e derivada

Preparou-se a cadeia A da insulina humana via tecnologia de DNA recombinante a partir da síntese química do gene codificador da cadeia A e sua expressão

-16em E. Coli. Resumidamente, o gene da cadeia A foi sintetizado a partir de vários trinucleotídeos em fragmentos sintéticos, deca a pentadecanucleotídeos de comprimento, através de um método de blocos fosfotriéster. 0 gene tinha extremos coesivos de cadeia simples para as endonucleases de restrição Eco RI e Bam HI. A sua inserção num vector de expressão adequado conten do o gene da p-galactosidase (p-gal ) originou um plasmídeo quimérico tendo a cadeia A ligada ao gene p-gal via codão metiomina. De preferência, o gene da triptofeno-sintetase (Trp LE') é usado como promotor em vez do gene p-gal para se conseguir níveis elevados de expressão. O plasmídeo quimérico foi usado para transformar E.. coli resultando na expressão de uma proteína precurssora, i.e., B-gal-met-cadeia A (ou Trp LE ’ -met-cadeia A quando se usa o sistema promotor trp LE'). 0 tratamento da proteína precursora com brometo de cianogénio clivou a ligação da metionona para se obter, após purificação, a cadeia A da insulina humana. A sulfitólise oxidativa tornou a cadeia A S-sulfonada a qual foi utilizada para combinação com a cadeia B (S-sulfonada) como descrito, infra.

Para detalhes completos sobre a síntese química dos genes da cadeia A da insulina humana ver Crea et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. (JSA, 75, 5765-5769, 1978 e referências nele citadas que aqui são incluida3 como referência. Para detalhes completos da expressão em E. coli do gene obtido por síntese química para a cadeia A da insulina humana ver Goeddel et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 76, 101-110, 1979 e referências nele citadas que aqui são incluídas por referência.

B. Proparação do Análogo da Cadeia B /Ly^s (28), Pro (B29)7

Usou-se um sintetizador de peptídeos Applied Biosystems 430A (incluindo revisão de software 1.4) para preparar uma resina peptidilica bruta. Usou-se 0,5

-17milimoles (mmol) da resina de partida para fase sólida (resina t-BOC-Tre(Bzl)OCH₂ Pam) (0,76 mMol/g x 0,658 g). Todos os aminoácidos usados estavam protegidos com BOC e excepto o ácido glutâmico e histidina, todos eles foram usados directamente como recebidos (i.e. em cassetes da Applied Biosystem, Inc., cada cassete contendo aproximadamente 2 mmol de aminoácido protegido). O ácido glutâmico e a histidina foram adquiridos à Peptides International Corporation e transferidos para cassetes de tal forma que cassete contivesse aproximadamente 2 mmoles do aminoácido protegido pretendido. Após secagem da resina peptidica bruta (sob vácuo, à temperatura ambiente, durante a noite) determinou-se o seu peso e comparou-se com o peso de partida para assegurar um ganho de peso razoável. Uma pequena fracção de amostra foi submetida a análise de aminoácidos para assegurar que os aminoácidos pretendidos eraà adicionados nas quantidades corretas.

O peptídeo foi clivado da resina peptidilica e desprotegidas as cadeias laterais por agitação durante aproximadamente uma hora a 02C numa solução de 10 partes (v/p) HF (contendo 5% v/v de etil-mercaptano e 5% v/v de m-cresol) para 1 parte de resina peptidilica. Após remoção da maior parte do HF com vácuo, o peptideo foi precipitado em éter etílico. Após várias lavagens com éter etílico seguido de filtração sob vácuo o peptídeo foi dissolvido em aproximadamente 200 ml de ureia 7M desionizada contendo 0,1M TRIS,

0,lM Na₂SC>3 e0,01M Na₂S₄O^. A solução foi ajustada a pH 8,5 com 5M NaOH e deixada a agitar vigorosamente durante a noite a 42C.

A solução resultante de peptídeos

S-sulfonados foi aplicada numa coluna de 5 x 125 de Sephadex G-25 (Fine) à temperatura ambiente. A amostra foi eluida a 20 ml/min à temperatura ambiente usando bicarbonato de amónio 50 mM. O efluente foi controlado a 276 um. Colheram-se fracçóes de 20 ml e fez-se um conjunto das fracções pretendidas que ainda foi purificado por cromatografia liquida de alta

-18resolução (HPLC) como se segue.

O conjunto das fracções pretendidas foi bombeado para uma coluna de HPLC 9-12 u de 2,5 x 30 cm Dupont C8 e eluido usando um gradiente linear de concentração crescente de acetonitrilo em bicarbonato de amónio 100 mM à temperatura ambiente (2,6 ml/min). 0 afluente foi controlado a 200 nm. Colheram-se fracções de 25 ml. As análises por HPLC analítica para efectuar em fracções seleccionadas para determinar quais as fracções a reter. As fracções pretendidas foram reunidas e liofilizadas e usada na combinação seguinte com a cadeia A preparada como descrito abaixo.

C. Preparação de Insulina Humana Ly (B2B), Pro (1329)

A combinação da cadeia A e B foi conseguido pelo processo de Chance et al., supra 700 mg de S-sulfonato da cadeia A derivada de DMA recombinante e 140 mg de S-sulfonato da cadeia B sintética Lys(B28), (B29) (ambas obtidas como descrito atrás) foram dissolvidas em 70 ml e 14 ml, respectivamente, de tampão glicina 0,lM à temperatura ambiente, cada um ajustado a pH 10,5 com NaOH 5N e depois arrefecidos até 52C. Preparou-se 6 ml de uma solução de ditio treitol (DTT) a 10,5 mg/ml em tampão glicina 0,1 M à temperatura ambiente para um pH de 10,5 com 5N NaOH e depois arrefeceu-se até 52C.

As soluções da cadeia A e B foram combinadas em seguida adicionou-se rápidamente 5,21 ml de solução de DTT (SH/SSO3 = 0,90). A solução de reacção foi agita da a 52C num frasco de centrífuga de vidro de 200 ml aberto durante 2,5 horas a 52C. Adicionou-se 45 ml de ácido acético glacial e a solução foi deixada a 52C durante a noite.

-19A mistura precipitada resultante foi centrifugada durante 20 minutos a 2000 rpm a 52C. 0 sobrenadante foi combinado com uma lavagem do sedimento com ácido acético IM e colocado numa coluna de 5 x 200 cm com Sephadex G-50 (superfine) em ácido acético 1 molar a 5QC e eluido por gravidade. Colheram-se fracções de 20 minutos durante três dias. As fracções foram examinadas a 276 nm e algumas por HPLC analítica. As fracções contendo a seguência Lys (328) Pro(B29) do análogo da insulina foram reunidas e liofilizadas dando uma amostra de 125 mg. Esta amostra foi ainda purificada por HPLC de fase reversa (usando uma coluna de 2,12 x 25 cm Dupont C8 eluida à temperatura ambiente a 2,5 ml/min., usan do um gradiente linear de acetonitrilo crescente em 0,lM NaH₂PO^, pH 2,2). 0 efluente foi controlado a 276 nm. As fracções seleccionadas foram testadas por HPLC analítica. As fracções pretendidas foram reunidas e ainda purificadas usando HPLC a pH 7 como se segue.

O conjunto de fracções da corrida preparativa de HPLC a pH baixo foi eluido aproximadamente 2 vezes num banho de gelo com 0,1 Μ (NH^^HPO^. O pH foi ajustado a 7 com NaOH 2M frio num banho de gelo. A amostra foi aplicada e eluida da mesma coluna de HPLC usando as mesmas condições da corrida preparativa de pH baixo exceptuando o tampão de eluição que foi 0,1 M (NH^^HPO^ pH7/acetonitrilo.

O conjunto de fracções da corrida preparativa em HPLC a pH 7 foi arrefecido num banho de gelo e diluido duas vezes com ácido trifluoroacético (TFA) aquoso a 0,1%. Adicionou-se HC1 IN (frio, amostra em banho de gelo) para baixar o pH até 3. A amostra foi aplicada numa coluna de HPLC Vydac C4 ou, como alternativa, Dupont C8 (2,12 x 25 cm) e eluida com um gradiente linear de acetonitrilo crescente em TFA aquoso a 0,1%. O efluente foi controlado a 214 nm ou a 276 nm. As fracções pretendidas foram reunidas e liofilizadas dando um rendimento de 41 mg do análogo pretendido com uma percentagem de pureza superior a 97 por cento por HPLC em fase

-20reversa.

EXEMPLO 2

Insulina Humana Lis(B28), Pro(B29)

Um segundo método para a prepara ção de insulina humana Lis(328) Pro(329) empregou a semi-síntese enzimática (proteólise reversa) para combinar insulina desocapeptídica ~ ^Sl-22^{com um octa}P^eP^tddeo sintético.

A insulina desoctapeptidica foi obtida a partir de uma diges tão triptica de insulina porcina ou humana natural como descr_i to por Bromer e Chance, Preparation and Characterization of Desoctapeptide-Insulin, Biochem. Biophys. Acta, 133:219-223 (1967) que aqui é incluído como referência. O octapeptídeo sintético, Gli-Fen-Fen-Ter-Tre-Lis-Pro-Tre, foi preparada por síntese automática em fase sólida como descrito atrás.

Insulina desocapeptídica (435 mg) e 465 mg de Gli-Fen-Fen-Ter-Tre-Lis-Pro-Tre sintética foram combinadas em 15 ml de uma solução contendo 1 parte de dimetilsulfóxido, 2 partes de 1,4-butanediol e 1 parte de tampão tris-ecetato 0,255 M pH 7,3. Os peptideos foram completamente dissolvidos através do aquecimento da solução numa placa quen te. A solução foi então incubada a 372C e adicionou-se 90 mg de tripsina de porco. A solução foi agitada ocasionalmente durante 90 minutos a 372C. A reacção foi parada por combinação da solução com 135 ml de 0,05N HC1.

O análogo da insulina do título foi purificado através da aplicação da solução adidificada

contendo o análogo numa coluna de HPLC Zorbax C-8 de 2,5 x 25 cm e eluindo-a com um gradiente linear de acetonitrilo crescente em tampão fosfato de sódio monobásico O,1M a pH 2,2. 0 efluente foi controlado a 276 nm. As fracções pretendidas foram reunidas, diluidas duas vezes com água e aplicadas numa coluna de HPLC Ultrasphere C-8 de 1 χ 25 cm. 0 análogo foi eluido com um gradiente linear de acetonitrilo crescente em TFA aquoso a 0,5%. 0 efluente foi controlado a 276 nm. As fracções pretendidas foram novamente reunidas e liofilizadas para dar 125 mg do análogo purificado. A estrutura foi purifjL cada por análise de aminoácidos (Tabela I) e espectroscopia de massa (MS).

MS: 5809.2 (Teoria: 5808.7)

Bombardeamento com átomos rápidos - A análise por estetroscopia de massa aqui apresentadas foram determinadas usando um espectrómetro de massa de dupla focagem VG-ZAB-25E a uma resolução de aproximadamente 1500.

Os análogos da insulina humana foram dissolvidos numa mistura de glicerol e triglicerol contendo ácido oxálico. Usou-se iodeto de césio para calibrar o instrumento que foi varrido magneticamente de m/z 5300 a m/z 6500. Os dados resultantes estão apresentados como massa média + 1.

EXEMPLO 3

Insulina Humana Aba(B28), Pro(329)

Insulina de porco desoctapeptidica (384 mg) e o octapeptideo sintético Gli-Fen-Fen-Ter-Tre-Aba-22-

-Pro-Tre (362 mg) foram combinadas em 13 ml de uma solução contendo uma parte de dimetilsulfóxido, duas partes de 1,4-butanediol e uma parte de tampão Tris 0,25M pH 7,3 a 37SC. Adicionou-se tripsina de porco (75 mg). A solução foi bem misturada e agitada ocasionalmente durante 120 min. a 37QC.

A reacção foi parada nesta altura através da adição da mistura a 137 ml de 0,05í£ HC1. Toda a solução foi bombeada para uma coluna Zorbax C-8 de 21 X 250 mm e os produtos foram eluidos num gradiente côncavo de acetonitrilo em tampão fosfato de sódio monobásico 0,1Í4, pH 2.

As fracções adequadas, conforme determinado por HPLC analítica foram reunidas, diluídas duas vezes com água e bombeadas para uma coluna Vydac C-18 de 25 x 300 mm. A proteína sem sal foi eluida da coluna com um gradiente de acetonitrilo em ácido trifluoroacético a 0,5%. As fracções contendo o análogo da insulina purificado foram reunidas e liofilizadas para dar 59 mg. A estrutura foi verificada por análise de aminoácidos (Tabela I) e espectroscopia de massa (MS ) .

MS: 5765,7 (Teoria: 5765,6).

EXEMPLO 4

Insulina humana Ala(B28), Pro(B29)

Insulina de porco desoctapeptídica (250 mg) e o octapeptideo sintético G1 i-Fen-Fen-Tir-Tre-Ala-Pro-Tre (310 mg) foram combinados em 10 ml de uma solu-23ção contendo uma parte de dimetilsulfóxido, duas partes de

1,4-butanediol, e, uma parte de tampão Tris 0,25 M_ pH 7,3 a 372C. Adicionou-se tripsina de porco (60 mg). As soluções foi bem misturada e agitada ocasionalmente durante 60 min. a 37SC.

A reacção foi parada nesta altura pela adição da mistura a 90 ml de 0,05fJ ACI. Toda a solução foi bombeada para uma coluna Zorbax (-8 de 21 x 250 mm e os produtos foram eluidos num gradiente côncavo de acetonitrilo em fosfato de sódio monobásico 0,lN1, pH 2.

As fracções adequadas, conforme determinado por HPLC analítica, foram reunidas, diluídas duas vezes com água e bombeadas para uma coluna Ultrasphere C-8 de 10 x 250 mm. A proteina sem sal foi eluida da coluna com um gradiente de acetonitrilo em ácido trifluoroacético a 0,5%. As fracções contendo o análogo da insulina purificado foram reunidas e liofilizadas para dar 43 mg. A estrutura foi verificada por análise de aminoácidos (Tabela I) e espectroscopia de massa (MS).

MS: 57523 (Teoria: 5751.6).

EXEMPLO 5

Insulina humana Arg(Ô28), Pro(B29)

Insulina de porco desoctapeptídica (290 mg) e octapeptídeo sintético Gli-Fen-Fen-Tir-Tre-Arg-Pro-Tre (310 mg) foram combinados em 10 ml de uma solução contendo uma parte de dimetilsulfóxido, duas partes de 1,4-24-butanediol e uma parte de tampão Tris 0,25M, pH 7,3 a 37CC. Adicionou-se tripsina de porco (60 mg). A solução foi bem mis turada e agitada ocasionalmente durante 60 min. a 372C.

A reacção foi parada nesta altura pela adição da mistura a 90 ml de 0,05N HC1. Toda a solução foi bombeada para uma coluna Zorbax C-8 de 21 x 250 mm e os produtos foram eluidos num gradiente côncavo de acetonitrilo em tampão fosfato de sódio monobásico 0,lM, pH 2.

As fracções adequadas conforme determinado por HPLC analítica foram reunidas, diluídas duas vezes com água e bombeadas para uma coluna de Ultrasphere C-8 de 10 x 250 mm. A proteína sem sal foi eluida da coluna com um gradiente acetonitrilo em ácido trifluoroacético a 0,5%.

As fracções contendo o análogo da insulina purificado foram reunidas e liofilizadas para dar 103 mg. A estrutura foi verificada por análise de aminoácidos (Tabela I) e espectroscopia de massa (MS).

MS: 5836.1 (Teoria: 5836.7).

EXEMPLO 6

Insulina humana Asn(B28), Pro(B29)

Insulina de porco desoctapeptídica (409 mg) e o octapeptídeo sintético Gli-Fen-Fen-Tir-Tre-Asn-Pro-Tre (398 mg) foram combinados em 14 ml de uma solução contendo uma parte de dimetilsulfóxido, duas partes de

1,4-butanediol e uma parte de tampão Tris 0,25M pH 7,3 a 37CC

-25Adicionou-se tripsina de porco (81 mg). A solução foi bem misturada e agitada ocasionalmente durante 120 min. a 372C.

A reacção foi parada nesta altura pela adição da mistura a 136 ml de Q,05N HCl. Toda a solução foi bombeada para uma coluna Zorbax C-8 de 21 x 250 mm e os produtos foram eluidos num gradiente côncavo de acetonitrilo em tampão fosfato de sódio monobásico 0, lf4 pH 2.

As fracções adequadas, conforme determinado por HPLC analítica foram reunidas, diluidas duas vezes com água e bombeada para uma coluna Vydac C-18 de 25 x 300 mm. A proteína sem sal foi eluida da coluna com um gradiente de acetonitrilo em ácido trifluoroacético a 0,5%. As fracções contendo o análogo da insulina purificado foram reunidas e liofilizadas para dar 56 mg. A estrutura foi verificada por análise de aminoácidos (Tabela I) e espectroscopia de massa (MS).

MS: 5794.7 (Teoria: 5794.6).

EXEMPLO 7

Insulina humana Asp(B28), Pro(B29)

Insulina de porco desoctapeptídica (400 mg) e o octapeptídeo sintético Gli-Fen-Fen-Tir-Tre-Asp-Pro-Tre (388 mg) foram combinados em 13 ml de uma solução contendo uma parte de dimetilsulfóxido, duas partes de

1,4-butanediol e uma parte de tampão Tris 0,25 M pH 7,3 a 372(1 Adicionou-se tripsina de porco (78 mg). A solução foi bem mis-26turada e agitada ocasionalmente durante 120 min. a 372C.

A reacção foi parada nesta altura pela adição da mistura a 137 ml de 0,09N HCl. Toda a solução foi bombeada para uma coluna Zorbax C-8 de 21 x 250 mm e os produtos foram eluidos num gradiente concavo de acetonitrilo em tampão fosfato de sódio monobásico 0,lí1, pH 2.

As fracções adequadas, conforme determinado por HPLC analítica foram reunidas, diluidas quatro vezes com água e bombeadas para uma coluna Vydac C-18 de 25 x 300 mm. A proteína sem sal foi eluida da coluna com um gradiente de acetonitrilo com ácido trifluoroacético a 0,1%. As fracções contendo o análogo da insulina purificado foram reunidas e liofilizadas para dar 85 mg. A estrutura foi verificada por análise de aminoácidos (Tabela I) e espectroscopia de massa (MS).

MS: 5795.7 (Teoria: 5795.6).

EXEMPLO 8

Insulina Humana Asp(BlO), His(B28), Pro(B29)

A. Preparação da cadeia B da insulina humana Asp(BlO), His (B28), Pro(B29)

Usou-se um sintetizador de peptídeos Applied Biosystems 430A (incluindo revisão de software 1.4) para preparar uma resina peptídica bruta. Usou-se 0,5

milimoles (mMol) da resina da fase sólida de partida (resina Pam t-BOC-Tre(Bzl)OCH^) (0,72 mMol/g x 0,705 g). Todos os aminoácidos usados estavam protegidos com BOC e exceptuando o ácido glutâmico, ácido aspártico e histidina, foram todos usados directamente conforme recebidos (i.e., em cassetes da Applied Biosystems, Inc., cada cassete continha aproximadamente 2 mmoles de aminoácido protegido). O ácido glutâmico, ácido aspártico e histidina foram obtidos de fontes comerciais e transferidos para cassetes de tal modo que cada cassete continha aproximadamente 2 mmoles do aminoácido protegido pretendido. A resina peptidilica bruta foi seca sob vácuo à temperatura ambiente durante a noite e o seu peso comparado com o peso de partida para assegurar um ganho de peso razoável.

□ma pequena fracção de amostra foi submetida à análise de aminoácidos para assegurar que os aminoácidos pretendidos eram adicionados nas proporções correctas.

O peptídeo foi clivado a partir da resina peptídica e a cadeia lateral desprotegida por agitação durante aproximadamente 1 hora a 02C numa solução de 10 partes (v/p de HF (contendo 5% v/v de p-tiocresol e 5% v/v de m-cresol) para 1 parte de resina peptidilica. Após remoção da maior parte do HF com vácuo, o peptídeo foi precipitado com éter etílico. Após várias lavagens com éter etílico seguido de filtração sob vácuo, o peptídeo foi dissolvido em aproximadamente 120 ml de guanidina-HCl 8M, pH 11, contendo 0,1M Tris 35 mg/ml de Na₂SO₃ e 25 mg/ml de ^Na2^S4^O6' A solução foi ajustada a pH 8,8 com 5N_ NaOH e deixada a agitar fortemente durante 3 horas à temperatura ambiente.

A solução resultante de peptídeo S-sulfonado foi aplicada numa coluna de Sephadex G-25 (médio) de 5 x 125 cm à temperatura ambiente. A amostra foi eluida a 21 ml/min à temperatura ambiente usando bicarbonato de amónio 50 mM. O efluente foi controlado a 276 nm. Colheram-se fracções de 25 ml cada e fez-se um conjunto das fracções pretendidas e purificou-se ainda por cromatografia líquida de alta

-28resolução (HPLC) como se segue.

O conjunto das fracções pretendidas foi bonbeado para uma coluna de HPLC Dupont C8 de 9-12M e 2,5 x 30 cm e eluido usando um gradiente linear de acetonitrilo crescente em bicarbonato de amónio 100 mM à temperatura ambiente (2,6 ml/min). O efluente foi controlada a 280 nm. Colheram-se fracções de 25 ml cada. As análises em HPLC analítica foram conduzidas em fracções seleccionadas para determinar quais as fracções a reter. As fracções pretendidas foram reunidas e liofilizadas e usadas na combinação que se segue com a cadeia A.

B. Combinação da cadeia B da insolina humana Asp(BlO), Lis(B28) Pro(B29) com a cadeia A da insulina humana.

A combinação das cadeias A e B foi conseguida pelo processo de Chance et al., supra. Duas g de S-sulfonato da cadeia A derivada de DNA recombinante e 400 mg de sulfonato da cadeia B sintética Asp(BlO), Lis(B28), Pro(B29) foram dissolvidas em 200 ml e 40 ml, respectivamente, de tampão glicina 0,1M à temperatura ambiente, cada uma ajustada a pH (0,5 com 5N NaOH e depois arrefecido até 5sc. Preparou-se uma solução de ditiotreitol (DTT) a 15,5 mg/ml em tampão glicina 0 , ÍM^ à temperatura ambiente, ajustou-se a pH 10,5 com NaOH e depois arrefeceu-se até 53C.

As soluções das cadeias A e B foram combinadas, em seguida adicionou-se rápidamente 15,9 ml da solução de DTT (SH/SSO^ - 1,0). A solução da reacção foi agitada a 4QC num frasco de centrífuga em vidro de 200 ml aberto durante 19,6 horas a 42C. Adicionou-se ácido acético glacial (125 ml) e a solução foi deixada em repouso a 4SC durante uma hora.

-29A mistura do precipitado resultante foi centrifugada durante 30 minutos a 2000 rpm a 49C. O sobrenadante foi combinado com 292 ml de água mili-Q e 73 ml de acetonitrilo e ainda purificado por HPLC de fase reversa (usando uma coluna Vydac C18 de 2,5 x 30 cm eluido à temperatura ambiente, a 2,5 ml/min, usando um gradiente linear de acetonitrilo crescente em 0, ÍM^ NaH2PO^, pH 2,1). O efluente foi controlado a 280 nm. Fracções seleccionadas foram testadas por HPLC analítica e as fracções pretendidas reunidas e diluídas duas vezes com ácido trifluoroacético (TFA) aguoso a 0,1%. depois aplicadas numa coluna de HPLC Uitrasphorese com octilo (1,0 x 25 cm) e eluidas com um gradiente linear de acetonitrilo crescente em TFA aguoso a 0,1%. 0 efluente foi controlado a 280 nm. Fracções seleccionadas foram testadas por HPLC analítica e as fracções pretendidas reuniaas e novamente purificadas usando a mesma coluna e condições de atrás com um gradiente ligeiramente diferente de acetonitrilo. As fracções adequadas foram reunidas e liofilizadas dando um rendimento de 65 mg do análogo da insulina com uma pureza superior a 93% por HPLC em fase reversa. A estrutura foi verificada por análise de aminoácidos (Tabela I) e espectroscopia de massa (MS).

MS: 5786.1 (Teoria: 5786.7),

EXEMPLO 9

Insulina humana Cya(B28), Pro(B29)

Fez-se oxidação com ácido perfórmico para converter a cisteina do octapeptídeo na forma de

ácido cisteico. 0 octapeptideo sintético Gli-Fen-Fen-Tir-Tre-Cis-Pro-Tre (363 mg) foi dissolvido em 36 ml de ácido perfórmico preparado de fresco num frasco arrefecido em gelo e deixado a agitar suavemente durante uma hora. 0 material oxidado foi diluído dez vezes com água e liofilizado. 0 liofilizado foi usado na semi-sintese.

Insulina de porco desoctapeptidica (222 mg) e o octapeptideo sintético Gli-Fen-Fen-Tir-Tre-Cia-Pro-Tre (225 mg) foram combinados em 18 ml de uma solur·-- ção contendo uma parte de dimetilsulfóxido, duas partes de

1,4-butanediol e uma parte do tampão Tris 0,25 M pH 7,3..a 37SC. Adicionou-se tripsina de porco (45 mg). A solução foi bem misturada e agitada ocasionalmente durante 120 minutos a 372C.

A reacção foi parada nesta altura pela adição da mistura a 242 ml de O,O5t4 HC1. Toda a solução foi bombeada para uma coluna Zorbax C-8 de 21 x 250 mm e os produtos foram eluidos num gradiente côncavo de acetonitrilo em fosfato de sódio monobássico O,1M, pH 2.

As fracções adequadas, conforme determinado por HPLC analítica foram reunidas, diluidas duas vezes com água e bombeadas para uma coluna Vydac C-18 de 29 x 300 min. A proteína sem sal foi eluída da coluna com um gradiente de acetonitrilo em ácido trifluoroacético a 0,5%. As fracções contendo o análogo da insulina purificado foram reunidas e liofilizadas para dar 16 mg. A estrutura foi verificada por análise de aminoácido (Tabela I) e espectroscopia de massa (MS ) .

MS: 5831.5 (Teoria: 5831.7).

-31EXEMPLO 10

Insulina humana Glu(B28), Pro(B29)

Insulina de porco desoctapeptídica (290 mg) e octapeptídeo sintético Gli-Fen-Fen-Tir-Tre-Gln-Pro-Tre (310 mg) foram combinados em 10 ml de uma solução contendo uma parte de dimetilsulfóxido, duas partes de 1,4butanodiol e uma parte de tampão Tris 0,25í4 pH 7,3 a 372C. Adicionou-se tripsina de porco (60 mg). A solução foi bem misturada e agitada ocasionalmente durante 60 mín a 372C.

Nesta altura a reacção foi parada através da adição da mistura a 90 ml de 0,05 N HC1. Toda a solução foi bombeada para uma coluna Zorbax C-8 de 21 x 299 mm e os produtos foram eluidos num gradiente côncavo de acetonitrilo em tampão fosfato de sódio monobásico 0,1 M pH 2.

As fracções adequadas, conforme determinado por HPLC analítica foram reunidas, diluídas duas vezes com água e bombeadas para uma coluna (Jltraspnere C-8 10 x 250 mm. A proteína sem sal foi eluida da coluna com um gradiente de acetonitrilo em ácido trifiuoroacético a 0,5£.

As fracções contendo o análogo da insulina purificada foram reunidas e liofilizadas para dar 87 mg. A estrutura foi verificada por análise de aminoácidos (Tabela I) e espectroscopia de massa (MS).

MS: 5809.4 (Teoria: 5808.6)

-32EXEMPLO 11

Insulina Humana Glu(28), Pro(B29)

Insulina de porco desoctapeptídica (402 mg) e o octapeptídeo sintético Gli-Fen-Fen-Tir-Tre-Glu-Pro-Tre (398 mg) foram combinados em 14 ml de uma solução contendo uma parte de dimetilsulfóxido, duas partes de 1,4-butanediol e uma parte de tampão Tris 0,25M pH 7,3 a 37SC. Adicionou-se tripsina de porco (80 mg). A solução foi bem misturada e agitada ocasionalmente durante 120 min. a 37SC.

A reacção foi parada nesta altura através da adição da mistura a 136 ml de 0,05 N_ HC1. Toda a solução foi bombeada para uma coluna Zorbax C-8 de 21 x 250 mm e os produtos foram eluidos num gradiente concavo de acetonitrilo em tampão fosfato de sódio monobásico 0,1(^, pH 2.

As fracções adequadas, conforme determinado por HPLC analítico foram reunidas, diluídas quatro vezes com água e bombeadas para uma coluna Vydac C-18 de 25 x 300 mm. A proteína sem sal foi eluida da coluna com um gradiente de acetonitrilo em ácido trifluoroacético a 0,5% As fracções contendo o análogo da insulina purificado foram reunidas e liofilizadas para dar 59 mg. A estrutura foi confirmada por análise de aminoácidos (Tabela I) e espectroscopia de massa (MS).

MS: 5809, 6 (Teoria: 5809.6).

EXEMPLQ 11

Insulina Humana Glu(28), Pro(B29)

Insulina de porco desoctapeptídica (402 mg) e o octapeptídeo sintético G1i-Fen-Ter-Tre-Glu-Pro-Tre (398 mg) foram combinados em 14 ml de uma solução contendo uma parte de dimetilsulfóxido, duas partes de 1,4-butanediol e uma parte de tampão Tris 0,25M pH 7,3 a 372C. Adicionou-se tripsina de porco (30 mg). A solução foi bem misturada e agitada ocasionalmente durante 120 min. a 372C.

A reacção foi parada nesta altura através da mistura a 136 ml de 0,05 N HCl. Toda a solução foi bombeada para uma coluna Zorbax C-8 de 21 x 250 mm e os produtos eluidos num gradienteconcavo de acetonitrilo em tampão fosfato de sódio monobásico 0,1 >1, pH 2.

As fracções adequadas, conforme determinado por HPLC analítico foram reunidos, diluidas quatro vezes com água e bombeadas para uma coluna Vydac C-18 de 25 x 300 mm. A proteína sem sal foi eluida da coluna com um gradiente de acetonitrilo em ácido trifluoroacético a 0,5%. As fracções contendo o análogo da insulina purificado foram reunidas e liofilizadas para dar 59 mg. A estrutura foi confirmada por análise de aminoácidos (Tabela I) e espectroscopia de massa (MS ) .

(MS: 5809.6 (Teoria: 5309.6).

-34EXEMPLO 12

Insulina Humana Gli(B28), Pro(B29)

Insulina de porco desoctapeptidica (412 mg) e o octapeptídeo sintético G1i-Fen-Fen-Tir-Tre-Gli-Pro-Tre (376 mg) foram combinados em 13 ml de uma solução cora tendo uma parte de dimetilsulfóxido, duas partes de 1,4-butanediol e uma parte de tampão Tris 0,25M pH 7,3 a 372C. Adicionou-se tripsina de porco (79 mg). A solução foi bem misturada e agitada ocasionalmente durante 180 min. a 372C.

A reacção foi parada nesta altura através de adição da mistura a 147 ml de 0,05 N HC1. Toda a solução foi bombeada para uma coluna zorbax C-8 de 21 x 250 mm e os produtos foram eluidos num gradiente côncavo de acetonitrilo em tampão fosfato de sódio monobásico O,1M_, pH 2.

As fracções adequadas, conforme determinado por HPLC analítica, foram reunidas, diluídas quatro vezes com água e bombeadas para uma coluna Vydac C-18 de 25 x 300 mm. A proteína sem sal foi eluida de coluna com um gradiente de acetonitrilo em ácido trifluoroacético a 0,1%.

As fracções contendo o análogo da insulina purificado forem reunidas e liofilizadas para dar 11 mg. A estrutura foi verificada por análise de aminoácidos (tabela I) e espectroscopia de massa (MS).

MS: 5737.2 (Teoria: 5737.5)

-35EXEMPLO 13

Insulina Humana His(B28), Pro(B29)

Insulina de porco desoctapeptídica (400 mg) e o octapeptídeo sintético Gli-Fen-Fen-Tir-Tre-His-Pro-Tre (398 mg) foram combinados em 13 ml de uma solução contendo uma parte de dimetilsulfóxido, duas partes de 1,4-butanediol e uma parte de tampão Tris 0,25M pH 7,3 a 37SC. Adicionou-se tripsina de porco (79 mg). A solução foi bem misturada e agitada ocasionalmente durante 120 min. a 37SC.

A reacção foi parada nesta altura pela adição da mistura a 137 ml de 0,05N HCl. Toda a solução foi bombeada para uma coluna Zorbax C-8 de 21 x 250 mm e os produtos foram eluidos num gradiente côncavo de acetonitrilo em tampão fosfato de sódio monobásico O,1M, pH 2.

As fracções adequadas, conforme determinado por HPLC analítica, foram reunidas, diluidas quatro vezes com água e bombeadas para uma coluna Vydac C-18 de 25 x 300 mm. A proteina sem sal foi eluida da coluna com um gradiente de acetonitrilo em ácido trifluoroacético a 0,1%.

As fracções contendo o análogo da insulina purificada foram reunidas e liofilizadas para dar 79 mg. A estrutura foi confirmada por análise de aminoácidos (Tabela I) e espectroscopia de massa (MS).

MS: 5816.9 (Teoria: 5817.7).

-36EXEMPLO 14

Insulina Humana Ile(B28), Pro(B29)

Insulina de porco desoctapeptidica (409 mg) e o octapeptideo sintético Gli-Fen-Fen-Tir-Tre-Ile-Pro-Tre (398 mg) foram combinadas em 13 ml de uma solução contendo uma parte de dimetilsulfóxido, duas partes de 1,4-butanodiol e uma parte de tampão 0,25 M Tris PH 7,3 a 37SC. Adicionou-se tripsina de porco (81 mg). A solução foi bem misturada e agitada ocasionalmente durante 120 minutos a 37SC.

A reacção foi parada nesta altura pela adição da mistura a 136 ml de 0,05 N HC1. Toda a solução foi bombeada para uma coluna Zorbax C-8 de 21 x 250 mm e os produtos foram eluidos num gradiente côncavo de acetonitrilo em tampão fosfato de sódio monobásico 0,1 pH 2.

As fracções adequadas, conforme determinado por HPLC analítica, foram reunidas, diluídas duas vezes com água, bombeadas para uma coluna Vydac C-18 de 25 x 300 mm. A proteína sem sal foi eluida da coluna com um gradiente de acetonitrilo em ácido trifluoroacético.,As fracções contendo o análogo da insulina purificado foram reunidas e liofilizados para dar 57 mg. A estrutura foi confirmada por análise de aminoácidos (Tabela I) e espectroscopia de massa (MS).

MS: 5793.7 (Teoria: 5793.7).

-37EXEMPLO 15

Insulina Humana Leu(B28), Pro(B29)

Insulina de porco desoctapeptídica (418 mg) e o octapeptídeo sintético Gli-Fen-Fen-Tir-Tre-Leu-Pro-Tre (410 mg) foram combinados em 14 ml de uma solução contendo uma parte de dimetilsulfóxido, duas partes de 1,4-butanediol e uma parte de tampão Tris 0,25M pH 7,3 a 37QC. Adicionou-se tripsina de porco (83 mg). A solução foi bem misturada e agitada ocasionalmente durante 120 min. a 37SC.

A reacção foi parada nesta altura através da adição da mistura a 136 ml de 0,05 N HC1. Toda a solução foi bombeada para uma coluna Zorbax C-8 de 21 x 250 mm e os produtos foram eluidos num gradiente côncavo de acetonitrilo em tampão fosfato de sódio monobásico 0,lM, pH 2.

As fracções adequadas, conforme determinado por HPLC, foram reunidas, diluídas duas vezes com água e bombeadas para uma coluna Vydec C-18 de 25 x 300 mm. A proteina sem sal foi eluída da coluna com um gradiente de acetonitrilo em ácido trifluoroacético a 0,5%. As fracções contendo o análogo da insulina purificada foram reunidas e liofilizadas para dar 74 mg. A estrutura foi verificada por análise de aminoácidos (Tabela I) e espectroscopia de massa (MS).

MS: 5793.8 (Teoria: 5793.7

EXEMPLO 16

Insulina Humana Nle(B28), Pro(B29)

-38Insulina de porco desoctapeptídica(290 mg) e o octapeptídeo sintético Gli-Fen-Fen-Tir-Tre-Nle-Pro-Tre (310 mg) foram combinadas em 20 ml de uma solução contendo uma parte de dimetilsulfóxido, duas partes de

1,4-butanodiol e uma parte de tampão Tris 0,25f4 pH 7,3 a 37SC. Adicionou-se tripsina de porco (60 mg). A solução foi bem misturada e agitada ocasionalmente durante 60 min. a 37CC,

A reacção foi parada nesta altura pela adição da mistura a 90 ml de 0,05NI HC1. Toda a solução foi bombeada para uma coluna Zorbax C-8 de 21 x 250 mm e os produtos foram eluídos num gradiente côncavo de acetonitrilo em tampão fosfato de sódio monobásico 0,lM pH 2.

As fracções adequadas, conforme determinado por HPLC analítica foram reunidas, diluídas duas vezes com água e bombeadas para uma coluna Ultraphere C-8 de 10 x 250 mm. A proteína sem sal foi eluida da coluna com um gradiente de acetonitrilo em ácido trifluoroacético a 0,5%.

As fracções contendo o análogo da insulina purificado foram reunidas e liofilizadas para dar 54 mg. A estrutura foi verificada por análise de aminoácidos (Tabela I) e espectroscopia de massa (MS).

MS: 5794.6 (Teoria: 5793.7).

-39EXEMPLO 17

Insulina Humana D-Lys (B29)

Insulina de porco desoctapeptídica (392 mg) e o octapeptídeo sintético Gli-Fen-Fen-Tir-Tre-Pro-D-Lis-Tre (387 mg) foram combinados em 13,5 ml de uma solução contendo uma parte de dimetilsulfóxido duas partes de

1,4-butanodiol e uma parte de tampão Tris 0,25f4 pH 7,3 a 37SC. Adicionou-se tripsina de porco (78 mg). A solução foi bem misturada e agitada ocasionalmente durante 120 min. a 372C.

A reacção foi parada nesta altura pela adição da mistura a 136,5 ml de 0,25N HC1. Toda a solução foi bombeada para uma coluna Zorbax C-8 de 21 x 250 mm e os produtos foram eluidos num gradiente côncavo de acetonitrilo em tampão fosfato de sódio monobásico O,1M, pH 2.

As fracções adequadas, conforme determinado por HPLC analítica foram reunidas, diluídas quatro vezes com água e bombeadas para uma coluna Vydac C-18 de 25 x 300 mm. A proteína sem sal foi eluida da coluna com um gradiente de acetonitrilo em ácido trifluoroacético a 3%. As fracções contendo o análogo da insulina purificado foram reunidas e liofilizadas para dar 94 mg. A estrutura foi verificada por análise de aminoácidos (Tabela I) e espectroscopia de massa (MS).

MS: 5809.0 (Teoria: 5808.7).

-40EXEMPLO 18

Insulina humana Met(B28), Pro(B29)

Insulina de porco desoctapeptídica (350 mg) e o octapeptídeo sintético Gli-Fen-Fen-Tir-Tre-Met-Pro-Tre (366 mg) foram consultados e combinados em 12 ml de uma solução contendo uma parte de dimetilsulfóxido, duas partes de 1,4-butanediol e uma parte de tampão tris 0,25M pH 7,3 a 37SC. Adicionou-se tripsina de porco (71 mg). A solução foi bem misturada e agitada ocasionalmente durante 120 min. a 372C.

A reacção foi parada nesta altura pela adição de mistura a 118 ml de 0,05N^ HC1. Toda a solução foi bombeada para uma coluna Zorbax C-8 de 21 x 250 mm e os produtos foram eluidos num gradiente côncavo de acetonitrilo em tampão fosfato de sódio monobásico Ο,ΙΜ^, pH 2.

As fracções adequadas, conforme determinado por HPLC analítica foram reunidas, diluidas quatro vezes com água e bombeada para uma coluna Vydac C-18 de 25 x 300 mm. A proteína sem sal foi eluida da coluna com um gradiente de acetonitrilo em ácido trifluoroacético a 0,1%.

As fracções contendo o análogo da insulina purificada foram reunidas e liofilizadas para dar 72 mg. A estrutura foi verificada por análise de aminoácidos (Tabela I) e espectroscopia de massa (MS).

MS: 584.8 (Teoria: 5811.71.

-41EXEMPLO 19

Insulina Humana Orn(B23), Pro(B29)

Insulina de porco desoctapeptídica (290 mg) e o octapeptídeo sintético Gli-Fen-Fen-Tir-Tre-Orn-Pro-Tre (310 mg) foram combinados em 10 ml de uma solução contendo uma parte de dimetilsulfóxido, duas partes de

1,4-butanediol e uma parte de tampão tris 0,2 5 Mi pH 7,3 a 379C Adicionou-se tripsina de porco (60 mg). A solução foi bem mis turada e agitada ocasionalmente durante 40 min. a 379C.

A reacção foi parada nesta altura pela adição da mistura a 90 ml de 0,05N HC1. Toda a solução foi bombeada para uma coluna Zorbax C-8 de 21 x 250 mm e os produtos foram eluídos num gradiente côncavo de acetonitrilo em tampão fosfato de sódio monobásico 0,lM, pH 2.

As fracções adequadas, conforme determinado por HPLC analítica, foram removidas, diluídas duas vezes com água e bombeadas para uma coluna Ultrasphere C-8 de 10 x 250 mm. A proleína sem sal foi eluída da coluna com um gradiente de acetonitrilo em ácido trifluoroacético a 0,5%.

As fracções contendo o análogo de insulina purificado foram reunidas e liofilizadas para dar 89 mg. A estrutura foi verificada por análise de aminoácidos (Tabela I) e espectroscopia de massa (MS).

MS: 5795.2 (Teoria: 5794.7).

EXEMPLO 20

-42Insulina Humana Fen(B28), Pro(29)

Insulina de porco desoctapeptidica (290 mg) e o octapeptídeo sintético Gli-Fen-Fen-Tir-Tre-Fen-Pro-Tre (310 mg) foram combinados em 10 ml de uma solução contendo uma parte de dimetilsulfóxido, duas partes de

1,4-butanediol, uma parte de tampão tris 0,25M pH 7,3 a 37SC. Adicionou-se tripoina de porco (60 mg). A solução foi bem misturada e agitada ocasionalmente durante 80 min. a 37SC.

A reacção já foi preparada nesta altura pela adição da mistura a 90 ml de 0,05N HC1. Toda a solução foi bombeada para uma coluna Zorbax C-8 de 21 x 250 mm e os produtos foram eluidos num gradiente côncavo de acetonitrilo em tampão fosfato de sódio monobásico 0,lM, pH 2.

As fracções adequadas, conforme determinado por HPLC analítica, foram reunidas, diluídas quatro vezes com água e bombeadas para uma coluna Vydac C-18 de 25 x 300 mm. A proteína sem sal foi eluida de coluna com um gradiente de acetonitrilo em ácido trifluoroacético. As fracções contendo o análogo da insulina purificado foram reunidas e liofilizadas para dar 17 mg. A estrutura foi verificada por análise de aminoácidos (Tabela I) e espectroscopia de massa (MS) .

MS: 5827.9 (Teoria: 5827.7)

EXEMPLO 21

-43Insulina Humana Pro (B29)

Insulina de porco desoctapeptidica (339 mg) e o octapeptideo sintético Gli-Fen-Fen-Tir-Tre-Pro-Pro-Tre (363 mg) foram combinados em 9 ml de uma solução contendo uma parte de dimetilsulfóxido, duas partes de 1,4-butanodiol e uma parte de tampão tris 0,25N[ pH 7,3 a 37SC. Adicionou-se tripsina de porco (70 mg). A solução foi bem misturada e agitada ocasionalmente durante 80 min a 372C.

A reacção foi parada nesta altura pela adição da mistura a 108 ml de 0,05l·) HC1. Toda a solução foi bombeada para uma coluna Zorbax C-8 de 10 x 250 mm e os produtos foram eluidos num gradiente côncavo de acetonitrilo em tampão fosfato de sódio monobásico 0,lM.

As fracções adequadas conforme determinado por HPLC analítica, foram reunidas, diluídas duas vezes com água e bombeadas para uma coluna Ultrasphere C-8 de 10 x 250 mm. A proteína sem sal foi eluida da coluna com um gradiente de acetonitrilo em ácido trifluoroacético a 0,5%. As fracções contendo o análogo de insulina purificado foram reunidas e liofilizadas para dar 17 mg. A estrutura foi verificada por análise de aminoácidos (Tabela I) e espectroscopia de massa (MS).

MS: 5778,6 (Teoria: 5777.6).

EXEMPLO 22

-44Insulina Humana Ser(B28), Pro(B29)

Insulina de porco desoctapeptidica (412 mg) e o octapeptídeo sintético Gli-Fen-Fen-Ter-Tre-Ser-Pro-Tre- (390 mg) foram combinadas em 13 ml de uma solução contendo uma parte de dimetilsulfóxido, duas partes de

1,4-butanediol e uma parte de tampão tris 0,25M pH 7,3 a 37SC. Adicionaram-se tripsina de porco (60 mg). A solução foi bem misturada e agitada ocasionalmente durante 120 min. a 37SC.

A reacção foi parada nesta altura pela adição da mistura a 137 ml de 0,05tJ HC1. Toda a solução foi bombeada para uma coluna Zorbax C-8 de 21 x 250 mm e os produtos foram eluidos num gradiente côncavo de acetonitrilo em tampão fosfato de sódio monobásico 0,1M, pH 2.

As fracções adequadas, conforme determinado por HPLC analítica, foram reunidas, diluídas duas vezes com água e bombeadas para uma coluna Vydac C-18 de 25 x 300 mm. A proteína sem sal foi eluida da coluna com um gradiente de acetonitrilo em ácido trifIuoroacético a 0,5%. As fracções contendo o análogo de insulina purificado foram reunidas e liofilizadas para dar 37 mg. A estrutura foi verificada por análise de aminoácidos (Tabela I) e espectroscopia de massa (MS).

MS: 5768.1 (Teoria: 5767.6).

-45EXEMPLO 23

Insulina Humana Tre(B28), Pro(B29)

Insulina de porco desoctapeptídia (437 mg) e o octapeptídeo sintético Gli-Fen-Fen-Tir-Tre-Tre-Pro-Tre (420 mg) foram combinadas em 14,5 ml de uma solução contendo uma parte de dimetilsulfóxido, duas partes de 1,4-butanodiol e uma parte de tampão tris 0,25M pH 7,3 a 372C. Adicionou-se tripsina de porco (86 mg). A solução foi bem misturada e agitada ocasionalmente durante 120 min. a 372C.

A reacção foi parada nesta altura pela adição da mistura a 135,5 ml de 0,05N. HC1. Toda a solução foi bombeada para uma coluna Zorbax C-8 de 21 x 250 mm e os produtos foram eluidos num gradiente côncavo de acetonitrilo em tampão fosfato de sódio monobásico 0,líl, pH 2.

As fracções adequadas, conforme determinado por HPLC analítica, foram reunidas, diluídas duas vezes com água e bombeadas para uma coluna Vydac C-18 de 25 x 300 mm. A proteína sem sal foi eluida coluna com um gradiente de acetonitrilo em ácido trifluoroacético a 0,5%. As fracções contendo o análogo de insulina purificado foram reunidas e liofilizadas para dar 78 mg. A estrutura foi verificada por análise de aminoácidos (Tabela I) e espectroscopia de massa (MS) .

MS: 5781.9 (Teoria: 5781.6).

-46EXEMPLO 24

Insulina Humana Trp(B28), Pro(B29)

Insulina de porco desoctapeptídia (310 mg) e o octapeptídeo sintético Gli-Fen-Fen-Tir-Tre-Trp-Pro-Tre (325 mg) foram combinados em 10,5 ml de uma solução contendo uma parte de dimetilsulfóxido, duas partes de 1,4-butanediol e uma parte de tampão tris 0,25M pH 7,3 a 37SC. Adicionou-se tripsina de porco (64 mg). A solução foi bem misturada e agitada ocasionalmente durante 120 min. a 37SC.

A reacção foi parada nesta altura pela adição de mistura a 140 ml de 0,0 5_ HC1. Toda a solução foi bombeada para uma coluna Zorbax C-8 de 21 x 250 mm e os produtos foram eluidos num gradiente côncavo de acetonitrilo em tampão fosfato de sódio monobásico 0,lM, pH 2.

As fracções adequadas, conforme determinado por HPLC analítica foram reunidas, diluídas duas vezes com água, bombeadas para uma coluna Vydac C-18 de 25 x 300 mm. A proteína sem sal foi eluida da coluna com um gradiente de acetonitrilo em ácido acético a 0,5%. As fracções contendo o análogo de insulina purificado foram reunidas e liofilizadas para dar 47 mg. A estrutura foi confirmada por análise de aminoácidos (Tabela I) e espectroscopia de massa (MS).

MS: 5866.2 (Teoria: 5866.7).

EXEMPLO 25

-47Insulina Humana Tri (B28), Pro(B29)

Insulina de porco desoctapeptídica (391 mg) e o octapeptídeo sintético Gli-Fen-Fen-Tir-Tre-Tir-Pro-Tre (400 mg) foram combinados em 13 ml de uma solução contendo uma parte de dimetilsulfóxido, duas partes de

1,4-butanediol e uma parte de tampão tris 0,05M pH 7,3 a 372C Adicionou-se tripsina de porco (79 mg). A solução foi bem misturada e agitada ocasionalmente durante 120 min. a 372C.

A reacção foi parada nesta altura pela adição da mistura a 137 ml de Q.05N HCl. Toda a solução foi bombeada para uma coluna Zorbac C-8 de 21 x 0,50 mm e os produtos foram eluidos um gradiente côncavo de acetonitrilo em tampão fosfato de sódio monobásico 0,8M a pH 2.

As fracções adequadas, conforme determinado por HPLC analítica foram reunidas, diluídas duas vezes com água e bombeada para coluna Vydac C-18 de 25 x 300 mm. A proteína sem sal foi eluida da coluna com um gradiente de acetonitrilo em ácido trifluoroacético a 0,5%. As fracções contendo o análogo da insulina purificada foram reunidas e liofilizadas para dar 30 mg. A estrutura foi confirmada por análise de aminoácidos (Tabela I) e espectraoscopia de massa (MS) .

MS: 5843.7 (Teoria: 5843.7).

EXEMPLO 26

Insulina Humana Val(B28), Pro(B29)

Insulina de porco desoctapeptídica (400 mg) e o octapeptídeo sintético Gli-Fen-Fen-Tir-Tre-Val-Pro-Tre (383 mg) foram combinados em 12 ml de uma solução contendo uma parte de dimetilsulfóxido, duas partes de

1,4-butanediol e uma parte de tampão tris 0,25M, pH 7,3 a 372C. Adiciona-se tripsina de porco (78 mg). A solução foi bem misturada e agitada ocasionalmente durante 120 min. a 37CC.

A reacção foi parada nesta altura pela adição da mistura a 238 ml de 0,05N HCl. Toda a solução foi bombeada para uma coluna Zorbax C-8 de 21 x 250 mm e os produtos foram eluidos num gradiente côncavo de acetonitrilo em tampão fosfato de sódio monobásico 0,lM, pH 2.

As fracções adequadas, conforme determinado por HPLC analítica, foram reunidas, diluídas quatro vezes com água e bombeadas para uma coluna Vydac C-18 de 25 x 300 mm. A proteína sem sal foi eluida de coluna, com um gradiente de acetonitrilo em ácido trifluoroacético a 0,1%.

As fracções contendo o análogo de insulina purificado foram reunidas e liofilizadas para dar 74 mg. A estrutura foi verificada por análise de aminoácidos (Tabela I) e espectroscopia de massa (MS).

MS: 5780.0 (Teoria: 5779.6).

-49EXEMPLO 27

Insulina Humana Nva(B28), Pro(B29)

Insulina de porco desoctapeptidica (292 mg) e o octapeptídeo sintético Gli-Fen-Fen-Tir-Tre-Nva-Pro-Tre (270 mg) foram combinados em 10 ml de uma solução contendo uma parte de dimetilsulfóxido, duas partes de

1,4-butanediol e uma parte de tampão tris 0,25M pH 7,3 a 37SC Adicionou-se tripsina de porco (57 mg). A solução foi bem mis turada e agitada ocasionalmente durante 20 min a 372C.

A reacção foi parada nesta altura pela adição da mistura a 240 ml de 0,05tQ HC1. Toda a solução foi bombeada para uma coluna Zorbax C-8 de 21 x 250 mm e os produtos foram eluidos num gradiente côncava de acetonitrilo em fosfato de sódio monobásico 0,lí1, pH 2.

As fracções adequadas, conforme determinado por HPLC analítica, foram reunidas, diluídas duas vezes com água e bombeadas para uma coluna Vydac C-18 de 25 x 300 mm. A proteína sem sal foi eluída da coluna com um gradiente de acetonitrilo em ácido trifluoroacético a 0,5%. As fracções contendo o análogo de insulina purificado foram reunidas e liofilizadas para dar 51 mg. A estrutura foi confirmada por análise de aminoácidos (Tabela I) e espectroscopia de massa (MS).

MS: 5780.0 (Teoria: 5779.6).

EXEMPLO 28

-50Utilizando os processos aqui estabelecidos prepararam-se ainda os análogos de insulina que se segue:

(a)	Insulina	Humana
(b)	Insulina	Humana
(c)	Insulina	Humana
(d)	Insulina	Humana
(e)	Insulina Pro(B29)	Humana
(f)	Insulina	HUmana
<g>	Insulina	HUmana
(h)	Insulina	Humana
(i)	Insulina	Humana
(j)	Insulina	HUmana
(k)	Insulina	HUmana

Asp(Bl), Lis(B28), Pro(B29) des(Fen-Bl), Lis(B28), Pro(B29) des(Fen-Bl), Asp(BlO), Lis(B28), Pro(B29) des(Fen-Bl), val-B2 ) , Lis(B28), Pro(B29) des(Fen-Bl, Val-B2), Asp(BlO), Lis(B28),

Gli(21), Asp(BlO), Lis(B28), Pro(B29)

Ala (A21), Asp(BlO), Lis(B28), Pro(B29) des(Tre-B30), Lis(B28), Pro(B29)

Asp(BlO), Arg(B28), Pro(B29)

Ala(A21), Arg(B28), Pro(B29)

Asp(Bl), Arg(B28), Pro(B29)

EXEMPLO 29

-51Insulina Humana Lis(B28), Pro(B29)

Construção de vectores e hospedeiros recomblnantes

A. Construção do plasmídeo pCZR126S

1. Isolamento do plasmídeo pKC283

Os liofilizados de E. coli K12 BE1201/pKC283 foram adquiridos à Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois 61604, com o número de acesso NRRL B-15830. Os liofilizados foram decantados para tubos con tendo 10 ml de meio LB (10 g de Bacto-Triptona, 5 g de extrac to de levedura Bacto e 10 g de NaCl por litro; o pH foi ajustado a 7,5) e incubados duas horas a 32SC, altura em que as culturas foram ajustadas a 50 pg/ml de ampicilina e depois in cubadas a 322C durante a noite. As células de E. coli K12 BE1201/pKC283 foram cultivadas a 322C devido às células compreenderem um gene repressor Cl sensível à temperatura integrado no DNA celular. Quando as células que compreendem ou não um gene repressor pL de lambda tipo selvagem são usadas neste processo de isolamento de plasmídeo, como descrito aqui nos Exemplos subsequentes, a temperatura de incubação é de 37CC.

Uma pequena fracção da cultura crescida durante a noite é semeada em placas LB (meio LB com 15 g/1 de agar Bacto) contendo 50 pg/ml de ampicilina de modo a obter-se colónias isoladas de E. coli KR BE 1201/pKC283.

Uma colónia isolada obtida foi inoculada em 10 ml de meio LB

-52contendo 50 ug/ml de ampicilina e incubada durante a noite a 322C com agitação forte. Os 10 ml de cultura crescidos durante a noite foram incubados em 500 ml de meio LB contendo 50 ug/ml de ampicilina e incubados durante a noite a 32QC com agitação forte, até a cultura ter atingido e fase estacionária.

O processo que se segue foi adaptado de Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory).

As células foram colhidas por centrifugação a 4000 g durante 10 minutos a 4SC e o sobrenadante foi rejeitado. O sedimento de células foi lavado em 100 ml de tampão STE arrefecido em gelo (0,lM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH, 7,8; e lmM EDTA). Após lavagem, o sedimento de células foi ressuspenso em 10 ml de solução 1 (50 mM glucose; 25 mM Tris-HC1, pH 8,0; e lOmM EDTA) contendo 5 mg/ml de lisozima e deixado à temperatura ambiente durante 10 minutos. Vinte ml de solução 2 (0,2 N NaOH e 1% SDS) foram então adicionados às células tratadas com lisozina e a solução foi misturada suavemente por inversão. A mistura foi incubada em gelo durante 10 minutos.

Quinze ml de acetato de potássio 5M arrefecido em gelo, pH 4,8, foram adicionados à mistura de células lisadas e a solução misturada por inversão. A solução foi então incubada em gelo durante 10 minutos. A solução de acetato de potássio 5M foi preparada pela adição de 11,5 ml de ácido acético glacial a 28,5 ml de água e 60 ml de acetato de potássio 5M; a solução resultante é 3M relativamente a potássio e 5M relativamente a acetato.

A mistura de células lisadas foi centrífugada num Beckman SW27 (ou seu equivalente) a 20000 rpm durante 20 minutos a 4CC. 0 DNA celular e detritos formaram um sedimento no fundo do tubo. Recuperam-se cerca de 36 ml de

sobrenadante e adicionou-se e misturou-se 0,6 volumes de isopropanol e a solução resultante foi deixada à temperatura ambiente durante 18 minutos. 0 DNA de plasmídeo foi colhido por centrifugação a 12000 g durante 30 min à temperatura ambiente. 0 sobrenadante foi rejeitado e o sedimento de DNA lavado com etanol a 70% à temperatura ambiente. 0 etanol da lavagem foi decantado e o sedimento seco num excicador sob vácuo. 0 sedimento foi então ressuspenso em 8 ml de tampão TE (lOmM Tris-HC1, pH 8,0 e 1 mM EDTA).

Adicionou-se oito gramas de CaCl à solução de DNA. Cerca de 2,8 ml de uma solução a 10 mg/ml de brometo de etídio em água foram adicionados para cada 10 ml de solução de DNA-CaCl. A densidade final da solução era de cerca de 1,55 g/ml e a concentração de bromato de etídeo era de aproximadamente 600 pg/ml. A solução foi transferida para um tubo de centrífuga Backman Type 50, cheio até ao topo com óleo de parafina, selado e centrifugado a 45 000 rpm durante 24 horas a 20QC. Após centrifugação, observaram-se duas bandas de DNA à luz normal. Após remoção da tampa do tubo, a banda inferior de DNA foi removida usando uma seringa com uma agulha hipodérmica 21 inserida lateralmente no tubo de centrífuga .

O brometo de etídeo foi removido através de várias extracções com 1-butanol saturado com água.

O CiCl foi removido por diálise contra tampão TE. Após extracção com fenol tamponado e depois com clorofórmio o DNA foi precipitado, lavado com etanol a 70% e seco. Obteve-se cerca de 1 mg do plasmídeo pKC283 que se guardou a 42C em tampão TE numa concentração de aproximadamente 1 pg/ml, Na Figura 1 dos desenhos juntos está apresentado num mapa de sítios de restrição e funções do plasmídeo pKC283.

-542. Construção do Plasmídeo pKC283PX

Cerca de 10 pl de DNA do plasmídeo pKC283 preparado no Exemplo 1 foram misturados com 20 pl de tampão de restrição 10 x com teor salino médio (500mM NaCl; lOOmM Tris-HCl, pH 7,5; 100 mM MgCl₂; e 10 mM DTT), 20 pl de BSA a 1 mg/ml, 5 pl da enzima de restrição PouII (“50 Unidades, como definido por Bethesda Reseanch Laboratories (BRL), de onde foram obtidas todas as enzimas de restrição aqui usadas) e 145 pl de água e a reacção resultante foi incubada a 37SC durante 2 horas. As reacções com enzimas de restrição aqui descritas de rotina foram paradas por extracções com fenol seguido de clorofórmio, as quais foram seguidas de precipitação do DNA, uma lavagem com etanol e ressuspensão do DNA em tampão TE. Após terminada a digestão com PouII como descrito atrás, o DNA do plasmídeo pKC283 digerido com PouII foi precipitado e depois ressuspenso em 5 pl de tampão TE.

Cerca de 600 picomoles (pM) de adaptadores Xhol (5'-CCTCGAGG-3¹) foram fosforiladas numa mistura contendo 10 pl de tampão de fosforilase 5X (300 mM Tris-HC1, pH 7,8; 50mM MgCl₂; e 25mM DTT), 5 pl de 5mM ATP, 24 pl de H₂O, 0,5 pl de polinucletídeo-cinase de T4 (cerca de 2,5 unidades como definido por P-L Biochemicals), 5 pl de BSA a 1 mg/ml e 5 pl de espermidina lOmM através da incubação da mistura a 37QC durante 30 minutos.

Cerca de 12,5 pl dos adaptadores Xhol fosforilados foram adicionados aos 5 pl de DNA do plasmídeo pKC283 digerido com PouII e em seguida adicionou-se ao DNA 2,5 pl de tampão ligase 10X (300Mm Tris-HCl, pH 7,6; 100 mM MgCl₂; e 50mM DTT), 2,5 pl de BSA a 1 mg/ml, 7 pl de 5mM ATP, 2,5 pl (cerca de 2,5 unidades conforme definido por B-L Biochemicals) de DNA-ligase de T4, 2,5 pl de espermidina lOmM e 3 pl de água. A reacção de ligação resultante foi incubada a 4fiC durante a noite. Depois da reacção de ligase, a mistura de reacção foi ajustada para ter a composição de tampão com alto teor salino (O,1M NaCl; 0,05M Tris-HCl, pH 7,5; 10,0mM MgCl₂; e lmM DTT). Cerca de 10 pl (100 unidades) da enzima de restrição Xhol foram adicionados à mistura e a reacção resultante foi incubada a 272C durante 2 horas.

Parou-se a reacção e o DNA digerido Xhol foi precipitado ressuspenso e ligado como descrito atrás, excepto não se terem adicionado adaptadores Xhol à mis tura de ligação. O DNA ligado constitui o plasmídeo pretendido pKC283PX. Na Figura 2 dos desenhos constitui um mapa de sítios de restrição e funções do plasmídeo pKC283PX.

3. Construção de E. coli K12 MO(A⁺)/pKC283PX

E. coli K12 MO(/⁺) pode ser adqui rido à Northern Regional Research Laboratories na forma, liofilizada cora 2 núraero de acesso NRRL B-15993. E. Coli K12 ΜΟ(λ⁺) compreende o gene do repressor pL cl de lambda tipo selvagem, de tal forma que a transcrição a partir do promotor híbrido pL-lpp do presente invento não ocorre em células E. coli K12 ΜΟ(Λ⁺). Oa liofilizados foram reconstituídos, colónias isoladas de ΜΟ(Λ⁺) foram isoladas e preparou-se uma cultura de 10 ml de células ΜΟ(λ⁺) que cresceu durante a noite substancialmente de acordo com o processo do Exemplo 29A1, excepto a temperatura de incubação ser de 372C e não se usar ampicilina no meio de cultura.

Cinquenta ml da cultura que cresceu durante a noite foram usados para inocular 3 ml de meio LB que também continha lOmM MgSO^ e lOmM MgCl₂· A cultura foi incubada a 37SC durante a noite com agitação forte. Na manha

-56seguinte a cultura foi diluída para 200 ml com meio LB contendo lOmM MgSO^ e lOmM MgC^· A cultura diluida foi incubada a 372C com agitação forte até a absorvância a 550 nm (A_ce._rt) □□u ser de aproximadamente 0,5, o que indicou uma densidade celuθ lar de aproximadamente 1 x 10 células/ml. A cultura foi arrefecida durante dez minutos num banho-maria com gelo e as céí. M lulas foram então colhidas por centrifugação a 4000 g durante minutos a 42C. 0 sedimento de células foi ressuspenso em 100 ml de MgSO^ lOmM frio e depois imediatamente sedimentado por centrifugação. O sedimento de células foi ressuspenso em 100 ml de CaCL₂ 30mM e incubado em gelo durante 20 minutos.

As células foram novamente colhidas por centrifugação e ressuspensas em 10 ml de 30mM CaCl₂. Uma amostra de meio ml das células foi adicionada ao DNA ligado preparado no Exemplo 29A2; o DNA foi agitado a CaCl₂ 30mM. A mistura de células-DNA foi incubada em gelo durante meia hora, sugeito a choque térmico a 428C durante 90 segundos e depois arrefecida em gelo durante aproximadamente dois minutos. A mistura de células-DNA foi diluída para 10 ml de meio LB em frascos de 125 ml e incubada a 37QC durante uma hora. Amostras de cem microlitros foram semeadas em placas de agar LB contendo ampicilina e incubadas a 372C até aparecerem colónias.

As colónias foram cultivadas individualmente e o DNA de plasmídeo das colónias individuais foi examinado por análise com enzimas de restrição e electroforese em gel. O isolamente do DNA de plasmídeo foi efectuado numa escala mais pequena de acordo com o processo do Exemplo 29A1, mas o passo do gradiente de CaCl foi omitido até serem identificados os transformantes pretendidos de E. coli K12 MO()/pKC283PX. Na Figura 2 dos desenhos juntos está apresentado um mapa de sítios de restrição e funções do plasmídeo pKC283PX.

-57⁴· Construção de E. coli K12 M0(A+)/pKC283-L

Dez pg de DNA do plasmídeo pKC283PX preparado de acordo com o processo do Exemplo 29A1 foram dissolvidos com 20 pl do tampão de alto teor salino 10X, 20 ul de BSA a 1 mg/ml, 5 pl (-50 unidades) da enzima de restrição BglII, 5 ul (-50 unidades) da enzima de restrição Xhol e 150 μΐ de água e a reacção resultante foi incubada a 379C durante duas horas. A reacção foi parada e após precipitação do DNA digerido com BglII-Xhol, o DNA foi ressuspenso com 5 ul de tampão TE.

Um adaptador de DNA com extremos de cadeia simples caracterizado da clivagem com as enzimas de restrição BglII e Xhol foi sintetizado e fosforilado. O adaptador foi fosforilado substancialmente de acordo com o processo do Exemplo 29A2. A adaptadora de DNA tem o seguinte estrutura .

5'-GATCTATTAACTCAATCTAGAC-3'

IIIIIIIIIIII I I I I I I 3'-ataattgagttagatctgagct-5'

O adaptador atrás descrito foi sintetizado a partir dos desoxioligonucleotídeos de cadeia simples por processos bem conhecidos. Os desoxioligonucleotídeos de cadeia simples podem ser sintetizados com instrumentos que estão comercialmente disponíveis, tais como o Sintetizador de DNA 380A comercializado pela Appliede Biosystems (850 Lincoln Centre Drive, Foster City, CA 94404), o qual utiliza química de fosforamidetos.

São também conhecidos outros processos para a sintese de DNA.

método de fosfotricóter convencional modificado para a síntese de DNA de cadeia simples está descrito em Itakus et al., 1977, Science 198: 1056 e em Crea et al., 1978, Proc. Nat. Acad. Scí. USA 75: 5765. Ainda, um método especialmente preferido para a síntese de DNA está descrito em Hsiung et al., 1983. Nucleic Acid Research 11: 3227 e Naran et al., 1980, Methodo in Enzymology 68: 90.

O adaptador e o plasmídeo pKC283PX digerido com BglII-Xhol foram ligados essencialmente de acordo com o processo do Exemplo 29A2. O DNA ligado constitui o plasmídeo pretendido pKC283-L. Na Figura 3 dos desenhos juntos está apresentado um mapa de síntios de restrição e funções do plasmídeo pKC283-L. O DNA de plasmídeo pKC283-L foi usado para transformar E-. Coli K12 ΜΟ/(λ⁺) e os transformantes resultantes de E. coli K12 (?\⁺)/pKC283-L, foram identificados essencialmente de acordo com o processo do Exemplo 29A3.

5. Construção de E. coli K12 MO() ZpKC283-LB

Cerca de 10 pg de DNA do plasmídeo pKC283-Lpreparado substancialmente de acordo com os processos do Exemplo 29A1, foram dissolvidos em 20 yil de tampão de alto teôr salino ΙΟχ, 20 pl de BSA a lmg/ml, 5 jil (-50 unidades) da enzima de restrição Xhol e 155 ul de M₂O e a reacção resultante foi incubada a 372C durante duas horas. O DNA do plasmídeo pKC283-L digefido com Xhol foi então precipitado da mistura de reacção pela adição de três volumes de etanol a 95% e um décimo do volume de acetato de sódio 3M, incubação num banho de neve carbónica-etanol durante cinco minutos e centrifugação. O sedimento de DNA resultante foi lavado com etanol a 70%, seco e ressuspenso em 2 ml de tampão de nick-59-translation 10X (0,5M Tris-HCl, pH 7,2; 2,1M MgSO^; e lmM DTT) , 1 jjI de uma solução 2mM para cada um dos trif osf atos de desoxinucleotídeos , 15 jul de f^O, 1 jil (~6 unidades como definido por P-L Biochemicals) de Klenow, o qual é o fragmento grande do DNA-polimerase I de E. co Help! de BSA a lmg/ml.

A reacção resultante foi incubada a 25SC durante 30 minutos; a reacção foi parada por incubação da solução a 70QC durante cinco minutos.

Adaptadores BamHI (5'-CGGGATCCCG-3') foram fosforilados e ligados com o DNA do plasmídeo pKC 283-L digerido com Xhol e tratado com Klenow essencialmente de acordo com o processo do Exemplo 29A2. Depois da reacção de ligação o DNA foi digerido com cerca de 100 unidades de BamHI durante cerca de 2 horas a 37SC em tampão de alto teor salino. Após a digestão com BamHI, o DNA foi preparado para ligação essencialmente de acordo com o processo do Exemplo 29A2 .

O fragmento de restrição BamHI -5,9 Kb foi circularizado por ligação e usado para transformar E.. coli K12 ΜΟ(λ⁺) essencialmente de acordo com os processos dos Exemplos 29A2 e 29A3. Os transformantes E. coli K12 MO(λ⁺)/pKC283-LB foram identificados e depois o DNA do plasmídeo DKC283-LB foi preparado essencialmente de acordo com o processo do Exemplo 29A1. Na Figura 4 dos desenhos juntos está apresentado um mapa de sítios de restrição e funções do plasmídeo pKC283-LB.

6. Construção de E. coli K12 MO(^⁺)/pL32

Cerca de 10 pg do plasmídeo pKC 283PX foram digeridos com a enzima de restrição Sall em tampão

-60de alto teor salino, tratados com Klenow e ligados a adaptadores EcoRI (5'-GAGGAATTCCTC-3') essencialmente de acordo com o processo do Exemplo 29A5, com excepção do plasmídeo de partida, enzima de restrição e adaptadores usados. Após digestão com a enzima de restrição EcoRI, que resulta na remoção do DNA de -2,1 Kb, o fragmento de restrição EcoRI -4,0 Kb foi circularizado por ligação para dar o plasmídeo pKC283PRS. O DNA ligado foi usado para transformar E. coli K12 Μ0(^⁺) essen cialmente de acordo com o processo do Exemplo 29A3. Após terem sido identificados os transformantes E. coli K12 MO()\⁺)/pKC 283PRS, o DNA do plasmídeo pKC283PRS foi preparado essencialmente de acordo com o processo do Exemplo 29A1. Na Figura 5 dos desenhos juntos está apresentado um mapa de sítios de restrição e funções do plasmídeo pKC283PRS.

Cerca de 10 pg do plasmídeo pKC 282PRS foram digeridos em 200 pl de tampão de alto teor salino com cerca de 50 unidades de cada uma das enzimas de restrição PstI e Sphl. Após incubação da reacção a 37QC durante aproximadamente 2 horas, a mistura de reacção foi sujeita a electroforese num gel de 0,6% de agarose de baixo ponto de fundo (FMC Corporation, Marine Colloids Division, Rockland, Maine 04841) durante 2-3 horas a ~13QV e -75mA em tampão tris-acetato.

gel foi corado numa solução diluida de brometo de etídio e a bamda de DNA constituindo o fragmento de restrição PstI-Sphl -0,85 Kb, o qual foi rimalizado com luz de UV de grande comprimento de onda, foi cortado do gel num segmento pequeno. 0 volume do segmento foi determinado por peso e densidade do segmento e um volume igual de lOmM Tris-HCl, pH 7,6 foi adicionado ao tubo contendo o segmento. 0 segmento foi então fundido por incubação a 72QC.

Cerca de 1 pg do fragmento de restrição Parl-Sphl de -0,85 Kb do plasmídeo pKC283PRS foi obtido num volume de aproximadamente 100 yxl. De modo análogo o plasmídeo pKC283-LB foi digerido com as enzimas de restrição PstI e Sphl e o fragmento de res-61trição resultante de -30 Kb foi isolado por electroforese em gel de agarose e preparado para ligação.

O fragmento de restrição PstI-Sphl

-0,05 Kb do plasmídeo pKC283PRS foi ligado ao fragmento de restrição PstI-Sphl -3,0 Kb do plasmídeo pKC283-LB substancialmente de acordo com o processo do Exemplo 29A2. 0 DNA ligado constituiu o plasmídeo pretendido pL32. Na Figura 6, dos desenhos juntos está apresentado um mapa de sítios de restrição e funções do plasmídeo pL 32. O plasmídeo pL32 foi usado para transformar células E. coli K12 MO(X⁺) substancialmente de acordo com o processo do Exemplo 29A3. O DNA do plasmídeo pL32 foi preparado a partir dos transformantes E. coli K12 MO(\⁺)/pL32 essencialmente de acordo com o processo do Exemplo 29A1. A análise do DNA do plasmídeo pL32 demonstrou que mais de um adaptador EcoRI se ligou ao plasmídeo pKC283PX de extremos Sall e tratado com Klenow. A presença de mais de um adaptador EcoRI não afectou a utilidade do plasmídeo pL32 ou derivado do plasmídeo pL32 e pode ser detectado pela presença de um sítio de restrição Xhol, o qual é gerada sempre que dois adaptadores EcoRI estão ligados um ao outro. Como alternativa o plasmídeo pL32 pode ser construído fazendo a excisão Sall-EcoRI e ligação do principio do primeiro parágrafo deste Exemplo ao plasmídeo DKC283LB.

7. Construção de E. coli K12 MQ(>⁺)/pL47

E. coli K12 RV308/pNM 789 pode ser adquirida aos Northern Regional Research Laboratories na forma liofilizada com o número de acesso NRRL B-18216. Na Figura 7 dos desenhos juntos está apresentado um mapa de sítios de restrição e funções de pNM 789. O DNA do plasmídeo foi extraído

-62da cultura essencialmente de acordo com os ensinamento do 2xem pio 1, escepto a temperatura de incubação ser de 372C. Dez microgramas de pNM 789 foram ressuspensos em 200 pl de tampão PouII (50mM Tris-HCl, pH 7,5), 60 mM NaCl e 6 mM MgCl₂). Adicionou-se uma unidade de PouII e a mistura de reacção foi incubada durante cinco minutos a 372C. A enzima foi inactivada por aquecimento durante 10 minutos a 653C, 30 pl de tampão BamII 10X (200mM Tris-HCl, pH 8,0), 1M NaCl e 70 mM MgCl₂), 70pl de H₂O e 10 unidades de BamHI foram em seguida adicionados e a reacção foi incubada durante 1 hora a 372C. Isto foi seguido da adição de 5 unidades de fosfatase alcalina e incubação durante 1 hora a 652C. Os fragmentos de DNA foram separados num gel de 1 por cento de agarose e um fragmento de DNA (Figura 8) do tamanho de um fragmento com um único corte foi purificado.

Sintetizou-se um adaptador de DNA com um extremo cerse e um extremo BamHI essencialmente de acordo com os ensinamentos do Exemplo 29A4. Este adaptador (mostrado em 118 na Figura 8) tem a seguinte estrutura:

5'-CTGTGCCTTCTAG-3’

3'-gÀcÀcGgÀÀgÀtCCTAG-5'

O adaptador foi fosforilado e ligado ao plasmídeo pNM789 digerido com BalHI-PouII essencialmente de acordo com os ensinamentos do Exemplo 29A2. Esta mistura de ligação foi usada para transformar células de E. coli K12 RV308 e o isolamento do plasmídeo foi efectuado nestes transformantes essencialmente de acordo com os ensinamentos do Exemplo 29A3. Foram seleccionados vários plasmídeos que contem o fragmento PouII do

-63tamanho adequado (494 pb) e o fragmento Xbal-BamHI (628 pb).

A sequência de pelo menos dois destes foi determinado por sequenciação a partir do sítio BamHI até ao sítio único Snal e seleccionou-se um clone com a sequência pretendida. Este plasmídeo intermediário foi designado plasmídeo 120. Na Figura 8 dos desenhos juntos está apresentado um esquema deste processo e um mapa dos sítios de restrição e funções do plasmídeo 120 .

Para isolar o DNA codificado de EK-BGH, cerca de 10 pg do plasmídeo 120 foram digeridos em 200 pl de tampão de alto teor salino contendo cerca de 50 unidades de cada uma das enzimas de restrição Xbal e BamHI. Os produtos de digestão foram separados por electroforese em gel de agarose e o fragmento de restrição Xbal-BamHI de -0,6 kb que codifica EK-BGH foi isolado e preparado para ligação essen cialmente de acordo com o processo do Exemplo 29A6.

O plasmídeo pL32 foi também digerido com os enzimas de restrição Xbal e BamHI e o fragmento de restrição ~3,9 kb foi isolado e preparado para ligação. O fragmento de restrição Xbal-BamHI -3,9 kb do plasmídeo pL32 foi ligado ao fragmento de restrição Xbal-BamHI -0,6 kb do plasmídeo 120 essencialmente de acordo com o processo do Exemplo 29A2 para dar o plasmídeo pL47. Na Figura 9 dos desenhos juntos está apresentado um mapa de restrição e funções do plasmídeo pL 47. O plasmídeo pL 47 foi usado para transformar E. coli K12 MO(2\⁺) substancialmente de acordo com o processo do Exemplo 29A3 e os transformantes E. coli K12 MO(À⁺)/PL47 foi preparado a partir dos transformantes essencialmente de acordo com os processos do Exemplo 29A1.

-648. Construção de E. coli K12 RV308/pPR12ARI plasmídeo pPR12 compreende o gene do repressor pL sensível à temperatura cI857 e o plasmídeo do gene que confere resistência à tetraciclina do plasmídeo pBR322. 0 plasmídeo pPR12 está descrito e reivindicado na Patente U.S. ff 4.436.815 publicada em 13 de Março de 1984. Na Figura 10 dos desenhos juntos está apresentado um mapa de sítios de restrição e funções do plasmídeo pPR12 . Cerca de 10 ug do plasmídeo pPRl2 foram digeridos com cerca de 50 unidades da enzima de restrição EcoRI em 200 ul de tampão de alto teor salino a 375C durante duas horas. O DNA do plasmídeo pPRl2 digerido com EcoRI foi precipitado e tratado com Klenow essencialmente de acordo com o processo do Exemplo 29A5. Após a reacção com Klenow o DNA do plasmídeo pPRl2 digerido com EcoRI e tratado com klenow foi recircularizado por ligação essencialmente de acordo com o processo do Exemplo 29A2. O DNA ligado, que constitui o plasmídeo pretendido pPRl2àRl, foi usado para transformar E. coli K12 RV308 essencialmente de acordo com o processo do Exemplo 29A3, excepto a selecção ter-se baseado na mistura da resistência à tetraciclina (5ug/ /ml) e são na resistência à ampicilina. E. coli K12 RV308 está disponível na NRRL com o número de acesso NRRL B-15624. Após identificação dos transformantes E. coli K12ARV208/pPR12ARl, o DNA do plasmídeo pPRl2ARl foi preparado a partir dos transformantes essencialmente de acordo com o processo do Exemplo 29A11.

Cerca de 10 ₍ug do plasmídeo pPRl2 ARI foram digeridos com cerca de 50 unidades da enzima de restrição Aval em 100 pl de tampão de médio teor salino a 379C durante 2 horas. O DNA do plasmídeo pPR12ARl digerido com Aval foi precipitado e tratado com klenow essencialmente de acordo com o processo do Exemplo 29A5. Após a reacção com Klenow, o DNA do plasmídeo pPR12 Rl digerido com Aval e tratado com Klenow foi ligado a adaptadores EcoRI (5'-GAGGAATTCCTC-3')

essencialmente de acordo com o processo do Exemplo 29A2. Após a ligação do adaptador, o DNA foi precipitado e depois ressuspenso em cerca de 200 pl de tampão de alto teor salino contendo cerca de 50 unidades da enzima de restrição EcoRI. A recção resultante foi incubada a 37SC durante cerca de 2 horas. Após a digestão com EcoRI, a mistura de reacção foi aplicada s num gel de agarose e o fragmento de restrição EcoRI de -5,1 kb foi purificado essencialmente de acordo com o processo do Exemplo 29A6. O fragmento de restrição EcoRI -5,1 kb foi recircularizado por ligação essencialmente de acordo com o pro/ cesso do Exemplo 29A2. O DNA ligado constituiu o plasmídeo pretendido pPR12ARl. 0 DNA do plasmídeo pPR12ARl foi usado para transformar E. coli K12 RV308 essencialmente de acordo com o processo do Exemplo 29A3, excepto a selecção ter-se baseado na resistência à tetraciclina e não na resistência à ampicilina. Após identificação dos transformantes E. coli K12 RV308/pPRl2ARl, o DNA do plasmídeo pPR12ARl foi preparado essencialmente de acordo com o processo do Exemplo 29A1. Na Figura 11 dos desenhos juntos está apresentado um mapa dos sítios de restrição e funções do plasmídeo pPR12ARl.

9. Construção de E. coli K12 RV308/pL110

Cerca de 10 ug de DNA do plasmídeo pPRl2ARl foram ressuspensos em cerca de 200 pl de tampão de elevado teor salino contendo cerca de 50 unidades de cada uma das enzimas de restrição PstI e EcoRI e a reacção de digestão foi incubada a 37QC durante aproximadamente 2 horas. A mistura de reacção foi então aplicada num gel de agarose e o fragmente de restrição PstI-EcoRI -2,9 kb do plasmídeo pPRl2 ARl foi isolado e preparado para ligação essencialmente de acordo com o processo do Exemplo 29A6.

Cerca de 10 pg do plasmídeo pL47 foram digeridos com as enzimas de restrição PstI e BamHI em 200 pl de tampão de alto teor salino a 372C durante duas horas. 0 DNA digerido com Pst I- Bam HI foi aplicado num gel de agarose e o fragmento de restrição PstI-BamHI -2,7 kb que compreende a origem de replicação e uma fracção do gene que confere resistência à ampicilina foi isolada e preparado para ligação essencialmente de acordo com o proceseo do Exemplo 29A6. Numa reacção separada, cerca de 10 pg de DNA do plasmídeo pL47 foram digeridos com as enzimas de restrição EcoRI e BamHI em 200 pl de tampão de alto teor salino a 372C durante duas horas e o fragmento de restrição EcoRI-BamHI -1.03 kb que compreende a nova sequência activadora da transerição e tradução e o DNA codificadora de EK-BGH foi isolado e preparado para ligação essencialmente de acordo com o processo EcoRI-BamHI -1,03 kb obtidas foram usadas na construção do plasmídeo pLUO.

Os fragmentos de restrição Pstl-BamHI -2,7 kb e EcoRI-BamHI -1,03 kb do plasmídeo pR47 foram ligados ao fragmento de restrição PstI-EcoRI -2,9kb do plasmídeo pPRl2ARl para construir o plasmídeo pLUO e o DNA ligado foi usado para transformar .E. coli K12 RV308 essencialmente de acordo com os processos dos Exemplos 29A2 e 29A3, excepto ter-se usado a resistência à tetraciclina e não a resistência à ampicilina como base da selecção dos transformante.

Dois sítios de reconhecimento da enzima de restrição PstI estão presentes na região codificadora de Ek-BGH que não estão descritos nos mapas de sítios de restrição e funções do plasmídeo pLUO.

10. Construção de E. coli K12 RV308/pLll0C

a. Construção de E, coli K12 RV308/pL110A

Cerca de 1 pg de DNA do plasmídeo pLUO foi digerido com a enzima de restrição Ndel em 20 pl de volume total contendo 2 pl de tampão de alto teor salino lOx (1,0 M NaCl; 0,50M Tris-HCl, pH = 7,5; o,10M MgC/; e ditiotreitol lOmM) e 3 unidades da enzima Ndel durante 1 hora a 37SC. A mistura de reacção foi extraída com fenol/clorofórmio e o DNA precipitado com etanol. O DNA do plasmídeo pLUO digerido com Ndel foi dissolvido em 50 pl de tampão Klenow lx (40mM KP(/, pH = 7,5; 6,6mM MgC^; 1, OmM 2-mercaptoetanol;

pM dATP; 33 pM dCTP; 33 pM dGTP; e 33 pM TTP). Dois pl (-10 unidades, New England Biolabs) do fragmento grande do DNA-polimerase I de E. coli conhecida com klenow, foram adicionados e misturados com o DNA e a reacção resultante foi incubada a 162C durante 1 hora. A reacção foi terminada por extracção com fenol e o DNA purificado convencionalmente. O DNA digerido com Ndel e tratado com Klenow foi então ligado com DNA-ligase de T4 a 4SC durante 16 horas. O DNA resultante foi usado convencionalmente para transformar E. coli K12 estirpe RV308 (NRRL B-15624). Os transformante foram seleccionados em placas de L-agar contendo 100 pg/ml de ampicilina e os plasmídeos isolados a partir das colónias resistentes pelo processo rápido de extracção alcalino descrito por Birnboim e Doly. Seleccionou-se um plasmídeo (pLllOA na Figura 13) sem um sítio Ndel.

b. Construção do Fago pLllOB por Mutagénese Específica de

Sítio

O protocolo para a eliminação do sítio BamHI no gene que confere resistência à tetraciclina por

-68mutagénese específica de sítio está apresentado no lado direito da Figura 13 dos desenhos juntos.

b(i) Construção do Fago M13Tc3

O plasmídeo pL.110 serviu de fonte do gene que confere resistência à tetraciclina. Cerca de 50 pg do plasmídeo pLUO em 50 μΐ de tampão TE foram adicionado a 25 μΐ de tampão HindIII lOx e 170μ1 de H?O. Cerca de 5 μΐ (-50 unidades) da enzima de restrição HindIII fofam adicionados à solução de DNA do plasmídeo pLUO e a reacção resultante foi incubada a 372C durante 2 horas. Cerca de 13 μΐ de 2M Tris.HCl, pH = 7,4 e 5 μΐ (-50 unidades) da enzima de restrição EcoRI foram adicionados ao DNA do plasmídeo pLUO digerido com Hind III e a reacção foi incubada durante mais 2 horas a 37SC. A reacção foi parada através da extracção da mistura de reacção com fenil saturado com TE; o fenol foi removido por extracções com clorofórmio. O DNA do plasmídeo pLUO digerido com EcoRI. HindIII foi então colhido por precipitação e centrifugação, aplicado num gel de 1% de agarose e o fragmento de restrição grande EcoRI-HINDIII -4,3 kb foi isolado e purificado.

Cerca de 5 μg do fago ml3mpl8 (New England Biolabs) foram dissolvidos em 50 μΐ de tampão TE e depois digerido com HindIII e EcoRI como descrito atrás. O DNA do fago H13mpl8 cortado com HINDIII-EcoRI foi purificado como descrito para pLUO excepto ter-se isolado e purificado um fragmento de restrição -7,25 kb.

Cerca de 100 nanogramas do fragmento HindIII-EcoRI -4,3 kb do plasmídeo pLUO foram misturados com cerca de 100 nanogramas do fragmento HindIII-EcoRI -7,25 kb do fago M13mpl8, 2 μΐ de tampão ligase ΙΟχ, 1 μΐ (-100 unidades) de DNA-ligase de T4 e 14 μΐ de H₂O. A reacção de ligação foi incubada a 15QC durante 1,5 horas; o DNA liga-69do constitui o DNA do fago pretendido ml3TC3. Na Figura 13 dos desenhos juntos está apresentado um mapa de sítios de restrição e funções do fago ml3TC3.

Um ml da cultura que cresceu duran te a noite de E. coli K12 JM109 (E. coli K12 JM101, que pode ser adquirido á New England Biolobs, pode ser usada em vez de 12. coli K12 JM109) foi usado para inocular 50 ml de caldo L e a cultura resultante foi incubada a 37QC com arejamento até a ΟΟ^^θ estar entre 0,3 e 0,1. As células foram ressuspensas em 25 ml de lOmM NaCl, incubadas em gelo durante 10 minutos e colhidos por centrifugação. As células foram ressuspensas em 1,25 ml de 75mM CaCl₂; retirou-se uma amostra de células de 200 μΐ, adicionou-se 10 ul do DNA ligado preparado atrás e incubou-se em gelo durante 40 minutos. A mistura de células-DNA foi então incubado a 42SC durante 2 minutos e diferentes amostras (1,10 e 100 ul) foram removidas e adicionadas a 3 ml de agar de topo (caldo L com 0,5% de agar mantido fundido a 452C) o qual também continha 50 ul de X-Gal a 2%, 50 μΐ de lOOmM IPTG e 200 μΐ de E. coli K12 JM109 na fase de crescimento logarítmico. A mistura de células-agar de topo foi então semeada em placas de agar L contendo 40 pg/ml de X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-tiogalactosido) e O.lmMIPTG (isopropil-p-D-tiogalactosido) e as placas foram incubadas a 37SC durante a noite.

Na manhã seguinte várias placas transparentes, em oposição às azuis, foram usadas individualmente para inocular 2 ml de caldo-L e as culturas resultantes foram incubadas a 37SC em arejamento durante 2 horas. A ausência de côr azul indica a presença da inserção de DNA pretendida. Em seguida, as culturas foram centrifugadas e 200 um do sobrenadante resultante foram adicionados a cultura de 10 ml (00550=0,5) de EI. coli K12 JM 109 a crescer a 372C com arejamento. Estas culturas foram incubadas durante mais 30 minutos a 37SC; em seguida, as células foram a sedimentadas por centrifugação e usadas para preparar a forma replicativa do fago

-70recombinante que elas contêm. Isolou-se DNA fágico de cadeia dupla, forma replicativa, e partir das células usando uma versão de escala mais pequena do processo descrito no Exemplo 1. Os transformantes contendo DNA fágico ml3Tc3 foram identificados por análise em enzimas de restrição do seu DNA fágico.

B5ii) Preparação de DNA de cadeia simples do fago m!3Tc3

Um ml e meio de uma cultura crescida durante a noite de E. coli K12 JM109/ml3Tc3 foi centrifugada e 100 jjl de sobrenadante contendo o fago ml3Tc3 foram usados para inocular uma cultura de 25 ml de E. coli JM 109 a uma UOggQ d® aproximadamente 0,4-0,5. A cultura foi incubada durante 6 horas a 372C com arejamento, altura em que a cultura foi centrifugada e o sobrenadante resultante, cerca de 20 ml, transferido para um novo tubo. Cerca de 2 ml de uma solução contendo polietilenoglicol (PEG) 6000 a 29% e 14,6% de NaCl foram adicionado ao sobrenadante que foi então incubado em gelo durante 20 minutos.

O sobrenadante foi centrifugado durante 25 minutos a 7000 rpm e o sedimento resultante, o qual continha DNA de cadeia simples do fago ml3Tc3, foi ressuspenso em 500 pl de tampão TE. A solução de DNA foi extraída duas vezes com fenol saturado com TE e duas vezes com clorofórmio.

O DNA de cadeia simples foi então precipitado usando NaOAc e etanol e centrifugado. O sedimento resultante foi lavado com etanol a 70%, seco e depois dissolvido em 60 pl de f^O.

b (iii ) Mutagénese fragmento de DNA de cadeia simplas usado na mutagénese foi sintetizado num sintetizador de DNA automático. O fragmento tem a sequência 5¹-CCCGTCCTGGATA-CTCTACGCCGA-3· e é homólogo da região que rodeia o sítio BamHI (5¹-GGATCC-3') no gene que confere resistências à tetraciclina do plasmídeo pBR322, excepto o resíduo A segundo a partir do extremo 5' (ou terceiro a partir do extremo 3') ser um C no plasmídeo pBR322. Esta alteração não modifica a composição em aminoácidos de proteína que confere resistência à tetraciclina mas elimina o sítio BamHI.

Cerca de 10 picomoles do iniciador mutagénico e do iniciador universal M13 (Bethesda Research Laboratories (BRL), P.O. Box 6009, Gaithexsburg, MD 20760) foram tratados individualmente com 10 unidades (BRL) de polinucleotídeo-cinase de T4 em 20 pl de tampão cinase lx (60mM Tris-HCl, pH - 7,8, 15mM 2-mercaptoetanol; lOmM MgCl₂; e 0,41 pM ATP) durante 3 minutos a 372C. Os DNAs foram usados no processo de mutagénese descrito abaixo.

A reacção de emparelhamento foi efectuada misturando 300 nanogramas (1,2 pl) do fago ml3Tc3 de cadeia simples, 1 picomole (2 pl) do iniciador universal, picomole (2 pl) do iniciador mutagénico, 2 ul de tampão de emparelhamento lOx (lOOmM Tris-HCl, pH = 7,5; lmM EDTA; e 500 mM NaCl) e 12,8 pl de H₂O. A reacção foi incubada a 802C durante 2 minutos, a 502C durante 5 minutos, e, depois deixada arrefecer até à temperatura ambiente.

A reacção de extensão foi efectuada adicionando 5 pl do tampão de extensão lOx (500mM Tris-HCl, pH = 8; lmM EDTA; e 120mM MgCl₂); 5 pl de 2mM dATP; 1 pl de uma solução 6mM para cada dGTP, TTP e dCTP; 1 pl (-2 unidades Pharmacia P-L Biochemacals, 800 Centennial Avenue, Piscataway

-72NJ 08854) de enzima Klenow; 1 pl (100 unidades) de DNA-ligase de T4; e 17 pl de f^O à mistura de DNA emparelhado. A reacção de extensão foi incubada à temperatura ambiente durante 1 hora, depois a 372C durante 2,5 horas e depois durante a noite a 4SC.

A reacção foi parada por duas extenções com fenol saturado com TE, as quais foram seguidas de duas extracções com CHCl^. O DNA foi precipitado com etanol e NaOAc. O DNA foi colhido por centrifugação e ressuspenso em 50 pl de tampão 51 lOx foram então adicionados à solução de DNA.

A solução de DNA foi dividida em partes iguais por três tubos. A dois dos tubos adicionou-se cerca de 200 unidades (Miles Laboratories) de nuclease Sl.

Uma reacção Sl foi incubada à temperatura ambiente durante 5 minutos e a outra durante 10 minutos. A reacção foi parada por extracção da mistura de reacção duas vezes com fenol saturado com TE. As extracções com fenol foram seguidas de duas extracções com clorofórmio; em seguida, o DNA foi precipitado a partir da mistura de reacção com NaOAc e etanol. A amostra de DNA não tratada serviu como testemunha negativa. As amostras tratadas com Sl foram mantidas separadas umas das outras ao longo do restante processo mas de resultados semelhantes.

Os sedimentos de DNA foram ressuspensos em 20 pl de f^O e 10 pl de solução resultante foram usadas para transformar E. coli K12 JM109 (E. coli K12 JM101 pode também ser usada) de acordo com o processo usado durante a construção do fago ml3Tc3, excepto não se ter adicionado às placas IPTG ou X-Gal.

DNA de cadeia dupla, forma replicativa de aproximadamente 48 placas foi isolado como descrito atrás e despistado quanto à presença de um sítio de restrição BamHI. Os isolados sem um sítio BamHI foram ainda despistados

-73preparando DNA de cadeia simples como descrito atrás. 0 DNA de cadeia simples foi sequenciado usando o método de sequênciação didesoxi (J. H. Smith, 1980, Methods in Enzymology 65: 560-580). O isolado pretendido foi designado pLUOB (Figura 13).

c. Construção do plasmídeo pLUOC

Cerca de 50 ug de forma replicativa de DNA do fago pLUOB foram digeridos em 250 ul de tampão Nhel lx (50mM NaCl; 6mM Tris.HCl, pH = 7,5; 6mM MgCl₂; e 6mM-B-mercaptoetanol) contendo -50 unidades da enzima de restrição Nhel a 378C, durante a cerca de 2 horas. Cindo ul de 5M NaCl foram então adicionados ao DNA do fago pLUOB digerido com Nhel, seguido de 5 ul (-50 unidades) da enzima de restrição Sall. A digestão continuou durante 2 horas a 37OC. O fragmento pretendido Nhel-6all -422 pb contendo a região mutagenizada do gene que confere resistência à tetraciclina foi então isolado a partir de um gel de acrilamida, de acordo com processos convencionais bem conhecidos.

DNA do plasmídeo pLllOA foi digerido com Nhel e Sall em condições idênticas, excepto o plasmídeo pLllOA ter substituído o fago pLUOB. O fragmento de restrição Nhel-Sall -6,1 kb do plasmídeo pLllOA foi purificado a partir de agarose.

O plasmídeo pretendido pLUOC foi construído ligando 100 nanogramas de cada um dos fragmentos Nhal-Sall de pLllOA (-6,1 kb) e de pLUOB (-422 pb) usando pro cessos convencionais. Na Figura 13 dos desenhos juntos está apresentado um mapa dos sítios de restrição e funções do plasmídeo pLUOC. O plasmídeo pretendido pLUOC confere resistência à tetraciclina para 10 ug/ml de tetraciclina em E. coli mas não possui um sítio BamHI no gene que confere resistência

-74à tetraciclina.

11. Construção do plasmídeo pCZRlll plasmídeo pLllOC contem um único sítio de restrição Ciai o qual foi removido pelas reacções seguintes. Cerca de 1 pg do plasmídeo pLllOC foi digerido com Ciai essencialmente de acordo com o ensinamento do Exemplo 29A2, excepto ter-se usado a enzima de restrição Ciai e tampão Ciai lOx (500 mM NaCl, 110 mM Tris-HCl (Ph 7,9) e lOOmM MgCl₂). O DNA digerido com Ciai foi então tratado com klenow essencial^ mente de acordo com o Exemplo 29A5 excepto ter-se adicionado apenas dATP em vez dos quatro dNTPs.

O DNA foi então precipitado e ressuspenso em 50 pl de tampão Mung Bean Nuclease (50raM acetato de sódio (pH 5,0), 30mM NaCl e lmM ZnSO₄). Uma unidade de Mung Bean Nuclease (adquirida à New England Biolabs) foi então adicionada e a reacção incubada a 30QC durante 30 minutos.

O tubo foi então colocado em gelo e adicionado NaCl para 0,2M, em seguida a mistura foi extraída com fenol/clorofórmio, precipitado com etanol e ressuspenso em lOmM Tris-HCl (pH 8,0).

O DNA foi então auto-ligado e usado para transformar células E. coli substancialmente de acordo com os ensinamentos dos Exemplos 29A3 e 29A4. O plasmídeo resultante foi designado plasmídeo pCZRlll.

12. Construção do Plasmídeo pCZR126S

Cerca de 26 pg do plasmídeo pCZRlll foi digerido com Xbal como se segue. O tampão Xbal lOx consiste em 600mM tris-HCl, lOOmM MgCl₂, 1M NaCl e lOmM 2-mercaptoetanol, pH 7,5 (a 37SC), 50 pl de tampão Xbal lOx 15 pl de Xbal

-75(lOU/ml) e 185 pl de H₂O foram adicionados aos 250 pl de água contendo cerca de 25 pg do plasmídeo pLUO. A digestão prosseguiu a 37SC durante 1 hora. pLllO digerido com Xbal foi então extraído em fenol, adicionou-se 1/10 do volume de 3M CH^COO-Na e 3 volumes de etanol; a mistura foi incubada num banho de neve carbónica-etanol durante 5 minutos e depois centrifugado. O DNA precipitado foi ressuspenso em 50 pl de H₂O.

O plasmídeo pCZRlll digerido Xbal foi digerido com BamHI como se sehue. 0,2 pl de BamHI (lOU/ul), 10 pl de tampão BamHI (lOOmM Tris-HCl, 50mM MgCl₂, 1M NaCl e lOmM 2-mercaptoetanol, pH 8,0 (a 37OC) e 90 pl de H₂O foi adicionado aos 50 pl de pLUO digerido com Xbal atrás. A digestão prosseguiu durante 5 minutos a 372C. O pCZRlll digerido foi extraído em fenol,.adicionou-se 1/10 do volume de CH^COONa*, seguido de adição de 3 volumes de etanol. O DNA precipitado foi ressuspenso em 50 pl de tampão lOmM Tris, lmM EDTA, pH 8,0.

O pCZRlll digerido com Xbal e BamHI foi então aplicado num gel de agarose e a banda de DNA a cerca de 5,8 kb foi isolada. O plasmídeo pCZR126S foi produzido por ligação do fragmento de -5,8 kb do pCZRlll a um adaptador Xbal e Ndel e um gene sintetizado codificador de hormona de crescimento bovina-EK, o qual contem um sítio Ndel no seu extremo 5· e um sítio BamHI no seu extremo 3'. A sequência Xbal e Ndel foi produzida e usando metodologia convencional para sequências de oligonucleotídeo e consiste na seguinte sequência.

5' CTAGAGGGTATTAATAATGTATATTGATTTTAATAAGGAGGAATAATCA 3'

TCCCATAATTATTACATATAACTAAAATTATTCCTCCTTATTAGTAT 5'

A sequência acima foi construída por síntese química de ambas as cadeias, seguido de mistura para permitir a hibridação. 0 gene codificador de EK bGH foi construído a partir de 16 pedaços obtidos por síntese guímica de DNA de cadeia simples, variando entre 71 e 83 nucleotídeos de comprimento, os quais em conjunto constituem ambas as cadeias de todo o gene. A síntese foi feita usando uma máquina Applied Biosystems (AB5) e consiste na seguinte sequência:

5' TATGTTCCCATTGGATGATGATGATAAGTTCCCAGCCATGTCCTT llllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll!

ACAAGGGTAACCTACTACTACTATTCAAGGGTCGGTACAGGAA

GTCCGGCCTGTTTGCCAACGCTGTGCTCCGGGCTCAGCACCTGCATCAGCTGGCTGCTGA llllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll

CAGGCCGGACAAACGGTTGCGACACGAGGCCCGAGTCGTGGACGTAGTCGACCGACGACT

CACCTTCAAAGAGTTTGAGCGCACCTACATCCCGGAGGGACAGAGATACTCCATCCAGAA

IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIHIIIIHIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII

GTGGAAGTTTCTCAAACTCGCGTGGATGTAGGGCCTCCCTGTCTCTATGAGGTAGGTCTT

CACCCAGGTTGCCTTCTGCTTCTCTGAAACCATCCCGGCCCCCACGGGCAAGAATGAGGC

1111111111111111111111111111111111111111 III11111 111111111III

GTGGGTCCAACGGAAGACGAAGAGACTTTGGTAGGGCCGGGGGTGCCCGTTCTTACTCCG

CCAGCAGAAATCAGACTTGGAGCTGCTTCGCATCTCACTGCTCCTCATCCAGTCGTGGCT

Hllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll

GGTCGTCTTTAGTCTGAACCTCGACGAAGCGTAGAGTGACGAGGAGTAGGTCAGCACCGA

TGGGCCCCTGCAGTTCCTCAGCAGAGTCTTCACCAACAGCTTGGTGTTTGGCACCTCGGA

IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIHIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII

ACCCGGGGACGTCAAGGAGTCGTCTCAGAAGTGGTTGTCGAACCACAAACCGTGGAGCCT

CCGTGTCTATGAGAAGCTGAAGGACCTGGAGGAAGGCATCCTGGCCCTGATGCGGGAGCT 11111!! 11111111111111111! 11111111 1111111 111111111111111111! I GGCACAGATACTCTTCGACTTCCTGGACCTCCTTCCGTAGGACCGGGACTACGCCCTCGA

GGAAGATGGCACCCCCCGGGCTGGGCAGATCCTCAAGCAGACCTATGACAAATTTGACAC

1111 Η 1111111IIIII11111II11II1111111111111111111111111111111

CCTTCTACCGTGGGGGGCCCGACCCGTCTAGGAGTTCGTCTGGATACTGTTTAAACTGTG

AAACATGCGCAGTGACGACGCGCTGCTCAAGAACTACGGTCTGCTCTCCTGCTTCCGGAA

IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIINIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIHII

TTTGTACGCGTCACTGCTGCGCGACGAGTTCTTGATGCCAGACGAGAGGACGAAGGCCTT

GGACCTGCATAAGACGGAGACGTACCTGAGGGTCATGAAGTGCCGCCGCTTCGGGGAGGC lllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllillll

CCTGGACGTATTCTGCCTCTGCATGGACTCCCAGTACTTCACGGCGGCGAAGCCCCTCCG

CAGCTGTGCCTTCTAG 3'

1111111111111111

GTCGACACGGAAGATCCTAG 5'

A construção do plasmídeo pCZR126S foi então conseguida através da ligação dos seguintes sítios: -0,28 pg do fragmento de 5,8 kb obtido a partir do plasmídeo pLUO após a digestão completa com Xbal e digestão parcial com BamHI num volume total de 2 pl, _0,18 pg do gene sintético codificador de um derivado do factor de crescimento bovino que possui um extremo 5' correspondendo a um sítio Xbal e a um extremo 3' correspondente a um sítio BamHI num volume total de 2,5 pl, 8,75 picomoles do adaptador Xbal a Ndel sintetizado quimicamente em 1 pl. Os componentes do plasmídeo foram adicionados a 6 pl do tampão de ligação 5x: 250 mM tris-HCl, 50mM MgCl₂, 5mM ATP, 5mM DTT, 25% v/v de polietilenoglicol 8000, pH 7,6, 2 pl de ligase e 16,5 ul de H₂0. A mistura de ligação foi incubada durante a noite a 16SC. O plasmídeo pCZR 126S foi então usado para transformar células E. coli RV308 essencialmente de acordo com o método do Exemplo 29A3, Na Figura 14 dos desenhos juntos está apresentado um mapa dos sítios de restrição e funções do plasmídeo pCZRl26S.

-78B. Construção do Plasmídeo de Expressão da Proinsullna Humana

PRB172

1. Construção do plasmídeo pRB145 gene da proinsulina humana foi primeiro sintetizado e clonado no plasmídeo pUC18 (adquirido à BRL). O gene foi sintetizado usando técnicas convencionais e compreende a sequência:

HindIII Ndel DralII

5’ * AGCTTCAT * ATGTATTTTGTTAACCAACACCTGTGCGGCTCCCACCTG * GTGGAAGCTCT

AGTA TACATAAAACAATTGGTTGTGGACACGCCGAGGGTGGAC CACCTTCGAGA

GTACCTGGTGTGCGGTGAACGTGGCTTCTTCTACACCCCGAAGACCCGCCGTGAGGCA CATGGACCACACGCCACTTGCACCGAAGAAGATGTGGGGCTTCTGGGCGGCACTCCGT Avall Xmal

GAGIGACCTGCAGGTGGGTCAGGTGGAGCTGGGCGGTGGC *CCGGGTGCAGGCAGCCTGC CTC CTGGACGTCCACCCAGTCCACCTCGACCCGCCACCG GGCCCACGTCCGTCGGACG

AGCCGCTGGCCCTGGAGGGTTCCCTGCAGAAGCGTGGCATTGTGGAACAATGCTGTAC

TCGGCGACCGGGACCTCCCAAGGGACGTCTTCGCACCGTAACACCTTGTTACGACATG

BamHI

CAGCATCTGCTCCCTGTACCAGCTGGAGAACTACTGCAACTAG * GATCCG 3'

GTCGTAGACGAGGGACATGGTCGACCTCTTGATGACGTTGATC CTAGGCTTAAj 5'

EcoRI

Um dos clones tendo a sequência correcta foi seleccionado para a produção de DNA purificado em cloreto de césio. O plasmíeo foi isolado pelo processo convencional (ver por exemplo, Mole-19cular Cloning a Laboratory Manual, (1982) ed. por Maniatis, T; Fritsch, E.F. e SambrooK, J. , Cold Spring Harbour Laboratory Publications, New York, sendo todos os ensinamentos dele aqui incorporados por referência). Cerca de 6 pl (20 ug) deste DNA de plasmídeo foi adicionado a 20 pl de tampão Ndel 10X (150M NaCl, lOmM tris-HCl (pH 7,8), 6mM MgCl₂, 6mM 2-mercaptoetanol, 100 pg/ml de BSA), 5 pl da enzima de restrição Ndel (-40 unidades) e 169 pl de H₂0. Após mistura, a reacção foi incubada a 372C durante 2 horas. O DNA foi precipitado fazendo a mistura de 0,3M NaOAc, adicionando três volumes de etanol, misturando e arrefecendo até -702C e centrifugando. O sedimento de DNA foi levado com etanol a 70% (1 ml), seco e dissolvido em 20 pl de tampão BamHI lOx (150 mM NaCl, 6 mM Tris-HCl (pH 7,8), 6mM MgCl₂ , 100 pg/ml BSA), 2 pl da enzima de restrição BamHI (40 unidades) e 178 pl de Η₂<3. Após agitação suave, a reacção foi incubada a 372C durante 2 horas. O DNA foi novamente precipitado com três volumes de etanol como atrás e sujeito a electroforese num gel de 1% de agarose de ponto de fusão baixo (FMC, agarose do mar em placas). O fragmento de DNA pretendido correspondendo a cerca de 270 pb foi cortado do gel e depois o DNA foi recuperado por fusão da agarose e passando-a através de uma coluna Elutip-d (Schleicher & Schnell Keene, N.H.) de acordo com o processo recomendado pelo vendedor. Após precipitado e secagem o DNA foi guardado em 30 pl de lOmM tris-HCl pH 8,0.

Cerca de 15 pg do plasmídeo pCZR 126S (do Exemplo 29A12) foi ressuspenso em 20 pl de tampão Ndel lOx, 5 pl da enzima de restrição Ndel (40 unidades) e H₂O (175 ul) , agitado suavemente e incubado a 372C durante 2 horas. Após a incubação, o DNA foi precipitado com três volumes de etanol como atrás, seco e ressuspenso em 20 ul de tampão BamHI lOx, 2 pl da enzima de restrição BamHI (40 unidades) e 178 pl de água. Após mistura suave, a reacção foi incubada a 372C durante 2 horas. O DNA foi novamente precipitado com três volumes de etanol e sujeito a electroforese num gel de 1% de agarose de baixo ponto de fusão. O fragmento maior

-80correspondendo ao DNA vector foi cortado deste gel e o DNA recuperado pelo processo da coluna Elutip-d como descrito atrás. Após precipitação e secagem o DNA foi guardado em 30 pl de lOmM tris-HCl pH 8,0.

Cerca de 2,5 pl do DNA vector foi misturado com 12 pl do fragmento purificado do gene da insulina humana de atrás, 4 pl de lOmM ATP, 0,5 pl de ditiotreitol 1M, 5 pl de tampão ligase lOx (500mM Tris-HCl pH 7,6 e lOOmM MgC^), 26 pl de água e 0,5 pl de DNA-ligase de t4 (Pharmacia 3,5 unidades). A reacção foi incubada a 4CC durante 16 horas.

A mistura ligada foi diluída com 50 ul de lOmM Tris-HCl (pH 7,6) e 3 pl de 1M CaC^ e depois subsequentemente usada para transformar E. coli K12 RV308 essencialmente de acordo com os ensinamentos do Exemplo 29A3. As células foram semeadas em placas Ty suplementares com 5 pg/ml de tetraciclina e depois incubadas durante a noite a 32SC.

Os plasmídeos de cultura de 3 ml foram isolados a partir de colónias resistentes à tetraciclina pelo processo rápido de extracção alcalina descrito em Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1982) ed. por Maniatis, T., Fritoch, E.F., e Sambrook, J. Cold Spring Harbour publications, New York, (página 368-369). A presença do fragmento correcto do gene da proinsulina humana foi encontrada pelo processo de mini-despiste usando electroforese em gel de poliacrilamida para analisar o fragmento digerido com Xbal/BamHI. As inscrições dos plasmídeos com o tamanho correcto (cerca de 315 pb) foram seleccionadas para amplificar e purificar. O plasmídeo contendo o gene da proinsulina humana foi pRBl45. Na Figura 16 dos desenhos juntos está apresentado um mapa do sítios de restrição e funções do plasmídeo pRB145.

-812. Construção do plasmídeo pRB164A

Cerca de 30 pg do plasmídeo pRBl45 foi ressuspenso em 20 pl de tampão Ndel ΙΟχ, 5 pl da enzima de restrição Ndel (New England Biolabs, 40 unidades) e 175 ml de U^O suavemente misturados e incubados a 37SC 1 hora. Dois pl da enzima de restrição BamII (New England Biolabs, 40 unidades) foi então adicionado à mistura de reacção e a incubação a 37QC continuou durante mais 2 horas. O DNA foi precipitado com três volumes de etanol e 0,3M NaOAc e sujeito a electroforese num gel de 1% de agarose de baixo ponto de fusão. O fragmento de restrição mais pequeno Ndel/BamHI (cerca de 270 pb) codificador do gene da proinsulina humana foi cortado do gel e o DNA recuperado passando através de uma coluna Elutip-d como descrito atrás. Após precipitação e secagem o DNA foi guardado em 30 pl de lOmM tris pH 8,0.

A este DNA (30 Rl ) foi então adicionado 20 pl de tampão Avall lOx (50 mM NaCl, 6mM tris-HCl, pH 8,0, lOmM MgC^, 6mM 2-mercaptoetanol, 100 pg/ml de BSA), pl da enzima de restrição Avall (New England Biolabs, 20 unidades) e 175 pl de ^O. Após mistura suave, esta reacção foi incubada a 372C durante 2 horas. O DNA foi precipitado com três volumes de etanol e 3M NaOAc (20 pl) e depois sujeito a electroforese num gel de 12% de agarose de baixo ponto de fusão, O fragmento de restrição maior AvalI/BamHI (cerca de 156 pb) foi cortado do gel e depois o DNA foi recuperado por passagem através de uma coluna Elutip-d como descrito atrás. Após precipitação e secagem o DNA foi guardado em 30 pi de lOmM tris pH 8,0.

O DNA (-115 pb) correspondendo ao fragmento de restrição Ndel/Avall do gene da proinsulina humana foi preparado sintéticamente. O primeiro passo consistiu na sintese de quatro desoxi ribo pelo sintetizador de DNA (Applied Biosystems, modelo 380 B). As sequências de núcleo-82tídeos destes quatro oligonucleotídeos são:

1. TATGCGTATGTTTGTTAACCAACACCTGTGCGGCTCCCACCTG

GTGGAAGCTCTGTACCT (60 mer)

2. GGTGTGCGGTGAACGTGGCTTCTTCTACACCAAGCCGACC

CGCCGTGAGGCAGAG (55 mer)

3. CACCAGGTACAGAGCTTCCACCAGGTGGGAGCC

GCACAGGTGTTGGTTAACAAACATACGCA (62 mer)

4. GTCCTCTGCCTCACGGCGGGTCGGCTTGGTGTAGAA

GAAGCCACGTTCACCGCA (54 mer)

Após purificação de cada oligonucleotídeo por electroforese em gel de poliacrilamina, os oligonucleotídeos dois e três foram fosforilados de acordo com os ensinamentos de Brown, E.L., Belagaje, R. , Ryon, M.J., e Khorama, H.G. (1979) Methods in Enzymalogy, Ed. por Wu, R., Academic Press, N.Y. 68 , 109-151, todos os ensinamentos dos quais são aqui incluídos como referência. Os oligonucleotídeos fosforilados dois e três (-715 pmoles), emparelhado e ligados num tampão (200 pl) contendo 50mM tris-HCl (pH 7,6), lOmM MgCL₂ lOmM DTT, 50 pM ATP e 20 unidades de DNA-ligase de T4 (Pharmacia) durante 16 horas a 4SC. O produto de ligação foi purificado num·, gel de 15% poliacrilamida. O DNA foi recuperado electroforéticamente da fatia de gel seguido da remoção do sal numa coluna

-83de Sephadex G-50. 0 rendimento do produto ligado pretendido foi de 485 pmoles.

Cerca de 100 pmoles deste DNA foram fosforilados num tampão (50 ul) contendo 50 mM Tris (pH 7,6), lOmM MgCl₂, 10 mM DTT e ATP, como descrito em Brown, E. L. et al., (1979), Methods in Enzymology 68 , 109-151 cujos ensinamentos estão aqui incluidos como referência. Após filtração através de uma coluna de Sephadex G-50, o DNA foi guardado em 50 pl de lOmM Tris, pH 8,0.

Cerca de 2,5 pl do DNA vector (pCZR 126S digerido com Ndel-BamHI) foi misturado com 18 pl do fragmento de restrição AvalI/BamHI do plasmídeo pRB145 e 10 pl (10 pmoles) do adaptador sintético Ndel/Avall construído num tamanho (50 pl) contendo 50mM tris (pH 7,6), 10 mM MgCl₂, lOmM DTT, 800 pl ATP e 3,5 unidades de DNA-ligase de T4. A reacção foi incubada a 42C durante a noite e depois usada para transformar 12. coli K12 RV308 de acordo com o processo do Exemplo 29A3. O transformante pretendido E. coli K12 RV308/pRBl64A foi identificado por análise do seu DNA de plasmídeo. O transformante adequado foi cultivado a 30QC em meio Ty contendo 5 pg/ ml de tetraciclina até uma O.D.^^q de aproximadamente 0,2 (fase log. precoce) e depois mudado para 422C durante 3 a 3,5 horas para induzir a sintese da proinsulina humana. As células foram sedimentadas e lisadas pela adição de tampão de amostra (0,125M Tris-HCl/pH 6,8), 2% SDS, 30% glicerol, lm 2-mercaptoetanol, ureia 6M). As amostras foram aquecidas até 972C durante 2 minutos antes da aplicação num gel de acrilamida. As bandas foram fácilmente visualizadas por coloração com o corante Coonassie Brilliant Blue. Usou-se um densitómetro de varrimento de géis para quantificar as percentagens de proteína celular. Na Figura 17 dos desenhos juntos está apresentado um mapa de sítios de restrição e mapa de funções do plasmídeo pRB164A.

-843· Construção do plasmídeo pRB172

Cerca de 25 pg do plasmídeo pRB145 foi ressuspenso em 15 pl de tampão DralII lOx (200mM NaCl,

50mM tris-HCl (pH 7,5), lOmM MgCl₂, lmM DTT, 10 pg/ml de BSA), 6 pl da enzima de restrição DralII (boehringer Mannheim, 27 unidades) e 129 pl de H₂O, suavemente misturado e incubado a 372C durante 6 horas. Depois da incubação, o DNA foi precipitado, seco e ressuspenso em lOpl de tampão Xbal lOx (150mM NaCl, 6mM Tris-HCl pH 7,9, 6mM MgCl₂, 2-mercaptoetanol 7mM, lOOug/ml BSA), 3 ul da enzima de restrição Xbal (Boehringer Mannheim, 36 unidades) e 77 pl de H₂O. A reacção foi misturada suavemente e incubada a 37SC durante 4 horas. O DNA foi novamente precipitado com três volumes de etanol e NaOAc e sujeito a electroforese num gel de 1% de agarose de baixo ponto de fusão. A banda inferior correspondendo ao fragmento de restrição Xbal/DralII de aproximadamente 85 pb do gene da proinsulina humana foi cortada do gel e o DNA recuperado pelo processo da coluna Elu±ip-d. Após precipitação e secagem o DNA foi guardado em 30 pl de lOmM Tris pH 8,0.

Cerca de 15 pg do plasmídeo pRB 164A foi cortado com a enzima de restrição DralII e Xbal de acordo com o processo descrito atrás. A banda superior correspondendo ao fragmento Xbal/DralII do vector foi isolada do gel de agarose pelo processo da coluna Elutip-d. Após precipitação e secagem, o DNA foi guardado em 30 ul de lOmM Tris pH 8,0.

Cerca de 5 pl de DNA do vector pRB164A digerido com Xbal/DralII foi misturado com 5 pl do fragmento de restrição Xbal/DralII do plasmídeo pBR145 num tampão (50 pl) contendo 50mM Tris-HCl (pH 7,6), lOmM MgCl₂, lOmM DTT, 800 uM ATP e 6 unidades de DNA-ligase de T4. A reacção para transformar células E. coli K12/RV308 tornadas com2* petentes por um tratamento convencional com CaCl

-85Os transformantes foram seleccionados em placas de agar T4 contendo 5 pg/ml de tetraciclina. Os plasmídeos foram isolados a partir de colónias resistindo à tetraciclina pelo processo rápido de extracção alcalina e analisados por digestão com as endonucleases de restrição Xbal e BamHI. O DNA de clones positivos foi sequenciado usando o sistema sequenase (U.S. Biochemicals). Os plasmídeos com a sequência pretendida correcta foram seleccionados para amplificação e purificação, Deste modo, a transf ormante IS. coli K12 RV308/pRB172 foi isolado. A expressão e acumulação deste plasmídeo portador da proteína celular total seguido de separação electroforética numa matrix de 15% de poliacrilamida.

Na Figura 18 dos desenhos juntos está apresentado um mapa de sítios de restrição e funções do plasmídeo pRB172.

C. Construção de Escherichla coli RV308/pRB173 e pRB!74

Cerca de 20 pg do plasmídeo pRB172 ou pRB145 foi suspenso em 20 pl de tampão Xbal lOx (150mM NaCl 6mM Tris-HCl, pH 7,9, 6mM MgCl₂, 2-mercaptoetanol 7mM, 100 pg/ ml BSA) 2 pl da enzima de restrição Xbal (Bochringer Mannheim, 24 unidades)foi adicionado, misturado suavemente e incubado a 37SC durante 1 hora. Após a incubação, o DNA foi precipitado, seco e ressuspenso em 10 pl de tampão BalHI lOx (lOOmM NaCl, lOmM Tris-HCl (pH 8,0), 5mM MgC/, 2-mercaptoetanol lmM, 100 ug/ml de BSA), 5 ul da enzima de restrição BamHI Boehringet Nanheim (40 unidades) e 75 pl de H₂O. A reacção foi suavemente misturada e incubada a 37SC durante 4 horas. O DNA foi novamente precipitado com etanole NaOAc e sujeito a electroforese num gel de 1% de agarose de baixo ponto de fusão. O fragmento de restrição Xbal/BamHI de 320 pb correspondendo ao gene da proinsulina humana foi isolada do gel pelo processo da coluna Elutip-d. Após precipitação e secagem, o DNA foi ressuspenso em 20 pl de tampão Xmal lOx (25mM NaCl, lOmM tris-HC1 (pH 7,5), lOmM MgCl₂ , 2-mercaptoetanol lOmM, 100 pg/ml

-85de BSA, 10 pl da enzima de restrição Xmal (New England Biolabs 10 unidades) e 170 pl de água. A reacção foi misturada suavemente e incubada a 372C durante 4 horas. Depois da incubação o DNA foi precipitado com etanol e NaOAc e sujeito a electroforese num gel de 0,1% de agarose de baixo ponto de fusão. 0 DNA maior correspondendo ao fragmento de restrição Xbal/Xmal de aproximadamente 200 pb foi cortado do gel e o DNA recuperado pela coluna Elatip-d como descrito atrás. O DNA foi guardado em 30 pl de lOmM Tris pH 8,0.

DNA de 51 pb correspondendo a um fragmento de restrição Xmal/BamHI do gene da proinsulina humana foi constituido sintéticamente como se segue. Dois desoxirribo-oligonucleotidos de cadeias simples:

CCGGGTGCAGGCAGCCTGCAGCCGCTGGCCCTGGAGGGTTCCCTGCAGTAG (51 mer) GATCCTACTGCAGGGAACCCTCCAGGGCCAGCGGCTGCAGGCTGCCTGCAC (51 mer) foram sintetizados num sintetizador de DNA Applied Biosystems (modelo 380B) e purificados por electroforese em gel de poliacrilamida na presença de ureia 7M. Após isolamento, os dois oligonucleotídeos foram fosforilados de acordo com os ensinamentos de Brown, E.L., Belagaje, R. Ryan, M.J. e Khorama, H. G. (1979) Methods in Enzymology, ed. Por Wu, R., Academic Press. N.Y., 109-151, e emparelhados para formar o adaptador pretendido.

Cerca de 10 pg do plasmídeo pCZR 126S (do Exemplo 29AR) foi ressuspenso em 20 ul de tampão Xbal lOx (150 mM NaCl, 6mM Tris-HCl (pH 7,9), 6mM MgCl₂, 7mM 2-mercaptoetanol, 100 ug/ml de BSA) 2 ul da enzima de restrição Xbal (Boehring Mannhein, 24 unidades) e 178 ul de água. A

reacção foi suavemente misturada e incubada a 372C durante 2 horas. Depois desta incubação adicionou-se 4.μ1 de 5M NaCl e 2 pl da enzima de restrição BamHI (New England Biolabs, 20 unidades) e a incubação continuou durante mais 2 horas a 37eC. O DNA foi então precipitado com etanol e NaOAc pelo processo 1% e de corresponde Elutip-d.

Após precipitação e secagem, o DNA foi guardado em 30 pl de lOmM, pH 8,0.

convencional e sujeito a electroforese num gel de agarose de baixo ponto de fusão. A banda superior ao DNA vector Xbal/BAMHI foi isolado com a coluna

Cerca de 5 pl do DNA vector pCZR 126S digerido com Xbal/BamHI foram misturados em 20 H¹ do fra^ mento de restrição XbaI/Xmal do pRB145 ou pRB172 e 4 pl doadap tador Xmal/BamHI fosforilado preparado atrás num tampão (50 pl) contendo 50 pM Tris (pH 7,6), lOmM MgCl_2> lOmM DTT, 300 pM ATP e 6 unidades de DNA-ligase de T4. A reacção foi incubada a 48C durante a noite e usada para transformar E.' coli Ki2 estirpe RV308 de acordo com o processo do Exemplo 29A3. Os transformantes pretendidos, E. coli K12 RV308/pRB173 (se feitos a partir do fragmento do vector pRB172) e E. coli K12 RV308/pRB174 (se feitos a partir do fragmento do vector pRB 145) foram identificados por análise do seu DNA de plasmídeo e produção de proteína antes e após indução a 422CV Na Figura 19 desenhos juntos está apresentado um mapa de sítios de restrição e funções do plasmídeo pRB173.

Cerca de 200 ng de DNA do plasmídeo derivado de minipreparações foram também usados para transformar células Eb coli L201 e os transformantes foram seleccionados em placas de agar Ty 2x contendo 15 pg/ml de tetraciclina. As proteínas expressas pelos transformantes foram analisados e os transformantes pretendidos foram confirmados pela sua produção de proinsulina humana. Neste caso foram isolados E. coli L201/pR3173 e E. Coli L201/pRB174.

.-88D. Construção de Escherichia coli K12 RV308/pRB175, pRB!76, pRB177 e pR3178

Cerca de 12 pg do plasmídeo pRB172 foram ressuspensas em 15 pl de tampão Ndel lOx (lOOmM NaCl, 50mM Tris-HCl (pH = 7,5), lOmM MgCl₂, lmM DTT, 100 pg/ml BSA), 2,5 pl da enzima de restrição Ndel (20 unidades) e 133 pl de água. A reacção foi misturada suavemente e incubada a 372C durante a noite. Depois de incubação, o DNA foi precipitado com etanol e NaOAc pelo processo convencional, seco e ressuspenso em 15 pl de tampão DralII lOx (50mM Tris-HCl (pH 7,5), 200 mH NaCl, lOmM MgCl₂, lmM DTT) e 5 pl da enzima de restrição DralII (20 unidades) e 130 ul de? H₂O. Após mistura suave, a reacção foi incubada a 37QC durante a noite. O DNA foi novamente precipitado com etanol e NaOAc como atrás e sujeito a electroforese num gel de 1% de agarose de baixo ponto de fusão. O fragmento de restrição maior pretendido foi cortado do gel e o DNA recuperado pelo processo da coluna Elutip-d. O DNA foi guardado em 30 pl de lOmM Tris-HCl pH 8,0.

Os adaptadores de DNA que se seguem foram sintetizados quimicamente pelo sintetizador de DNA Applied Biosystems (modelo 380B)

(i) 5' TATGTACGACCAACACCTGTGCGGCTCCCATCTG 3'

3' ACATGCTGGTTGTGGACACGCCGAGGGTA 5' _para pRB175 (ii) 5' TATGTACGACGTTAACCAACACCTGTGCGGCTCCCATCTG 3'

3' ACATGCTGCAATTGGTTGTGGACACGCCGAGGGTA 5' pare _PRB176 (iii) 5' TATGTATAACCAACACCTGTGCGGCTCCCATCTG 3'

3' ACATATTGGTTGTGGACACGCCGAGGGTA 5' para pRB177 (iv) 5' TATGTACGTTAACCAACACCTGTGCGGCTCCCATCTG 3'

3' ACATGCAATTGGTTGTGGACACGCCGAGGGTA 5' _para pRB178

Após purificação de cada um dos oligonucleotídeos por electroforese em gel de poliacrilamida eles foram fosforilados de acordo com os ensinamentos préviamente mencionados e emparelhados para facilitar a ligação e construção dos fragmentos de DNA codificadores do análogo do gene da proinsulina humana. Os adaptadores (i) a (iv) foram usados para construir os plasmídeos pRB175, pRBl76, pRB177 e pRB173 respectivamente.

Cerca de 3 pl do fragmento de DNA do vector pRB172 digerido com Ndel/DralII foi misturado com 4 pl de cada um dos adaptadores fosforilados (i-iv) em separado num tampão {50 pl) contendo 50 pM Tris-HCl (pH 7,6), 10mM MgCl₂, lOmM DTT, 800 pM ATP e 6 unidades de DNA-ligase de T4.

A reacção foi incubada a 45C durante a noite e esta mistura foi usada para transformar células de E. coli K12 RV308 de

acordo com o processo do Exemplo 29A3. Os transformantes pretendidos, E. coli K12 RV308/pRB175, E. coli K12 RV308/pRB176,

E. coli RV308/pRB179 e E. coli K12 RV308/pRB178 foram identificados por análise do seu DNA de plasmídeo e produção de pro teína antes e depois da indução das células a 42SC. Na Figura 20 dos desenhos juntos está apresentado um mapa de sítios de restrição e funções do plasmídeo pRB175.

TAEELA I: ANÁLOGOS DA PROINSULINA HUMANA

Analog o	Plasmid eo	% Protei
Met-Tyr-Proinsulina Humana(HPI)	pRBl45	11,3
Met-Arg-Met-[Lys(B28),Pro(B29)HPI]	pRBl64A	10,5
Met-Tyr-[Lys(B28),Pro(B29)HPI]	pRB172	7)3
Met-Tyr[Lys(B28),Pro(B29)B-chain]-	Q* pRB173	ND
Met-Tyr-[B-chainJ-Q*	pRB174	ND
Met-Tyr-[Des(BI),Des(B2),Asp(B3),	pRB175	8,5
Lys(B28),Pro(B29)HPI]
Met-Tyr-[Asp(BI),Lys(B28),	pRB176	9,3
Pro(B29)HPI]
Met-Tyr-[Des(Bl),Des(B2),Lys(B28),	pRB177	9,4
Pro(B29)HPI]
Met-Tyr-[Des(Bl),Lys(B28) ,	pRB178	8,5
Pro(B29)HPI]
“Q = -Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-	Gln-Val-Gly-Gln	-Val-Glu-
Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-AIa-Gly-Ser-Leu-Gln-	Pro-Leu-

Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-91-

E. Uma cultura sock de E. coli K12 RV308/pRB172 foi tornada cultura “stock permanente como se segue.

Colónias isoladas foram transferidas pontualmente para as seguintes placas fenotipicas: agar L + 5 pg/ml Tc (tetraciclina), agar L + Sm (sulfato de estreptomicina), agar de meio M-9 (um meio à base de sais contendo MgSO^, tiamina, HYCASE e glucose) e agar de meio M-9 sem glucose e com lactose. Uma placa de agar L/Tc foi incubada a 42âC e as restantes placas foram incubadas a 30SC durante 24 horas. Uma colónia fenotipicamente correcta seleccionada da placa de agar L/Tc a 30QC foi usado para inocular um frasco contendo 50 ml de caldo L (contem triptona, extracto de levedura, NaCl e glucose) mais 5 μg/ml de Tc. O frasco foi incubado a 30QC com agitação durante 7 horas. 0 material do frasco (1,2 ml) foi distribuído por ampolas de congelação e congelado na fase de vapor do azoto líquido. O material foi depois descongelado e 1 ml usado para inocular um frasco contendo 50 ml de caldo L mais 5 pg/ml Tc. O frasco foi incubado a 30SC com agitação durante 4 horas. Dois frascos contendo 500 ml de meio BG-7 (contém MgSO₄, tiamina, glucose, Tc e vestígios de sais) foram inoculados com 1 ml cada do inoculo anterior e os frescos foram incubados com agitação durante 9 horas a 30SC.

Um fermentador de 150 litros contendo 80 litros do meio (contem ácido cítrico, sulfato de amónio ferroso, í^HPO^, NH^Cl, Naf^PO^, CaCl₂, MgSO^, glucose e sais inorgânicos em quantidade Ínfimas) foi inoculado com 1 litro de caldo de meio BG-7 descrito atrás. O fermentador foi. manipulado a 30QC até a velocidade de libertação de dióxido de carbono atingir 1,0 ml/min. Naquela altura 50 litros decaído foram transferidos para o fermentador de produção para dar e proporcionar o inoculo de células.

Um fermentador de 2500 litros contendo 1500 litros do mesmo meio usado no fermentador de 150

-92litros foi manipulado a 302C a velocidade de libertação de dióxido de carbono atingir 1,0 mM/l/min e em seguida a temperatura foi aumentada para 402C. A operação continuou durante mais 8 horas. 0 caldo foi então inactivado pelo calor a 61QC durante 7 minutos. Os dados de produção que se seguem foram obtidos a partir de caldo inactivado pelo calor. Produção celular, 13,1 gramas/1 de peso seco; Potência do produto, 273 pg Des-formilato/ml de caldo; Actividade Específica (e.g. gramas de produto/grama de células), 2,1 por cento; Percentagem de produto formilado, 13 por cento.

caldo de fermentação foi transI ferido .para um tanque de aço inoxidável e a temperatura manti-i da entre 2fiC e 82C. A totalidade do caldo foi então centrifugado ou filtrado para colher as células de E. coli de modo que se obteve um peso seco de sólidos de aproximadamente 15 a 20 por cento. Os sólidos celulares colhidos foram ressuspensos na água do processo. As células foram então rebentados usando homogenização a pressão elevada ou outros métodos adequados para se conseguir a lise de 90 a 99 por cento das células. A pasta homogenizada foi diluida para 5 por cento de peso seco com água do processo. O pH da pasta de células rebentadas diluída foi ajustado a pH entre 7 e 10 através de adição ' de hidróxido de sódio. Os corpos de inclusão (grânulos) foram separadas dos restritos celulares por centrifugação diferencial. 0 concentrado resultante foi 15 a 20 por cento dos sólidos .

v Os corpos de inclusão foram solubilizados a pH alcalino na presença de cisteina e ureia. Estes grânulos solubilizados foram sujeitos o cromatografo de permuta catiónica em SP Sepharose-superfluxo de modo a resolver a forma dissulfureto mista do análogo de proinsulina de entre o material granular global.

A extensão metionil-tirosina do extremo amina do análogo da proinsulina foi removida por incu-93bação com catepsina C, uma dipeptidilaminopeptidase..A reacção de clivagem com catepsina foi terminada por sulfitólise com tetrationato de potássio e císteina a pH 8,8. Após permuta de solvente através de Sephadex G-25, o S-sulfonato resultante do análogo de proinsulina foi deixado a envolver por incubação a pH 10,6 na presença de císteina. O processo de enrolamento foi parado ajustado o pH a 2,4. O análogo de proinsulina adequadamente enrolado foi separado do material inadequadamente enrolado assim como dos contaminantes restantes do passo de clivagem com catepsina C por cromatografia de interacção hidrofóbica em resina SP20SS. Esta separação ocorre através de um gradiente de acetona de modo a que o solvente orgânico deva ser comovido do conjunto da corrente principal por evaporação antes de qualquer outro processamento.

Após evaporação do solvente orgânico, o análogo da proinsulina adequadamente enrolado foi incubado com tripsina e carboxipeptidase B. Estas enzimas removem o peptídeo C do análogo da proinsulina e dão origem à insulina humana Lis(828), Pro(B29). O análogo da insulina foi ainda purificado por cromatografia de permuta catiónica em S-Sepharose seguido de cromatografia de alta resolução em fase reversa inuma resina C-8 de 10 pm. O acetonitrilo foi removido da corrente principal de fase reversa por permuta de solvente através de Sephadex G-25 e o material resultante foi concentrado usando um sistema de ultrafiltração enrolado em espiral O material concentrado foi sujeito a cromatografia de exclusão por tamanho em resina Sephadex G-50 e liofilizado até secagem .

Na Tabela II que se segue são for necidas as análises de aminoácidos dos compostos dos exemplos precedentes.

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Os efeitos fisiológicos do.i análogos da insulina do presente invento foram demonstrados no sistema de ensaio in vivo que se segue.

Ratos Sprague Dawley machos normais dos Laboratórios Charles River (Portage, MI) foram usados como animais teste. Foram comprados numa gama de peso 160-180 gramas e mantidos durante uma semana em salas para animais a 752F com um ciclo de luz controlado (luz acesa da 7 da manhã às 7 da noite, luz apagada de 7 da noite às 7 da manhã). Os animais foram alimentados com ração para ratos Purina 5001 ad libitum. Os ratos usados para cada ensaio deixaram de ser alimentados 16 horas antes de serem usados. Eles pesavam cerca de 200 g quando foram primeiro usados. Quando atigiram um peso de aproximadamente 275 g (ao longo de um período de três semanas) os animais deixaram de ser usados. Um grupo de dez ratos machos foi usado em cada dia para cada composto testado (i.e. insulina humana biossintética, insulina porcina e análogo da insulina humana). Cada grupo foi usado apenas uma vez durante a semana. Os dez ratos foram divididos em dois grupos de cinco ratos cada. Um grupo serviu de testemunha e foi administrado subcutâneamente apenas veículo. Ao outco grupo de cinco ratos foi dado o composto a ser testado. As proteínas foram dissolvidas em 0,05 NHC1 (pH 1,6) para dar uma solução stock de 100 fig por ml. A partir desta fizeram-se uma série de diluições em soro fisiológico normal que foram injectados subcutâneamente em ratos. Uma amostra de 100 jil de sangue foi retirado da veia da cauda de cada rato no tempo zero e 30 minutos, 1 hora, 2 horas 3 horas e 4 horas após administração. A glucose foi determinada colorimétricamente pelo método da glucose oxidase (Sigma Chemical Co.) A alteração percentual na glucose do sangue relativamente ao tempo zero foi calculada para cada rato e os resultados finais foram expressos como alteração percentual média ± SEM no grupo experimental corrigido para a alteração média no grupo testemunha para aquele dia.

-98A curva de dose resposta foi retirada de testes com 4 a 7 concentrações diferentes do composto testado usando a resposta máxima numa dada altura (geralmente uma a duas horas após administração da proteína). A partir desta curva determinou-se um valor de ΕΏ^θ como a dose subcutânea (jig/Kg) de proteína que deu metade da resposta hipoglicémica máxima. Os resultados e3tão apresentados na Tabela III seguinte;

TABELA III^a·

Composto	Efeito máximo	(%)	ED5t?	Activic BioloPi
Insulina Humana H (HI)a	66		7,95	100
Insulina Porcina	60		7,70	103
Lys(B28),Pro(B29)HI	66		6,8	117
Ala(B28),Pro(B29)HI	71		15,0	53
Asp(B28),Pro(B29)HI	64		10,2	78
Asp(B10),Lys(B28 ), Pro(B29)HI	53		10,7	74
Gln(B28),Pro(B29)HI	69		6,6	120
Gly(B28),Pro(B29)HI	58		10,5	76
Met(B28),Pro(B29)HI	51		14,6	54
Nle(B28),Pro(B29)HI	54		V	114
Orn(B28),Pro(B29)HI	60		12 ,7	63
Pro(B29)HI	63		8,7	91
Phe(B28),Pro(B29)HI	57		9,7	82
Val(B28),Pro(B29)HI	53		8,7	91

-99Todos os valores apresentados referem-se a amostras de sangue tiradas uma hora após administração, do composto apresen tado

Expresso em ug/kg, subcutâneo

Relativo à insulina humana

Insulina humana biossintética.

Conforme foi referido anteriormente, os análogos da insulina do presente invento têm uma propen são reduzida para dimerizar ou auto-associar-se de outro modo para dar formas de peso molecular mais elevado. Assim, quando da administração de um ou mais dos referidos análogos, consegue-se um estabelecimento rápido da actividade. Os análogos da insulina do presente invento são eficazes tratamento de hiperglicémia por administração a um paciente necessitado de uma quantidade eficaz de um análogo da insulina da fórmula I. Conforme aqui usados o termo quantidade eficaz refere-se à quantidade de uma ou mais análogos da insulina do presente invento necessária para baixar ou manter os níveis de açúcar do sangue terapêuticamente ou profiláticamente. Esta quantidade tipicamente pode variar entre cerca de 10 unidades e cerca de 60 unidades ou mais por dia (ou cerca de 0,3 a cerca de 2 mg assumindo aproximadamente 29 unidades por mg). No entanto deve-se compreender que a quantidade do(s) análogo(s) da insulina que de facto se administra será determinado por um médico face às circunstâncias relevantes incluindo o estado a ser tratado (i. e., a causa de hiperglicémia) o análogo particular a ser administrado, a via de administração parenteral escolhida, a idade, peso e resposta do paciente individual e da gravidade dos sistemas do paciente. Portanto, as gamas de dosagem acima não pretendem de algum modo limitar o âmbito do invento.

-100Os análogos da insulina do invento são administrados a um paciente deles necessitado (i.e., um paciente que sofra de hiperglicémia) por meio de composição farmacêuticas contendo uma quantidade eficaz de pelo menos um análogo da insulina da fórmula I em combinação com um ou mais excipientes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis. Com esta finalidade as composições farmacêuticas podem ser tipicamente formuladas de modo a conterem cerca de 100 unidades por ml ou concentrações semelhantes contendo uma quantidade eficaz do(s) análogo(s) da insulina. Estas composições são tipicamente, se bem que não necessariamente, de natureza parenteral e podem ser preparados por qualquer uma de uma variedade de técnicas usando excipientes ou veículos convencionais para produtos parenterais os quais são bem conhecidos. Ver, por exemplo, Remington¹s Pharmaceutical Sciences, 172 Edição, Mack Publishing Company, Eastor, PA, USA (1985) que aqui é incluído como referência. Por exemplo as formas de dosagem para administração parenteral podem ser preparados ressuspendendo ou dissolvendo a quantidade pretendida de pelo menos um análogo da insulina de fórmula I num veículo líquido não tóxico adequado >para injecção como seja um meio aquoso e esterilizado da suspensão ou solução. Como alternativa, uma quantidade medida do composto pode ser colocado num frasco e este e o seu conteúdo esterilizado e selado. Pode ser fornecido um outro frasco ou veículo para se fazer a mistura antes da administração. As composições farmacêuticas adaptadas a administração parenteral empregam diluentes, excipientes e veículos tais como água e solventes orgânicos miscíveis em água tais como glicerina, óleode sésamo, óleo de amendoin, propileno glicol aquoso, N,N'-dimetilformamida e similares. Exemplos de tais composições farmacêuticas incluem soluções salinas aquosas isotónicas e estéreis dos análogos da insulina da fórmula I que podem ser tamponadas com um tampão farmaceuticamente aceitável e que são apirogénicas.

Em adição, a formulação farmacêutica parenteral pode conter preservativos tais como meta-cresol ou outros agentes para ajustar o pH do produto final como sejam hidróxido de sódio ou ácido clorídrico.

Os análogos da insulina do presen te invento podem também ser formulados em composições farmacêu ticas adequadas à administração intranasal. Tais composições estão divulgadas detalhadamente no Pedido de Patente Europeia 0200383 A3 que aqui é incluido como referência. Resumidamente tais composições são formuladas com um ou mais diluentes farmacêuticamente aceitáveis, uma quantidade farmacêuticamente aceitável de um sal de metal alcalino, o sal de amónio ou o ácido livre de uma insulina substancialmente livre de zinco e facultativamente, uma quantidade indutora da adsorção de pelo menos um agente aumentador da absorção seleccionado do grupo constituído por (1) ácido oleico ou um éster ou um seu sal (2) uma forma líquida de éster de sorbitano e ácido gordo (3) um derivado de polioxietileno na forma líquida de um éster de ácido gordo e sorbitano e (4) um eopolimero na forma líquida de hidroxipolioxietileno-polioxipropileno-polioxietileno.

Para demonstrar a eficácia da administração intranasal do análogo de insulina humana Lis (B28), Pro(B29) versus insulina sódica humana realizaram-se os estudos que se seguem. Cães bigle machos pesando 10 a 12 kg fo ram mantidos em excelente condição fisica antes e durante o es tudo. Os cães jejuaram durante 16 horas mas tiveram acesso a água para evitar flutuações inesperadas nos níveis de insulina Durante o curso do estudo os cães foram anestesiados com pento barbitol sódico e a temperatura do corpo foi mantida com almofadas de aquecimento para minimizar a flutuação de glucose. As amostras de insulina a testar (i.e., insulina humana Lis(B28), Pro(B29) e insulina sódica humana) foram dissolvidas em água destilada e o pH da solução foi ajustado a 7,5 com hidróxido de sódio. A concentração final de insulina foi de 70 unidades por ml. Uma dose de insulina de 0,8 unidades por kg de insulina humana Lis(B28), Pro(B29) foi administrada a cada um. de oito cães e de modo semelhante, foi administrada uma dose de 0,8 unidades por kg de insulina sódica humana a cada um dos quatro cães. Todos as doses foram administradas à cavidade nasal libertando um spray por narina com um nebulizador de dose controlada e um aplicador nasal modificado. Retiraram-se amostras de sangue da veia jugular aos 30 , 15 e 0 minutos antes da admi_ nistração e aos 10, 20, 30, 45, 60, 90, 120, 180 e 240 minu tos após administração por medição da redução de glucose no sangue. Os resultados deste estudo estão apresentados na Tabela IV.

TABELA IV^a

Tempo (min)

Insulina Humana Lis(B28) , Pro(B29 (% do Inicial)

Insulina Sódica Hu (% do Inicial)

120

180

240

95,4 ± 25 98,2 ± 2,8

100

95.4

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101,6 ± 2,4 102.,4 ± 2,9

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100,8 ± 1,9 96,0 ± 2,1

91.6 ± 2,8

89.1 ± 2,3

93.6 ± 45

92.2 ± 1,6

91.3 ± 28 93,8 ± 1,8

90.7 ± 2,8

Niveis de glucose no sangue: média + S.E.M.

Utilizando o protocolo descrito atrás o perfil de redução de glucose no sangue da insulina humana Lis(B28), Pro(B29) via administração intranasal foi com parado com a administração intravenosa e subcutânea do análogo como se segue. Para administração intravenosa, a solução de in

-103sulina contendo o análogo da insulina humana Lis(B28), Pro(B29) foi administrado por injecção de bolus (0,1 unidades por kg) na veia safena de cada um de quatro cães. Retiraram-se amos tras de sangue aos 30, 15 e 0 minutos ante3 da administração e aos 5, 10, 15, 20, 30, 45, 60, 90, 120, 180 e 240 minutos após administração. Para administração subcutânea, a solução de insulina contendo o análogo da insulina humana Lis(B28), Pro(B29) foi administrado por baixo da epiderme (0,2 unidades por kg) do lado de fora do flanco de cada um de seis cães. Retiraram-se amostras de sangue com o mesmo protocolo descrito atrás pa. ra a administração nasal como descrito atrás. Os resultados deste estudo comparativo estão apresentados na Tabela IV.

TABELA V^a

Tempo ( m i n . )

I.V.

(% do Inicial)

-30 96,6 ± 6,5

-15 101,3 ± 1,5

0	100
5	99,9 ± 2,5
10	84,8 ± 4,0
15	68,1 ± 2,1
20	54,5 ± 3,3
30 45	43,3 ± 2,8
60	55,3 ± 3,1
90	77.2 ± 6,4 85.2 ± 4,7
120
180	97,1 ± 6f4 100,0 ± 9,6
240

S . C .

( % do Inicial)

Nasal (% do Inicial)

95.6 ± 2,1 98.7 ± 2,7	95,4 98,2	± 2,5 ± 2,8 100
	100
99,2	± 4,8	95,4	± 2,1
91,9	± 2,4	83,5	± 3,3
81,6	±3,0	72,2	± 4,5
55,8	± 3,5	61,6 60,6	± 6,9
35.3	± 3,1	± 6,0
39,5	± 3,4	71,6	± 4,6
36,1	± 2,6	76.1 91.2 85r4	± 3,7
64,5	± 7,0	± 1,8
81,3	± 2,4	± 2,7

^a Níveis de glucose do sangue:

média ± S.E.M.

Claims (25)

1. REIVINDICAÇÕES

   I^a. - Processo para a preparação

   UC U.1U insulina de fórmula

   NH₂

   I

   Gly¹

   I

   Ile²

   I

   Vai³ _r

   I 5 6

   Gln-CysCadeia A (I)

   7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

   Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tvr-Gln-Leti-Glu-Asn-Tyr-Cvs-A-OH \ ' I

   \.

   HisI⁵

   Gin

   I

   B ³ I

   B ² I

   B ¹ I nh₂

   Leu-Cys-Gly—B-B—Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys ^{6 7} 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 |19

   Cadeia B

   Gly

   I

   Glu

   I

   Arg

   Z-Y-X-B—B—B—B—Tyr-Phe-Phe-Gly ²· 30 29 28 27 26 25 24 ou de um seu sal farmacêuticamente aceitável, em que A21 é alanina, asparagina, ácido aspártico, glutamina, ácido glutâmico, glicina, treonina ou serina BI é fenilalanina, ácido aspártico ou está ausente; B2 é valina ou pode estar ausente quando BI estiver ausente; B3 é asparagina ou ácido aspártico; B9 é serina ou ácido aspártico; B10 é histidina ou ácido aspártico; B27 é treonina ou está ausente; B28 é qualquer aminoácido, B29 é L-prolina, D-prolina, D-hidroxiprolina, L-hidroxiprolina, L(N-meti.1-lisina), D-lisina, L-(N-metilarginina) ou D-arginina; B30 é alanina, treonina ou está ausente; Z é -OH, -NH₂, -OCH^ ou -OCH₂CH₃; X é Arg,

   105

   Arg-Arg, Lis, Lis-Lis, Arg-Lis ou está ausente? e Y pode estar presente apenas quando X estiver presente e se presente, é Glu ou uma sequência de aminoácidos que compreende toda ou parte da sequência -Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gli-Glu-Val-Glu-Leu-Gli-Gli-Gli-Pro-Gli-Ala-Gli-Ser-Leu-Glu-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gli-Ser-Leu-Glu-Lis-Arg- e que começa na Glu do extremo N de tal sequência, caracterizado por compreender

   A) a combinação da cadeia A de um composto da Fórmula (I) em que A21 é como definido na reivindicação 1, com a cadeia B de um composto da Fórmula (I) em que Bl, B2, B3, B9, ΒΙΟ, B27, B28, B29, B30, X, Y e Z são como definidos na reivindicação 1 para formar as pontes dissulfureto adequadas; ou

   B) a reacção de um composto modificado da Fórmula (I) sem a sequência peptídica começando em B23 e em que A21, Bl, B2, B3, B9 e B10 são como definidos na reivindicação 1 com um peptídeo tendo a sequência Gli-Fen-Fen-Tir-B27-B28-B29-B30-X-Y-Z em que B27, B28, B29, B30, X, Y e Z são como definidos na reivindicação 1; ou

   C) a clivagem de uma molécula de proinsulina compreendendo a sequência de aminoácidos de um composto da Fórmula (I) em que A21, Bl, B2, B3, B9, B10,

   B27, B28, B29, B30, X, Y e Z são como definidos na reivindicação 1 para remover toda ou parte do peptídeo C de tal proinsulina modificada.
2. 2 ^a. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por X e Y estarem ausentes e Z ser OH.
3. 3^a. - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por B29 ser L-prolina, D-prolina, D-hidroxipropilna ou L-hidroxipropilna; e B30 é treonina.

   106
4. 4^a. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por B28 ser ácido aspártico, valina, leucina, isoleucina, norleucina, prolina, arginina, histidina, citrulina, ormitina, lisina, fenilalanina, alanina ou glicina.
5. 5^a. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 4, caracterizado por B28 ser ácido aspártico, valina, leucina, isoleucina, norleucina, prolina, arginina, histidina, orsitina ou lisina.
6. 6^a. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por B28 ser lisina.
7. 7^a. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por B28 ser lisina; B29 ser L-prolina; e B30 ser treonina.
8. 8^a. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por A21 ser alanina.
9. 9^a. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por BI estar ausente.
10. 10^a. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado por B10 ser ácido aspártico.
11. 11^a. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado por B2 estar ausente.
12. 12^a. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado por B10 ser ácido aspártico.
13. 13^a. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado por B30 estar ausente.

    107
14. 14^a. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado por B30 ser alanina.
15. 15^a. - Processo de acordo com a reivindicaçmo 1 ou 2, caracterizado por B28 ser L-prolina e B29 ser L-(N-metil-lisina), D-lisina, L-(N-metilarginina) ou D-arginina.
16. 16^a. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 e 15, caracterizado por B28 ser L-prolina e B29 ser L-(N-metil-lisina) ou D-lisina.
17. 17^a. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 15 e 16, caracterizado por A21 ser alanina.
18. 18^a. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 e 15 a 17, caracterizado por BI estar ausente.
19. 19^a. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 e 15 a 18, caracterizado por B10 ser ácido aspártico.
20. 20^a. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 e 15 a 19, caracterizado por B2 estar ausente.
21. 21^a. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 e 15 a 20, caracterizado por B10 ser ácido aspártico.
22. 22^a. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 e 15 a 21, caracterizado por B30 está ausente.
23. 23^a. - processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 e 15 a 20, caracterizado por qualquer

    108 uma das reivindicações 1, 2 e 15 a 22, caracterizado por B30 ser alanina.
24. 24^a. - Processo para a preparação de um análogo da insulina de fórmula nh₂ !

    Gly¹

    I

    Ile²

    I

    Vai³

    I

    Glu⁴

    Cadeia A (I)

    I 5 6

    Gln-Cys7

    Cys\

    S \

    Tk í? n¹ Í^{2 13 14 15} 17 18 19

    Thr Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-TyrHis

    I⁵

    Gin

    I

    B ³ I

    B ² I

    B i I

    NH₂

    -Leu· \, •Cvs-Gly—B7 8 9 ío ^LfV'^V^^G^'^Ala‘^Leu~Tyr-Leu-Val· ^{10 11 12} 13 14 15 16 17 18

    Cadeia B

    Z-Y-X-B—B—B—B—Tyr-Phe-Phe 30 29 28 27 26 25 24

    20 21

    Cys-A-01

    I

    S

    I

    S •Cys

    I¹⁹

    Gly ²⁰ I

    Glu 21 I

    Arg ²² I

    -Gly ²³ ou de um seu sal farmaceuticamente aceitável, em que A21 é asparagina, BI é fenilalanina, B2 é valina, B3 é asparagina, B9 ser serina, B10 é histidina, B27 é treonina, B28 é lisina, B29 é L-prolina, B30 é treonina, Z é OH, X é Arg, Arg-Arg, Lis, Lis-Lis ou Arg-Lis e Y está ausente;

    caracterizado por compreender

    A) a combinação da cadeia A de um composto da Fórmula (I) em que A21 é como definido nesta reivindicação, com a cadeia B de um composto da Fórmula (I)

    109 em que Bl, B2, B3, B9, ΒΙΟ, B27, B28, B29, B30, X, Y e Z são como definidos nesta reivindicação para formar as pontes dissulfureto adequadas; ou

    B) a reacção de um composto modificado da Fórmula (I) sem a sequência peptídica começando em B23 e em que A21, Bl, B2, B3, B9 e B10 são como definidos nesta reivindicação com um peptídeo tendo a sequência Gli-Fen-Fen-Tir-B27-B28-B29-B30-X-Y-Z em que B27, B28, B29, B30, X, Y e Z são como definidos nesta reivindicação; ou

    C) a clivaqem de uma molécula de proinsulina compreendendo a sequência de aminoácidos de um composto da Fórmula (I) em que A21, Bl, B2, B3, B9, B10,

    B27, B28, B29, B30, X, Y e Z são como definidos nesta reivindicação para remover toda ou parte do peptídeo C de tal proinsulina modificada.
25. 25^a. - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado por se incluir na referida composição um análoqo de insulina de acordo com a reivindicação 24 em combinação com um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.