JPH02264798A - インスリン類似体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、天然ヒトインスリンＢ鎖の２９位アミノ酸が
改変され、さらにその他の部位も改変されていることあ
るインスリンの類似体に関する。 このインスリン類似体は天然のヒトインスリンの生物学
的活性を保持している一方で、二量体化または自己会合
して高分子量体になりにくいので、比較的迅速に活性が
発現する。 本発明は、式： ％式％） ［式中、Ａ２１はアラニン、アスパラギン、アスパラギ
ン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、スレオニ
ン、またはセリンであり、Ｂ１はフェニルアラニン、ア
スパラギン酸、または不存在であり、 Ｇｌ、　Ｍ＠ Ｇｌｕ　” Ｂ２はバリン、またはＢ１が不存在の場合に不存在であ
ってもよく、 Ｂ３はアスパラギンまたはアスパラギン酸であり、 Ｂ９はセリンまたはアスパラギン酸であり、Ｂ１０はヒ
スチジンまたはアスパラギン酸であり、 Ｂ２８はいずれのアミノ酸であってもよく、Ｂ２９はＬ
−プロリン、Ｄ−プロリン、Ｄ−ヒドロキシプロリン、
Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−（Ｎ−メチルリシン）、
Ｄ−リシン、Ｌ−（Ｎ−メチルアルギニン）、またはＤ
−アルギニンであり、Ｂ３０はアラニン、スレオニン、
または不存在であり、 Ｚｉｐ！−ＯＨ，−ＮＨ，、−〇ＣＨ，、または−〇〇
Ｈ，ＣＨ，であり、 ＸはＡｒｇＳＡｒｇ−ＡｒｇＳＬｙｓ、　Ｌｙｓ−Ｌｙ
ｓ、　Ａｒｇ−Ｌｙｓ、　Ｌｙｓ−Ａｒｇ、または不存
在であり、ＹはＸが存在する場合にのみ存在することが
でき、それが存在する場合は、Ｇ　ｌｕ、または配列ニ
ーＧ　ＩＬＩ−Ａ　Ｉａ−Ｇ　１ｕ−Ａ　５ｐ−Ｌ　ｅ
ｕ−Ｇ　Ｉｎ−Ｖ　ａｌ−Ｇ　Ｉｙ−Ｇ　Ｉｎ−Ｖ　ａ
ｌＧ　１ｕ−Ｌ　ｅｕ−Ｇ　Ｉｙ−Ｇ　１ｙ−Ｇ　Ｉｙ
−Ｐ　ｒｏ−Ｇ　１ｙ−Ａｌａ−Ｇ　１ｙ−３ｅｒ−Ｌ
　ｅｕ−Ｇ　Ｉｎ−Ｐ　ｒｏ−Ｌ　ｅｕ−Ａ　１ａ−Ｌ
　ｅｕ−Ｇ　１ｕ−Ｇ　１ｙ−３ｅｒ−Ｌ　ｅｕ−Ｇ　
Ｉｎ−Ｌ　ｙｓ−Ａ　ｒｇのすべて、もしくほこの配列
のＮ末端Ｇｌｕから始まるその一部からなるアミノ酸で
ある］で示されるインスリン類似体を提供するものであ
る。 さらに、有効量の式（Ｉ）で示されるインスワン類似体
を、それを必要としている患者に投与することを特徴と
する高血糖症を処置する方法も開示し、特許請求するも
のである。また、１つまたはそれ以上の製薬的に許容さ
れ得る賦形剤と共に、式（Ｉ）で示されるインスリン類
似体の有効量を含有している医薬製剤をも開示し、特許
請求するものである。 式（Ｉ）は、本発明のインスリン類似体のアミノ酸配列
を簡単に描いたものである。使用しているアミノ酸の略
語は、以下の通りの通常の意味を有する： 略　　語 ｂａ Ａｌａ Ａｒｇ ｓｎ ｓｐ ｙａ Ｌｙｓ ｉｎ ｌｕ １ｙ ）４ｉｓ ｃｅ ｅｕ Ｌｙｓ ｅｔ ｌｅ ｖａ ○ｒｎ ｈｅ アミノ酸 α−アミノ酪酸 アラニン アルギニン アスパラギン アスパラギン酸 システィン酸 システィン グルタミン グルタミン酸 グリシン ヒスチジン イソロイシン ロイシン リシン メチオニン ノルロイシン ノルバリン オルニチン フェニルアラニン Ｐｒ。 プロリン ｅｔ セリン Ｔｈｒ　　　　　　　　　スレオニン Ｔｒｐ　　　　　　　　　トリプトファンＴｙｒ　　　
　　　　　　チロシン Ｖａｌ　　　　　　　　バリン ８２８は天然に存在する、または存在しないアミノ酸で
あってよい。好ましい該アミノ酸は、アスパラギン酸、
′バリン、ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、プ
ロリン、アルギニン、ヒスチジン、シトルリン、オルニ
チン、リジン、フェニルアラニン、アラニン、またはグ
リシンである。これらのアミノ酸の中で特に好ましいサ
ブグループは、アスパラギン酸、バリン、ロイシン、イ
ソロイシン、ノルロイシン、プロリン、アルギニン、ヒ
スチジン、オルニチン、またはりシンである。 リシンはＢ２８において特に最も好ましいアミノ酸であ
る。Ｂ２９は好ましくは、Ｌ−プロリン、Ｄ−プロリン
、Ｄ−ヒドロキシプロリン、またはＬ−ヒドロキシプロ
リンである。本発明の特に好ましいインスリン類似体は
、Ｂ２８がリジンであり、Ｂ２９がプロリンであるイン
スリン類似体、すなわちＢ鎖の２８位および２９位にお
いて天然のヒトインスリンアミノ酸配列が入れかわって
いる本発明の類似体である。 さらなる態様としては、既述したような、Ｂ２８がＬ−
プロリンである場合、８２９位がＬ−（Ｎ−メチルリジ
ン）、Ｄ−リジン、Ｌ−（Ｎ−メチルアルギニン）、ま
たはＤ−アルギニンであるのが好ましい。この態様にお
ける好ましいものは、Ｂ２８がＬ−プロリンであり、Ｂ
２９がＬ−（Ｎ−メチルリシン）またはＤ−リシンであ
る類似体である。 本発明のインスリン類似体にはさらに改変を含有させる
こともある。すなわちＢ２８および８２９位以外の位置
におけるインスリン類似体の改変である。具体的には、
Ａ鎖の２１位のＡｓｎ残基（すなわちカルボキシ末端）
をＡｌａ、　Ａｓｐ、　Ｇｉｎ、　Ｇｌｕ、　Ｇａｙ、
　Ｔｈｒ、またはＳｅｔと置換することが望ましい場合
もあり、このように置換するときには、ＡＩａとの置換
が好ましい。同様に、Ｂ鎖における３位のＡｓｎ残基を
アスパラギン酸（Ａ　ｓｐ）に置換することが望ましい
場合がある。このような任意の置換は、Ａｓｎが低いｐ
Ｈおよび高いｐＨの両者における転移反応および脱アミ
ド化に特に感受性であるので、本類似体のｐＨ極値にお
ける安定性を増大させる効果ををする。当業者ならば、
本発明のインスリン類似体のグルタミン残基が同様に脱
アミド化および転移に対して感受性であり得ることも容
易に理解されるであろう。したがって、それをグルタミ
ン酸で置換することも、本発明の範囲内に包含される。 さらに、本発明のインスリン類似体における任意の置換
としては、８１０位のヒスチジン残基をアスパラギン酸
アミノ酸と置換、８１位のフェニルアラニン残基をアス
パラギン酸と置ｍ、８３０位のスレオニン残基をアラニ
ンと置換、８９位のセリン残基をアスパラギン酸と置換
、８１位のアミノ酸のみの欠失（デス−Ｂ１）または８
２位の欠失（デス−８２）との組合わせ、およびＢ−３
０位のスレオニンの欠失（デス−Ｂ３０）（これらのあ
らゆる組合わせもあり得る）が挙げられる。 本発明のインスリン類似体は、以下のアミノ酸またはジ
ペプチドを付加することによって、Ｂ３０末端を改変す
ることもできる：　Ａｒｇ、　ＡｒｇＡ　ｒｇＸＬ　ｙ
ｓ、　Ｌ　ｙｓ−Ｌ　ｙｓ、　Ａ　ｒｇ−Ｌ　ｙｓ、ま
たは［、ｙｓＡｒｇｏこれらが存在する場合、式（Ｉ）
中では基Ｘとして表す。このような延長がある場合、好
ましいものはＡ　ｒｇ−Ａ　ｒｇである。 さらに、Ｂ−３０におけるこのような延長が存在する場
合、この類似体は、得られたＢ３０延長末端にグルタミ
ン酸（Ｇｌｕ）、または配列：Ｇ　Ｉｕ−Ａ　Ｉａ−Ｇ
　Ｉｕ−Ａ　５ｐ−Ｌ　ｅｕ−Ｇ　Ｉｎ−Ｖ　ａｉＧ　
Ｉｙ−Ｇ　Ｉｎ−ＶａｌＧ　１ｕ−Ｌｅｕ−Ｇ　１ｙ−
Ｇ　Ｉｙ−Ｇ　Ｉｙ−Ｐ　ｒｏ−Ｇ　１ｙ−ＡＩａ−Ｇ
　１ｙ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉｎ−Ｐ　ｒｏ−Ｌｅｕ
−Ａ　１ａ−Ｌｅｕ−Ｇ　１ｕ−Ｇ　１ｙ−５ｅｒ−Ｌ
　ｅｕ−Ｇ　Ｉｎ−Ｌ　ｙｓ−Ａ　ｒｇのすべてもしく
はこの配列のＮ末端Ｇｌｕから始まるその一部からなる
アミノ酸配列を付加することによってさらに改変するこ
とができる。このアミノ酸またはアミノ酸配列が存在す
る場合、式（Ｉ）では基Ｙとして表している。この配列
が前述の配列の一部のみである場合、それは、この配列
のＮ末端、すなわちグルタミン酸（Ｇｌｕ）残基から始
まるあらゆる一部分であり得る。 上記の定義中、Ｘ、またはＸとＹとの組合わせ物は、天
然のヒトインスリンの生成時における生物学的前駆体で
ある分子、ヒト・プロインスリン中に見いだされる結合
ペプチドのすべて、またはその一部である。 Ｙについての好ましい配列は、以下の配列であるニ ーＧ　１ｕ−Ａ　１ａ−Ｇ　１ｕ−Ａ　５ｐ−Ｌ　ｅｕ
−Ｇ　Ｉｎ−Ｖ　ａｌ−Ｇ　ｌｙＧ　Ｉｎ−Ｖ　ａｉＧ
　Ｉｕ−Ｌ　ｅｕ−Ｇ　１ｙ−ｃ　１ｙ−Ｇ　１ｙ−Ｐ
　ｒｏ−Ｇ　１ｙ−Ａ　１ａ−Ｇ　１ｙ−３ｅｒ−Ｌ　
ｅｕ−Ｇ　Ｉｎ−Ｐ　ｒｏ−Ｌ　ｅｕ−Ａ　１ａ−１，
ｅｕ−Ｇ　Ｉｕ−Ｃ；　１ｙ−３ｅｒ−Ｌ　ｅｕ−Ｇ　
Ｉｎ−Ｌ　ｙｓ−Ａ　ｒｇ−１−Ｇ　Ｉｕ−Ａ　１ａ−
Ｇ　１ｕ−Ａ　５ｐ−Ｌ　ｅｕ−Ｇ　Ｉｎ−Ｖ　ａｉＧ
　ＩｙＧ　Ｉｎ−Ｖ　ａｉＧ　Ｉｕ−Ｌ　ｅｕ−Ｇ　１
ｙ−Ｇ　１ｙ−Ｇ　ｌｙ−Ｐ　ｒｏ−Ｇ　１ｙ−Ａ　１
ａ−Ｇ　Ｉｙ−Ｓ　ｅｒ−Ｌ　ｅｕ−Ｇ　Ｉｎ−Ｐ　ｒ
ｏ−Ｌ　ｅｕ−Ａ　１ａ−Ｌ　ｅｕ−Ｇ　１ｕ−Ｇ　１
ｙ−３ｅｒ−Ｌ　ｅｕ−Ｇ　Ｉｎ−Ｌ　ｙｓ−１Ｇ　Ｉ
ｕ−Ａ　Ｉａ−Ｇ　１ｕ−Ａ　５ｐ−Ｌ　ｅｕ−Ｇ　Ｉ
ｎ−Ｖ　ａｌＧ　ｌｙＧ　１ｎ−Ｖ　ａｌＧ　１ｕ−１
，ｅｕ−Ｇ　１ｙ−Ｇ　１ｙ−Ｇ　１ｙ−Ｐ　ｒｏ−Ｇ
　ｌｙ−Ａ　１ａ−Ｇ’１ｙ−３ｅｒ−Ｌ　ｅｕ−Ｇ　
Ｉｎ−Ｐ　ｒｏ−Ｌ　ｅｕ−Ａ　Ｉａ−Ｌ　ａｕ−Ｇ　
Ｉｕ−Ｇ　１ｙ−３ｅｒ−Ｌ　ｅｕ−Ｇ　１ｎ−１Ｇ　
Ｉｕ−Ａ　Ｉａ−Ｇ　１ｕ−Ａ　５ｐ−Ｌ　ｅｕ−Ｇ　
Ｉｎ−Ｖ　ａｌ−Ｇ　１ｙＧｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌ
ｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａ　
１ａ−Ｇ　Ｉｙ−３ｅｒ−Ｌ　ｅｕ−Ｇ　１ｎ−Ｐ　ｒ
ｏ−Ｌ　ｅｕ−Ａ　Ｉａ−Ｌ　ｅｕ−Ｇ　Ｉｕ−１ −Ｇ　１ｕ−Ａ　１ａ−Ｇ　Ｉｕ−Ａ　５ｐ−Ｌ　ｅｕ
−Ｇ　Ｉｎ−Ｖ　ａｌＧ　１ｙ−Ｇ　Ｉｎ−Ｖ　ａｉＧ
　１ｕ−Ｌ　ｅｕ−Ｇ　１ｙ−Ｇ　１ｙ−Ｇ　１ｙ−Ｐ
　ｒｏ−Ｇ　ｌｙＡ　１ａ−Ｇ　Ｉｙ−Ｓ　ｅｒ−Ｌｅ
ｕ−Ｇ　Ｉｎ−Ｐ　ｒｏ−Ｌｅｕ−Ａ　１ａ−２および −Ｇ　Ｉｕ−Ａ　Ｉａ−Ｇ　Ｉｕ−Ａ　ｓｐ−Ｌ　ｅｕ
−Ｇ　Ｉｎ−Ｖ　ａｌＧ　Ｉｙ−Ｇ　Ｉｎ−Ｖ　ａｉＧ
　１ｕ−０ さらに、Ｘのみが、またはＸおよびＹが共に、存在、ま
たは存在しなくても、末端基：Ｚは一０Ｈ１−Ｎ　Ｈ、
、−０ＣＨ３、＊ｆニーは−ＯＣＨ，ＣＨ。 のいずれであってもよい。好ましくは、２は−ＯＨであ
る。 上述のように、本発明は、インスリン類似体の医薬的に
許容され得る塩類を包含している。このような塩のうち
好ましい塩類は、亜鉛、ナトリウム、カリウム、マグネ
シウム、またはカルシウムの塩である。 本発明のインスリン類似体は、古典的な液体法、固相法
、半合成法、および近年利用可能となった組換えＤＮＡ
法などの種々の認識されたペプチド合成法のいずれによ
っても製造することが可能である。 固相法では、アミノ酸配列は、不溶性の樹脂に固定した
最初のＣ−末端アミノ酸から連続的に構築される。この
固相法の手順は、スチュア−１−（Ｊ。 ５ｔｅｖａｒｔ）らの５ｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐ
ｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、フリーマン・アンド・
Ｃｏ、　、サンフランシスコ、　１９６９に記載されて
いる。 一般に固相法は、所望のペプチドのＣ−末端アミノ酸残
基に相当するアミノ酸を不溶性樹脂の支持体に引っ掛け
（アンカーし）、次いでこの樹脂固定化Ｃ−末端アミノ
酸から開始してペプチド鎖を形成させる。個々のアミノ
酸を、所望のアミノ酸配列になるまで連続して導入する
。あるいは、小さなペプチドフラグメントを製造し、所
望の順序でそのペプチド鎖を導入することもできる。ペ
プチド鎖は、合成時に終始固定されたままであり、鎖が
完了したなら、ペプチドを樹脂から開裂する。 ペプチド鎖をポリスチレン樹脂に結合するには、Ｃ−末
端部のカルボキシ基とその樹脂マトリックスに存在する
結合部位としての特異的メチレン基との間に、エステル
結合を生成させることによって行う。 アミノ酸は、ペプチド結合を生成させるための当業界周
知の方法によって結合される。１つの方法は、カルボキ
シ基がペプチドフラグメントの遊。 ！１ｌｌＮ−末端アミノ基とより反応し易くなった誘導
体にアミノ酸を変換することである。たとえば、アミノ
酸は、保護アミノ酸をクロロギ酸エチル、クロロギ酸フ
ェニル、クロロギ酸５ｅｃ−ブチル、またはクロロギ酸
イソブチルと反応させて混合無水物に変換することがで
きる。また、アミノ酸は、２．４．５−１リクロロフエ
ニルエステル、ペンタクロロフェニルエステル、ｐ−ニ
トロフェニルエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
エステル、または１−ヒドロキシベンゾトリアゾールか
ら生成されるエステルなどの活性エステルに変換するこ
とができる。 もう１つのカップリング法では、Ｎ、　Ｎ’−ジシクロ
へキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、またはＮ。 Ｎｏ−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）などの
適当なカップリング剤を用いる。ショーダー（Ｓｃｈｒ
ｏｄｅｒ）およびルーフ（Ｌｕｂｋｅ）のＴｈｅ　Ｐｅ
ｐｔｉｄｅｓ。 アカデミツク・プレス、１９６５年第■章を参照のこと
。 カップリング反応時には、ペプチド合成に使用する各ア
ミノ酸の反応性のα−アミ７基に関連する副反応を防ぐ
ため、その官能基を保護しなければならないことを認識
すべきである。さらに認識すべきことは、特定のアミノ
酸は反応性の側鎖官能基（たとえば、スルフヒドリル、
ε−アミノ、β−およびγ−カルボキシ、イミダゾール
、グアニド、およびヒドロキシ）を含有しており、この
ような官能基も最初および以後のカップリング工程時に
保護しなければならないことである。適当な保護基は当
業界既知である。たとえば、マツクオミ−（ＭｃＯｍｉ
ｅ）１１のＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　Ｉｎ
　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ブレノーン・
プレス（Ｐｌｅｎｕｍ　ＰｒｅｓＳ）、ニューヨーク、
ｌ９７３、および米国特許筒４．６１７，１４９号を参
照のこと。 具体的に保護基を選択するに当たっては、特定の条件を
守らなければならない。α−アミノ保護基は、（Ｉ）カ
ップリング反応に用いられる条件下でα−アミン基を不
活性にしなければならず、（２）側鎖の保護基は除去せ
ずに、かつペプチドフラグメントの構造を変化させない
条件下で、カップリング反応後に容易に除去できなけれ
ばならず、そして（３）カップリング反応直前の活性化
の際にラセミ化の起こる可能性が排除されていなければ
ならない。側鎖保護基は、（Ｉ）カップリング反応に用
いられる条件下で側鎖官能基を不活性にしておかなけれ
ばならず、（２）α−アミノ保護基を除去するときに用
いられる条件下で安定でなければならず、そして（３）
ペプチド鎖の構造を変化させない条件下で、所望のアミ
ノ酸配列の形成完了時に容易に除去できなければならな
い。 ペプチド合成に有用であると知られている保護基は、そ
れを除去するために使用される試剤との反応性が種々異
なっていることは、当業者にとって明らかであろう。た
とえば、トリフェニルメチル、および２−（ｐ−ビフェ
ニルイル）イソプロピルオキシカルボニルなどの特定の
保護基は非常に不安定であり、温和な酸性条件下で開裂
し得る。池の保護基、たとえばＬ−ブチルオキシカルボ
ニル、

【−アミルオキシカルボニル、アダマンチルオキ
シカルボニル、およびｐ−メトキシベンジルオキシカル
ボニルなどはそれほど不安定でなく、これらを除去する
には、トリフルオロ酢酸、塩酸、マタハ酢酸中のトリフ
ルオロ化ホウ素などの中程度に強い酸が必要である。さ
らに、ベンジルオキシカルボニル、へロペンジルオキシ
力ルボニル、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、シ
クロアル牛ルオキシ力ルボニル、およびイソプロピルオ
キシカルボニルなどのその他の保護基もより不安定でな
く、それらを除去するには、フッ化水素、臭化水素、ま
たはトリフルオロ酢酸中のトリフルオロ酢酸ホウ素など
のより強い酸が必要である。 所望のペプチド配列が生成されたなら、その保護された
ペプチドを樹脂支持体から開裂しなければならず、また
すべての保護基を除去しなければならない。この開裂反
応と保護基の除去は、同時に、または段階的に行うこと
ができる。樹脂支持体がクロロメチル化ポリスチレン樹
脂である場合、樹脂にペプチドをアンカーする結合は、
Ｃ−末端部の遊離カルボキシ基と、樹脂マトリックスに
存在する多くのクロロメチル基のなかの１つとの間に形
成されるエステル結合である。このアンカー結合は、エ
ステル結合を分解し得ること、および樹脂マトリックス
に浸透し得ることが知られている試剤によって開裂する
ことができる。１つの特に簡便な方法は、液体無水フッ
化水素で処理することによるものである。この試剤はペ
プチドを樹脂から開裂するばかりでなく、すべての保護
基を除去することもできる。したがって、この試剤を使
用すれば、完全に脱保護されたペプチドが直接的に得ら
れる。保護基を除去することなく、ペプチドを開裂する
ことを望む場合、保護ペプチド−樹脂にメタツリシスを
施せば、Ｃ−末端力ルボキシ基がメチル化された保護ペ
プチドを得ることができる。次いで、得られたメチルエ
ステルを温和なアルカリ条件下で加水分解すれば、遊離
のＣ末端カルボキシルを得ることができる。次いで、ペ
プチド鎖の保護基を、液体フッ化水素などの強酸で処理
して除去すればよい。メタツリシスに特に有用な方法は
、保護ペプチド−樹脂をクラウンエーテルの存在下にメ
タノールおよびシアン化カリウムで処理する、モア（Ｇ
、　Ｍｏｏｒｅ）らのＰｅｐｔ　１ｄｅｓ。 Ｐｒｏｃ、　５ｔｈ　Ａｍｅｒ、　Ｐｅｐｔ、　Ｓｙｍ
ｐ、　、　　グツドマン（Ｍ、　Ｇｏｏｄｍａｎ）およ
びメインホソフｙ　−（Ｊ、　Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ）
ｍ、ジョーン・ウィレイ、ニューヨーク、　１９７７、
５１８−５２１頁の方法である。 保護ペプチドを樹脂から開裂させるもう１つの方法は、
アンモノリシスに、またはヒドラジンで処理することに
、基づくものである。所望ならば、得られたＣ−末端ア
ミドまたはヒドラジドを加水分解して遊離のＣ−末端力
ルポキシルにし、常法により保護基を除去することがで
きる。 さらに、Ｎ−末端α−アミ７基に存在する保護基は、樹
脂支持体から保護ペプチドを開裂する前、またはそれと
同時に優先的に除去し得ることは理解されるであろう。 本発明のインスリン類似体のＡおよびＢ鎖は、組換えＤ
ＮＡ法によっても調製することができる。 これらの調製では、そのような合成にとって今日常法で
ある手法により、ＡまたはＢ鎖の所望のペプチドをコー
ドしているヌクレオチド配列を：ＪＡ製する。これらの
方法は、一般には、所望のコード化配列のフラグメント
とその相補配列とをコードしているオリゴヌクレオチド
を調製することを含む。これらのオリゴヌクレオチドは
、コード化配列の１つのフラグメントが相補配列の２つ
のフラグメントとオーバーラツプするように、またその
逆となるように設計する。これらオリゴヌクレオチドを
対合して結合させ、最終的に所望の遺伝子配列を得る。 この配列を、クローニングベクターにおける、コードさ
れたペプチド産物が発現できる位置に挿入する。適当な
りローニングベクターはｊＲ伝壬子発現制御配列を少な
くとも１部分含有する。 本発明のインスリン類似体のＡ鎖およびＢ鎖はさらに、
組換えＤＮＡ法を使ってプロインスリン様前駆体分子を
介して製造することもできる。フランク（Ｆｒａｎｋ）
らのＰｅｐｔｉｄｅｓ：５ｙｎｔｈｅｓｉｓ−Ｓｔｒｕ
ｃｔｕｒｅ−Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、　Ｐｒｏｃ、　７ｔｈ
　Ａｍ、　Ｐｅｐｔ、　Ｓｙｍｐ、　、リッチ（Ｄ。 Ｒｉｃｈ）およびグロス（Ｅ、　Ｇｒｏｓｓ）（Ｉ９８
１）を参照のこと。 Ａ鎖およびＢ鎖のそれぞれを組み合わせる工程は、それ
らをどのようにして製造したかに関係なく、チャンス（
Ｃｈａｎｃｅ）らのＰｅｐｔｉｄｅｓ：　５ｙｎｔｈｅ
ｓ１ｓ。 ５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：　Ｐ
ｒｏｃ、ｏｆ　７ｔｈ　ＡｍｅｒｉｃａｎＰｅｐｔｉｄ
ｅ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ（Ｉ９８１）の方法によって行
うことができる。 以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが
、これらを本発明の限定と解してはならない。尚、本実
施例で引用し、本明細書に添付している図面はすべて正
確なスケールで描いていな実施例１ ヒトインスリンＡ鎖をコードしている遺伝子を化学的に
合成し、それを大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）内で発現させる
ことにより、ヒトインスリンＡ鎖を組換えＤＮＡ法で調
製［７た。簡単に説明すると、ブロック・ホスホトリエ
ステル法によって、種々のトリヌクレオチドを長さがデ
カルペンタデカまでのヌクレオチド合成フラグメントに
し、Ａ鎖をコードしている遺伝子を合成した。その遺伝
子は、Ｅｃ。 Ｒ１およびＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼに係る１
本鎖粘着末端を有していた。それらをβ−ガラクトシダ
ーゼ遺伝子（β−ｇａｌ）を含有する適当な発現ベクタ
ーに挿入し、メチオニンコドンを介してβ−ｇａｌ遺伝
子と結合しているＡ鎖を有するキメラプラスミドを作成
した。プロモーターとしてはβ−ｇａｌ遺伝子でなく、
トリプトファンシンセターゼ遺伝子（ｔｒｐＬＥ’）を
使用するのが好ましく、そうすれば高レベルの発現が得
られる。そのキメラプラスミドを大腸菌に形質転換し、
前駆タンパク質、すなわちβ−ｇａｌ−ｍｅｔ−Ａ鎖（
または、ｔｒｐＬＥ’プロモーター系を使用する場合は
ｔｒｐＬＥ’ｍｅｔ−へ鎖）が発現された。前駆タンパ
ク質を臭化シアンで処理してメチオニン結合を開裂させ
、精製後、ヒトインスリンＡ鎖を作成した。以下に記載
するように、Ｂ鎖（Ｓ−スルホネート）との結合に利用
されるＳ−スルホン化Ａ鎖を、酸化的スルフィトリシス
により作成した。 ヒトインスリンＡ鎖遺伝子の化学的合成については、フ
レア（Ｃｒｅａ）らのＰｒｏｃ、　Ｎａ目、Ａｃａｄ、
　Ｓｃ　ｉ、　、　Ｕ。 Ｓ、Ａ、　７５．５７６５−５７６９（Ｉ９７８）に徹
底して詳細に記載されている。ヒトインスリンＡ鎖をコ
ードしている化学的に合成した遺伝子の大腸菌内におけ
る発現は、ゴーデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）らのＰｒｏｃ、
　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　Ｕ、　Ｓ
、　Ａ、　７６、１０１−１１０（Ｉ９７９）に徹底し
て詳細に記載されている。 Ｂ、　　Ｂ鎖類似体の調！Ｖ［Ｌ　ｙｓ（８２８）、Ｐ
ｒｏ（８２隻Ｕ アプライド・バイオシステムダ４３０Ａペプチド合成機
（ソフトウェア改訂１．４を内蔵）を使用し、粗製のペ
プチジル樹脂を調製した。０，５ミリモル（ｍＭｏｌ）
の出発固相樹脂（Ｌ−Ｂ　ＯＣ−７１１ｒ（Ｂｚｌ）　
ＯＣＨｔ　Ｐ　ａｍ樹脂）を使用した（０　、７８　ｍ
Ｍｏ１／ｇｘ０．６５８ｇ）。使用したアミノ酸はすべ
てＢＯＣ保護されており、グルタミン酸およびヒスチジ
ンを除き、すべて購入したものを直接使用したくすなわ
ち、アプライド・バイオシステムズＩ　ｎｃ。 から市販されているカートリッジ各々は保護アミノ酸約
２ｍｌｌ１ｏｌを含有する）。グルタミン酸およびヒス
チジンはベブチドズ・インターナショナル・コーポレー
ションから入手し、所望の保護アミノ酸約２ｉｉｏ１を
含有するようカートリッジにそれぞれ移した。粗製のペ
プチジル樹脂を乾燥（減圧下に室温で一晩）した後、そ
の重量を測定して出発重量と比較することで、理論的な
重量増加を確認した。試料を少量採取し、アミノ酸分析
にかけ、所望のアミノ酸が正しい量で付加されているこ
とを確認した。 ヘフチジル樹脂１部に対してＨＦ（５％Ｖ／Ｖエチルメ
ルカプタンおよび５％ｖ／ｖ　ｍ−クレゾールを含有）
１０部（ｖ／ｖ）の溶液中、０°Ｃで約１時間撹拌する
ことによって、ペプチドをペプチジル樹脂から開裂し、
側鎖を脱保護した。吸引してＨＦをほとんど除去した後
、得られたペプチドをエチルエーテル中で沈殿させた。 エチルエーテルで数回洗浄いた後、吸引濾過し、次いで
ペプチドを、０゜ＩＭ　Ｆリス、Ｏ，１Ｍ硫酸ナトリウ
ム、および０、ＯＩＭ四チオン酸ナトリウムを含有する
７Ｍ脱イオン化尿素約２００ｉＣに溶解した。得られた
溶液のｐＨを５ＮＮａＯＨで８．５に調節し、４℃にお
いて一晩激しく撹拌した。 得られたＳ−スルホン化ペプチド溶液を、室温において
、セファデックスＧ−２５（微細）の５ｘ２１ＳｃＩカ
ラムに入れた。その試料を５０ｍＭ重炭酸アンモニウム
で溶出（室温、２０　ｊ１１２／分）した。流出液を２
７６ｎｍでモニターした。フラクション２０ｊｌ１２を
採取し、所望のフラクションをまとめ、さらに高速液体
クロマトグラフィー（Ｉ−（ＰＬＣ）によって以下のよ
うに精製した。 所望のフラクションのプールを２．５Ｘ３０ｃｘＤｕＰ
ｏｎｔ　Ｃ８の９−１２μＨＰＬｃカラムに注ぎ込み（
ｐｕｍｐｅｄ　ｏｎｔｏ）、ｌｏＯｍＭ重炭酸アンモニ
ウム中アセトニトリルを一次関数的に増量するグラジェ
ントで溶出する（室温、２　、６　ｙｔ（Ｉ／分）。 流出液を２８Ｏｒ＋ｌ＋＋でモニターする。フラクショ
ン２５ｘＱを採取する。分析用ＨＰＬＣにより、どのフ
ラクションが保持しているか否かを分析し、フラクショ
ンを選択した。所望のフラクションをまとめ、凍結乾燥
し、上記のようにして製造したＡ鎖との組合わせに使用
した。これについては、以下に記載する。 Ｃ，Ｌｙｓ（８２８）、Ｐｒｏ（Ｂ２９）ヒトインスリ
ンの調製 チャンス（Ｃｈａｎｃｅ）らの操作法（上掲）によって
、Ａ鎖およびＢ鎖を組合わせた。組換えＤＮＡ誘導化Ａ
鎖Ｓ−スルホネー）７００＋ｇ、および合成Ｌｙｓ（８
２８）、Ｐｒｏ（Ｂ２９）Ｂ鎖Ｓ−スルホネー）１４０
ｍｇ（両者とも既述のようにして得た）を、環境温度下
、０．１Ｍグリ／ン緩衝液７０ｚａおよび１４ｚｆ！に
それぞれ溶解し、５Ｎ水酸化ナトリウムで各々ｐＨ１０
，５に調節し、次いで５℃に冷却した。環境温度下、０
．１Ｍグリシン緩衝液中、濃度１０．５ｘｇ／ｌ（ｌの
ジチオトレイトール（ＤＴＴ）　６ｘ（ｌを調製し、５
Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨを１０．５に調節し、次いで
５°Ｃに冷却した。 Ａ鎖およびＢ鎖溶液を一緒にし、次いでＤＴＴ溶液５．
２１ｚｉＪを素早く加えた（ＳＨ／５ＳＯ８＝０．９０
）。２００１１２容量ガラス製遠心管の栓をせず、その
中で、５℃において、反応溶液を２゜５時間撹拌した。 氷酢酸４５ｘ（ｌを加え、得られた溶液を５℃で一晩放
置した。 得られた沈殿混合物を５°Ｃにおいて、２０分間、２０
０　Ｏｒｐｍで遠心した。上清をベレットの１Ｍ酢酸洗
液と一緒にし、５°Ｃのモル酢酸中、５Ｘ２０Ｑｃｘセ
ファデックスＧ−５０（極微細カラム）に入れ、重力に
より溶出させた。３日間、２０分フラクションを採取し
た。得られたフラクションを２７６　ｎｍで分析し、い
くつかは分析用ＨＰＬＣによって分析した。Ｌｙｓ（８
２８）、Ｐｒｏ（Ｂ２９）配列のインスリン類似体を含
有するフラクションをまとめ、凍結乾燥し、試料１２５
ｍｇを得た。 コノ試料を逆相ＨＰＬＣ［２，１２Ｘ２５ｃ肩ＤｕＰｏ
ｎｔＣ８カラムを使用し、０　、１　Ｍ　ＮａＨｔ　Ｐ
　Ｏ、（ｐ　Ｈ２，２）中、アセトニトリルを一次関数
的に増量するグラジェントで溶出する（室温、２．６ｗ
（Ｉｙ分）］によってさらに精製した。溶出液を２７６
ｎｍでモニターした。分析用ＨＰＬ、Ｃによって、選択
したフラクションを検定した。所望のフラクションをま
とめ、以下のようにしてｐＨ７のＨＰＬＣでさらに精製
した。 低いｐＨのＨＰＬＣ調製物をまとめたものを、水浴中、
Ｏ，ＩＭ　（ＮＨ，）、ＨＰＯ，で約２倍に希釈した。 水浴中、冷した２Ｎ水酸化ナトリウムによりそのｐＨを
７に調節した。溶出緩衝液がＯｌＩＭ　ｐＨ７（ＮＨ，
）ｔＨＰＯ４／アセトニトリルであることを除いては、
低ｐＨＩ製物で行った条件と同一の条件下で、同じＨＰ
ＬＣカラムに、試料を入れ、溶出した。 ｐＨ７の調製ＨＰＬＣによるプールを水浴中で冷凍し、
０．１％水性トリフルオロ酢酸（Ｔ　Ｆ　Ａ）で２回希
釈した。ＩＮ塩酸を加え（冷状態、水浴中の試料）、ｐ
Ｈを３に低下させた。この試料をＶｙｄ６ｃＣ４、また
はＤｔ＋Ｐｏｎｔ　Ｃ８ＨＰＬＣカラム（２，１２Ｘ　
２５ｃｍ）に入れ、０．１％水性ＴＦＡ中、アセトニト
リルを一次関数的に増量するグラジェントで溶出する。 溶出液を２１４ｎｍまたは２７６ｎｍでモニターした。 所望のフラクションをまとめ、凍結乾燥し、逆相ＨＰＬ
Ｃにより９７％よりも高い純度の所望の類似体４１ｍｇ
を得た。 実施例２ Ｌｙｓ（Ｂ２８）、Ｐｒｏ（Ｂ２９）ヒトインスリンＬ
ｙｓ（８２８）、Ｐｒｏ（Ｂ２９）ヒトインスリンを調
製するための２番目の方法は、酵素による半合成（逆タ
ンパク質分解）を利用し、デス−オクタペプチドインス
リン（Ａ　ｌ−１１−Ｂ　＋−ｔｔ）を合成オクタペプ
チドと結合することであった。デス−オクタペプチドイ
ンスリンは、プロマー（Ｂｒｏｍａｒ）およびチャンス
（Ｃｈａｎｃｅ）のＢｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ
、　Ａｃｔａ、　１３３：２１９−２２３（Ｉ９６７）
　ｒデス−オクタペプチド−インスリンの調製法および
その特性化」に記載されているように天然のブタまたは
ヒトインスリンをトリプシン消化することによって入手
した。合成オクタペプチド：　Ｇ　１ｙ−Ｐ　ｈｅ−Ｐ
　ｈｅ−Ｔ　ｙｒ−Ｔ　ｈｒ−Ｌ　ｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔ　
ｈｒは、既述の態様の自動固相合成機によって調製した
。 デス−オクタペプチドインスリン（４３５ｍｇ）および
合成Ｇ　１ｙ−Ｐ　ｈｅ−Ｐ　ｈｅ−Ｔ　ｙｒ−Ｔ　ｈ
ｒ−Ｌ　ｙｓ−Ｐ　ｒ。 −Ｔｈｒ４６５ｍｇを、ジメチルスルホキシド１部、１
．４−ブタンジオール２部、および０．２５Ｍトリス酢
酸緩衝液ｐＨ７，３（Ｉ部）を含有する溶液１５ｚ１２
中で混合した。得られた溶液をホットプレート上で暖め
、ペプチドを完全に溶解させた。 次いで、この溶液を３７℃でインキ−ベートし、ブタの
トリプシン９０ｍｇを加えた。この溶液を時々撹拌しな
がら、３７℃で９０分間装いた。０゜０５Ｎ塩酸１３５
＋ｅを溶液に加え、この反応を終止させた。 標題のインスリン類似体を含有する酸性溶液を２、５　
Ｘ　２５ｃｘ　Ｃ−８Ｚｏｒｂａｘ　ＨＰ　ＬＣカラム
に入れ、Ｏ，ＩＭ−塩基性リン酸ナトリウムｐＨ２２緩
衝液中２−次間数的に増量させるアセトニトリルのグラ
ジェントで溶出することによって、該類似体を精製した
。溶出液を２７６ｎｍでモニターした。所望のフラクシ
ョンをまとめ、水で２倍に希釈し、ｌＸ２５Ｃ肩ｃ−Ｂ
ウルトラスフェア（Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ）ＨＰ　Ｌ
　Ｃカラムに入れた。０．５％水性ＴＦＡ中、−次間数
的に増量させるアセトニトリルのグラジェントで類似体
を溶出した。溶出液を２７６ｎｍでモニターした。所望
のフラクションを再びまとめ、凍結乾燥し、精製された
類似体１２５１ｇを得た。その構造を、アミノ酸分析（
第１表）、および質量スペクトル分析（ＭＳ）によって
確認した。 ＭＳ　：　５８０９．２　（理論１：５８０８．７）。 分解能約１５　Ｑ　ＱノＶＧ−Ｚ　Ａ　Ｂ−２５Ｅダフ
ル焦点質量スペクトル分光器（ｄｏｕｂｌｅ　ｆｏｃｕ
ｓｉｎｇ　ｍａｓｓ　５ｐｅｃｔｒｏＩＩｌｅｔｅｒ）
を使用し、本明細書に記載している高速原子衝撃質量ス
ペクトル分析を得た。ヒトインスリン類似体を、シュウ
酸を含有するグリセロールおよびチオグリセロールの混
液に溶解した。ヨウ化セシウムをこの装置の検量に使用
シ、ｍ／ｚ５３００からｍ／ｚ６５００で磁気的にスキ
ャンする。得られたデータは平均質量＋１として表わさ
れる。 実施例３ Ａｂａ（Ｂ２８）、Ｐｒｏ（Ｂ２９）ヒトインスリンブ
タのデス−オクタペプチドインスリン（３８４、ｗｇ）
および合成オクタペプチド：　Ｇ　Ｉｙ−Ｐ　ｈｅ−Ｐ
　ｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｂａ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ３５
２部ｇを、ジメチルスルホキシド１部、１，４−ブタン
ジオール２部、および０．２５Ｍ　　トリス緩衝液（ｐ
Ｈ７，３）１部を含有する溶液１３村中で混合した（３
７０Ｃ）。ブタトリプシン７５１ｇを加えた。３７℃で
１２０分間、時折撹拌しながら、この溶液を充分に混合
した。 この時点で、得られた混合物を０．０５Ｎ塩酸１３７ｘ
＋２に加え、反応を終止させた。得られた全溶液を、２
１　Ｘ　２５０ｕ＋　Ｃ−８Ｚｏｒｂａｘカラム上に注
ぎ込み、０．１Ｍ−塩基性リン酸ナトリウムｐＨ２緩衝
液中、浅いアセトニトリルのグラジェントで生成物を溶
出させた。 分析用ＨＰＬＣによって決定した適当なフラクションを
まとめ、水で２倍に希釈し、２５Ｘ３０Ｑｗｗ　Ｃ４Ｖ
ｙｄａｃカラム上に注ぎ込んだ。脱塩化タンパク質を、
０．５％トリフルオロ酢酸中、アセトニトリルのグラジ
ェントを使用してカラムカラ溶出させた。精製されたイ
ンスリン類似体を含有するフラクションをまとめ、凍結
乾燥して５９翼ｇを得た。その構造を、アミノ酸分析（
第１表）、および質量スペクトル分析（Ｍ　Ｓ　）によ
って確認した。 ＭＳ　：　５７６５．７　（理論値：５７６５．６）。 実施例４ Ａｌａ（Ｂ２８）、Ｐｒｏ（Ｂ　２９）Ｌ：　トインス
＋）　７ブタのデス−オクタペプチドインスリン（２９
０ｍｇ）および合成オクタペプチド：　Ｇｌｙ−Ｐｈｅ
−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ３
１０部１ｇを、ジメチルスルホキシド１部、■、４−ブ
タンジオール２部、および０．２５Ｍ　　トリス緩衝液
（ｐ　Ｈ７，３）１部を含有する溶液１３１１２中で混
合したく３７℃）。ブタトリプシン６０ｉ＋ｇを加えた
。３７℃で６０分間、時折撹拌しながら、この溶液を充
分に混合した。 この時点で、得られた混合物を０．０５Ｎ塩酸９０肩ρ
に加え、反応を終止させた。得られた全溶液を、２１　
Ｘ　２５０ｗ貢Ｃ−８Ｚｏｒｂａｘカラム上に注ぎ込み
、０．１Ｍ−塩基性リン酸ナトリウムｐＨ２緩衝液中、
浅い（ｓｈａｌｌｏｗ）アセトニトリルのグラジェント
で生成物を溶出させた。 分析用ＨＰＬＣによって決定した適当なフラクションを
まとめ、水で２倍に希釈し、１ＯＸ２５０ｘｘＣ−８ウ
ルトラスフエアカラム上に注ぎ込んだ。脱塩化タンパク
質を、０．５％トリフルオロ酢酸中、アセトニトリルの
グラジェントでカラムから溶出させた。精製されたイン
スリン類似体を含有するフラクションをまとめ、凍結乾
燥して４３ｍｇを得た。その構造を、アミノ酸分析（第
１表）、および質量スペクトル分析（ＭＳ）によって確
認した。 ＭＳ　：　５７５２．３　（理論値＋５７５１．６）。 実施例５ Ａｒｇ（８２８）、Ｐｒｏ（Ｂ　２９）ｌ：：　トイン
ス’）　７ブタのデス−オクタペプチドインスリン（２
９０ｚｇ）および合成オクタペプチド：　Ｇ　ｌｙ−Ｐ
ｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｈ
ｒ３１０部ｇを、ジメチルスルホキシド１部、１，４−
ブタンジオール２部、および０．２５Ｍ　トリス緩衝液
（ｐ　Ｈ７，３）１部を含有する溶液１０３！１２中で
混合した（３７℃）。ブタトリプシン６０ｍｇを加えた
。３７℃で６０分間、時折撹拌しながら、この溶液を充
分に混合した。 この時点で、得られた混合物を０．０５Ｎ塩酸９０ｊｌ
ｆｆに加え、反応を終止させた。得られた全溶液を、２
１　ｘ　２５０ｘｘ　Ｃ−８Ｚｏｒｂａｘカラム上に注
ぎ込み、Ｏ，ＩＭ−塩基性リン酸ナトリウムｐ　Ｈ２１
１を衝に中、浅いアセトニトリルのグラジエンドで生成
物を溶出させた。 分析用ＨＰＬＣによって決定した適当なフラクションを
まとめ、水で２倍に希釈し、１０Ｘ２５０１１ＪＩＣ−
８ウルトラスフエアカラム上に注ぎ込んだ。脱塩化タン
パク質を、０．５％トリフルオロ酢酸中、アセトニトリ
ルのグラジェントでカラムから溶出させた。精製された
インスリン類似体を含有するフラクションをまとめ、凍
結乾燥して１０３ｍｇを得た。その構造を、アミノ酸分
析（第１表）、および質量スペクトル分析（ＭＳ）によ
って確認した。 ＭＳ　：　５８３６．１　（理論値：５８３６．７）。 ブタのデス−オクタペプチドインスリン（４０９ｍｇ）
および合成オクタペプチド：　Ｇ　１ｙ−１’　ｂｅ−
Ｐ　ｈｅＴｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ３９
８部１ｇを、ジメチルスルホキシド１部、１，４−ブタ
ンジオール２部、および０．２５Ｍ　　トリス緩衝液（
ｐＨ７，３）１部を含有する溶液１４酎中で混合した（
３７℃）。ブタトリプシン８１ｍｇを加えた。３７°Ｃ
で１２０分間、時折撹拌しながら、この溶液を充分に混
合した。 この時点で、得られた混合物を０．０５Ｎ塩酸１３６ｊ
ｌ１２に加え、反応を終止させた。得られた全溶液を、
２１　Ｘ　２５　Ｑｚｚ　Ｃ−ｇ　　Ｚｏｒｂａｘカラ
ム上に注ぎ込み、０．１Ｍ−塩基性リン酸ナトリウムｐ
Ｈ２緩衝液中、浅いアセトニトリルのグラジェントで生
成物を溶出させた。 分析用ＨＰＬＣによって決定した適当なフラクションを
まとめ、水で２倍に希釈し、２５Ｘ３０Ｑｙｒｘ　Ｃ−
１３Ｖｙｄａｃカラム上に注ぎ込んだ。脱塩化タンパク
質を、０．５％トリフルオロ酢酸中、アセトニトリルの
グラジェントでカラムから溶出させた。精製されたイン
スリン類似体を含有するフラクションをまとめ、凍結乾
燥して５６ｘｇを得た。その構造を、アミノ酸分析（第
１表）、および質量スペクトル分析（ＭＳ）によって確
認した。 ＭＳ　：　５７９４．７　（理論値：５７９４．６）。 彩■ Ａｓｐ（Ｂ２８）、Ｐｒｏ（Ｂ２９）ヒトインスリンブ
タのデス−オクタペプチドインスリン（４００ｘｇ）お
よび合成オクタペプチド：　Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−ＰｈｅＴ
ｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ３８８ｍｇを、
ジメチルスルホキシド１部、ｌＩ４−ブタンジオール２
部、および０．２５Ｍ　　トリス緩衝液（ｐＨ７，３）
１部を含有する溶液１３ｚ１２中で混合した（３７°Ｃ
）。ブタトリプシン７８ｍｇを加えた。３７°Ｃで１２
０分間、時折撹拌しながら、この溶液を充分に混合した
。 この時点で、得られた混合物を０．０５Ｎ塩酸１３７１
（２に加え、反応を終止させた。得られた全溶液を、２
１　Ｘ　２５０ｘｘ　Ｃ−８Ｚｏｒｂａｘカラム上に注
ぎ込み、０．１Ｍ−塩基性リン酸ナトリウムｐＨ２緩衝
液中、浅いアセトニトリルのグラジェントで生成物を溶
出させた。 分析用ＨＰＬＣによって決定した適当なフラクションを
まとめ、水で４倍に希釈し、２５Ｘ３００＊ｘ　Ｃ−１
８Ｖｙｄａｃカラム上に注ぎ込んだ。脱塩化タンパク質
を、０．１％トリフルオロ酢１１２中、アセトニトリル
のグラジェントでカラムから溶出させた。精製されたイ
ンスリン類似体を含有するフラクションをまとめ、凍結
乾燥して８５＊ｇを得た。その構造を、アミノ酸分析（
第１表）、および質量スペクトル分析（ＭＳ）によって
確認した。 ＭＳ　：　５７９５．７　（理論値＋５７９５．６）。 実施例８ Ａｓｐ（Ｂ　１０）、Ｌｙｓ（８２８）、Ｐｒｏ（Ｂ２
９）ヒトインスリン アプライド・バイオシステムズ４３０Ａペプチド合成機
（ソフトウェア改訂１．４を内蔵）を使用し、粗製のペ
プチジル樹脂を調製した。０．５ミリモル（ａ＋Ｍｏ１
）の出発固相樹脂（ｔ−Ｂ　ＯＣ＝Ｔ　ｈｒ（Ｂｚｌ）
ＯＣＨ＊　Ｐａｌ１樹脂）を使用した（０　、７２　ｍ
Ｍｏ１／ｇｘ０．７０５ｇ）。使用したアミノ酸はすべ
てＢＯＣ（’４護されており、グルタミン酸、アスパラ
ギン酸およびヒスチジンを除き、すべて購入したものを
直接使用した（すなわち、アプライド・バイオシステム
ズＩ　ｎｃ、から市販されているカートリッジは、各々
に保護アミノ酸約２ＩｎＩＩＩｏｌを含有する）。 グルタミン酸、アスパラギン酸およびヒスチジンは商業
的供給元から入手し、所望の保護アミノ酸約２１１１１
０１を含有するようカートリッジそれぞれに移した。粗
製のペプチジル樹脂を乾燥（減圧下に室温で一晩）した
後、その重量を測定して出発重量と比較することで、理
論的な重量増加であることを確認した。試料を少量採取
し、アミノ酸分析にかけ、所望のアミノ酸が正しい比率
で付加されていることを確認した。 ペプチジル樹脂１部に対してＨＦ（５％ｖ／ｖ　ｐ−チ
オクレゾールおよび５％Ｖ／Ｖ　Ｓ−クレゾールを含有
）１０部（ｖ／ｗ）の溶液中、０℃で約１時間撹拌する
ことによって、ペプチドをペプチジル樹脂から開裂し、
側鎖を脱保護した。吸引してＨＦをほとんど除去した後
、得られたペプチドをエチルエーテル中で沈殿させた。 エチルエーテルで数回洗浄した後、吸引濾過し、次いで
ペプチドを、０゜ＩＭ　　！−リス、３５＋ｙｇ／ｘＱ
硫酸ナトリウム、および２５ｍｇ／ｘ（ｌ四チオン酸ナ
トリウムを含有する８Ｍ塩酸グアニジン（ｐＨ１１）約
１２０ｉｉ２に溶解した。得られた溶液のｐＨを５ＮＮ
ａＯＨで８、Ｂに調節し、室温で３時間激しく撹拌した
。 得られたＳ−スルホンイヒベブチド溶液を、室温におい
て、セファデックスＧ−２５（中級）の５８２１５ｃｍ
カラムに入れた。その試料を５０ｍＭ重炭酸アンモニウ
ムで溶出した（室温、２’１ｘ（Ｉ部分）。溶出液を２
７６ｎｍでモニターした。各々２５祿のフラクションを
採取し、所望のフラクションをまとめ、さらに高速液体
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって以下のように
精製した。 所望のフラクションのプールを２．５Ｘ３０ＣｊｌＤｕ
Ｐｏｎｔ　Ｃ８の９−１２μＨＰＬＣカラムに注ぎ込み
、ｌｏｏｍＭ重炭酸アンモニウム中アセトニトリルを一
次関数的に増量するグラジェントで溶出する（室温、２
．６ｘＱ１分）。溶出液を２８０ｎｓでモニターする。 フラクション（各々２５１Ｎりを採取した。分析用ｆ−
（Ｐ　Ｌ　Ｃ分析により、どのフラクションが保持して
いるか決定し、フラクションを選択した。所望のフラク
ションをまとめ、凍結乾燥し、以下のようにして、製造
したＡ鎖との組合わせに使用した。 合わせ チャンス（Ｃｈａｎｃｅ）らの操作法（上掲）によって
、Ａ鎖およびＢ鎖を組合わせた。組換えＤＮＡ誘導化Ａ
鎖Ｓ−スルホネート２ｇ１および合成Ａ　ｓｐ（Ｂ１０
）、Ｌｙｓ（Ｂ２８）、Ｐｒｏ（Ｂ２９）Ｂ鎖Ｓ−スル
ホネート４００１ｇを、環境温度下、０．１Ｍグリシン
緩衝液２００祿および４０３！１２にそれぞれ溶解し、
５Ｎ水酸化ナトリウムで各々ｐＨ１０，５に調節し、次
いで５°Ｃに冷却した。環境温度下、Ｏ，１Ｍグリシン
緩衝液中、濃度１５，５肩ｇ／ｘＱのジチオトレイトー
ル（ＤＴＴ）溶液を調製し、５Ｎ水酸化ナトリウムでｐ
Ｈを１Ｏ１５に調節し、次いで５°Ｃに冷却した。 得られたＡ鎖およびＢ鎖溶液を一緒にし、次いでＤＴＴ
溶液１５．９次Ｑを素早く加えた（ＳＨ／Ｓ　Ｓ　Ｏ，
−＝　１．０）。２００ｍ１２容量ガ５ｘ’ＪＪ遠心管
の栓をせず、その中で、４°Ｃにおいて、反応溶液を１
９．６時間撹拌した。氷酢酸１２９ｉＱを加え、得られ
た溶液を４°Ｃに１時間放置した。 得られた沈殿混合物を４℃において、３０分間、２００
　Ｏｒｐｍで遠心した。上清をｍ１ｌｌｉ−Ｑ水２９２
ｗ（ｌおよびアセトニトリル７３１１Ｉ２と混合し、逆
相ＨＰＬＣ［２，５ｘ３０ｃｚ　Ｖｙｄａｃ　Ｃ］、　
８カラムを使用し、Ｏ，ＩＭ　ＮａＨ，ＰＯ＝（ｐＨ２
，１）中、アセトニトリルを一次関数的に増量するグラ
ジェントで溶出する（室温、２．６ｘＱ１分）］によっ
てさらに精製した。得られた溶出液を２８０ｎｍでモニ
ターした。分析用ＨＰＬＣによって、選択したフラクシ
ョンを検定し、所望のフラクションをまとめ、０．１％
水性トリフルオロ酢酸（Ｔ　Ｆ　Ａ）で２倍に希釈し、
次いでウルトラスフェアオクチルＨＰＬＣカラム（Ｉ，
ＯＸ２５ｃｍ）に入れ、０．１％水性ＴＦＡ中、アセト
ニトリルを一次関数的に増量するグラジェントで溶出し
た。溶出液を２８０ｇｍでモニターした。分析用ＨＰＩ
、Ｃによって、選択したフラクションを検定し、所望の
フラクションをまとめ、再度、若干アセトニトリルのグ
ラジェントが異なるが、前記と同一のカラムおよび条件
を使用する方法によって再精製した。適当なフラクショ
ンをまとめ、凍結乾燥し、逆相ＨＰＬＣにより９３％よ
りも高い純度のインスリン類似体６５ｍｇを得た。その
構造を、アミノ酸分析（第１表）、および質量スペクト
ル分析（ＭＳ）によって確認した。 ＭＳ　：　５７８６．１　（理論値＋５７８６．７）。 実施例９ Ｃｙａ（８２８）、Ｐｒｏ（Ｂ２９）ヒトインスリンオ
クタペプチドのシスティンをシスティン酸形態に変換す
るため、過ギ酸酸化を行った。合成オクタペプチド：　
Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｐ
ｒｏ−Ｔｈｒ３６３Ｊｆｇを、水冷フラスコ中で、調製
したばかりの過ギ酸３６１Ｑに溶解し、穏やかに１時間
撹拌した。得られた酸化物を水で１０倍に希釈し、凍結
乾燥した。この凍結乾燥物を半合成に使用した。 ブタのデス−オクタペプチドインスリン（２２２ｍｇ）
および合成オクタペプチド：　Ｇ　１ｙ−Ｐ　ｈｅ−Ｐ
　ｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙａ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ２２
５ｍｇを、ジメチルスルホキシド１９部、ｌ、４−ブタ
ンジオール２部、および０．２５Ｍ　トリス緩衝液（ｐ
Ｈ７゜３）１部を含有する溶液１８＊（ｌ中で混合した
（３７°Ｃ）。ブタトリプシン４５１ｇを加えた。３７
℃で１２０分間、時折撹拌しながら、この溶液を充分に
混合した。 この時点で、得られた混合物を０．０．５Ｎ塩酸２４２
＊（ｌに加え、反応を終止させた。得られた全溶液を、
２１　Ｘ　２５　Ｑｘｘ　Ｃ−８Ｚｏｒｂａｘカラム上
に注ぎ込み、Ｏ，ＩＭ−塩基性リン酸ナトリウムｐＨ２
１１Ｍ中、浅いアセトニトリルのグラジェントで生成物
を溶出させた。 分析用ＨＰＬＣによって決定した適当なフラクションを
まとめ、水で２倍に希釈し、２５Ｘ３００１１ＭＣ−Ｉ
　Ｆ３　Ｖｙｄａｃカラム上に注ぎ込んだ。脱塩された
タンパク質を、０．５％トリフルオロ酢酸中、アセトニ
トリルのグラジェントでカラムから溶出させた。精製さ
れたインスリン類似体を含有するフラクションをまとめ
、凍結乾燥して１６ｍｇを得た。その構造を、アミノ酸
分析（第１表）、および質量スペクトル分析（ＭＳ）に
よって確認した。 ＭＳ　：５８３１．５　（理論値：５８３１．７）。 実施例ＩＱ Ｇｌｎ（８２８）、Ｐｒｏ（Ｂ２９）ヒトインスリンブ
タのデス−オクタペプチドインスリン（２９０ｇｇ）お
よび合成オクタペプチド：　Ｇｌｙ−Ｐ　ｈｅ−Ｐ　ｈ
ｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ３１０Ｍ
ｇを、ジメチルスルホキシド１部、■、４−ブタンジオ
ール２部、および０．２５Ｍ　　）リス緩衝液（ｐＨ７
，３）１部を含有する溶液１０ｊ１１２中で混合した（
３７℃）。ブタトリプシン６０ｍｇを加えた。３７℃で
６０分間、時折撹拌しながら、この溶液を充分に混合し
た。 この時点で、得られた混合物を０．０５Ｎ塩酸９０１（
！に加え、反応を終止させた。得られた全溶液を、２１
　Ｘ　２５０Ｒｙｘ　Ｃ−Ｆ３　　Ｚｏｒｂａｘカラム
上に注ぎ込み、０．１Ｍ−塩基性リン酸ナトリウムｐＨ
２緩衝液中、浅いアセトニトリルのグラジェントで生成
物を溶出させた。 分析用ＨＰＬＣによって決定した適当なフラクションを
まとめ、水で２倍に希釈し、１０Ｘ２５０１１Ｃ−１８
ウルトラスフエアカラム上に注ぎ込んだ。脱塩化タンパ
ク質を、０．５％トリフルオロ酢酸中、アセトニトリル
のグラジェントでカラムから溶出させた。精製されたイ
ンスリン類似体を含有するフラクションをまとめ、凍結
乾燥して８７１ｇを得た。その構造を、アミノ酸分析（
第１表）、および質量スペクトル分析（ＭＳ）によって
確認した。 ＭＳ　：　５８０９．４　（理論値：５８０８．６）。 実施例１１ Ｇｌｕ（Ｂ２８）、Ｐｒｏ（Ｂ２９）ヒトインスリンブ
タのデス−オクタペプチドインスリン（４０２ｍｇ）お
よび合成オクタペプチド：　Ｇ　１ｙ−Ｐ　ｈｅ−Ｐ　
ｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ３９８
ｍｇを、ジメチルスルホキシド１部、１．４−ブタンジ
オール２部、および０．２５Ｍ　　）リス緩衝液（ｐＨ
７，３）１部を含有する溶液１４ＩｌＱ中で混合した（
３７°Ｃ）。ブタトリプシン８０ｍｇを加えた。３７℃
で１２０分間、時折撹拌しながら、この溶液を充分に混
合した。 この時点で、得られた混合物を０．０５Ｎ塩酸１３６ｘ
Ｑに加え、反応を終止させた。得られた全溶液を、２１
　Ｘ　２５０ｘＲＣ−８Ｚｏｒｂａｘカラム上に注ぎ込
み、Ｏ，ＩＭ−塩基性リン酸ナトリウムｐＨ２緩衝液中
、浅いアセトニトリルのグラジェントで生成物を溶出さ
せた。 分析用ＨＰＬＣによって決定した適当なフラクションを
まとめ、水で２倍に希釈し、２５Ｘ３００ｕ＋　Ｃ−１
８Ｖｙｄａｃ上に注ぎ込んだ。脱塩化タンパク質を、０
．５％トリフルオロ酢酸中、アセトニトリルのグラジェ
ントでカラムから溶出させた。精製されたインスリン類
似体を含有するフラクションをまとめ、凍結乾燥して５
９ｍｇを得た。 その構造を、アミノ酸分析（第１表）、および質量スペ
クトル分析（ＭＳ）によって確認した。 ＭＳ　：　５８０９．６　（理論値：５８０９．６）。 実施例１２ Ｇｌｙ（Ｂ２８）、Ｐｒｏ（Ｂ２９）ヒトインスリンブ
タのデス−オクタペプチドインスリン（４１２ｚｇ）お
よび合成オクタペプチド：　Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−
Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ３７６ｙｇを
、ジメチルスルホキシド１部、１．４−ブタンジオール
２部、および０．２５Ｍ　　トリス緩衝液（ｐ　Ｈ７，
３）１部を含有する溶液１３ｊ！１２中で混合した（３
７℃）。ブタトリプシン７９肩ｇを加えた。３７℃で１
８０分間、時折撹拌しながら、この溶液を充分に混合し
た。 この時点で、得られた混合物を０．０５Ｎ塩酸１４７ｚ
Ｉ２に加え、反応を終止させた。得られた全溶液を、２
１　Ｘ　２５　Ｑａｕ　ｃ−３Ｚｏｒｂａｘカラム上に
注ぎ込み、０．１Ｍ−塩基性リン酸ナトリウムｐＨ２緩
衝液中、浅いアセトニトリルのグラジェントで生成物を
溶出させた。 分析用ＨＰＬＣによって決定した適当なフラグジョンを
まとめ、水で４倍に希釈し、２５Ｘ３０Ｑｍｘ　Ｃ−１
８Ｖｙｄａｃ上に注ぎ込んだ。脱塩化タンパク質を、０
．１％トリフルオロ酢酸中、アセトニトリルのグラジェ
ントでカラムから溶出させた。精製されたインスリン類
似体を含有するフラクションをまとめ、凍結乾燥して１
１ｍｇを得た。 その構造を、アミノ酸分析（第１表）、および質量スペ
クトル分析（ＭＳ）によって確認した。 ＭＳ　：　５７３７．２　（理論値：５７３７．６）。 叉廊グユ】 Ｈｉｓ（Ｂ２８）、Ｐｒｏ（Ｂ２９）ヒトインスリンブ
タのデス−、オクタペプチドインスリン（４００ｍｇ）
および合成オクタペプチド：　Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ
−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ３９８１ｇ
を、ジメチルスルホキシド１部、１，４−ブタンジオー
ル２部、および０．２５Ｍ　　）リス緩衝液（ｐＨ７，
３）１部を含有する溶液１３＋Ｑ中で混合した（３７℃
）。ブタトリプシン７９ｍｇを加えた。３７°Ｃで１２
０分間、時折撹拌しながら、この溶液を充分に混合した
。 この時点で、得られた混合物を０．０５　Ｎ塩酸２３７
３！（に加え、反応を終止させた。得られた全溶液を、
２１　ｘ　２５０ｘｘ　Ｃ−８Ｚｏｒｂａｘカラム上に
注ぎ込み、０．１Ｍ−塩基性リン酸ナトリウムｐＨ２１
衝液中、浅いアセトニトリルのグラジェントで生成物を
溶出させた。 分析用ＨＰＬＣによって決定した適当なワラクシ９ンを
まとめ、水で４倍に希釈し、２５Ｘ３００ｘｘ　Ｃ−１
８Ｖｙｄａｃ上に注ぎ込んだ。脱塩化タンパク質を、０
．１％トリフルオロ酢酸中、アセトニトリルのグラジェ
ントでカラムから溶出させた。精製されたインスリン類
似体を含有するフラクションをまとめ、凍結乾燥して７
９ｍｇを得た。 その構造を、アミノ酸分析（第１表）、および質量スペ
クトル分析（Ｍ　Ｓ　）によって確認した。 ＭＳ　：　５８１６．９　（、理論値：５８１７．７）
。 実施例１４ １１ｅ（８２８）、Ｐｒｏ（Ｂ２９）ヒトインスリンブ
タのデス−オクタペプチドインスリン（４０９ｘｇ）お
よび合成オクタペプチド：　Ｇ　１ｙ−Ｐ　ｈｅ−Ｐ　
ｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ３９８
１ｆｇを、ジメチルスルホキシド１部、■、４−ブタン
ジオール２部、および０．２５Ｍ　　トリス緩衝液（ｐ
　Ｈ７，３）１部を含有する溶液１３Ｍ（ｌ中で混合し
た（３７°Ｃ）。ブタトリプシン８１ｆｇを加えた。３
７°Ｃで１２０分間、時折撹拌しながら、この溶液を充
分に混合した。 この時点で、得られた混合物を０．０５Ｎ塩酸１３６ｊ
１１２に加え、反応を終止させた。得られた全溶液を、
２１　Ｘ　２５０ｚｘ　Ｃ−８Ｚｏｒｂａｘカラム上に
注ぎ込み、Ｏ，ＩＭ−塩基性リン酸ナトリウムｐＨ２緩
衝液中、浅いアセトニトリルのグラジェントで生成物を
溶出させた。 分析用ＨＰ　Ｌ　Ｃによって決定した適当なフラクショ
ンをまとめ、水で２倍に希釈し、２５Ｘ３００ｘｘ　Ｃ
−１８Ｖｙｄａｃ上に注ぎ込んだ。脱塩化タンパク質を
、０．５％トリフルオロ酢酸中、アセトニトリルのグラ
ジェントでカラムから溶出させた。精製されたインスリ
ン類似体を含有するフラクションをまとめ、凍結乾燥し
て５７＋ｇを得た。 その構造を、アミノ酸分析（第１表）、および質量スペ
クトル分析（ＭＳ）によって確認した。 ＭＳ　：　５７９３．７　（理論値：５７９３．７）。 実施例１５ Ｌｅｕ（Ｂ２８）、Ｐｒｏ（Ｂ２９）ヒトインスリンブ
タのデス−オクタペプチドインスリン（４１８ｍｇ）お
よび合成オクタペプチド：　Ｇ　１ｙ−Ｐ　ｈｅ−Ｐ　
ｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ４１０
屑ｇを、ジメチルスルホキシド１部、１．４−ブタンジ
オール２部、および０．２５Ｍ　　トリス緩衝液（ｐＨ
７，３）１部を含有する溶液１４ｘ（！中で混合した（
３７°Ｃ）。ブタトリプシン８３ｍｇを加えた。３７°
Ｃで１２０分間、時折撹拌しながら、この溶液を充分に
混合した。 この時点で、得られた混合物を０．０５Ｎ塩酸１３６村
に加え、反応を終止させた。得られた全溶液を、２１　
Ｘ　２５０ｘｘ　Ｃ−８Ｚｏｒｂａｘカラム上に注ぎ込
み、０．１Ｍ−塩基性リン酸ナトリウムｐＨ２緩衝液中
、浅いアセトニトリルのグラジェントで生成物を溶出さ
せた。 分析用ＨＰ　Ｌ、　Ｃによって決定した適当なフラクシ
ョンをまとめ、水で２倍に希釈し、２５Ｘ３００ｙｘ　
Ｇ−１３Ｖｙｄａｃ上に注ぎ込んだ。脱塩化タンパク質
を、０．５％トリフルオロ酢酸中、アセトニトリルのグ
ラジェントでカラムから溶出させた。精製されたインス
リン類似体を含有するフラクションをまとめ、凍結乾燥
して７４Ｍｇを得た。 その構造を、アミノ酸分析（第１表）、および質量スペ
クトル分析（ＭＳ）によって確認した。 ＭＳ　：　５７９３、Ｂ　（理論値：５７９３．７）。 実施例１６ Ｎｌｅ（８２８）、Ｐｒｏ（Ｂ２９）ヒトインスリンブ
タのデス−オクタペプチドインスリン（２９０ｍｇ）お
よび合成オクタペプチド：　Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−
Ｔ　ｙｒ−Ｔ　ｈｒ−Ｎ　ｌｅ−Ｐ　ｒｏ−Ｔ　ｈｒ　
３１　Ｑ　ｚｇを、ジメチルスルホキシド１部、ｌ、４
−ブタンジオール２部、および０．２５Ｍ　　トリス緩
衝液（ｐＨ７，３）１部を含有する溶液１０酎中で混合
した（３７°Ｃ）。ブタトリプシン６０ｍｇを加えた。 ３７℃で６０分間、時折撹拌しながら、この溶液を充分
に混合した。 この時点で、得られた混合物を０．０５Ｎ塩酸９０ｘ（
ｌに加え、反応を終止させた。得られた全溶液を、２１
　Ｘ　２５０ｓｓ　Ｃ−８Ｚｏｒｂａｘカラム上に注ぎ
込み、０．１Ｍ−塩基性リン酸ナトリウムｐＨ２緩衝液
中、浅いアセトニトリルのグラジェントで生成物を溶出
させた。 分析用ＨＰＬＣによって決定した適当なフラクションを
まとめ、水で２倍に希釈し、１０Ｘ２５０ｘｘＣ−８ウ
ルトラスフェア上に注ぎ込んだ。 脱塩化タンパク質を、０．５％トリフルオロ酢酸中、ア
セトニトリルのグラジェントでカラムから溶出させた。 精製されたインスリン類似体を含有するフラクションを
まとめ、凍結乾燥して５４Ｍｇを得た。その構造を、ア
ミノ酸分析（第１表）、および質量スペクトル分析（Ｍ
Ｓ）によって確認した。 ＭＳ　：　５７９４．６　（理論値：５７９３．７）。 大施例１７ ブタのデス−オクタペプチドインスリン（３９２ｚｇ）
および合成オクタペプチド：　Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ
−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ３８７
亀ｇを、ジメチルスルホキシド１部、ｌ、４−ブタンジ
オール２部、および０．２５Ｍ＋−リス緩衝液（ｐＨ７
゜３）１部を含有する溶液１３．５＋ｖ（中で混合した
（３７°Ｃ）。ブタトリプシン７８ｍｇを加えた。３７
°Ｃで１２０分間、時折撹拌しながら、この溶液を充分
に混合した。 この時点で、得られた混合物を０．０５Ｎ塩酸１３６．
５ｚ＆に加え、反応を終止させた。得られた全溶液を、
２１　Ｘ　２５０ｙｔｍ　Ｃ−８Ｚｏｒｂａｘカラム上
に注ぎ込み、０．１Ｍ１ａ基性リン酸ナトリウムｐＨ２
緩衝液中、浅いアセトニトリルのグラジェントで生成物
を溶出させた。 分析用ＨＰＬＣによって決定した適当なフラクションを
まとめ、水で４倍に希釈し、２５Ｘ３００ｍｘ　Ｃ−１
３Ｖｙｄａｃ上に注ぎ込んだ。脱塩化タンパク質を、０
．５％トリフルオロ酢酸中、アセトニトリルのグラジェ
ントでカラムから溶出させた。精製されたインスリン類
似体を含有するフラクションをまとめ、凍結乾燥して９
４ｙｇを得た。 その構造を、アミノ酸分析（第１表）、および質量スペ
クトル分析（Ｍ　Ｓ　）によって確認した。 ＭＳ　：　５８０９．０　（理論値：５８０８．７）。 実施例１亀 Ｍｅｔ（８２８）、Ｐｒｏ（Ｂ２９）ヒトインスリンブ
タのデス−オクタペプチドインスリン（３５０ｘｇ）お
よび合成オクタペプチド：　Ｇ　Ｉｙ−Ｐ　ｈｅ−Ｐ　
ｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ３６６
ｍｇを、ジメチルスルホキシド１部、１．４−ブタンジ
オール２部、および０．２５Ｍ　　トリス緩衝液（ｐＨ
７，３）１部を含有する溶液１２ｆｆ（中で混合した（
３７°Ｃ）。ブタトリプシン７１ｚｇを加えた。３７°
Ｃで１２０分間、時折撹拌しながら、この溶液を充分に
混合した。 この時点で、得られた混合物を０．０５Ｎ塩酸１１８ｉ
Ｃに加え、反応を終止させた。得られた全溶液を、２１
　Ｘ　２５０ｍｇ　Ｃ−８Ｚｏｒｂａｘカラム上に注ぎ
込み、０．１Ｍ−塩基性リン酸ナトリウムｐ　Ｈ２緩衝
液中、浅いアセトニトリルのグラジェントで生成物を溶
出させた。 分析用１−（Ｐ　Ｌ　Ｃによって決定した適当なフラク
ションをまとめ、水で４倍に希釈し、２５Ｘ３００ｕ＋
　Ｃ−１８Ｖｙｄａｃ上に注ぎ込んだ。脱塩化タンパク
質を、０．１％トリフルオロ酢酸中、アセトニトリルの
グラジェントでカラムから溶出させた。精製されたイン
スリン類似体を含有するフラクションをまとめ、凍結乾
燥して７２肩ｇを得た。 その構造を、アミノ酸分析（第１表）、および質量スペ
クトル分析（ＭＳ）によって確認した。 ＭＳ：５８１１、Ｂ（理論値：　５８１１．７）。 夫Ｕ生り旦 ０ｒｎ（Ｂ２８）、Ｐｒｏ（Ｂ２９）ヒトインスリンブ
タのデス−オクタペプチドインスリン（２９０ｍｇ）お
よび合成オクタペプチド：　Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−ＰｈｅＴ
ｙｒ−Ｔｈｒ−Ｏｒｎ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ３１０ｊＩｇを
、ジメチルスルホキシド１部、１．４−ブタンジオール
２部、および０．２５Ｍ　　トリス緩衝液（ｐ＋−［７
，３）１部を含有する溶液１０肩１２中で混合した（３
７°Ｃ）。ブタトリプシン６０ｘｇを加えた。３７℃で
９０分間、時折撹拌しなから、この溶液を充分に混合し
た。 この時点で、得られた混合物を０．０５Ｎ塩酸９０！Ｉ
！に加え、反応を終止させた。得られた全溶液を、２１
　Ｘ　２５０ｍｇ　Ｃ−８Ｚｏｒｂａｘカラム上に注ぎ
込み、Ｏ，１Ｍ−塩基性リン酸ナトリウムｐ　１］２１
ｆｊｔ　街ｍ中、浅いアセトニトリルのグラジェントで
生成物を溶出させた。 分析用１−（Ｐ　Ｌ　Ｃによって決定した適当なフラク
ションをまとめ、水で４倍に希釈し、１ＯＸ２５０ＪＩ
ＩＣ−８ウルトラスフェア上に注ぎ込んだ。 脱塩化タンパク質を、０．５％トリフルオロ酢ｆｉｔ中
、アセトニトリルのグラジェントでカラムから溶出させ
た。精製されたインスリン類似体を含有するフラクショ
ンをまとめ、凍結乾燥して８９１１ｇを得た。その構造
を、アミノ酸分析（第１表）、および質量スペクトル分
析（ＭＳ）によって確認した。 ＭＳ　：　５７９５．２　（理論値：５７９４．７）。 実施例２０ Ｐｈｅ（８２８）、Ｐｒｏ（Ｂ２９）ヒトインスリンブ
タのデス−オクタペプチドインスリン（２９０ｍｇ＞お
よび合成オクタペプチド：　Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−
Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ３１０１ｆｇ
を、ジメチルスルホキシド１部、ｌ、４−ブタンジオー
ル２部、および０．２５Ｍ　　Ｉ−リス緩衝液（ｐＨ７
，３）１部を含有する溶液１０村中で混合した（３７°
Ｃ）。ブタトリプシン６０ｍｇを加えた。３７°Ｃで８
０分間、時折撹拌しながら、この溶液を充分に混合した
。 この時点で、得られたｉ＝物を０．０５Ｎ塩酸９０ｘＱ
に加え、反応を終止させた。得られた全溶液を、２１　
Ｘ　２５０ｘｘ　Ｃ−８Ｚｏｒｂａｘカラム上に注ぎ込
み、Ｏ，ＩＭ−塩基性リン酸ナトリウムｐ　Ｈ２ｆｌＪ
Ｌ液中、浅いアセトニトリルのグラジェントで生成物を
溶出させた。 分析用ＨＰＬＣによって決定した適当なフラクションを
まとめ９水で４倍に希釈し、２５Ｘ３００ｘｘ　Ｃ−１
８Ｖｙｄａｃ上に注ぎ込んだ。脱塩化タンパク質を、Ｏ
，１％トリフルオロ酢酸中、アセトニトリルのグラジェ
ントでカラムから溶出させた。精製されたインスリン類
似体を含有するフラクションをまとめ、凍結乾燥して１
７１ｇを得た。 その構造を、アミノ酸分析（第１表）、および質量スペ
クトル分析（Ｍ　Ｓ　）によって確認した。 ＭＳ　：　５８２７．９　（、理論値：５８２７．７＞
。 ブタのデス−オクタペプチドインスリン（３３９ｇｇ）
および合成オクタペプチド：　Ｇ　！ｙ−Ｐ　ｈｅ−Ｐ
　ｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ３６
３ｍｇを、ジメチルスルホキシドＩＬ　　１．４−７’
タンジオ一ル２部、および０．２５Ｍ　　トリス緩衝液
（ｐＨ７，３）１部を含有する溶液９ｆｆ１２中で混合
した（３７°Ｃ）。 ブタトリプシン７０ｍｇを加えた。３７℃で８０分間、
時折撹拌しながら、この溶液を充分に混合した。 この時点で、得られた混合物を０．０５　Ｎ塩酸ＬＯ８
ｘρに加え、反応を終止させた。得られた全溶液を、ｌ
　Ｑ　ｘ　２５０ｘｘ　Ｃ−８Ｚｏｒｂａｘカラム上に
注ぎ込み、０．１Ｍ−塩基性リン酸ナトリウムｐＨ２Ｆ
ｔｊ液中、浅いアセトニトリルのグラジェントで生成物
を溶出させた。 分析用ＨＰ　Ｌ　Ｃによって決定した適当なフラクショ
ンをまとめ、水で２倍に希釈し、ｌ０Ｘ２５ＱｘｘＣ−
８ウルトラスフェア上に注ぎ込んだ。 脱塩化タンパク質を、０．５％トリフルオロ酢酸中、ア
セトニトリルのグラジェントでカラムから溶出させた。 精製されたインスワン類似体を含有するフラクションを
まとめ、凍結乾燥して９７１Ｋｇを得た。その構造を、
アミノ酸分析（第１表）、および質量スペクトル分析（
ＭＳ）によって確認した。 ＭＳ　：　５７７８．６　（理論値：５７７７．６）。 実施例２２ Ｓｅｒ（Ｂ２８）、Ｐｒｏ（Ｂ２９）ヒトインスリンブ
タのデス−オクタペプチドインスリン（４１２ｍｇ）お
よび合成オクタペプチド：　Ｇ　１ｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ
Ｔ　ｙｒ−Ｔｈｒ−３ｅｒ−Ｐ　ｒｏ−Ｔｈｒ３９０　
ｍｇを、ジメチルスルホキシド１部、１，４〜ブタンジ
オ一ル２部、および０．２５Ｍ　　ｌ−リス緩衝液（ｐ
Ｈ７，３）１部を含有する溶液１：３＋＋２中で混合し
た（３７°Ｃ）。ブタトリプシン８０ｚｇを加えた。３
７°Ｃで１２０分間、時折撹拌しながら、この溶液を充
分に混合した。 この時点で、得られた混合物を０．０５Ｎ塩酸１３７１
１２に加え、反応を終止させた。得られた全溶液を、２
１　Ｘ　２５０．ｘｘ　Ｃ−８Ｚｏｒｂａｘカラム上に
注ぎ込み、０．ＩＭ−塩基性リン酸ナトリウムｐＨ２Ｍ
衝液中、浅いアセトニトリルのグラジェントで生成物を
溶出させた。 分析用ＨＰＬＣによって決定した適当なフラクションを
まとめ、水で２倍に希釈し、２５×３０Ｑｘｚ　Ｃ−１
３Ｖｙｄａｃ上に注ぎ込んだ。脱塩化タンパク質を、０
．５％トリフルオロ酢酸中、アセトニトリルのグラジェ
ントでカラムから溶出させた。精製されたインスリン類
似体を含有するフラクションをまとめ、凍結乾燥して３
７ｍｇを得た。 その構造を、アミノ酸分析（第１表）、および質量スペ
クトル分析（Ｍ　Ｓ　）によって確認した。 ＭＳ　：　５７６８．１　（理論値：５７６７．６）。 害飾湾ユ良 Ｔｈｒ（Ｂ２８）、Ｐｒｏ（Ｂ２９）ヒトインスリンブ
タのデス−オクタペプチドインスリン（４３７ｍｇ）お
よび合成オクタペプチド：　Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−ＰｈｅＴ
ｙｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ４２０＋ｇを、
ジメチルスルホキシド１部、１，４−ブタンジオール２
部、および０．２５Ｍ　　トリス緩衝液（ｐ）（７，３
）１部を含有する溶液１４．５＋（中で混合した（３７
°Ｃ）。ブタトリプシン８６ｍｇを加えた。３７°Ｃで
１２０分間、時折撹拌しながら、この溶液を充分に混合
した。 この時点で、得られた混合物を０．０５Ｎ塩酸１３５、
Ｅｌ！に加え、反応を終止させた。得られた全溶液を、
２１　Ｘ　２５０ｘｘ　Ｃ−Ｆ３　　Ｚｏｒｂａｘカラ
ム上に注ぎ込み、０．１Ｍ−塩基性リン酸ナトリウムｐ
　Ｈ２緩衝液中、浅いアセトニトリルのグラジェントで
生成物を溶出させた。 分析用ＨＰ　Ｌ　Ｃによって決定した適当なフラクショ
ンをまとめ、水で２倍に希釈し、２５Ｘ３０ＱｉＨＣ−
Ｉ　Ｆ３　Ｖｙｄａｃ上に注ぎ込んだ。脱塩化タンパク
質を、０．５％トリフルオロ酢酸中、アセトニトリルの
グラジェントでカラムから溶出させた。精製されたイン
スリン類似体を含有するフラクションをまとめ、凍結乾
燥して７８ｘｇを得た。 その構造を、アミノ酸分析（第１表）、および質量スペ
クトル分析（ＭＳ）によって確認した。 ＭＳ　：　５７８１．９　（理論値：５７８１．６）。 実施例２４ Ｔｒｐ（Ｂ２８）、Ｐｒｏ（Ｂ２９）ヒトインスリンブ
タのデス−オクタペプチドインスリン（３１０ｍｇ）お
よび合成オクタペプチド：　Ｇ　１ｙ−Ｐ　ｈｅ−Ｐ　
ｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ３２５
ｙｇを、ジメチルスルホキシド１部、１．４−ブタンジ
オール２部、および０．２５Ｍ　　）リス緩衝液（ｐＨ
７，３）１部を含有する溶液１０．５ｆｆｃ中で混合し
た（３７°Ｃ）。ブタトリプシン６４Ｒｇを加えた。３
７°Ｃで１２０分間、時折撹拌しなから、この溶液を充
分に混合した。 この時点で、得られた混合物を０．０５Ｎ塩酸＋４０．
ＭＱに加え、反応を終止させた。得られた全溶液を、２
１　Ｘ　２５０ｍｇ　Ｃ−８Ｚｏｒｂａｘカラム上に注
ぎ込み、０．ＩＭ−塩基性リン酸ナトリウムｐ　）（２
４ｆ２　面液中、浅いアセトニトリルのグラジェントで
生成物を溶出させた。 分析用ＨＰ　Ｌ　Ｃによって決定した適当なフラクショ
ンをまとめ、水で２倍に希釈し、２５Ｘ３００ｍｚ　Ｃ
−１８Ｖｙｄａｃ上に注ぎ込んだ。脱塩化タンパク質を
、０．５％トリフルオロ酢酸中、アセトニトリルのグラ
ジェントでカラムから溶出させた。精製されたインスリ
ン類似体を含有するフラクションをまとめ、凍結乾燥し
て４１ｍｇを得た。 その構造を、アミノ酸分析（第１表）、および質量スペ
クトル分析（Ｍ　Ｓ　）によって確認した。 ＭＳ　：　５８６６．２　（理論値：５８６６．７）。 実施例え５ Ｔｙｒ（８２８）、Ｐｒｏ（Ｂ２９）ヒトインスリンブ
タのデス−オクタペプチドインスリン（３９１ｍｇ）お
よび合成オクタペプチド：　Ｇ　Ｉｙ−Ｐ　ｈｅ−Ｐ　
ｈｅＴｙｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ４００ｍ
ｇを、ジメチルスルホキシド用部、１，４−ブタンジオ
ール２部、および０．２５Ｍ　　トリス緩衝液（ｐ　Ｈ
７，３）１部を含有する溶液１３１ｉ２中で混合した（
３７°Ｃ）。ブタトリプシン７９ｘｇを加えた。３７°
Ｃで１２０分間、時折撹拌しながら、この溶液を充分に
混合した。 この時点で、得られた混合物を０．０５　Ｎ塩酸１３７
３！（２に加え、反応を終止させた。得られた全溶液を
、２１　Ｘ　２５０ｘｘ　Ｃ−８Ｚｏｒｂａｘカラム上
に注ぎ込み、０．１Ｍ−塩基性リン酸ナトリウムｐＨ２
緩衝液中、浅いアセトニトリルのグラジェントで生成物
を溶出させた。 分析用ＨＰＬＣによって決定した適当なフラクションを
まとめ、水で２倍に希釈し、２５Ｘ３００ｘｘ　Ｃ−１
８Ｖｙｄａｃ上に注ぎ込んだ。脱塩化タンパクＷを、０
．５％トリフルオロ酢酸中、アセトニトリルのグラジェ
ントでカラムから溶出させた。精製されたインスリン類
似体を含有するフラクションをまとめ、凍結乾燥して３
０ｊ１ｇを得た。 その構造を、アミノ酸分析（第１表）、および質量スペ
クトル分析（ＭＳ）によって確認した。 ＭＳ　：　５８４３．７　（理論値：、５８４３．７）
。 大廊り叩頭 Ｖａｌ（Ｂ２８）、Ｐｒｏ（Ｂ２９）ヒトインスリンブ
タのデス−オクタペプチドインスリン（４００ｍｇ）お
よび合成オクタペプチド：　Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−ＰｈｅＴ
ｙｒ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ３８３ＪＩｇを
、ジメチルスルホキシド１部、１，４−ブタンジオール
２部、および０．２５Ｍ　　）リス緩衝液（ｐＨ７，３
）１部を含有する溶液１２ｘ（ｌ中で混合した（３７°
Ｃ）。ブタトリプシン７８ｘｇを加えた。３７°Ｃで１
２０分間、時折撹拌しながら、この溶液を充分に混合し
た。 この時点で、得られた混合物を０．０５Ｎ塩酸２３８１
（ｌに加え、反応を終止させた。得られた全溶液を、２
１　Ｘ　２５０ｕ＋　Ｃ−８Ｚｏｒｂａｘカラム上に注
ぎ込み、０．１Ｍ−塩基性リン酸ナトリウムｐＨ２緩衝
液中、浅いアセトニトリルのグラジェントで生成物を溶
出させた。 分析用）ＩＰＬＣによって決定した適当なフラクション
をまとめ、水で４倍に希釈し、２５Ｘ３００ｒｉｘ　Ｃ
−１８Ｖｙｄａｃ上に注ぎ込んだ。脱塩化タンパク質を
、０．１％トリフルオロ酢酸中、アセトニトリルのグラ
ジェントでカラムから溶出させた。精製されたインスリ
ン類似体を含有するフラクションをまとめ、凍結乾燥し
て７４ｍｇを得た。 その構造を、アミノ酸分析（第１表）、および質量スペ
クトル分析（Ｍ　Ｓ　）によって確認した。 ＭＳ　：　５７８０．０　（理論値：５７７９．６）。 実施例２７ Ｎｖａ（Ｂ２８）、Ｐｒｏ（Ｂ２９）ヒトインスリンブ
タのデス−オクタペプチドインスリン（２９２ｘｇ）お
よび合成オクタペプチド：　Ｇ　１ｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ
Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｎｖａ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ２７９ｍｇを
、ジメチルスルホキシド１部、１．４−ブタンジオール
２部、および０．２５Ｍ　　トリス緩衝液（ｐＨ７，３
）１部を含有する溶液１０ｊｌ＆中で混合した（３７°
Ｃ）。ブタトリプシン５７１ｇを加えた。３７℃で１２
０分間、時折撹拌しながら、この溶液を充分に７ｆｆ音
した。 この時点で、得られたＩｆ！音物を０．０５　Ｎ塩酸２
４０ｘＣに加え、反応を終止させた。得られた全溶液を
、２１　ｘ　２５　Ｑｎｘ　Ｃ−８Ｚｏｒｂａｘカラム
上に注ぎ込み、０．１Ｍ−塩基性リン酸ナトリウムｐ　
Ｈ２１衝ｉ＆中、浅いアセトニトリルのグラジェントで
生成物を溶出させた。 分析用ＨＰ　Ｌ　Ｃによって決定した適当なフラクショ
ンをまとめ、水で２倍に希釈し、２５Ｘ３００！Ｊｘ　
Ｃ−］８Ｖｙｄａｃ上に注ぎ込んだ。脱塩化タンパク質
を、０．５％トリフルオロ酢酸中、アセｊ・ニトリルの
グラジェントでカラムから溶出させた。精製されたイン
スリン類似体を含有するフラクションをまとめ、凍結乾
燥して５１ｍｇを得た。 その構造を、アミノ酸分析（第１表）、および質量スペ
クトル分析（ＭＳ）によって確認した。 ＭＳ　：　５７８０．０　（理論値二５７７９．６）。 実施例２８ 既述の操作法により、以下のインスリン類似体をさらに
調製した。 （ａ）　　Ａｓｐ（Ｂｌ）、Ｌｙｓ（Ｂ２８）、Ｐｒｏ
（Ｂ２９）ヒトインスリン （ｂ）　　デス（Ｐｈｅ−Ｂ　ｌ）、Ｌｙｓ（Ｉ３２８
）、Ｐ　ｒｏ（Ｂ２９）ヒトインスリン （Ｃ）　　デス（Ｐｈｅ−Ｂｌ）、Ａｓｐ（Ｂ１０）、
Ｌｙｓ（Ｂ２８）、Ｐｒｏ（Ｂ　２９）ヒトイ７ス１）
７（ｄ）　　デス（Ｐｈｅ−Ｂｌ、Ｖａｌ−Ｂ２）、Ｌ
　ｙｓ（Ｂ２８）、Ｐｒｏ（Ｂ２９）ヒトインスリン（
ｅ）　　デス（Ｐｈｅ−Ｂ　１、Ｖａｌ、−Ｂ２）、Ａ
ｓｐ（８゜１０）、Ｌｙｓ（［３２８）、Ｐｒｏ（Ｂ２
９）ヒトインスリン （ｆ、）　　Ｇｌｙ（Ａ２１）、Ａｓｐ（Ｂ１０）、Ｌ
ｙｓ（［３２８）、Ｐｒｏ（Ｉ３２９）ヒトインスリン
（ｇ）　　Ａｌａ（Ａ２１＞、Ａｓｐ（Ｂ　Ｉ　Ｏ）、
Ｌｙｓ（Ｂ２８）、Ｐｒｏ（Ｂ２９）ヒトインスリン（
ｈ）　　デス（Ｔｈｒ−Ｂ　３０）、Ｌｙｓ（８２８）
、Ｐｒ０（Ｉ３２９）ヒトインスリン （ｉ　）　　Ａｓｐ（Ｂ　１０）、Ａｒｇ（８２８）、
Ｐｒｏ（Ｂ２９）ヒトインスリン （ｊ）　　Ａ　Ｉａ（Ａ２１）、Ａｒｇ（Ｂ２８）、Ｐ
ｒｏ（Ｂ２９）ヒトインスリン （ｋ）　　Ａｓｐ（Ｂｌ）、Ａｒｇ（８２８）、Ｐｒｏ
（Ｂ２９）ヒトインスリン 実施例２９ 大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）Ｋ　１２　　Ｂ　Ｅ　１２０１
／ｐＫＣ２８３の凍結乾燥品は、受託番号ＮＲＲＬ　Ｂ
−１５８３０のもと、ノーザン・リージ曹ナル・リサー
チ会ラボラトリ−（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎａ
ｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｐｅ
ｏｒｉａ、　　ｌ１ｌｉｎｏｉｓ　６１６０４）から入
手される。この凍結乾燥品をＬＢ培地［ＩＱ中にバタト
ートリブトン　ｌＯｇ、バクトー酵母工牛ス　５ｇおよ
びＮａＣ（！１０ｇを含有、ｐＨを７．５に調節］（ｌ
　Ｏ＊０の入った試験管内にデカンテーションし、３２
°Ｃで２時間インキュベートする。 この時点で培養物を５０μｇ／＊αアンピシリンとし、
次いで３２°Ｃで一夜インキユベートする。大腸菌Ｋ　
１２　　ＢＥ　１２０１／ｐＫＣ２８３細胞は細胞性Ｄ
ＮＡに組込まれている温度感受性のｃＩリプレッサー遺
伝子を含有しているので、３２℃で培養した。本明細書
中、以後の実施例に記載しているように、このプラスミ
ドの単離操作に野生型のラムダｐＬリプレッサー遺伝子
を含む細胞、またはラムダｐＬプロモーターを含まない
細胞を用いる場合には、インキュベーション温度は３７
℃とする。 一夜培養物の少量をとり、大腸菌に１２　　ＢＥ１２０
１／ｐＫＣ２８３の単一のコロニー単離体が得られる様
な方法で、５０μｇ／＊Ｑアンピシリンを含むＬＢ−寒
天（Ｉ５ｇ／（ｌバクトル寒天を含むＬＢ培地）平板上
に蒔いた。得られた単一のコロニーを５０ｕｇ／ｘ（ｌ
アンピシリンを含むＬＢ培地（Ｉ０ｊｌ１２）に接種し
、激しく振盪しなから３２°Ｃで一夜インキユベートし
た。この−夜培養物１０ｘ１２を５０μｇ／＋（ｌアン
ピシリン含有のＬＢ培地（５００１１２）に接種し、激
しく振盪しながら培養物を定常相に達するまで３２℃に
おいてインキュベートした。 以下の操作は、マニアティス等［Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅ
ｔａｌｌ、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ　Ｃ１゜ｎｉｎｇ）、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　
ｌ１ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙコの方法を脚色
したものである。 ４°Ｃ５４０００ｇで１０分間遠心することによって細
胞を集め、その上清を捨てた。得られた細胞ペレットを
水冷のＳＴＥ緩衝液［０，１Ｍ　ＮａＣＲ；１０ｍＭ　
　トリス−ＨＣｌ２（ｐＨ７，８）　；およびｌｌ１Ｍ
　ＥＤＴＡＩ（ｌ　０Ｏｊｌ１２）で洗浄した。洗浄後
、得られた細胞ペレットを５ｇｇ／ｘ（ｌリゾチーム含
有の溶液１　［５０ｍＭ　グルツース：２５ｍＭトリス
ＨＣｇ（ｐＨ８，０）；および１０ｎＭ　ＥＤＴＡＩ（
Ｉ０Ｒシ）に再懸濁し、室温で１０分間放置した。次い
で、このリゾチーム処理した細胞に溶１ｆｆ１２［０゜
２Ｎ　ＮａＯＨおよび１％ＳＤＳ］（２０ｍ□を加え、
この溶液を反転させて穏やかに混合した。この混合物を
水上で１０分間インキュベートした。 この溶菌細胞混合物に水冷した５Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ
４，８）（Ｉ５ｍ１２）を加え、溶液を反転混合した。 この溶液を水上で１０分間インキュベートした。水（２
８，ＦＭ）および５Ｍ酢酸カリウム（６０ｊＩ＋２）に
氷酢酸（Ｉ１，５３１１２）を加えることによって５Ｍ
酢酸カリウム溶液を調製した；得られた溶液はカリウム
については３Ｍ、そして酢酸塩については５Ｍである。 この溶菌細胞混合物を、ベック７ン（Ｂｅｃｋｍａｎ）
ＳＷ２．７（またはその同等の機器）中、４°Ｃｌ２Ｏ
。 ０００　ｒｐｍで２０分間遠心した。細胞ＤＮＡと残骸
は管の底にベレットを形成した。上清約３６１１Ｌ（Ｉ
を回収し、インプロパツール（０，６容量）を加えて混
合し、得られた溶液を室温で１５分間放置した。室温、
１２．０００ｇで３０分間遠心することによってプラス
ミドＤＮＡを集めた。上清を捨て、ＤＮＡペレットを７
０％エタノールにより室温で洗浄した。このエタノール
洗液をデカントし、ベレットを真空デシケータ−中で乾
燥した。次いで、このベレットをＴＥ緩衝液［１０１１
１Ｍトリス−ＨＣ＆（ｐＨ８，０）および１ｍＭ　ＥＤ
ＴＡＩ（８ｘＲ）中に再懸濁した。 このＤＮＡ溶液にＣｓＣｓＣｌ２（８を加えた。各１ｏ
ｙａのＣｓＣｆ２−ＤＮＡ溶液に１０ｍｇ／ｘ（の臭化
エチジウム水溶液（約０、Ｂｇ＋（２）を加えた。最終
の溶液密度は約１．５５ｇ／ｉｃであり、臭化エチジウ
ム濃度は約６００μｇ／ｚ（ｌであった。この溶液をベ
ックマン５０型遠心管に移し、パラフィンオイルで上部
まで満たし、封をし、そして２０°Ｃ１４５，００Ｏｒ
ｐｍで２４時間遠心した。遠心後、普通光のもとて２つ
のＤＮＡバンドが観察された。 管からキャップを取った後、遠心管の側面から挿入する
＃２１皮下注射針の注射器を用いて下方のＤＮＡバンド
を採取した。 水飽和の１−ブタノールで数回抽出して臭化エチジウム
を除去した。ＴＥ緩衝液に対して透析することによって
ＣｓＣρを除去した。緩衝フェノール、次いでクロロホ
ルムで抽出した後、ＤＮＡ４７０％エタノールで沈澱さ
せ、洗浄し、そして乾燥した。約１１！ｇのプラスミド
ｐＫＣ２８３が得られ、これをＴＥ緩衝液中、約１μｇ
／μぐの濃度、４°Ｃで保存した。プラスミドｐＫＣ２
８３の制限部位および機能地図を添付の第１図に示す。 ２、′プラスミドｐＫＣ２８３ＰＸの構築実施例１で調
製したプラスミドｐＫＣ２８３ＤＮＡ（約１０μのを、
ｔＯＸ中−塩制限緩衝液［５００ｎ＋Ｍ　ＮａＣ（Ｉ：
　１００ｍＭ　　トリス−ＨＣ（（ｐＨ７５）　：　１
００　ｎ＋Ｍ　ＭｇＣＱｔ　；および１０ｍＭＤＴＴ］
（２０μＱ）、ｌｔｇ／峠Ｂ　Ｓ　Ａ（２０μＱ）、制
限酵素ＰｖｕＩｒ　（５ｕ１２）［〜５０単位（ベセス
ダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅＳ：ＢＲＬ）
の定義）；本明細書中で用いる制限酵素のすべてはここ
から人手した］、および水（Ｉ４５μｅ）と混合し、得
られた反応液を３７℃で２時間インキュベートした。本
明細書中に記載の制限酵素反応は、フェノール、次いで
クロロホルムで抽出することによって常法通り停止させ
、続いてＤＮＡを沈澱させ、エタノール洗浄し、そして
ＤＮＡをＴＥ緩衝液に再懸濁させる。このようにしてＰ
ｖｕｎ消化を停止させた後、ＰｖｕＩＩ消化プラスミド
ｐＫＣ２８３ＤＮＡを沈澱させ、次いでＴＥ緩衝液（５
μｇ）に再懸濁した。 Ｘｈｏｌリンカ−（５’−ＣＣＴＣＧＡＧＧ−３°）［
約６００ピコモル（ｐＭ）］を、５×キナーゼ緩衝液［
３００ｍＭトソスーＨＣｌ２（ｐＨ７，８）；　５０ｍ
Ｍ　Ｍｇ（ｄ！ｔ；および２５ｍＭ　ＤＴＴ］（ＬＯμ
ｆ２）、５ｍＭ　ＡＴＰ（５μＱ）、水（２４μｍ２）
、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ［０，５ｕ（！；Ｐ−
Ｌバイオケミカルズ（Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
ｓ）の定義で約２．５単位］、ＩＪＩｇノ１１ｅＢＳＡ
（５ｕの、および１０＠Ｍスペルミジ７　（５μ０を含
む混合物中、該混合物を３７℃で３０分間インキュベー
トすることによってキナーゼ処理した。 このキナーゼ処理したＸｈｏｌリンカ−（約１２゜５　
ｕ（２）をＰｖｕＵ−消化プラスミドｐＫＣ２８３ＤＮ
Ａ（５μｇ）に加え、次いでこのＤＮＡに、１０Ｘリガ
ーゼ緩衝液［３００＋Ｍ）リス−ＨＣｌ２（ｐＨ７゜６
）　：　ｌ　ＯＯｍＭ　ＭｇＣｌ２ｆｆ１：および５０
ｎＭＤＴＴ］（２，５μの、ｌＲｇ／村ＢＳＡ（２，５
μＱ）、５ｍＭＡＴＰ（７μの、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ［
２，５μＣ；約２．５単位（Ｐ−Ｌバイオケミカルスの
定義）コ、１０ｍＭスペルミジン（２，５μＱ）、およ
び（水３μ＋２）を加えた。得られたライゲージコン（
連結）反応液を４℃で一夜インキコベートした。ライゲ
ーション反応の後、反応混合物の組成を高−塩緩衝液［
０゜ＩＭ　ＮａＣＱ：　０．０５Ｍ　トリス−ＨＣｌ２
（ｐＨ７，５）；　１０．ＯｍＭ　ＭｇＣＱ、；および
１ｍＭＤＴＴコの組成に調節した。この混合物に制限酵
素ＸｈｏＩ（約１０μｍ２；　１００単位）を加え、得
られた反応液を３７℃で２時間インキュベートした。 反応を停止させ、Ｘｈｏｌ消化ＤＮＡを析出させ、再懸
濁し、そしてライゲーション混合物にＸｈｏｌリンカ−
を加えないということ以外は上記と同様にして連結させ
た。連結したＤＮＡは所望のブラ。 スミドｐＫＣ２８３ＰＸを構成していた。プラスミドｐ
ＫＣ２８３ＰＸの制限部位および機能地図を添付の第２
図に示す。 ３、大腸菌に１２Ｍ０（λ’）／ｐＫ　Ｃ２８３ＰＸの
構築 大腸菌に１２Ｍ０（λ°）は、ノーザン・リージコナル
・リサーチ・ラボラトリーズから、受託番号ＮＲＲＬ　
　Ｂ−１５９９３のもと、凍結乾燥品の形で入手するこ
とができる。大腸菌Ｋ１２ＭＯ（λつは野生型のラムダ
ｐＬｃｌリプレッサー遺伝子を含有しているので、本発
明のハイブリッドｐｉ、−１ｐｐプロモーターからの転
写は、この大腸菌Ｋ１２Ｍ○（λ゛）細胞内では起こら
ない。この凍結乾燥品を復元し、ＭＯ（λ゛）の単一コ
ロニーを単離し、そしてインキュベーション温度が３７
℃であることと増殖培地にアンピシリンを用いないこと
以外は、実質的に実施例２９Ａ１の方法に従ってＭＯ（
λ°）細胞の一夜培養物（Ｉ０ｆｆｉＱ）を調製した。 一夜培養物（５０μρ）を１０　ｍＭ　Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ
４および１０　ｏ＋Ｍ　ＭｇＣ（ｌ、含有のＬＢ培地（
５村）に接種した。この培養物を、激しく振盪しながら
３７℃で一夜インキコベートした。翌朝、培養物を１０
５ＭＭｇＳＯ４および１０＋Ｍ　ＭｇＣｌ２＊含有のり
、Ｂ培地で２００Ｊ１１２に希釈した。この希釈培養物
を激しい振盪下において、５５０　ｎｍでの吸光度（Ａ
１．。）が約０．５（これは約ｌＸｌ０’細胞／１１２
の細胞密度を示す）に達するまで、３７℃でインキュベ
ートした。水−水浴中で１０分間、培養物を冷却し、次
に４℃において、４０００ｙで１０分間遠心して細胞を
集めた。得られた細胞ベレットを冷１０ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ
４（ｌ　ＱＱｘのに再懸濁した後、直ちに遠心して再度
ペレット化した。この細胞ベレットを３０１１ＩＭ　Ｃ
ａＣ１２ｔ（Ｉ００ｉ＆）に再！Ｉ！、濁し、水上で２
０分間インキュベートした。 遠心して細胞を再び集め、３０ｍＭ　ＣａＣｅ−（Ｉ０
１（２）中に再懸濁した。細胞０．５ｘＱづつを実施例
２９Ａ２で調製した連結ＤＮＡに加えた（このＤＮＡは
３０　ｓＭ　ＣａＣ（ｌｘに調製しておいた）。この細
胞−ＤＮＡ混合物を水上で１時間インキュベートし、４
２℃で９０秒間熱シヨツクを与えた後、氷上で約２分間
冷凍した。この細胞−ＤＮＡ混合物を１２５１１２容量
のフラスコ中、ＬＢ培地（Ｉ０次１２）に希釈し、３７
°Ｃで１時間インキュベートした。 この１００μｅ部分量づつをアンピシリン含有のＬＢ−
寒天平板上にプレートし、コロニーが現われるまで３７
℃でインキュベートした。 コロニーを個々に培養し、各コロニーのプラスミドＤＮ
Ａを制限酵素分析とゲル電気泳動によって調へた。プラ
スミドＤＮＡの単離は、実施例２９Ａｌの方法に従って
小さいスケールで行ったが、所望の大腸菌に１２Ｍ０（
λ”）／ｐＫ　Ｃ２８３ＰＸ形質転換体が同定されるま
ではＣ３Ｃｉ２勾配の工程を削除した。プラスミドＰＫ
Ｃ２８３ＰＸノ制限部位および機能地図を添付の第２図
に示す。 ４、大腸菌に１２Ｍ０（λ”）／ｐＫＣ２８３−Ｌの構
築 実施例２９Ａ１の方法に従って調製したプラスミ　ド１
）ＫＣ２８３ＰＸ　　ＤＮＡ（ＩＱμｇ）を、　１０×
高−塩緩衝液（２０μ１２）、１ｍｇ／ｘｇＢ　Ｓ　Ａ
（２０ｕ（Ｉ）、制限酵素Ｂｇｌｎ（５μ（：〜５０単
位）、制限酵素Ｘｈｏ■（５μｅ；〜５０単位）、およ
び水（Ｉ５０μＱ）に溶解し、得られた反応液を３７℃
で２時間インキュベートした。反応を止め、ＢｇｌＩＩ
　−Ｘｈｏｒ消化ＤＮＡを沈澱させた後、このＤＮＡを
ＴＥ緩衝液（５μρンに再懸濁した。 ＢｇｌＩＴおよびＸｈｏＩ制限酵素切断の特徴を有する
１本鎖ＤＮＡ末端のＤＮＡリンカ−を合成し、キナーゼ
処理した。このリンカ−のキナーゼ処理は実質的に実施
例２９Ａ２の方法に従って行った。 このＤＮＡリンカ−は次の構造を有している：このリン
カ−は、当業界でよく知られている方法により、１本鎖
のデオキシオリゴヌクレオチドから合成した。その１本
鎖のデオキシオリゴヌクレオチドは、市販の装置、例え
ばアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、　８５０　ＬｉｎｃｏｌｎＣｅｎ
ｔｒｅ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　Ｃ
Ａ　９４４０４）から市販されている３８０Ａ　　ＤＮ
Ａ合成機によって合成することができるにの装置はホス
ホルアミダイトの化学を利用するものである）。ＤＮＡ
を合成するための他の方法も当業界で知られている。 １本鎖ＤＮＡ合成のための通常の改良ホスホトリエステ
ル法は、イタクラ等［１ｔａｋｕｒａ　ｅｔ　ａｌ、、
　５ｃｉｅｎｃｅ　１９８：１［１５６，１９７７コ、
およびフレア等［Ｃｒｅａ　ｅｔａｌ、、　Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７５：５７６５
，１９７８］に開示されている。さらに、ＤＮＡ合成に
特に好ましい方法は、シング等［１１ｓｉｕｎｇ　ｅｔ
　ａｌｌ、　ＮｕｃｌｅｉｃＡｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃ
ｈ　１１：３２２７．１９８３］、およびナラン等［Ｎ
ａｒａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、　　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉ
ｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　６８：９０．１９８０コに
開示されている。 このリンカ−とＢｇｌｌｌ−Ｘｈｏｌ消化プラスミドｐ
ＫＣ２８３ＰＸとを実質的に実施例２９Ａ２の方法に従
って連結させた。連結したＤＮＡは所望のプラスミドｐ
ＫＣ２８３−Ｌを構成していた。 プラスミドｐＫＣ２８３−Ｌの制限部位および機能地図
を添付の第３図に示す。プラスミドｐＫＣ２８３−Ｌ　
ＤＮＡを用いて大腸菌に１２Ｍ０（λ°）を形質転換し
、実質的に実施例２９Ａ３の方法に従って、得られた大
腸菌に１２Ｍ０（λ゛）／ｐＫＣ２８３−Ｌ形質転換体
を同定した。 ５、　大ＩＡｍＫ　１２　ＭＯ（λ”）／ｐＫＣ２８３
−ＬＢの構築 実質的に実施例２９ＡＩの方法に従って調製したプラス
ミドｐＫＣ２８３−Ｌ　ＤＮＡ（約１０μｇ）を、１０
Ｘ高−塩緩衝液（２０μＱ）、’１１１ｇ／ｌ（ｌ　Ｂ
Ｓ　Ａ（２０μの、制限酵素Ｘｈｏｌ（５μ１２；〜５
０単位）、および水（Ｉ５５μｇ）に溶解し、得られた
反応液を３７°Ｃで２時間インキュベートした。次いで
、９５％エタノール（３容量）と３Ｍ酢酸ナトリウム（
Ｉ／１０容量）を加え、ドライアイス−エタノール浴中
で５分間インキュベートすることにより反応混合物から
Ｘｈｏｌ−消化プラスミドｐＫＣ２８３−Ｌ　ＤＮＡを
沈澱させ、そして遠心した。 得られたＤＮＡベレットを７０％エタノールで洗浄シて
乾燥し、１０Ｘニック−トランスレーション緩衝液［０
，５Ｍｌ−リス−ＨＣ（（ｐＨ７，２）：　ＯＩＭ　Ｍ
ｇ５Ｏ，、およびＩＩＩＩＭ　ＤＴＴＩＩ（２μｇ）、
デオキシヌクレオチド三すン酸各２ｍＭづつを含む溶液
（ＩμＣ）、水（Ｉ５μｆｆ）、フレノウ（大腸菌ＤＮ
Ａポリメラーゼ■の大きいフラグメント）（ＩμＱ；〜
６単位（Ｐ−Ｌバイオケミカルズの定義））、および１
ｄｇ／ｘＱ　ＢＳＡ（Ｉμｇ）中に再懸濁した。得られ
た反応液を２５°Ｃで３０分間インキュベートし、この
溶液を７０℃で５分間インキュベートすることにより反
応を止めた。 ＢａｍＨＩリンカ−（５’　−ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＧ−
３’　）をキナーゼ処理し、Ｘｈｏｒ−消化してフレノ
ウ処理したプラスミドｐＫＣ２８３−Ｌ　ＤＮＡに、実
質的に実施例２９Ａ２の方法に従って連結させた。この
連結反応の後、高−塩緩衝液中、３７°Ｃで約２時間、
このＤＮＡをＢａｍＨＩ（約１００単位）で消化した。 このＢａｍＨＩ消化の後、実質的に実施例２９Ａ２の方
法に従ってＤＮＡをライゲーション用に調製した。 実質的に実施例２９Ａ２および２９Ａ３の方法に従い、
得られた〜５．９ｋｂ　ＢａｍＨｒ制限フラグメントを
連結反応によって環化し、大腸菌に１２　ＭＯ（λ゛）
に導入した。大腸菌に’１２Ｍ０（λ”）／ｐＫＣ２８
３−ＬＢ形質転換体を同定した後、実質的に実施例２９
Ａ１の方法に従ってプラスミドｐＫＣ２８３−ＬＢ　　
ＤＮＡを調製した。プラスミドｐＫＣ２８３−ＬＢの制
限部位および機能地図を添付の第４図に示す。 ６、大腸菌に１２Ｍ０（λ’）／ｐＬ　３２　（Ｄ構築
使用する出発プラスミド、制限酵素およびリンカ−が異
なる以外は、実質的に実施例２９Ａ５の方法に従い、プ
ラスミドＰＫＣ２８３ＰＸ（約１０μｇ）を高−塩緩衝
液中で制限酵素５ａｌＩにより消化し、フレノウ処理し
、ＥｃｏＲＩリンカ−（５’　−Ｇ＾ＧＧＡＡＴＴＣＣ
ＴＣ−３’　）に連結させた。制限酵素ＥｃｏＲＩで消
化して〜２．ｌｋｂのＤＮＡを除去し、次いで連結によ
り〜４．Ｏｋｂ　ＥｃｏＲｌ制限フラグメントを環化し
、プラスミドｐＫＣ２８３ＰＲ３を得た。 この連結したＤＮＡを用い、実質的に実施例２９Ａ３の
方法に従って大腸菌に１２Ｍ０（λ°〉を形質転換した
。大腸菌に１２Ｍ０（λ’）／ｐＫＣ２８３ＰＲ３形質
転換体を同定した後、実質的に実施例２９ＡＩの方法に
従ってプラスミドｐＫＣ２８３ＰＲＳ　　ＤＮＡを調製
した。プラスミドｐＫＣ２８３ＰＲＳの制限部位および
機能地図を添付の第５図に示す。 プラスミドｐＫＣ２８３ＰＲ３（約１０μｇ）を、高−
塩緩衝液（２００μｇ）中、制限酵素Ｐｓｔｒおよびｓ
　ｐｈ　ｒ　＜それぞれ約５０単位）で消化した。反応
液を３７°Ｃで約２時間インキュベートした後、反応混
合物をトリス−酢酸緩衝液中、０．６％低−ゲル化温度
アガロース［ＦＭＣコーボレイション（ＦＭＣＣｏｒｐ
ｏｒａｔｉｏｎ、　　Ｍａｒｉｎｅ　Ｃｏ１１ｏｉｄｓ
　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、　　Ｒ。 ｃｋｌａｎｄ、　Ｍａｉｎｅ　０４８４１）］ゲルによ
り、〜１３０Ｖ１〜７５ＩＩＩＡにおいて２〜３時間電
気泳動した。 ゲルを臭化エチジウムの希溶液で染色し、〜０゜８５ｋ
ｂ　Ｐｓｔｒ−８ｐｂｌ制限フラグメントを構成するＤ
ＮＡバンドを長波長のＵＶ光で観察し、これを小さなセ
グメントとしてゲルから切り取った。 このセグメントの容積をセグメントの重量と密度とから
計算し、それと等容量のｌＱｍＭトリス−ＨＣ＆（ｐＨ
７，６）をセグメントの入っている試験管に加えた。次
いで、このセグメントを７２℃でインキュベートして溶
融した。プラスミドｐＫＣ２８３ＰＲ８の〜０、Ｂ５ｋ
ｂ　ＰｓＬＩ−Ｓｐｈｌ制限フラグメント（約１μｇ）
を約１００μｇ容量中に得た。同様にして、プラスミド
ｐＫＣ２８３−ＬＢを制限酵素ＰｓＬＩとＳ　ｐｈ　Ｉ
で消化し、アガロースゲル電気泳動によって〜３．Ｏｋ
ｂ制限フラグメントを単離し、連結反応用に調製した。 実質的に実施例２９Ａ２の方法に従い、ブラスミ　ドｐ
ＫＣ２８３ＰＲＳの〜０、Ｂ５ｋｂ　　Ｐｓｔｌ　−５
ｐｈｒ制限フラグメントをプラスミドｐＫＣ２８３−Ｌ
Ｂの〜３．Ｏｋｂ　ＰｓｔＩ−３ｐｈｌ制限フラグメン
トに連結した。この連結ＤＮＡは所望のプラスミドｐＬ
　３２を構成していた。プラスミドｐＬ３２の制限部位
および機能地図を添付の第６図に示す。実質的に実施例
２９Ａ３の方法に従い、プラスミドｐＬ３２を大腸菌Ｋ
１２Ｍ０（λ°）細胞に導入した。実質的に実施例２９
Ａ１の方法に従い、大腸菌Ｋ１２Ｍ０（λ’）／ｐＬ　
３２形質転換体からプラスミドｐＬ３２　ＤＮＡを調製
した。プラスミドｐＬ３２　ＤＮＡの分析の結果、プラ
スミドｐＫＣ２８３ＰＸのフレノウ処理した５ａｌｔ末
端には１以上のＥｃｏＲＩリンカ−が結合していること
が分った。１以上のＥｃｏＲＩリンカ−の存在はプラス
ミドｐＬ３２またはプラスミドｐＬ３２誘導体の有用性
には何ら影響を及ぼさず、またそのことは、２個のＥｃ
ｏＲＩリンカ−が−緒にライゲートした場合には必ず生
成するＸｈｏｌ制限部位の存在によって検出することが
できる。別法として、ｐＬ３２プラスミドは、プラスミ
ドｐＫＣ２８３−ＬＢに対して、本実施例の第１パラグ
ラフに記載している５ａｌＩ−ＥｃｏＲＩ削除と連結反
応を行うことによっても構築することができる。 ７、大腸菌に１２Ｍ０（λ”）／ｐＬ　４７の構築大腸
菌に１２　　ＲＶ３０８／ｐＮＭ７８９は、ノーザン・
リージョナル・リサーチ・ラボラトリーズから受託番号
ＮＲＲＬ　　Ｂ−１８２１６のもと、凍結乾燥品として
入手することができる。ｐＮＭ７８９の制限部位および
機能地図を添付の第７図に示す。インキュベート温度を
３７°Ｃとしたこと以外は実質的に実施例１の教示に従
って、培養物からプラスミドＤＮＡを抽出する。ｐＮＭ
７８９（Ｉ０Ｍｇ）をＰｖｕＩＩ緩衝液［５０ＩＩＭト
リスーＨＣ（！（ｐＨ７、５）　；　６０ｍＭ　ＮａＣ
ｌ２　：および６１Ｍ　ＭｇＣｌ２ｔ］（２００μのに
懸濁させる。ＰｖｕＩ［（Ｉ単位）を加え、反応混合物
を３７°Ｃで５分間インキュベートする。 ６５°Ｃで１０分間加熱することによって酵素を失活さ
せる。次に、１０Ｘ１０ＸＢａ緩衝液［２００ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ２（ｐＨ８，０）；　ＩＭ　ＮａＣＱ：およ
び７０　ｍＭ　ＭｇＣ（ｔ］（３０μｇ）、水（７０μ
ｉ２）、およびＢａｍＨＩ（Ｉ０単位）を加え、この反
応液を３７℃で１時間インキュベートする。これに続い
てアルカリホスファターゼ（５単位）を加え、６５°Ｃ
で１時間インキュベートする。得られたＤＮＡフラグメ
ントを１％アガロースゲルで分離し、１カ所切断フラグ
メントのサイズのＤＮＡフラグメント（第８図）を精製
した。 平滑末端およびＢａｍＨＩ末端を有するＤＮＡ！Ｊンカ
ーを、実質的に実施例２９Ａ４の教示に従って合成する
。こ、のリンカ−（第８図中、１１８で示されている）
は次の構造を有している：実質的に実施例２９Ａ２の教
示に従って、このリンカ−をキナーゼ処理し、ＢａｍＨ
Ｉ　−Ｐｖｕｌｌ消化のプラスミドｐＮＭ７８９と連結
する。実質的に実施例２９Ａ３の教示に従い、この連結
混合物を用いて大腸菌Ｋ１２　ＲＶ３０８細胞を形質転
換し、得られた形質転換体についてプラスミドの単離を
行う。適切な大きさのＰｖｕｌｌフラグメント（４９４
　ｂｐ）およびＸｂａｌ−ＢａｍＨＩフラグメント（６
２８ｂｐ）を含むプラスミド数個を選択する。これらの
内の少なくとも２つの配列について、ＢａｍＨ■部位か
ら１つしかないＳ　ｍａ　１部位に向がって配列決定を
行い、所望の配列を有する１つのクローンを選択する。 この中間体プラスミドをプラスミド１２０と命名する。 この方法の工程図、ならびにプラスミド１２０の制限部
位および機能地図を添付の第８図に示す。 ＥＫ−ＢＧＨ−コード化ＤＮＡを単離するため、プラス
ミド１２０（約１０μｇ）を、制限酵素ＸｂａＩおよび
ＢａｍＨＩそれぞれを約５０単位含む高−塩緩衝液（２
００μの中で消化した。実質的に実施例２９八６の方法
に従い、得られた消化産物をアガロースゲル電気泳動で
分離し、ＥＫ−ＢＧＭをコードしている〜０．６ｋｂ　
Ｘｂａｌ　−ＢａｍＨＩ制限フラグメントを単離して連
結反応に備えた。 プラスミドｐＬ３２も制限酵素ＸｂａｌおよびＢａｍＨ
Ｉで消化し、〜３．９ｋｂ制限フラグメントを単離し、
連結反応用に備えた。実質的に実施例２９Ａ２の方法に
従って、プラスミドｐＬ　３２の〜３．９　ｋｂ　Ｘｂ
ａ　Ｉ　−ＢａｍＨＩ制限フラグメントをプラスミド１
２０の〜０．６　ｋｂ　Ｘｂａ　Ｉ　−ＢａｍＨＩ制限
フラグメントに連結し、プラスミドｐＬ４７を得た。プ
ラスミドｐＬ４７の制限部位および機能地図を添付の第
９図に示す。実質的に実施例２９Ａ３の方法と同様にし
てプラスミドｐＬ４７を大腸菌に１２Ｍ０（λ゛）に導
入し、得られた大腸菌Ｋｌ　２Ｍ０（λ”）／ｐＬ　４
７形質転換体を同定した。実質的に実施例２９Ａ１と同
様にして形質転換体からプラスミドｐＬ４７　　ＤＮＡ
をＭｉｄした。 ８、大腸菌に１２　ＲＶ３０８／ｐＰＲＩ２ＡＲ１の構
築 プラスミドｐＰＲ１２は、温度感受性ｐＬリプレッサー
遺伝子ｃ１８５７とプラスミドｐＢＲ３２２のテトラサ
イクリン耐性付与遺伝子を含有している。 プラスミドｐＰＲＩ２は米国特許第４．４３６、Ｂ１５
号（Ｉ９８４年３月１３日発行）に開示され、特許請求
されている。プラスミドＩ）ＰＨ１０の制限部位および
機能地図を添付の第１０図に示す。 プラスミドｐＰＲ１２（約１０μｇ）を、高−塩緩衝液
（２００ｐρ）中、制限酵素ＥｃｏＲＩ（約５０単位）
により、３７°Ｃで２時間消化した。このＥｃ。 Ｒ１消化プラスミドｐＰＲ１２ＤＮＡを、実質的に実施
例２９Ａ５の方法に従って沈澱させ、フレノウ処理した
。フレノウ反応の後、ＥｃｏＲＩ−消化してフレノウ処
理したプラスミドｐＰＲ１２ＤＮＡを、実質的に実施例
２９Ａ２の方法に従って連結して再環化した。アンピシ
リン耐性ではなくテトラサイタリン（５μｇ／ｍ□耐性
に基づいて選択を行なうこと以外は、実質的に実施例２
９Ａ３の方法に従い、所望のプラスミドｐＰＲ１２△Ｒ
１を構成している連結ＤＮＡを用いて大腸菌Ｋ１２　　
ＲＶ３０８を形質転換した。大腸菌に１２　　ＲＶ３０
８は受託番号ＮＲＲＬ　　Ｂ−１５６２４のもとてＮＲ
ＲＬから入手可能である。大腸菌に１２　ＲＶ３０８／
ｐＰＲ１２△Ｒ１形質転換体を同定した後、実質的に実
施例２９Ａｌの方法に従い、プラスミドｐＰＲ１２△Ｒ
Ｉ　　ＤＮＡを得られた形質転換体から調製した。 プラスミドｐＰＲ１２△Ｒ１（約１０μｇ）を、中−塩
緩衝液（２００μｊ）中、制限酵素ＡｖａＩ（約５０単
位）により３７℃で２時間消化した。実質的に実施例２
９Ａ５の方法に従い、Ａｖａｌ消化プラスミドｐＰＲ１
２△ＲＩ　　ＤＮＡを沈澱させ、フレノウ処理した。フ
レノウ反応の後、このＡｖａｌ消化してフレノウ処理し
たプラスミドｐＰＲ１２△ＲＩ　　ＤＮＡとＥｃｏＲＩ
リンカー：５’−ＧＡＧＧＡＡＴＴＣＣＴＣ−３’とを
実質的に実施例２９Ａ２の方法に従って連結した。この
リンカ一連結反応の後、得られたＤＮＡを沈澱させ、次
いで約５０単位の制限酵素Ｅｃｏ、ＲＩを含む高−塩緩
衝液（約２００μｉ２）に再懸濁した。得られた反応液
を３７℃で約２時間インキュベートした。このＥｃｏＲ
ｒ消化の後、実質的に実施例２９八６の方法に従い、反
応混合物をアガロースゲルに供し、〜５．１ｋｂのＥｃ
ｏＲＩ制限フラグメントを精製した。実質的に実施例２
９Ａ２の方法に従い、〜５．１ｋｂのＥｃｏＲｒ制限フ
ラグメントを連結して再環化した。 この連結ＤＮＡは所望のプラスミドｐＰＲ１２Ａｌｌを
構成していた。アンピシリン耐性ではなくテトラサイク
リン耐性に基づいて選択する以外は、実質的に実施例２
９Ａ３の方法に従い、プラスミドｐＰＲ１２ＡＲＩ　　
ＤＮＡを用いて大腸菌に１２ＲＶ３０８を形質転換した
。大ｉ！１に１２ＲＶ３０８／ｐＰＲ１２ＡＲ１形質転
換体を同定した後、実質的に実施例２９Ａ１の方法に従
ってプラスミドｐＰＲ１２ＡＲＩ　　ＤＮＡを調製した
。プラスミドｐＰＲ１２ＡＲ１の制限部位および機能地
図を添付の第１１図に示す。 ９、大腸菌Ｋ１２　ＲＶ３０８／ＰＬ１１０１７）構築 プラスミドｐＰＲ１２ＡＲＩ　　ＤＮＡ（約１０μｇ）
を、制限酵素ＰｓｔｌおよびＥｃｏＲＩ（それぞれ約５
０単位）を含む高−塩緩衝液（約２００ｉのに懸濁し、
この消化反応物を３７°Ｃで約２時間インキュベートし
た。次いで、実質的に実施例２９Ａ６の方法に従い、こ
の反応混合物をアガロースゲルに供し、プラスミドｐＰ
Ｒ１２ＡＲ１の〜２．９ｋｂＰｓｔ　Ｉ　−ＥｃｏＲＩ
制限フラグメントを単離し、連結反応に備えた。 プラスミドｐＬ４７（約ｌＯμｇ）を、高−塩緩衝液（
２００μ１２）中、制限酵素ＰｓｔｌおよびＢａｍＨＩ
により３７℃で２時間消化した。このＰｓｔｌ　　Ｂａ
ＩＩＩＨＩ消化ＤＮＡを、実質的に実施例２９八６の方
法に従ってアガロースゲルにかけ、複製起点とアンピシ
リン耐性付与遺伝子の一部とを含有する〜２．７ｋｂの
Ｐｓｔ　Ｉ　−ＢａＩＩＩＨＩ制限フラグメントを単離
し、連結反応に備えた。別の反応系で、プラスミドｐＬ
４７　　ＤＮＡ（約１０μｇ）を、高−塩緩衝液（２０
０μｌ）中、制限酵素ＥｃｏＲ１およびＢａｍＨＩによ
り３７°Ｃで２時間消化し、実質的に実施例２９Ａ６の
方法に従い、新規な転写および翻訳活性化配列とＥＫ−
ＢＧＨ−コード化ＤＮＡを含有する〜１．０３ｋｂのＥ
ｃｏＲＩ　−Ｂａｎ＋ＨＩ制限フラグメントを単離し、
連結反応に備えた。得られた〜１．０３ｋｂ　ＥｃｏＲ
Ｉ−ＢａｍＨＩ制限フラグメント（〜２μｇ）をプラス
ミドｐＬ１１０の構築に使用した。 アンピシリン耐性の代りにテトラサイクリン耐性を用い
て形質転換体を選択する以外は実質上実施例２９Ａ２お
よび２９Ａ３の方法に従い、プラスミドｐＬ４７の〜２
．７ｋｂ　ＰｓｔＩ　−ＢａｍＨＩ制限フラグメントお
よび〜１．０３ｋｂ　ＥｃｏＲＩ　−Ｂａｎ＋ＨＩ制限
フラグメントを、プラスミドｐＰＲ１２ＡＲ１の〜２．
９ｋｂ　Ｐｓｔｌ−ＥｃｏＲＩ制限フラグメントに連結
してプラスミドｐＬ１１０を構築し、この連結したＤＮ
Ａを用いて大腸ｍＫ１２ＲＶ３０８を形質転換した。 ＥＫ−８０Ｍコード化領域には、添付図面に示す制限部
位および機能地図には表わされていない２つのＰｓｔｌ
制限酵素認識部位が存在する。プラスミドｐＬ１１０の
制限部位および機能地図を添付の第１２図に示す。 １０、大腸菌Ｋ１２ＲＶ３０８／ｐＬ　１１０ｃの構築 ａ、大腸菌Ｋ　１２ＲＶ３０８／ｐＬ１１０Ａ（７）構
築 プラスミドｐＬ１１０ＤＮＡ約ｌμｇを、１０Ｘ高−塩
緩衝液［１，０Ｍ　ＮａＣｌ２．０．５０Ｍ　　トリス
−Ｈ（ｊ！　ｐＨ７，５，０、１０Ｍ　ＭｇＣ（ｌｔ、
　オヨび１０ｍＭ　ジチオトレイトール］２μｇおよび
Ｎｄｅｌ酵素３単位からなる液（総ｆｆ１２０μ１２）
中、制限酵素Ｎｄｅｌにより３７°Ｃで１時間消化した
。この反応渥合物をフェノール／クロロホルムで抽出し
、エタノールでＤＮＡを沈殿させた。Ｎｄｅ［消化プラ
スミドｐＬ１１０ＤＮＡをＩＸＸフレノウ衝液［４０Ｍ
Ｍ　ＫＰＯ４ｐＨ７，５，６、６ｍＭ　ＭｇＣム、１．
０ｍＭ２−メルカプトエタノール、３３ＭＭｄＡＴＰ、
３３μＭｄＣＴＰ、３３ＭＭｄＧＴＰ、および３３ＭＭ
ＴＴＰ］５０μＱに溶解した。フレノウとして知られて
いる大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ■の大きなフラグメント
２μｇ（〜ｌＯ単位、二ニー・イングランド・バイオラ
プス（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ））を
加え、ＤＮＡと混合し、得られた反応物を１６°Ｃで１
時間インキュベートした。フェノール抽出して反応を止
め、常法によりＤＮＡを精製した。次いで、Ｎｄｅｌ消
化してフレノウ処理したＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼに
よリ４°Ｃで１６時間連結（ライゲート）した。得られ
たＤＮＡを使用し、大腸菌に１２株ＲＶ３０８（ＮＲＲ
Ｌ　　Ｂ−１５６２４）を常法により形質転換した。１
００μｇ／＊Ｑアンピシリンを含有するし一寒天平板上
で形質転換体を選択し、バーンポインら（Ｂｉｒｎｂｏ
ｉｓ＋　ａｎｄ　Ｄｏｌｙ）により記載されている急速
アルカリ抽出法によって耐性コロニーからプラスミドを
単離した。Ｎｄｅ１部位を欠いているプラスミド（第１
３図に示すｐＬｌｌｏＡ）を選択した。 ｂ１部位特異的突然変異によるファージｐＬ１１０Ｂの
構築 部位特異的突然変異によってテトラサイクリン耐性付与
遺伝子内のＢａｎ＋Ｈ１部位を削除するためのプロトコ
ールを添付の第１３図の右側に示す。 ｂ（ｉ）ファージＭ１３Ｔｃ３の構築 プラスミドｐＬ１１０をテトラサイクリン耐性付与遺伝
子の供給源として使用した。ＴＥ緩衝液５０μρ中、プ
ラスミドｐＬｌｌＯ（約５０μｇ）をｌ　Ｑ　Ｘ　Ｈ１
ｎｄＩＩ［緩衝液２５ｔｔＱおよび水１７０μｅに加え
た。制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ約５μＣ（〜５０単位）を
このプラスミドＰＬＩ１０ＤＮＡの溶液に加え、得られ
た反応物を３７℃で２時間インキュベートシた。２Ｍ　
　ト！ＪＸ−ＨＣ１２（ｐ）ｔ７．４）約１３μｌ！、
および制限酵素ＥｃｏＲＩ　　５１ｔ（Ｉ（〜５０単位
）をＨｉｎｄｌｌｌ消化プラスミドＩ）ＬＩ１０ＤＮＡ
に加え、得られた反応物を３７６０でさらに２時間イン
キュベートした。この反応混合物をＴＥ−飽和フェノー
ルで抽出し、反応を停止させた（このフェ／−ルはクロ
ロホルム抽出で除去した）。 次いで、Ｅ　ｃｏＲＩ　−Ｈ１ｎｄＩ［Ｉ消化プラスミ
ドｐＬＩＩＱＤＮＡを沈殿および遠心によって採取し、
１％アガロースゲルに供し、そして大きな〜４゜３ｋｂ
　ＥｃｏＲ１−ＨｉｎｄｌＩ［制限フラグメントを単離
し、精製した。 ファージ５１３ｓ＋ｐ１８［二ニー・イングランド・バ
イオラプスコ約５μｇをＴＥ緩衝液５０μｇに溶解し、
次いで既述のようにＨｉｎｄ［［とＥｃｏＲＩで消化し
た。〜７．２５ｋｂ制限フラグメントを単離して精製す
る以外はｐＬｌｌｏに関して記載した通りに行い、得ら
れたＨ　１ｎｄｌｌＩ　−Ｅ　ｃｏＲＩ切断ファージＭ
１３ｒａｐｌ　８　　ＤＮＡを精製した。 プラスミドｐＬｌｌｏの〜４．３ｋｂ　ＨｉｎｄＩ［Ｉ
−ＥｃｏＲＩフラグメント約１１００ｎを、ｌＯＸリガ
ーゼ緩衝液２ａ（Ｉ，Ｔ４　　ＤＮＡ’Ｊガーゼｌμｇ
（〜１００単位）、および水１４μＱ中、ファージＭ１
３ｍｐ１８の〜７．２５ｋｂ　ＨｉｎｄＩＩ［−Ｅｃｏ
ＲＩフラグメント約１１００ｎと混合した。この連結反
応物を１５℃で１．５時間インキュベートした（得られ
た連結ＤＮＡは所望のファージｍ１３Ｔｃ３を構成して
いた）。ファージｍ１３Ｔｃ３の制限部位および機能地
図を添付の第１３図に示す。 大腸菌に１２　　ＪＭ１０９　（この代わりに、二ニー
・イングランド・バイオラプスから入手可能な大腸菌Ｋ
１２　　ＪＭ１０Ｉを使用することもできる）の−夜培
養物１ｆｆ１２をＬブロス５０Ｍ（ｌに接種し、Ｏ，Ｄ
、、、。が０．３から０．４の間になるまで通気下３７
°Ｃでこの培養物をインキュベートした。 得られた細胞を１０ｍＭ　ＮａＣｆｆ　２５ｆｆ１２中
に再懸濁し、氷上で１０分間インキュベートし、遠心し
て採取した。この細胞を７５ｍＭ　ＣａＣＱ＊　　１．
２５村に再び懸濁し、２００μＱの細胞を取り出し、上
記で調製した連結ＤＮＡｌ０μｇに加え、水上で約４０
分間インキュベートした。次いで、得られた細胞−ＤＮ
Ａ混合物を４２°Ｃで２分間インキュベートし、種々の
ｊ！（Ｉ，１０，およびｌＯＯμｇ）で取り出し、２％
Ｘ−ガル５０μρ、１０ＱｍＭ　　Ｉ　ＰＴＧ　５０μ
ｇ１および対数増殖期にある大腸菌に１２　　ＪＭ１０
９　２００μｇをさらに含有しているトップ寒天［４５
°Ｃにおいて融解したままである０、５％寒天を含有す
るしブロスコ３酎に加えた。次いで、この細胞−トップ
寒天混合物を、４０μｇ／ｍ（ＩＸ−ガノ喧５−ブロモ
ー４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−チオガラクト
シド）およびＯ，１ｍＭ　　ｒ　ＰＴＧ（インプロピル
−β−Ｄ−チオガラクトシド）を含有するし一寒天平板
上にプレートし、得られた平板を３７℃で一晩インキユ
ベートした。 翌朝、青色とは対照的な幾つかのきれいなプラークを別
々にＬグロス２ｘ（ｌに接種し、得られた培養物を通気
下３７℃で２時間インキュベートした。青色が存在しな
いことは、所望のＤＮＡの挿入が起こっていることを示
唆するものである。次いで、この培養物を遠心し、得ら
れた上清２００μＱを、通気下３７°Ｃで増殖している
大腸菌に１２　　ＪＭ１０９の培養物（０，Ｄ、、、ｏ
＝Ｑ、　５）１０ｘｇに加えた。これらの培養物を３７
℃でさらに３０分間インキユベートシ、次いで遠心して
ペレット化し、それが含有している組換えファージの複
製体を調製するために使用した。実施例１に記載した操
作法より小規模な変法により、２本鎖の複製型であるフ
乙−ジＤＮＡを細胞から単離した。 ファージｌｌ１ｌ　３Ｔｃ３　　ＤＮＡを含有する形質
転換体をそれらファージＤＮＡの制限酵素分析によって
同定した。 ｂ（ｉｉ）　　１本鎖ファージｍｌ　３Ｔｃ３　　ＤＮ
Ａの調製・ 大腸菌Ｋ　１２　　ＪＭ１０９／ｍｌ　３Ｔｃ３の一夜
培養物１．５１を遠心し、得られたファージｌｌ１１３
Ｔｃ３を含有する上清１００　ａＱを、Ｏ，Ｄ、、、。 ＝約０．４−０．５である大腸菌ＪＭ１０９の培養物２
５ｘＱに接種した。この培養物を通気下、３７℃で６時
間インキュベートし、次いで培養物を遠心し、得られた
上清約２０１を新しい試験管に移した。この上清に、２
０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）６０００および
１４，６％ＮａＣ１２を含有する溶液約２ｘ（ｌを加え
、次いで氷上で２０分間インキュベートシタ。 上清を７００　Ｏｒｐｍで２５分間遠心し、１本鎖ファ
ージｎ＋１３Ｔｃ３　　ＤＮＡを含有する得られたペレ
ットをＴＥ緩衝液５００μｅ中に再懸濁した。 このＤＮＡ溶液をＴＥ飽和フェノールで２回、さらにク
ロロホルムで２回抽出した。次いで、酢酸ナトリウムお
よびエタノールを使用して１本鎖ＤＮＡを沈殿させ、遠
心した。得られたベレットを７０％エタノールで洗浄し
、乾燥し、次いで水６０μｇに溶解した。 ｂ　（ｉｉｉ　）突然変異 突然変異に使用する１本鎖ＤＮＡフラグメントは、自動
ＤＮＡ合成機によって合成した。このフラグメントは、
配列： ５’　−ＣＣＣＧＴＣＣＴＧＴＧＧＡＴＡＣＴＣＴＡＣ
ＧＣＣＧＡ−３’を有しており、これは、プラスミドｐ
Ｂ　Ｒ３２２由来のテトラサイクリン耐性付与遺伝子内
においてＢａｍＨ１部位（５’−ＧＧＡＴＣＣ−３”）
を取り巻く領域とホモローガスであるが、５′末端から
２番目（または３′末端から３番目）のＡ残基はプラス
ミドｐＢＲ３２２ではＣ残基である。この変化は、テト
ラサイクリン耐性付与タンパク質のアミノ酸組成を変化
させないが、Ｂａ５Ｈ１部位を削除させる。 突然変異ブライマーおよびＭ１３普遍ブライマー［ベセ
スダ・リサーチ・ラボラトリーズ（ＢＲＬ、　Ｂｅｔｈ
ｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ、　ｐ、ｏ、ボックス６００９、ガイセルスベルク、
ＭＤ　２０７６０）コ約１０ピコモルを、１×キナーゼ
緩衝液（６０１ＩＭ　トリス−ＨＣ（ｌ　ｐＨ７，８，
１５５Ｍ２−メルカプトエタノール、１０　ａ＋Ｍ　Ｍ
ｇＣｈ、および０．４１μＭＡＴ　Ｐ）２０μｇ中、個
々にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ１０単位（Ｂ　ＲＬ
）で３７°Ｃ１３０分間処理した。得られたキナーゼ処
理ＤＮＡを以下に記載した突然変異誘発操作に使用した
。 １本鎖ファージｍｌ　３Ｔｃ３（３００ｎｇ、１．２μ
Ｑ）、を遍ブライマー１ピコモル（２μρ）、突然変異
ブライマー１ピコモル（２μｍ２）、１０Ｘアニーリン
グ緩衝液［１００ｍＭ　　トリス−ＨＣ（ｐＨ７，５，
１ｍＭＥＤＴＡ、および５００ｍＭＮａＣ（］３μＱ、
および水１２、ＢμＱを共に混合することによって、ア
ニーリング反応を行った。この反応物を８０°Ｃで２分
間、５０°Ｃで５分間インキュベートし、次いで室温に
−まで冷却した。 １０Ｘ伸長緩衝液［５００ｍＭ　　ト＋）　ス−Ｈ（ｄ
ｊｐＨ８，１ｍＭＥＤＴＡ、および１２０　ｍＭ　Ｍｇ
ＣＣ，コ５　μρ、　２ｔｍＭｄＡＴＰ５Ｂρ、　ｄＧ
ＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰの６１１ＩＭの各溶液ｌ
μＱ、フレノウｆｌｌμ１２［〜２２単、ファルマシア
　ｌ”Ｌバイオケミカルズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｐ−
Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ。 ８００センテニアル・アベニュー、ビスカッタウェイ。 ＮＪ　ａｓｓｓ４）］％Ｔ４　　ＤＮＡリガーゼ１μρ
（Ｉ００単位）、および水１７μＱをアニーリングした
ＤＮＡの混合物に加えることによって、伸長反応を行っ
た。この伸長反応物を室温で１時間、次いで３７℃で２
．５時間インキュベートした後、４℃で一夜インキユベ
ートした。 ＴＥ飽和フェノールで２回、次にクロロホルムで２回抽
出して反応を停止させた。得られたＤＮＡをエタノール
および酢酸ナトリウムで沈殿させた。遠心してＤＮＡを
採取し、水５０μＱ中に再懸濁し、次いでｌ０ＸｓＩ緩
衝液６μａをＤＮＡの溶液に加えた。 このＤＮＡ溶液を等量づつ３つの試験管に分けた。ｓ１
ヌクレアーゼ約２００単位［ミリス・ラボラトリーズ（
Ｍｉｌｅｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）コをこれらの
うち２つの試験管に加えた。１つのＳ１反応物を室温で
５分間インキュベートし、他方を１０分間インキュベー
トした。得られた反応混合物をＴＥ飽和フェノールで２
回抽出することによって反応を停止させた。このフェノ
ール抽出の後、クロロホルム抽出を２回行い、次いで酢
酸ナトリウムおよびエタノールを使用して反応混合物か
らＤＮＡを沈殿させた。未処置のＤＮＡ試料は、ネガテ
ィブ対照として利用した。残りの操作について、Ｓｌ処
置試料をそれぞれ別々に行ったが、同様の結果が得られ
た。 得られたＤＮＡペレットを水２０μｅ中に再懸濁し、Ｉ
　ＰＴＧまたはＸ−ガルを平板に加えないこと以外はフ
ァージｍ１３Ｔｃ３の構築を行った操作に従い、その溶
液１０μＱを使用して大腸菌に１２　　ＪＭ１０９（大
腸菌に１２　　ＪＭ１０Ｉも使用することができる）を
形質転換した。 約４８個のプラークから得た２本鎖の複製型であるＤＮ
Ａを既述のように単離し、ＢａｍＨＩ制限部位の存在に
関してスクリーニングした。ＢａｍＨ１部位を欠く単離
体を、既述のように１本鎖ＤＮＡ＠調製することによっ
てさらにスクリーニングした。ジデオキシ配列決定法［
スミス（Ｊ、　Ｈ，５ａｉｔｈ）。 Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　６５：
　５６０−５８０（Ｉ９８０）コによって配列決定を行
った。所望の単離体をｐＬｌｌｏＢと命名した（第１３
図）。 Ｃ，プラスミドｐＬ１１０ｃの構築 ファージｐＬＩ　１０Ｂ　　ＤＮＡの複製型約５０μｇ
を、Ｎｈｅｌ制限酵素〜５０単位を含有する１×Ｎｈｅ
ｌ緩衝液［５０ｍＭ　ＮａＣｆ２，６ｍＭ　　トリス−
ＨＣＱ　ｐＨ７，５，６ｍＭ　ＭｇＣ１２ｔ、および６
ｍＭβ−メルカプトエタノール］２５０μｇ中、３７°
Ｃで２時間消化した。次いで、ＳＭ　ＮａＣ＆５μＱを
Ｎｈｅｌ消化ファージｐＬ１１０Ｂ　　ＤＮＡに加え、
次いで５ａｌｌ制限酵素５μＩ２（〜５０単位）を加え
た。この消化を３７°Ｃで２時間続行した。次いで、周
知の標準的な方法に従って、テトラサイクリン耐性付与
遺伝子の突然変異領域を含有する所望の〜４２２ｂｐ　
Ｎｈｅｌ−３ａｉｌフラグメントをアクリルアミドゲル
から単離した。 ファージｐＬ１１０ＢをプラスミドｐＬ１１０Ａと置き
換える以外は同一の条件下で、プラスミドｐＬ　ｌ　１
０Ａ　ＤＮＡをＮｈｅＩおよび５ａｉｌで消化した。プ
ラスミドｐＬ１１０Ａの〜６．１　ｋｂ　Ｎｈｅｒ−３
ａｌｌ制限フラグメントをアガロースから精製した。 所望のプラスミドｐＬ１１０ｃは、ｐＬｌｌｏＡおよび
ｐＬｌｌｏＢのＮｈｅｌ−３ａｌｌフラグメント（それ
ぞれ〜６．ｌｋｂおよび〜４２２　ｂｐ）の各々１１０
０ｎを常法により互いに連結することによって構築した
。プラスミドＩ）ＬＩ１０Ｃの制限部位および機能地図
を添付の第１３図に示す。所望のプラスミドｐＬ１１０
ｃは、大腸菌内においてｌＯμｇ／ｘＱテトラサイクリ
ンに対する耐性を付与するが、テトラサイクリン耐性付
与遺伝子内でＢａＩＩＨ１部位を欠いている。 １１、　プラスミドｐｃＺＲ１１１の構築プラスミドｐ
Ｌ１１０ｃは、以下の反応を行うことによって除去され
たＣ１ａｌ制限部位を含有している。制限酵素Ｃ１ａｌ
および１０ＸＣ１ａＩ緩衝液［５００５Ｍ　ＮａＣＮ、
１００ｍＭ　　トリス−ＨＣ（ｌ　ｐＨ７，９、および
１００　ｍＭ　ＭｇＣＩ２ｔ］を使用すること以外は実
施例２９Ａ２の教示に実質的にしたがい、プラスミドＰ
ＬＩ１０Ｃ約１μｇをＣ１ａｌで消化した。次いで、４
つのｄＮＴＰのすべてでなくｄＣＴＰのみを加えること
以外は実施例２９Ａ５の教示に実質的にしたがい、Ｃ１
ａｌ消化ＤＮＡをフレノウ処理した。 次いで、ＤＮＡを沈殿させ、ムング・ビーン・ヌクレア
ーゼ（Ｍｕｎｇ　Ｂｅａｎ　Ｎｕｃｌｅａｓｅ）緩衝液
［５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，０）、３０ｍＭＮ
ａＣｌ２、および１ｍＭ　ＺｎＳＯ４］５０μＣ中に再
懸濁した。 ムング・ビーン・ヌクレアーゼにューイングランド・バ
イオラプスから市販されている）１単位を加え、得られ
た反応物を３０℃で３０分間インキュベートした。次い
で、試験管を水中に入れ、ＮａＣ１！を０．２Ｍになる
まで加えた後、その混合物をフェノール／クロロホルム
で抽出し、エタノール沈殿し、１０１１Ｍ　トリス−Ｈ
ＣＮ’ｐＨ８，０に再懸濁した。次いで、実施例２９Ａ
３および２９Ａ４の教示に実質的にしたがって、ＤＮＡ
を自己連結させ、大腸菌細胞に導入した。得られたプラ
スミドをｐｃＺＲｌｌｌと命名した。 １２、ブラｘミｌ’ｐｃＺＲ１２６ｓの構築プラスミド
ｐｃＺＲ１１１約２６μｇを以下のようにＸｂａｌで消
化した。１０ＸＸｂａｌ緩衝液の組成は、６００ａ＋Ｍ
）リス−ＨＣＩ２．１００ｍＭＭ　ｇ　ＣＱ　！、ＩＭ
ＮａＣＬおよび１０ｍＭ２−メルカプトエタノールｐＨ
７，５（３７°Ｃ）である。プラスミドｐＬ　ｌ　１０
約２５μｇを含有する水２５０ａＱに１０ＸＸｂａｌ緩
衝液５０ｔｔＱ、　Ｘｂａｌ　１５μ１２（ｌＯ単位／
、ｃｌ）、および水１８５μＣを加えた。消化反応を３
７°Ｃで１時間行った。次いで、Ｘｂａｌ消化ｐＬ１１
０をフェノールで抽出し、ｌ／１０容量の３Ｍ酢酸ナト
リウム、３容量のエタ／−ルを加え、得られた混合物を
ドライアイス−エタノール浴中で５分間インキユベート
シ、次いで遠心した。沈殿したＤＮＡを水５０μＱに再
懸濁した。 ＸｂａＩ消化プラスミドｐｃＺＲ１１１を以下のように
してＢａａ＋ＨＩで消化した。上記のようにして得たＸ
ｂａｌ消化ｐＬ１１０　５０ｔｔ（ｌに、ＢａｍＨｌｏ
、２μｍ２（Ｉ０単位／μ１２）、ＢａｍＨＩ緩衝液［
ＩＱＱｉＭ）リス−ＨＣ１２，５０ａ＋Ｍ　ＭｇＣＩ２
ｔ、ＩＭＮａＣＱ、および１０＋ａＭ２−メルカプトエ
タノール、ｐＨ８，０（３７℃）コ１０μ＆、および水
９０μｇを加えた。３７°Ｃで５分間消化を行った。 消化ｐｃＺＲ１１１をフェノールで抽出し、１／ｉｏ容
ｆｆｔの酢酸すｌ−’Ｊウムを加えた後、３容量のエタ
ノールを加えた。沈殿したＤＮＡをＩＣ）ｏＭト　リス
、　ＩＭ　　ＥＤＴＡｐＨ８，０緩速ｊｌ夜５０μｇ中
に再懸濁した。 次いで、ＸｂａｌおよびＢａｍＨＩ消化ｐｃＺＲＩＩＩ
をアガロースゲルに供し、約５、ＢｋｂのＤＮ”Ａバン
ドを単離した。ｐｃＺＲｌｌｌの〜５、Ｂｋｂフラグメ
ントを、Ｘｂａｌ−Ｎｄｅｌリンカ−１および５°末端
にＮｄｅ１部位を含有して３′末端にＢａＩＩＩＨ１部
位を含有するＥＫ−ウシ成長ホルモンをコードしている
合成遺伝子と連結することによって、プラスミドｐｃＺ
Ｒ１２６ｓを調製した。ｘｂａｌからＮｄｅｌまでの配
列は標準的なオリゴヌクレオチド配列法により調製し、
それは以下の配列を有している： て構築した。ＥＫｂＧＨをコードしている遺伝子は、全
遺伝子の相補性鎖の両方を一緒に含有している、７１か
ら８３ヌクレオチドの長さを有する１６個の化学的に合
成された１本鎖ＤＮＡ片から構築した。この合成は、ア
プライド・バイオシステムズ（ＡＢＳ）機器を使用して
行い、それは以下の配列を有するものである： （以下余白） この配列は、側鎖を化学的に合成した後、ハイブリダイ
ゼーシヨンするように混合することによっプラスミドｐ
ＣＺＲ１２６Ｓの構築は、以下の部位成分を連結するこ
とによって行った：Ｘｂａｌで完全消化してＢａｍＨＩ
で部分消化した後のプラスミドｐＬ１１０から得た５、
８ｋｂフラグメント〜０．２８μｇ（総ｆｆ１２μｆｆ
）、ＸｂａＩ部位に相当する５°末端を有し、Ｂａａ＋
８１部位に相当する３゛末端を有しているウシ成長因子
誘導体をコードしている合成遺伝子〜０．■８μｇ（総
攬２゜５μｅ）、および化学的に合成したＸｂａｌ　−
Ｎｄｅｌリンカ−８，７５ピコモル（ＩμＩ２）。これ
らのプラスミド成分を、５ｘ連結緩衝液［２５０ｍＭ）
リス−ＨＣＱ、５０ｍＭ　ＭｇＣＱ＝、５＋ｎＭ　ＡＴ
Ｐ、５ｍＭ　ＤＴＴ、　２５％ｖ／ｖポリエチＬ／７グ
リコールｓ、ｏｏｏ、ｐＨ７，６］６μ１２．！Ｊガー
ゼ２μｆ２゜および水１６．５μＱに加えた。この連結
混合物を１６℃で一夜インキユベートした。次いで、実
施例２９Ａ３の方法に実質的にしたがって、環化したプ
ラスミドｐｃＺＲＩ２６ｓを使用して大腸菌ＲＶ３０８
細胞を形質転換した。プラスミドｐＣＺＲ１２６Ｓの制
限部位および機能地図を添付の第１４図に示す。 Ｂ　ヒト・プロインスリン発現プラスミドｐＲＢ１７２
の構築 １、プラスミドｐＲ８１４５の構築 ヒトプロインスリン遺伝子をまず常法により合成し、Ｐ
ＵＣ１８プラスミド（ＢＲＬから市販されている）にク
ローンした。この遺伝子の合成は漂準的な方法で行い、
それは以下の配列を有している： ＭπＡ ＣＡＣＣＴＴＣＧＡＧＡ ＴＣ ＧＧＣＣＣＡＣＧＴＣＣＧＴＣＧＧＡＣＧ正しい配列を
有する１つのクローンを選択し、塩化セシウム精製した
ＤＮＡを調製した。標準的な方法「たとえば、モレ牛ニ
ラ−・クローニング。 ア・ラボラトリ−・マニユアル（Ｉ９８２）、マニアチ
スら（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　
Ｅ、　Ｆ、　　およびＳａｍｂｒｏｏｋ。 Ｊ、　）１．コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラ
トリ−・パブソケイションズ、ニューヨーク］によって
プラスミドを単離した。このプラスミドＤＮＡ約６　μ
Ｑ＜２０　ｔｔ　ｇ）を１０ＸＮｄｅｌ緩衝液［１５０
１１ＮａＣＱ、１０ＩＩ＋Ｍ　　トリス−ＨＣｆ２ｐＨ
７゜８．６ｍＭ　ＭｇＣ（ｂ、６ｎ＋Ｍ２−メルプＪブ
トエタノール、１００　ｉｔ　ｇ／ｘＱ　Ｂ　Ｓ　Ａｌ
１０１ｔ（Ｉ，、ＮｄｅＩ制限酵素５μａ（〜４０単位
）、および水１６９μｅに加えた。混合した後、この反
応物を３７°Ｃで２時間インキュベートした。０．３Ｍ
酢酸ナトリウムの混合物を調製し、３容量のエタノール
を加えて混合することによってＤＮＡを沈殿させ、−７
０℃に冷凍し、遠心した。得られたＤＮＡベレットを７
０％エタノール（ＩｘＱ”）で洗浄し、乾燥し、ｌ　Ｏ
Ｘ　ＢａｍＨＩ緩衝液［１５０ｘｘ　Ｎａ（Ｊ！、　６
ｆｆ１Ｍ　トリス−ＨＣ（ｌ　ｐＨ７，９，６ｍＭ　Ｍ
ｇＣＱｔ−１００ａｇ／ｙｔ（ｌ　ＢＳＡコ２０　ｔｔ
ＱＳＢａｍＨＩ制限酵素２μＱ、（４，０単位）、およ
び水１７８μｇに溶解した。穏やかに混合した後、反応
物を３７°Ｃで２時間インキュベートした。上記のよう
にして３容量のエタノールを使用し、ＤＮＡを再び沈殿
させ、１％低融解アガロースゲル［ＦＭＣ、シー・プラ
ーク１アガロース（ｓｅａ　ｐｌａｑｕｅ　ａｇａｒｏ
ｓｅ）コの電気泳動にかけた。約２７０ｂｐに相当する
所望のＤＮＡフラグメントをそのゲルから切除した後、
本編者によって推奨されている操作にしたがって、アガ
ロースを溶融してＥｌｕｔｉｐ−ｄカラム［５ｃｈｌｅ
ｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｕｅｌｌ、　Ｋｅｅｎｅ、　Ｎ
、　Ｈ，］に通すことによりＤＮＡを回収した。沈殿さ
せて乾燥した後、得られたＤＮＡを１０ｍＭ　トリス−
ＨＣ１２（ｐ　Ｈ８，０）３０μＱ中で保存した。 プラスミドＰＣＺＲ１２６Ｓ（実施例２９Ａ１２から入
手）約１５μｇを１０ＸＮｄｅｌ緩衝液２０１１（Ｉ，
Ｎｄｅｌ制限酵素５μ（！（４０単位）、および水１７
５μＱに懸濁し、穏やかに混合し、３７°Ｃで２時間イ
ンキュベートした。インキュベートした後、上記のよう
にしてＤＮＡを３容量のエタノールで沈殿させ、乾燥し
た後、１０Ｘ１０ＸＢａ緩衝液２０１ｔ（ｌＳＢａｍＨ
ｒ制限酵素２μ（（４０単位）および水１７８μｅ中に
再懸濁した。穏やかに混合した後、反応物を３７°Ｃで
２時間インキュベートした。再び、３容量のエタノール
を使用してＤＮＡを沈殿させ、１％低融解アガロースゲ
ルの電気泳動にかけた。ベクターＤＮＡに相当する大き
い方のフラグメントをそのゲルから切除し、既述のよう
にＥ　１ｕｔｉｐ−ｄカラム操作によってＤＮＡを回収
した。ベクターＤＮＡを沈殿させて乾燥した後、１０Ｉ
ｌ＋Ｍ　　Ｘ）ｘ−ＨＣ（ｌｃｐＨ８，０）３５ｕ（ｌ
中で保存した。 このベクターＤＮＡ約２．５μρを、上記で得た精製ヒ
トインスリン遺伝子フラグメント１２μ（２，１０ｍＭ
　ＡＴＰ４μρ、ＩＭ　ジチオトレイトール０．５μＣ
，１０Ｘリガーゼ緩衝液［５００＋＋＋Ｍトリス−ＨＣ
ＱｐＨ７，６、および１００ｍＭＭｇＣＱｔコ５μＱ１
水２６μＱ、およびＴ、−、ＤＮＡリガーゼ［ファルマ
シア、３．５単位］０．５μｇト混合した。この反応物
を４℃で１６時間インキュベートした。得られた連結混
合物をｌＱｍＭ　　トリス−ｏｃａｐ８７．６（５０μ
Ｒ）およびｌ　Ｍ　ＣａＣＱ、ｔ３ｔｔ（！で希釈し、
続いて実施例２９Ａ３の教示に実質的にしたがって大腸
１１に１２　　ＲＶ３０８に導入した。得られた細胞を
、５μｇ／ｘＱテトラサイタリンを含有するＴＹ平板上
にプレートし、次いで３２°Ｃで一夜インキユベートし
た。 モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリ−・マニ
ュアル［（Ｉ９ｇ２）、マニアチスら（Ｍａｎｉａｔ　
ｉｓ。 Ｔ、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　Ｅ、　Ｆ、　およびＳａｍｂ
ｒｏｏｋ、　Ｊ、）綱、コールド・スプリング・ハーバ
−・パブリケイションズ。 ニューヨーク］（３６８−３６９頁）に記載されている
急速アルカリ抽出法によってテトラサイクリン耐性コロ
ニーから、培養物３３１（中のプラスミドを単離した。 ポリアクリルアミドゲル電気泳動を利用したミニスクリ
ーン法によりＸｂａｌ／Ｂａ５ｉＨＩ消化フラグメント
を分析し、正しいプロインスリン遺伝子フラグメントの
存在を見いだした。 正しい大きさ（約３１５ｂｐ）の挿入体を有するプラス
ミドを選択し、増幅して精製した。ヒトプロインスリン
遺伝子を含有するプラスミドはｐＲＢ１４５であった。 プラスミドｐＲＢ１４５の制限部位および機能地図を添
付の第１６図に示す。 ２、プラスミドＲＢ１６４Ａの構築 プラスミドｐＲ−８１４５（約３０μｇ）をｌ０ＸＮｄ
ｅｌ緩衝液２０ａＱ、Ｎｄｅ［制限酵素［ニューイング
ランド・バイオラプス、４０単位コ５μｇ、および水１
７５μＱに懸濁し、穏やかに混合して３７℃で１時間イ
ンキュベートした。次いで、ＢａＩＩＨ■制限酵素２μ
１２［ニューイングランド・バイオラプス、４０単位コ
を反応混合物に加え、３７°Ｃでさらに２時間インキュ
ベートした。３容量のエタノールおよび０．３Ｍ酢酸ナ
トリウムを使用してＤＮＡを沈殿させ、１％低融解アガ
ロースゲルの電気泳動にかけた。ヒトプロインスリン遺
伝子をコードしている小さい方のＮｄｅ　Ｉ　／　Ｂ　
ａｍＨＩ制限フラグメント（約２７０　ｂｐ）をそのゲ
ルから切除した後、既述のようにしてＥｌｕｔｉｐ−ｄ
カラムに通すことによってＤＮＡを回収した。沈殿させ
て乾燥した後、得られたＤＮＡを１０ｆｌ１Ｍ　トリス
−Ｈｏｆｆ（ｐ　Ｈ８，０）３０　ｕ（ｌ中に保存シタ
。 次いで、このＤＮＡ（３０μＱ）に、１ＯＸＡｖａ■緩
衝液［５０ＩＩ＋Ｍ　ＮａＣ１１！、　６１１１Ｍ　　
トリス−ＨＣ＆ｐＨ８，０，１０ｍＭ　ＭｇＣｆ２＊、
６ａ＋Ｍ　２−メルカプトエタノール、１００μｇ／ｘ
ＱＢｓＡコ２０μ（Ｉ，Ａｖａｉｌ制限酵素５μ１２に
ューイングランド・バイオラプス、２０単位）、および
水１７５μＣを加えた。穏やかに混合した後、この反応
物を３７℃で２時間インキュベートした。３容量のエタ
ノールおよび３Ｍ酢酸ナトリウム（２０μｇ）でＤＮＡ
を沈殿させた後、１．２％低融解アガロースゲルの電気
泳動にかけた。大きい方のＡｖａＩＩ／ＢａａＨ１制限
フラグメント（約１５６　ｂｐ）をそのゲルから切除し
、次いで既述のようにＥｌｕｔｉｐ−ｄカラムに通して
ＤＮＡを回収した。沈殿させて乾燥した後、得られたＤ
ＮＡを１１０１１Ｉトリス−ＨＣ（２（ｐＨ８，０）３
０μｇ中で保存した。 ヒトプロインスリン遺伝子のＮｄｅｌ　／　ＡｖａｌＩ
制限フラグメントに相当するＤＮＡ（〜１１５ｂｐ）を
合成的に調製した。最初の工程は、ＤＮＡ合成機［アプ
ライド・バイオシステムズの３８０Ｂ型コによる４つの
１本鎖デオキシリボオリゴヌクレオチドの合成である。 これら４つのオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を
以下に示す； １、　ＴＡＴＧＣＧＴＡＴＧＴＴＴＧＴＴＡＡＣＣＡＡ
ＣＡＣＣＴＧＴＧＣＧＧＣＴＣＣＣＡＣＣＴＧＧＴＧＧ
ＡＡＧＣＴＣＴＧＴＡＣＣＴ　（６０ｎｅｒ）２、　Ｇ
ＧＴＧＴＧＣＧＧＴＧＡＡＣＧＴＧＧＣＴＴＣＴＴＣＴ
ＡＣＡＣＣＡＡＧＣＣＧＡＣＣＣＧＣＣＧＴＧＡＧＧＣ
ＡＧＡＧ　（５５ｍｅｒ）３、　ＣＡＣＣＡＧＧＴＡＣ
ＡＧＡＧＣＴＴＣＣＡＣＣＡＧＧＴＧＧＧＡＧＣＣＧＣ
ＡＣＡＧＧＴＧＴＴＧＧＴｒＡＡＣＡＡＡＣＡＴＡＣＧ
ＣＡ　（６２ｍｅｒ）４、　ＧＴＣＣＴＣＴＧＣＣＴＣ
ＡＣＧＧＣＧＧＧＴＣＧＧＣＴＴＧＧＴＧＴＡＧＡＡＧ
ＡＡＧＣＣＡＣＧＴＴＣＡＣＣＧＣ＾（５４ｌｌ１ｅｒ
）ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって各オリゴヌ
クレオチドを精製した後、ブラウンら［１３ｒ。 ｖｎ、　Ｅ、　Ｌ、、Ｂｅｌａｇａｊｅ、　Ｒ，、Ｒｙ
ａｎ、　Ｍ、　Ｊ、、およびＫｈｏｒａｎａ、　Ｈ，Ｇ
、　］のＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
、ｆｌｕ、Ｒ，編、アカデミツク・プレス、ニューヨー
ク、　６８．１０９−１５１（Ｉ９７９）の教示にした
がって、オリゴヌクレオチド２および３をリン酸化した
。次いで、このリン酸化したオリゴヌクレオチド２およ
び３（各〜７１５７１５ピコをオリゴヌクレオチド１お
よび２（〜８６０ピコモル）と混合してアニーリングし
、５０ｆｆ１ＭトリスーＨＣＩ２　ｐＨ７，６、ｌ　Ｏ
ｍＭ　ＭｇＣ（、、ｌＱｍＭ　ＤＴＴ１５０μＭＡＴＰ
、およびＴ４ＤＮＡリガーゼ（ファルマシア）２０単位
を含有する緩衝液２００μσ中において４°Ｃで１６時
間連結した。この連結産物を１５％ポリアクリルアミド
ゲルで精製した。電気泳動によって得られたゲル切片か
らＤＮＡを回収し、次いでセファデックスＧ−５０カラ
ムで脱塩化した。所望の連結産物の収量は４８５ピコモ
ルであった。 ブラウンらのＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ、　６８．１０９−１５１（Ｉ９７９）に記載され
ているように、５０Ｉｌ１ＭトリスｐＨ７，６，１０ｍ
Ｍ　ＭｇＣｌ２ｔ、　１０ｍＭ　ＤＴＴおよびＡＴＰを
含有する緩衝液５０μｇ中において、このＤＮＡ約１０
０ピコモルをリン酸化した。 セファデックスＧ−５０のカラムで濾過した後、得られ
たＤＮＡを１０ｍＭ　　トリス　ｐＨ８，０（５０μｇ
）中で保存した。 ５０ｍＭ　　トリスｐＨ７，６，１０ｍＭ　ＭｇＣρ、
、１０ｍＭ　ＤＴＴ、８００μＭ　ＡＴＰ、およびＴ４
ＤＮＡリガーゼ３．５単位を含有する緩衝液５０μρ中
で構築したばかりのＮｄｅｌ／Ａｖａ［Ｉ合成リンカ−
１０μｅ（Ｉ０ピコモル）、およびプラスミドｐＲＢ１
４５から得たＡｖａＩＩ／　ＢａｍＨＩ制限フラグメン
ト１８μｇと、得られたベクターＤＮＡ（Ｎｄｅｌ−Ｂ
ａｎ＋ＨＩ消化ｐｃＺＲ１２６ｓ）約２．５μｇとを混
合した。この反応物を４℃で一晩インキコベートし、次
いで実施例２９Ａ３の操作法にしたがって大腸菌に１２
　ＲＶ３０８に導入した。所望の形質転換体である大腸
菌に１２　　ＲＶ３０８／ｐＲＢ１６４Ａをそのプラス
ミドＤＮＡの分析によって同定した。適切な形質転換体
を、５μｇ／１１２テトラサイクリンを含有するＴＹ培
地中、３０℃で、Ｏ，Ｄ、ｓｓｏが約０．２（対数期の
初期）になるまで増殖させ、次いで３から３．５時間か
けて４２℃に変更し、ヒトプロインスリンの合成を誘導
した。細胞をベレット化し、試料緩衝液［０１２５Ｍ　
トリス−ＨＣ１２ｐＨ６，８，２％ＳＤＳ。 ３０％グリセロール、１Ｍ２−メルカプトエタノール、
６Ｍ尿素コを滴加して溶菌した。アクリルアミドゲルに
かける前に、この試料を９７°Ｃに２分間加熱した。コ
オマッシー・ブリリアント・ブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉ
ｅ　Ｂｒ１ｌｌｉａｎｔ　Ｂｌｕｅ）色素の染色により
、バンドは容易に検知された。スキャンニング・ゲル密
度測定器を使用して細胞タンパク質の百分率を定量化し
た。プラスミドｐＲＢ１６４Ａの制限部位および機能地
図を添付の第１７図に示す。 ３、プラスミドｐＲＢ１７２の構築 プラスミドｐＲＢ１４５（約２５μｇ）を、１ＯＸＤｒ
ａｌｌｌ緩衝液［２００ｆｆ１Ｍ　ＮａＣＱ、　５０＋
ｎＭ　トリス−ＨＣ（２ｐＨ７，５，１０ａ＋Ｍ　Ｍｇ
Ｃｄ、、１１ＩＩＭ　　ＤＴＴ、　　１　０μｇ／ｚ＆
　　ＢＳＡコ１５μＲ，Ｄｒａ■制限酵素［ベーリンガ
ー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅ
ｉｍ）、２７単位３６μ（Ｉ，および水１２９μｇに懸
濁し、穏やかに混合して３７°Ｃで６時間インキュベー
トした。インキュベート後、ＤＮＡを沈殿させて乾燥し
、１０ＸＸｂａＬ緩衝液［１５０ｍＭ　ＮａＣｌ２，６
ｍＭ　　トリス−ＨＣＱｐＨ７，９，６ａ＋Ｍ　ＭｇＣ
Ｑｘ、７ｍＭ２−メルカプトエタノール、１００μｇ／
ｘＱＢｓＡコ１０μｍ２．Ｘｂａｌ制限酵素［ベーリン
ガー・マンハイム、３６ｆｉ位］３μＱ１および水７７
μρ中に再懸濁した。得られた反応物を穏やかに混合し
、３７℃で４時間インキュベートした。３容量のエタノ
ールおよび酢ｌナトリウムを使用してＤＮＡを再び沈殿
させ、１％低融解アガロースゲルの電気泳動にかけた。 ヒトプロインスリン遺伝子のＸｂａｌ／ＤｒａＩＩ［制
限フラグメント（約８５ｂｐ）に相当する下方のバンド
をそのゲルから切除し、Ｅｌｕｔｉｐ−ｄカラム操作に
よってＤＮＡを回収した。沈殿させて乾燥した後、得ら
れたＤＮＡを１０ｍＭ　　トリス−ＨＣ（２（ｐＨ８゜
０）３０μａ中に保存した。 既述のようにしてプラスミドルＲ８１６４Ａ約１５μｇ
を制限酵素ＤｒａＩＩｒおよびＸｂａｌで切断した。Ｅ
ｌｕｔｉｐ−ｄカラム操作法によってアガロースゲルか
らＸｂａｌ／ＤｒａＩＩ［ベクターフラグメントに相当
する上方のバンドを単離した。沈殿させて乾燥した後、
得られたＤＮＡを１０ＩＩＭ　　トリス−■（Ｃ１２（
ｐ　Ｈ８，０）３０μＱ中に保存した。 Ｘｂａｌ／Ｄｒａｌｌｌ消化ｐＲＢ１６４ＡベクターＤ
ＮＡ約５μぐを、５ＱｍＭ　　トリス−ＨＣｌ２　ｐＨ
７゜６．１０ｍＭ　ＭｇＣ（ｈ、ｌ０ｍＭ　ＤＴＴ、８
００μＭ　ＡＴＰ、およびＴ、ＤＮＡリガーゼ６単位を
含有する緩衝液５０μａ中、プラスミドｐＢＲ１４５か
ら得たＸｂａＩ／ＤｒａＩＩ［制限フラグメント５μｇ
と混合した。この反応物を４℃で一晩インキコヘートし
、標準的なＣａＣ（Ｉｔ処装によってコンビ−テントに
した大腸菌に１２／ＲＶ３０８に導入した。 ５μｇ／ｘ（ｌテトラサイタリンを含有するＴＹ寒天平
板上で形質転換体を選択した。急速アルカリ抽出法によ
ってテトラサイクリンＭ性コロニーからプラスミドを単
離し、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアー
ゼによって分析した。シークエンスジステム（米国バイ
オケミカルズ）を使用し、陽性コロニーから得たＤＮＡ
の配列決定を行つた。正しい所望の配列を有するプラス
ミドを選択し、増幅して精製した。このようにして、大
腸菌に１２／ＲＶ３０８／ｐＲＢ１７２形質転換体を単
離した。ヒトプロインスリンの発現および蓄積を担うこ
のプラスミドを、１５％ポリアクリルアミドマトリック
スの電気泳動分離にかけた後、総細胞内タンパク質を視
覚化することによって分析した。プラスミドｐＲＢ１７
２の制限部位および機能地図を添付の第１８図に示す。 Ｃ９大腸菌ＲＶ３０８／ｐＲＢ　１７３およびｐＲＢ１
７４の構築 プラスミドｐＲＢ１７２またはｐＲ８１４５（約２０μ
ｇ）を１０ＸＸｂａＩ緩衝液［１５０ｍＭＮａＣｌ２．
６＋Ｍ　　ｔ−リス−ＨＣ（ｌ　ｐＨ７，９，６ｍＭＭ
ｇｃＩ２ｔ、７ｍＭ　２−メルカプトエタノール、１０
０μｇ　／ｘＱ　Ｂ　Ｓ　Ａｌ１０１１Ｑ中に懸濁し、
Ｘｂａｌ制限酵素２μ（２（ヘーリンガー・マンノ＼イ
ム、２４単位）を加え、穏やかに混合し、３７°Ｃで４
時間インキュベートシタ。インキュベート後、ＤＮＡを
沈殿させ、乾燥し、１０Ｘ１０ＸＢａ緩衝液［１００ｍ
ＭＮａＣｌ２．１０ｍＭ１−リス−ＨＣ（ｐＨ８゜０．
５ｍＭ　ＭｇＣ１２ｔ、１ｍＭ２−メルカプトエタノー
ル、ｒｏｏａｇ／ｘｌ　ＢＳＡＳエコμρ、Ｂａｍｈ（
Ｉ制限酵素ベーリンガー・マンハイム５μＱ（４０単位
）、および水７５μρ中に懸濁した。この反応物を穏や
かに混合し、３７°Ｃで４時間インキュベートした。再
び、ＤＮＡをエタノールおよび酢酸ナトリウムで沈殿さ
せ、１％低融解アガロースゲルの電気泳動にかけた。ヒ
トプロインスリン遺伝子に相当するＸｂａ　Ｉ　／　Ｂ
　ａｍＨＩ制限フラグメント（約３２０　ｂｐ）を、Ｅ
　Ｉｕｔｉｐ−ｄカラム操作法によってゲルから単離し
た。沈殿させて乾燥した後、ＩＱｘＸｍａｌ緩衝液［２
５ａ＋Ｍ　Ｎａ（Ｊ！、１０ｍＭ　　トリス−ＨＣｅ　
ｐＨ７，５，１０ｍＭ　ＭｇＣＱｔ、１０ｍＭ　２−メ
ルカプトエタノール、１００μｇ／ｘ１２　ＢＳＡ］２
０μＣ，Ｘｍａｌ制限酵素１０μ１２にニューイングラ
ンド・バイオラプス、１０単位）、および水１７０μＱ
中に再懸濁した。この反応物を穏やかに混合し、３７°
Ｃで４時間インキュベートした。インキュベート後、Ｄ
ＮＡをエタノールおよび酢酸ナト、リウムで沈殿させ、
１％低融解アガロースゲルの電気泳動にかけた。Ｘｂａ
ｌ／Ｘｍａｌ制限フラグメント約２００ｂｐに相当する
比較的大きなりＮＡをゲルから切除し、既述のようにし
てＥｌｕｔｉｐ−ｄカラムからＤＮＡを回収した。得ら
れたＤＮＡを１０ｍＭ）リス−ＨＣｆｆ（ｐ　Ｈ８，０
）３０μρ中で保存した。 ヒトプロインスリン遺伝子のＸｍａｌ　／　ＢａｍＨＩ
制限フラグメントに相当するＤＮＡ（５１ｂｐ）を以下
のようにして合成的に調製した。アプライド・バイオシ
ステムダＤＮＡ合成機３８０Ｂ型によって、２つの１本
鎖デオキシリボオリゴヌクレオチド： ＴＡＧ （５１ｍｅｒ）、および ＧＡＴＣＣＴＡ　ＣＴＧＣＡ　ＧＧＧＡ　Ａ　ＣＣＣＴ
ＣＣＡＧＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＴＧＣＡ　ＧＧＣＴＧ　
ＣＣＴＧＣＡＣ（５１ｍｅｒ） を合成し、７Ｍ尿素の存在下にポリアクリルアミドゲル
電気泳動法によって精製した。単離した後、ブラウンら
［Ｂｒｏｗｎ、　Ｅ、　Ｌ、、Ｂｅｌａｇａｊｅ、　Ｒ
，、Ｒｙａｎ。 Ｍ、Ｊ、、およびＫｈｏｒａｎａ、　Ｈ，Ｇ、　］のＭ
ｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍ。 １μｇｙ、　Ｗｕ、　Ｒ，編、アカデミツク・プレス、
ニューヨーク、　６８．１０９−１５１（Ｉ９７９）の
教示にしたがって、この２つのオリゴヌクレオチドをリ
ン酸化してアニーリングし、所望のリンカ−を作成した
。 プラスミドｐＣＺＲ１２６Ｓ［実施例２９Ａ１２から得
た］約１０μｇを、１０ＸＸｂａＩ緩衝液［１５０ｍＭ
ＮａＣＱ、６μＭｈリスーＨＣ（ｌ　ｐＨ７゜９．６　
ｍＭ　ＭｇＣＱｔ、７１１１Ｍ２−メルカプトエタノー
ル、１００　Ｉｔ　ｇ／ｘＱ　Ｂ　Ｓ　Ａｌ１０　ｔｔ
（ｌ、　Ｘｂａ■制限酵素［ベーリンガー・マンハイム
、２４単位］２μρ、および水１７８μｅに懸濁した。 この反応物を穏やかに混合し、３７°Ｃで２時間インキ
ュベートした。インキュベートした後、５Ｍ　ＮａＣ（
！４μｇ１およびＢａｍＨＩ制限酵素［ニューイングラ
ンド・バイオラプス、２０単位コ２μＱを加え、３７°
Ｃでさらに２時間インキュベートした。次いで、エタノ
ールおよび酢酸ナトリウムを用いた標準的な方法によっ
てＤＮＡを沈殿させ、１％低融解アガロースゲルの電気
泳動にかけた。Ｘｂａｌ／ＢａｍＨＩベクターＤＮＡに
相当する上方のバンドをＥｌｕｔｉｐ−ｄカラムによっ
て単離した。沈殿させて乾燥した後、得られたＤＮＡを
１０ｍＭｈリスー　ＨＣり（ｐ　Ｈ８，０）３０μρ中
に保存した。 ＸｂａＩ／ＢａｍＨＩ消化したｐｃＺＲ１２６ｓベクタ
ーＤＮＡ約５μσを、５０μＭ　トリスｐ　Ｈ７，６，
１０ｍＭ　ＭｇＣＱｔ、１０ｍＭＤＴＴ、８００μＭＡ
ＴＰ、およびＴ、ＤＮＡリガーゼ６単位を含有する緩衝
液５０μσ中、前記のように調製したキナーゼ処理化Ｘ
ｍａ　Ｉ　／　Ｂ　ａｍＨＩリンカ−４μＱおよびプラ
スミドｐＲＢ１４５またはｐＲＢ１７２から得たＸｂａ
Ｉ／Ｘｍａｒ制限フラグメント１０μｅと混合した。こ
の反応物を４℃で一晩インキユベートし、これを用い、
実施例２９Ａ３の操作法にしたがって大腸菌に１２／Ｒ
Ｖ３０８株を形質転換した。所望の形質転換体である大
腸ＦａＫ１２　　ＲＶ３０８／ｐＲＢ　ｌ　７３（ｐＲ
Ｂ　１７２ベクターフラグメントから調製した場合）、
および大腸菌Ｋ　１２　ＲＶ３０８／ｐＲＢ　１７４（
ｐＲＢ　１４５ベクターフラグメントから調製した場合
）を、それらのプラスミドＤＮＡの分析、および４２℃
のインキュベートの前後におけるタンパク質産生によっ
て分析した。プラスミドｐＲＢ１７３の制限部位および
機能地図を添付の第１９図に示す。 ｍ１ｎｉ−１）ｒ６ｐから入手したプラスミドＤＮＡ約
２００ｎｇを大腸菌Ｌ２０１細胞に導入し、得られた形
質転換体を、１５μｇ／１ｌ（ｌテトラサイクリンを含
有する２ＸＴＹ寒天平板上で選択した。この形質転換体
から発現されたタンパク質を分析し、ヒトプロインスリ
ンの産生によって所望の形質転換体を確認した。これに
より、大腸菌Ｌ２０１／ｐＲＢ１７３および大腸菌Ｌ２
０１／ｐＲＢ１７４が単離された。 の構築 プラスミドｐＲＢ１７２（約１２μｇ）を、１０ＸＮｄ
ｅｌ緩衝液［１００ｍＭ　ＮａＣ（，５０ＩＩＩＭトリ
スーＨＣｌ２ｐＨ７，５、ｌ　ＯｍＭ　ＭｇＣ（！−１
１＋ｎＭ　　ＤＴＴ、　　１００μｇ／ｘ＆　　ＢＳＡ
コ１５ａ（２，Ｎｄｅｌ制限酵素（２０単位）２．５　
ｕ（Ｉ、および水１３３μｇに懸濁した。この反応物を
穏やかに混合して３７℃で一晩インキユベートした。イ
ンキュベート後、標準的な操作によってエタ／−ルおよ
び酢酸ナトリウムでＤＮＡを沈殿させ、乾燥し、１Ｑｘ
Ｄｒａ［ＩＩ緩衝液［２００ｍＭ　ＮａＣ（Ｉ，５０ｍ
Ｍ）　リフ、−Ｈ（Ｊ！　ｐＨ７，５，１０ｍＭ　Ｍｇ
Ｃ（７−１１ｍＭ　ＤＴＴ］１５１１Ｑ、Ｄｒａｍ制限
酵素［２０単位コ５μＱ５および水１３０μＱに再懸濁
した。穏やかに混合した後、得られた反応物を３７℃で
一晩インキユベートした。前記のようにしてエタノール
および酢酸ナトリウムでＤＮＡを再度沈殿させ、１％低
融解アガロースゲルの電気泳動にかけた。 所望の比較的大きな制限フラグメントをゲルがら切除し
、Ｅｌｕｔｉｐ−ｄカラム操作によってＤＮＡを回収し
た。得られたＤＮＡを１Ｏｎ＋Ｍ　　トリス−ＨＣＣ（
ｐ　Ｈ８，０）３０　ｔｔＱ中で保存した。 アプライド・バイオ／ステムズＤ　Ｎ　Ａ合１ｔ（３８
０Ｂ型）によって、以下のＤＮＡリンカ−を化学的に合
成した： （ｉ）　　５’ ＲＢ１７５ （ｉｉ）　　５’ ３′ Ｒ１１７６ （ｉｉｉ）　　５’ ３′ ＲＢ１７７ ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって各オリゴヌ
クレオチドを精製した後、ヒトプロインスリン類似体遺
伝子をフードしているＤＮＡフラグメントを連結して構
築するために、既述の教示にしたがってそれらをリン酸
化し、アニーリングした。上記リンカ−（ｉ）から（ｉ
ｖ）を使用し、それぞれプラスミドｐＲＢ１７５、ｐＲ
Ｂ１７６、ｐＲＢ１７７、およびｐＲＢ１７８を構築し
た。 Ｎｄｅｒ／ＤｒａＵ肖化したｐＲＢ１７２ベクターＤＮ
Ａフラグメント約３ａ（ｌを、５０μＭ　トリス−ＨＣ
ｌ２１）Ｈ７，６，１０ｍＭ　ＭｇＣ１２ｆ、ｌ　Ｏｍ
Ｍ　Ｄ　Ｔ　Ｔ　、　８００　Ｉｔ　Ｍ　Ａ　Ｔ　Ｐ　
、　オヨヒＴ　、　Ｄ　ＮＡツリガーゼ単位を含有する
緩衝液５０μｇ中、キナーゼ処理した別々のリンカ−（
ｉ　−１ｖ）それぞれ４μρと混合した。この反応物を
４°Ｃで一晩インキユベートし、実施例２９Ａ３の操作
法に従い、得られた混合物を使用して大腸菌に４２ＲＶ
３０８細胞を形質転換した。所望の形質転換体である大
腸ｍＫ１２　　ＲＶ３０８／ｐＲＢ１７５、大腸菌Ｋ１
２　　ＲＶ３０８／ｐＲＢ１７６、大腸菌に１２　　Ｒ
Ｖ３０８／ｐＲＢ１７７、および大腸菌に１２　　ＲＶ
３０８／ＰＲＢ１７８を、それらのプラスミドＤＮＡの
分析、および４２℃においてそれらの細胞をインキュベ
ートした前後におけるタンパク質産生によって分析した
。プラスミドｐＲＢＩ７５の制限部位および機能地図を
添付の第２０図に示す。 （以下余白） 第１表 Ｍａｔ−Ｔｙｒ−ヒトプロインスリンＣＨ５す）　　　
　　ｐＲＢ１４５Ｍａｔ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−［Ｌｙｓ（
Ｉ２ｇ）、Ｐｒｏ（Ｂ２９）ＨＭＩ　　ｐＲＢ１６４Ａ
Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−（Ｌｙｓ（３２８）　、Ｐｒｏ（Ｂ２
９））（ＰＩ）　　　　　ｐＲＢ１７２Ｍｅｔ−Ｔｙｒ
［Ｌｙｓ（Ｂ２８）、Ｐｒｏ（Ｂ２９）Ｂ−鎖１−炉ｐ
ＲＢ１７３Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−［１−鎖　］−Ｑ”　　　
　　　　　　　　ｐＲＢ１７４Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−（デス
（Ｂｌ）、デス（Ｂ２）、Ａｓｐ（Ｂ３）、　　　　ｐ
ＲＢ１７５Ｌｙｓ（Ｂ２８）　、Ｐｒｏ（Ｉ２９））［
ＰＩｌＮｅｔ４ｙｒ−（Ａｓｐ（Ｂ１）　、Ｌｙｅ（８
２Ｂ）　、　　　　　　　ｐＲＢ１７６Ｐｒｏ（Ｂ２９
））ｉＰＩ］ Ｍｅｔ−丁ｙｒ−［デス（！Ｈ）、デス（Ｂ２）、Ｌｙ
ｓ（Ｉ２ｇ）、　　　ｐＲＢ１７７Ｐｒｏ（Ｂ２９）Ｈ
ＰＩＩ Ｍｅｔ４ｙｒ−［デス（Ｂｌ）、Ｌｙｍ（Ｂ２８）、　
　　　　　　　　ｐＲ８１７ｇＰｒｏ（Ｂ２９））［Ｐ
Ｉｌ １１．３ １０．５ ７．３ ね 冊 ８．５ ９．３ ９．４ ８．５ −への変換 単離したコロニーを、以下の表現型平板にスポットする
：表現型平板−Ｌ−寒天＋５μｇ／ｚ（ＩＴｃ（テト、
ラサイクソン）、Ｌ−寒天＋　Ｓ　ｍ（＆！酸ストレプ
トマイシン）、Ｍ−９培地寒天（ＭｇＳＯ４、チアミン
、ＨＹＣＡＳＥおよびグルコースを含有する塩基率培地
（ｓａｌｔ　ｂａｓｅｄ　ａ＋ｅｄｉｕｍ））、および
グルコースを含有せずにラクトースを含有スるＭ−９培
地寒天。１つのし一寒天／　Ｔ　ｃ平板を４２°Ｃでイ
ンキュベートし、得られた平板を３０℃で２４時間イン
キュベートする。３０℃Ｌ−寒天／Ｔｃ平板から選択し
た表現型の正しいコロニーを使用し、５μｇ／１１ＱＴ
ｃ培地を加えたし一ブロス（トリプトン、酵母エキス、
ＮａＣＱおよびグルコースを含有）５０Ｒ（ｌのフラス
コに接種する。このフラスコを振盪下に３０’Ｃで７時
間インキュベートする。フラスコ中の物質（Ｉ，２ｚｃ
）を生物冷凍バイアルに分散させ、気相液体窒素中で冷
凍させる。次いで、その物質を解凍し、その１村を使用
して、５μｇ／ｘＱＴｃを含有するし一ブロス５０３１
１２を入れたフラスコ中に接種する。そのフラスコを振
盪下に３０°Ｃで４時間インキュベートする。そのｔ、
ＶＣを、ＢＧ−７培地（ＭｇＳＯ，、チアミン、グルコ
ース、Ｔｃおよび微１塩を含有する＞５００ｘ（ｌを入
れた２つのフラスコそれぞれに接種し、振盪下に３０℃
で９時間インキュベートする。 クエン酸、硫酸鉄アンモニウム、Ｋ、ＨＰＯ４、ＮＨ４
Ｃｌ２ＳＮａＨｔＰＯ，、ＣａＣ（Ｉ１、Ｍ　ｇ　Ｓ　
Ｏ４、グルコース、および微１無機塩を含有する培地８
０リツトルを入れた１５０リットル容潰発酵槽に、上記
で得たＢＧ−７培地ブロス１リツトルを接種する。この
発酵槽は、二酸化炭素の放出速度が１゜ＯｍＭ／Ｌ／分
になるまで３０℃で操作する。この時点で、ブロス５０
リツトルを生産発酵槽に移し、細胞接種物を得る。 １５０リットル容量発酵槽で使用したものと同一の培地
１５００リツトルを含有する２５００リットル容量発酵
槽を、二酸化炭素の放出速度がｌ。 ＯｍＭ／Ｌ／分になるまで３０℃で操作し、次いで温度
を４０℃に上昇させる。この操作をさらに８時間行う。 次いで、得られたブロスを６１°Ｃで７時間熱不活化す
る。この熱不活化ブロスから以下の収量データを得た：
細胞板ｔｌ−１３．１ｇ／Ｌ乾燥重量、産物効カーデス
ーホルミレート２７３μｇ／ブロス肩Ｑ、比活性くたと
えば、産物ｇ／細胞ｇ）　　　　２．１％、ホルミル化
産物％１３％。 発酵ブロスをステンレス鋼製保持タンクに移し、温度を
２°Ｃから８°Ｃに維持する。次いで、全ブロスを遠心
または濾過し、大腸菌細胞を採取して固体乾燥重量を約
１５から２０％にする。この採取した細胞固形物を加工
水中で再度スラリー化する。 次いで、高圧ホモジナイズまたは他の適当な方法によっ
て細胞を粉砕し、細胞の溶菌率を９０から９９％にする
。ホモジナイズしたスラリーを加工水で５％乾燥重量に
まで希釈する。この希釈粉砕細胞スラリーのｐＨを水酸
化ナトリウムを添加して７から１０に調節する。分画遠
心によって封入体（顆粒）を細胞残骸から分離する。得
られる濃縮物は１５から２０％の固形物である。 その封入体をシスティンおよび尿素の存在下、アルカリ
性ｐＨで可溶化する。顆粒物質の固まりから混合ジスル
フォド形態のプロインスリン類似体を分割するため、可
溶化顆粒をＳＰ　セファロ−スースーパーフローの陽イ
オン変換クロマトグラフィーにかける。 プロインスリン類似体のアミノ末端のメチオニル−チロ
シン伸長は、ジペプチジルアミノペプチダーゼであるカ
セグレンＣ（ｃａｔｈｅｐｓｉｎ　Ｃ）、と共にインキ
ュベートすることによって除去される。 このカセブシン開裂反応は、カリウム・テトラチオネー
トおよびシスティンｐＨ８，８によるスルフィトリシス
によって終止する。セファデックスＧ−２５による溶媒
変換を行った後、得られたプロインスリン類似体のＳ−
スルホネートをシスティンの存在下にｐＨ１０，６でイ
ンキユベートして折り畳む。この折り畳み反応をｐＨ２
，４に調節してクエンチする。適切に折り畳まれたプロ
インスリン類似体を、適切に折り畳まれていない物質、
および５Ｐ２０ＳＳ樹脂の疎水性相互作用クロマトグラ
フィーによるカセプシンＣ開裂工程により残っている混
入物から分割する。アセトンのグラジェントに沿って分
離されるので、以後の処理を行う前に留去してその有機
溶媒を主流プールから除去しなければならない。 有機溶媒を留去した後、適切に折り畳まれたプロインス
リン類似体をトリプシンおよびカルボキシペプチダーゼ
Ｂと共にインキ−ベートする。これらの酵素はプロイン
スリン類似体のＣペプチドを切除し、Ｌｙｓ（Ｂ２８）
、Ｐｒｏ（Ｂ２９）ヒトインスリンを生成させる。この
インスリン類似体をＳセファロースの陽イオン変換クロ
マトグラフィーにかけた後、１０μｚ　Ｃ−８樹脂の高
速逆相クロマトグラフィーにかけることによってさらに
精製する。セファデックスＧ−２５に溶媒変換を施すこ
とによってアセトニトリルをこの逆相の主流から除去し
、得られた物質をらせん巻限外濾過システムによって濃
縮する。濃縮した物質をセファデックスＧ−５０樹脂の
サイズ排除クロマトグラフィーにかけ、凍結乾燥する。 以下の第２表に、既述した実施例にかかる化合物のアミ
ノ酸分析の結果を示す。 本発明のインスリン類似体の生理学的効果を以下のイン
ビボ検定システムによって試験した。 カールス・リバー・ラボラトリーズ（Ｃｈａｒｌｅｓ　
Ｒｉｖｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ボーテイジ、
Ｍｌ）から人手した正常のスプラーク・ダウリー（Ｓｐ
ｒａｇｕｅ　Ｄａｖｌｅｙ）雄性ラットを試験動物とし
て使用した。体重は１６０−１８０ｇであり、制御した
照明サイクル［午前７時−午後７時は照射（照明オン）
、午後７時−午前７時は暗闇（照明オフ）］の条件下、
７５°Ｆの動物室で１週間維持した。動物には、食事と
してブリナ・ラット・チｓ　−（Ｐｕｒｉｎａ　ｒａｔ
　ａｈｏｙ）５００１を自由に摂らせた。各検定で使用
した動物は、使用前１６時間絶食させた。最初に使用す
る時、体重は約２００ｇであった。絶食させたときの体
重が約２７５ｇ（３週間）の場合には、その動物を使用
しなかった。１０匹の雄性ラットの１群を使用し、毎日
、各試験化合物［すなわち、生合成ヒトインスリン、ブ
タインスリン、およびヒトインスリン類似体］を与えた
。各群は、１週間に１回だけ使用した。この１０匹をそ
れぞれ５匹づつの群に分けた。１つの群は対照としてビ
ヒクルのみを皮下投与した。他方の５匹の群には試験す
べき化合物を投与した。これらのタンパク質を００５Ｎ
塩酸（ｐｉ−１１，６）に溶解し、ｌ屑Ｑ当たり１００
μｇの保存溶液を調製した。この保存溶液から、普通の
生理食塩水中、多くの希釈液を：Ａ要し、ラットに皮下
注射する。投与後０時、３０分、１時間、３時間、およ
び４時間の時点に、各ラットの尾静脈から血液試料１０
０μＱを採血した。グルコースオキシダーゼ法［シグマ
・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌ　Ｃｏ、）］によってグルコースを比色分析で測定し
た。血中グルコースの０時値に対する変化％を各ラット
について計算し、最終結果をその試験日における対照群
の平均変化について補正した各実験群の平均変化％±Ｓ
ＥＭとして表した。 特定の時間（通常、タンパク質投与後ｌまたは２時間）
における最大応答を使用し、試験した化合物の４から７
つの異なる濃度で試験した結果から用量作用曲線を描い
た。この曲線から、最大の低血糖性応答の半分を与える
タンパク質の皮下投与量（μｇ／ｋｇ）をＥＤ、。値と
して求めた。１邪られた結果を次の第３表に示す。 化合物 第　３　表″１ 最大効果（％）　　ＥＤ、、” 生物活性０ ｄ） ヒトインスリン　（ＩＩ　） ブタインスリン Ｌｙｓ（８２Ｂ）、Ｐｒｏ（Ｂ２９）Ｈ１八１ａ（８２
８）、Ｐｒｏ（Ｂ２９）ＨＩＡｓｐ（８２８）、Ｐｒｏ
（Ｂ２９）ＨＩＡｓｐ（Ｂ１０）、Ｌｙｓ（Ｂ２Ｂ）。 Ｐｒｏ（Ｂ２９　）ＨＩ Ｇｉｎ（Ｂ２８）、Ｐｒｏ（Ｂ２９）ＨＩＣｌｙ（Ｂ２
８）、Ｐｒｏ（Ｂ２９）ＨＩＭｅｔ（８２Ｂ）、Ｐｒｏ
（Ｂ２９）ＨＩＮｌｅ（Ｂ２８）、Ｐｒｏ（Ｂ２９）Ｈ
ＩＯｒｎ（８２８）、Ｐｒｏ（Ｂ２９）ＨＩＰｒｏ（Ｂ
２９）ＨＩ Ｐｈｅ（Ｂ２Ｂ）、Ｐｒｏ（Ｂ２９）ＨＩＶａｌ（Ｂ２
８）、Ｐｒｏ（Ｂ２９）Ｂ１７．９５ ７．７０ ６、Ｂ １５．０ １０．２ ５３　　　　　１０．７ ６９　　　　　　６．６ ５Ｂ　　　　　　１０．５ ５１　　　　　　１４．６ ５４　　　　　　７．０ ６０　　　　　１２．７ ６３　　　　　　８．７ ５７　　　　　　９．７ ５３　　　　　　８．７ ａ）全ての値は、示した化合物の投与ｔ＆　１時間に採
取した血液試料についての値である。 ｂ）単位μｇ／ｋｙ、皮下投与 Ｃ）対ヒトインスリン ｄ）生合成ヒトインスリン 既述したように、本発明のインスリン類似体は、二量体
化する、またはそうでな（でも自己会合して高分子量体
になる傾向が減少されている。したがって、１つまたは
それ以上の本発明類似体を投与すると、活性が急速に現
れる。本発明のインスリン類似体は、それを必要として
いる患者に式（■）で示されるインスリン類似体の有効
量を投与することによって高血糖症を処置する上で有効
である。本明細書中で使用している「有効量」なる用語
は、糖の血中レベルを治療的または予防的に低下または
維持させるのに必要とされる、１つまたはそれ以上の本
発明のインスリン類似体の量を意味する。この量は通常
、１日当たり約１０単位から約６０単位であればよい［
またはｌｚｇ当たり約２９単位と推定して約０．３から
約２ｍｇである］。 しかし、実際投与するインスリン類似体（群）の量は、
処置する状態（すなわち、高血糖症の原因）、投与する
具体的な類似体、選択する腸管外の投与経路、個々の患
者の年令、体重および応答性、ならびに患者の症状の重
篤度など、関連する状況に照らして臨床医によって決定
されるものであることは理解すべきである。したがって
、上記投与量の範囲は、あらゆる意味においても本発明
の限定を意図するものでない。 本発明のインスリン類似体はそれを必要としている患者
（すなわち、高血糖症に罹患している患者）に投与する
に当たり、少なくとも１つの式（Ｉ）で示されるインス
リン類似体の有効量を１つまたはそれ以上の製薬的に許
容され得る賦形剤、または担体と共に含有している医薬
組成物として投与する。この目的には、通常、有効量の
インスリン類似体く群）を１１１Ｑ当たり約１００単位
、またはそれよりも小さい濃度となるように含有する医
薬組成物を製剤化すればよい。これらの組成物は、必須
ではないが腸管外投与するのが通常であり、当業界周知
の腸管外製品のための通常の賦形剤または担体を使用す
る各種の方法のいずれの方法によっても製造することが
できる。たとえば、Ｒｅｍ　ｉｎｇｔｏｎ’　ｓ　Ｐｈ
ａｒａ＋ａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、　１
７版、マツクーパブリッシイング・カンパニー、米国、
　ＰＡ、イーストン（Ｉ９８５）を参照のこと。たとえ
ば、腸管外投与のための投与剤形は、少なくとも１つの
式（Ｉ）で示されるインスリン類似体の所望の量を注射
に適した水性媒質などの無毒性の液状ビヒクルに懸濁ま
たは溶解し、そして得られた懸濁液または溶解液を滅菌
することによって調製することができる。 あるいは、測定した化合物の量をバイアルに入れ、その
バイアルおよび内容物を滅菌して封栓してもよい。ここ
に付随するバイアルまたはビヒクルは、投与前の混合を
目的として得ることができる。腸管外投与に適した医薬
組成物には、水および水混和性有機溶媒、たとえばグリ
セリン、ゴマ油、グランドナツツ油、水性プロピレング
リコール、Ｎ。 Ｎｏ−ジメチルホルムアミドなどの希釈剤、賦形剤、担
体を使用する。医薬組成物の例としては、製薬的に許容
され得る緩衝液で緩衝化することのできる、パイロジエ
ン不含の式（Ｉ）で示されるインスリン類似体の滅菌し
た等張性生理食塩水が挙げられる。さらに、この腸管外
医薬製剤には、メタ−クレゾールなどの保存剤、または
水酸化ナトリウムまたは塩酸などの最終製品のｐＨを調
節するためのその他の活性剤を含有させることもできる
。 本発明のインスリン類似体は、鼻腔内投与に適した剤形
に製剤化することもできる。このような組成物は、欧州
特許出願０２００３８３　Ａ３に詳細に開示されている
。簡単に言えば、このような組成物は、１つまたはそれ
以上の製薬的に許容され得る希釈剤、製薬的に許容され
得る量のアルカリ金属塩、アンモニウム塩または実質的
に亜鉛を含まないインスリンの遊離酸、ならびに要すれ
ば、吸収促進量の（Ｉ）オレイン酸またはそのエステル
もしくは塩、（２）液状ソルビタン脂肪酸エステル、（
３）ソルビタン脂肪酸エステルの液状ポリオキシエチレ
ン誘導体および（４）液状ヒドロキシポリオキシエチレ
ン−ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレン共重合
体の中から選択される少なくとも１つの吸収促進剤から
製剤化される。 Ｌｙｓ（８２８）、Ｐｒｏ（Ｂ２９）ヒトインスリンの
インスリン類似体と、ヒトナトリウムインスＩＪ　７と
の鼻腔的投与における効能を証明するため、以下に記載
の試験を行った。雄性ピーグル犬（体重１０−１０−ｌ
２について身体的状態を試験前と試験中に良好な状態に
維持させた。１６時間絶食させたが、インスリンレベル
の予期できない変動に備えるため水は飲めるようにした
。試験の全期間にわたり、犬をベントパルビタールナト
リウムで麻酔し、グルコース変動を最小にするため足跳
を暖めて体温を維持させた。被検インスリン試料［すな
わち、Ｌｙｓ（８２８）、Ｐｒｏ（Ｂ２９）のヒトイン
スリン、およびヒトナトリウムインスリン］を蒸留水に
溶解し、その溶液のｐＨを水酸化ナトリウムで７．５に
調節した。最終的インスリン濃度は、７０単位／Ｉｇで
あった。１ｋｇ当たりＬｙｓ（８２８）、Ｐｒｏ（Ｂ２
９）ヒトインスリン０、Ｂ単位の投与量で８匹のピーグ
ル大にインスリンを投与し、同様にして１ｋｇ当たりヒ
トナトリウムインスリン０゜８単位を４匹のピーグル大
に投与した。すべての投与は、計量投与量ネプライザ（
噴霧器）および改変鼻腔アプリケイタにより鼻孔に１ス
プレー供給して行った。投与前３０分、１５分、および
Ｏ分時、ならびに投与後１０．２０．３０．４５．６０
．９０．１２０，１８０および２４０分時に、頚静脈か
ら採血し、血中のグルコース減少を測定した。得られた
結果を以下の第４表に示す。 ａ）血中グルコース濃度：平均±Ｓ、Ｅ、Ｍ。 上記のプロトコールを使用し、Ｌｙｇ（８２８）、Ｐｒ
ｏ（Ｂ２９）ヒトインスリンの鼻腔的投与による血中グ
ルコース減少のテロフィルを、次のようにその類似体を
静脈内投与および皮下投与した場合と比較した。静脈内
投与では、Ｌｙｓ（８２８）、Ｐｒｏ（Ｂ２９）ヒトイ
ンスリン類似体を含有するインスワン溶液をポーラス注
射（Ｉｋｇ当たり０．１単位）により４匹の各ピーグル
大の伏在静脈に投与した。 投与前３０分、１５分、およびＯ分時、ならびに投与後
５．１０．１５．２０．３０．４５．６０．９０．１２
０．１８０および２４０分時に、血液試料を採取した。 皮下投与では、Ｌｙｓ（８２８）、Ｐｒｏ（Ｂ２９）ヒ
トインスリン類似体を含有するインスリン溶液を６匹の
ピーグル大の各脇腹の外側表皮の下方に投与した（Ｉｋ
ｇ当たり０．２単位）。 既述の鼻腔内投与後に記載しているプロトコールと同上
プロトコールによって血液試料を採取した。 この比較試験の結果を以下の第５表に示す。 （以下余白） 第　５　表１ ａ）血中グルコース濃度：平均±Ｓ、Ｅ、Ｍ。

【図面の簡単な説明】

第１図は、プラスミドｐＫＣ２８３の制限部位および機
能地図、第２図は、プラスミドｐＫＣ２８３ＰＸの制限
部位および機能地図、第３図は、プラスミドｐＫＣ２８
３−Ｌの制限部位および機能地図、第４図は、プラスミ
ドｐＫＣ２８３−ＬＢの制限部位および機能地図、第５
図は、プラスミドｐＫＣ２８３−ＰＲ３の制限部位およ
び機能地図、第６図は、プラスミドｐＬ３２．の制限部
位および機能地図、第７図は、プラスミドｐＮＭ７８９
の制限部位および機能地図、第８図は、プラスミド１２
０の構築の概略を示す模式図、第９図は、プラスミドｐ
Ｌ４７の制限部位および機能地図、第１Ｏ図は、プラス
ミドｐＰＲ１２の制限部位および機能地図、第１１図は
、プラスミドｐｐＲｌ　２ＡＲ１の制限部位および機能
地図、第１２図は、プラスミドｐＬ１１０の制限部位お
よび機能地図、第１３図は、プラスミドｐＬ１１０ｃの
構築の概略を示す模式図、第１４図は、プラスミドｐｃ
ＺＲ１２６ｓの制限部位および機能地図、第１５図は、
ヒトプロインスリン遺伝子のヌクレオチド配列の模式図
、第１６図は、プラスミドｐＲＢ１４５の制限部位およ
び機能地図、第１７図は、プラスミドｐＲＢ１６４Ａの
制限部位および機能地図、第１８図は、プラスミドｐＲ
８１７２の制限部位および機能地図、第１９図は、プラ
スミドｐＲ８１７３の制限部位および機能地図、そして
第２０図は、プラスミドｐＲＢ１７５の制限部位および
機能地図である。 ＦＩＧ、２ ＦＩＧ、１ ａｃ　Ｉ ＦＩＧ、３ ＦＩＧ、４ ＥｃｏＲＩ ＦＩＧ、６ ｄｅＩ ＦＩＧ、５ ＦＩＧ、７ ＨｉｎｄＩＩＩ ａｌ　Ｉ ＦＩＧ、８ ７Ｄう人Ｓド。 ＦＩＧ、１０ ρＰＲ１２ （〜５．１　ｋｂ） Ｎｄｅ　Ｉ ＦＩＧ、９ ＦＩＧ、ｔｌ Ｎｄｅ　工 ＦＩＧ、１２ ＦＩＧ、１４ ｐｃＺＲ１２６ｓ ＦＩＧ、Ｉ５ ＾ＧＴ＾ ＣＡＣＣｒＴＣＧＡＧＡ Ｇ（ｉｃｃｃＡｃＧＴｃｃＧＴｃＧＧＡｃ（ｉＦＩＧ、
１７ ｐＲ８１６４Ａ ＦＩＧ、Ｉ６ ＲＢ１４５ ＦＩＧ、Ｉ８ ＲＢ１７２ ＦＩＧ、１９ ＦＩＧ、２０

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、式（ I ）： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） ［式中、Ａ２１はアラニン、アスパラギン、アスパラギ
   ン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、スレオニ
   ン、またはセリンであり、 Ｂ１はフェニルアラニン、アスパラギン酸、または不存
   在であり、 Ｂ２はバリン、またはＢ１が不存在の場合に不存在であ
   ってもよく、 Ｂ３はアスパラギンまたはアスパラギン酸であり、 Ｂ９はセリンまたはアスパラギン酸であり、Ｂ１０はヒ
   スチジンまたはアスパラギン酸であり、 Ｂ２７はスレオニンまたは不存在であり、 Ｂ２８はいずれのアミノ酸であってもよく、Ｂ２９はＬ
   −プロリン、Ｄ−プロリン、Ｄ−ヒドロキシプロリン、
   Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−（Ｎ−メチルリシン）、
   Ｄ−リシン、Ｌ−（Ｎ−メチルアルギニン）、またはＤ
   −アルギニンであり、 Ｂ３０はアラニン、スレオニン、または不存在であり、 Ｚは−ＯＨ、−ＮＨ＿２、−ＯＣＨ＿３、または−ＯＣ
   Ｈ＿２ＣＨ＿３であり、 ＸはＡｒｇ、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ
   、Ａｒｇ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ａｒｇ、または不存在であ
   り、ＹはＸが存在する場合にのみ存在することができ、
   それが存在する場合は、Ｇｌｕ、または配列：【遺伝子
   配列があります。】 のすべて、もしくはこの配列のＮ末端Ｇｌｕから始まる
   その一部からなるアミノ酸である］ で示されるインスリン類似体、またはその医薬的に許容
   され得る塩。 ２、ＸおよびＹが不存在であり、ＺがＯＨである請求項
   １に記載のインスリン類似体。 ３、Ｂ２９がＬ−プロリン、Ｄ−プロリン、Ｄ−ヒドロ
   キシプロリン、またはＬ−ヒドロキシプロリンであり、
   Ｂ３０がスレオニンである請求項１に記載のインスリン
   類似体。 ４、Ｂ２８がアスパラギン酸、バリン、ロイシン、イソ
   ロイシン、ノルロイシン、プロリン、アルギニン、ヒス
   チジン、シトルリン、オルニチン、リシン、フェニルア
   ラニン、アラニン、またはグリシンである請求項１から
   請求項３までのいずれかに記載のインスリン類似体。 ５、Ｂ２８がアスパラギン酸、バリン、ロイシン、イソ
   ロイシン、ノルロイシン、プロリン、アルギニン、ヒス
   チジン、オルニチン、またはリシンである請求項１から
   請求項４までのいずれかに記載のインスリン類似体。 ６、Ｂ２８がリシンである請求項１から請求項５までの
   いずれかに記載のインスリン類似体。 ７、Ｂ２８がリシンであり、Ｂ２９がＬ−プロリンであ
   り、Ｂ３０がスレオニンである請求項１から請求項６ま
   でのいずれかに記載のインスリン類似体。 ８、Ａ２１がアラニンである請求項１から請求項７まで
   のいずれかに記載のインスリン類似体。 ９、Ｂ１が不存在である請求項１から請求項８までのい
   ずれかに記載のインスリン類似体。 １０、Ｂ１０がアスパラギン酸である請求項１から請求
   項９までのいずれかに記載のインスリン類似体。 １１、Ｂ２が不存在である請求項１から請求項１０まで
   のいずれかに記載のインスリン類似体。 １２、Ｂ１０がアスパラギン酸である請求項１１に記載
   のインスリン類似体。 １３、Ｂ３０が不存在である請求項１から請求項１２ま
   でのいずれかに記載のインスリン類似体。 １４、Ｂ３０がアラニンである請求項１から請求項１３
   までのいずれかに記載のインスリン類似体。 １５、Ｂ２８がＬ−プロリンであり、Ｂ２９がＬ−（Ｎ
   −メチルリシン）、Ｄ−リシン、Ｌ−（Ｎ−メチルアル
   ギニン）、またはＤ−アルギニンである請求項１または
   請求項２に記載のインスリン類似体。 １６、Ｂ２８がＬ−プロリンであり、Ｂ２９がＬ−（Ｎ
   −メチルリシン）またはＤ−リシンである請求項１、請
   求項２および請求項１５のいずれかに記載のインスリン
   類似体。 １７、Ａ２１がアラニンである請求項１、２、１５およ
   び１６のいずれかに記載のインスリン類似体。 １８、Ｂ１が不存在である請求項１、２、および請求項
   １５から１７のいずれかに記載のインスリン類似体。 １９、Ｂ１０がアスパラギン酸である請求項１、２、お
   よび請求項１５から１８のいずれかに記載のインスリン
   類似体。 ２０、Ｂ２が不存在である請求項１、２、および請求項
   １５から１９のいずれかに記載のインスリン類似体。 ２１、Ｂ１０がアスパラギン酸である請求項１、２、お
   よび１５から２０のいずれかに記載のインスリン類似体
   。 ２２、Ｂ３０が不存在である請求項１、２、および１５
   から２１のいずれかに記載のインスリン類似体。 ２３、Ｂ３０がアラニンである請求項１、２、および１
   ５から２２のいずれかに記載のインスリン類似体。 ２４、Ａ２１がアスパラギン、Ｂ１がフェニルアラニン
   、Ｂ２がバリン、Ｂ３がアスパラギン、Ｂ９がセリン、
   Ｂ１０がヒスチジン、Ｂ２７がスレオニン、Ｂ２８がリ
   シン、Ｂ２９がＬ−プロリン、Ｂ３０がスレオニン、Ｚ
   がＯＨ、Ｘが不存在、そしてＹが不存在である請求項１
   に記載のインスリン類似体。 ２５、Ａ）Ａ２１が請求項１における定義と同意義であ
   る式（ I ）で示される化合物のＡ鎖を、Ｂ１、Ｂ２、
   Ｂ３、Ｂ９、Ｂ１０、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９、Ｂ３０
   、Ｘ、Ｙ、およびＺが請求項１における定義と同意義で
   ある式（ I ）で示される化合物のＢ鎖と一緒にし、適
   当なジスルフィド結合を生成させるか、 Ｂ）Ｂ２３から始まるペプチド配列を欠いており、かつ
   Ａ２１、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ９、およびＢ１０が請求
   項１における定義と同意義である式（ I ）の改変化合
   物を、式： 【遺伝子配列があります。】 ［式中、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９、Ｂ３０、Ｘ、Ｙ、お
   よびＺは請求項１における定義と同意義である］ で示される配列を有するペプチドと反応させるか、また
   は Ｃ）Ａ２１、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ９、Ｂ１０、Ｂ２７
   、Ｂ２８、Ｂ２９、Ｂ３０、Ｘ、Ｙ、およびＺが請求項
   １における定義と同意義である式（ I ）で示される化
   合物のアミノ酸配列からなる改変プロインスリン分子を
   開裂させ、この改変プロインスリンからＣ−ペプチドの
   すべて、またはその一部を除去する ことを特徴とする請求項１から請求項２４までのいずれ
   かに記載の式（ I ）で示される化合物の製造方法。 ２６、１つまたはそれ以上の医薬的に許容され得る担体
   と共に、活性成分として請求項１から請求項２４までの
   いずれかに記載の式（ I ）で示される化合物を含有す
   る医薬製剤。 ２７、請求項１から請求項２４までのいずれかに記載の
   化合物を投与することを特徴とする、真性糖尿病に罹患
   した哺乳動物を処置するための方法。