BG60769B2

BG60769B2 - Аналози на инсулина

Info

Publication number: BG60769B2
Application number: BG098572A
Authority: BG
Inventors: Ronald Chance; Richard Dimarchi; Bruce Frank; James Shields
Original assignee: Eli Lilly And Company
Priority date: 1989-02-09
Filing date: 1994-02-25
Publication date: 1996-02-29
Also published as: ATE133961T1; HU211276A9; CN1034080C; KR0169727B1; HU900726D0; CA2009579A1; CN1044820A; DE69025210D1; ES2170122T3; CY1911A; CN1103602C; DE69025210T2; GR3019501T3; NZ232375A; LU88831I2; EP0383472B1; LU88830I2; AU630912B2; JPH02264798A; RU2109749C1

Abstract

Изобретението се отнася до аналог на инсулина с формула верига а верига в в която а21 е аланин, аспарагин, аспарагинова киселина, глутамин, глутаминова киселина, глицин, треонин или серин, в1 е фенилаланин, аспарагинова киселина или отсъства, в2 е валин или може да отсъства, когато отсъства в1, в3 е аспарагин или аспарагинова киселина, в9 е серин или аспарагинова киселина, в10 е хистидин или аспарагинова киселина, в27 е треонин или отсъства, в28 е която и да е аминокиселина, в29 е l-пролин, d-пролин, d-хидроксипролин, l-хидроксипролин, l-(n-метиллизин), d-лизин, l-(n-метиларгинин) или d-аргинин, в30 е аланин, треонин или отсъства, z е -он, -nн2, -осн3 или -осн2сн3, х е аrg, аrg-аrg, lys, lys-lys, аrg-lys, lys-аrg или отсъства, а y може да присъства само когато присъства х и ако присъства, е glu или аминокиселинна последователност, която включва цялата или част от последователността -glu-аlа-glu-аsр-lеu-gln-vаl-gly-gln-vаl-glu-lеu-gly-gly-gly -рrо-gly-аlа-gly-sеr-lеu-gln-рrо-lеu-аlа-lеu-glu-gly-sеr-lеu -gln-lys-аrgи която започва от n-крайната glu от тази последователност, или до негова фармацевтично приемлива сол. 35 претенции

Description

Изобретението се отнася до инсулин, модифициран при 29-та аминокиселинна позиция от В веригата на нативен човешки инсу- 5 лин и по избор при други позиции. Посочените инсулинови аналози са по-малко склонни към димеризация или присъединяване към форми с по-високо молекулно тегло и следователно имат сравнително по-бързо начало на действие, запазвайки биологичната активност на естествения човешки инсулин.

Като първи вариант изобретението включва инсулинови аналози с формула

NH₂

I

Gly¹

I lie²

I Vai³

ВЕРИГА A (I)

Glu⁴ J---------S-------SJ

IS 6 7 8 9 10 11 12 13 14 IS 16 17 18 19 2021

Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cvs-A-OH \Г

ВЕРИГА B в която A21 е аланин, аспарагин, аспарагинова киселина, глутамин, глутаминова киселина, глицин, треонин или серии; В1 е фенилаланин, аспарагинова киселина или 40 отсъства; В2 е валии или може да отсъства, когато отсъства В1; ВЗ е аспарагин или аспарагинова киселина; В9 е серин или аспарагинова киселина; В10 е хистидин или аспарагинова киселина; В27 е треонин или отсъства; В28 е която и да е аминокиселина, В29 е Lпролин, D-пролин, D-хидроксипролин, Lхидроксипролин, Ь-(М-метиллизин), D-лизин, L-(N-метил аргинин) или D-аргинин; ВЗО е аланин, треонин или отсъства; Z е -OH, -NH₂, 50 -ОСН₃, или ОСН₂СН₃; X е Arg, Arg-Arg, Lys, Lys-Lys, Arg-Lys, Lys-Arg или отсъства; a Y може да присъства само когато X присъства и ако присъства е Glu или аминокиселинна последователност, която включва цялата или част от последователността -Glu-Ala-Glu-AspLeu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-GlyPro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-LeuGlu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg- и която започва от N-крайната Glu от тази последователност. 45 Описан е и се претендира също така за метод за лечение на хипергликемия чрез прилагане на ефективно количество от инсулинов аналог с формула I. Претендира се също за описаните по-нататък фармацевтични състави, съдържащи ефективно количество от инсулиновия аналог с формула I в комбинация с един или повече фармацевтично приемливи инерт3 ни пълнители.

Съгласно втори вариант на изобретението се осигурява метод за получаване на съединение с формула I, който включва, в съответствие с първия вариант следното.

A) свързване на А-верига от съединение с формула I, в която А21 е дефинирана в първия етап, с В веригата от съединение с формула I, в която Bl, В2, ВЗ, В9, BIO, В27, В28, В29, ВЗО, X, Y и Z са дефинирани в първия етап, за да се образуват подходящите дисулфидни връзки, или

B) взаимодействие на модифицирано съединение с формула I, несъдържащо пептидната последователност, започваща с В23 и в която А21, В1, ВЗ, В9 и В10 са дефинирани в първия етап, с пептид, имащ последователността Gly-Phe-Phe-Tyr-B27-B28-B29-B30-XY-Z, в която В27, В28, В29, ВЗО, X, Y и Z са дефинирани в първия етап, или

C) разцепване на модифицирана проинсулинова молекула, съдържаща аминокиселинната последователност от съединение с формула (I), в която А21, Bl, В2, ВЗ, В9, BIO, В27, В28, В29, ВЗО, X, Y и Z са дефинирани в първия етап, за да се отдели целият или част от Спептида от този модифициран проинсулин.

Според трети вариант на изобретението се осигурява фармацевтичен състав, съдържащ като активен компонент съединение с формула I в съответствие с първия вариант, заедно с един или повече фармацевтично приемливи носители.

Според четвърти вариант на изобретението се осигурява метод за лечение на диабет при бозайници, който се състои в прилагане спрямо такъв бозайник на съединение с формула I, в съответствие с първия вариант.

Според пети вариант на изобретението се осигурява съединение с формула I съгласно първия вариант, но което съединение се получава по метода от третия вариант.

Изобретението се пояснява с приложените фигури, които не са начертани мащабно и представляват следното.

Фигура 1 представлява рестрикционен сайт и функционална карта на плазмид рКС283;

фигура 2 - рестрикционен сайт и функционална карта на плазмид рКС283РХ;

фигура 3 - рестрикционен сайт и функционална карта на плазмид pKC283-L;

фигура 4 - рестрикционен сайт и функционална карта на плазмид pKC283-LB;

фигура 5 - рестрикционен сайт и функционална карта на плазмид pKC283-PRS;

фигура 6 - рестрикционен сайт и функционална карта на плазмид pL32;

фигура 7 - рестрикционен сайт и функционална карта на плазмид pNM789;

фигура 8 - схематично описание на конструкцията на плазмид 120;

фигура 9 - рестрикционен сайт и функционална карта на плазмид pL47;

фигура 10 - рестрикционен сайт и функционална карта на плазмид pPR12;

фигура 11 - рестрикционен сайт и функционална карта на плазмид pPR12ARl;

фигура 12 - рестрикционен сайт и функционална карта на плазмид pLllO;

фигура 13 - схематично описание на конструкцията на плазмид pLUOC;

фигура 14 - рестрикционен сайт и функционална карта на плазмид pCZR126S;

фигура 15 - нуклеотидна последователност на синтетичния човешки проинсулинов ген;

фигура 16 - рестрикционен сайт и функционална карта на плазмид pRB145;

фигура 17 - рестрикционен сайт и функционална карта на плазмид pRB164A;

фигура 18 - рестрикционен сайт и функционална карта на плазмид pRB172;

фигура 19 - рестрикционен сайт и функционална карта на плазмид pRB173;

фигура 20 - рестрикционен сайт и функционална карта на плазмид pRB175.

Формула I накратко представя аминокиселинната последователност на аналозите на инсулина от изобретението. Аминокиселинните съкращения имат следните конвенционални значения.

Съкращение	Аминокиселина
Aba	α-аминобутанова киселина
Ala	Аланин
Arg	Арганин
Asn	Аспарагин
Asp	Аспарагинова киселина
Cya	Цистеинова киселина
Cys	Цистеин
Gin	Глутамин
Glu	Глутаминова киселина

Gly	Глицин
His	Хистидин
He	Изолевцин
Leu	Левцин
Lys	Лизин
Met	Метионин
Nle	Норлевцин
Nva	Норвалин
Om	Орнитин
Phe	Фенилаланин
Pro	Пролин
Ser	Серин
Thr	Треонин
Trp	Триптофан
Tyr	Тирозин
Vai	Валин

В28 може да бъде която и да е естествено или неестествено срещаща се аминокиселина. За предпочитане тази аминокиселина е аспарагинова киселина, валин, левцин, изолевцин, норлевцин, пролин, аргинин, хистидин, цитрулин, орнитин, лизин, фенилаланин, аланин или глицин. От горните аминокиселини, особено предпочитана подгрупа съдържа аспарагинова киселина, валин, левцин, изолевцин, норлевцин, пролин, аргинин, хистидин, орнитин или лизин. Лизин е най-предпочитаната аминокиселина за В28. В29 е за предпочитане L-пролин, D-пролин, D-хидроксипролин или L-хидроксипролин. Особено предпочитан аналог на инсулина от изобретението е този, при^който В28 е лизин, a В29 е пролин, т.е. инверсия в естествената аминокиселинна последователност на човешки инсулин при позиции 2828 и 29 от Вверигата.

Като следващ вариант, както е споменато по-горе, когато В28 е L-пролин, тогава позиция В29 за предпочитане е Ь-(М-метиллизин), D-лизин, Е-(М-метиларгинин) или D-аргинин. Предпочитан аналог от този вариант е когато В28 е L-пролин, a В29 е Ь-(М-метиллизин) или D-лизин.

По-долу са разгледани други модификации на инсулиновите аналози от изобретението, т.е. модификации на инсулиновите аналози на други позиции, освен позициите В28 и В29. По-специално може да се замести, по желание, остатъкът Asn от позиция 21 от А-веригата (т.е. карбокси края) с Ala, Asp, Gin, Glu, Gly Thr или Ser и ако се извърши такова заместване, за предпочитане е с Ala. По подобен начин може да се замести по желание остатъкът Asn в позиция 3 от В-веригата с аспарагинова киселина (Asp). Такива незадължителни замествания имат ефект при увеличаване стабилността на аналозите при екстремни pH стойности, тъй като Asn е особено чувствителен към реакции на дезамидиране и прегрупиране, както при високи така и при ниски pH. Специалистите в областта също така високо ще оценят факта, че глутаминовите остатъци от инсулиновите аналози могат, по подобен начин, да са чувствителни към дезамидиране и прегрупиране. Съответно, заместването с глутаминова киселина също се включва в обхвата на изобретението. Други незадължителни модификации на инсулиновите аналози от изобретението са (включително в каквато и да е комбинация помежду си) заместване на хистидиновия остатък в позиция В10 с аминокиселината аспарагинова киселина; заместване на фенилаланиновия остатък в позиция В1 с аспарагинова киселина; заместване на треониновия остатък в позиция ВЗО с аланин; заместване на сериновия остатък в позиция В9 с аспарагинова киселина; премахване на аминокиселини в позиция В1 (дес-В1) отделно или в комбинация с премахване и в позиция В2 (дес-В2); и премахване на треонин от позиция В-30 (дес-ВЗО).

Аналозите на инсулин от изобретението могат също да бъдат модифицирани при В30края чрез прибавяне на която и да е аминокиселина или дипептид: Arg, Arg-Arg, Lys, LysLys, Arg-Lys или Lys-Arg. Когато присъстват, те са отбелязани във формула I с групата X. Когато е налице такова прибавяне, за предпочитане то е Arg-Arg.

В допълнение, когато съществува посоченото прибавяне в ВЗО, аналогът може да бъде модифициран и чрез добавяне към получения ВЗО удължен край на глутаминова киселина (Glu)или на аминокиселинна последователност, включваща цялата или част от последователността -Glu-Ala-Glu-Asp-LeuGln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-ProGly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-GluGly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-, и която започва от N-крайната Glu. Когато присъства тази аминокиселина или последователност, тя е отбелязана във формула I с групата Y. Когато последователността представлява само част от описаното по-горе, тя може да бъде коя да е от частите, които започват при N-края на последователността, т.е. при остатъка глутаминова киселина (Glu).

В описаното X или комбинацията от X и Y представляват целия или част от свързващия пептид, намиращ се в човешкия проинсулин, молекула, която е биологическия предшественик при образуването на нативен човешки инсулин.

Предпочитани последователности за Y са следните.

-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-GlnVal-Glu-Leu-Cly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-SerLeu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-GlnLys-Arg-;

-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-GlnVal-Glu-Leu-Cly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-SerLeu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-GlnLys-;

-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-GlnVal-Glu-Leu-Cly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-SerLeu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-;

-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-GlnVal-Glu-Leu-Cly-GIy-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-SerLeu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-;

-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-GlnVal-Glu-Leu-Cly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-SerLeu-Gln-Pro-Leu-Ala-;

-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-GlnVal-Glu-.

В допълнение, в зависимост (ft· това дали X самостоятелно или X и Y заедно присъстват или отсъстват, крайната група Z може да бъде някоя от следните: -OH, -NH₂, -ОСН₃ или ОСН₂СН₃. За предпочитане Ze- ОН.

Както е описано по-горе, изобретението включва фармацевтично приемливи соли на аналози на инсулина. Предпочитани такива соли са тези на цинка, натрия, калия, магнезия или калция.

Аналозите на инсулина съгласно изобретението могат да бъдат получени чрез който и да е от редица известни методи за пептиден синтез, включващи класически (с разтвор) методи, твърдофазни методи, полусинтетични методи и най-новите рекомбинантни ДНК методи.

При твърдофазовия метод аминокиселинната последователност се конструира последователно от начална, неразтворима, С-крайна аминокиселина с носител смола. Операциите на твърдофазовия метод са описани от J. Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, Freeman and Co., San Francisco, 1969.

Най-общо при твърдофазовия метод аминокиселината, съответстваща на С-крайния аминокиселинен остатък на желания пептид се захваща към неразтворимия носител смола и тогава пептидната верига се образува, като започва от С-крайната аминокиселина, с носител смола. Последователно се вкарват отделни аминокиселини, докато се постигне желаната аминокиселинна последователност. Алтернативно, могат да се приготвят малки пептидни фрагменти и да се вкарат в пептидната верига в желания порядък. Пептидната верига .остава свързана към смолата по време на синтезата и след оформяне на веригата пептидът се отцепва от смолата.

Пептидната верига е закачена за полистиреновата смола чрез естерна връзка, образувана между карбоксилната група от Скрайната част и специфична метиленова група, присъстваща върху матрикса от смолата, като сайт за това присъединяване.

Аминокиселините се свързват, като се използват операции, добре известни при образуването на пептидни връзки. Единият метод включва превръщане на аминокиселината в производно, което улеснява реагирането на карбоксилната група със свободната N-крайна аминогрупа на пептидния фрагмент. Например, аминокиселината може да бъде превърната в смесен анхидрид чрез реакция на защитена аминокиселина с етилохлороформиат, фенилохлороформиат, втор.-бутилохлороформиат или изобутилохлороформиат. Алтернативно, аминокиселината може да бъде превърната в активен естер, като 2,4,5-трихлорофенилов естер, пентахлорофенилов естер, р-нитрофенилов естер, N-хидроксисукцинимидоестер или естер, образуван от 1-хидроксибензотриазол.

Друг метод на свързване включва използването на подходящ свързващ агент, такъв като Ν,Ν’-дициклохексил-карбодиимид (DCC) или Ν,Ν’-диизопропилкарбодиимид (DIC).

Известни са и други подходящи свързващи агенти, описани в Schroder и Lubke, The Peptides, Academic Press, 1965, Раздел III, който се цитира в описанието за справка.

Трябва да се отбележи, че α-амино групата на всяка аминокиселина, използвана в пеп тидния синтез, трябва да бъде защитена по време на свързващата реакция, за да се избегнат странични реакции поради реакционната способност на α-амино групата. Също така трябва да се отбележи, че някои аминокиселини съдържат в страничната верига реактивни функционални група (като сулфхидрилна, ε-амино, β - и γ-карбоксилна, имидазолова, гуанидо и хидроксилна) и че такива функционални групи също трябва да бъдат защитени както при първоначалния, така и при следващите етапи на свързване. От нивото на техниката са известни подходящи защитни групи. Виж, например, Protective Groups In Organic Chemistry, M. McOmie, Editor, Plenum Press, N.Y., 1973 и U.S. Patent 4 617 149, който се цитира за справка.

При избора на защитна група трябва да се спазват следните определени условия, а-аминозащитната група: 1) Трябва да направи инертна α-аминогрупа при условията на реакцията на свързване; 2) Трябва да бъде лесно отцепваща се след реакцията на свързване при условия, които да не отделят защитните групи от страничната верига и да не променят структурата на пептидната част и 3) трябва да се елиминира възможността за рацемизация след активиране, непосредствено преди свързване. Защитната група на страничната верига 1) трябва да направи инертна функционалната група на страничната верига при условията на реакцията на свързване, 2) трябва да бъде стабилна при приложените условия з£ отделяне на α-аминозащитната група и 3) трябва да бъде лесно отцепваща се след оформяне на желаната аминокиселинна последователност при реакционни условия, които да не променят структурата на пептидната верига.

Очевидно е за специалистите в областта, че реакционната способност на защитните групи, за които е известно, че са полезни при пептидния синтез, е различна спрямо агентите, използвани за тяхното отделяне. Например, определени защитни групи, като трифенил, метил и 2-(р-бифенилил)изопропилоксикарбонил са много лабилни и могат да бъдат отцепени при меки киселинни условия. Други защитни групи, като трет.-бутилоксикарбонил, трет.анилоксикарбонил, адамантилоксикарбонил и р-метоксибензилоксикарбонил са по-малко лабилни и изискват за тяхното отделяне сравнително силни киселини, такива като трифлуороцетна, солна или боротрифлуорид в оцетна киселина. Други защитни групи, като бензилоксикарбонил, халобензилоксикарбонил, рнитробензилоксикарбонил, циклоалкилоксикарбонил и изопропилоксикарбонил са още помалко лабилни и изискват за тяхното отделяне по-силни киселини, като флуороводородна, бромоводородна или боротрифлуороацетат в трифлуороцетна киселина.

След оформяне на желаната пептидна последователност защитеният пептид трябва да бъде отцепен от смолата носител и всички защитни групи трябва да бъдат отделени. Реакцията на отцепване от носителя и отделянето на защитните групи може да бъде проведена наведнъж или на етапи. Когато носителят смола е хлорометилирана полистиренова смола, връзката, свързваща пептида към смолата, е естерна, образувана между свободната карбоксилна група на С-крайната част и една от множеството хлорометилни групи, присъстващи в матрицата от смолата. Установено е, че свързващата връзка може да бъда отцепена с реагенти, за които се знае, че са способни да разкъсат естерната връзка и да проникнат в матрицата от смолата. Един особено подходящ метод е чрез третиране с течен безводен флуороводород. Този реагент не само отцепва пептида от смолата, но и отделя всички защитни групи. Следователно, чрез използването на този реагент, директно се получава напълно незащитен пептид. Когато е необходимо да се отдели пептидът, без да се отделят защитните групи, защитеният пептид смола трябва да се подложи на метанолиза, за да се получи защитен пептид, в който С-крайната карбоксилна група е метилирана. След това метиловият естер може да бъде хидролизиран при меки алкални условия, за да се получи свободният С-краен карбоксил. След това защитните групи на пептидната верига могат да бъдат отделени чрез третиране със силна киселина, като течен флуороводород. Особено полезна технология за метанолиза е тази на

G.Moore и др., Peptides, Proc. 5th Amer. Pept. Symp., M. Goodman и J. Meienhofer, Eds., John Wiley, N.Y., 1977, стр. 518-521, в която защитеният пептид смола е третиран с метанол и натриев цианид в присъствието на етер.

Друг метод за отцепване на защитения пептид от смолата е чрез амонолиза или чрез третиране с хидразин. Ако е необходимо, полученият С-краен амид или хидразидът могат да бъдат хидролизирани до свободен С-краен карбоксил и защитните групи могат да бъдат отделени по конвенционален път.

Приема се, че защитната група, присъстваща в N-крайната α-амино група, може да бъде преференциално отделена, както преди, така и заедно с отцепването на защитения лепти д от смолата носител.

А и В веригите на инсулиновите аналози от изобретението могат също така да бъдат получени чрез рекомбинантна ДНК техника. Получава се нуклеотидна последователност, кодираща желания пептид от А и В веригата, чрез използване на рутинни техники за такъв синтез. Тези методи най-общо включват получаване на олигонуклеотидно, кодиращ както фрагменти от желаната кодираща последователност, така и комплементарната й последователност. Олигонуклеотидите са предназначени да осигуряват припокриване на един фрагмент от кодиращата последователност с два фрагмента от комплементарната последователност и обратно. Олигонуклеотидите се спояват и присъединяват и накрая се получава желаната генна последователност.

Последователността се вкарва в клониращ вектор на място, което позволява експресията на пептидния продукт, който тя кодира. Подходящият клониращ вектор съдържа наймалко една част от генната експресионна контролна последователност.

А и В веригите на инсулиновите аналози от изобретението могат също да бъдат получени чрез подобна на проинсулин молекула предшественик, като се използват рекомбинантна ДНК техника. Виж Frank и др., Peptides: Synthesys-Structure-Function, Proc. Seventh Am. Pept. Symp., Eds. D. Rich и E. Gross (1981), който се цитира тук за справка.

Етапът на комбиниране на получените вече отделни А и В вериги може да се осъществи по метода на Chance и др., Peptides: Synthesys-Stucture-Function: Proc, of Seventh American Peptide Symposium (1981), който се цитира тук за справка.

Следните примери илюстрират изобретението, без да го ограничават.

Пример 1. Lys(B28),Pro(B29) човешки инсулин.

А. Получаване на рекомбинантно-получена А верига.

А-веригата на човешки инсулин се по лучава чрез рекомбинантна ДНК техника чрез химически синтез на гена, кодиращ А-веригата и експресията му в E.coli. Накратко, генът за А-веригата се синтезира от различни тринуклеотиди в синтетични фрагменти с дължина дека- до пентадекануклеотиди, чрез блокфосфотриестерен метод. Генът има едноверижни лепливи краища за Есо RI и Bam HI рестрикционни ендонуклеази. Инсерирането му в подходящ експресионен вектор, съдържащ βгалактозидазен ген (β-гал) води до химеричен плазмид, имащ А-верига, свързана с β-гал гена чрез метионинов кодон. Триптофансинтетазен ген (trp LE’) се използва като промотор, вместо β-гал гена, за да се постигне по-висока степен на експресия. Химеричният плазмид се трансформира в E.coli, като се получава експресия на предшестващ протеин, т.е. β-гaл-met-A- верига (или trp LE’-met-А-верига, когато се използва trp LE’ промоторната система) . След третиране на предшестващия протеин с цианобромид се отцепва метиониновата връзка, за да се получи след пречистване Аверигата на човешки инсулин. След окислителна сулфитолиза се получава S-сулфонирана А-верига, която се комбинира с В-веригата (S-сулфонат), както е описано по-долу.

За подробна информация за химическия синтез на гените на А-веригата на човешки инсулин, виж Сгеа и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 5765-5769, 1978 и източниците, цитирани тук за справка. За пълна информация за експресията в E.coli на химически синтезирания ген А-веригата на човешки инсулин, виж Goeddel и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 101-110, 1979 и източниците, цитирани тук за справка.

В. Получаване на аналог на В-верига [Lys(B28),Pro(B29)].

За получаването на сурова пептидилова смола се използва Applied Biosystems пептиден синтезатор 430А (включващ софтуерна версия 1.4). Използват се 0,5 mMol (0,76 mMol/g х 658 g) от началната твърдофазна смола (t-BOCThr(Bzl)OCH₂ Pam смола). Всички използвани аминокиселини са ВОС защитени и освен глутаминова киселина и хистидин всички се използват директно както са получени (т.е. в опаковки от Applied Biosystems, Inc., като всяка кутия съдържа приблизително 2 mMol защитена аминокиселина). Глутаминова киселина и хистидин се получават от Peptides International

Corporation и се прехвърлят в кутии, така че всяка кутия да съдържа приблизително 2 mMol от желаната защитена аминокиселина. След изсушаване на суровата пептидилова смола (под вакуум при стайна температура цяла нощ) се определя нейното тегло и се сравнява с началното тегло, за да се установи приемливото му нарастване. Малка част като образец се подлага на аминокиселинен анализ, за да се установи, че желаните аминокиселини са прибавени в необходимите количества.

Пептидът се отцепва от пептидиловата смола и се отнема защитата на страничната верига чрез разбъркването му за около 1 час при 0°С в разтвор от 10 части (об./тегл.) HF (съдържащ 5 % об./об. етиломеркаптан и 5 % об./ об. m-крезол) към 1 част пептидилова смола. След отделяне на по-голяма част от HF под вакуум пептидът се утаява в етилов етер. След неколкократно промиване с етилов етер, последвано от вакуумно филтриране, пептидът се разтваря в приблизително 200 ml 7М разтвор на дейонизиран карбамид, съдържащ 0,1М TRIS, 0,1М Na₂SO₃ и 0,01 М Na₂S₄O₆. Разтворът се довежда до pH 8,5 с 5N NaOH и се оставя да се разбърква интензивно цяла нощ при 4°С.

Полученият S-сулфониран пептиден разтвор се подава на 5x215 cm колона от Sephadex G-25 (фин) при стайна температура. Пробата се елуира при 20 ml/min, при стайна температура, като се използва 50 rnMol амониев бикарбонат. Изтичащият поток се изследва при 276 nm. Събират се фракции по 20 ml, обединяват се желаните фракции и се пречистват чрез високоефективна течна хроматография (HPLC), както следва.

Пробата от желаните фракции се пропуска през 2,5x30 cm DuPont С8, 9-12 μ HPLC колона и се елуира с разтвор на ацетонитрил, чието количество се увеличава по линеен градиент, в 100 шМ амониев бикарбонат при стайна температура (2,6 ml/min). Изтичащият поток се изследва при 280 nm. Събират се фракции по 25 ml. На подбрани фракции се извършва аналитичен HPLC анализ, за да се определи кои фракции да се запазят. Желаните фракции се обединяват и лиофилизират и се използват в следващата комбинация с Аверигата, получена, както е описано по-горе.

С. Получаване Lys(B28),Pro(B29) човешки инсулин.

Комбинирането на А и В веригите се по лучава по метода на Chance и др., по-горе. 700 mg, получена от рекомбинанта ДНК- S-сулфонат, А-верига и 140 mg синтетичен Lys(B28), Рго(В29) S-сулфонат В-верига (и двата получени, както е описано по-горе) се разтварят, поотделно, съответно в 70 ml и 14 ml 0,1 М глицинов буфер, при стайна темпера-тура, като всеки се довежда до pH 10,5 с 5N NaOH и след това се охлажда до 5°С. Приготвят се 6 ml разтвор на дитиотреитол (DTT) (10,5 mg/ml) 0,1М глицинов буфер при стайна температура, довежда се до pH 10,5 с 5N NaOH и след това се охлажда до 5°С.

Разтворите на А и В веригите се комбинират, след това бързо се прибавя 5,21 ml от DTT разтвора (SH/SSO₃=O,90). Реакционният разтвор се разбърква при 5°С в отворена 200 ml-ова стъклена центрофужна епруветка за

2,5 h при 5°С. Прибавят се 45 ml ледена оцетна киселина и разтворът се оставя при 5°С цяла нощ.

Получената утаена смес се центрофугира 20 min при 2000 об./min при 5°С. Супернатантата се смесва с 1М оцетна киселина и се поставя в 5x200 cm Sephadex G-50 (суперфина) колона с едномоларна оцетна киселина при 5°С и се елуира по гравитация. За три дни се събират 20 минутни фракции. Фракциите се изследват при 276 nm, а някои чрез аналитична HPLC. Фракциите, съдържащи Lys(B28), Pro (В29) последователност на инсулиновия аналог, се събират и лиофилизират, при което се получават 125 mg проба. След това пробата се пречиства чрез обратнофазова HPLC (като се използва 2,12 х 25 cm DuPont С8 колона, елуирана при стайна температура, при скорост 2,6 ml/min и използване на разтвор на ацетонитрил, с нарастващ линеен градиент, в 0,1 М NaH₂PO₄, pH 2,2). Изтичащият поток се изследва при 276 nm. Избрани фракции се изследват чрез аналитична HPLC. Желаните фракции се събират и допълнително се пречистват, като се използва HPLC при pH 7, както следва.

Събраните след HPLC фракции при ниско pH се разреждат приблизително 2 пъти в ледена баня с 0,1М (NH₄)₂HPO₄. pH се довежда до 7 със студена 2N NaOH в ледена баня. Пробата се нанася и се елуира в същата HPLC колона, като се използват същите условия, както при фракциите с ниско pH, освен че елуиращият буфер е 0,1М, pH 7(NH₄)₂HPO₄/ ацетонитрил.

Събраните фракции от HPLC с pH 7 се изстудяват в ледена баня и се разреждат два пъти с 0,1 % воден разтвор на трифлуороцетна киселина (TFA). Прибавя се IN НС1 (студена, проба в ледена баня), за да се понижи pH до 3. Пробата се нанася на HPLC колона (2,12 х 25 cm) на Vydac С4 или на DuPont С8 и се елуира с разтвор на ацетонитрил с нарастващ линеен градиент, в 0,1 % воден разтвор на TFA. Изтичащият поток се изследва при 214 nm или 276 nm. Желаните фракции се събират и лиофилизират, при което се получават 41 mg от желания аналог, с чистота над 97 %, чрез обратнофазова хроматография.

Пример 2. Lys(B28),Pro(B29), човешки инсулин.

Втори метод за получаване на Lys(B28), Рго(В29), човешки инсулин използва ензимна полусинтеза (реверсивна протеолиза), за свързване на дезоктапептиден инсулин (Α,.^-Β,.^) със синтетичен октапептид. Дезоктапептид-ния инсулин се получава чрез смилане с трипсин на естествен свински или човешки инсулин, както е описано от Bromer и Chance, “Preparation and Characterization of Des-octapeptide-Insulin”, Biochim. Biophys.Acta, 133:219-223 (1967), който е цитиран тук за справка. Синтетичният октапептид Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Lys-Pro-Thr се получава чрез автоматичен твърдофазов синтез, по описан по-горе начин.

Дезоктапептидният инсулин (435 mg) и 465 mg синтетичен Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-LysPro-Thr се комбинират в 15 ml разтвор, съдържащ една част диметилсулфоксид, две части 1,4-бутандиол и една част 0,25М триацетатен буфер с pH 7,3. Пептидите се разтварят напълно чрез затопляне на разтвора на гореща плоча. След това разтворът се слага в инкубатор при 37°С и се прибавя 90 mg свински трипсин. Разтворът се разбърква периодично в продължение на 90 min при 37°С. Реакцията се прекратява чрез комбиниране на разтвора с 135 ml 0,05N HCI.

Посоченият инсулинов аналог се пречиства чрез нанасяне на киселинния разтвор, съдържащ аналога, в 2,5 х 25 cm С-8 Zorbax HPLC колона и се елуира с разтвор на ацетонитрил, с нарастващ линеен градиент, в 0,1М натриев моноосновен фосфатен буфер с pH 2,2. Изтичащият поток се изследва при 276 nm. Желаните фракции се събират, разреждат се двукратно с вода и се пускат на 1 х 25 cm С-8

Ultrasphere HPLC колона. Аналогът се елуира с разтвор на ацетонитрил, с нарастващ линеен градиент, в 0,5 % воден разтвор на TFA. Изтичащият поток се изследва при 276 nm. Желаните фракции отново се събират и лиофилизират, при което се получават 125 mg пречистен аналог. Структурата се изследва чрез аминокиселинен анализ (Таблица I) и масспектроскопия (MS).

MS: 5809,2 (Теоретично: 5808,7).

Използваният тук анализ масспектроскопия се осъществява, като се използва VGZAB-25E двойнофокусиращ масспектрометър с разрешаваща способност, приблизително 1500. Човешките инсулинови аналози се разтварят в смес от глицерол и тиоглицерол, съдържащ оксалова киселина. Използва се цезиев йодид за калибриране на инструмента, който се подлага на магнитно сканиране от т/ ζ 5300 до m/z 6500. Получените резултати са представени като средна маса +1.

Пример 3. АЬа(В28),Рго(В29) човешки инсулин.

Свински дезоктапептиден инсулин (384 mg) и синтетичен октапептид Gly-Phe-Phe-TyrThr-Aba-Pro-Thr (362 mg) се комбинират в 13 ml разтвор, съдържащ една част диметилсулфоксид, две части 1,4-бутандиол и една част 0,25М трие буфер с pH 7,3 при 37“С. Прибавя се свински трипсин (75 mg). Разтворът се размесва добре и се разбърква периодично 120 min при 37°С.

Реакцията се прекратява чрез прибавяне на сместа към 137 ml 0,05N НС1. Целият разтвор се пропуска през 21 х 250 mm С-8 Zorbax колона и продуктите се елуират с малко количество ацетонитрил, в 0,1М натриев моноосновен фосфатен буфер с pH 2.

Подходящите фракции, определени чрез аналитична HPLC, се събират, разреждат се двукратно с вода и се пропускат през 25 х 300 mm С-18 Vydac колона. Обезсоленият протеин се елуира от колоната с ацетонитрил, в 0,5 % трифлуороцетна киселина. Фракциите, съдържащи пречистения инсулинов аналог, се събират и лиофилизират, при което се получават 59 mg. Структурата се изследва чрез аминокиселинен анализ (таблица I) и масспектроскопия (MS).

MS: 5765,7 (Теоретично: 5765,6).

Пример 4. А1а(В28),Рго(В29) човешки инсулин.

Свински дезоктапептиден инсулин (290 mg) и синтетичен октапептид Gly-Phe-PheTyr-Thr-Ala-Pro-Thr (310 mg) се комбинират в 10 ml разтвор, съдържащ една част диметилсулфоксид, две части 1,4-бутандиол и една част 0,25М трие буфер с pH 7,3 при 37°С. Прибавя се свински трипсин (60 mg). Разтворът се размесва добре и се разбърква периодично 60 min при 37°С.

В този момент реакцията се прекратява чрез прибавяне на сместа към 90 ml 0,05N HCI. Целият разтвор се пропуска през 21 х 250 mm С-8 Zorbax колона и продуктите се елуират с малко количество ацетонитрил, в 0,1М натриев моноосновен фосфатен буфер с pH 2.

Подходящите фракции, определени чрез аналитична HPLC, се събират, разреждат се двукратно с вода и се пропуска през 10 х 250 mm С-8 Ultrasphere колона. Обезсоленият протеин се елуира от колоната с ацетонитрил, в 0,5 % трифлуороцетна киселина. Фракциите, съдържащи пречистения инсулинов аналог, се събират и лиофилизират, при което се получават 43 mg. Структурата се изследва чрез аминокиселинен анализ (таблица I) и масспектроскопия (MS).

MS: 5752,3 (Теоретично: 5751,6).

Пример 5. Arg(B28),Pro(B29) човешки инсулин.

Свински дезоктапептиден инсулин (290 mg) и синтетичен октапептид Gly-Phe-PheTyr-Thr-Arg-Pro-Thr (310 mg) се кбмбинират в 10 ml разтвор, съдържащ една част диметилсулфоксид, две части 1,4-бутандиол и една част 0,25М трие буфер с pH 7,3 при 37°С. Прибавя се свински трипсин (60 mg). Разтворът се размесва добре и се разбърква периодично 60 min при 37°С.

Реакцията се прекратява чрез прибавяне на сместа към 90 ml 0,05N НС1. Целият разтвор се пропуска през 21 х 250 mm С-8 Zorbax колона и продуктите се елуират с малко количество ацетонитрил, в 0,1М натриев моноосновен фосфатен буфер с pH 2.

Подходящите фракции, определени чрез аналитична HPLC, се събират, разреждат се двукратно с вода и се пропускат през 10 х 250 mm С-8 Ultrasphere колона. Обезсоленият протеин се елуира от колоната с ацетонитрил, в 0,5 % трифлуороцетна киселина. Фракциите, съдържащи пречистения инсулинов аналог, се събират и лиофилизират, при което се получа ват 103 mg. Структурата се изследва чрез аминокиселинен анализ (таблица I) и масспектроскопия (MS).

MS: 5836,1 (теоретично: 5836,7).

Пример 6. Asn(B28),Pro(B29) човешки инсулин.

Свински дезоктапептиден инсулин (409 mg) и синтетичен октапептид Gly-Phe-PheTyr-Thr-Asn-Pro-Thr (398 mg) се комбинират в 14 ml разтвор, съдържащ една част диметилсулфоксид, две части 1,4-бутандиол и една част 0,25М трие буфер с pH 7,3 при 37°С. Прибавя се свински трипсин (81 mg). Разтворът се размесва добре и се разбърква периодично 120 min при 37°С.

Реакцията се прекратява чрез прибавяне на сместа към 136 ml 0,05N НС1. Целият разтвор се пропуска през 21 х 250 mm С-8 Zorbax колона и продуктите се елуират с малко количество ацетонитрил, в 0,1М натриев моноосновен фосфатен буфер с pH 2.

Подходящите фракции, определени чрез аналитична HPLC, се събират, разреждат се двукратно с вода и се пропускат през 25 х 300 mm С-18 Vydac колона. Обезсоленият протеин се елуира от колоната с ацетонитрил, в 0,5 % трифлуороцетна киселина. Фракциите, съдържащи пречистения инсулинов аналог, се събират и лиофилизират, при което се получават 56 mg. Структурата се изследва чрез аминокиселинен анализ (таблица I) и масспектроскопия (MS).

MS: 5794,7 (теоретично: 5794,6).

Пример 7. Asp(B28),Pro(B29) човешки инсулин.

Свински дезоктапептиден инсулин (400 mg) и синтетичен октапептид Gly-Phe-PheTyr-Thr-Asp-Pro-Thr (388 mg) се комбинират в 13 ml разтвор, съдържащ една част диметилсулфоксид, две части 1,4-бутандиол и една част 0,25М трие буфер с pH 7,3 при 37°С. Прибавя се свински трипсин (78 mg). Разтворът се размесва добре и се разбърква периодично 120 min при 37°С.

Подходящите фракции, определени чрез аналитична HPLC, се събират, разреждат се двукратно с вода и се пропускат през 25 х 300 mm С-18 Vydac колона. Обезсоленият протеин се елуира от колоната с ацетонитрил, в 0,1 % трифлуороцетна киселина. Фракциите, съдържащи пречистения инсулинов аналог, се събират и лиофилизират, при което се получават 85 mg. Структурата се изследва чрез аминокиселинен анализ (таблица I) и масспектроскопия (MS).

MS: 5795,7 (теоретично: 5795,6).

Пример 8. Asp(B10),Lys(B28),Pro(B29) човешки инсулин.

А. Получаване на Asp(B10),Lys(B28), Рго(В29) В-верига на човешки инсулин.

За получаването на сурова пептидилова смола се използва Applied Biosistems пептиден синтезатор 430А (включващ софтеуерна версия 1,4). Използват се 0,5 mMol 0,72 mMol/g х 0,705 g) от началната твърдофазна смола (tBOC-Thr(Bzl)OCH₂ Pam смола). Всички използвани аминокиселини са ВОС защитени и освен глутаминова киселина, аспарагинова киселина и хистидин, всички се използват директно, както са получени (т.е. в кутии от Applied Biosystems, Inc., като всяка кутия съдържа приблизително 2 mMol защитена аминокиселина). Глутаминовата киселина, аспарагиновата киселина и хистидинът се получават от търговската мрежа и се прехвърлят в кутии, така че всяка кутия да съдържа приблизително 2 mMol от желаната защитена аминокиселина. След изсушаване на суровата пептидилова смола (под вакуум при стайна температура, цяла нощ) нейното тегло се сравнява с началното тегло, за да се установи приемливото му нарастване. Малка част като образец се подлага на аминокиселинен анализ, за да се установи, че желаните аминокиселини са прибавени в необходимите количества.

Пептидът се отцепва от пептидиловата смола и се премахва защитата на страничната верига чрез разбъркването му за около 1 h, при 0°С, в разтвор от 10 части (об./тегл.) HF (съдържащи 5 % об./об. р-тиокрезол и 5 % об./ об. m-крезол) към 1 част пептидилова смола. След отделяне на по-голяма част от HF под вакуум, пептидът се утаява в етилов етер. След неколкократно разклащане с етилов етер, последвано от вакуумно филтриране, пептидът се разтваря в приблизително 120 ml 8М гуанидин НС1, pH 11, съдържаща 0,1М TRIS, 35 mg/ml Na₂SO₃ и 25 mg/ml Na₂S₄O₆. Разтворът се до вежда до pH 8,8 с 5N NaOH и се оставя да се разбърква интензивно 3 h, при стайна температура.

Полученият S-сулфониран пептиден разтвор се подава на 5 х 215 cm колона със Sephadex G-25 (среднофин), при стайна температура. Пробата се елуира при скорост 21 ml/min, при стайна температура, като се използва 50 mM амониев бикарбонат. Изтичащият поток се изследва при 276 nm. Събират се фракции по 25 ml, като желаните фракции се обединяват и пречистват чрез високоефективна течна хроматография (HPLC), както следва.

Сместа от желаните фракции се пропуска през 2,5 х 30 cm DuPont С-8, 9-12 μ HPLC колона и се елуира с разтвор на ацетонитрил, с нарастващ линеен градиент, в 100 шМ амониев бикарбонат при стайна температура (2,6 ml/ min). Изтичащият поток се изследва при 280 nm. Събират се фракции по 25 ml. Извършва се аналитичен HPLC анализ на подбраните фракции, за да се определи кои фракции да се запазят. Желаните фракции се събират и лиофилизират и се използват в следващата комбинация с А-веригата.

В. Комбиниране на Asp(B10),Lys(B28), Рго(В29) човешки инсулин В-верига с човешки инсулин А-верига.

Комбинацията от А и В веригите се получава по метода на Chance et al., по-горе. 2 g, получена от рекомбинанта ДНК S-сулфонат А-верига и 400 mg синтетичен Asp (В 10), Lys(B28),Pro(B29) S-сулфонат В-верига се разтварят поотделно, съответно в 200 ml и 40 ml 0,1М глицинов буфер, при стайна температура, като всеки се довежда до pH 10,5 с 5N NaOH и след това се охлажда до 5°С. Приготвя се разтвор на 15,5 mg/ml дитиотреитол (DTT) в 0,1М глицинов буфер, при стайна температура, довежда се до pH 10,5 с 5N NaOH и след това се охлажда до 5°С.

Разтворите на А и В веригите се комбинират, след това бързо се прибавя 15,9 ml от DTT разтвора (SH/SSO₃=l,0). Реакционният разтвор се разбърква при 4°С в отворена 200 милилитрова стъклена центрофужна епруветка за 19,6 h, при 4°С. Прибавя се 129 ml ледена оцетна киселина и разтворът се оставя при 4°С за 1 h.

Получената преципитационна утаена смес се центрофугира 30 min при 2000 об./min при 4°С. Супернатантата се смесва с 292 ml вода и 73 ml ацетонитрил и се пречиства чрез обратнофазова HPLC (като се използва 2,5 х 30 cm Vydac Cl8 колона, елуирана при стайна температура, при скорост 2,6 ml/min при използване на разтвор на ацетонитрил, с нарастващ линеен градиент, в 0,1М NaH₂PO₄, pH 2,1). Изтичащият поток се изследва при 280 nm. Избрани фракции се изследват чрез аналитична HPLC и желаните фракции се събират и разреждат двукратно с 0,1 % воден разтвор на трифлуороцетна киселина (TFA), след това се поставят в Ultrasphere octyl HPLC колона (1,0 χ 25 cm) и се елуира с разтвор на ацетонитрил, с нарастващ линеен градиент, в 0,1 % воден разтвор на TFA. Изтичащият поток се изследва при 280 nm. Избрани фракции се подлагат на аналитична HPLC и желаните фракции се събират и отново се пречистват, като се използват същата колона и условия, както по-горе, но с незначително различен градиент на ацетонитрил. Подходящите фракции се събират и лиофилизират, при което се получават 65 mg от инсулиновия аналог, с чистота над 93 %, чрез обратнофазова HPLC. Структурата се изследва чрез аминокиселинен анализ (таблица I) и масспектроскопия (MS).

MS: 5786,1 (теоретично: 5786,7).

Пример 9. Суа(В28),Рго(В29) човешки инсулин.

Осъществява се окисляване с пероксимравчена киселина, за да се превърне цистеинът от октапептида до цистеинова^киселина. Синтетичният октапептид Gly-Phe-Phe-TyrThr-Cya-Pro-Thr (363 mg) се разтваря в 36 ml свежо приготвена пероксимравчена киселина в леденостудена колба и се оставя да се разбърква бавно за 1 h. Окисленият материал се разрежда десетократно с вода и се лиофилизира. Лиофилизатът се използва при полусинтезата.

Свински дезоктапептиден инсулин (222 mg) и синтетичен октапептид Gly-Phe-Phe-TyrThr-Cya-Pro-Thr (225 mg) се комбинират в 18 ml разтвор, съдържащ една част диметилсулфоксид, две части 1,4-бутандиол и една част 0,25М трие буфер с pH 7,3 при 37°С. Прибавя се свински трипсин (45 mg). Разтворът се размесва добре и се разбърква периодично 120 min при 37°С.

В този момент реакцията се прекратява чрез прибавяне на сместа към 242 ml 0,05N НС1. Целият разтвор се пропуска през в 21 х 250 mm С-8 Zorbax колона и продуктите се елуират със слаб градиент на ацетонитрил, в 0,1М натриев моноосновен фосфатен буфер с pH 2.

Подходящите фракции, определени чрез аналитична HPLC, се събират, разреждат се двукратно с вода и се пропускат през 25 х 300 mm С-18 Vydac колона. Обезсоленият протеин се елуира от колоната с ацетонитрил, в 0,5 % трифлуороцетна киселина. Фракциите съдържащи пречистения инсулинов аналог, се събират и лиофилизират, при което се получават 16 mg. Структурата се изследва чрез аминокиселинен анализ (таблица I) и масспектроскопия (MS).

MS: 5831,5 (теоретично: 5831,7).

Пример 10. Gln(B28),Pro(B29) човешки инсулин.

Свински дезоктапептиден инсулин (290 mg) и синтетичен октапептид Gly-Phe-Phe-TyrThr-Gln-Pro-Thr (310 mg) се комбинират в 10 ml разтвор, съдържащ една част диметилсулфоксид, две части 1,4-бутандиол и една част 0,25М трие буфер pH 7,3 при 37°С. Прибавя се свински трипсин (60 mg). Разтворът се размесва добре и се разбърква периодично 60 min при 37°С.

В този момент реакцията се прекратява чрез прибавяне на сместа към 90 ml 0,05N НС1. Целият разтвор се пропуска през 21 х 250 mm С-8 Zorbax колона и продуктите се елуират със слаб градиент на ацетонитрил, в 0,1М натриев моноосновен фосфатен буфер с pH 2.

Подходящите фракции, определени чрез аналитична HPLC, се събират, разреждат се двукратно с вода и се пропускат през 10 х 250 mm С-8 Ultrasphere колона. Обезсоленият протеин се елуира от колоната с ацетонитрил, в 0,5 % трифлуороцетна киселина. Фракциите, съдържащи пречистения инсулинов аналог, се събират и лиофилизират, при което се получават 87 mg. Структурата се изследва чрез аминокиселинен анализ (таблица I) и масспектроскопия (MS).

MS: 5809,4 (теоретично: 5808,6).

Пример 11. Glu(B28),Pro(B29) човешки инсулин.

Свински дезоктапептиден инсулин (402 mg) и синтетичен октапептид Gly-Phe-PheTyr-Thr-Glu-Pro-Thr (398 mg) се комбинират в 14 ml разтвор, съдържащ една част диметилсулфоксид, две части 1,4-бутандиол и една част 0,25М трие буфер с pH 7,3 при 37°С. Прибавя се свински трипсин (80 mg). Разтво рът се размесва добре и се разбърква периодично 120 min при 37°С.

В този момент реакцията се прекратява чрез прибавяне на сместа към 136 ml 0,05N НС1. Целият разтвор се пропуска през 21 х 250 mm С-8 Zorbax колона и продуктите се елуират със слаб градиент на ацетонитрил, в 0,1М натриев моноосновен фосфатен буфер с pH 2.

Подходящите фракции, определени чрез аналитична HPLC, се събират, разреждат се четирикратно с вода и се пропускат през 25 х 300 mm С-18 Vydac колона. Обезсоленият протеин се елуира от колоната с ацетонитрил, в 0,5 % трифлуороцетна киселина. Фракциите, съдържащи пречистения инсулинов аналог, се събират и лиофилизират, при което се получават 59 mg. Структурата се изследва чрез аминокиселинен анализ (таблица I) и масспектроскопия (MS).

MS: 5809,6 (теоретично: 5809,6).

Пример 12. Gly(B28),Pro(B29) човешки инсулин.

Свински дезоктапептиден инсулин (412 mg) и синтетичен октапептид Gly-Phe-Phe-TyrThr-Gly-Pro-Thr (376 mg) се комбинират в 13 ml разтвор, съдържащ една част диметилов сулфоксид, две части 1,4-бутандиол и една част 0,25М трие буфер с pH 7,3 при 37°С. Прибавя се свински трипсин (79 mg). Разтворът се размесва добре и се разбърква периодично 180 min при 37_ОС.

В този момент реакцията се прекратява чрез прибавяне на сместа към 147 ml 0,05N НС1. Целият разтвор се пропуска през 21 х 250 mm С-8 Zorbax колона и продуктите се елуират със слаб градиент ацетонитрил, в 0,1М натриев моноосновен фосфатен буфер с pH 2.

Подходящите фракции, определени чрез аналитична HPLC, се събират, разреждат се четирикратно с вода и се пропускат през 25 х 300 mm С-18 Vydac колона. Обезсоленият протеин се елуира от колоната с ацетонитрил, в 0,1% трифлуороцетна киселина. Фракциите, съдържащи пречистения инсулинов аналог, се събират и лиофилизират, при което се получават 11 mg. Структурата се изследва чрез аминокиселинен анализ (таблица I) и масспектроскопия (MS).

MS: 5737,2 (теоретично:5737,6).

Пример 13. His(B28),Pro(B29) човешки инсулин.

Свински дезоктапептиден инсулин (400 mg) и синтетичен октапептид Gly-Phe-Phe-TyrThr-His-Pro-Thr (398 mg) се комбинират в 13 ml разтвор, съдържащ една част диметилеулфоксид, две части 1,4-бутандиол и една част 0,25М трие буфер с pH 7,3 при 37°С. Прибавя се свински трипсин (79 mg). Разтворът се размесва добре и се разбърква периодично 120 min при 37°С.

В този момент реакцията се прекратява чрез прибавяне на сместа към 237 ml 0,05N НС1. Целият разтвор се пропуска през 21 х 250 mm С-8 Zorbax колона и продуктите се елуират със слаб градиент на ацетонитрил, в 0,1М натриев моноосновен фосфатен буфер с pH 2.

Подходящите фракции, определени чрез аналитична HPLC, се събират, разреждат се четирикратно с вода и се пропускат през 25 х 300 mm С-18 Vydac колона. Обезсоленият протеин се елуира от колоната с ацетонитрил, в 0,1 % трифлуороцетна киселина. Фракциите, съдържащи пречистения инсулинов аналог, се събират и лиофилизират, при което се получават 79 mg. Структурата се изследва чрез аминокиселинен анализ (таблица I) и масспектроскопия (MS).

MS: 5816,9 (теоретично: 5817,7).

Пример 14. 11е(В28),Рго(В29) човешки инсулин.

Свински дезоктапептидов инсулин (409 mg) и синтетичен октапептид Gly-Phe-Phe-TyrThr-Ile-Pro-Thr (398 mg) се комбинират в 13 ml разтвор, съдържащ една част диметилеулфоксид, две части 1,4-бутандиол и една част 0,25М трие буфер с pH 7,3 при 37°С. Прибавя се свински трипсин (81 mg). Разтворът се размесва добре и се разбърква периодично 120 min при 37°С.

Подходящите фракции, определени чрез аналитична HPLC, се събират, разреждат се двукратно с вода и се пропускат през 25 х 300 mm С-18 Vydac колона. Обезсоленият протеин се елуира от колоната с ацетонитрил, в 0,5 % трифлуороцетна киселина. Фракциите, съдържащи пречистения инсулинов аналог, се събират и лиофилизират, при което се получават 57 mg. Структурата се изследва чрез аминокиселинен анализ (таблица I) и масспектроскопия (MS).

MS: 5793,7 (теоретично: 5793,7).

Пример 15. Leu(B28),Pro(B29) човешки инсулин.

Свински дезоктапептиден инсулин (418 mg) и синтетичен октапептид Gly-Phe-Phe-TyrThr-Leu-Pro-Thr (410 mg) се комбинират в 14 ml разтвор, съдържащ една част диметилсулфоксид, две части 1,4-бутандиол и една част 0,25М трие буфер с рН 7,3 при 37°С. Прибавя се свински трипсин (83 mg). Разтворът се размесва добре и се разбърква периодично 120 min при 37°С.

В този момент реакцията се прекратява чрез прибавяне на сместа към 136 ml 0,05 N HCI. Целият разтвор се пропуска през 21 х 250 mm С-8 Zorbax колона и продуктите се елуират със слаб гредиент на ацетонитрил, в 0,1 М натриев моноосновен фосфатен буфер с рН2.

Подходящите фракции, определени чрез аналитична HPLC, се събират, разреждат се двукратно с вода и се пропускат през 25 х 300 mm С18 Vydac колона. Обезсоленият протеин се елуира от колоната с ацетонитрил, в 0,5 % трифлуороцетна киселина. Фракциите, съдържащи пречистения инсулинов аналог, се събират и лиофилизират, при което се получават 74 mg. Структурата се изследва чрез аминокиселинен анализ (таблица I) и масспектроскопия (MS).

MS: 5793,8 (теоретично: 5793,7).

Пример 16. Nle(B28),Pro(B29) човешки инсулин.

Свински дезоктапептиден инсулин (290 mg) и синтетичен октапептид Gly-Phe-Phe-TyrThr-Nle-Pro-Thr (310 mg) се комбинират в 10 ml разтвор, съдържащ една част диметилсулфоксид, две части 1,4-бутандиол и една част 0,25М трие буфер с рН 7,3 при 37°С. Прибавя се свински трипсин (60 mg). Разтворът се размесва добре и се разбърква периодично 60 min при 37°С.

В този момент реакцията се прекратява чрез прибавяне на сместа към 90 ml 0,05N HCI. Целият разтвор се пропуска през 21 х 250 mm С-8 Zorbax колона и продуктите се елуират със слаб градиент на ацетонитрил, в 0,1М натриев моноосновен фосфатен буфер с рН 2.

Подходящите фракции, определени чрез аналитична HPLC, се събират, разреждат се двукратно с вода и се пропускат през 10 х 250 mm С-8 Ultrasphere колона. Обезсоленият протеин се елуира от колоната с ацетонитрил, в 0,5 % трифлуороцетна киселина. Фракциите, съдържащи пречистения инсулинов аналог, се събират и лиофилизират, при което се получават 54 mg. Структурата се изследва чрез аминокиселинен анализ (таблица I) и масспектроскопия (MS).

MS: 5794,6 (теоретично: 5793,7).

Пример 17. D-Lys(B29) човешки инсулин.

Свински дезоктапептиден инсулин (392 mg) и синтетичен октапептид Gly-Phe-Phe-TyrThr-Pro-D-Lys-Thr (387 mg) се комбинират в 13 ,5 ml разтвор, съдържащ една част диметилсулфоксид, две части 1,4-бутандиол и една част 0,25М трие буфер с рН 7,3 при 37°С. Прибавя се свински трипсин (78 mg). Разтворът се размесва добре и се разбърква периодично 120 min при 37°С.

В този момент реакцията се прекратява чрез прибавяне на сместа към 136,5 ml 0,05N НС1. Целият разтвор се пропуска през 21 х 250 mm С-8 Zorbax колона и продуктите се елуират със слаб градиент на ацетонитрил, в 0,1М натриев моноосновен фосфатен буфер с рН 2.

Подходящите фракции, определени чрез аналитична HPLC, се събират, разреждат се четирикратно с вода и се пропускат през 25 х 300 mm С-18 Vydac колона. Обезсоленият протеин се елуира от колоната с ацетонитрил, в 0,5 % трифлуороцетна киселина. Фракциите, съдържащи пречистения инсулинов аналог, се събират и лиофилизират, при което се получават 94 mg. Структурата се изследва чрез аминокиселинен анализ (таблица I) и масспектроскопия (MS).

MS: 5809,0 (теоретично: 5808,7).

Пример 18. Met(B28).Pro(B29) човешки инсулин

Свински дезоктапептиден инсулин (350 mg) и синтетичен октапептид Gly-Phe-PheTyr-Thr-Met-Pro-Thr (366 mg) се комбинират в 12 ml разтвор, съдържащ една част диметилсулфоксид, две части 1,4-бутандиол и една част 0,25М трие буфер с рН 7,3 при 37°С. Прибавя се свински трипсин (71 mg). Разтворът се размесва добре и се разбърква периодично 120 min при 37°С.

В този момент реакцията се прекратява чрез прибавяне на сместа към 118 ml 0,05N HCI. Целият разтвор се пропуска през 21 х 250 mm С-8 Zorbax колона и продуктите се елуират със слаб градиент на ацетонитрил, в 0,1М натриев моноосновен фосфатен буфер с рН 2.

Подходящите фракции, определени чрез аналитична HPLC, се събират, разреждат се четирикратно с вода и се пропускат през 25 х 300 mm С-18 Vydac колона. Обезсоленият протеин се елуира от колоната с ацетонитрил в 0,1% трифлуороцетна киселина. Фракциите, съдържащи пречистения инсулинов аналог, се събират и лиофилизират, при което се получават 72 mg. Структурата се изследва чрез аминокиселинен анализ (таблица 1) и масспектроскопия (MS).

MS: 5811,8 (теоретично: 5811,7).

Пример 19. Огп(В28)= Рго(В29) човешки инсулин

Свински дезоктапептиден инсулин (290 mg) и синтетичен октапептид Gly-Phe-Phe-TyrThr-Orn-Pro-Thr (310 mg) се комбинират в 10 ml разтвор, съдържащ една част диметилсулфоксид, две части 1,4-бутандиол и една част 0,25М трие буфер с рН 7,3 при 37°С. Прибавя се свински трипсин (60 mg). Разтворът се размесва добре и се разбърква периодично 90 min при 37°С.

В този момент реакцията се прекратява чрез прибавяне на сместа към 90 ml 0,05N HCI. Целият разтвор се пропуска през 21 х 250 mm С-8 Zorbax колона и продуктите се елуират със слаб градиент ацетонитрил, в 0,1М натриев моноосновен фосфатен буфер с рН 2.

Подходящите фракции, определени чрез аналитична HPLC, се събират, разреждат се двукратно с вода и се пропускат през 10 х 250 mm С-8 Ultrasphere колона. Обезсоленият протеин се елуира от колоната с ацетонитрил, в 0,5 % трифлуороцетна киселина. Фракциите, съдържащи пречистения инсулинов аналог, се събират и лиофилизират, при което се получават 89 mg. Структурата се изследва чрез аминокиселинен анализ (таблица 1) и масспектроскопия (MS).

MS:5795,2 (теоретично: 5794,7).

Пример 20. Phe(B28). Рго(В29) човешки инсулин

Свински дезоктапептиден инсулин (290 mg) и синтетичен октапептид Gly-Phe-Phe-TyrThr-Phe-Pro-Thr (310 mg) се комбинират в 10 ml разтвор, съдържащ една част диметилеулфоксид, две части 1,4-бутандиол и една част 0,25М трие буфер с рН 7,3 при 37°С. Прибавя се свински трипсин (60 mg). Разтворът се размесва добре и се разбърква периодично 80 min при 37°С.

В този момент реакцията се прекратява чрез прибавяне на сместа към 90 ml 0,05N HCI. Целият разтвор се пропуска през 21 х 250 mm С-8 Zorbax колона и продуктите се елуират със слаб градиент на ацетонитрил, в 0,1 М натриев моноосновен фосфатен буфер с рН 2.

Подходящите фракции, определени чрез аналитична HPLC, се събират, разреждат се четирикратно с вода и се пропускат през 25 х 300 mm С-8 Vydac колона. Обезсоленият протеин се елуира от колоната с ацетонитрил, в 0,1 % трифлуороцетна киселина. Фракциите, съдържащи пречистения инсулинов аналог, се събират и лиофилизират, при което се получават 17 mg. Структурата се изследва чрез аминокиселинен анализ (таблица 1) и масспектроскопия (MS).

MS:5827,9 (теоретично: 5827,7).

Пример 21. Рго(В29) човешки инсулин

Свински дезоктапептиден инсулин (339 mg) и синтетичен октапептид Gly-Phe-Phe-TyrThr-Pro-Pro-Thr (363 mg) се комбинират в 9 ml разтвор, съдържащ една част диметилеулфоксид, две части 1,4-бутандиол и една част 0,25 М трие буфер с рН 7,3 при 37°С. Прибавя се свински трипсин (70 mg). Разтворът се размесва добре и се разбърква периодично 80 min при 37°С.

В този момент, реакцията се прекратява чрез прибавяне на сместа към 108 ml 0,05N НС1. Целият разтвор се пропуска през 10 х 250 mm С-8 Zorbax колона и продуктите се елуират със слаб градиент на ацетонитрил, в 0,1М натриев моноосновен фосфатен буфер с рН 2.

Подходящите фракции, определени чрез аналитична HPLC, се събират, разреждат се двукратно с вода и се пропускат през 10 х 250 mm С-8 Ultrasphere колона. Обезсоленият протеин се елуира от колоната с ацетонитрил, в 0,5 % трифлуороцетна киселина. Фракциите, съдържащи пречистения инсулинов аналог, се събират и лиофилизират, при което се получават 97 mg. Структурата се изследва чрез аминокиселинен анализ (таблица 1) и масспектроскопия (MS).

MS: 5778,6 (теоретично: 5777,6).

Пример 22. Ser(B28). Рго(В29) човешки инсулин

Свински дезоктапептиден инсулин (412 mg) и синтетичен октапептид Gly-Phe-Phe-TyrThr-Ser-Pro-Thr (390 mg) се комбинират в 13 ml разтвор, съдържащ една част диметилеулфоксид, две части 1,4-бутандиол и една част

0,25М трие буфер е pH 7,3 при 37°С. Прибавя се свински трипсин (80 mg). Разтворът се размесва добре и се разбърква периодично 120 min при 37°С.

В този момент реакцията се прекратява чрез прибавяне на сместа към 137 ml 0,05N HCI. Целият разтвор се пропуска през 21 х 250 mm С-8 Zorbax колона и продуктите се елуират със слаб градиент на ацетонитрил, в 0,1М натриев моноосновен фосфатен буфер с pH 2.

Подходящите фракции, определени чрез аналитична HPLC, се събират, разреждат се двукратно с вода и се пропускат през 25 х 300 mm С-18 Vydac колона. Обезсоленият протеин се елуира от колоната с ацетонитрил, в 0,5 % трифлуороцетна киселина. Фракциите, съдържащи пречистения инсулинов аналог, се събират и лиофилизират, при което се получават 37 mg. Структурата се изследва чрез аминокиселинен анализ (таблица 1) и масспектроскопия (MS).

MS: 5768,1 (теоретично: 5767,6).

Пример 23. Thr(B28).Pro(B29) човешки инсулин.

Свински дезоктапептиден инсулин (437 mg) и синтетичен октапептид Gly-Phe-Phe-TyrThr-Thr-Pro-Thr (420 mg) се комбинират в 14,5 ml разтвор, съдържащ една част диметилсулфоксид, две части 1,4-бутандиол и една част 0,25М трие буфер с pH 7,3 при 37°С. Прибавя се свински трипсин (86 mg). Разтворът се размесва добре и се разбърква перис^ично 120 min при 37°С.

В този момент реакцията се прекратява чрез прибавяне на сместа към 135,5 ml 0,05N НС1. Целият разтвор се пропуска през 21 х 250 mm С-8 Zorbax колона и продуктите се елуират със слаб градиент на ацетонитрил, в 0,1М натриев моноосновен фосфатен буфер с pH 2.

Подходящите фракции, определени чрез аналитична HPLC, се събират, разреждат се двукратно с вода и се пропускат през 25 х 300 mm С-18 Vydac колона. Обезсоленият протеин се елуира от колоната с ацетонитрил, в 0,5 % трифлуороцетна киселина. Фракциите, съдържащи пречистения инсулинов аналог, се събират и лиофилизират, при което се получават 78 mg. Структурата се изследва чрез аминокиселинен анализ (таблица 1) и масспектроскопия (MS).

MS: 5781,9 (теоретично: 5781,6).

Пример 24. Тгр(В28).Рго(29) човешки ин сулин

Свински дезоктапептиден инсулин (310 mg) и синтетичен октапептид Gly-Phe-Phe-TyrThr-Trp-Pro-Thr (325 mg) се комбинират в 10,5 ml разтвор, съдържащ една част диметилсулфоксид, две части 1,4-бутандиол и една част 0,25М трие буфер с pH 7,3 при 37°С. Прибавя се свински трипсин (64 mg). Разтворът се размесва добре и се разбърква периодично 120 min при 37°С.

В този момент реакцията се прекратява чрез прибавяне на сместа към 140 ml 0,05N НС1. Целият разтвор се пропуска през 21 х 250 mm С-8 Zorbax колона и продуктите се елуират със слаб градиент ацетонитрил, в 0,1М натриев моноосновен фосфатен буфер с pH 2.

Подходящите фракции, определени чрез аналитична HPLC, се събират, разреждат се двукратно с вода и се пропускат през 25 х 300 mm С-18 Vydac колона. Обезсоленият протеин се елуира от колоната с ацетонитрил, в 0,5 % трифлуороцетна киселина. Фракциите, съдържащи пречистения инсулинов аналог, се събират и лиофилизират, при което се получават 47 mg. Структурата се изследва чрез аминокиселинен анализ (таблица 1) и масспектроскопия (MS).

MS: 5866,2 (теоретично: 5866,7).

Пример 25. Туг(В28).Рго(29) човешки инсулин

Свински дезоктапептиден инсулин (391 mg) и синтетичен октапептид Gly-Phe-Phe-TyrThr-Tyr-Pro-Thr (400 mg) се комбинират в 13 ml разтвор, съдържащ една част диметилсулфоксид, две части 1,4-бутандиол и една част 0,25М трие буфер с pH 7,3 при 37°С. Прибавя се свински трипсин (79 mg). Разтворът се размесва добре и се разбърква периодично 120 min при 37°С.

В този момент реакцията се прекратява чрез прибавяне на сместа към 137 ml 0.05N НС1. Целият разтвор се нагнетява в 21 х 250 mm С-8 Zorbax колона и продуктите се елуират със слаб градиент на ацетонитрил, в 0,1М натриев моноосновен фосфатен буфер с pH 2.

Подходящите фракции, определени чрез аналитична HPLC, се събират, разреждат се двукратно с вода и се пропускат през 25 х 300 mm С-18 Vydac колона. Обезсоленият протеин се елуира от колоната с ацетонитрил, в 0,5 % трифлуороцетна киселина. Фракциите, съдържащи пречистения инсулинов аналог, се събират и лиофилизират, при което се получават 30 mg. Структурата се изследва чрез аминокиселинен анализ (таблица 1) и масспектроскопия (MS).

MS: 5843,7 (теоретично: 5843,7).

Пример 26. Val(B28).Pro(29) човешки инсулин

Свински дезоктапептиден инсулин (400 mg) и синтетичен октапептид Gly-Phe-Phe-TyrThr-Val-Pro-Thr (383 mg) се комбинират в 12 ml разтвор, съдържащ една част диметилсулфоксид, две части 1,4-бутандиол и една част 0,25М трие буфер с pH 7,3 при 37°С. Прибавя се свински трипсин (78 mg). Разтворът се размесва добре и се разбърква периодично 120 min при 37°С.

В този момент реакцията се прекратява чрез прибавяне на сместа към 238 ml 0,05N НС1. Целият разтвор се пропуска през 21 х 250 mm С-8 Zorbax колона и продуктите се елуират със слаб градиент на ацетонитрил, в 0,1М натриев моноосновен фосфатен буфер с pH 2.

Подходящите фракции, определени чрез аналитична HPLC, се събират, разреждат се четирикратно с вода и се пропускат през 25 х 300 mm С-18 Vydac колона. Обезсоленият протеин се елуира от колоната с ацетонитрил, в 0,1 % трифлуороцетна киселина. Фракциите, съдържащи пречистения инсулинов аналог, се събират и лиофилизират, при което се получават 74 mg. Структурата се изследва чрез аминокиселинен анализ (таблица 1) и^асспектроскопия (MS).

MS: 5780,0 (теоретично: 5779,6).

Пример 27. Nva(B28).Pro(B29) човешки инсулин

Свински дезоктапептиден инсулин (292 mg) и синтетичен октапептид Gly-Phe-Phe-TyrThr-Nva-Pro-Thr (279 mg) се комбинират в 10 ml разтвор, съдържащ една част диметилеулфоксид, две части 1,4-бутандиол и една част 0,25М трие буфер с pH 7,3 при 37°С. Прибавя се свински трипсин (57 mg). Разтворът се размесва добре и се разбърква периодично 120 min при 37°С.

В този момент реакцията се прекратява чрез прибавяне на сместа към 240 ml 0,05N НС1. Целият разтвор се пропуска през 21 х 250 mm С-8 Zorbax колона и продуктите се елуират със слаб градиент на ацетонитрил, в 0,1М натриев моноосновен фосфатен буфер с pH 2.

Подходящите фракции, определени чрез аналитична HPLC, се събират, разреждат се двукратно с вода и се пропускат през 25 х 300 mm С-18 Vydac колона. Обезсоленият протеин се елуира от колоната с ацетонитрил, в 0,5 % трифлуороцетна киселина. Фракциите, съдържащи пречистения инсулинов аналог, се събират и лиофилизират, при което се получават 51 mg. Структурата се изследва чрез аминокиселинен анализ (таблица 1) и масспектроскопия (MS).

MS: 5780,0 (теоретично: 5779,6).

Пример 28.

Като се използват процедурите, описани по-горе, се получават следните допълнителни инсулинови аналози:

а) Asp(Bl), Lys(B28), Рго(В29) човешки инсулин

б) дез(РЬе-В1), Lys(B28), Рго(В29) човешки инсулин

в) дез(РЬе-В1), Asp(BlO), Lys(B28), Pro (В29) човешки инсулин

г) дез(РЬе-В1, Val-B2), Lys(B28), Pro (В29) човешки инсулин

д) дез(РЬе-В1, Val-B2), Asp(BlO), Lys (В28), Рго(В29) човешки инсулин

е) Gly(A21), Asp(BlO), Lys(B28), Pro (B29) човешки инсулин

ж) А1а(А21), Asp (В 10), Lys(B28), Pro (В29) човешки инсулин

з) дез(ТЬг-ВЗО), Lys(B28), Рго(В29) човешки инсулин

и) Asp (В 10), Arg(B28), Рго(В29) човешки инсулин

к) А1а(А21), Arg(B28), Рго(В29) човешки инсулин

л) Asp(Bl), Arg(B28), Рго(В29) човешки инсулин

Пример 29. Lys(B28). Рго(В29) човешки инсулин

Конструиране на рекомбинантни вектори и Гостоприемници

А. Конструиране на плазмид pCZR126S

1. Изолиране на плазмид рКС283

Получени са лиофилизирани E.coli К12 ВЕ1201/рКС283 от Northern Research Laboratory, Peoria, Illinois 61604 c каталожен номер NRRL B-15830. Лиофилизатът се декантира в епруветки, съдържащи 10 ml среда LB(10g Bacto-триптон, 5 g Bacto-дрождев екстракт и 10 g NaCl на литър; pH се довежда до 7,5), и се инкубират в продължение на 2 h при 32°С, след което към културите се прибавя ампици лин (50 pg/ml) и се инкубират при 32°С за цяла нощ. Клетки от Е. coli К12 BE 1201/ рКС283 се култивират при 32°С, тъй като клетките съдържат температурночувствителен cl репресорен ген, интегриран в клетъчната ДНК. Когато клетки, които съдържат див тип ламбда pL репресорен ген или не съдържат ламбда pL промотор, се използват в този процес на изолиране на плазмид, както е описано в следващите примери, температурата на инкубиране е 37°С.

Малко количество от културата, престояла цяла нощ, се посява върху петрита с LBагар (LB среда с 15 g/1 Bacto-arap), съдържащ 50 gg/ml ампицилин, с цел да се получи единична колония, изолирана от Е. coli К12 ВЕ1201/ рКС283. Получената единична колония се инокулира в 10 ml LB среда, съдържаща 50 p.g/ml ампицилин и се инкубира цяла нощ при 32°С, при интензивно разбъркване. 10-милилитровата култура, престояла цяла нощ, се инокулира в 500 ml LB среда, съдържаща 50 pg/ml ампицилин и се инкубира при 32°С, при интензивно разбъркване, докато културата достигне стационарна фаза.

Следващата процедура е приспособена от Maniatis et al, 1982, Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory).

Клетките се събират чрез центрофугиране (4000 g, за 10 min, при 4°С) и супернатантата се отделя. Клетъчната плътна утайка се промива в 100 ml леденостуден STE буфер (0,1М NaCl; 10 mM mpuc-HCl, pH 7,8; u 1 тМ EDTA). След промиването клетъчната утайка се ресуспендира в 10 ml разтвор 1 (50 тМ глюкоза, 25 тМ трис-HCl, pH 8,0; и 10 тМ EDTA), съдържащ 5 mg/ml лизозим и се оставя при стайна температура за 10 min. След това към лизозимтретираните клетки се прибавят 20 ml от разтвор 2 (0,2N NaOH u 1 % SDS) и разтворът се подлага на внимателно инверсионно разбъркване. Сместа се инкубира върху лед за 10 min.

След това към клетъчния лизат се прибавя 15 ml леденостуден 5М калиев ацетат с pH 4,8 и разтворът се подлага на инверсионно разбъркване. Разтворът се инкубира върху лед за 10 min. Разтворът на 5М калиев ацетат се получава чрез прибавяне на 11,5 ml ледена оцетна киселина към 28,5 ml вода и 60 ml 5М калиев ацетат; полученият разтвор е ЗМ по отношение на калия и 5М по отношение на ацетата.

Клетъчният лизат се центрофугира на Beckman SW27 (или неин еквивалент) при 20000 об./min за 20 min при 4°С. Клетъчната ДНК и отломките образуват плътна утайка на дъното на епруветката. Получават се около 36 ml супернатанта, към която се прибавят 0,6 обема изопропанол, смесват се и полученият разтвор се оставя при стайна температура за 15 min. Плазмидната ДНК се отделя чрез центрофугиране (12000 g, за 30 min, при стайна температура). Супернатантата се отделя и утаената ДНК се промива с 70 % етанол при стайна температура. Промивният етанол се декантира и утайката се изсушава във вакуумен десикатор. След това утайката се ресуспендира в 8 ml ТЕ буфер (10 тМ трис-HCl, pH 8,0 u 1 mM EDTA).

Осем грама CsCl се прибавят към ДНК разтвора. Около 0,8 ml воден разтвор на етидиев бромид (10 mg/ml) се прибавя на всеки 10 ml разтвор на CsCl-DNA. Крайната концентрация на разтвора е около 1,55 g/ml, а концентрацията на етидиевия бромид е около 600 pg/ml. Разтворът се прехвърля в центрофужна епруветка Beckman Type 50, допълва се до горе с парафиново масло, запечатва се и се центрофугира при 45000 об./min за 24 h, при 20°С. След центрофугиране на обикновена светлина се виждат две ивици ДНК. След сваляне на капачката на епруветката долната ивица ДНК се отделя, като се използва спринцовка с хиподермична игла *21, вкарана през стената на ценрофужната епруветка.

Етидиевият бромид се отделя чрез неколкократни екстракции с наситен воден 1бутанол. CsCl се отделя чрез диализа срещу ТЕ буфер. След екстракция с буфериран фенол и след това с хлороформ ДНК се утаява, промива се с 70 % етанол и се изсушава. Получава се около 1 mg плазмид рКС283 и се съхранява при 4°С в ТЕ буфер, при концентрация от около 1 pg/ml. Рестрикционният сайт и функционалната карта на плазмид рКС283 са представени на фиг. 1, приложена към описанието.

2. Конструиране на плазмид рКС283РХ.

Около 10 ml от плазмидна рКС283 ДНК, получена в пример 1, се смесват с 20 ml 10 X средно-солев рестрикционен буфер (500 тМ NaCl; 100 тМ трие НС1, pH 7,5; 100 тМ MgCl₂; и 10 тМ DTT), 20μΐ 1 mg/ml BSA (RCA), 5μ1 рестрикционен ензим Pvull (- 50 единици, как то е определено от Bethesda Research Laboratories (BRL), откъдето се получават всички използвани тук рестрикционни ензими) и 145 1 вода, като реакцията се провежда при 37°С за 2 h. Описаните тук рестрикционно-ензимни реакции обикновено завършват чрез фенолна и след това хлороформна екстракция, последвана от утаяване на ДНК, промиване с етанол и ресуспендиране на ДНК в ТЕ буфер. След завършване на описаното по-горе Pvull смилане, Pvull смляната плазмидна рКС283 ДНК се утаява и след това ресуспендира в 5 μΐ ТЕ буфер.

Около 600 пикомола (рМ) Xhol линкери (5'-CCTCGAGG-3') се подлагат на действието на киназа в смес, съдържаща 10 μΐ 5 X киназен буфер (300 тМ трие НС1,рН 7,8; 50 тМ MgCl₂; и 25 тМ DTT), 5 μΐ 5 тМ АТФ, 24 μΐ Н₂О, 0,5 μΐ Т4 полинуклеотидкиназа (около

2,5 единици, както е определено от P-L Biochemicals), 5 μΐ 1 mg/ml BSA u 5 μΐ 10 mM спермидин, като сместа се инкубира при 37°С за 30 min.

Около 12,5 μΐ от подложените на действието на киназа Xhol линкера се прибавят към 5 μΐ на Pvull-смляна плазмидна рКС283 ДНК и след това към ДНК-το се прибавят 2,5 μΐ 10 X лигазен буфер (300 тМ трис-HCl, pH 7,6; 100 mM MgCl₂; и 50 тМ DTT), 2,5 μΐ 1 mg/ml BSA, (RCA) 7 μΐ mM АТФ, 2,5 μΐ (около 2,5 единици, както са определени от P-L Biochemicals) Т4 ДНК лигаза, 2,5 ml 10 mM спермидин и 3 μΐ вода. Реакцията нгГ лигиране се провежда при 4°С за цяла нощ. След лигазната реакцията съставът на реакционната смес се довежда до този на високосолеви буфер (0,1 М NaCl; 0,05М трис-HCl, pH 7,5; 10,0 тМ MgCI₂; u 1 тМ DTT). Към сместа се прибавя около 10 μΐ (100 единици) от рестрикционния ензим Xhol и реакцията се провежда при 37°С за 2 h. След реакцията завършване на Xhol смляната ДНК се утаява, ресуспендира, и се лигира, както е описано по-горе, с изключение на това, че не се прибавят Xhol линкери към сместа за лигиране. Лигираната ДНК представлява желаният плазмид рКС283РХ. Рестрикционният сайт и функционалната карта на плазмид рКС283РХ са представени на фиг. 2 от приложените фигури.

3. Конструиране на Е. coli Κ12ΜΟ(λ+)/ рКС283РХ

Е. coli К12 МО (λ +) може да бъде получен от Northern Regional Research Laboratories в лиофилизирана форма, с каталожен номер NRRL В-15993. Е. coli К12 ΜΟ(λ+) съдържа див тип ламбда pL cl репресорен ген, така че в клетките Е. coli К12 МО (λ +) не се извършва транскрибция от хибридния pL-lpp промотор, съгласно изобретението. Лиофилизирани клетки се съживяват, изолират се единични колонии от МО (λ +) и се приготвя 10 ml престояла цяла нощ култура от клетките МО (λ +) в съответствие с процедурата от пример 29А1, с изключение на това, че температурата на инкубиране е 37°С и не се използва ампицилин в растежната среда.

μΐ от престоялата цяла нощ култура се използват за инокулиране на 5 ml LB среда, която също съдържа 10 mM MgSO₄ и 10 тМ MgCl₂. Културата се инкубира при 37°С за цяла нощ, като се разбърква интензивно. На следващата сутрин културата се разрежда до 200 ml с LB среда, съдържаща 10 mM MgSO₄ и 10 тМ MgClj. Разредената култура се инкубира при 37°С, като се разбърква интензивно, докато абсорбцията при 550 nm (A_JJ0) не достигне 0,5, което показва клетъчна плътност около 1 х 10’ клетки/ml. Културата се охлажда за lOrnin в ледена баня и клетките се събират чрез центрофугиране (4000 g, за 10 min, при 4°С). Клетъчната плътна утайка се ресуспендира в 100 ml 10 mM студен MgSO₄ и веднага след това отново се утаява чрез центрофугиране. Клетъчната утайка се ресуспендира в 100 ml 30 mM СаС1₂ и се инкубира (престоява) върху лед, за 20 min.

Клетките отново се събират чрез ценрофугиране и се ресуспендират в 10 ml 30 mM СаС1₂, Половин ml аликвотна част клетки се прибавя към лигираната ДНК, получена в пример 29А2; получена е концентрация на ДНК 30 тМ в СаС1₂. Сместа на клетъчна ДНК се инкубира (престоява) върху лед за половин час, загрява се шоково при 42°С, за 90 s и след това се изстудява върху лед за около 2 min. Сместа на клетъчна ДНК се разрежда в 10 ml LB среда в 125 милиметрови колби и се инкубира при 37°С за 1 h. 100 μΐ аликвотни части се появяват в петрита с LB-arap, съдържащ ампицилин, и се инкубират при 37°С, до поява на колонии. Колониите се култивират индивидуално и плазмидната ДНК от отделните колонии се изследва чрез рестрикционен ензимен анализ и гел електрофореза. Изолирането на плазмидната ДНК е в по-слаба степен, в сравнение с метода от пример 29А1, но се изпуска етапът на градиента на CsCl, докато се идентифицират желаните трансформирани Е. coll К12 МО(Х+)/рКС283РХ. Рестрикционният сайт и функционалната карта на плазмид рКС283РХ са представени на фиг.2, приложена в описанието.

4. Конструиране на Е. coli К12 ΜΟ(λ+)/ PKC283-L рКС283РХ 10 pg плазмидна ДНК, получен в съответствие с метода от пример 29А1, се разтваря в 20 ml 10Х високосолеви буфер, 20 ц1 1 mg/ml BSA, 5 μΐ (-50 единици) рестрикционен ензим Bglll, 5 μΐ (-50 единици) рестрикционен ензим Xhol и 150 μΐ вода, като реакцията се осъществява при 37°С за 2 h. Реакцията се спира и след утаяване на смляната с BglllXhol ДНК, тя се ресуспендира в 5 μΐ ТЕ буфер.

Синтезира се и се подлага на действието на кинази ДНК линкер с едноверижни краища на ДНК, характерни за Bglll u Xhol рестрикционно ензимно разцепване. Линкерът се подлага на действието на кинази в съответствие с метода от пример 29А2. ДНК линкерът има следната структура:

5’-GATCTATTAACTCAATCTAGAC-3' IIIIIIIIIIIIIIIIII

3'-ATAATTGAGTTAGATCTGAGCT-5'

Линкерът, изобразен по-горе, се синтезира от едноверижни дезоксиолигонуклеотиди по методи, добре известни от нивото на техниката. Едноверижните дезоксиолигонуклеотиди могат да бъдат синтезирани с търговско достъпни средства, такива като 380А ДНК синтезатор, разпространяван от Applied Biosystems (850 Lincoln Centre Drive, Foster City, CA 94404), при който се използват фосфорамидите. В нивото на техниката са известни и други методи за синтезиране на ДНК. Конвенционалният модифициран фосфотриестерен метод за синтезиране на едноверижна ДНК е описан в Itakura и^др., 1977, Science 198:1056 и в Сгеа и др., 1978, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 75:5765. Също така особено предпочитан метод за синтез на ДНК е описан в Hsiung и др., 1983, Nucleic Acid Research 11:3227 и Narang и др., 1980, Methods in Enzymology 68:90.

Линкерът и BglII-XhoI-смления плазмид рКС283РХ се лигират в съответствие с метода от пример 29А2. Лигираната ДНК представлява желания плазмид pKC283-L. Рестрикцион ният сайт и функционалната карта на плазмид pKC283-L са представени на фигура 3 от приложените фигури. pKC283-L плазмидна ДНК се използва за трансформиране на Е. coli К12 ΜΟ(λ+) и получените трансформирани Е. coli К12 ΜΟ(λ +)/pKC283-L се идентифицират в съответствие с метода от пример 29АЗ.

5. Конструиране на Е. coli К12 МО (λ +)/pKC283-LB

Около 10 pg pKC283-L плазмидна ДНК, получена в съответствие с метода от пример 29А1 се разтваря в 20 μΐ 10 X високо-солеви буфер, 20 μΐ 1 mg/ml BSA, 5 μΐ (-50 единици) рестрикционен ензим Xhol и 155 μΐ вода и реакцията се провежда при 37°С за 2 h. След това Xljol-смляната pKC283-L плазмидна ДНК се утаява от реакционната смес чрез прибавяне на три обема 95 % етанол и 0,1 обем ЗМ натриев ацетат, инкубира се в сух леден етанол, за 5 min и се центрофугира. Получената плътна утайка на ДНК се промива със 70 % етанол, изсушава се и се ресуспендира в 2 μΐ nick-транслационен буфер (0,5М трис-HCl, pH 7,2; 0,1М MgSO₄; u 1 mM DTT), 1 μΐ 2 тМ разтвор във всеки от дезоксинуклеотидните трифосфати, 15 μΐ вода, 1 μΐ (-6 единици, както е описан от P-L Biochemicals) от Klenow, който е основният фрагмент от Е. coli ДНК полимераза I и 1 μΐ mg/ml BSA. Получената реакционна смес се инкубира при 25°С за 30 min, реакцията се спира чрез поставяне на разтвора при 70° за 5 min.

BamHI линкери (5'-CGGGATCCCG-3') се подлагат на действието на кинази и лигират към Xhol-смляна и обработен с Klenow плазмидна pKC283-L ДНК в съответствие с метода от пример 29А2. След лигирането ДНК се смила с около 100 единици BamHI за около h, при 37°С, във високосолеви буфер. След BamHI смилането ДНК се приготвя за лигиране в съответствие с метода от пример 29А2.

-5,9 kb BamHI рестрикционен фрагмент се привежда в кръгова форма чрез лигиране и се трансформира в Е. coli К12 ΜΟ(λ +) в съответствие с методите от примери 29А2 и 29АЗ. Идентифицират се трансформанти Е. coli К12 МО (λ +)/pKC283-LB след което се приготвя плазмидна pKC283-LB ДНК в съответствие с метода от пример 29А1. Рестрикционният сайт и функционалната карта на плазмид рКС283LB са представени на фигура 4 от приложените фигури.

6. Конструиране на Е. coli К12 МО (λ +)/ pL32

Около 10 pg плазмид pKC283PX се смила с рестрикционен ензим Sall във високо-солеви буфер, третира се с Klenow и се лигира към EcoRl линкер (5'-GAGGAATTCCTC-3') в съответствие с метода от пример 29А5, с изключение на използваните изходен плазмид, рестрикционни ензими и линкери. След смилане с рестрикционен ензим EcoRl, което води до изрязване на -2.1 kb от ДНК, -4,0 kb EcoRl рестрикционният фрагмент се привежда в кръгова форма чрез лигиране, за да се получи плазмид pKC283PRS. Лигираната ДНК се използва за трансформиране на Е. coli К12 ΜΟ(λ+) в съответствие с метода от пример 29АЗ. След идентифициране на Е. coll К12 MO(X+)/pKC283PRS трансформантите, плазмидната pKC283PRS ДНК се получава в съответствие с метода от пример 29А1. Рестрикционният сайт и функционалната карта на плазмид pKC283PRS са представени на фигура 5, приложена към описанието. Около 10 pg плазмид pKC283PRS се смилат в 200 μΐ високо-солеви буфер с около 50 единици от всеки рестрикционен ензим PstI u Sphl. Реакционната смес престоява при 37°С, за около 2 h, след което се подлага на електрофореза върху 0,6 % агарозен гел, желиращ при ниска температура (FMC Corporation, Marine Colloids Division, Rockland, Maine 04841), за 23 h при -130 V u -75 mA в трис-ацетатен буфер.

Гелът се оцветява в разреден разтвор на етидиев бромид и ДНК веригата,^представляваща -0,85 kb Pstl-SphI рестрикционен фрагмент, която е визуализирана с дълговълнова UV светлина, се изрязва като малък сегмент от гела. Обемът на сегмента се определя чрез теглото и плътността му и към епруветката, съдържаща сегмента се прибавя еквивалентен обем 10 тМ трис-HCl с pH 7,6. След това сегментът се разтопява при 72°С. Около 1 pg от -0,85 kb Pstl-SphI рестрикционен фрагмент от плазмид pKC283PRS се получава в обем от около 100 μΐ. По аналогичен начин, плазмид pKC283-LB се смила с рестрикционни ензими PstI u Sphl и полученият -3,0 kb рестрикционен фрагмент се изолира чрез агарозна гел електрофореза и се приготвя за лигиране.

-0,85 kb Pstl-SphI рестрикционен фрагмент на плазмид pKC283PRS се лигира с -3,0 kb Pstl-SphI рестрикционен фрагмент на плазмид pKC283-LB в съответствие с метода от пример 29А2. Лигираната ДНК представлява желаният плазмид pL32. Рестрикционният сайт и функционалната карта на плазмид pL32 са представени на фигура 6, приложена към описанието. Плазмидът pL32 се трансформира в Е. coli К12 МО (λ +) клетки в съответствие с метода от пример 29АЗ. Плазмидна pL32 ДНК се получава от трансформираните Е. coli К12 МО (λ +)/pL32 в съответствие с метода от пример 29А1. Анализът на плазмидната pL32 ДНК показва, че към третираните с Klenow, Sall краища на плазмид рКС283РХ са прикрепени повече от един EcoRl линкер. Присъствието на повече от един EcoRl линкер не влияе на полезността на плазмид pL32 или неговите производни и може да е установено чрез присъствието на Xhol рестрикционен сайт, който се образува, когато две EcoRl линкера се лигират заедно. Алтернативно плазмид pL32 може да бъде конструиран чрез осъществяване на Sall-EcoRI изрязване и лигиране на плазмид pKC283-LB, в съответствие с първи абзац на този пример.

7. Конструиране на Е. coli К12 МО (λ +)/pL47

Е. coli К12 RV308/pNM789 могат да бъдат получени от Northern Regional Research Laboratories в лиофилизирана форма, с каталожен номер NRRL В-18216. Рестрикционният сайт и функционалната карта на плазмид pNM789 са представени на фигура 7 от приложените фигури. Плазмидната ДНК се екстрахира от културата в съответствие с посоченото в пример 1, с изключение на това, че се инкубира при 37°С. 10 pg pNM789 се суспендира в 200 μΐ PvuII буфер (50 mM трис-HCl (pH 7,5), 60 mM NaCl u 6 тМ MgCl₂). Прибавя се една единица PvuII и реакционната смес престоява 5 min при 37°С. Ензимът се инактивира чрез загряване 10 min, при 65°С. След това се прибавят 30 μΐ 10Х BamHI буфер (200 mM трисHCl (pH 8,0), IM NaCl и 70 mM MgCl₂), 70 μΐ вода и 10 единици BamHI и реакционната смес се инкубира 1 h при 37°С. След това се прибавят 5 единици алкална фосфатаза и се инкубира 1 h при 65°С. ДНК фрагментите се разделят върху един процент агарозен гел и ДНК фрагмент (фигура 8) с размер на фрагмент с единично срязване се пречиства.

ДНК линкер с леплив край и BamHI край се синтезира в съответствие с посоченото в пример 29А4. Този линкер, показан на 118 позиция във фигура 8, има следната структура:

5'-CTGTGCCTTCTAG-3’

I I III 11111 I

3'-GACACGGAAGATCCTAG-5’

Линкерът се подлага на действието на кинази и се лигира към BamHI-PvuII смления плазмид pNM789 в съответствие с описаното в пример 29А2. Тази смес за лигиране се използва за трансформиране на Е. coli К12 RV308 клетки и се осъществява изолиране на плазмида в трансформантите, в съответствие с посоченото в пример 29АЗ. Избират се няколко плазмида, които съдържат подходящия размер PvuII фрагмент (494Ьр-двойки бази) и XbalBamHI фрагмент (628 bp). Последователността на най-малко два от тях се определя чрез секвениране от BamHI сайта към уникалния Smal сайт, като се избира една от тях с желаната последователност. Този междинен плазмид е означен като плазмид 120. Схематично описание на тази процедура и рестрикционният сайт и функционална карта на плазмид 120 са представени на фиг. 8 от приложените фигури. За да се изолира EK-BGH-кодираща ДНК, около 10 gg плазмид 120 се смилат в 200 ml високосолеви буфер, съдържащ по около 50 единици от всеки от рестрикционните ензими Xbal и BamHI. Продуктите на смилането се разделят чрез агарозна гел електрофореза и рестрикционният фрагмент -0,6 kb Xbal-BamHl, който кодира EK-BGH, се изолира и приготвя за лигиране в съответствие с метода от пример 29А6.

Плазмид pL32 се смила с рестрикционни ензими Xbal u BamHI и -3,9 kb рестрикционният фрагмент се изолира и подготвя за лигиране. -3,9 kb Xbal-BamHl рестрикционният фрагмент от плазмид pL32 се лигира към -0,6 kb XbalBamHl рестрикционния фрагмент от плазмид 120, в съответствие с метода от пример 29А2, за да се получи плазмид pL47. Рестрикционният сайт и функционалната карта на плазмид pL47 са представени на фиг.9 от приложените фигури. Плазмид pL47 се трансформира в Е. coli К12 ΜΟ(λ+) в съответствие с метода от пример 29АЗ и се идентифицират Е. coli К12 МО (λ +)/pL 47 трансформантите. От трансформантите се получава плазмидна pL47 ДНК в съответствие с методите от пример 29А1.

8. Конструиране на Е. coli К12 RV308/ PPR12AR1

Плазмидът pPR12 се състои от темпера турно чувствителния pL репресорен ген с1857 и от придавания резистентност към тетрациклина плазмиден pBR322 ген. Плазмид pPR12 е описан и патентован в US патент № 4 436 815, публикуван на 13 март 1984. Рестрикционният сайт и функционалната карта на плазмид pPR12 са представени на фигура 10 от приложените фигури.

Около 10 gg от плазмид pPR12 се смилат с около 50 единици от рестрикционния ензим EcoRI в 200 gl високо солеви буфер при 37°С за 2 h. EcoRI смляната плазмидна pPR12 ДНК се утаява и третира с Klenow в съответствие с метода от пример 29А5. След реакцията с Klevow EcoRI смляната, третирана с Klenow плазмцдна pPR12 ДНК, се рециклира чрез лигиране, в достатъчно съответствие с процедурата от пример 29А2. Лигираната ДНК, която съдържа желания плазмид pPR12ARl, се използва за трансформиране на Е. coli К12 RV308, в достатъчно съответствие с процедурата от пример 29АЗ, с изключение на това, че селекцията се базира на резистентност към тетрациклин (5 ug/ml), а не на резистентност към ампицилин. Е. coli К12 RV308 се получават от NRRL под каталожен номер NRRL В-15624. След като се идентифицират Е. coli К12 RV308/ pPR12ARl трансформантите, от тях се получава плазмидна pPR12ARl ДНК в достатъчно съответствие с процедурата от пример 29А11.

Около 10 gg от плазмид pPR12ARl се смилат с около 50 единици рестрикционен ензим Aval в 200 gl средносолеви буфер при 37°С за 2 h. Смляната с Aval плазмидна pPR12ARl ДНК се утаява и третира с Klenow в достатъчно съответствие с процедурата от пример 29А5. След реакцията с Klenow Aval смляната, третирана с Klenow плазмидна pPR12gARl ДНК, се лигира към EcoRI линкери (5'-GAGGAATT ССТС-3') в достатъчно съответствие с процедурата от пример 29А2. След линкерното лигиране ДНК се утаява и след това ресуспендира в около 200 gl високо солеви буфер, съдържащ около 50 единици рестрикционен ензим EcoRI. Реакцията се инкубира при 37°С за около 2 h. След смилането с EcoRI реакционната смес се нанася върху агарозен гел и -5,1 kb EcoRI рестрикционният фрагмент се пречиства в достатъчно съответствие с процедурата от пример 29А6. -5,1 kb EcoRI рестрикционният фрагмент се привежда в кръгова форма, чрез лигиране в достатъчно съответствие с процедурата от пример 29А2. Лигираната ДНК съдържа желания плазмид pPR12ARl. Плазмидната pPR12ARl ДНК се трансформира в Е. coli К12 RV308, в достатъчно съответствие с процедурата от пример 29АЗ, с изключение на това, че селекцията се базира на резистентност към тетрациклин, а не на резистентност към ампицилин. След като се идентифицират Е. coli К12 RV308/pPR12ARl трансформантите, от тях се получава плазмидна pPR12ARl ДНК в достатъчно съответствие с процедурата от пример 29А1. Рестрикционният сайт и функционалната карта на плазмид pPR12ARl са представени на фигура 11 от приложените фигури.

9. Конструиране на Е. coli К12 RV308/ pLllO.

Около 10 gg плазмидна pPR12ARl ДНК се суспендират в около 200 ml високо солеви буфер, съдържащ около 50 единици от всеки от рестрикционните ензими PstI u EcoRl и реакцията на смилане се провежда при 37°С за около 2 h. След това реакционната смес се поставя върху агарозен гел и -2,9 kb Pstl-EcoRI рестрикционния фрагмент от плазмид pPR12ARl се изолира и подготвя за лигиране, в достатъчно съответствие с процедурата от пример 29А6.

Около 10 ug от плазмид pL47 се смилат с рестрикционни ензими PstI u BamHI в 200 μΐ високо солеви буфер при 37°С за 2 h. Смляната с Pstl-BamHI ДНК се поставя върху агарозен гел u -2,7 kb Pstl-BamHI рестрикционният фрагмент, който съдържа кодона за 'начало на репликация, и част от гена, придаващ резистентност към ампицилин, се изолира и подготвя за лигиране в достатъчно съответствие с процедурата от пример 29А6. В отделна реакция около 10 gg от плазмидна pL47 ДНК се смилат с рестрикционни ензими EcoRl u BamHI в 200 gl високо солеви буфер при 37°С за 2 h, и -1,03 kb EcoRI-BamHI рестрикционният фрагмент, който съдържа новата активираща транскрипцията и транслацията последователност и Ek-BGH-кодираща ДНК се изолира и подготвя за лигиране, в достатъчно съответствие с процедурата от пример 29А6. Получените -2 gg от -1,03 kb EcoRI-BamHI рестрикционен фрагмент се използват при конструирането на плазмид pLllO. -2,7 kb Pstl-BamHI u -1,03 kb EcoRI-BamHI рестрикционните фрагменти на плазмид pL47 се лигират към -2,9 kb Pstl-EcoRI рестрикционния фрагмент на плазмид pPRl 2AR1, за да се конструира плазмид pLllO и лигира ната ДНК се използва за трансформиране на Е. coli К12 RV308, в достатъчно съответствие с процедурата от примери 29А2 и 29АЗ, с изключение на това, че селекцията на трансформантите се базира на резистентност към тетрациклин, а не на резистентност към ампицилин. Два сайта за разпознаване на рестрикционен ензим PstI присъстват в EK-BGH кодиращата област, като не са представени в рестрикционния сайт и функционалната карта на приложените фигури. Рестрикционният сайт и функционалната карта на плазмид pLl 10 са представени на фигура 12 от приложените фигури.

10. Конструиране на Е. coli К12 RV308/ pLIOOC

a. Конструиране на Е. coli К12 RV308/ pLllOA

Около 1 gg pLl 10 ДНК плазмидна се смилат с рестрикционен ензим Ndel в 20 gl общ обем, съдържащ 2 gl 10Х високо солеви буфер (1,0М NaCl; 0,50М трис-HCl, рН=7,5; 0,1 ОМ MgCl₂; и 10 mM дитиотреитол) и 3 единици Ndel ензим за един час при 37°С. Реакционната смес се екстрахира с фенол/хлороформ и ДНК се утаява с етанол. Смляната с Ndel плазмидна pLllO ДНК се разтваря в 50 gl IX Klenow буфер (40 mM КРО₄, рН=7,5; 6,6 mM MgCl₂; 1,0 тМ 2-меркаптоетанол; 33 dATP; 33 dCTP; 33 dGTP; u 33 gM TTP), 2 gl(~10 единици, New England Biolabs) от големия фрагмент ДНК-полимераза I на Е. coli, известен като Klenow, се добавят към и се смесват с ДНК, като реакцията се провежда при 16°С за 1 Ь. Реакцията завършва чрез фенолна екстракция и ДНК се пречиства по конвенционален начин. След това смляната с Ndel, третирана с Klenow, ДНК се лигира с Т4 ДНК лигаза при 4°С за 16 h. Получената ДНК се използва за конвенционално трансформиране на Е. coli К12 щам RV308 (NRRL В-15624). Трансформантите се селекционират на петрита с L-arap, съдържащ 100 gg/ml ампицилин и плазмиди, изолирани от резистентни колонии, чрез бърза алкална екстракционна процедура, описана от Bimboim и Doly. Селекционира се плазмид (pLl 10А от фигура 13) без Ndel сайт.

b. Конструиране на фаг pL 110В чрез сайт специфичен мутагенез.

Процедурата за елиминиране на BamHIсайта в придаващия резистентност към тетрациклин ген чрез сайт-специфична мутагенеза е показана в дясната страна на фигура 13 от приложените фигури.

b’(i). Конструиране на фаг М13ТсЗ.

Плазмид pLllO се използва като източник на гена, придаващ резистентност към тетрациклин. Около 50 pg от плазмид pLllO в 50 μΐ ТЕ буфер се прибавят към 25 μ 1 10Х Hindlll u 170 μΐ вода. Около 5 μΐ (-50 единици) от рестрикционен ензим Hindlll се прибавят към разтвор на плазмидна pLllO ДНК и реакцията се провежда при 37°С за 2 h. Около 13 μΐ от 2М трис-HCl, рН=7,4 u 5 ml (~50 единици) от рестрикционен ензим EcoRI се прибавят към Hindlll смляна плазмидна pLllO ДНК и реакционната смес се инкубира за още 2 h при 37°С. Реакцията се прекратява чрез екстракция на реакционната смес с ТЕ-наситен фенол, фенолът се отделя чрез екстракция с хлороформ.След това смляната с EcoRI-Hindlll плазмидна pLllO ДНК се събира чрез утаяване и центрофугиране, нанася се върху 1 % агарозен гел и големият, -4,3 kb EcoRI-Hindlll рестрикционен фрагмент се изолира и пречиства.

Около 5 pg от фаг ml3mpl8(New England Biolabs) се разтварят в 50 μΐ ТЕ буфер и след това се смилат с Hindlll u EcoRI, както е описано по-горе. Срязаната с Hindlll-EcoRI фагова М13тр18 ДНК се пречиства, както е описано за pLl 10, с изключение на това, че -7,25 kb рестрикционният фрагмент се изолира и пречиства.

Около 100 ng от -4,3 kb Hindlll-EcoRI фрагмент от плазмид pLllO се смесва с около 100 ng от -7,25 kb Hindlll-EcoRI фрагмент от фаг М13тр18, 2 μΐ 10Х лигазен буфер, 1 μΐ (-100 единици) Т4 ДНК лигаза и 14μ1 вода. Реакцията на лигиране се провежда при 15°С за 1,5 h; лигираната ДНК съдържа желаната фагова ml3Tc3 ДНК. Рестрикционният сайт и функционалната карта на фаг пПЗТсЗ са представени на фигура 13 от приложените фигури.

ml от престоялата цяла нощ култура на Е. coli К12 JM109 (Е. coli К12 JM101, получени от New England Biolads, може да се използва вместо Е. coli К12 JM109) за инокулиране на 50 ml L хранителна среда и получената култура се инкубира при 37°С с аериране, докато O.D._6W(оптическата плътност) достигне 0,3 или 0,4. Клетките се ресуспендират в 25 ml (10 mM) NaCl и се инкубират върху лед за 10 min и се събират чрез центрофугиране. Клетките се ресуспендират в 1,25 ml 75 тМ СаС1₂, 200 μΐ аликвотни части от клетките се отделят, прибавя се към 10 μΐ от лигираната ДНК, получена по горе, и се инкубират върху лед за около 40 min. След това сместа от клетъчна ДНК се инкубира при 42°С за 2 min и различни аликвотни части (1, 10 и 100 μΐ) се отделят и се прибавят към 3 ml arap (L хранителна среда с 0,5 % агар, поддържан разтопен при 45°С), който също съдържа 50 μΐ 2 % X-Gal, 50 μΐ 100 mM IPTG u 200 μΐ E. coli К12 JM109 в логаритмична фаза на растеж. След това сместа клеткаагар се посява върху петрита с агар, съдържащ 40 pg/ml X-Gal (5-бромо-4-хлоро-3-индолил-З-О-тиогалактозид) и 0,1 mM IPTG (изопропил-р-О-тиогалактозид) и петрита се инкубират при 37°С за цяла нощ.

На следващата сутрин няколко светли, за разлика от сините плаки се използват индивидуално за инокулиране на 2 ml L хранителна среда и получените култури се инкубират при 37°С с аериране за 2 h. Отсъствието на син цвят показва, че се е получила желаната ДНК-инсерция. След това, културите се центрофугират и 200 μΐ от получената супернатанта се прибавят към 10 ml от културите (fl.D._JJ0=0,5) на Е. coli К12 JM 109 прораснали при 37°С с аериране. Тези култури се инкубират още 30 min при 37°С; след това клетките се центрофугират и получената утайка се използва за приготвяне на репликативната форма на рекомбинантния фаг, който те съдържат. Двуверижна репликативна форма на фаг ДНК се изолира от клетките, като се използва съкратена версия на процедурата, описана в пример 1. Трансформантите, съдържащи фагове ml3Tc3 ДНК, се идентифицират чрез рестрикционен ензимен анализ на тяхната фагова ДНК.

b’ (ii). Получаване на едноверижна фагова пНЗТсЗ ДНК.

и 1,5 ml от престоялата цяла нощ култура на Е. coli К12 JM109/ml3Tc3 се центрофугират и 100 μΐ от супернатантата, съдържаща фаг ml3Tc3 се използват за инокулиране на 25 ml култура от Е. coli JM109 при O.D.₆₆₀от около 0,4-0,5. Културата се инкубира 6 h при 37°С с аериране, след което културата се центрофугира и получената супернатанта, около 20 ml се прехвърля в нова епруветка. Към супернатантата се прибавят около 2 ml разтвор, съдържащ 20 % полиетиленгликол (PEG) 6000 и 14,6 % NaCl, която след това се инкубира върху лед, за 20 min.

Супернатантата се центрофугира 25 min при 7000 об./min и получената плътна утайка, която съдържа едноверижна фагова ml3Tc3 ДНК, се ресуспендира в 500 μΐ ТЕ буфер. Разтворът на ДНК се екстрахира двукратно с ТЕ-наситен фенол и двукратно с хлороформ. След това едноверижната ДНК се утаява, като се използва NaOAc и етанол и се центрофугира. Получената утайка се промива с 70 % етанол, изсушава се, и след това се разтваря в 60 μΐ вода.

b’(iii). Мутагенез.

Едноверижният ДНК фрагмент, използван в мутагенезата, се синтезира на автоматичен ДНК синтезатор. Фрагментът има последователността 5'CCCGTCCTGTGGATACTCTACGCCGA-3' и е хомоложен на областта, обграждаща BamHI сайта (5'-GGATCC-3') в придаващия резистентност към тетрациклин ген от плазмид pBR322, с изключение на това, че А остатъкът, втори от 5' края (или трети от З'края) е С в плазмида pBR322. Тази промяна не изменя аминокиселинния състав на придаващия резистентност към тетрациклин протеин, но елимира BamHI сайта.

Около 10 рМ от мутагенния праймер и Ml3 универсалния праймер (Bethesda Research Laboratories (BRL), P.O. Box 6009, Gaithesburg, MD 20760) се третират индивидуално c 10 единици (BRL) T4 полинуклеотид-киназа в 20 μΐ IX киназен буфер (60 mM трис-HCl, рН=7,8; 15 mM 2-меркаптоетанол; 10 mM MgCl₂; и 0,41 Μ АТР) за 30 min при 37°С. Третираните с кинази ДНК се използват при мутагенезната процедура, описана по-долу.

Реакцията на хибридизация се провежда, като се смесват 300 ng (1,2 μΐ) от едноверижен фаг ml3Tc3, 1 рМ (2 μΐ) от универсален праймер, 1 рМ (2 μΐ) мутагенен праймер, 2 μΐ 10Х хибридизационен буфер (100 mM трисHCl, рН=7,5; 1 mM EDTA; и 500 mM NaCl) и 12,8 μΐ вода. Реакцията се провежда при 80°С за 2 min, при 50°С за 5 min и след това се оставя да се охлади до стайна температура.

Реакцията на удължаване (екстенция) се провежда чрез прибавяне на 5 μΐ 10Х екстенционен буфер (500 mM трис-HCl, рН=8; 1 шМ EDTA; и 120 mM MgCl₂); 5 1 2 mM dATP; 1 μΐ 6 тМ разтвор на всеки от dGTP, TTP u dCTP; 1 μΐ (-2 единици, Pharmacia P-L Biochemicals, 800 Centennial Avenue, Piscataway, NJ 08854) ензим на Klenow; 1 ml (100 единици) T4 ДНК лигаза; и 17 μΐ вода към сместа на хибридната ДНК. Реакцията на удължаване се провежда при стайна температура за 1 h, след това при 37°С за 2,5 h и след това цяла нощ при 4°С.

Реакцията се спира чрез двукратно екстрахиране с ТЕ-наситен фенол, което е последвано от двукратно екстрахиране с СНС1₃. ДНК се утаява с етанол и NaOAc, отделя се чрез центрофугиране и се ресуспендира в 50 μΐ вода, като към разтвора на ДНК се прибавят 6 μΐ 10Х S1 буфер.

Разтворът на ДНК се разпределя поравно в три епруветки. Към две от тях се прибавят около 200 единици (Miles Laboratories) S1 нуклеаза. Едната реакция със S1 се провежда при стайна температура за 5 min, а другата за 10 min. Реакциите се спират чрез екстрахиране на реакционната смес двукратно с ТЕ-наситен фенол. Фенолните екстракции са последвани от две екстракции с хлороформ, след това ДНК се утаява от реакционната смес с NaOAc и етанол. Нетретираната проба ДНК служи като отрицателна контрола. S1-третираните проби се съхраняват отделно една от друга през остатъка от процедурата, но дават подобни резултати.

Утайката на ДНК се ресуспендира в 20 μΐ вода и 10 μΐ от получения разтвор се използват за трансформиране на Е. coli К12 JM109 (Е. coli К12 JM101 може също да се използва), в съответствие с процедурата, използвана при конструирането на фаг пйЗТсЗ, с изключение на това, че към петрито не се прибавя IPTG или X-Gal.

Двуверижна репликативна форма на ДНК от около 48 плаки се изолира, както е описано по-горе и се изследва за наличието на BamHI рестрикционен сайт. Изолатите, без BamHI сайт, се скринират по-нататък чрез приготвяне на едноверижна ДНК, както е описано по-горе. Едноверижната ДНК се секвенира, като се използва дидеоксисеквенционния метод (J.H. Smith,1980, Methods in Enzymology 65:560-580). Желаният изолат е обозначен pLllOB (фигура 13).

с) Конструиране на плазмид pLllOC.

Около 50 pg репликативна форма на фагова pLl 10В ДНК се смилат в 250 μΐ IX Nhel буфер (50 mM NaCl; 6 тМ трис-HCl, рН=7,5; 6 тМ MgCl₂; и 6 тМ β-меркаптоетанол), съдържащ -50 единици Nhel рестрикционен ензим при 37°С за 2 h. След това се прибавят 5

5М NaCl към смляната с Nhel фагова pLl 10В ДНК, последвано от 5 μ 1 (-50 единици) Sall рестрикционен ензим. Смилането продължава h при 37°С. След това желаният -422 bp NhelSall фрагмент, съдържащ мутиралата област на придаващия резистентност към тетрациклин ген, се изолира от акриламиден ген, съгласно добре известни стандартни процедури.

Плазмидна pLl 10А ДНК се смила с Nhel и Sall при същите условия, с изключение на това, че плазмид pLllOA е заместен с фаг pLl 10В. -6,1 kb Nhel-Sall рестрикционният фрагмент от плазмид pLllOA се пречиства върху агароза.

Желаният плазмид pLl ЮС се конструира, като се лигират заедно 100 ng от всеки от NhelSall фрагментите на pLl 10А (~6,1 kb) u pLl 10В (-422 bp), използвайки конвенционални процедури. Рестрикционният сайт и функционалната карта на плазмид pLllOC са представени на фиг. 13 от приложените фигури. Желаният плазмид pLllOC придава резистентност към тетрациклин при 10 pg тетрациклин в Е. coli, но при него липсва BamHI сайт в гена, придаващ резистентност към тетрациклин.

11. Конструиране на плазмид pCZRlll.

Плазмид pLllOC съдържа единичен Clal рестрикционен сайт, който се премахва чрез осъществяване на следните реакции. Около 1 pg плазмид pLllOC се смила с Clal в достатъчно съответствие с начина от пример 29А2, с изключение на използването на рестрикционен ензим Clal u 10Х Clal буфер (500 mM NaCl, 100 тМ трис-HCl, (рН=7,9) и 100 mM MgCip. След това смляната с Clal ДНК се третира с Klenow, в достатъчно съответствие с начина от пример 29А5, с изключение на това, че се прибавя само dCTP, вместо всичките четири dNTP.

След това ДНК се утаява и ресуспендира в 50 μΐ Mung Bean нуклеазен буфер (50 mM натриев ацетат (pH 5.0), 30 mM NaCl u 1 шМ ZnSO₄). Прибавя се една единица Mung Bean нуклеаза (търговско достъпна от New England Biolabs) и реакцията се провежда при 30°С за 30 min. След това епруветката се поставя в лед и се прибавя NaCl до 0,2 М, след това сместа се екстрахира с фенол/хлороформ, утаява се с етанол и се ресуспендира в 10 mM трис-HCl (pH 8,0). След това ДНК се самолигазира и трансформира в клетки на Е. coli, в достатъч5 но съответствие с начина от примери 29АЗ и 29А4. Полученият плазмид се обозначава плазмид pCZRlll.

12. Конструиране на плазмид pCZR126S.

Около 26 pg плазмид pCZRlll се смилат с Xbal, както следва. 10Х Xbal буфер съдържа 600 шМ трис-HCl, 100 mM MfCl₂, 1 М NaCl и 10 mM 2-меркаптоетанол, pH 7,5 (при 37°С). Прибавят се 50 μΐ 10Х Xbal буфер, 15 ul Xbal (10U/ 1) u 185 μΐ вода към 250 1 вода, съдържаща около 25 pg плазмид pLllO. Смилането се осъществява при 37°С за 1 h. След това смленият с Xbal pLllO се екстрахира с фенол, прибавя се 1/10 обем ЗМ CH₃COO-Na, прибавят се три обема етанол, сместа се инкубира в баня сух лед-етанол за 5 min и след това се центрофугира. Утаената ДНК се ресуспендира в 50 μΙ вода. Смленият с Xbal плазмид pCZRlll се смила с BamHI, както следва. 0,2 μΐ BamHI (10 U/ 1), 10 μΐ BamHI буфер (ЮОтМ трис-HCl, 50 mM MgCl₂, 1 M NaCl u 10 mM 2-меркаптоетанол, pH 8,0 [при 37°C]), u 90 μΐ вода се прибавят към 50 μΐ смлян с Xbal pLl 10, получен по-горе. Смилането се провежда 5 min при 37°С. Смленият pCZRl 11 се екстрахира във фенол, прибавя се 1 /10 обем СН₃СОО Na+, последвано от прибавяне на три обема етанол. Утаената ДНК се ресуспендира в 50 μΐ трие, 1 mM EDTA, pH 8,0 буфер.

След това смленият с Xbal u BamHI pCZRlll се нанася върху агарозен гел и се изолира ДНК веригата при около 5,8 kb. Плазмид pCZR126S се получава чрез лигиране на -5,8 kb фрагмента от pCZRl 11 към Xbal-Ndel линкер и синтетичен ген, кодиращ ЕК-говежди хормон на растение, който съдържа Ndel сайт на неговия 5' край и BamHI сайт на неговия 3' край. От Xbal до Ndel последователността се получава, като се използва стандартна методика за олигонуклеотидна последователност и е следната:

5' CTAGAGGGTATTAATAATGTATATTGATTTTAATAAGGAGGAATAATCA 3' ιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιι TCCCATAATTATTACATATAACTAAAATTATTCCTCCTTATTAGTAT 5’

Посочената последователност се конструира чрез химически синтез на двете вериги, последван от смесване, за осъществяване на хибридизацията. Генът кодиращ ЕК bGH се конструира от 16 химически синтезирани части на едноверижна ДНК с дължина на веригата от до 83 нуклеотида, които заедно съдържат двете комплементарни вериги на целия ген. Синтезът се осъществява, като се използва апарат на Applied Biosystems (ABS) и се състои в 5 посочената по-нататък последователност:

5' TATGTTCCCATTGGATGATGATGATAAGTTCCCAGCCATGTCCTT

IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIHII ACAAGGGTAACCTACTACTACTATTCAAGGGTCGGTACAGGAA

GTCCGGCCTGTTTGCCAACGCTGTGCTCCGGGCTCAGCACCTGCATCAGCTGGCTGCTGA IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIH CAGGCCGGACAAACGGTTGCGACACGAGGCCCGAGTCGTGGACGTAGTCGACCGACGACT

CACCTTCAAAGAGTTTGAGCGCACCTACATCCCGGAGGGACAGAGATACTCCATCCAGAA ΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΊΙΙΙΠΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙ GTGGAAGTTTCTCAAACTCGCGTGGATGTAGGGCCTCCCTGTCTCTATGAGGTAGGTCTT

CACCCAGGTTGCCTTCTGCTTCTCTGAAACCATCCCGGCCCCCACGGGCAAGAATGAGGC

ΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΜΙΙΙΙΙΙΙΙΗΙΙΙΙΙΙΙΙΙ

GTGGGTCCAACGGAAGACGAAGAGACTTTGGTAGGGCCGGGGGTGCCCGTTCTTACTCCG

CCAGCAGAAATCAGACTTGGAGCTGCTTCGCATCTCACTGCTCCTCATCCAGTCGTGGCT llllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll GGTCGTCTTTAGTCTGAACCTCGACGAAGCGTAGAGTGACGAGGAGTAGGTCAGCACCGA

TGGGCCCCTGCAGTTCCTCAGCAGAGTCTTCACCAACAGCTTGGTGTTTGGCACCTCGGA IIIIIHIIIitllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll ACCCGGGGACGTCAAGGAGTCGTCTCAGAAGTGGTTGTCGAACCACAAACCGTGGAGCCT

CCGTGTCTATGAGAAGCTGAAGGACCTGGAGGAAGGCATCCTGGCCCTGATGCGGGAGCT 1111111 f1111IIIli111111 ItIIIIIII1111111II1111 JI III1111111111 GGCACAGATACTCTTCGACTTCCTGGACCTCCTTCCGTAGGACCGGGACTACGCCCTCGA

GGAAGATGGCACCCCCCGGGCTGQGCAGATCCTCAAGCAGACCTATGACAAATTTGACAC lllllllllllllllllllllllllllllltlllllllllllllllllilllllllllll CCTTCTACCGTGGGGGGCCCGACCCGTCTAGGAGTTCGTCTGGATACTGTTTAAACTGTG

AAACATGCGCAGTGACGACGCGCTGCTCAAGAACTACGGTCTGCTCTCCTGCTTCCGGAA IIIHIlllillllllllllllilHIIllIlllllllllllllllllllllllllllli TTTGTACGCGTCACTGCTGCGCGACGAGTTCTTGATGCCAGACGAGAGGACGAAGGCCTT

GGACCTGCATAAGACGGAGACGTACCTGAGGGTCATGAAGTGCCGCCGCTTCGGGGAGGC

IIIIHIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIItlllllllllllllllll CCTGGACGTATTCTGCCTCTGCATGGACTCCCAGTACTTCACGGCGGCGAAGCCCCTCCG

CAGOTGTGCCTTCTAG 3' llllllllllllllll

GTCGACACGGAAGATCCTAG 5'

Конструирането на плазмид pCZR126S се осъществява чрез лизиране на следните компоненти: 0,28 gg от 5,8 kb фрагмента, получен от плазмид pLllO след пълно смилане с Xbal и частично смилане с BamHI в общ обем от 2 μΐ, - 0,18 gg от синтетичния ген, кодиращ производно на говежди растежен фактор, кой50 то има 5' край, съответстващ на Xbal сайта и 3' край, съответстващ на BamHI сайта в общ обем от 2.5 gl, 8,75 пикомола от химически синтезирания Xbal до Ndel линкер в 1 gl. Плазмидните компоненти се прибавят към 6 gl от 5 лигазен буфер: 250 тМ трис-НС1, 50 mM MgCl₂,5 тМ ATP, 5 mm DTT, 25% об./об. полиетилен гли кол 8000, pH 7,6 2 μΐ лигаза и 16,5 μΙ вода. Сместа за лигиране се инкубира цяла нощ при 16°С. След това циклизираният плазмид pCZR126S се използва за трансформиране на E.coli RV308 клетки, в достатъчно съответствие 5 с метода от пример 29АЗ. Рестрикционният сайт и функционалната карта на плазмид pCZR126S са представени на фигура 14.

Б.Конструиране на плазмид pRB172 за експресия на човешки проинсулин

1. Конструиране на плазмид pRB145

Генът на човешкия проинсулин е синтезиран за първи път в практиката и клониран в PUC18 плазмид (търговско достъпен от BRL). Генът е синтезиран, като са използвани стандартни техники и включва последователността:

Hindlll Ndel Dralll

5' ¹AGCTTCAT * ATGTATTTTGTTAACCAACACCTGTGCGGCTCCCACCTG*GTGGAAGCTCT

AGTA TACATAAAACAATTGGTTGTGGACACGCCGAGGGTGGAC CACCTTCGAGA

GTACCTGGTGTGCGGTGAACGTGGCTTCTTCTACACCCCQAAGACCCGCCGTGAGGCA

CATGGACCACACGCCACTTGCACCGAAGAAGATGTGGGGCTTCTGGGCGGCACTCCGT

Avail Xmal

GAG¹GACCTGCAGGTGGGTCAGGTGGAGCTGGGCGGTGGC¹CCGGGTGCAGGCAGCCTGC

CTC CTGGACGTCCACCCAGTCCACCTCGACCCGCCACCG GGCCCACGTCCGTCGGACG

AGCCGCTGGCCCTGGAGGGTTCCCTGCAGAAGCGTGGCATTGTGGAACAATGCTGTAC

TCGGCGACCGGGACCTCCCAAGGGACGTCTTCGCACCGTAACACCTTGTTACGACATG BamHl

CAGCATCTGCTCCCTGTACCAGCTGGAGAACTACTGCAACTAG¹GATCCG 3'

GTCGTAGACGAGGGACATGGTCGACCTCTTGATGACGTTGATC CTAGGCTTAA_} 5’

EcoRI

Единият от ключовете, имащ правилната последователност, се селекционира за получаване на пречистена с цезиев хлорид ДНК. Плазмидът се изолира чрез стандартната процедура [виж, например, Molecular Cloning. A Labortory Manual, (1982) изд. от Maniatis, Τ; Fritsch, E.F. u Sambrook, J., Cold Spring Harbour Laboratory Publications, New York, чиято цяла методика е включена тук за справка]. Около 6 μΐ (20 pg) от тази плазмидна ДНК се прибавя към 20 μΐ 10Х Ndel буфер (150 тм NaCl, 10 тМ трис-HCI (pH 7,8), 6 тМ MgCl₂, 6 тМ 2-меркаптоетанол, 100 pg/ml BSA -говежди серумен албумин), 5 μΐ Ndel рестрикционен ензим (-40 единици) и 169 μΐ вода. След смесване реакцията се инкубира при 30°С 2h. за ДНК се утаява чрез добавяне към сместа на 0,3M NaOAc, прибавяне на 3 обема етанол, смесване, изстудяване до -70°С и центрофугиране. Плътната утайка от ДНК се промива със

70% етанол ( 1 ml), изсушава се и се разтваря в 20μΐ 10Х BamHl буфер (150 mM),NaCl, 6 mM трис-HCI (pH 7.9), 6 тм MgCl₂, 100; g/ml BSA), 2 μΐ BamHl рестрикционен ензим (40 единици) и 178 μΐ вода. След бавно разбъркване реакцията се инкубира при 37°С 2 h. ДНК отново се утаява с три обема етанол, както по-горе и се подлага на електрофореза върху 1 % агарозен гел, топящ се при ниска температура (FMC, агарозна пластина). Желаният ДНК фрагмент, съответстващ на около 270 Ьр, се отделя от гела и след това ДНК се получава чрез разтопяване на агарозата и пропускането й през Elutip-d колона (Schleicher & Schuell, Keene, N.H.), съгласно процедурата препоръчана от продавача. След утаяване и изсушаване ДНК се съхранява в 30 μΐ 10 тм трис-HCI рН 8.0.

Около 15 g от плазмид pCZR126S (от пример 29А12) се суспендира в 20 μΐ 10Х Ndel буфер, 5 μΐ Ndel рестрикционен ензим (40 единици) и вода (175 μΐ), малко се разбърква и се инкубира при 37°С за 2 h. След инкубирането ДНК се утаява с 3 обема етанол, както по-горе, изсушава се и след това се ресуспендира в 20 μΐ 10Х BamHI буфер, 2 μΐ BamHI рестрикционен енизм (40 единици) и 178 μΐ вода. След малко разбъркване реакционната смес се инкубира при 37°С, за 2 h. ДНК отново се утаява с 3 обема етанол и се подлага на електрофореза върху 1 % нискотопящ се агарозен гел. По-големият фрагмент, съответстващ на вектора ДНК, се отделя от този гел и ДНК се получава по описаната по-горе процедура с Elutip-d колона. След утаяване и изсушаване векторната ДНК се съхранява в 35 μΐ 120 тМ трис-HCl pH 8.0.

Около 2,5 μΐ от векторната ДНК се смесват с 12 μΐ от пречистения фрагмент от гена на човешкия инсулин, описан по-горе, 4 μΐ 10 тМ АТР, 0,5 μΐ 1М дитиотреитол, 5 μΐ 10Х лигазен буфер (500 тМ трис-HCl pH 7.6 и 100 тМ MgCl₂), 26 μΐ вода и 0.5 μΐ Т₄-ДНК лигаза (Pharmacia, 3.5 единици). Реакцията се поставя при 4°С, за 16 h. Лигиращата смес се разрежда с 50 μΐ 10 тМ трис-НСЦрН 7.6) и 3 μΐ 1М СаС1₂ след това се трансформира в E.coli К12 RV308, в достатъчно съответствие с начина от пример 29АЗ. Клетките се поставят върху TY блюда, при които са добавени 5 pg/ml тетрациклин, след което се инкубират за цяла нощ при 32°С.

Плазмиди от 3 mL култури се, изолират от колонии, резистентни към тетрациклин, чрез бърза алкална екстракционна техника, описана в Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1982) изд. от Maniatis, T., Fritsch, E.F., и Sambrook, J. Cold Spring Harbour Publications, New York, (стр. 368-369). Присъствието на правилния фрагмент от гена на човешкия проинсулин се установява чрез минискрининг проце-дура, като се използва полиакриламидна електрофореза, за да се анализира смленият с Xbal/ BamHI фрагмент. Избират се плазмидите с правилния размер (315 Ьр) инсерти и се подлагат на амплификация и пречистване. Плазмидът, който съдържа гена на човешкия проинсулин, е pRB145. Рестрикционният сайт и функционалната карта на плазмид pRB145 са представени на фиг. 16.

2. Конструиране на плазмид pRB164A.

Около 30 pg от плазмид pRB145 се суспендират в 20 μΐ 10Х Ndel буфер, 5 μΐ Ndel рестрикционен ензим (New England Biolabs, 40 единици) и 175 μ вода, малко се разбърква и се инкубира при 37°С 1 h. След това към реакционната смес се прибавят 2 μΐ BamHI рестрикционен ензим (New England Biolabs, 40 единици) и се инкубира при 37°С за още 2 h часа. ДНК се утаява с 3 обема етанол и 0,3 М NaOAc и се подлага на електрофореза върху 1 % нискотопящ се агарозен гел. По-малкият (около 270 bp) Ndel/BamHl рестрикционен фрагмент, кодиращ гена на човешкия проинсулин, се отделя от гела и ДНК се получава чрез пропускане през Elutip-d колона, както е описано по-горе. След утаяване и изсушаване ДНК се съхранява в 30 1 10 тМ трие pH 8,0.

След това към тази ДНК (30 μΐ) се прибавят 20 μΐ 10Х Avail буфер (50 pmM NaCl, 6 тМ трис-HCl pH 8,0, 10 тМ MgCl₂, 6 тМ 2меркаптоетанол, 10pg/ml BSA), 5μΐ Avail рестрикционен ензим (New England Biolabs, 20 единици) и 175 μΐ вода. След леко разбъркване реакцията се инкубира при 37°С за 2 h. ДНК се утаява с 3 обема етанол и ЗМ NaOAc (20 μΐ) и след това се подлага на електрофореза върху 1,2% нискотопящ агарозен гел. По-големият Avall/BamHi рестрикционен фрагмент (около 156 Ьр) се отделя от гела и след това ДНК се получава чрез пропускане през Elutip-d колона, както е описано по-горе. След утаяване и изсушаване, ДНК се съхранява в 30 μΐ 10 тМ трие pH 8,0.

Синтетично се получава ДНК (-115Ьр), съответстваща на Ndel/Avail рестрикционен фрагмент на гена на човешкия проинсулин. Първият етап се състои в синтезиране на четири едноверижни дезоксикарбоолигонуклеотида на ДКН синтезатор (Applied Biosystems, модел 380В). Нуклеотидните последователности на тези четири олигонуклеотиди са следните:

1. TATGCGTATGTTTGTTAACCAACACCTGTGCGGCTCCCACCTG

GTGGAAGCTCTGTACCT (60 мономерни звена)

2. GGTGTGCGGTGAACGTGGCTTCTTCTACACCAAGCCGACC

CGCCGTGAGGCAGAG (55 мономерни звена)

3. CACCAGGTACAGAGCTTCCACCAGGTGGGAGCC

GCACAGGTGTTGGTTAACAAACATACGCA ((62 мономерни звена)

4. GTCCTCTGCCTCACGGCGGGTCGGCTTGGTGTAGAA

GAAGCCACGTTCACCGCA (54 мономерни звена)

След пречистване на всеки олигонуклеотид чрез електрофореза полиакриламиден гел, олигонуклеотиди две и три се фосфорилират съгласно методите на Brown, E.L., Belagaje, R., Ryan, M. J., u Khorana, H.G. (1979) Methods in Enzymology, изд. от Wu, R., Academic Press, N.Y. 68, 109-151, чиято цяла методика е включена тук за справка. След това фосфорилираните олигонуклеотиди две и три (всеки по -715 пикомола) се смесват с олигонуклеотиди едно и две (-860 пикомола) хибридизират се и се лигират в буфер (200 μΐ), съдържащ 50 тМ трис-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl₂, 10 тМ DTT, 50 μΜ ATP и 20 единици Т₄ ДНК лигаза (Pharmacia) за 16 h при 4°С. Лигираният продукт се пречиства върху 15% полиакриламиден гел. ДНК се получава електрофоретично от гелната пластина с последващо пречистване в Sephadex G-50 колона. Добивът на желания лигиран продукт е 485 рМ.

Около 100 рМ от тази ДНК се фосфорилират в буфер (50 μΐ), съдържащ 50 тМ трие (pH 7,6), 10 mM MgCl₂, 10 тМ DTT и АТР, както е описано в Brown, E.L. и др. (1979), Methods in Enzymology 68, 109-151, чиято методика е посочена за справка. След филтриране през колона със Sephadex G-50, ДНК се съхранява в 50 μΐ 10 mM трие, pH 8.0.

Около 2.5 μΐ от векторната ДНК (NdelBamHl-смлян pCZR126S) се смесват с 18 μΐ от Avall/BamHl рестрикционен фрагмент от плазмид pRB145 и 10 μΐ (10 рМ) Ndel/Avall синтетичен линкер, в момента конструиран в буфера (50 μΐ), съдържащ 50 тМ трие (pH 7,6), 10 тМ NgCl₂, 10 mM DTT, 800 μΐ АТР и 3.5 единици от Т₄ ДНК лигаза. Реакционната смес се инкубира при 4°С за цяла нощ и след това се тран20 сформира в E.coli К 12 RV308, в съответствие с процедурата от пример 29АЗ. Желаният E.coli К12 RV308/pRB164A трансформант се идентифицира чрез анализ на неговата плазмидна ДНК. Подходящият трансформант се култивира при 30°С в TY среда, съдържаща 5 pg/ml тетрациклин, до O.D._JJ0 от около 0,2 (рано log фаза) и след това се пренася при 42°С за 3 до 3,5 h , за да се индуцира синтеза на човешкия проинсулин. Клетките се утаяват и се разтварят в лизин, чрез прибавяне на буфер (0.125М трис-С1 (pH 6,8), 2% SDS, 30% глицерол, 1М 2-меркаптоетанол, 6М карбамид). Пробите се загряват до 97°С 2 min, преди да се нанесат върху акриламиден гел. Ивиците се визуализират лесно чрез оцветяване с Coomassie Brilliant Blue багрило. Използва се скениращ гел денситометър за определяне процентното количество съдържание на клетъчния протеин. Рестрикционният сайт и функционалната карта на плазмид pRB164A са представени на фигура 17.

3. Конструиране на плазмид pRB172.

Около 25 pg от плазмид pRB145 се суспендират в 15 μΐ 10Х Dralll буфер (200 mM NaCl, 50 шМ трис-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl₂, 1 тМ DTT, 10 pg/ml BSA), 5 μΐ Dralll рестрикционен ензим (Boehringer Mannheim, 27 единици) и 129 μΐ вода, малко се разбъркват и се инкубират при 37°С за 6 h. След инкубацията ДНК се утаява, изсушава се и се ресуспендира в 10 μΐ 10Х Xbal буфер (150 mM NaCl, 6 тМ трис-HCl (pH 7,9), 6 тМ MgCl₂, 7 тМ 2меркаптоетанол, 100 pg/ml BSA), 3 μΐ Xbal рестрикционен ензим (Boehringer Mannheim, 36 единици) и 77 μΐ вода. Реакционната смес се разбърква леко и се инкубира при 37°С за 4 h.

ДНК отново се утаява с 3 обема етанол и NaOAc и се подлага на електрофореза върху 1 % нискотопящ агарозен гел. Долната ивица, съответстваща на около 85 bp Xbal/Dralll рестрикционния фрагмент от гена на човешкия проин- 5 сулин, се изрязва от гела и ДНК се получава чрез процедурата в Elutip-d колона. След утаяване и изсушаване ДНК се съхранява в 30 μΐ 10 шМ трие рН 8,0.

Около 15 gg плазмид pRB164A се отцепва с рестрикционни ензими Dralll и Xbal, в съответствие с процедурата, описана по-горе. Горната ивица, съответстваща на Xbal/Dralll векторния фрагмент, се изолира от агарозния гел, чрез процедурата в Elutip-d колона. След утаяване и изсушаване ДНК се съхранява в 30 gl 10 mM трие pH 8.0.

Около 5 μΐ от смляната с Xbal/Dralll pRB164A векторна ДНК се смесват с 5 μΐ от Xbal/Dralll рестрикционен фрагмент от плазмид pBR145 в буфер (50 μΙ), съдържащ 50 тМ трис-НСКрН 7,6), 10 mM MgCl₂, 10 тМ DTT, 800 тМ АТР и 6 единици от Т₄ DNA лигаза. Реакцията инкубира при 4°С, за цяла нощ и се използва, за трансформиране на E.coli К 12/RV308 компетентни клетки чрез стандартно третиране с СаС1₂.

Трансформантите се селекционират върху TY агарови пластини, съдържащи 5 gg/ml тетрациклин. Плазмидите се изолират от колониите, резистентни на тетрациклин, чрез бърза алкална екстракционна процедура и се анализират чрез смилане с Xbal и BamHI рестрикционни ендонуклеази. ДНК от положителните клонове се секвенира чрез секвеназна система (U.S.Biochemicals). Плазмидите с правилната желана последователност се селекционират за амплификация и пречистване. По този начин се изолира E.coli К12 RV308/ pRB172 трансформанти. Експресията и акумулирането на човешкия проинсулин, приел този плазмид, се анализира чрез визуализиране на общия клетъчен протеин, което се извършва след електрофоретично разделяне в

15%-на полиакриламидна матрица. Рестрикционният сайт и функционалната карта на плазмид pRB172 са представени на фиг. 18.

В. Конструиране на Escherichia coli RV308/pRB173 и pRB174

Около 20 gg от плазмид pRB145 или pRB172 се суспендират в 20 μΐ 10Х Xbal буфер (150 mM NaCl, 6 тМ трис-HCl, рН 7,9,6 тМ MgClj, 7 тМ 2-меркаптоетанол, 100gg/ml BSA), прибавят се 2 gl Xbal рестрикционен ензим (Boehringer Mannheim, 24 единици), леко се разбърква и се инкубира при 37° С за 4 h След инкубирането ДНК се утаява, изсушава се и се ресуспендира в 10 μΐ 10Х BamHI буфер (100 mM NaCl, 10 тМ трис-HCl (рН 8,0) 5 тМ MgCl₂, 1 тМ 2-меркаптоетанол, 100 gg/ml BSA), 5 μΐ BamHI рестрикционен ензим Boehringer Manheim (40 единици) и 75 μΐ при 37°С за 4 h. ДНК отново се утаява с етанол и NaOAc и се подлага на електрофореза върху 1 % нискотопящ агарозен гел. Около 320 bp Xbal/BamHl рестрикционен фрагмент, съответстващ на гена на човешкия проинсулин, се изолира от гела, чрез процедурата в Elutip-d колона. След утаяване и изсушаване ДНК се ресуспендира в 20 μΐ 10Х Xmal буфер (25 mM NaCl, 10 тМ трис-HCl (рН 7,5), 10 тМ MgCl₂, 10 тМ 2-меркаптоетанол, 100 g/ml BSA), 10 gl Xmal рестрикционен ензим (New England Biolabs, 10 единици) и 170 gl вода. Реакционната смес леко се разбърква и се инкубира при 37°С за 4 h. След това в ДНК се утаява с етанол и NaOAC и се подлага на електрофореза върху 1 % нискотопящ агарозен гел. По-голямата ДНК, съответстваща на около 200 bp Xbal/Xmal рестрикционен фрагмент се изразява от гела и ДНК се получава чрез пропускане през Elutip-d колона, както е описано по-горе. ДНК се съхранява в 30 gl 10 mM трие рН 8,0.

Ьр ДНК, съответстваща на Xmal/ BamHI рестрикционен фрагмент на гена на човешкия проинсулин, се конструира синтетично, както следва. Два едноверижни дезоксирибоолигонуклеотида

CCGGGTGCAGGCAGCCTGCAGCCGCTGGCCCTGGAGGGTTCCCTGCAGTAG (51 мономерни звена и

GATCCTACTGCAGGGAACCCTCCAGGGCCAGCGGCTGCAGGCTGCCTGCAC (51 мономерни звена) се синтезират чрез Applied Biosystems _ват чрез полиакриламиден гел, електрофореза ДНК- синтезатор (модел 380В) и се пречист- в присъствие на 7М карбамид. След изолиране двата олигонуклеотида се фосфорилират в съответствие с методите на Brown, E.L., Belagaje, R., Ryan, M.J., и Khorana, H.G. (1979) Methods in Enzymology, изд. от Wu,R., Academic Press, N.Y. 68, 109-151, и се хибридизират, за да се получи желаният линкер.

Около 10 pg плазмид pCZR126S (от пример 29А12) се суспендират в 20 μΐ 10Х Xbal буфер (150 mM NaCl, 6 тМ трис-HCl (pH 7.9), 6 тМ MgCl₂, Ί тМ 2-меркаптоетанол, 100 pg/ ml BSA), 2 μΐ Xbal рестрикционен ензим (Boehringer Mannheim, 24 единици) и 178 μΐ вода. Реакционната смес леко се разбърква и се инкубира при 37°С за 2 h. След това се прибавят 4 μΐ 5М NaCl и 2 μΐ BamHI рестрикционен ензим (New England Biolabs, 20 единици, и се инкубира за още 2 h при 37°С. След това ДНК се утаява с етанол и NaOAc чрез стандартни процедури и се подлага на електрофореза върху 1 % нискотопящ агарозен гел. Горната ивица, съответстваща на Xbal/BamHl векторна ДНК, се изолира посредством Elutip-D колона. След утаяване и изсушаване ДНК се съхранява в 30 μΐ 10 mM трие, pH 8.0.

Около 5 μΙ от смляната с Xbal/BamHl pCZR126S векторна ДНК се смесват с 10 μΐ Xbal/Xmal рестрикционен фрагмент от pRB145 или pRBl 72 и 4 μΐ от подложения на действието на киназа Xmal/BamHl линкер, получен по-горе в буфер (50 1), съдържащ 50 μΜ Трие (pH 7,6), 10 mM MgCl₂, 10 тМ DTT, 800^μΜ ATP и 6 единици от Т₄ ДНК лигаза. Реакционната смес се инкубира при 4°С, за цяла нощ и се използва за трансформиране на E.coli щам К12 RV308, в съответствие с процедурата от пример 29АЗ. Желаните трансформанти E.coli К12 RV308/ pRB173 (ако са получени от pRB172 векторния фрагмент) и E.coli К12 RV308/pRB174 (ако са получени от pRB145 векторния фрагмент) се идентифицират чрез анализ на тяхната плаз20 мидна ДНК и протеина, получен преди и след индуциране при 42°С. Рестрикционният сайт и функционалната карта на плазмид pRB 172 са показани на фигура 19 от приложените фигури.

Около 200 ng от получената плазмидна

ДНК от минипрепарата също се трансформират в E.coli L201 клетки и трансформантите се селекционират върху 2 х TY агарови пластини, съдържащи 15 pg/ml тетрациклин.

Експресира-ните от трансформантите протеини се анализират и желаните трансформанти се потвърждават по тяхното производство на човешки проин-сулин. По този начин се изолират E.coli L201/pRB173 и E.coli L201/ pRB174.

Г. Конструиране на Escherichia coli KI2 RV308/pRB175. pRB176,pRB177 и pRB178.

Около 12 pg плазмид pRB172 се суспендират в 15 μΐ lOXNdel буфер (100 mM NaCl, 50 mM трис-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 1000 pg/ml BSA), 2,5 μΐ Ndel рестрикционен ензим (20 единици) и 133 μΐ вода. При леко разбъркване реакцията се инкубира при 37°С за цяла нощ. След престоя ДНК се утаява с етанол и NaOAc чрез стандартни процедури, изсушава се и се ресуспердира в 15 μΐ 10Х Drall буфер (50 mM трис-HCl (,Н 7.5), 200 mM NaCl, 10 тМ MgClj, 1 тМ DTT), 5 μΐ Drall реустрикционен ензим (20 единици) и 130 μΐ вода. След леко разбъркване, реакционната смес се инкубира при 37°С за цяла нощ. ДНК отново се утаява с етанол и NaOAc, както по-горе, и се подлага електрофореза върху 1% нискотопяща агароза. Желаният по-голям рестрикционен фрагмент се изрязват от гела ДНК и се получава чрез пускане през Elutip-d колона. ДНК се съхранява в 30 μΐ 10 mM трие HCI pH 8,0.

Следните ДНК линкери се синтезират химически чрез Applied Biosystems ДНК синтезатор (модел 380В):

(х) 5' TATGTACGACCAACACCTGTGCGGCTCCCATCTG 3'

3' ACATGCTGGTTGTGGACACGCCGAGGGTA 5' for pRB175 (ii) 5' TATGTACGACGTTAACCAACACCTGTGCGGCTCCCATCTG 3'

3' ACATGCTGCAATTGGTTGTGGACACGCCGAGGGTA 5’ for pRB176 (iii) 5’ TATGTATAACCAACACCTGTGCGGCTCCCATCTG 3'

3' ACATATTGGTTGTGGACACGCCGAGGGTA 5’ for pRB177 (iv) 5' TATGTACGTrAACCAACACCTGTGCGGCTCCCATCTG 3'

3' ACATGCAATTGGTTGTGGACACGCCGAGGGTA 5' for _PRBI78

След пречистване на всеки от олигонуклеотидите, чрез електрофореза върху полиакриламиден гел, те се фосфорилират, в съответствие с начините, посочени по-горе, и се хибридизират, за да се улесни лигирането и коне- 5 труирането на аналога на гена на човешки проинсулин - кодиращите ДНК фрагменти. Линкерите (i) до (iv) се използват за конструиране съответно на плазмидите pRB175, pRB176, pRB177 и pRB178.

Около 3 μΐ от смлян с Ndel/Drall pRB172 векторен ДНК фрагмент се смесват с 4 μΐ от всеки от отделните подложени на действието на киназа линкери (i-iv) в буфер (50 μΐ), съдържащ 50μΜ трис-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCL,, тМ DTT, 800 цт АТР 6 единици от Т₄ ДНК лигаза. Реакционната смес се инкубира при 4°С, за цяла нощ и тази смес се използва за трансформиране на E.coli К12 RV308 клетки, в съответствие с процедурата от пример 29АЗ. Желаните трансформанти E.coli К12 RV308/ pRB175, E.coli К12 RV308/pRB176, E.coli K12 RV308/pRB177 и E.coli KI2 RV308/pRB178 ce идентифицират чрез анализ на тяхната плазмидна ДНК и протеина, получен преди и след индуциране на клетките при 42°С. Рестрикционният сайт и функционалната карта на плазмид pRB175 са показани на фигура 20 от приложените фигури.

Таблица I: Човешки проинсулииови аналози

Акалоа	Плазмио
Met-Tyr-Човешки проинсулин (HPI)	pRB145	11.3
Met-Aig-Met-(Lys(B28)_> Рго(В29)НР1]	pRB164A	10.5
Met-Tyr-[Lys(B28), Pro(B29)HPI]	pRB172	7.3
Met-Tyr-[Lys(B28), Рго(В29)В-верига]-О*	pRB173	ND
Ме1-Туг-[В-верига(-О*	pRB174	ND
Met-Tyr-[Des(Bl), Des(B2), Asp(B3), Lys(B28),	pRB175	8.5
Pro(B29)HPI] Met-Tyr-(Asp(Bl), Lys(B28), Pro(B29)HPI]
pRB176	9.3
Met*Tyr-[Des(Bl), Des(B2), Lys(B28),	pRB177	9.4
Pro(B29)HPI]
Met-Tyr-[Des(Bl), Lys(B28), Pro(B29)HPI]	pRB178	8.5

•Q = -Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-GluLcu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly>Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-LeuAla-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gla-;

ND - не е определен.

Д. Изходната култура E.coli K12 R12 RV308/pRB172 се преобразува в постоянна изходна култура по следния начин.

Изолирани колонии се забелязват на след- 50 ните фенотипни пластини L-агар + 5 (pg/ml Тс (тетрациклин), L-arap + Sm (стрептомицин сул фат), М-9 агарова следа (солева среда, съдържаща MgSO₄, тиамин, HYCASE и глюкоза) и М-9 агарова среда, без глюкоза и с лактоза. Една L-агарова/Тс пластина се инкубира при 42°С, а останалите пластини се инкубират при 30°С за 24 h. Фенотипно коректна колония, селекционирана от 30°С L-arap/Tc пластината се използва за иноклуиране на колба, съдържаща 50 ml L-хранителна среда (съдържаща триптон, дрождев екстракт, NaCl и глюкоза) плюс 5 pg/ ml Тс среда. Колбата се поставя на клатачка при 30°С в продължение на 7 h. Материалът от колбата (1,2 ml) се разпределя в биозамразяващи ампули и се замразява с парофазен течен азот. След това материалът се размразява и се използва 1 ml за инокулиране на колба, съдържаща 50 ml L-хранителна среда плюс 5 mcg/ml Тс. Колбата се поставя на клатачка при 30°С в продължение на 4 h. Две колби, съдържащи 500 ml BG-7 среда (съдържаща MgSO₄, тиамин, глюкоза, Тс и следи от соли), се инокулират с по 1 ml от посоченото по-горе и колбите се инкубират при разклащане в продължение на 9 h, при 30°С.

150-литров ферментатор, съдържащ 80 1 среда, включваща лимонена киселина, железен амониев сулфат, К₂НРО₄, NH₄Cl,NaH₂PO₄, СаС1₂, MgSO₄, глюкоза и следи от неорганични соли) се инокулира с 1 1 BG-7 хранителна среда, посочена по-горе. Ферментаторът работи при 30°С, докато скоростта на отделяне на въглеродния двуокис достигне 1.0 mM/1/min. В този момент 50 1 хранителна среда се прехвърлят в производствения ферментатор, за да се осигури клатачен инокулум.

2500-литров ферментатор, съдържащ 1500 1 от същата среда, използвана в 150-литровия ферментатор, работи при 30“С, докато скоростта на отделяне на въглеродния двуокис достигне 1,0 mM/1/min и след това температурата се увеличава до 40°С. Култивирането продължава още 8 h. След това хранителната среда се инактивира чрез загряване до 61°С, за 7 min. Следващите данни за добива се получават от топлинно инактивираната хранителна среда: Клетъчен добив, 13,1 g/Ι сухо тегло; активност на продукта 273, mcg ge 3 формилат/ml хранителна среда; специфична активност (т.е. грам продукт/грам клетки), 2,1%; процент формилиран продукт, 13%.

Ферментационната хранителна среда се прехвърля в танкер от неръждаема стомана и температурата се поддържа между 2° и 8°С. След това цялата хранителна среда се центрофугира или филтрира, за да се съберат клетките E.coli, като се получава приблизително 15 до 20% сухо тегло на твърдата маса.

Събраната клетъчна твърда маса се ресуспендира в отработена вода. След това клет ките се разкъсват, като се използват хомогенизация при високо налягане или други подходящи методи, за постигане на лизис при 90 до 99% от клетките. Хомогенната суспензия се разрежда до 5% сухо тегло с отработена вода. pH на разредената, разкъсана клетъчна суспензия се довежда до между 7 и 10 чрез добавяне на натриев хидроксид. Включените частици (гранули) се отделят от клетъчните отломки чрез диференциално центрофугиране. Полученият концентрат съдържа от 15 до 20% твърдо вещество.

Включените гранули се солюбилизират при алкално pH в присъствието на цистеин и карбамид. Тези солюбилизирани гранули се подлагат на скоростна катионобменна хроматография върху SP Sepharose-поток, за да се разтвори отново смесената дисулфидна форма на проинсулиновия аналог от основната маса гранулиран материал.

Метионилтирозиновото удължение на аминокрая на проинсулиновия аналог се отделя чрез инкубиране в присъствие на катепсин С, т.е. дипептидиламинопептидаза. Реакцията на разцепване с катепсин завършва със сулфитолиза с калиев тетратионат и цистеин при pH 8,8. След пропускане на получения Sсулфонат на проинсулиновия аналог през Sephadex G-25, той се поставя да се нагъне чрез инкубиране при pH 10,6 в присъствието на цистеин. Процесът на нагъване се прекъсва чрез довеждане на pH до 2,4. Правилно нагънатият проинсулинов аналог се отделя от неправилно нагънатия материал, както и от примесите останали от етапа на разцепването с катепсин-С чрез хидрофобна хроматография върху SP20SS смола. Това разделяне се осъществява с помощта на градиент на ацетон, при което органичният разтворител трябва да се отдели от главния поток чрез изпаряване преди по-нататъшна обработка.

След изпаряване на органична разтворител правилно нагънатият проинсулинов аналог се инкубира в присъствието на трипсин и карбоксипептидаза В. Тези енмизи изрязват С-пептида на проинсулиновия аналог и образуват Lys(B28), Рго(В29) човешки инсулин. След това инсулиновият аналог допълнително се пречиства чрез катионобменна хроматография върху S-Sephxrose чрез високоефективна проматография с обърната фаза, скоростна реверсивно-фазова хроматорафия вър xy 10 gm С-8 смола. Ацетонитрилът се отделя от основния поток на обратната фаза чрез пропускане през Sephadex G-25 и полученият продукт се концентрира, като се използва спираловидна ултрафилтрационна система. Концентрираният продукт се подлага на разделяне чрез хроматография върху Sephadex G-50 смола и се лиофилизира до сухо.

В следващата таблица II са дадени аминокиселините анализи на съединения от предшестващите примери.

to p cd cn XX p

CM cn p

cd

GO

XX s

co p d td

CM p to ч-z cn cn d

GO p

cd

CM oo p cn cn

ЧХ p

cd

CN

O см oo ex d ©x n

Sw« o p cd cn p

CM tn xx Ν’ p CN

P

4^ Ox Ox d

Οχ ρ tn ox cd tn o

G x CM d tn p cd

CM x^x 00

G x^x CN O d cd <η χ^χ CN ρ CN

CM ν-ζ CM ρ CN

Ox co d

CN σ

p VO co H сс X «

CD

Ο я

Ρ

5’

X Ρ

Λ1 3 <υ CD

Ο ρ w Я

Μ Ρ < ra X α

X ω X Ρ «1 . <u ο Ρ Λ ι

Ο

X Ρ I to <O

CN

X (X ο

Й

Ct Κ

X * u сП cn co cd e* CM

P

XX •—4 <N o cn o to χ—/ СП tn d p cd cm to

G s*z Ox Ox d tn Ч-/ so oo <d ox d ·* cn cn rMX S.Z χ,χ 4,/ O to Ox ρ οχ p p cd cd d t-x co p d

S; cd «Л o ox to cd

CM S*/ tn MJ

M3 S>

p d

tn p cd

ΟΟ ο z“4 /*>. Z*x Х-х *· w сп Ь

- - о Р -I р «J р

CM o tn

G χ»χ CM ρ d

CM en

G »^x Ό O d

Z“4 z“S XX. Z-ч z—« cn tn cn r-χ

ЧиХ 4«Z x^z

O Q tf) O0 00Oi

O oO t⁴· O Oxox cd cd cd dd cd

CM p

G

Se* e* d

CM •%-ζ οΟ ρ

G of d

ST cn % cd (N cm cn <n <n c*·* χχ ·χ-χ χχ χ—xχ-х

O ·* O сПoJ

O p p OxOX td cd rd do /-ч х-\ х-ч х-ч

СП СП СПГ*

ЧХ ХчХ Х.ХХ«х © Η Μ ΙΛн

Р О0 С-* о*-* cd cd cd d-d

Χ-Χ Ζ“Χ Ζ^4 X-ч ζ-4 cn tn tn Η •^-Ζ Ч^¹......

Ο CN

Ο 00 td cd to to p p cd cd

CM p

X~4 tn cd cn Ox td «ч/ сп Ох

G

X»X cH

ΜΊ cn z-ч

G⁴

Ox tn to cn •H d

Μι ρ cd ci

CN '•-x Ox to to co d

CM p cn cn cd

CM XX

CM p cd

GO co d tn <M ¢CM

O so ρ cd <n

4/ «

cd

CN

O <s s'·³ ·< н м «S Λ φ о м Ри erf >> o

Crf >

G s-X o d

Й cd cn cd

CM ’w* ЧП cn

CM

Ox p d α ν »-4 >х .3 £ >J aO M erf Λ <

o P Я e· •И

ο. έ

Ox O ’ Я xo

Я ^w < ® g· _o σ.

P ro X P i 2 § * «>

O re ! 1 s 1 a £ ' o

X a

Ϊ w

V и

XO <

O R

Q * “ e ce u ?* r-ι C« ? 5 ft >· 2^o я

<

V D u Q< O

U a

OJ erf &

Л o o u

S S

Рч “ tw W4 »» <©·< ¹ 2 p o

X p я

H ol m

«η 4»z CC ο

cc 'w' 00 VO

Г-* ο* O\

m· i-4

4-z 00 o

·—1 'w' e* o

so 5

'w' CC VO

<N s-* U0 C**

VO 00 Ok

S*' O 00

m 4—*· cc w-f

¢4 4.Z Ok <N

сс

oi

so

•—1

*-1

№

CC

»—1

U0

ec

cc

CN

7^4	/-4	/—4	Z“S z*s zS /-4 z-s	z-4	z-ч	/-4	/-4
cc	cc	cc			cc	<n
4—Z	s/	4Z	4-/ 4—z *-Z 4-/ S-Z Ч-Z 4—z 4/	4-z		4—z	4-/
o	cc	OO	оочоом-ио^^о	SO	SO	OO	o
G>	O0	e*	O ”* © O C* UO © ·-ΐ	oo	oo	Mr	o
CC	CN	oi	¢4 н »н чг н \d	cc	CN	<N	v—4

/-4 cc	/“4 cc	/-4 cc		/-4 /-4 rH	/-4 /-4 z—s m 0? <e	/“4 £-4. /“4 <N S M	Z*4 CC	z-4 CN	·—«
4«z	4^	%✓		s-< 4-z	4-z 4-/	w	4-Z «w*	\z		4-Z	ч—z
O	O	fr*	M·	CC OO ©J Ok	OO O	^-4	Μ Ok	3		©	VO
o	e*	oo	o	O Q	xt	М“ 00	e**	CC	00
cC	OJ	οί		Ο tC	—< vn	cc	m \O	cc	ri	<4	©

»—< w я я < ю л Н

z—k.

/•4

/•s

Z^h

Z*\

/-ч

Z-ч

Z“4

z*4

z-\

(S'

7*4»

z*s

Z4

/*4

cc

<c

CC

O

**·<

M-

*©

M*

CC

M*

CC

CN

4—f

4—z

4-z

4/

4Z

4-z

4—/

4-/

4Z

%—z

S^Z

4-/

o

s

00

Ol

СЧ

CC

U0

Ok

CC

so

00

uo

fr*

os

o

Ε*ζ

©

*T

©

o

•-1

<c

o

c*»

00

©

00

cc

<N

CN

»—1

W

•-Ч

uo

cc

oi

uo

cc

CN

o

Z^v CC

Z-4. cc

z-4 CC

7*4» e*

Z-4

Z*4 4Г

Z-4, M

z^. CN

Z-4 VO

z^. M·

z-4 CC

Z**4 CC

/-4 e-1

4-z

s-z

4-Z

s«z s-z

Ч-/

4Z

4-/

\·ζ

4-/

O

©

CC

Ok

OS

Ok

¢4.

00

O

WO

uo

Ok

w>

o

οδ

00

o

00

o »A

wo

t-

Os

e*^

o

CC

Ov

cc

CN

(N

so

»—4

cc

CC

r-4

wi

cc

CC

cc

o

z*4

Z-4. Z^\ Z—4 Ζ-4» z*\ /-*4. z-4 z**4 /-4 ζ-4» X4, /^,

cc

co

cc

e*

СЧ

SO

*e

<N

so

•ЧГ

<c

CN

*^Z

4-/

4—*

4-Z

4-/

•4/·

4-/

4^Z

%✓

>-z

S-z

4-/

’W

4—*·

o

Ok

M·

00

o

•M

<N

Ok

r*

o

S©

oo

Μ»

z-1

uo

U0

00

CO

M·

CN

oo

cc

CC

(N

40

•4

U0

*—t

М“

CC

w

WO

CC

cc

<N

O

a	M	«	GO	«4	oo	CO
«> U	f-	PU	•♦4 Д	*J	5	A <

се >»

О

Nle 0.93(1)

Orn 0.96(1)

Nva

Met 0.98(1)

Z—s Z*4

z-N. z-N

Z-N. Z“N Z-N Z“N Z*N Z-N

./-X

Z*X Z^4

/—c

ΓΊ

tn

cn

o*

*—<

*e

1

so

04

so

M·

cn

oj

4Z

x-z

XZ

n-z

Nm*

N*

Nm*

NZ

n*

Nm*

nm*

Nm*

O

•A

СП

04

Ό

©0

cn

SO

Os

SA

r*

04

r*

O

r*

so

o

r—1

Os

O

»“4

ΜΊ

*A

Os

«Ο

<=>

00

tn

OJ

oi

cn

*4

uS

cn

SA

cn

oi

ci

d

Z“s /—4

ZN /**4 Z*N Z“N z“N

Z4

SO Nm* so OS iA

-^N hZN. Z-N

ZN >w* 04 O

СП nm* O o cn

cn Nm* SO cn

tn Nm/ SA e*· oi

t* Nm* 00 OS so

•H N«Z OJ Ol

N-* SO 04

·*< Nm* f-4 ^-1

so Nm* ГЦ CO ^r

SA 4/

OJ Хм/ s5 ▼—4

xz Ь· cn

cn Nm* ©0 Oi cn

04 Nm* SA oi oi

ZN,

Z-N

Z*N.

Z“4

z^»

z-x

Z*4

z*N

z^N

СП*

c*?

ίη

t*·

SO

04

SO

SA

cn

04

—4

Хм*

Nm*

o

Q

00

4fr

—4

£

O'

сП

40

©0

r*

СЛ

»

SO

o

©$

e*.

O

—4

OS

co

•w

**

*e

so

©0

o

©0

cn

oi

o·

v-i

cn

SA

tn

Ή

SA

Mr

oi

d

Z*N.

7*N

/**N

z~N

Z^4

Z'N.

<Z'

7*X

z^.

л

Z4

Z*^4

Z*N

/**4

cn

tn

r*

•-I

»—4

so

OJ

SO

cn

Oi

v-1

NZ

Nm*

XwZ

NZ

Nm*

NM*

Nm*

N_Z

Nm*

o

so

/4

©0

Ά

•—1

’“I

GO

<*9

m*j

o

fr-

Φ

Os

Oi

o

O

^f·

O

ъ»

e*

©J

Ф

cn

oi

OJ

O

tn

f-4

cn

•-4

so

cn

r4

oJ

Z^4

Z*K

z*s

Z*x

z“s

z^>.

ZX

/***

/**ч

Z-N

Z*s

tn

чф

tn

r*

rH

so

че

04

so

M·

cn

04

Sm*

X/

4Z

N-Z

Nm*

xz

Nm*

Хм*

Nm*

Хм*

o

tn

чг

r*

O

5*

tn

4—1

04

©0

OJ

oi

SA

04

OJ

o

o-

o

Oi

O

•Чг

o

С-ζ

©0

cn

Ol

cn

tn

oi

o*

w4

cn

wS

tn

so

cn

oi

d

/*ч

z-x

Z“N

Z“S

Z*4

/-Х

Z^<

Z^s

Ζ·Ν

Z*v

z^

tn

fr*

Г“*

SO

OJ

so

Μ*

СП

ol

•Ή

4Z

Nm*

Чм*

NZ

Nm*

*M*

Хм*

Nm*

*»*

Nm*

Xw*

Nm*

NmZ

o

so

O

o

SA

C*·

*4

C*·

04

SA

Q

SO

»A

<A

o

o*

Ю

Oi

Os

o

cn

OS

SO

<A

©Ф

tn

oi

tn

SO

d

tn

cn

*4

»A

cn

04

oi

o

z**x

Z*N

z\

z-x

Z*N

zN

Z“*»

ΖΝ

z—N

Z-N.

Z^s,

ZN.

tn

cn

b<

o>

*e

tH

SO

•4t

OJ

so

СП

04

ч/

Nm*

4Z

Nm*

Хм*

NZ

X»m*

Nm*

Хм*

*w*

NZ

Nm*

co

Os

so

o

cn

OJ

fr-

SO

Os

tn

O

OI

o

SO

O

Oi

Os

o

SA

so

SA

o

Os

^4

•Ч

o

СП

tn

oi

t>

oi

tn

‘A

tn

*4

SO

cn

oi

*“*

Z*4

Z“N

z\

ZN

z-*4

Z*N

ZN

Z-\

Z*4

Z-N

/***

z*N

Z*N,

z*x

z^4

tn

en

tn

e·*

m4

•O’

“1

so

4f

OJ

so

че

M*

OI

Nm*

xz

S-Z

Nm*

Хм*

Nm*

*M*

N_Z

o

•—4

<A

*A

cn ¢9

Os

cn

OJ

04

SA

Oi

M¹

e*

o

*A

*O

04

OS Os

O

*A

r*_e

0ζ

o

SA

V>

r—1

oo

СП

oi

o

cn

*—<

M

cn

f*4

so

cn

oi

d

o M	►» rt *» МЧ	«Я —* >» «	4> 3	V и >> jJ	>>	40 M
СЧ	Ф <<	o >	ΣΞ -1	H H. Д	u

Ora

Nva. 0.98(1)

Met

Trp 0.89(1)

Физиологичните ефекти на инсулиновите аналози съгласно изобретението са показани в следната in vivo аналитична система.

Като животни за тестуване се използват нормални мъжки Spraque Dawley плъхове от 5 Charles River Laboratories (Portage, MI). При получаването им те са в тегловни граници от 160 до 180 g и се отглеждат една седмица в стаи за животни при 75° F с контролиран цикъл на осветление светло от 7,00 до 19,00 h, тъмно от 10 19,00 до 7,00 h). Животните се хранят с храна за плъхове Purina 5001, ad libitum. Плъховете, използвани за всеки опит, се обездвижват 16 h, преди тяхното използване. Когато се използват за първи път, те тежат около 200 g. При дости- 15 гане не тегло от около 275 g (за период от три седмици), животните не се използват повече. Една група от 10 мъжки плъха се използва всеки ден, за всяко тестувано съединение (т.е. биосинтетичен човешки инсулин, свински инсу- 20 лин и аналог на човешки инсулин. Всяка група се използва само веднъж през седмицата. Десетте плъха се разделят на две групи по пет плъха всяка. Едната група служи за контролна и подкожно й се прилага само носител. На дру- 25 гата група от пет плъха й се прилага тестваното съединение. Протеините се разтварят в 0.05N

HCI (pH 1,6), за да се получи изходен разтвор от 100 pdm/ml. От него се правят определен брой разреждания в обикновен физиологичен разтвор, който се инжектира подкожно в плъховете. Взема се 100 μΐ кръвна проба от опашната вена на всеки плъх, непосредствено и 30 min, 1 h, 2h, 3h, и 4h, след прилагането. Глюкозата се определя колориметрично, чрез глюкознооксидазен метод (Sigma Chemical Co).Процентното изменение на съдържанието на глюкоза в кръвта пробите от стойността нула на времето се изчислява за всеки плъх и крайните резултати се изразяват като среднопроцентно изменение ± SEM на експерименталната група, коригирана със средната промяна при контролната група за същия ден.

Построява се кривата доза - отговор от тестове с 4 до 7 различни концентрации на тестуваното съединение, като се използва максималния отговор в определен момент (обикновено 1 или 2 h след прилагането на протеина). От тази крива се определя E.D._J0стойност така, както и дозата за подкожно приложение ^g/kg) протеин, което дава половината от максималния хипоглицемичен отговор. Резултатите са показани в таблица III, посочена по-долу.

Таблица Ш^а

Съединение		Максимален ефект (96)	ED₅₀b	Биологична активност ^c
Човешки инсулин (HI)d		66	7.95	100
Свински инсулин		60	7.70	103
Lys(B28), Pro(B29)HI		66	6.8	117
AIa(B28), Pro(B29)HI		71	15.0	53
Asp(B28), Pro(B29)HI		64	10.2	78
Asp(BlO), Lys(B28), Pro(B29)Hl	53	10.7	74
Gln(B28), Pro(B29)HI		69	6.6	120
G1y(B28), Pro(B29)HI		58	10.5	76
Met(B28), Pio(B29)HI		51	14.6	54
Nle(B28), Pto(B29)HI		54	7.0	114
Orn(B28), Pro(B29)HI		60	12.7	63
Pro(B29)HI		63	8.7	91
Phe(B28), Pro(B29)HI		57	9.7	82
Val(B28), Pro(B29)HI		53	8.7	91

а- всички показани стойности се отнасят до кръвни проби, взети lh след прилагане на посоченото съединение.

В - изразени в pg/kg, подкожно с- отнася се за човешки инсулин d-биосинтетичен човешки инсулин Както е отбелязано по-горе, инсулиновите аналози от изобретението имат намалена склонност към димеризация или превръщане във форма с по-високо молекулно тегло. Така след прилагане на един или повече от посочените аналози се постига бързо показване на активността. Аналозите на инсулина от изобретението са ефективни при лечение на хипергликемия чрез прилагане спрямо нуждаещ се пациент на ефективно количество инсулинов аналог с формула I. Използваният тук термин “ефективно количество” означава такова количество на един или повече инсулинови аналози от изобретението, което е необходимо да намали или поддържа нивата на кръвната захар, както терапевтично, така профилактично. Обикновено това количество може да бъде от около 10 единици до около 60 единици или повече на ден (или от 0.3 до около 2 mg, с приблизително 29 единици на mg). Все пак трябва да се разбира, че количеството прилаган (и) в действителност инсулинов(и) аналогии) се определя от лекар, в зависимост от обстоятелствата, включително условията на лечение (т.е. причината за хипергликемията), конкретния прилаган аналог, избралия парентерален път на приложение, възрастта, теглото и реакцията на индивидуалния пациент и изразеност на симптомите при пациента. Следователно посочените граници на дозите не са предназначени да ограничат обхвата на изобретението по никакъв начин. Аналозите от инсулина от изобретението се прилагат спрямо съответните нуждаещи се пациенти (т.е. пациенти, страдащи от хипергликемия), чрез фармацевтични състави, съдържащи ефективно количество най-малко от един инсулинов аналог с формула I, в комбинация с един или повече фармацевтично приемливи пълнители или носители. За тези цели фармацевтичните състави обикновено могат да бъдат формувани така, че да съдържат около 100 единици на ml или подобни концентрации, съдържащи ефективно количество инсулинов(и) аналог (зи). Тези състави са обикновено, но не задължително, парентерални по своята същ ност и могат да бъдат получени по която и да е от множеството технологии, използващи конвенционални пълнители или носители за парентерални продукти, които са добре известни от нивото на техниката. Виж, например Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17-то издание, Mack Publishimg Company, Easton, PA, USA (1985), което се цитира тук за справка. Например дозирани форми за парентерално приложение могат да бъдат получени чрез суспендиране или разтваряне на желаното количество от най-малко един инсулинов аналог с формула I в нетоксичен течен носител, подходящ за инжектиране, като водна среда , стерилизиране на суспензията или разтвора. Алтернативно измерено количество от съединението може да бъде поставено в ампула и ампулата и нейното съдържание се стерилизират и запечатват. Носител или друга ампула могат да се използват за смесване преди приложението във фармацевтичните състави за парентерално приложение са включени разредители, пълнители и носители, като вода и водосмесими органични разтворители, като глицерин, сусамово масло, фъстъчено масло, воден пропилея гликол, Ν,Ν’-диметилформамид и други подобни. Примери за такива фармацевтични състави са стерилни, изотонични и водни физиологични разтвори на инсулиновите аналози с формула I, които могат да бъдат буферирани с фармацевтично приемлив буфер и които са апирогенни. В допълнение парентералната фармацевтична формула може да съдържа консерванти, като метакрезол или други агенти, които да регулират pH на крайния продукт, като натриев хидроксид или солна киселина.

Инсулиновите аналози от изобретението могат също така да бъдат формувани във фармацевтични състави, подходящи на назално приложение. Такива състави са подробно описан в европейско патентно описание 0200383 АЗ, което се цитира тук за справка. Накратко такива състави се формуват с един или повече фармацевтично приемливи разделители, фармацевтично приемливо количество на алкалнометална сол, амониева сол или свободната киселина на достатъчно свободния от цинк инсулин и по желание усилващо абсорбцията количество на най-малко един усилващ абсорбцията агент, избран от групата .състояща се от: 1 ) олеинова киселина или естер или съот ветна сол; 2) течна форма на сорбитанов, мастнокиселинен естер; 3)течна форма на полиоксиетиленово производно на сорбитанов, мастнокиселинен естер; 4) течна форма на хидроксиполиоксиетилен-полиоксипропилен-поли- 5 оксиетиленов кополимер.

За да се демонстрира ефикасността на приложението през носа на инсулиновия аналог Lys(B28), Рго(В29) човешки инсулин спрямо човешкия натриев инсулин, се осъществява следното изследване. Мъжки кучета от порада “Бигьл”, тежащи 10 до 12 кг се отглеждат в отлично физическо състояние, преди и по време на изследването. Кучетата се обездвижват, но имат достъп до вода, за да се избегнат неочаквани промени на нивото на инсулина. През целия курс на изследване кучетата се анестезират с натриев пентобарбитол и тяхната телесна температура се поддържа със загряващи възглавници, за да се намали промяната на глюкоза.

Пробите за изследване на инсулина (т.е. Lys(B28),Pro(B29) човешки инсулин и човешки натриев инсулин) се разтварят в дестилирана вода и pH на разтвора се довежда до 7,5 с натриев хидроксид. Крайната концентрация на инсулина е 70 единици на ml. Инсулинова доза от 0,8 единици на 1 kg от Lys(B28), Pro (В29) човешки инсулин се прилага спрямо осем кучета, а също така човешки натриев инсулин се прилага при доза от 0,8 единици на kg спрямо четири кучета. Всички дози се прилагат в назалната кухина, като се впръсква по веднъж във всяка ноздра с измерващ дозата небюлайзер и модифициран назален апликатор. Взимат се кръвни проби от югуларната вена 30, 15 и 0 min преди приложението, както и 10,20, 30,45,60,90,120,180, и 240 min след приложението, за да се измери намаляването на глюкоза в кръвта. Резултатите от това изследване са показани на таблица IV.

Таблица 1У^а

Време (мин)	Lys(B28), Рго(В29)човешки инсулин (% от първоначалния)	Човешки натриев инсулин (% от първоначалния)
-30	95.4 ±2.5	101.6 ±2.4
-15	98.2 ±2.8	102.4 ±2.9
0	* 100	100
10	95.4 ±2.1	100.8 ± 1.9
20	83.5 ±3.3	96.0 ±2.1
30	72.2 ±4.5	91.6 ±2.8
45	61.6 ±6.9	89.1 ±2.3
60	60.0 ± 6.0	93.6 ±4.5
90	71.6 ±4.6	92.2 ± 1.6
120	76.1 ±3.7	91.3 ±2.8
180	91.2 ±1.8	93.8 ± 1.8
240	85.4 ±2.7	90.7 ±2.8

а- нива на глюкоза в кръвта: средни ±

S.E.M.

Използвайки описания по-горе протокол, 50 се прави сравнение между намаляването на кръвната глюкоза от Lys (В29), Рго(В28) чо вешки инсулин при назално приложение с венозното и подкожно приложение, както следва. При венозното приложение, разтворът на инсулин, съдържащ Lys(B28), Рго(В29) човешки инсулинов аналог, се прилага чрез болус но инжектиране (0,1 единици на kg, в saphenous вената на четири кучета. Взимат се кръвни проби 30, 15 и 0 min преди приложението и 5, 10, 15, 20, 30, 45, 60, 90, 120,180, и 240 min след приложението. При подкожното прило- 5 жение разтворът на инсулин, съдържащ Lys(B28), Рго(В29) човешки инсулинов ана лог се прилага под епидермиса (0.2 единици на kg) от външната страна на хълбока на шест кучета. Взимат се кръвни проби съгласно същия протокол, като този при назалното приложение, посочено по-горе. Резултатите от това сравнително изследване са показани в таблица IV.

Таблица У^а

Време	l.V.	S.C.	Носово
(мин)	(% om	(% от	(% ОП1
	първоначалния)	първоначалния)	първоначалния)
-30	96.6 ±6.5	95.6 ±2.1	95.4 ±2.5
-15	101.3 ±1.5	98.7 ±2.7	98.2 ±2.8
0	100	100	100
5	99.9 ±2.5	-	-
10	84.8 ±4.0	99.2 ±4.8	95.4 ±2.1
15	68.1 ±2.7	•	•
20	54.5 ±3.3	91.9 ±2.4	83.5 ±3.3
30	43.3 ±2.8	81.6 ±3.0	72.2 ±4.5
45	•	55.8 ±3.5	61.6 ±6.9
60	55.3 ±3.1	35.3 ±3.1	60.6 ± 6.0
90	77.2 ±6.4	39.5 ±3.4	71.6 ±4.6
120	85.2 ±4.7	36.1 ±2.6	76.1 ±3.7
180	97.1 ±6.4	64.5 ±7.0	91.2 ±1.8
240	100.0 ±9.6	81.3 ±2.4	85.4 ±2.7
а нива на	глюкоза в кръвта: средни	± нататък.

Патентни претенции

Claims

Патентни претенции

S.E.M.

Микроорганизмите са депозирани в Agricultural Research Culture Collection, от 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61064, United States of America, както са посочени no-

1. Аналог на инсулина с формула

NH₂

I

Gly¹

I lie²

I

Vai³

Верига A (I)

16 17 18 19 20 21

Верига B или негова фармацевтично приемлива сол, в която А21 е аланин, аспарагин, аспарагинова киселина, глутамин, глутаминова киселина, глицин, треонин или серин; В1 е фенилаланин, аспарагинова киселина или отсъства; В2 е валин или може да отсъства, когато отсъства В1; ВЗ е аспарагин или аспарагинова киселина; В9 е серин или аспарагинова киселина; В10 е хистидин или аспарагинова киселина; В27 е треонин или отсъства; В28 е която и да е амино киселина, В29 е L-пролин, D-пролин, Dхидроксипролин, L-хидроксипролин, L-(N-Meтиллизин), D-лизин, Ь-(М-метиларгинин) или D-аргинин; ВЗО е аланин, треонин или отсъства; Z е -OH, -NH₂, -ОСН₃, или -ОСН₂СН₃; X е Arg, Arg-Arg,Lys, Lys-Lys, Arg-Lys, Lys-Arg или отсъства; a Y може да присъства само когато X присъства и ако присъства е Glu или аминокиселинна последователност, която включва цялата или част от последователността -Glu-AlaGlu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-GlyGly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-LeuAla-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg- и която започва от N- крайната Glu от тази последователност.
2. Аналог на инсулина съгласно претен- ция 1, характеризиращ се с това, че X и Y отсъстват, a Z е ОН.
3. Аналог на инсулина съгласно претенция 1 или 2, характеризиращ се с това, че В29 е L-пролин, D-пролин,D-хидроксипролин или L-хидроксипролин; а ВЗО е треонин.
4. Аналог на инсулина съгласно която и да е претенция от 1 до 3, характеризиращ се с това, че В28 е аспарагинова киселина, валин, левцин, изолевцин, норлевцин, пролин аргинин, хистидин, цитролин, орнитин, лизин, фенилаланин, аланин или глицин.
5. Аналог на инсулина съгласно която и да е претенция от 1 до 4, характеризиращ се с това, че В28 е аспарагинова киселина, валин, левцин, изолевцин, норлевцин, пролин, аргинин, хистидин, орнитин или лизин.
6. Аналог на инсулина съгласно която и да е претенция от 1 до 5, характеризиращ се с това, че В28 е лизин.
7. Аналог на инсулина съгласно която и да е претенция от 1 до 6, характеризиращ се с това, че В28 е лизин; В29 е L-пролин; ВЗО е треонин.
8. Аналог на инсулина съгласно която и да е претенция от 1 до 7, характеризиращ се с това, че А21 е аланин.
9. Аналог на инсулина съгласно която и да е претенция от 1 до 8, характеризиращ се с това, че В1 отсъства.
10. Аналог на инсулина съгласно която и да е претенция от 1 до 9, характеризиращ се с това, че В10 е аспарагинова киселина.
11. Аналог на инсулина съгласно която и да е претенция от 1 до 10, характеризиращ се с това, че В2 отсъства.
12. Аналог на инсулина съгласно претенция 11, характеризиращ се с това, че В10 е аспарагинова киселина.
13. Аналог на инсулина съгласно която и да е претенция от 1 до 12, характеризиращ се с това, че ВЗО отсъства.
14. Аналог на инсулина съгласно която и да е претенция от 1 до 13, характеризиращ се с това, че ВЗО е аланин.
15. Аналог на инсулина съгласно претенция 1 или 2, характеризиращ се с това, че В28 е L-пролин, a В29 е L-iN-метиллизин), D-лизин, Ь-(1Ч-метиларгинин) или D-аргинин.
16. Аналог на инсулина съгласно която и да е претенция от 1,2 и 15, характеризиращ се с това, че В28 е L-пролин, a В29 е L(Nметиллизин) или D-лизин.
17. Аналог на инсулина съгласно която и да е претенция от 1, 2,15 и 16, характеризиращ се с това, че А21 е аланин.
18. Аналог на инсулина съгласно която и да е претенция от 1,2 и 15 до 17, характеризиращ се с това, че В1 отсъства.
19. Аналог на инсулина съгласно която и да е претенция от 1,2 и 15 до 18, характеризиращ се с това, че В10 е хистидин.
20. Аналог на инсулина съгласно която и да е претенция от 1,2 и 15 до 19, характеризиращ се с това, че В2 отсъства.
21. Аналог на инсулина съгласно която и да е претенция от 1,2 и 15 до 18, характеризиращ се с това, че В10 е аспарагинова киселина.
22. Аналог на инсулина съгласно която и да е претенция от 1,2 и 15 до 21, характеризиращ се с това, че ВЗО отсъства.
23. Аналог на инсулина съгласно която и да е претенция от 1,2 и 15 до 21, характеризиращ се с това, че ВЗО е аланин.
24. Аналог на инсулина съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че А21 е аспарагин, В1 е фенилаланин, В2 е валин, ВЗ е аспарагин, В9 е серин, В10 е хистидин, В27 е треонин, В28 е лизин, В29 е L-пролин, ВЗО е треонин , Z е OH, X отсъства и Y отсъства.
25. Метод за получаване на съединение с формула, както е дефинирано в която и да е претенция от 1 до 24, характеризиращ се с това, че А верига от съединение с формула I, в която А21 е дефинирана в претенция 1, се свързва с В веригата от съединение с формула I, в която Bl, В2, ВЗ, В9, В10, В27, В28,В29,ВЗО, Χ,Υ и Ζ са дефинирани в претенция 1, до образуване на подходящите дисулфидни връзки; или несъдържащо пептидната последователност, започваща с В23, модифицирано съединение с формула I, в която А21,В1,В2,ВЗ,В9 и В10 са дефинирани в претенция 1, взаимодейства с пептид, имащ последователността Gly-Phe-PheTyr-B27-B28-B29-B30-X-Y-Z, в която В27, В28,В29,В30, X, Y и Z са дефинирани в претенция 1, или модифицирана проинсулинова молекула, съдържаща аминокиселинната последователност от съединение с формула I, в която А21, В1,В2,ВЗ,В9,В10, В27,В28,В29,В30,Х, Y и Z са дефинирани в претенция 1, се разцепва до отделяне на целия или част от С пептида от този модифициран проинсулин.
26. Фармацевтична форма, характеризираща се с това, че съдържа като активен компонент съединение с формула I съгласно която и да е претенция от 1 до 24 и един или повече фармацевтично приемливи носители.
27. Метод за лечение на диабет при бозайници, характеризиращ се с това, че се прилага съединение с формула I съгласно която и да е претенция от 1 до 24.
28. Съединение с формула I съгласно която и да е претенция от 1 до 24, характеризиращо се с това, че е получено по метода съгласно претенция 25.
29. Аналог на инсулина съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че е такъв, какъвто е описан в примерите.
30. Метод за получаване на аналог на инсулина, както е дефиниран в претенция 1, характеризиращ се с това, че е такъв, какъвто е описан в примерите от 1 до 28.
31. Плазмид за експресия на проинсулин, от който може да се получи аналог на инсулина съгласно претенция 1, както е описан в пример 29.
32. Плазмид за експресия на проинсулин, от който може да се получи аналог на инсулина съгласно претенция 1, както е описан във фигурите от 17 до 20.
33. Метод за получаване на плазмид за експресия на проинсулин, от който може да се получи аналог на инсулина съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че е такъв, какъвто е описан в пример 29.
34. Фармацевтичен състав за лечение на диабет при бозайници, характеризиращ се с това, че се състои от ефективно количество аналог на инсулина съгласно претенция 29, заед но с фармацевтично приемлив носител, разтворител и/или усилваща добавка.
35. Метод за лечение на диабет при бозайници, характеризиращ се с това, че се 5 прилага ефективно количество от аналог на инсулина съгласно претенция 29 или от състав съгласно претенция 34.