NO319171B1

NO319171B1 - Rekombinant fremgangsmate for fremstilling av en terapeutisk aktiv insulinanalog.

Info

Publication number: NO319171B1
Application number: NO19950721A
Authority: NO
Inventors: Bruce Hill Frank; James Edwin Shields; Richard Dennis Dimarchi; Ronald Eugene Chance
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1989-02-09
Filing date: 1995-02-24
Publication date: 2005-06-27
Also published as: NO950721L; NO950721D0

Abstract

Rekombinant fremgangsmåte for fremstilling av en terapeutisk aktiv lnsulinanalog med formelen,. eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav og et mellomprodukt som er nyttig i fremgangsmåten er beskrevet.

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en rekombinant fremgangsmåte for fremstilling av en terapeutisk aktiv insulinanalog. Oppfinnelsen angår videre et mellomprodukt fremstilt ved fremgangsmåten.

Foreliggende oppfinnelse er avdelt fra norsk patent nr. 179587.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en rekombinant fremgangsmåte for fremstilling av insulinanaloger med formelen

formel ( I)

eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, hvor Bl er fenylalanin, asparaginsyre eller er fraværende; B2 er valin eller kan være fraværende når Bl er fraværende; B3 er asparagin eller asparaginsyre; B10 er histidin eller asparaginsyre; B28 er en hvilken som helst aminosyre, B2 9 er L-prolin; D-lysin, eller L-Lysin; Z er -0H; X er Arg-Arg eller er fraværende; og Y kan være tilstede bare når X er tilstede og, hvis tilstedeværende, er Glu eller en aminosyresekvens som omfatter alle eller en del av sekvensen Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg og begynner ved N-terminusen Glu til en slik sekvens, kjennetegnet ved å: i) transfomere en vertscelle med DNA som koder for en proinsulin med formel I hvor X, Y og Z er til stede;

ii) dyrke den rekombinante vertscellen og isolere en

forbindelse som blir kodet av DNA i trinn i) og

iii) enzymatisk spalte forbindelsen for å fjerne X, Y og

Z for å tilveiebringe en insulinanalog.

En foretrukken utførelsesform omfatter en fremgangsmåte, kjennetegnet ved at Bl er fenylalanin; B2 er valin; B3 er asparagin; B10 er histidin, B28 lysin, B29 er L-prolin; Z er -0H; X er Arg-Arg: og Y er aminosyresekvensen Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg og begynner ved N-terminusen Glu til en slik sekvens.

Foreliggende oppfinnelsen angår videre mellomprodukt nyttig i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, kjennetegnet ved at det omfatter B-kjeden ifølge formel (I) hvor Bl er fenylalanin; B2 er valin; B3 er asparagin; B10 er histidin; B2 8 lysin; B29 er L-prolin; Z er -OH; X er Arg-Arg; og Y er aminosyresekvensen Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg og begynner ved N-terminusen Glu til en slik sekvens.

Insulinanalogene fremstil ifølge oppfinnelsen kan anvendes for behandling av hyperglycemi ved administrering til en pasient en effektiv mengde av en insulinanalog med formel I. Videre kan det fremstilles farmasøytiske sammensetninger inneholdende en effektiv mengde av en insulinanalog med formel I i kombinasjon med en eller flere farmasøytisk akseptable hjelpestoffer.

De tilveiebrakte figurene er ikke tegnet i nøyaktig skala. Figur 1 - Restriksjonssete og funksjonskart av plasmid pKC2 83. Figur 2 - Restriksjonssete og funksjonskart av plasmid pKC283PX. Figur 3 - Restriksjonssete og funksjonskart av plasmid pKC283-L. Figur 4 - Restriksjonssete og funksjonskart av plasmid pKC283-LB. Figur 5 - Restriksjonssete og funksjonskart av plasmid pKC283-PRS. Figur 6 - Restriksjonssete og funksjonskart av plasmid pL32 . Figur 7 - Restriksjonssete og funksjonskart av plasmid pNM789. Figur 8 - Skjematisk presentasjon av konstruksjon av plasmid 120. Figur 9 - Restriksjonssete og funksjonskart av plasmid pL47. Figur 10 - Restriksjonssete og funksjonskart av plasmid pPR12. Figur 11 - Restriksjonssete og funksjonskart av plasmid pPR12ARl. Figur 12 - Restriksjonssete og funksjonskart av plasmid pLUO. Figur 13 - Skjematisk presentasjon av konstruksjon av plasmid pLllOC. Figur 14 - Restriksjonssete og funksjonskart av plasmid pCZR126S. Figur 15 - Nukleotidsekvens til syntetisk humant proinsulingen. Figur 16 - Restriksjonssete og funksjonskart av plasmid pRB145. Figur 17 - Restriksjonssete og funksjonskart av plasmid pRB164A. Figur 18 - Restriksjonssete og funksjonskart av plasmid pRB172. Figur 19 - Restriksjonssete og funksjonskart av plasmid pRBl73. Figur 2 0 - Restriksjonssete og funksjonskart av plasmid pRB175.

Formel I er en forkortet representasjon av aminosyresekvensen til insulinanalogene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse. Aminosyreforkortelsene har følgende konvensjonelle betydninger:

B28 kan være en hvilken som helst naturlig eller ikke-naturlig oppstående aminosyre. Nevnte aminosyre er fortrinnsvis asparaginsyre, valin, leucin, isoleucin, norleucin, prolin, arginin, histidin, citrullin, ornitin, lysin, fenylalanin, alanin eller glycin. Av ovennevnte aminosyrer er en spesielt foretrukket undergruppe derav asparaginsyre, valin, leucin, isoleucin, norleucin, prolin, arginin, histidin, ornitin eller lysin. Lysin er den mest foretrukne aminosyren ved B28. B29 er fortrinnsvis L-prolin, D-lysin, eller L-lysin. En spesielt foretrukket insulinanalog ifølge foreliggende oppfinnelse er en hvori B28 er lysin og B29 er L-prolin, d.v.s. en ombytting av den native humane insulinaminosyre-sekvensen ved posisjonene 28 og 29 i B-kjeden.

Som nevnt ovenfor omfatter oppfinnelsen farmasøytisk akseptable salter av insulinanaloger. Foretrukne salter er salter av sink, natrium, kalium, magnesium eller kalsium.

Ved den rekombinante fremstillingen ifølge oppfinnelsen blir en nukleotidsekvens kodende for det ønskede peptidet til A eller B kjeden fremstilt ved anvendelse av rutinemessige teknikker for en slik syntese. Disse metodene omfatter generelt fremstilling av oligonukleotider som koder både for fragmenter av den ønskede kodende sekvensen og for den komplementære sekvensen derav. Oligonukleotidene er konstruert slik at de tilveiebringer overlapping av et fragment av den kodende sekvensen med to fragmenter av den komplementære sekvensen og omvendt. Oligonukleotider blir parret og spleiset. Dette danner den ønskede gensekvensen.

Sekvensen blir spleiset inn i en kloningsvektor i et sted som muliggjør at peptidproduktet som den koder for blir uttrykt. En egnet kloningsvektor inneholder minst en del av ekspresjonskontrollsekvensen til genet.

A og B kjedene til insulinanalogene kan også fremstilles via et proinsulin-lignende forløpermolekyl ved anvendelse av rekombinante DNA-teknikker. Se Frank et al., "Peptides: Synthesis-Structure-Function", Proe. Seventh Am. Pept. Symp., red. D. Rich og E. Gross (1981) som er inkorporert heri som referanse.

Trinnet som kombinerer de individuelle A og B kjedene kan oppnås ved hjelp av metoden til Chance et al., "Peptides: Synthesis, Structure and Function: Proe. of Seventh American Peptide Symposium" (1981) som er inkorporert heri som referanse.

Følgende eksempler er tilveiebrakt for å illustrere foreliggende oppfinnelse og skal ikke begrense denne.

Eksempel 1

Lys( B28), Pro( B29) human insulin

A. Preparering av rekombinant-avledet A-kjede

Human insulin A-kjede ble preparert via rekombinant DNA-teknologi fra kjemisk syntese av genet som koder for A-kjeden og ekspresjon derav i E. coli. Forklart i korte trekk, ble genet for A-kjeden syntetisert fra forskjellige trinukleotider inn i syntetiske fragmenter, deka-to pentadekanukleotider i lengde, ved en blokk-fosfotriestermetode. Genet har enkelt-trådede kohesive ender for Eco RI og Barn HI rest riks jonsendonukleaser. Spleising av dette inn i en hensiktsmessig ekspresjonsvektor inneholdende S-galaktosidasegenet (6-gal) tilveiebringer et chimerisk plasmid med A-kjeden bundet til fi-gal genet via et metioninkodon. Tryptofan-syntetasegenet (trp LE') blir fortrinnsvis anvendt som en promoter istedenfor fi-gal genet for å oppnå høyere ekspre-sjonsnivåer. Det chimeriske plasmidet ble transformert inn i E. coli og resulterte i ekspresjon av et forløper-protein, d.v.s. &-gal-met-A-kjede (eller trp LE'-met-A-kjede når trp LE' promotersystemet blir anvendt) . Behandling av forløperproteinet med cyanogenbromid spaltet metionin-bindingen og tilveiebrakte etter rensning human insulin A-kjede. Oksidativ sulfitolyse tilveiebrakte den S-sulfonerte A-kjeden som ble anvendt for kombinering med B-kjeden (S-sulfonat) som beskrevet.

Den detaljerte beskrivelsen angående kjemisk syntese av genene for den humane insulin A-kjeden er beskrevet i Crea et al., "Proe. Nati. Acad. Sei." USA, 75, 5765-5769, 1978 og referanser sitert deri som er inkorporert heri som referanse. For fullstendige detaljer på ekspresjonen i E. coli av det kjemisk syntetiserte genet for human insulin A-kjeden se Goeddel et al., "Proe. Nati. Acad. Sei." USA, 76, 101-110, 1979 og referanser sitert deri er inkorporert heri som referanse.

B. Preparering av B-kjede analog [Lys(B28), Pro(B29)]

En Applied Biosystems 430A peptidsyntese-maskin (inkludert programvare 1.4) ble anvendt for å fremstille rå peptidyl-harpiks. 0,5 millimol (mMol) av fastfase harpiks (t-BOC-Thr(Bzl)OCH2 Pam harpiks) ble anvendt (.76 mMol/g x .658 g). Alle aminosyrene som ble anvendt ble BOC-beskyttet og, med unntagelse av glutaminsyre og histidin, ble direkte anvendt som mottatt (d.v.s. i beholdere fra Applied Biosystems, Inc., idet hver beholder inneholdt omtrent 2 mmol beskyttet aminosyre). Glutaminsyre ' og histidin ble tilveiebrakt fra Peptides International Corporation og overført til beholdere slik at hver beholder inneholdt omtrent 2 mmol av den ønskede beskyttede aminosyren. Etter tørking av råpeptidyl-harpiksen (under vakuum ved romtemperatur over natt) ble vekten bestemt og sammenlignet med utgangsvekten for å forsikre tilstrekkelig vektøkning. En liten del av prøven ble utsatt for aminosyreanalyse for å forsikre at de ønskede aminosyrene ble tilsatt i riktige mengder.

Peptidet ble spaltet fra peptidyl-harpiksen og side-kjeden ble avbeskyttet ved omrøring i omtrent 1 time ved 0°C i en oppløsning bestående av 10 deler (v/w) HF (inneholdende 5% v/v etylmerkaptan og 5% v/v m-kresol) til 1 del peptidyl-harpiks. Etter at det meste av HF ble fjernet ved vakuum ble peptidet presipitert i etyleter. Etter flere skyllinger med etyleter etterfulgt av vakuumfiltrering ble peptidet løst opp i omtrent 2 00 ml 7M deionisert urea inneholdende 0, IM TRIS, 0,1M Na2SC>3 og 0,01M Na2S40g. Oppløsningen ble justert til pH 8,5 med 5N NaOH og omrørt over natt ved 4°C.

Den resulterende S-sulfonerte peptid-oppløsningen ble applisert på en Sephadex G-25 (Fine) 5 x 215 cm kolonne ved romtemperatur. Prøven ble eluert ved 20 ml/min ved romtemperatur ved anvendelse av 50 mM ammoniumbikarbonat. Eluatet ble registrert ved 276 nm. 20 ml fraksjoner ble samlet og en blanding av de ønskede fraksjonene dannet og ytterligere renset ved høytrykks-væskekromatografi (HPLC) som følger.

Blandingen av de ønskede fraksjonene ble pumpet på en 2,5 x 30 cm DuPont C8, 9-12// HPLC-kolonne og eluert ved . anvendelse av en lineær gradient med økende acetonitril i 100 mM ammoniumbikarbonat ved romtemperatur (2,6 ml/min). Eluatet ble registrert ved 280 nm. 25 ml fraksjoner ble samlet. Analytiske HPLC-analyser ble utført på valgte fraksjoner for å bestemme hvilke fraksjoner som skulle bevares. De ønskede fraksjonene ble slått sammen og lyofilisert, og anvendt i følgende kombinasjon med A-kjeden fremstilt som beskrevet ovenfor.

C. Preparering av Lys(B28), Pro(B29) human insulin Kombinasjon av A og B kjeden ble utført ved prosedyren til Chance et al., ovenfor. 700 mg rekombinant DNA-avledet A-kjede S-sulfonat og 140 mg syntetisk Lys(B28), Pro(B29) B-kjede S-sulfonat (begge tilveiebrakt som beskrevet ovenfor) ble hver løst opp i 70 ml og 14 ml, respektivt, 0,1M glycinbuffer ved romtemperatur, hver justert til pH 10,5 med 5N NaOH og deretter avkjølt til 5°C. 6 ml ditiotreitol (DTT) oppløsning ved 10,5 mg/ml ble preparert i 0,1M glycinbuffer ved romtemperatur, justert til pH 10,5 med 5N NaOH og deretter avkjølt til 5°C.

A- og B-kjede-oppløsningene ble slått sammen og deretter ble 5,21 ml av DTT-oppløsningen hurtig tilsatt (SH/SS0S3 = 0,90). Reaksjonsoppløsningen ble omrørt ved 5°C i en åpen 200 ml glass-sentrifugebeholder i 2,5 timer ved 5°C. 45 ml iseddiksyre ble tilsatt og oppløsningen ble latt stå ved 5°C over natt.

Den resulterende presipiterte blandingen ble sentrifugert i 20 minutter ved 2.000 rpm ved 5°C. Supernatanten ble kombinert med en IM eddiksyre-vask av pelleten og applisert på en 5 x 200 cm Sephadex G-50 (superfine) kolonne i molar eddiksyre ved 5°C og eluert ved tyngdekraften. Tyve-minutt fraksjoner ble samlet i tre dager. Fraksjonene ble undersøkt ved 276 nm og noen ved analytisk HPLC. Fraksjonene inneholdende Lys{B28), Pro(B29) sekvensen av insulinanalogen ble slått sammen og lyofilisert til en prøve på 125 mg. Denne prøven ble ytterligere renset ved revers-fase HPLC {ved anvendelse av en 2,12 x 25 cm DuPont C8 kolonne eluert ved romtemperatur, ved 2,6 ml/min, ved anvendelse av en lineær gradient med økende acetonitril i 0,1M NaH2P04, pH 2,2). Eluatet ble registrert ved 276 nm. Valgte fraksjoner ble analysert ved analytisk HPLC. De ønskede fraksjonene ble slått sammen og ytterligere renset ved anvendelse av pH 7 HPLC som følger.

Blandingen fra lav pH HPLC prepareringen ble fortynnet omtrent 2 ganger i et isbad med 0,1M (NH4)2HP04. pH ble justert til 7 med kald 2N NaOH i isbad. Prøven ble applisert og eluert fra samme HPLC-kolonne ved anvendelse av de samme betingelsene som lav pH prepareringskjøringen med unntagelse av at elueringsbufferen var 0,1M, pH 7 (NH4)2HP04/acetonitril.

Blandingen fra pH 7 HPLC preparative kjøringen ble avkjølt i et isbad og fortynnet to ganger med 0,1% vandig trifluoreddiksyre (TFA). IN HCl ble tilsatt (avkjølt, prøve i isbad) for å senke pH til 3. Prøven ble applisert på en Vydac C4 eller, alternativt en DuPont C8 HPLC-kolonne (2,12 x 25 cm) og eluert med en lineær gradient av økende acetonitril i 0,1% vandig TFA. Eluatet ble registrert ved 214 nm eller 2 76 nm. De ønskede fraksjonene ble slått sammen og lyofilisert, og dette tilveiebrakte en prøve på 41 mg av den ønskede analogen med større renhet enn 97 prosent ifølge revers-fase HPLC.

Eksempel 2

Lys( B28), Pro( B29) human insulin

En annen metode for preparering av Lys(B28), Pro(B29) human insulin anvender enzymatisk semisyntese (revers proteolyse) for å kombinere des-oktapeptid insulin (A^_2i - ^ 1- 22^ me<^ et syntetisk oktapeptid. Des-oktapeptid insulin ble tilveiebrakt fra en tryptisk spaltning av naturlig grise-eller human insulin som beskrevet av Bromer og Chance, "Preparation and Characterization of Des-octapeptide-Insulin", Biochim. Biophys. Acta, 133:219-223 (1967) som er inkorporert heri ved referanse. Det syntetiske oktapeptidet Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Lys-Pro-Thr ble fremstilt ved automatisk fast-fase syntese som beskrevet ovenfor.

Des-oktapeptid insulin (435 mg) og 465 mg syntetisk Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Lys-Pro-Thr ble kombinert i 15 ml av en oppløsning inneholdende 1 del dimetylsulfoksid, 2 deler 1,4-butandiol og 1 del 0,25M tris acetatbuffer pH 7,3. Peptidene ble fullstendig løst opp ved oppvarming av oppløsningen på en varmeplate. Oppløsningen ble deretter inkubert ved 37°C og 90 mg grisetrypsin ble tilsatt. Oppløsningen ble omrørt leilighetsvis i 90 minutter ved 37°C. Reaksjonen ble stoppet ved kombinering av oppløsningen med 135 ml 0,05N HCl.

Tittel-insulinanalogen ble renset ved applisering av den surgjorte oppløsningen inneholdende analogen på en 2,5 x 25 cm C-8 Zorbax HPLC kolonne og eluering av denne med en lineær gradient av økende acetonitril i 0,1M natrium monobasisk fosfat pH 2,2 buffer. Eluatet ble registrert ved 276 nm. De ønskede fraksjonene ble slått sammen, fortynnet to ganger med vann og applisert på en 1 x 25 cm C-8 Ultrasphere HPLC-kolonne. Analogen ble eluert med en lineær gradient av økende acetonitril i 0,5% vandig TFA. Eluatet ble registrert ved 276 nm. De ønskede fraksjonene ble igjen slått sammen og lyofilisert for å tilveiebringe 125 mg av den rensede analogen. Strukturen ble verifisert ved aminosyre-analyse {tabell I) og massespektroskopi {MS).

MS: 5809,2 (teoretisk: 5808,7).

"Fast Atom Bombardement" - massespektroskopi-analyser tilveiebrakt heri ble bestemt ved anvendelse av et VG-ZAB-25E dobbeltfokuserende massespektrometer ved en resolusjon på omtrent 1.500. Human insulinanalogene ble løst opp i en blanding av glycerol og tioglycerol inneholdende oxalsyre. Cesiumiodid ble anvendt for å kalibrere instrumentet som ble scannet magnetisk fra m/z 5.300 til m/z 6.500. De resulterende data er presentert som gjennomsnittlig masse + 1.

Eksempel 3

Aba( B28), Pro( B29) human insulin

Grise des-oktapeptid-insulin (384 mg) og syntetisk oktapeptid Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Aba-Pro-Thr (362 mg) ble slått sammen i 13 ml av en oppløsning inneholdende en del dimetylsulfoksid, to deler 1,4-butandiol og en del 0,25M tris pH 7,3 buffer ved 37°C. Grisetrypsin (75 mg) ble tilsatt. Oppløsningen ble grundig blandet og omrørt i 120 min. ved 37°C.

Reaksjonen ble deretter stoppet ved tilsetning av blandingen til 137 ml 0,05N HCl. Hele oppløsningen ble pumpet på en 21 x 250 mm C-8 Zorbax-kolonne, og produktene ble eluert i en grunn acetonitrilgradient i 0,1 M natrium-monobasisk fosfat, pH 2 buffer.

Hensiktsmessige fraksjoner, bestemt ved analytisk HPLC, ble slått sammen, fortynnet to ganger med vann og pumpet på en 25 x 300 mm C-18 Vydac-kolonne. Det avsaltede proteinet ble eluert fra kolonnen med en acetonitrilgradient i 0,5% trifluoreddiksyre. Fraksjonene inneholdende den rensede insulinanalogen ble slått sammen og lyofilisert til 59 mg. Strukturen ble verifisert ved aminosyreanalyse (tabell I) og massespektroskopi (MS).

MS: 5765,7 (teoretisk: 5765,6).

Eksempel 4

Ala( B28), Pro( B29) human insulin

Grise des-oktapeptidinsulin (290 mg) og syntetisk oktapeptid Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Ala-Pro-Thr (310 mg) ble kombinert i 10 ml av en oppløsning inneholdende en del dimetylsulfoksid, to deler 1,4-butandiol og en del 0,25M tris pH 7,3 buffer ved 37°C. Grisetrypsin (60 mg) ble tilsatt. Oppløsningen ble blandet godt og omrørt av og til i 60 min. ved 37°C.

Reaksjonen ble på denne tiden stoppet ved tilsetning av blandingen til 90 ml 0,05N HCl. Hele oppløsningen ble pumpet på en 21 x 250 mm C-8 Zorbax-kolonne, og produktene ble eluert i en grunn acetonitrilgradient i 0,1 M natrium monobasisk fosfatbuffer pH 2.

De hensiktsmessige fraksjonene, bestemt ved analytisk HPLC, ble slått sammen, fortynnet to ganger med vann, og pumpet på en 10 x 250 mm C-8 Ultrasphere-kolonne. Avsaltet protein ble eluert fra kolonnen med en acetonitrilgradient i 0,5% trifluoreddiksyre. Fraksjonene inneholdende den rensede insulinanalogen ble slått sammen og lyofilisert til 4 3 mg. Strukturen ble verifisert ved aminosyreanalyse (tabell I) og massespektroskopi (MS).

MS: 5752,3 (teoretisk: 5751,6).

Eksempel 5

Arg( B28),, Pro( B29) human insulin

Grise des-oktapeptidinsulin (290 mg) og syntetisk oktapeptid Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Arg-Pro-Thr (310 mg) ble kombinert i 10 ml av en oppløsning inneholdende en del dimetylsulfoksid, to deler 1,4-butandiol og en del 0,25M tris pH 7,3 buffer ved 37°C. Grisetrypsin (60 mg) ble tilsatt. Oppløsningen ble godt blandet og av og til omrørt i 60 min. ved 37°C.

Reaksjonen ble deretter stoppet ved tilsetning av blandingen til 90 ml 0,05N HCl. Hele oppløsningen ble pumpet på en 21 x 250 mm C-8 Zorbax-kol onne, og produktene ble eluert i en grunn acetonitrilgradient i 0,1 M natrium monobasisk fosfatbuffer pH 2.

Hensiktsmessige fraksjoner, bestemt ved analytisk HPLC, ble slått sammen, fortynnet to ganger med vann, og pumpet på en 10 x 250 mm C-8 Ultrasphere-kolonne. Det avsaltede proteinet ble eluert fra kolonnen med en acetonitrilgradient i 0,5% trifluoreddiksyre. Fraksjonene inneholdende den rensede insulinanalogen ble slått sammen og lyofilisert for åtilveiebringe 103 mg. Strukturen ble verifisert ved aminosyreanalyse (tabell I) og massespektroskopi (MS).

MS: 5836,1 (teoretisk: 5836,7).

Eksempel 6

Asn( B28), Pro( B2 9) human insulin

Grise des-oktapeptidinsulin (409 mg) og syntetisk oktapeptid Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Asn-Pro-Thr (3 98 mg) ble slått sammen i 14 ml av en oppløsning inneholdende en del dimetylsulfoksid, to deler 1,4-butandiol og en del 0,25M tris pH 7,3 buffer ved 37°C. Grisetrypsin (81 mg) ble tilsatt. Oppløsningen ble blandet grundig og omrørt av og til i 120 min. ved 37°C.

Reaksjonen ble nå stoppet ved tilsetning av blandingen til 136 ml 0,05N HCl. Hele oppløsningen ble pumpet på en 21 x 250 mm C-8 Zorbax-kol onne, og produktene ble eluert i en grunn acetonitrilgradient i 0,1 M natrium monobasisk fosfatbuffer pH 2.

Hensiktsmessige fraksjoner, bestemt ved analytisk HPLC, ble slått sammen, fortynnet to ganger med vann og pumpet på en 25 x 300 mm C-18 Vydac-kolonne. Avsaltet protein ble eluert fra kolonnen med en acetonitrilgradient i 0,5% trifluoreddiksyre. Fraksjonene inneholdende den rensede insulinanalogen ble slått sammen og lyofilisert til 56 mg. Strukturen ble verifisert ved aminosyreanalyse (tabell I) og massespektroskopi (MS).

MS: 5794,7 (teoretisk: 5794,6).

Eksempel 7

Asp( B28) Pro( B29) human insulin

Grise des-oktapeptidinsulin (400 mg) og syntetisk oktapeptid Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Asp-Pro-Thr (388 mg) ble slått sammen i 13 ml av en oppløsning inneholdende en del dimetylsulfoksid, to deler 1,4-butandiol og en del 0,25M tris pH 7,3 buffer ved 37°C. Grisetrypsin (78 mg) ble tilsatt. Oppløsningen ble grundig blandet og av og til omrørt i 120 min. ved 37°C.

Reaksjonen ble deretter stoppet ved tilsetning av blandingen til 137 ml 0,05N HCl. Hele oppløsningen ble pumpet på en 21 x 250 mm C-8 Zorbax-kol onne, og produktene ble eluert i en grunn acetonitrilgradient i 0,1 M natrium monobasisk fosfatbuffer pH 2.

Hensiktsmessige fraksjoner, bestemt ved analytisk HPLC, ble slått sammen, fortynnet fire ganger med vann og pumpet på en 25 x 300 mm C-18 Vydac-kolonne. Avsaltet protein ble eluert fra kolonnen med en acetonitrilgradient i 0,1% trifluoreddiksyre. Fraksjonene inneholdende den rensede insulinanalogen ble slått sammen og lyofilisert til 85 mg. Strukturen ble verifisert ved aminosyreanalyse (tabell I) og massespektroskopi (MS).

MS: 5795,7 (teoretisk: 5795,6).

Eksempel 8

Asp( BlO), Lys( B28), Pro( B29) human insulin

A. Preparering av Asp(BlO), Lys(B28), Pro(B29) human

insulin B-kjede.

En Applied Biosystems 430A peptidsyntese-maskin (inkludert "software revision" 1,4) ble anvendt for å preparere en rå peptidylharpiks. 0,5 millimol (mMol) av fastfase harpiksen (t-BOC-Thr(Bzl)0CH2 Pam harpiks) ble anvendt (.72 mMol/g x .705 g) . Alle anvendte aminosyrene ble BOC-beskyttet og, med unntagelse av glutaminsyre, asparaginsyre og histidin, ble alle direkte anvendt som mottatt (d.v.s. i beholdere fra Applied Biosystems, Inc.; idet hver beholder inneholdt omtrent 2 mmol beskyttet aminosyre). Glutaminsyre, asparaginsyre og histidin ble tilveiebrakt kommersielt og overført til beholdere slik at hver beholder omtrent inneholdt 2 mmol av den ønskede beskyttede aminosyren. Rå peptidylharpiksen ble tørket under vakuum ved romtemperatur over natt og dens vekt sammenlignet med utgangsvekten for å forsikre akseptabel vektøkning. En liten del av prøven ble utsatt for aminosyreanalyse for å forsikre at de ønskede aminosyrene ble tilsatt i riktige proporsjoner.

Peptidet ble spaltet fra peptidylharpiksen og sidekjeden ble avbeskyttet ved omrøring i omtrent 1 time ved 0°C i en oppløsning bestående av 10 deler (v/w) HF (inneholdende 5% v/v p-tiocresol og 5% v/v m-cresol) til 1 del peptidyl-harpiks. Etter fjerning av det meste av HF ved vakuum ble peptidet^presipitert i etyleter. Etter flere skyllinger med etyleter etterfulgt av vakuumfiltrering, ble peptidet løst opp i omtrent 120 ml 8M guanidin HCl pH 11, inneholdende 0,1M TRIS, 35 mg/ml Na2S03 og 25 mg/ml Na2S406. Oppløsningen ble justert til pH 8,8 med 5N NaOH og omfattende omrørt i 3 timer ved romtemperatur.

Den resulterende S-sulfonerte peptidoppløsningen ble applisert på en 5 x 215 cm Sephadex G-25 (medium) kolonne ved romtemperatur. Prøven ble eluert ved 21 ml/min. ved romtemperatur ved anvendelse av 50 mM ammoniumbikarbonat. Eluatet ble registrert ved 2 76 nm. Fraksjoner på hver 25 ml ble slått sammen, og en blanding av de ønskede fraksjonene ble ytterligere renset ved høy ytelse væskekromatografi (HPLC) som følger.

Blandingen av de ønskede fraksjonene ble pumpet på en 2,5 x 30 cm DuPont C8, 9-12/i HPLC-kolonne og eluert ved anvendelse av en lineær gradient av økende acetonitril i 100 mM ammoniumbikarbonat ved romtemperatur (2,6 ml/min.). Eluatet ble registrert ved 280 nm. Fraksjoner (25 ml hver) ble samlet. Analytiske HPLC-analyser ble utført på utvalgte fraksjoner for å bestemme hvilke som skulle beholdes. De ønskede fraksjonene ble slått sammen og lyofilisert og anvendt i følgende kombinasjon med A-kjeden.

B. Kombinasjon av Asp(BlO), Lys(B28), Pro(B29) human

insulin B-kjede med human insulin A-kjéde. Kombinasjonen av A og B kjedene ble tilveiebrakt ved prosedyren til Chance et al., ovenfor. To g rekombinant DNA-avledet A-kjede S-sulfonat og 400 mg syntetisk Asp(BlO), Lys(B28), Pro(B29) B-kjede S-sulfonat ble hver løst opp i 200 ml og 40 ml, respektivt, 0,1M glycinbuffer ved romtemperatur, hver justert til pH 10,5 med 5N NaOH og deretter avkjølt til 5°C. En ditiotreitol (DTT) oppløsning ved 15,5 mg/ml ble preparert i 0,1M glycinbuffer ved romtemperatur, justert til pH 10,5 med 5N NaOH og deretter avkjølt til 5°C.

A- og B-kjede oppløsningene ble kombinert og deretter ble 15,9 ml av DTT-oppløsningen hurtig tilsatt (SH/SSO3" = 1,0). Reaksjonsoppløsningen ble omrørt ved 4°C i en åpen 200 ml glass-sentrif ugef laske i 19,6 timer ved 4°C. Iseddiksyre (129 ml) ble tilsatt, og oppløsningen ble latt stå ved 4°C i en time.

Den resulterende utfelte blandingen ble sentrifugert i 30 minutter ved 2.000 rpm ved 4°C. Supernatanten ble kombinert med 292 ml milli-Q vann og 73 ml acetonitril og ytterligere renset ved revers-fase HPLC (ved anvendelse av en 2,5 x 30 cm Vydac C18 kolonne eluert ved romtemperatur ved 2,6 ml/min., ved anvendelse av en lineær gradient av økende acetonitril i 0,1M NaH2P04, pH 2,1). Eluatet ble registrert ved 280 nm. Valgte fraksjoner ble analysert ved analytisk HPLC og de ønskede fraksjonene ble slått sammen og fortynnet to ganger med 0,1% vandig trifluoreddiksyre (TFA), og deretter applisert på en Ultrasphere oktyl HPLC-kolonne (1,0 x 25 cm) og eluert med en lineær gradient av økende acetonitril i 0,1% vandig TFA. Eluatet ble registrert ved 280 nm. Valgte fraksjoner ble analysert ved analytisk HPLC og de ønskede fraksjonene ble slått sammen og på ny renset ved anvendelse av samme kolonne og betingelser som ovenfor med en noe annerledes gradient av acetonitril. Hensiktsmessige fraksjoner ble slått sammen og lyofilisert med et utbytte på 65 mg av insulinanalogen med mer enn 93% renhet ifølge revers-fase HPLC. Strukturen ble verifisert ved aminosyreanalyse (tabell I) og massespektroskopi (MS).

MS: 5786,1 (teoretisk: 5786,7).

Eksempel 9

Cya( B28), Pro( B29) human insulin

Permaursyre-oksidasjon ble utført for å omdanne cysteinet i oktapeptidet til cysteinsyreformen. Det syntetiske oktapeptidet Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Cys-Pro-Thr (363 mg) ble løst opp i 36 ml nylaget permaursyre i en isavkjølt flaske, og omrørt forsiktig i en time. Det oksiderte materialet ble fortynnet ti ganger med vann og lyofilisert. Lyofilisatet

ble anvendt i semisyntesen.

Grise des-oktapeptidinsulin (222 mg) og. syntetisk oktapeptid Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Cya-Pro-Thr (225 mg) ble kombinert i 18 ml av en oppløsning inneholdende en del dimetylsulfoksid, to deler 1,4-butandiol og en del 0,25M tris pH 7,3 buffer ved 37°C. Grisetrypsin (45 mg) ble tilsatt. Oppløsningen ble blandet godt og omrørt av og til i 120 min. ved 37°C.

Reaksjonen ble nå stoppet ved tilsetning av blandingen til 242 ml 0,05N HCl. Hele oppløsningen ble pumpet på en 21 x 250 mm C-8 Zorbax-kolonne, og produktene ble eluert i en grunn acetonitrilgradient i 0,1 M natrium monobasisk fosfatbuffer pH 2.

Hensiktsmessige fraksjoner, bestemt ved analytisk HPLC, ble slått sammen, fortynnet to ganger med vann, og pumpet på en 25 x 3 00 mm C-18 Vydac-kolonne. Avsaltet protein ble eluert fra kolonnen med en acetonitrilgradient i 0,5% trifluoreddiksyre. Fraksjonene inneholdende den rensede insulinanalogen ble slått sammen og lyofilisert til 16 mg. Strukturen ble verifisert ved aminosyreanalyse (tabell I) og massespektroskopi (MS).

MS: 5831,5 (teoretisk: 5831,7).

Eksempel 10

Gln( B28), Pro( B29) human insulin

Grise des-oktapeptidinsulin (290 mg) og syntetisk oktapeptid Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Gln-Pro-Thr (310 mg) ble kombinert i 10 ml av en oppløsning inneholdende en del dimetylsulf oksid, to deler 1,4-butandiol og en del 0,25M tris pH 7,3 buffer ved 37°C. Svinetrypsin (60 mg) ble tilsatt. Oppløsningen ble blandet godt og av og til omrørt i 60 min. ved 37°C.

Reaksjonen ble deretter stoppet ved tilsetning av blandingen til 90 ml 0,05N HCl. Hele oppløsningen ble pumpet på en 21 x 250 mm C-8 Zorbax-kolonne, og produktene ble eluert i en grunn acetonitrilgradient i 0,1 M natrium monobasisk fosfatbuffer pH 2.

Hensiktsmessige fraksjoner, bestemt ved analytisk HPLC, ble slått sammen, fortynnet to ganger med vann og pumpet på en 10 x 250 mm C-8 Ultrasphere kolonne. Avsaltet protein ble eluert fra kolonnen med en acetonitrilgradient i 0,5% trifluoreddiksyre. Fraksjoner inneholdende den rensede insulinanalogen ble slått sammen og lyofilisert til 87 mg. Strukturen ble verifisert ved aminosyreanalyse (tabell I) og massespektroskopi (MS).

MS: 5809,4 (teoretisk: 5808,6).

Eksempel 11

Glu( B28), Pro( B29) human insulin

Grise des-oktapeptidinsulin (402 mg) og syntetisk oktapeptid Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Glu-Pro-Thr (398 mg) ble kombinert i 14 ml av en oppløsning inneholdende en del dimetylsulfoksid, to deler 1,4-butandiol og en del 0,25M tris pH 7,3 buffer ved 37°C. Grisetrypsin (80 mg) ble tilsatt. Oppløsningen ble blandet godt og omrørt iblant i 120 min. ved 37°C.

Reaksjonen ble deretter stoppet ved tilsetning av blandingen til 136 ml 0,05N HCl. Hele oppløsningen ble pumpet på en 21 x 250 mm C-8 Zorbax-kol onne, og produktene ble eluert i en grunn acetonitrilgradient i 0,1 M natrium monobasisk fosfatbuffer pH 2.

Hensiktsmessige fraksjoner, bestemt ved analytisk HPLC, ble slått sammen, fortynnet fire ganger med vann, og pumpet på en 25 x 3 00 mm C-18 Vyda c-kol onne. Avsaltet protein ble eluert fra kolonnen med en acetonitrilgradient i 0,5% trifluoreddiksyre. Fraksjoner inneholdende den rensede insulinanalogen ble slått sammen og lyofilisert til 59 mg. Strukturen ble verifisert ved aminosyreanalyse (tabell I) og massespektroskopi (MS).

MS: 5809,6 (teoretisk: 5809,6).

Eksempel 12

Gly( B28), Pro( B29) human insulin

Grise des-oktapeptidinsulin (412 mg) og syntetisk oktapeptid Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Gly-Pro-Thr (376 mg) ble kombinert i 13 ml av en oppløsning inneholdende en del dimetylsulfoksid, to deler 1,4-butandiol og en del 0,25M tris pH 7,3 buffer ved 37°C. Grisetrypsin (79 mg) ble tilsatt. Oppløsningen ble omfattende blandet og omrørt av og til i 180 min. ved 37°C.

Reaksjonen ble deretter stoppet ved tilsetning av blandingen til 147 ml 0,05N HCl. Hele oppløsningen ble pumpet på en 21 x 250 mm C-8 Zorbax-kol onne, og produktene ble eluert i en grunn acetonitrilgradient i 0,1 M natrium monobasisk fosfatbuffer pH 2.

Hensiktsmessige fraksjoner, bestemt ved analytisk HPLC, ble slått sammen, fortynnet fire ganger med vann, og pumpet på en 25 x 300 mm C-18 Vydac-kolonne. Avsaltet protein ble eluert fra kolonnen med en acetonitrilgradient i 0,1% trifluoreddiksyre. Fraksjoner inneholdende den rensede insulinanalogen ble slått sammen og lyofilisert til 11 mg. Strukturen ble verifisert ved aminosyreanalyse (tabell I) og massespektroskopi (MS).

MS: 5737,2 (teoretisk: 5737,6).

Eksempel 13

His( B28), Pro( 29) human insulin

Grise des-oktapeptidinsulin (400 mg) og syntetisk oktapeptid Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-His-Pro-Thr (398 mg) ble kombinert i 13 ml av en oppløsning inneholdende en del dimetylsulfoksid, to deler 1,4-butandiol og en del 0,25M tris pH 7,3 buffer ved 37°C. Grisetrypsin (79 mg) ble tilsatt. Oppløsningen ble blandet godt og omrørt av og til i 120 min. ved 37°C.

Reaksjonen ble deretter stoppet ved tilsetning av blandingen til 237 ml 0,05N HCl. Hele oppløsningen ble pumpet på en 21 x 250 mm C-8 Zorbax-kol onne, og produktene ble eluert i en grunn acetonitrilgradient i 0,1 M natrium monobasisk fosfatbuffer pH 2.

Hensiktsmessige fraksjoner, bestemt ved analytisk HPLC, ble slått sammen, fortynnet fire ganger med vann, og pumpet på en 25 x 300 mm C-18 Vydac-kolonne. Avsaltet protein ble eluert fra kolonnen med en acetonitrilgradient i 0,1% trifluoreddiksyre. Fraksjoner inneholdende den rensede insulinanalogen ble slått sammen og lyofilisert til 79 mg. Strukturen ble verifisert ved aminosyreanalyse (tabell I) og massespektroskopi (MS).

MS: 5816,9 (teoretisk: 5817,7).

Eksempel 14

Ile( B28), Pro( B29) human insulin

Grise des-oktapeptidinsulin (409 mg) og syntetisk oktapeptid Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Ile-Pro-Thr (398 mg) ble kombinert i 13 ml av en oppløsning inneholdende en del dimetylsulfoksid, to deler 1,4-butandiol og en del 0,25M tris pH 7,3 buffer ved 37°C. Grisetrypsin (81 mg) ble tilsatt. Oppløsningen ble blandet godt og omrørt av og til i 120 min. ved 37°C.

Reaksjonen ble deretter stoppet ved tilsetning av blandingen til 136 ml 0,05N HCl. Hele oppløsningen ble pumpet på en 21 x 250 mm C-8 Zorbax-kolonne, og produktene ble eluert i en grunn acetonitrilgradient i 0,1 M natrium monobasisk fosfatbuffer pH 2.

Hensiktsmessige fraksjoner, bestemt ved analytisk HPLC, ble slått sammen, fortynnet to ganger med vann, og pumpet på en 25 x 300 mm C-18 Vydac-kolonne. Avsaltet protein ble eluert fra kolonnen med en acetonitrilgradient i 0,5% trifluoreddiksyre. Fraksjoner inneholdende den rensede insulinanalogen ble slått sammen og lyofilisert til 57 mg. Strukturen ble verifisert ved aminosyreanalyse (tabell I) og massespektroskopi (MS).

MS: 5793,7 (teoretisk: 5793,7).

Eksempel 15

Leu( B28), Pro( B29) human insulin

Grise des-oktapeptidinsulin (418 mg) og syntetisk oktapeptid Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Leu-Pro-Thr (410 mg) ble kombinert i 14 ml av en oppløsning inneholdende en del dimetylsulfoksid, to deler 1,4-butandiol og en del 0,25M tris pH 7,3 buffer ved 37°C. Grisetrypsin (83 mg) ble tilsatt. Oppløsningen ble blandet godt og omrørt av og til i 120 min. ved 37°C.

Reaksjonen ble deretter stoppet ved tilsetning av blandingen til 13 6 ml 0,05N HCl. Hele oppløsningen ble pumpet på en 21 x 250 mm C-8 Zorbax-kolonne, og produktene ble eluert i en grunn acetonitrilgradient i 0,1 M natrium monobasisk fosfatbuffer pH 2.

Hensiktsmessige fraksjoner, bestemt ved analytisk HPLC, ble slått sammen, fortynnet to ganger med vann, og pumpet på en 25 x 300 mm C-18 Vydac-kolonne. Avsaltet protein ble eluert fra kolonnen med en acetonitrilgradient i 0,5% trifluoreddiksyre. Fraksjoner inneholdende den rensede insulinanalogen ble slått sammen og lyofilisert til 74 mg. Strukturen ble verifisert ved aminosyreanalyse (tabell I) og massespektroskopi (MS).

MS: 5793,8 (teoretisk: 5793,7).

Eksempel 16

Nle( B28), Pro( B29) human insulin

Grise des-oktapeptidinsulin (290 mg) og syntetisk oktapeptid Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Nle-Pro-Thr (310 mg) ble kombinert i 10 ml av en oppløsning inneholdende en del dimetylsulfoksid, to deler 1,4-butandiol og en del 0,25M tris pH 7,3 buffer ved 37°C. Grisetrypsin (60 mg) ble tilsatt. Oppløsningen ble blandet godt og omrørt av og til i 60 min. ved 37°C.

Hensiktsmessige fraksjoner, bestemt ved analytisk HPLC, ble slått sammen, fortynnet to ganger med vann, og pumpet på en 10 x 250 mm C-8 Ultrasphere-kolonne. Avsaltet protein ble eluert fra kolonnen med en acetonitrilgradient i 0,5% trifluoreddiksyre. Fraksjoner inneholdende den rensede insulinanalogen ble slått sammen og lyofilisert til 54 mg. Strukturen ble verifisert ved aminosyreanalyse (tabell I) og massespektroskopi (MS).

MS: 5794,6 (teoretisk: 5793,7).

Eksempel 17

D- Lys( B29) human insulin

Grise des-oktapeptidinsulin (392 mg) og syntetisk oktapeptid Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-D-Lys-Thr (387 mg) ble kombinert i 13,5 ml av en oppløsning inneholdende en del dimetylsulfoksid, to deler 1,4-butandiol og en del 0,25M tris pH 7,3 buffer ved 37°C. Grisetrypsin (78 mg) ble tilsatt. Oppløsningen ble blandet godt og omrørt av og til i 120 min. ved 37°C.

Reaksjonen ble deretter stoppet ved tilsetning av blandingen til 136,5 ml 0,05N HCl. Hele oppløsningen ble pumpet på en 21 x 250 mm C-8 Zorbax-kolonne, og produktene ble eluert i en grunn acetonitrilgradient i 0,1 M natrium monobasisk fosfatbuffer pH 2.

Hensiktsmessige fraksjoner, bestemt ved analytisk HPLC, ble slått sammen, fortynnet fire ganger med vann, og pumpet på en 25 x 300 mm C-18 Vydac-kolonne. Avsaltet protein ble eluert fra kolonnen med en acetonitrilgradient i 0,5% trifluoreddiksyre. Fraksjoner inneholdende den rensede insulinanalogen ble slått sammen og lyofilisert til 94 mg. Strukturen ble verifisert ved aminosyreanalyse (tabell I) og massespektroskopi (MS).

MS: 5809,0 (teoretisk: 5808,7).

Eksempel 18

Met( B28), Pro( B29) human insulin

Grise des-oktapeptidinsulin (350 mg) og syntetisk oktapeptid Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Met-Pro-Thr (366 mg) ble kombinert i 12 ml av en oppløsning inneholdende en del dimetylsulfoksid, to deler 1,4-butandiol og en del 0,25M tris pH 7,3 buffer ved 37°C. Grisetrypsin (71 mg) ble tilsatt. Oppløsningen ble blandet omhyggelig og omrørt av og til i 120 min. ved 37°C.

Reaksjonen ble deretter stoppet ved tilsetning av blandingen til 118 ml 0,05N HCl. Hele oppløsningen ble pumpet på en 21 x 250 mm C-8 Zorbax-kolonne, og produktene ble eluert i en grunn acetonitrilgradient i 0,1 M natrium monobasisk fosfatbuffer pH 2.

Hensiktsmessige fraksjoner, bestemt ved analytisk HPLC, ble slått sammen, fortynnet fire ganger med vann, og pumpet på en 25 x 300 mm C-18 Vydac-kolonne. Avsaltet protein ble eluert fra kolonnen med en acetonitrilgradient i 0,1% trifluoreddiksyre. Fraksjoner inneholdende den rensede insulinanalogen ble slått sammen og lyofilisert til 72 mg. Strukturen ble verifisert ved aminosyreanalyse (tabell I) og massespektroskopi (MS).

MS: 5811,8 (teoretisk: 5811,7).

Eksempel 19

Orn( B28), Pro( B29) human insulin

Grise des-oktapeptidinsulin (290 mg) og syntetisk oktapeptid Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Orn-Pro-Thr (310 mg) ble kombinert i 10 ml av en oppløsning inneholdende en del dimetylsulfoksid, to deler 1,4-butandiol og en del 0,25M tris pH 7,3 buffer ved 37°C. Grisetrypsin (60 mg) ble tilsatt. Oppløsningen ble blandet omhyggelig og omrørt av og til i 90 min. ved 37°C.

Hensiktsmessige fraksjoner, bestemt ved analytisk HPLC, ble slått sammen, fortynnet to ganger med vann, og pumpet på en 10 x 250 mm C-8 Ultrasphere-kolonne. Avsaltet protein ble eluert fra kolonnen med en acetonitrilgradient i 0,5% trifluoreddiksyre. Fraksjoner inneholdende den rensede insulinanalogen ble slått sammen og lyofilisert til 89 mg. Strukturen ble verifisert ved aminosyreanalyse (tabell I) og massespektroskopi (MS).

MS: 5795,2 (teoretisk: 5794,7).

Eksempel 20

Phe( B28), Pro( B29) human insulin

Grise des-oktapeptidinsulin (290 mg) og syntetisk oktapeptid Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Phe-Pro-Thr (310 mg) ble kombinert i 10 ml av en oppløsning inneholdende en del dimetylsulfoksid, to deler 1,4-butandiol og en del 0,2 5M tris pH 7,3 buffer ved 37°C. Grisetrypsin (60 mg) ble tilsatt. Oppløsningen ble blandet godt og omrørt av og til i 80 min. ved 37°C.

Hensiktsmessige fraksjoner, bestemt ved analytisk HPLC, ble slått sammen, fortynnet fire ganger med vann, og pumpet på en 25 x 300 mm C-18 Vydac-kolonne. Avsaltet protein ble eluert fra kolonnen med en acetonitrilgradient i 0,1% trifluoreddiksyre. Fraksjoner inneholdende den rensede insulinanalogen ble slått sammen og lyofilisert til 17 mg. Strukturen ble verifisert ved aminosyreanalyse {tabell I) og massespektroskopi (MS).

MS: 5827,9 {teoretisk: 5827,7).

Eksempel 21

Pro( B29) human insulin

Grise des-oktapeptidinsulin (339 mg) og syntetisk oktapeptid Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Pro-Thr (363 mg) ble kombinert i 9 ml av en oppløsning inneholdende en del dimetylsulfoksid, to deler 1,4-butandiol og en del 0,25M tris pH 7,3 buffer ved 37°C. Grisetrypsin (70 mg) ble tilsatt. Oppløsningen ble blandet godt og omrørt av og til i 80 min. ved 37°C.

Reaksjonen ble deretter stoppet ved tilsetning av blandingen til 108 ml 0,05N HCl. Hele oppløsningen ble pumpet på en 10 x 250 mm C-8 Zorbax-kolonne, og produktene ble eluert i en grunn acetonitrilgradient i 0,1 M natrium monobasisk fosfatbuffer pH 2.

Hensiktsmessige fraksjoner, bestemt ved analytisk HPLC, ble slått sammen, fortynnet to ganger med vann, og pumpet på en 10 x 250 mm C-8 Ultrasphere-kolonne. Avsaltet protein ble eluert fra kolonnen med en acetonitrilgradient i 0,5% trifluoreddiksyre. Fraksjoner inneholdende den rensede insulinanalogen ble slått sammen og lyofilisert til 97 mg. Strukturen ble verifisert ved aminosyreanalyse (tabell I) og massespektroskopi (MS).

MS: 5778,6 (teoretisk: 5777,6).

Eksempel 22

Ser( B28), Pro( B29) human insulin

Grise des-oktapeptidinsulin (412 mg) og syntetisk oktapeptid Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Ser-Pro-Thr (390 mg) ble kombinert i 13 ml av en oppløsning inneholdende en del dimetylsulfoksid, to deler 1,4-butandiol og en del 0,25M tris pH 7,3 buffer ved 37°C. Grisetrypsin (80 mg) ble tilsatt. Oppløsningen ble blandet omhyggelig og omrørt av og til i 120 min. ved 37°C.

Reaksjonen ble deretter stoppet ved tilsetning av blandingen til 137 ml 0,05N HCl. Hele oppløsningen ble pumpet på en 21 x 250 mm C-8 Zorbax-kolonne, og produktene ble eluert i en grunn acetonitrilgradient i 0,1 M natrium monobasisk fosfatbuffer pH 2.

Hensiktsmessige fraksjoner, bestemt ved analytisk HPLC, ble slått sammen, fortynnet to ganger med vann, og pumpet på en 25 x 300 mm C-18 Vydac-kolonne. Avsaltet protein ble eluert fra kolonnen med en acetonitrilgradient i 0,5% trifluoreddiksyre. Fraksjoner inneholdende den rensede insulinanalogen ble slått sammen og lyofilisert til 37 mg. Strukturen ble verifisert ved aminosyreanalyse (tabell I) og massespektroskopi (MS).

MS: 5768,1 (teoretisk: 5767,6).

Eksempel 23

Thr( B28), Pro( B29) human insulin

Grise des-oktapeptidinsulin (437 mg) og syntetisk oktapeptid Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Thr-Pro-Thr (420 mg) ble kombinert i 14,5 ml av en oppløsning inneholdende en del dimetylsulfoksid, to deler 1,4-butandiol og en del 0,25M tris pH 7,3 buffer ved 37°C. Grisetrypsin (86 mg) ble tilsatt. Oppløsningen ble blandet omhyggelig og omrørt av og til i 120 min. ved 37°C.

Reaksjonen ble deretter stoppet ved tilsetning av blandingen til 135,5 ml 0,05N HCl. Hele oppløsningen ble pumpet på en 21 x 250 mm C-8 Zorbax-kolonne, og produktene ble eluert i en grunn acetonitrilgradient i 0,1 M natrium monobasisk fosfatbuffer pH 2.

Hensiktsmessige fraksjoner, bestemt ved analytisk HPLC, ble slått sammen, fortynnet to ganger med vann, og pumpet på en 25 x 3 00 mm C-18 Vydac-kolonne. Avsaltet protein ble eluert fra kolonnen med en acetonitrilgradient i 0,5% trifluoreddiksyre. Fraksjoner inneholdende den rensede insulinanalogen ble slått sammen og lyofilisert til 78 mg. Strukturen ble verifisert ved aminosyreanalyse (tabell I) og massespektroskopi (MS). MS: 5781,9 (teoretisk: 5781,6).

Eksempel 24

Trp( B28), Pro( B29) human insulin

Grise des-oktapeptidinsulin (310 mg) og syntetisk oktapeptid Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Trp-Pro-Thr (325 mg) ble kombinert i 10,5 ml av en oppløsning inneholdende en del dimetylsulfoksid, to deler 1,4-butandiol og en del 0,25M tris pH 7,3 buffer ved 37°C. Grisetrypsin (64 'mg) ble tilsatt. Oppløsningen ble blandet omhyggelig og omrørt av og til i 120 min. ved 37°C.

Reaksjonen ble deretter stoppet ved tilsetning av blandingen til 140 ml 0,05N HCl. Hele oppløsningen ble pumpet på en 21 x 250 mm C-8 Zorbax-kolonne, og produktene ble eluert i en grunn acetonitrilgradient i 0,1 M natrium monobasisk fosfatbuffer pH 2.

Hensiktsmessige fraksjoner, bestemt ved analytisk HPLC, ble slått sammen, fortynnet to ganger med vann, og pumpet på en 25 x 300 mm C-18 Vydac-kolonne. Avsaltet protein ble eluert fra kolonnen med en acetonitrilgradient i 0,5% trifluoreddiksyre. Fraksjoner inneholdende den rensede insulinanalogen ble slått sammen og lyofilisert til 47 mg. Strukturen ble verifisert ved aminosyreanalyse (tabell I) og massespektroskopi (MS).

MS: 5866,2 (teoretisk: 5866,7).

Eksempel 25

Tyr( B28), Pro( B29) human insulin

Grise des-oktapeptidinsulin (391 mg) og syntetisk oktapeptid Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Tyr-Pro-Thr (400 mg) ble kombinert i 13 ml av en oppløsning inneholdende en del dimetylsulfoksid, to deler l,4-butandiol og en del 0,25M tris pH 7,3 buffer ved 37°C. Grisetrypsin (79 mg) ble tilsatt. Oppløsningen ble blandet omhyggelig og omrørt av og til i 120 min. ved 37°C.

Hensiktsmessige fraksjoner, bestemt ved analytisk HPLC, ble slått sammen, fortynnet to ganger med vann, og pumpet på en 25 x 300 mm C-18 Vydac-kolonne. Avsaltet protein ble eluert fra kolonnen med en acetonitrilgradient i 0,5% trifluoreddiksyre. Fraksjoner inneholdende den rensede insulinanalogen ble slått sammen og lyofilisert til 30 mg. Strukturen ble verifisert ved aminosyreanalyse (tabell I) og massespektroskopi (MS).

MS: 5843,7 (teoretisk: 5843,7).

Eksempel 26

Val( B28), Pro( B29) human insulin

Grise des-oktapeptidinsulin (40 mg) og syntetisk oktapeptid Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Val-Pro-Thr (3 83 mg) ble kombinert i 12 ml av en oppløsning inneholdende en del dimetylsulfoksid, to deler 1,4-butandiol og en del 0,25M tris pH 7,3 buffer ved 37°C. Grisetrypsin (78 mg) ble tilsatt. Oppløsningen ble blandet omhyggelig og omrørt av og til i 120 min. ved 37°C.

Reaksjonen ble deretter stoppet ved tilsetning av blandingen til 238 ml 0,05N HCl. Hele oppløsningen ble pumpet på en 21 x 250 mm C-8 Z orbax-kol onne, og produktene ble eluert i en grunn acetonitrilgradient i 0,1 M natrium monobasisk fosfatbuffer pH 2.

Hensiktsmessige fraksjoner, bestemt ved analytisk HPLC, ble slått sammen, fortynnet fire ganger med vann, og pumpet på en 25 x 300 mm C-18 Vyda c-kol onne. Avsaltet protein ble eluert fra kolonnen med en acetonitrilgradient i 0,1% trifluoreddiksyre. Fraksjoner inneholdende den rensede insulinanalogen ble slått sammen og lyofilisert til 74 mg. Strukturen ble verifisert ved aminosyreanalyse (tabell I) og massespektroskopi (MS).

MS: 5780,0 (teoretisk: 5779,6).

Eksempel 27

Nva( B28), Pro( B29) human insulin

Grise des-oktapeptidinsulin (292 mg) og syntetisk oktapeptid Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Nva-Pro-Thr (279 mg) ble kombinert i 10 ml av en oppløsning inneholdende en del dimetylsulfoksid, to deler 1,4-butandiol og en del 0,25M tris pH 7,3 buffer ved 37°C. Grisetrypsin (57 mg) ble tilsatt. Oppløsningen ble blandet omhyggelig og omrørt av og til i 120 min. ved 37°C.

Reaksjonen ble deretter stoppet ved tilsetning av blandingen til 240 ml 0,05N HCl. Hele oppløsningen ble pumpet på en 21 x 250 mm C-8 Zorbax-kolonne, og produktene ble eluert i en grunn acetonitrilgradient i 0,1 M natrium monobasisk fosfatbuffer pH 2.

Hensiktsmessige fraksjoner, bestemt ved analytisk HPLC, ble slått sammen, fortynnet to ganger med vann, og pumpet på en 25 x 300 mm C-18 Vydac-kolonne. Avsaltet protein ble eluert fra kolonnen med en acetonitrilgradient i 0,5% trifluoreddiksyre. Fraksjoner inneholdende den rensede insulinanalogen ble slått sammen og lyofilisert til 51 mg. Strukturen ble verifisert ved aminosyreanalyse (tabell I) og massespektroskopi (MS).

MS: 5780,0 (teoretisk: 5779,6).

Eksempel 28

Ved anvendelse av prosedyrene beskrevet heri blir følgende ytterligere insulinanaloger preparert: (a) Asp(Bl),Lys(B28),Pro(B29) human insulin (b) des(Phe-Bl),Lys(B28),Pro(B29) human insulin (c) des(Phe-Bl),Asp(B10),Lys(B28),Pro(B29)human

insulin

(d) des(Phe-Bl,Val-B2),Lys(B28),Pro(B29)human insulin (e) des(Phe-Bl,Val-B2),Asp(B10),Lys(B28),Pro(B29)

human insulin

(f) Gly(A21),Asp(B10),Lys(B28),Pro(B29) human insulin (g) Ala(A21),Asp(B10),Lys(B28),Pro(B29) human insulin (h) des(Thr-B30),Lys(B28),Pro(B29) human insulin (i) Asp(B10),Arg(B28),Pro(B29) human insulin (j) Ala(A21),Arg(B28),Pro(B29) human insulin (k) Asp(Bl),Arg(B28),Pro(B29) human insulin

Eksempel 2 9

Lys(B28), Pro(B29) human insulin

Konstruksjon av rekombinante vektorer og verter

A. Konstruksjon av plasmid pCZR126S

1. Isolasjon av lasmid pKC283

Lyofiler av E. coli K12 BE1201/pKC283 blir tilveiebrakt fra Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois 61604, under aksesjonsnummer NRRL B-15830. Lyofiler blir dekantert i rør inneholdende 10 ml LB-medium (10 g Bacto-trypton, 5 g Bacto-gjærekstrakt og 10 g NaCl pr. liter; pH blir justert til 7,5) og inkubert i to timer ved 32°C, idet kulturene blir gjort 50 /xg/ml i ampicillin og deretter inkubert ved 32 °C over natt. E. coli K12 BE1201/pKC283 cellene blir dyrket ved 32°C på grunn av at cellene har et temperatur-følsomt cl-repressorgen integrert inn i cellulært DNA. Når celler som omfatter et vild-type lambda pL repressorgen eller ikke omfatter en lambda pL-promoter blir anvendt i denne plasmidisoleringsprosedyren, som beskrevet i påfølgende eksempler heri, er temperaturen ved inkubasjon 37°C.

En liten del av over-natt kulturen blir plassert på LB-agar (LB-medium med 15 g/l Bacto-agar) skåler inneholdende 50 /zg/ml ampicillin for å oppnå et enkelt koloni isolat av en E. coli K12 BE120l/pKC283. Den tilveiebrakte enkelte kolonien ble inokulert i 10 ml LB-medium inneholdende 50 /ig/ml ampicillin og inkubert over natt ved 32°C med omfattende rysting. 10 ml over natt kultur ble inokulert i 500 ml LB-medium inneholdende 50 /*g/ml ampicillin og inkubert ved 32°C med omfattende rysting helt til kulturen nådde stasjonær fase.

Følgende prosedyre er tilpasset fra Maniatis et al., 1982, "Molecular Cloning" (Cold Spring Harbor Laboratory).

Cellene ble høstet ved sentrifugering ved 4.000 g i 10 minutter ved 4°C, og supernatantene ble fjernet. Cellepelleten ble vasket i 100 ml iskald STE-buffer (0,1 M NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 7,8; og 1 mM EDTA). Etter vaskingen ble cellepelleten resuspendert i 10 ml oppløsning 1 (50 mM glukose; 25 mM Tris-HCl, pH 8,0; og 10 mM EDTA) inneholdende 5 mg/ml lysozym og latt stå ved romtemperatur i 10 minutter. Tyve ml oppløsning 2 (0,2 N NaOH og 1% SDS) ble deretter satt til lysozym-behandlede celler, og oppløsningen ble forsiktig blandet ved inversjon.

Blandingen ble inkubert på is i 10 minutter.

Femten ml iskald 5 M kaliumacetat, pH 4,8, ble satt til den lyserte celleblandingen og blandingen ble blandet ved inversjon. Oppløsningen ble inkubert på is i 10 minutter. 5 M kaliumacetat-oppløsning ble preparert ved tilsetning av 11,5 ml iseddiksyre ■ til 28,5 ml vann og 60 ml 5 M kaliumacetat; og den resulterende oppløsningen er 3 M med hensyn på kalium og 5 M med hensyn på acetat.

Den lyserte celleblandingen ble sentrifugert i en Beckman SW27 (eller ekvivalentet derav) ved 20.000 rpm i 20 minutter ved 4°C. Celle-DNA og debriet dannet en pellet i bunnen av røret. Omtrent 36 ml av supernatanten ble isolert, og 0,6 volum isopropanol ble tilsatt, blandet og den resulterende oppløsningen ble latt stå i romtemperatur i 15 minutter. Plasmid DNA ble samlet ved sentrifugering ved 12.000 g i 30 minutter ved romtemperatur. Supernatanten ble fjernet og DNA-pelleten ble vasket med 70% etanol ved romtemperatur. Etanol-vaskeblandingen ble dekantert, og pelleten ble tørket i en vakuum-desikator. Pelleten ble deretter resuspendert i 8 ml TE-buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0 og 1 mM EDTA).

Åtte gram CsCl ble satt til DNA-oppløsningen. Omtrent 0,8 ml av en 10 mg/ml oppløsning etidiumbromid i vann ble tilsatt for hver 10 ml CsCl-DNA oppløsning. Den endelige tettheten til oppløsningen var omtrent 1,55 g/ml, og etidiumbromid-konsentrasjonen var omtrent 600 //g/ml. Oppløsningen ble overført til et Beckman type 50 sentrifugerør, fylt opp med parafinolje, forseglet og sentrifugert ved 45.000 rpm i 24 timer ved 20°C. Etter sentrifugeringen var to DNA-bånd synlige i vanlig lys. Etter fjerning av toppen av røret ble det lavere DNA-båndet fjernet ved anvendelse av en sprøyte med en nr. 21 hypodermisk nål stukket inn gjennom veggen av sentrifugerøret.

Etidiumbromid ble fjernet ved flere ekstraheringer med vann-mettet 1-butanol. CsCl ble fjernet ved dialyse mot TE-buffer. Etter ekstraksjoner med bufferet fenol og deretter kloroform ble DNA presipitert, vasket med 70% etanol, og tørket. Omtrent 1 mg plasmid pKC283 ble tilveiebrakt og lagret ved 4°C i TE-buffer i en konsentrasjon på omtrent 1 Hg/[ il. Et restriks jonssete og funksjonskart av plasmid pKC283 er presentert i figur 1.

2. Konstruksjon av plasmid pKC283PX

Omtrent 10 /il plasmid pKC2 83 DNA preparert i eksempel 1 ble blandet med 2 0 /il 10 X medium-salt restriks jonsbuf f er (500 mM NaCl; 100 mM Tris-HCl, pH 7,5; 100 mM MgCl2; og 10 mM DTT) , 20 /il 1 mg/ml BSA, 5 /il restriksjonsenzym PyuII ($50 enheter, definert av Bethesda Research Laboratories (BRL), hvor alle restriksjonsenzymene anvendt heri er tilveiebrakt fra) , og 145 /il vann, og den resulterende reaksjonen ble inkubert ved 37°C i 2 timer. Reaksjonene med restriksjonsenzym beskrevet heri ble rutinemessig avsluttet med fenol og deretter kloroform-ekstraheringer, som ble etterfulgt av presipitasjon av DNA, etanolvask og resuspensjon av DNA i TE-buffer. Etter avsluttet P<y>uII spaltning som beskrevet ovenfor ble PyuII-spaltet plasmid pKC283 DNA presipitert og deretter resuspendert i 5 f/l TE-buffer.

Omtrent 600 picomol (pM) Xhol linkere (5<1->CCTCGAGG-3<1>) ble kinase-behandlet i en blanding inneholdende 10 /il 5 X kinase-buffer (300 mM Tris-HCl, pH 7,8; 50 mM MgCl2; og 25 mM DTT), 5 fil 5 mM ATP, 24 /xl H20, 0,5 /il T4 polynukleotid-kinase (omtrent 2,5 enheter definert av P-L Biochemicals), 5 /il 1 mg/ml BSA og 5 ^1 10 mM spermidin ved inkubering av blandingen ved 37°C i 30 minutter.

Omtrent 12,5 /il kinasebehandlede Xhol linkere ble satt til 5 /il PvuII-spaltet plasmid pKC283'DNA, og deretter ble 2,5 /il 10 X ligasebuffer (300 mM Tris-HCl, pH 7,6; 100 mM MgCl2; og 50 mM DTT), 2,5 /il 1 mg/ml BSA, 7 /il 5 mM ATP, 2,5 /il (omtrent 2,5 enheter definert av P-L Biochemicals) T4 DNA-ligase, 2,5 /il 10 mM spermidin og 3 /il vann satt til DNAet. Den resulterende ligeringsreaksjonen ble inkubert ved 4°C over natt. Etter ligeringsreaksjonen ble reaksjonsblandingen justert til en sammensetning med høy-salt buffer (0,1 M NaCl; 0,05 M Tris-HCl, pH 7,5; 10,0 mM MgCl2; og 1 mM DTT). Omtrent 10 ( il (100 enheter) restriks jonsenzym Xhol ble satt til blandingen, og den resulterende reaksjonen ble inkubert ved 37°C i 2 timer.

Reaksjonen ble avsluttet, Xhol-spaltet DNA ble presipitert, resuspendert og ligert som beskrevet ovenfor, med unntagelse av at ingen Xhol-linkere ble satt til ligeringsblåndingen. Det ligerte DNA inneholdt ønsket plasmid pKC283PX. Et restriksjonssete og funksjonskart av plasmid pKC283PX er presentert i figur 2 i de vedlagte tegningene.

3. Konstruksjon av E. coli K12 MOfX±)/ dKC283PX

E. coil K12 (MO(X<+>) kan bli tilveiebragt fra Northern Regional Research Laboratories i lyofilisert form under aksesjonsnummer NSRL B-15993. E. coli K12 MO(X<+>) omfatter vill-type lambda pL cl repressor-genet, slik at transkripsjon fra hybrid pL- lpp-promoteren ifølge foreliggende oppfinnelse ikke er tilstede i E. coli K12 MO(X<+>) cellene. Lyofilene blir rekonstituert, enkeltkolonier av M0(X<+>) isolert og en 10 ml overnatt kultur av M0(X<+>) cellene blir preparert i henhold til prosedyren i eksempel 29A1, med unntagelse av at temperaturen ved inkubasjonen er 37 'C og at det ikke anvendes ampicillin i vekstmediet.

Femti ul overnatt kultur ble anvendt for å inokulere 5 ml LB-medium som også inneholdt 10 mM MgSC>4 og 10 mM MgCl2> Kulturen ble inkubert ved 37'C overnatt med omfattende rysting. Den følgende morgenen ble kulturen fortynnet til 200 ml med LB-medium inneholdende 10 mM MgS04 og 10 mM MgCl2-Den fortynnede kulturen ble inkubert ved 37<*>C med omfattende rysting helt til absorbansen ved 550 nm (Aggø) var omtrent 0,5, som angir en celletetthet på omtrent 1 x 10<8> celler/ml. Kulturen ble avkjølt i ti minutter i et is-vannbad, og cellene ble deretter samlet ved sentrifugering ved 4.000 g i 10 minutter ved 4<*>C. Cellepelleten ble resuspendert i 100 ml kald 10 mM MgS04 og deretter på ny pelletert ved sentrifugering. Cellepelleten ble resuspendert i 100 ml 30 mM CaCl2 og inkubert på is i 20 minutter.

Cellene ble igjen samlet ved sentrifugering og resuspendert i 10 ml 30 mM CaClg^ En halv ml aliquot av cellene ble satt til ligert DNA preparert i eksempel 29A2; og DNA var på 30 mM i CaCl2» Celle-DNA blandingen ble inkubert på is i en time, varme-sjokkbehandlet ved 42°C i 90 sekunder, og deretter avkjølt på is i omtrent to minutter. Celle-DNA blandingen ble fortynnet i 10 ml LB-medium i 125 ml flasker og inkubert ved 37° C i en time. Ett hundre pl aliquoter ble sådd ut på LB-agarskåler inneholdende ampicillin og inkubert ved 37'C helt til kolonier fremkom.

Koloniene ble dyrket enkeltvis, og plasmid DNA til de individuelle koloniene ble undersøkt ved restriksjonsenzym-analyser og gelelektroforese. Plasmid DNA-isolasjon ble utført i mindre skala i henhold til prosedyren i eksempel 29A1, men CsCl-gradienttrinnet ble utelatt helt til de ønskede E. coli K12 M0(\<+>)/pKC283PX transformantene ble identifisert. Et restriksjonssete og funksjonskart av plasmid pKC283PX er presentert i figur 2.

4. Konstruksjon av E. coli K12 MQfX±WoKC283- L

Ti jig plasmid pKC283PX DNA preparert i henhold til prosedyren i eksempel 29A1 ble løst opp 1 20 pl 10X høy-salt buffer, 20 pl 1 mg/ml BSA, 5 pl (~50 enheter) restriksjonsenzym Bglll. 5 pl (-50 enheter) restriksjonsenzym Xhol og 150 pl vann, og den resulterende reaksjonen ble inkubert ved 37°C i to timer. Reaksjonen ble stoppet og etter presipitering av Bglll- Xhol spaltet DNA, ble DNA resuspendert i 5 pl TE-buffer.

En DNA-linker med enkelt-trådede DNA-ender karakteristiske for B<g>lll og Xhol restriksjonsenzym-spaltning ble syntetisert og kinasebehandlet. Linkeren ble kinase-behandlet vesentlig som i prosedyren i eksempel 29A2. DNA-linker hadde følgende struktur:

Linkeren angitt ovenfor ble syntetisert fra enkelt-trådede deoksyoligonukleotider ifølge velkjente prosedyrer. Enkelt-trådede deoksyoligonukleotider kan bli syntetisert med kommersielt tilgjengelige instrumenter, så som 380A DNA Synthesizer forhandlet av Applied Biosystems (850 Lincoln Centre Drive, Foster City, CA 94404), som anvender fosfor-amidit-kjemi. Andre prosedyrer for syntetisering av DNA er også kjent innenfor fagområdet. Den konvensjonelt modifiserte fosfotriester-metoden for syntetisering av enkelt-trådet DNA er beskrevet i Itakura et al., 1977, Science 198:1056 og i Crea et al., 1978, Proe. Nat. Acad. Sei. USA 75:5765. I tillegg utgjør en spesielt foretrukket metode for syntetisering av DNA-metoden til Hsiung et al., 1983, Nucleic Acid Research 11:3227 og Narang et al., 1980, Methods in Enzymology 68:90.

Linkeren og BalII- Xhol-spaltet plasmid pKC283PX ble ligert vesentlig som i prosedyren i eksempel 29A2. Ligert DNA utgjør det ønskede plasmidet pKC283-L. Et restriksjonssete og funksjonskart av plasmid pKC283-L er presentert i figur 3. Plasmid pKC283-L DNA ble anvendt for å transformere E. coli K12 M0(X<+>) og resulterende E. coli K12 M0(X<+>)/pKC283-L transformanter ble identifisert vesentlig som i prosedyren i eksempel 29A3.

5. Konstruks. ion av E. coil K12 ( M0( X±)/ dKC283- LB

Omtrent 10 pl plasmid pKC283-L DNA, fremstilt vesentlig som i prosedyrene i eksempel 28A1, ble løst opp i 20 pl 10X høy-salt buffer, 20 pl 1 mg/ml BSA, 5 pl (-50 enheter) restriksjonsenzym Xhol. 155 pl H2O og den resulterende reaksjonen ble inkubert ved 37"C i ti timer. Xhol-spaltet plasmid pKC283-L DNA ble deretter presipitert fra reaksjonsblandingen ved tilsetning av tre volumer 95SÉ etanol og en tiendedel volum 3 M natriumacetat, inkubert i et tørris-etanolbad i fem minutter og sentrifugert. Den resulterende DNA-pelleten ble vasket med 709É etanol, tørket og resuspendert i 2 pl 10X nick-translasjonsbuffer (0,5 M Tris-HCl, pH 7,2; 0,1 M MgS04; og 1 mM DTT), 1 pl av en oppløsning 2 mM i hver av deoksy-nukleotid-trifosfatene, 15 pl HgO, 1 pl (-6 enheter definert av P-L Biochemicals) Klenow, som er det store fragmentet til E. coil DNA-polymerase I, og 1 pl 1 mg/ml BSA. Den resulterende reaksjonen ble inkubert ved 25<*>C i 30 minutter og reaksjonen ble stoppet ved lnkubering av oppløsningen ved 70°C i fem minutter.

BamHI-linkere (5'-CGGGATCCCG-3<*>) ble kinase-behandlet og ligert til Xhol-saltet. Klenow-behandlet plasmid pKC283-L DNA vesentlig i henhold til prosedyren i eksempel 29A2. Etter ligeringsreaksjonen ble DNA spaltet med omtrent 100 enheter BamHI i omtrent 2 timer ved 37 "C i høy-saltbuffer. Etter BamHI-spaltningen ble DNA preparert for ligering vesentlig som prosedyren i eksempel 29A2. -5,9 kb BamHI-restriksjonsfragmentet ble sirkularisert ved ligering og transformert inn i E. coli K12 M0(X<+>) vesentlig i henhold til prosedyrene i eksemplene 29A2 og 29A3. E. coli K12 M0(X<+>)/pKC283-LB transformantene ble identifisert, og deretter ble plasmid pKC283-LB DNA preparert vesentlig i henhold til prosedyren i eksempel 29A1. Et restriksjonssete og funksjonskart av plasmid pKC283-LB er presentert i figur 4.

6. Konstruksjon av E. coli K12 M0( X±)/ pL32

Omtrent 10 jjg plasmid pKC283PX ble spaltet med restriksjonsenzym Sali i høy-saltbuffer, behandlet med Klenow, og ligert til EcoRI linkere (5'-GAGGAATTCCTC-3<*>) vesentlig som angitt i prosedyren i eksempel 29A5, med unntakelse av utgangsplas-midet, restriksjonsenzymer og linkere som ble anvendt. Etter spaltning med restriksjonsenzym EcoRI som resulterer i uttak av -2,1 kb DNA ble -4,0 kb EcoRI restriksjonsf ragmentet sirkularisert ved ligering for å tilveiebringe plasmid pKC283PRS. Ligert DNA ble anvendt for å transformere E. coli K12 M0(X<+>) vesentlig som i prosedyren i eksempel 29A3. Etter E. coil K12 M0(X<+>)/pKC283PRS trasformanter ble identifisert, ble plasmid pKC283PRS DNA preparert vesentlig som i eksempel 29A1. Et restriksjonssete og funksjonskart av plasmid pKC283PRS er presentert i figur 5.

Omtrent 10 jjg plasmid pKC283PRS ble spaltet i 200 ul høy-saltbuffer med omtrent 50 enheter av hver av restriksjonsenzymene Pstl og ShI. Etter inkubering av reaksjonen ved 37<*>C i omtrent 2 timer, ble reaksjonsblandingen kjørt ved elektroforese på en 0 ,656 lav-geldannende temperatur-agarose (FMC Corporation, Marine Colloids Division, Rockland, Maine 04841) gel 1 2-3 timer ved -130 V og -75 mA i Tris-acetatbuffer.

Gelen ble farget i en fortynnet oppløsning etidiumbromid, og DNA-båndet inneholdende -0,85 kb Pstl-SphI restriksjonsfragmentet, som ble visualisert med lang-bølget UV-lys, ble kuttet fra gelen I et lite segment. Volumet til segmentet ble bestemt i vekt og tetthet av segmentet, og et likt volum 10 mM Tris-HCl, pH 7,6 ble satt til røret inneholdende segmentet. Segmentet ble deretter smeltet ved inkubering ved 72'C. Omtrent 1 pg av -0,85 kb Pstl-SphI restriksjonsfragmentet til plasmid pKC283PRS ble tilvelebragt i et volum på omtrent 100 pl. På en analog måte ble plasmid pKC283-LB spaltet med restriksjonsenzymene Pstl og ShI. og det resulterende -3,0 kb restriksjonsfragmentet ble isolert ved agarose-gelelektroforese og preparert for ligering. -0,85 kb Pstl- SphI restriksjonsfragmentet til plasmid pKC283PRS ble ligert til -3,0 kb PstI-§hI-restriksjonsfragmentet til plasmid pKC283-LB vesentlig som i prosedyren til eksempel 29A2. Ligert DNA utgjør ønsket plasmid pL32. Et restriksjonssete og funksjonskart av plasmid pL32 er presentert i figur 6. Plasmid pL32 ble transformert inn i E. coli K12 M0(X<+>) celler vesentlig som i prosedyren til eksempel 29A3. Plasmid pL32 DNA ble preparert fra E. coli K12 M0(X<+>)/- pL32 transformanter vesentlig som i prosedyren til eksempel 29A1. Analyse av plasmid pL32 DNA demonstrerte at mer enn en EcoRI-linker var knyttet til Klenow-behandlede, Sall-ender av plasmid pKC283PX. Tilstedeværelse av mer enn en EcoRI-linker påvirker ikke anvendelsen av plasmid pL32 eller derivater av plasmid pL32 og kan bli påvist ved tilstedeværelse av et Xhol-restriks.lonssete. som blir dannet når to EcoRI-linkere er ligert sammen. Alternativt kan plasmid pL32 bli konstruert ved utførelse av SalI-EcoRI-utkutting og ligering av den første paragrafen i dette eksempelet på plasmid pKC283-LB.

7. Konstruksjon av E. coli K12 M0(\ ±)/ pL47

E. coli K12 RV308/pNM789 kan bli tilveiebragt fra Northern Regional Research Laboratories i lyofilisert form under aksesjonsnummer NRRL B-18216. Et restriksjonssete og funksjonskart av pNM789 er presentert i vedlagte figur 7. Plasmid DNA blir ekstrahert fra kulturen vesentlig som i eksempel 1, med unntagelse av at temperaturen ved inku-beringen er 37"C. Ti mikrogram pNM789 blir suspendert i 200 pl PvuII-buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 60 mM NaCl og 6 mM MgClg). En enhet PvuII blir tilsatt og reaksjonsblandingen inkubert I 5 minutter ved 37<*>C. Enzymet blir Inaktivert ved oppvarming I 10 minutter ved 65<*>C. 30 pl 10X BamHI-buffer (200 mM Tris-HCl (pH 8,0), IM NaCl og 70 mM MgCl2), 70 pl H20 og 10 enheter BamHI blir deretter tilsatt og reaksjonen blir inkubert i 1 time ved 37<*>C. Dette blir etterfulgt av tilsetning av 5 enheter alkalisk fosfatase og inkubering i 1 time ved 65°C. DNA-fragmentene blir separert på en 1 prosent agarosegel, og et DNA-fragment (figur 8) med størrelse som et enkelt-kuttet fragment blir renset.

En DNA-linker med en butt ende og en BamHI-ende blir syntetisert vesentlig som I eksempel 29A4. Denne linkeren (vist ved 118 I figur 8) har følgende struktur:

Linkeren blir kinasebehandlet og ligert Inn i BamHI- PvuII spaltet plasmid pNM789 vesentlig som i eksempel 29A2. Denne ligeringsblandingen blir anvendt for å transformere E. coli K12 RV308-celler og plasmidisolerlngen blir utført på disse transformantene vesentlig ifølge eksempel 29A3. Flere plasmider blir valgt som inneholder PvuII-fragment (494bp) og Xbal-BamHI-fragmentet (628bp) med hensiktsmessig størrelse. Sekvensen til minst to av disse blir bestemt ved sekvensering fra BamHI-setet mot det unike Smal-setet og en klon med ønsket sekvens blir valgt. Dette intermediære plasmidet blir betegnet plasmid 120. En skjematisk oppstilling av denne prosedyren og et restriksjonssete og funksjonskart av plasmid 120 er presentert i vedlagte figur 8.

For å isolere EK-BGH-kodende DNA ble omtrent 10 pg plasmid 120 spaltet i 200 ul høy-saltbuffer Inneholdende omtrent 50 enheter av hver av restriksjonsenzymene Xbal og BamHI. Spaltnlngsproduktene ble separert ved agarose-gelelektroforese og -0,6 kb Xbal-BamHI-restriksjonsfragmentet som koder for EK-BGH ble isolert og preparert for ligering vesentlig som i prosedyren i eksempel 29A6.

Plasmid pL32 ble også spaltet med restriksjonsenzymene Xbal og BamHI. og -3,9 kb restriksjonsfragmentet ble isolert og preparert for ligering. -3,9 kb Xbal-BamHI-restrIksjonsfragmentet til plasmid pL32 ble ligert til -0,6 kb Xbal-BamHI-restriksjonsfragmentet til plasmid 120 vesentlig som i prosedyren i eksempel 29A2 for å tilveiebringe plasmid pL47. Et restriksjonssete og funksjonskart av plasmid pL47 er presentert i vedlagte figur 9. Plasmid pL47 ble transformert i E. coli K12 M0(X<+>) vesentlig som i prosedyren til eksempel 29A3, og E. coli K12 M0(X<+>)/pL47 transformanter ble identifisert. Plasmid pL47 DNA ble preparert fra transformanter vesentlig som i prosedyren til eksempel 29A1. 8. Konstruksjon av E. coli K12 RV308/ pPR12ARl Plasmid pPR12 omfatter temperatur-følsomt pL-repressorgenet cI857 og plasmid pBR322 er tetracyklinresistens-dannende genet. Plasmid pPR12 er beskrevet og krevet 1 US patent nr. 4.436.815, utstedt 13. mars 1984. Et restriksjonssete og funksjonskart av plasmid pPR12 er presentert i vedlagte figur 10.

Omtrent 10 pg plasmid pPR12 ble spaltet med omtrent 50 enheter restriksjonsenzym EcoRI i 200 pl høy-saltbuffer ved 37"C i to timer. EcoRI-spaltet plasmid pPR12 DNA ble presipitert og behandlet med Klenow vesentlig som i eksempel 29A5. Etter Klenow-reaksjonen ble EcoRI-spaltet, Klenow-behandlet plasmid pPR12 DNA resirkulert ved ligering vesentlig som i eksempel 29A2. Ligert DNA, som utgjør det ønskede plasmid pPR12ARl, ble anvendt for å transformere E. coli K12 RV308 vesentlig som I eksempel 29A3, med unntagelse av at seleksjon var basert på tetracyklin (5 pg/ml) resistens, ikke ampicillin-resistens. E. coli K12 RV308 er tilgjengelig fra NRRL under aksesjonsnummer NRRL B-15624. Etter at E. coli K12 RV308/pPR12ARl transformanter ble identifisert, ble plasmid pPR12ARl DNA preparert fra transformanter vesentlig som i eksempel 29A11.

Omtrent 10 pg plasmid pPR12ARl ble spaltet med omtrent 50 enheter restriksjonsenzym Aval i 200 pl medium-saltbuffer ved 37<*>C 1 2 timer. Aval-spaltet plasmid pPR12ARl DNA ble presipitert og behandlet med Klenow vesentlig som i eksempel 29A5. Etter Klenow-reaksjonen ble Aval-spaltet, Klenow-behandlet plasmid pPR12ARl DNA ligert til EcoRI linkeren (5'-GAGGAATTCCTC-3 *) vesentlig som i eksempel 29A2. Etter linkerligeringen ble DNA presipitert og deretter resuspendert i omtrent 200 pl høy-saltbuffer Inneholdende omtrent 50 enheter restriksjonsenzym EcoRI. Den resulterende reaksjonen ble inkubert ved 37" C i omtrent 2 timer. Etter EcoRl-spaltning ble reaksjonsblandingen applisert på en agarosegel og

-5,1 kb EcoRI restriksjonsfragmentet ble renset vesentlig som i eksempel 29A6. -5,1 kb EcoRI restriksjonsfragmentet ble resirkulert ved ligering vesentlig som i eksempel 29A2. Ligert DNA utgjør ønsket plasmid pPR12ARl. Plasmid pPR12ARl DNA ble transformert inn i E. coli K12 RV308 vesentlig som i eksempel 29A3, med unntagelse av at seleksjon var basert på tetracyklin-resistens, ikke ampicillin-resistens. Etter identifisering av E. coli K12 RV308/pPR12ARl transformanter ble plasmid pPR12ARl DNA preparert vesentlig som i eksempel

29A1. Et restriksjonssete og funksjonskart av plasmid pPR12ARl er presentert i vedlagte figur 11.

9. Konstruksjon av E. coli K12 RV308/ dL110

Omtrent 10 pg plasmid pPR12ARl DNA ble suspendert i omtrent 200 ml høy-saltbuffer inneholdende omtrent 50 enheter av hver av restriksjonsenzymene Pstl og EcoRI. og spaltningsreaksjonen ble inkubert ved 37<*>C i omtrent 2 timer. Reaksjonsblandingen ble deretter applisert på en agarosegel, og

-2,9 kb Pstl-EcoRI restriksjonsfragmentet til plasmid pPR12ARl ble isolert og preparert for ligering vesentlig som i eksempel 29A6. Omtrent 10 pg plasmid pL47 ble spaltet med restriksjonsenzymene Pstl og BamHI i 200 pl høy-saltbuffer ved 37°C I to timer. Psti- BamHI-spaltet DNA ble applisert på en agarosegel, og -2,7 kb PstI-BamHI restriksjonsfragmentet som omfattet replikasjonsorigo og en del av ampicillinresistens-dannende genet ble isolert og preparert for ligering vesentlig som i eksempel 29A6. I en separat reaksjon ble omtrent 10 pl plasmid pL47 DNA spaltet med restriksjonsenzymene EcoRI og BamHI i 200 pl høy-saltbuf f er ved 37° C i to timer, og -1,03 kb EcoRI- BamHI restriksjonsfragmentet som omfattet den nye transkripsjonene og translasjonene aktiveringssekvensen og EK-BGH-kodende DNA ble isolert og preparert for ligering vesentlig som ved prosedyren i eksempel 29A6. -2 pg -1,03 kb EcoRI- BamHI restriksjonsfragmentet som ble tilveiebragt ble anvendt for konstruksjon av plasmid pLllO. -2,7 kb Pstl-BamHI og -1,03 kb EcoRI- BamHI restriksjons-fragmentene til plasmidet pL47 ble ligert til -2,9 kb Pstl-EcoRI restriksjonsfragmentet til plasmid pPR12ARl for å konstruere plasmid pLllO, og ligert DNA ble anvendt for å transformere E. coli K12 RV308 som i eksempel 29A2 og 29A3, med unntagelse av at tetracyklin-resistens, ikke ampicillin-resistens, ble anvendt som basis for valg av transformanter.

To Pstl-restriksjonsenzym-gjenkjenningsseter er tilstede I EK-BGH kodende regionen som ikke er angitt 1 restriksjons-setet og funksjonskartene presentert i vedlagte tegninger. Et restriksjonssete og funksjonskart av plasmid pLllO er presentert i vedlagte figur 12.

10. Konstruksjon av E. coli K12 RV308/ pL110C

a. Konstruksjon av E. coli K12 RV308/ pL11QA

Omtrent l ug plasmid pLllO DNA ble spaltet med restriksjonsenzym Ndel i 20 pl totalt volum inneholdende 2 pl 10X høy-saltbuf fer (1,0 M NaCl; 0,50 M Tris-HCl, pH = 7,5; 0,10 M MgCl2; og 10 mM ditiotreitol) og 3 enheter Ndel-enzym i 1 time ved 37°C. Reaksjonsblandingen ble ekstrahert med fenol/kloroform og DNA presipitert med etanol. Ndel-spaltet plasmid pLllO DNA ble løst opp i 50 pl IX Klenow buffer (40 mM KP04, pH = 7,5; 6,6 mM MgCl2; 1,0 mM 2-merkaptoetanol; 33 pM dATP; 33 pM dCTP; 33 pM dGTP; og 33 pM TTP). To pl (-10 enheter, New England Biolabs) og det store fragmentet til E. coli DNA polymerase I, som Klenow, ble satt til og blandet med DNA, og den resulterende reaksjonen ble Inkubert ved 16°C i 1 time. Reaksjonen ble avsluttet ved fenolekstraksjon og DNA ble hensiktsmessig renset. Ndel-spaltet, Klenow-behandlet DNA ble deretter ligert med T4 DNA llgase ved 4'C i 16 timer. Resulterende DNA ble anvendt for hensiktsmessig å transformere E. coli K12 stamme RV308 (NRRL B-15624). Transformanter ble valgt på L-agarskåler inneholdende 100 pg/ml ampicillin og plasmider ble isolert fra resistente kolonier ved den hurtige alkaliske ekstraksjonsprosedyren beskrevet av Birnboim og Doly. Et plasmid (pLllOA i figur 13) som mangler et Ndel-sete ble valgt.

b. Konstruksjon av fag pLllOB ved sete- spesiflkk mutagenese Protokollen for eliminering av BamHI-setet i tetracyklin-resistens-genet ved sete-spesifikk mutagenese er vist på den høyre siden av figur 13.

b(i) Konstruksjon av fag M13Tc3

Plasmid pLllO var kilden for tetracyklinresistens-dannende genet. Omtrent 50 pg plasmid pLllO i 50 pl TE-buffer ble satt til 25 pl 10X Hindlll-buffer og 170 pl H20. Omtrent 5 pl (-50 enheter) av restriksjonsenzym Hindlll ble satt til oppløs-ningen av plasmid pLllO DNA, og den resulterende reaksjonen ble inkubert ved 37<*>C i 2 timer. Omtrent 13 pl 2M Tris*HCl, pH = 7,4 og 5 pl (-50 enheter) restriksjonsenzym EcoRI ble satt til HindiII-spaltet plasmid pLllO DNA, og reaksjonen ble inkubert i ytterligere 2 timer ved 37<*>C. Reaksjonen ble stoppet ved ekstrahering av reaksjonsblandingen med TE-mettet fenol, og fenol ble fjernet ved kloroform-ekstraksjoner. EcoRI-HindiII-spaltet plasmid pLllO DNA ble deretter samlet ved presipitering og sentrifugering, applisert på en 1% agarosegel, og det store -4,3 kb EcoRI-HindiII restriksjonsfragmentet ble isolert og renset.

Omtrent 5 pg fag ml3mpl8 (New England Biolabs) ble løst opp i 50 pl TE-buffer og deretter spaltet med HindiII og EcoRI som beskrevet ovenfor. HindiII- EcoRI-kuttet fag M13mpl8 DNA ble renset som beskrevet for pLllO med unntagelse av at et

-7,25 kb restriksjonsfragment ble isolert og renset.

Omtrent 100 nanogram -4,3 kb Hindlll- EcoRI fragment av plasmid pLllO ble blandet med omtrent 100 nanogram -7,25 kb HindiII-EcoRI fragment av fag M13mpl8, 2 pl 10X 1Igasebuffer, 1 pl (-100 enheter) T4 DNA ligase og 14 pl H20. Ligeringsreaksjonen ble Inkubert ved 15<*>C i 1,5 timer og ligert DNA utgjør ønsket fag ml3Tc3 DNA. Et restriksjonssete og funksjonskart av fag ml3Tc3 er angitt i vedlagte figur 13.

En ml av en overnatt kultur av E. coli K12 JM109 ( E. coli K12 JM101, tilgjengelig fra New England Biolabs, kan bli anvendt istedenfor E. coli K12 JM109) ble anvendt for å inokulere 50 ml L-kraft, og den resulterende kulturen ble inkubert ved 37<*>C med lufting helt til O.D.^n var mellom 0,3 og 0,4. Cellene ble resuspendert i 25 ml 10 mM NaCl, inkubert på is i 10 minutter og samlet ved sentrifugering. Cellene ble resuspendert i 1,25 ml 75 mM CaCl2 og en 200 pl allquot av cellene ble fjernet, satt til 10 pl av ligert' DNA preparert ovenfor, og inkubert på is i omtrent 40 minutter. Celle-DNA blandingen ble deretter inkubert ved 42<*>C i 2 minutter, og varierende aliquoter (1, 10 og 100 pl) ble fjernet og satt til 3 ml toppagar (L-kraft med 0 , 556 agar som blir holdt i smeltet tilstand ved 45'C) som også inneholdt 50 pl 256 X-gal, 50 pl 100 mM IPTG og 200 pl E. coil K12 JM109 1 logaritmisk vekstfase. Celle-topp agarblandingen ble deretter sådd ut på L-agarskåler inneholdende 40 pg/ml X-gal (5-brom-4-klor-3-indolyl-e-D-tiogalaktosid) og 0,1 mM IPTG (isopropyl-p<->D-tiogalaktosid), og skålene ble inkubert ved 37'C over natt.

Den følgende morgenen ble flere klare, i motsetning til blå, plaque individuelt anvendt for å inokulere 2 ml L-kraft, og de resulterende kulturene ble inkubert ved 37°C med lufting i 2 timer. Fravær av blå farge tyder på at ønsket DNA var blitt satt inn. Deretter ble kulturene sentrifugert og 200 pl av den resulterende supernatanten ble satt til 10 ml kulturer (O.D.ggg = 0,5) av E. coli K12 JM109 som vokser ved 37°C med lufting. Disse kulturene ble inkubert i ytterligere 30 minutter ved 37<*>C, og deretter ble cellene pelletert ved sentrifugering og anvendt for å preparere replikative former av den rekombinante fagen som de inneholder. Dobbelt-trådede, replikative former av fag-DNA ble isolert fra cellene ved anvendelse av en nedskalert versjon av prosedyren beskrevet i eksempel 1. Transformanter Inneholdende fag ml3Tc3 DNA ble Identifisert ved restriksjonsenzymanalyse av fag DNA.

b(ii) Preparering av enkelt- trådet fag m! 3Tc3 DNA

En og en halv ml av en overnatt kultur av E. coli K12 JM109/ml3Tc3 ble sentrifugert, og 100 pl fag ml3Tc3-inneholdende supernatant ble anvendt for å inokulere en 25 ml kultur av E. coli JM109 ved en O.D.^O på omtrent 0,4-0,5. Kulturen ble inkubert I 6 timer ved 37° C med lufting og kulturen ble sentrifugert, og den resulterende supernatanten på omtrent 20 ml ble overført til et nytt rør. Omtrent 2 ml av en oppløsning inneholdende 2056 polyetylenglycol (PEG) 6.000 og 14,656 NaCl ble satt til supernatanten, som deretter ble Inkubert på is i 20 minutter.

Supernatanten ble sentrifugert i 25 minutter ved 7.000 rpm, og den resulterende pelleten som inneholdt enkelt-trådet fag ml3Tc3 DNA, ble resuspendert i 500 pl TE-buffer. DNA-oppløs-ningen ble ekstrahert to ganger med TE-mettet fenol og to ganger med kloroform. Enkelt-trådet DNA ble deretter presipitert ved anvendelse av NaOAc og etanol og sentrifugert. Den resulterende pelleten ble vasket med 7056 etanol, tørket og deretter løst opp i 60 pl H2O.

b(iii) Mutagenese

Enkelt-trådet DNA-fragment anvendt i mutagenesen ble syntetisert på en automatisert DNA-synthesizer. Fragmentet har sekvensen 5'-CCCGTCCTGTGGATACTCTACGCCGA-3<*>, og er homolog med regionen som omgir BamHI-setet (5'-GGATCC-3') i tetracyklin-resistens-dannende genet fra plasmid pBR322, med unntagelse av at A-residiet nummer to fra 5' enden (eller nummer tre fra 3' enden) er en C i plasmid pBR322. Denne forandringen endrer ikke aminosyresammensetningen til tetracyklinresistens-dannende proteinet, men eliminerer BamHI-setet.

Omtrent 10 picomol av den mutagene primeren og M13 universal primeren (Bethesda Research Laboratories (BRL), P.O. Box 6009, Gaithersburg, MD 20760) ble individuelt behandlet med 10 enheter (BRL) T4 polynukleotid-kinase i 20 pl IX klnase-buffer (60 mM Tris-HCl, pH = 7,8; 15 mM 2-merkaptoetanol; 10 mM MgCl2; og 0,41 pM ATP) i 30 minutter ved 37°C. Kinase-behandlet DNA ble anvendt i mutageneseprosedyren beskrevet nedenfor.

Sammensmeltningsreaksjonen ble utført ved blanding av omtrent 300 nanogram (1,2 pl) enkelt-trådet fag ml3Tc3, 1 picomol (2 pl) universal primer, 1 picomol (2 pl) mutagenisk primer, ml3Tc3, med unntagelse av at IPTG eller X-gal Ikke ble satt til skålene.

Dobbelt-trådet replikativ form DNA fra omtrent 48 plaque ble isolert som beskrevet ovenfor og screenet for tilstedeværelse av et BamHI-restrikslonssete. Isolater uten et BamHI-sete ble ytterligere screenet ved preparering av enkelt-trådet DNA som beskrevet ovenfor. Enkelt-trådet DNA ble sekvensert ved anvendelse av dideoksy-sekvenseringsmetoden (J.H. Smith, 1980, Methods in Enzymology 65: 560-580). Det ønskede isolatet ble betegnet pLIIOB (figur 13).

c. Konstruksjon av plasmid pLllOC

Omtrent 50 pg av den replikative formen av fag pLIIOB DNA ble spaltet i 250 pl IX Nhel-buffer (50 mM NaCl; 6 mM Tris'HCl, pH = 7,5; 6 mM MgClg; og 6 mM 3-merkaptoetanol) inneholdende -50 enheter Nhel-restrIksjonsenzym ved 37"C i 2 timer. Fem pl 5 M NaCl ble deretter satt til Nhel-spaltet fag pLIIOB DNA, etterfulgt av 5 pl (-50 enheter) SalI-restriksjonsenzym. Spaltingen ble fortsatt I 2 timer ved 37' C. Det ønskede -422 bp Nhel- Sall fragmentet inneholdende den muterte regionen av tetracyklinresistens-dannende genet ble deretter Isolert fra en akrylamldge1, ifølge velkjente standard prosedyrer.

Plasmid pLllOA DNA ble spaltet med Nhel og Sali under identiske betingelser, med unntagelse av at plasmid pLllOA ble erstattet for fag pLIIOB. -6,1 kb Nhel- SalI-restriksjonsfragmentet av plasmid pLllOA ble renset fra agarosen.

Ønsket plasmid pLllOC ble konstruert ved å ligere sammen 100 nanogram av hver av Nhel- SalI-fragmentene av pLllOA (-6,1 kb) og pLIIOB (-422 bp) ved anvendelse av konvensjonelle prosedyrer. Et restriksjonssete og funksjonskart av plasmid pLllOC er presentert 1 vedlagte figur 13. Det ønskede plasmid pLllOC utviser tetracyklin resistens overfor 10 pg/ml tetracyklin i

E. coli. men manglet et BamHI-sete i tetracykllnresistens-dannende genet.

11. Konstruksjon av plasmid pCZRlll

Plasmid pLllOC inneholder et enkelt Clal-restriksjonssete som ble fjernet ved utførelse av følgende reaksjoner. Omtrent 1 pg plasmid pLllOC ble spaltet med Clal. vesentlig ifølge eksempel 29A2, med unntagelse av at restriksjonsenzym Clal og 10X Clal-buffer (500 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl (pH 7,9) og 100 mM MgCl2) ble anvendt. Clal-spaltet DNA ble deretter behandlet med Klenow, vesentlig Ifølge eksempel 29A5, med unntagelse av at bare dCTP, istedenfor alle fire dNTP, ble tilsatt.

DNA ble deretter presipitert og resuspendert i 50 pl Mung-bønne nukleasebuffer (50 mM natriumacetat (pH 5,0), 30 mM NaCl og 1 mM ZnS04). En enhet Mung-bønne nuklease (kommersielt tilgjengelig fra New England Biolabs) ble tilsatt og reaksjonen ble inkubert ved 30°C i 30 minutter. Røret ble deretter plassert på is og NaCl ble tilsatt opp til 0,2 M, og deretter ble blandingen fenol/kloroform-ekstrahert, etanol-presipitert og resuspendert i 10 mM Tris-HCl (pH 8,0). DNA ble deretter selv-ligert og transformert inn i E. coll-celler vesentlig som i eksemplene 29A3 og 29A4. Det resulterende plasmidet ble betegnet plasmid pCZRlll.

12. Konstruksjon av plasmid PCZR126S

Omtrent 26 pl plasmid pCZRlll ble spaltet med Xbal som følger. 10X Xbal-buffer består av 600 mM Tris-HCl, 100 mM MgCl2, 1 M NaCl og 10 mM 2-merkaptoetanol, pH 7,5 (ved 37°C). 50 pl 10X Xbal-buffer. 15 pl Xbal (10U/pl) og 185 pl H20 ble satt til 250 pl vann inneholdende omtrent 25 pg plasmid pLllO. Spaltingen forløp ved 37° C i 1 time. Xbal-spaltet pLllO ble deretter ekstrahert i fenol, 1/10 volum 3M CH3COO-Na ble tilsatt, 3 volum etanol ble tilsatt; og blandingen ble inkubert i et tørris-etanolbad i 5 minutter, og deretter sentrifugert. Presipitert DNA ble resuspendert i 50 pl N20. Xbal-spaltet plasmid pCZRlll ble spaltet med BamHI som følger. 0,2 pl BamHI (10 U/pl), 10 pl BamHI-buffer (100 mM Tris-HCl, 50 mM MgCl2, 1 M NaCl og 10 mM 2-merkaptoetanol, pH 8,0 [ved 37°C], og 90 pl H20 ble satt til 50 pl Xbal-spaltet pLllO tilveiebragt ovenfor. Spaltingen forløp i 5 minutter ved 37<*>C. Spaltet pCZRlll ble ekstrahert i fenol, 1/10 volum CH3C00Na+ ble tilsatt, etterfulgt av tilsetning av 3 volum etanol. Presipitert DNA ble resuspendert I 50 pl

10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0 buffer.

Xbal og BamHI spaltet pCZRll ble deretter applisert på en agarosegel og DNA-båndet ved omtrent 5,8 kb ble isolert. Plasmid pCZR126S ble produsert ved ligering av -5,8 kb fragmentet av pCZRlll til en Xbal til Ndel linker og et syntetisk gen som koder for EK-bovint veksthormon, som inneholder et Ndel-sete på 5' enden og et BamHI-sete ved 3' enden. Xbal til Ndel sekvensen ble produsert ved anvendelse av standard oligonukleotid-sekvensmetodologi og består av følgende sekvens:

Sekvensen ovenfor ble konstruert ved kjemisk syntese av begge trådene, etterfulgt av blanding for å muliggjøre hybridi-sasjon. Genet som koder for EK bGH ble konstruert fra 16 kjemisk syntetiserte stykker enkelt-trådet DNA, varierende fra 71 til 83 nukleotider, som sammen omfatter begge komplementære tråder av det ønskede genet. Syntesen ble utført ved anvendelse av en Applied Biosystems (ABS) maskin og består av følgende sekvens:

Konstruksjon av plasmid pCZR126S ble utført ved ligering a\ følgende setekomponenter: -0,28 pg 5,8 kb fragment tilveiebragt fra plasmid pLllO etter fullstendig spaltning med Xbal og delvis spaltning med BamHI i et totalt volum på 2 pl, -0,18 pg syntetisk gen kodende for et bovlnt vekstfaktor-derivat som har en 5' terminal ende som korresponderer med et Xbal-sete og en 3' terminal ende som korresponderer med et BamHI-sete i et totalt volum på 2,5 pl, 8,75 picomol kjemisk syntetisert Xbal til Ndel linker i 1 pl. Plasmidkomponentene ble satt til 6 pl 5x ligerIngsbuffer: 250 mM Tris-HCl, 50 mM MgCl2, 5 mM ATP, 5 mM DTT, 2556 v/v polyetylenglycol 8.000, pH 7,6, 2 pl ligase og 16,5 pl HgO. Ligeringsblandingen ble inkubert over natt ved 16<*>C. Sirkularisert plasmid pCZR126S ble deretter anvendt for å transformere E. coli RV308-celler vesentlig Ifølge metoden i eksempel 29A3. Et restriksjonssete og funksjonskart av plasmid pCZR126S er presentert i vedlagte figur 14.

B. Konstruksjon av humant proinsulin ekspreslonsplasmid

PRB172

1. Konstruksjon av plasmid PRB145

Human proinsulingenet ble først syntetisert og klonet inn i PUC18-plasmid (kommersielt tilgjengelig fra BRL). Genet ble syntetisert ved anvendelse av standard teknikker og omfatter følgende sekvens:

En av klonene med riktig sekvens ble valgt for produksjon av cesiumklorid-renset DNA. Plasmidet ble Isolert ved standard-prosedyre (se for eksempel "Molecular Cloning, A Laboratory Manual" (1982) red. ved Maniatis, T; Fritsch, E.F. og Sambrook, J., Cold Spring Harbour Laboratory Pub!icatlons, New York og dette er Inkorporert som referanse). Omtrent 6 pl (20 pg) av dette plasmid DNA ble satt til 20 pl 10X Ndel-buffer (150 mm NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,8), 6 mM MgCl2, 6 mM 2-merkaptoetanol, 100 pg/ml BSA), 5 pl Ndel-restriksjonsenzym (-40 enheter) og 169 pl H2O. Etter blanding ble reaksjonen inkubert ved 37<*>C i 2 timer. DNA ble presipitert ved å gjøre blandingen 0,3 M NaOAc, tilsetning av tre volum etanol, blanding og avkjøling til -70°C og sentrifugering. DNA-pelleten ble vasket med 7056 etanol (1 ml), tørket og løst opp i 20 pl 10X BamHI-buffer (150 mm NaCl, 6 mM Tris-HCl (pH 7,9), 6 mM MgClg, 100 pg/ml BSA), 2 pl BamHI-restriksjonsenzym (40 enheter) og 178 pl H20. Etter forsiktig blanding ble reaksjonen inkubert ved 37°C i 2 timer. DNA ble igjen presipitert med tre volum etanol som ovenfor og elektroforert på en 156 lavtsmeltende agarosegel (FMC, s jøplaqueagarose). Det ønskede DNA-fragmentet som korresponderer med omtrent 270 bp ble kuttet fra gelen og deretter ble DNA Isolert ved smelting av agarosen og ved å bli sendt gjennom en Elutip-d kolonne (Schleicher & Schuell, Keene, N.H.) ifølge den anbefalte prosedyren. Etter presipitasjon og tørking ble DNA lagret i 30 pl 10 mM Tris-HCl pH 8,0.

Omtrent 15 pg plasmid pCZR126S (fra eksempel 29A12) ble suspendert i 20 pl 10X Ndel-buffer, 5 pl Ndel-restriksjonsenzym (40 enheter) og HgO (175 pl), blandet forsiktig og inkubert ved 37 °C i 2 timer. Etter Inkubasjonen ble DNA presipitert med tre volum etanol som ovenfor, tørket og deretter resuspendert i 20 pl 10X BamHI-buffer. 2 pl BamHI-restriksjonsenzym (40 enheter) og 178 pl vann. Etter forsiktig blanding ble reaksjonen inkubert ved 37° C i 2 timer. DNA ble igjen presipitert med tre volum etanol og elektroforert på en 156 lav-smeltende agarosegel. Det store fragmentet som korresponderer med vektor-DNA ble kuttet fra denne gelen og DNA ble isolert ved Elutip-d kolonneprosedyren som beskrevet ovenfor. Etter presipitasjon og tørking ble vektor-DNA lagret i 35 pl 10 mm Tris-HCl pH 8,0.

Omtrent 2,5 pl vektor-DNA ble blandet med 12 pl renset humaninsulin-genfragment fra ovenfor, 4 pl 10 mM ATP, 0,5 pl IM ditiotreitol, 5 pl 10X ligasebuffer (500 mM Tris-HCl pH 7,6 og 100 mM MgCl2), 26 pl vann og 0,5 pl T4-DNA ligase (Pharmacia, 3,5 enheter). Reaksjonen ble inkubert ved 4<*>C i 16 timer. Den ligerte blandingen ble fortynnet med 50 pl 10 mM Tris-HCl (pH 7,6) og 3 pl 1 M CaCl2 og deretter transformert inn I E. coil K12 RV308 vesentlig ifølge eksempel 29A3. Cellene ble sådd ut på TY-skåler supplementert med 5 pg/ml tetracyklin og deretter inkubert over natt ved 32<*>C.

Plasmider fra 3 mL kulturer ble Isolert fra tetracyklin-resistente kolonier ved hurtig alkalisk ekstraksjonsprosedyre beskrevet i Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1982) red. ved Maniatis, T. , Fritsch, E.F. og Sambrook, J. Cold Spring Harbour publications, New York (sidene 368-369). Tilstedeværelse av riktig human proinsulingenfragment ble funnet ved mlniscreen-prosedyren ved anvendelse av polyakryl-amld-gelelektroforese for å analysere Xbal/ BamHI spaltet fragment. Plasmider med riktig størrelse (omtrent 315 bp) innskudd ble valgt for amplifikasjon og rensning. Plasmidet inneholdende human proinsulingen var pRB145. Et restriksjonssete og funksjonskart av plasmid pRB145 er presentert i vedlagte figur 16.

2. Konstruksjon av lasmid pRB164A

Omtrent 30 pg plasmid pRB145 ble suspendert i 20 pl 10X Ndel-buffer, 5 pl Ndel-restriksjonsenz<y>m (New England Biolabs, 40 enheter), og 175 pl H20 ble forsiktig blandet og Inkubert ved 37 "C I 1 time. To pl BamHI-restriksjonsenzym (New England Biolabs, 40 enheter) ble deretter satt til reaksjonsblandingen og inkubasjonen ved 37<*>C ble fortsatt i ytterligere 2 timer. DNA ble presipitert med tre volum etanol og 0,3M NaOAc og elektroforert på en ' 13É lavt smeltende agarosegel. Det mindre (omtrent 270 bp) Ndel/BamHI-restriksjonsfragmentet som koder for humant proinsulingen ble kuttet fra gelen og DNA ble isolert ved å bli sendt gjennom en Elutip-d kolonne som beskrevet ovenfor. Etter presipitasjon og tørking, ble DNA lagret i 30 pl 10 mM Tris pH 8,0.

Til dette DNA (30 pl) ble deretter 20 pl 10X Aval I-buffer (50 mM NaCl, 6 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM MgCl2, 6 mM 2-merkaptoetanol, 100 pg/ml BSA), 5 pl Aval I-restriksjonsenzym (New England Biolabs, 20 enheter) og 175 pl H20 tilsatt. Etter forsiktig blanding ble denne reaksjonen inkubert ved 37<*>C i 2 timer. DNA ble presipitert med tre volum etanol og 3M NaOAc (20 pl) og deretter elektroforert på en 1,256 lavtsmeltende agarosegel. Det større Ava.il/BamHI-restriksjonsfragmentet (omtrent 156 bp) ble kuttet ut fra gelen og deretter ble DNA Isolert ved å bil sendt gjennom en Elutip-d kolonne som beskrevet ovenfor. Etter presipitasjon og tørking, ble DNA lagret i 30 pl 10 mM tris pH 8,0.

DNA (-115 bp) korresponderende med Ndel/ AvalI restriksjonsfragmentet til humant proinsulingen ble preparert syntetisk. Det første trinnet består av syntese av fire enkelt-trådede deoksyribooligonukleotider ved hjelp av DNA-synthesizer (Applied Biosystems, modell 380B). Nukleotidsekvensene til disse fire oligonukleotIdene er

Etter rensing av hvert oligonukleotid ved polyakrylamid-gelelektroforese ble oligonukleotidene to og tre fosforylert ifølge Brown, E.L., Belagaje, R., Ryan, M.J. og Khorana, H.G.

(1979) Methods in Enzymology, red. ved Wy, R., Academic Press, N.Y. 68, 109-151, og dette er inkorporert som referanse. De fosforylerte oligonukleotidene to og tre (-715 pmol av hver) ble deretter blandet med oligonukleotidene en og to (-860 pmol), sammensmeltet og ligert i en buffer (200 pl) inneholdende 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 50 pM ATP og 20 enheter T4 DNA-ligase (Pharmacia) i 16 timer ved 4°C. Ligeringsproduktet ble renset på en 1556 polyakrylamidgel. DNA ble isolert fra gelbiten elektroforetisk, etterfulgt av avsaltning på en Sephadex G-50 kolonne. Utbyttet av det ønskede ligerte produktet var 485 pmol.

Omtrent 100 pmol av dette DNA ble fosforylert i en buffer (50 pl) Inneholdende 50 mM Tris (pH 7,6), 10 mM MgCl2, 10 mM DTT og ATP, som beskrevet i Brown, E.L. et al., (1979), Methods in Enzymology 68, 109-151 og dette er inkorporert heri som referanse. Etter filtrering gjennom en Sephadex G—50-kolonne ble DNA lagret i 50 pl 10 mM Tris, pH 8,0.

Omtrent 2,5 pl vektor-DNA ( Ndel- BamHI spaltet pCZR126S) ble blandet med 18 pl AvalI/ BamHI restriksjonsfragment fra plasmid pRB145 og 10 pl (10 pmol) Ndel/ AvalI syntetisk linker konstruert i en buffer (50 pl) Inneholdende 50 mM Tris (pH 7,6), 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 800 pl ATP og 3,5 enheter T4 DNA-ligase. Reaksjonen ble inkubert ved 4<*>C over natt og deretter transformert inn i E. coli K12 RV308 i henhold til prosedyren i eksempel 29A3. Den ønskede transformanten E. coli K12 RV308/pRB164A ble Identifisert ved analyse av plasmid DNA. Den riktige transformanten ble dyrket ved 30°C i TY-medium inneholdende 5 pg/ml tetracyklin til en O.D.ggQ på omtrent 0,2 (tidlig log-fase) og deretter skiftet til 42°C i 3 til 3,5 timer for å indusere syntese av humant proinsulin. Cellene ble pelletert og lysert ved tilsetning av prøvebuffer

(0,125 M Tris-HCl (pH fa,8), 2* SDS, 30* glycerol, IM 2-markaptoetanol, 6M urea). Prøver ble oppvarmet til 97°C i 2 minutter før applisering på en akrylamidge1. Bånd ble lett visualisert ved farging med Coomassie Brilliant blåfarge. Et scanning-gel densitometer ble anvendt for å kvantifisere prosentandel celleprotein. Et restriksjonssete og funksjonskart av plasmid pRB164A er presentert i figur 17.

3. Konstruksjon av plasmid pRB172

Omtrent 25 pg plasmid pRB145 ble suspendert i 15 pl 10X Dralll-buffer (200 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 10 pg/ml BSA) 6 pl DrallI-restriksjonsenzym (Boehringer Mannheim, 27 enheter) og 129 pl H20, forsiktig blandet og inkubert ved 37°C i 6 timer. Etter inkubasjon ble DNA presipitert, tørket og resuspendert i 10 pl 10X Xbal-buffer (150 mM NaCl, 6 mM Tris-HCl pH 7,9, 6 mM MgCl2, 7 mM 2 merkaptoetanol, 100 pg/ml BSA), 3 pl Xbal-restriksionsenzvm (Boehringer Mannheim, 36 enheter) og 77 pl H20. Reaksjonen ble forsiktig blandet og inkubert ved 37° C i 4 timer. DNA ble på nytt presipitert med tre volum etanol og NaOAc og elektroforert på en 156 lavtsmeltende agarosegel. Det nedre båndet korresponderende til omtrent 85 bp Xbal/Dralll restriksjonsfragmentet til humant proinsulingen ble spaltet fra gelen og DNA ble isolert ved Elutip-d kolonneprosedyren. Etter presipitasjon og tørking ble DNA lagret i 30 pl 10 mM Tris pH 8,0.

Omtrent 15 pg plasmid pRB164A ble kuttet med restriksjonsenzym Dralll og Xbal i henhold til prosedyren beskrevet ovenfor. Det øvre båndet korresponderende med Xbal/ Dralll vektorfragmentet ble isolert fra agarosegelen ved Elutip-d kolonneprosedyren. Etter presipitasjon og tørking ble DNA lagret i 30 pl 10 mM Tris pH 8,0.

Omtrent 5 pl Xbal/Dralll spaltet pRB164A vektor-DNA ble blandet med 5 pl Xbal/ PralII-restriksjonsfragmentet fra plasmid pBR145 i en buffer (50 pl) inneholdende 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 800 pM ATP og 6 enheter T4 DNA llgase. Reaksjonen ble Inkubert ved 4°C over natt og anvendt for å transformere E. coli K12/RV308 celler som er blitt gjort kompetente ved en standard CaCl2-behandling.

Transformanter ble selektert på TY-agarskåler inneholdende 5 pg/ml tetracyklin. Plasmider ble isolert fra tetracyklin-resistente kolonier ved hurtig alkalisk ekstraksjonsprosedyre og analysert ved spaltning med Xbal og BamHI restriksjons-endonukleaser. DNA fra positive kloner ble sekvensert ved anvendelse av sekvenasesystemet (U.S. Biochemicals). Plasmider med riktig ønsket sekvens ble valgt for amplifikasjon og rensning. På denne måten ble E. coli K12 RV308/pRB172 transformanter isolert. Ekspresjon og akkumu-lering av humant prolnsulin Inneholdende dette plasmidet ble analysert ved visualisering av totalt cellulært protein etter elektroforetisk separasjon i en 15* polyakrylamidmatrise. Et restriksjonssete og funksjonskart av plasmid pRB172 er presentert i vedlagte figur 18.

C. Konstruksjon av Escherichia coli RV308/ PRB173 og pRB174

Omtrent 20 pg plasmid pRB172 eller pRB145 ble suspendert i 20 pl 10X Xb_al-buffer (150 mm NaCl, 6 mM Tris-HCl, pH 7,9,

6 mM MgCl2, 7 mM 2-merkaptoetanol, 100 pg/ml BSA) og 2 pl Xbal-restriksjonsenzym (Boehringer Mannheim, 24 enheter) ble tilsatt, forsiktig blandet og inkubert ved 37"C i 4 timer. Etter inkubasjonen ble DNA presipitert, tørket og resuspendert i 10 pl 10X BamHI-buffer (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 5 mM MgCl2, 1 mM 2-merkaptoetanol, 100 pg/ml BSA), 5 pl BamHI-restriksjonsenzym Boehringer Manheim (40 enheter) og 75 pl H20. Reaksjonen ble forsiktig blandet og inkubert ved 37'C i 4 timer. DNA ble igjen presipitert med etanol og NaOAc og elektroforert på en 1* lavtsmeltende agarosegel. Omtrent 320 bp Xbal/ BamHI-restriksjonsfragment korresponderende med humant proinsulingen ble Isolert fra gelen ved Elutip-d kolonneprosedyren. Etter presipitasjon og tørking, ble DNA resuspendert i 20 pl 10X Xmal-buffer (25 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgClg. 10 mM 2-merkaptoetanol, 100 pg/ml BSA), 10 pl Xmal-restriksjonsenzym (New England Biolabs 10 enheter) og 170 pl vann. Reaksjonen ble forsiktig blandet og inkubert ved 37" C i 4 timer. Etter inkubasjonen ble DNA presipitert med etanol og NaOAc og elektroforert på en 15é lavtsmeltende agarosegel. Det større DNA korresponderende til omtrent 200 bp Xbal/ Xmal restriksjonsfragmentet ble kuttet ut fra gelen og DNA ble isolert ved Elutip-d kolonne som beskrevet ovenfor. DNA ble lagret i 30 pl 10 mM Tris pH 8,0. 51 bp DNA korresponderende til et Xmal/ BamHI restriksjonsfragment av det humane proinsullngenet ble konstruert syntetisk som følger. To enkelt-trådede deoksyribooligonukleotider:

ble syntetisert på en Applied Biosystems DNA-synthesizer (modell 380B) og renset ved polyakrylamid-gelelektroforese i nærvær av 7 M urea. Etter Isolasjon ble de to oligonukleotidene fosforylert ifølge Brown, E.L., Belagaje, R., Ryan, M.J. og Khorana, H.G. (1979) "Methods In Enzymology", red. ved Wu, R., Academic Press, N.Y. 68. 109-151, og sammensmeltet for å danne den ønskede linkeren.

Omtrent 10 pg plasmid pCZR126S (fra eksempel 29A12) ble suspendert 1 20 pl 10X Xbal-buffer (150 mM NaCl, 6 mM Tris-HCl (pH 7,9), 6 mM MgCl2, 7 mM 2-merkaptoetanol, 100 pg/ml BSA) 2 pl Xbal-restriksjonsenzym (Boehringer Mannheim, 24 enheter) og 178 pl vann. Reaksjonen ble forsiktig blandet og inkubert ved 37"C I 2 timer. Etter denne inkubasjonen ble 4 pl 5M NaCl og 2 pl BamHI-restrlksjonsenzym (New England Biolabs, 20 enheter) tilsatt, og inkubasjonen ble fortsatt i ytterligere 2 timer ved 37*C. DNA ble deretter presipitert med etanol og NaOAc ved standard prosedyre og elektroforert på en 1* lavtsmeltende agarosegel. Det øvre båndet korresponderende med Xbal/ BamHI vektor DNA ble isolert med en Elutip-d kolonne. Etter presipitasjon og tørking ble DNA lagret i 30 pl 10 mM Tris, pH 8,0.

Omtrent 5 ul Xbal/BamHI-saltet pCZR126S vektor DNA ble blandet med 10 pl Xbal/Xmal restriksjonsfragment fra pRB145 eller pRB172 og 4 pl kinasebehandlet Xmal/ BamHI linker preparert ovenfor i en buffer (50 pl) inneholdende 50 pm Tris (pH 7,6), 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 800 pM ATP og 6 enheter T4 DNA-ligase. Reaksjonen ble Inkubert ved 4<*>C over natt og anvendt for å transformere E. coli K12 RV308 stammen i henhold til prosedyren I eksempel 29A3. De ønskede transformantene, E. coil K12 RV308/pRB173 (dersom de er tilveiebragt fra pRB172-vektorfragmentet) og E. coli K12 RV308/pRB174 (dersom de er tilveiebragt fra pRB145-vektorfragmentet) ble identifisert ved analyse av deres plasmid DNA og proteinproduksjon før og etter induksjon ved 42'C. Et restriksjonssete og funksjonskart av plasmid pRB173 er presentert i vedlagte figur 19.

Omtrent 200 ng plasmid DNA fra mlni-prep ble også transformert inn I E. coli L201-celler og transf ormantene ble selektert på 2 x TY-agarskåler inneholdende 15 pg/ml tetracyklin. Proteinene uttrykt av transformantene ble analysert og de ønskede transformantene ble bekreftet ved produksjon av humant proinsulin. På denne måten ble E. coli L201/pRB173 og E. coli L201/pRB174 isolert. D. Konstruksjon av Escherichla coli K12 RV308/ pRB175. PRB176.

PRB177 og PRB178

Omtrent 12 pg plasmid pRB172 ble suspendert i 15 pl 10X Ndel-buffer (100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 100 pg/ml BSA), 2,5 pl Ndel-restriksjonsenzym (20 enheter) og 133 pl vann. Reaksjonen ble forsiktig blandet og inkubert ved 37 "C over natt. Etter Inkubasjonen ble DNA presipitert med etanol og NaOAc ved standard prosedyre, tørket og resuspendert i 15 pl 10X PralII-buffer (50 mM Tris-HCl (ph 7,5), 200 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT) 5 pl Dralll-restriksjonsenzym (20 enheter) og 130 pl H20. Etter forsiktig blanding ble reaksjonen inkubert ved 37* C over natt. DNA ble igjen presipitert med etanol og NaOAc som ovenfor og elektroforert på en 1* lavtsmeltende agarosegel. Det ønskede store restriksjonsfragmentet ble kuttet ut fra gelen og DNA ble isolert ved Elutlp-d kolonneprosedyren. DNA ble lagret i 30 pl 10 mM Tris HCl pH 8,0.

Følgende DNA-linkere ble syntetisert kjemisk ved Applied Biosystems DNA Synthesizer (modell 380B):

Etter rensning av hver oligonukleotid ved polyakrylamid-gelelektroforese ble de fosforylert ifølge ovennevnte læring og sammensmeltet for å lette ligeringen og konstruksjonen av de humane proinsulin genanalog-kodende DNA-fragmentene. Llnkerne (i) til (iv) ble anvendt for å konstruere plasmidene pRB175, pRB176, pRB177 og pRB178 respektivt.

Omtrent 3 pl Ndel/ PralII-spaltet pRB172 vektor DNA fragment ble blandet med 4 pl av hver av de separerte kinasebehandlede linkerene (i-iv) i en buffer (50 pl) inneholdende 50 pM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl2, 10 mM PTT, 800 pM ATP og 6 enheter T4 PNA ligase. Reaksjonen ble inkubert ved 4<*>C over natt og RV308-celler ifølge prosedyren i eksempel 29A3. De ønskede transformantene, E. coli K12 RV308/pRBl75, E. coli K12 RV308/pRB176, E. coli RV308/pRB177 og E. coli K12 RV308/- pRB178 ble identifisert ved analyse av deres plasmid DNA og proteinproduksjon før og etter induksjon av cellene ved 42'C. Et restriksjonssete og funksjonskart av plasmid pRB175 er presentert i figur 20.

E. En stamkultur av E. coli K12 RV308/ pRB172 ble dannet inne

i en permanent stamkultur på følgende måte.

Isolerte kolonier blir spottet på følgende fenotypeskåler: L-agar + 5 mcg/ml Tc (tetracyklin), L-agar + Sm (streptomycin-sulfat), M-9 medium agar (et saltbasert medium inneholdende MgS04, "tiamin, HY CASE og glukose), og M-9 medium agar uten glukose og med laktose. En L-agar/Tc-skål blir inkubert ved 42° C og de gjenværende skålene blir inkubert ved 30'C i 24 timer. En fenotypisk korrekt koloni valgt fra 30°C L-agar/Tc-skåler blir anvendt for å inokulere en flaske inneholdende 50 ml L-kraft (inneholder tryptone, gjærekstrakt, NaCl og glukose) pluss 5 mcg/ml TC-medium. Flasken blir inkubert ved 30<*>C med rysting i 7 timer. Materialet i flasken (1,2 ml) blir overført til bio-frys beholdere og frosset i damp-fase flytende nitrogen. Materialet blir deretter tinet og 1 ml blir anvendt for å inokulere en flaske inneholdende 50 ml L-kraft pluss 5 mcg/ml Tc. Flasken blir inkubert ved 30° C med rysting I 4 timer. To flasker inneholdende 500 ml BG-7 medium (Inneholder MgS04, tiamln, glukose, Tc og sporsalter) blir inokulert med 1 ml av hver av det foregående, og flaskene blir inkubert med rysting I 9 timer ved 30°C.

En 150-1Iter fermentor inneholdende 80 liter medium (inneholder sitronsyre, jernammoniumsulfat, K2HPO4, NH4CI, NaH2P04, CaCl2, MgS04, glukose og uorganiske sporsalter) blir inokulert med 1 liter BG-7 medium kraft. Fermentoren blir drevet ved 30°C helt til karbondloksld-utviklingshastigheten når 1,0 mM/L/min. Ved dette punktet blir 50 liter kraft overført til produksjonsfermentoren for å tilveiebringe celleinokulumet.

En 2.500-1 iter fermentor inneholdende 1.500 liter av samme medium anvendt 1 150-liter fermentoren blir drevet ved 30<*>C helt til karbondioksld-utviklingshastigheten når 1,0 mM/L/- min. , og deretter blir temperaturen hevet til 40°C. Driften blir fortsatt i ytterligere 8 timer. Kraften blir deretter varmeinaktivert ved 61 *C i 7 minutter. Følgende utbytte ble tilveiebragt fra varmeinaktivert kraft: Celleutbytte, 13,1 gram/L tørrvekt; produktpotentet, 273 meg Des-forarylert/ml kraft; spesifikk aktivitet (f.eks. gram produkt/gram celle), 2,1 prosent; prosent formylert produkt, 13 prosent.

Fermenteringskraften blir overført til en rustfri ståltank og temperaturen opprettholdt mellom 2° og 8°C. Hele kraften blir deretter sentrifugert eller filtrert for å samle E. coli-cellene slik at en tørrvekt av faste stoffer på omtrent 15 til 20 prosent blir tilveiebragt. De samlede celle-faste stoffer blir på ny oppslemmet i prosessvann. Cellene blir deretter ødelagt ved anvendelse av homogenisering med høyt trykk eller andre egnede metoder for å oppnå lysering av 90 til 99 prosent av cellene. Den homogeniserte oppslemmingen blir fortynnet til 5 prosent tørrvekt ved prosessvann. pH til den fortynnede ødelagte celleoppslemmingen blir justert til mellom pH 7 og 10 ved tilsetning av natriumhydroksid. Innlæringslegemene (granuler) blir separert fra celledebriet ved differensial-sentrifugering. Det resulterende konsen-tratet har et Innhold av faste stoffer fra 15 til 20 prosent.

Innlæringslegemene blir løst opp ved alkalisk pH i nærvær av cystein og urea. Disse oppløste granulene blir utsatt for kationbytte-kromatografi på SP Sepharose-superflow for å adskille den blandede disulfid-formen av proinsulinanalogen fra hovedmassen av granulmaterlalet.

Metionyl-tyrosin ekstensjonen av den aminoterminale enden til proinsulinanalogen blir fjernet ved inkubasjon med catepsin C, en dipeptidylaminopeptidase. Catepsin-spaltningsreaksjonen blir avsluttet med sulfitolyse med kaliumtetrationat og cystein ved pH 8,8. Etter oppløsningsmiddel-bytting gjennom Sephadex G-25 blir det resulterende S-sulfonatet av proinsulinanalogen foldet ved inkubasjon ved pH 10,6 i nærvær av cystein. Foldlngsprosessen blir avsluttet ved justering av pH til 2,4. Riktig foldet proinsulinanalog blir separert fra uriktig foldet materiale samt forurensninger fra catepsin C-spaltningstrinnet ved hydrofobisk interaksjonskromatografi på SP20SS-harplks. Denne separasjonen oppstår over en aceton-gradient slik at det organiske oppløsningsmiddelet må bli fjernet fra hovedblåndingen ved avdampning før ytterligere bearbeidning.

Etter avdampning av det organiske oppløsningsmiddelet blir riktig foldet proinsulinanalog inkubert med trypsin og karboksypeptidase B. Disse enzymene spalter bort C-peptidet til proinsulinanalogen og danner Lys(B28), Pro(B29) humaninsulin. Insulinanalogen blir deretter ytterligere renset ved kationbytte-kromatografi på S-Sepharose etterfulgt av høy ytelse revers fase-kromatografi på et 10 pm C-8 harpiks. Acetonitril blir fjernet fra revers fase-hovedstrømmen ved oppløsningsmiddelbytte gjennom Sephadex G-25 og det resulterende materialet blir konsentrert ved anvendelse av et spiraltvunnet ultrafiltreringsystem. Konsentrert materiale blir utsatt for størrelses-eksklusjonskromatografi på Sephadex G-50 harpiks og lyofilisert til tørrhet.

I tabell II nedenfor er aminosyreanalyser av forbindelsene i ovennevnte eksempler tilveiebragt.

vis en eller to timer etter administrasjon av proteinet). Fra denne kurven ble en EDgQ-verdi bestemt som den subkutane dosen (pg/kg) av proteinet som tilveiebragte den halve maksimale hypoglycemi-responsen. Resultatene er vist i følgende tabell III.

Som tidligere angitt har insulinanalogene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse en redusert tendens til å dimerisere eller på annen måte selv-assosiere til former med høyere molekylvekt. Ved administrasjon av en eller flere av de nevnte analogene blir et hurtig forløp av aktiviteten oppnådd. Insulinanalogene ifølge foreliggende oppfinnelse er effektive for behandling av hyperglycemi ved administrering til en pasient som trenger dette, en effektiv mengde av en insulinanalog med formel I. Som anvendt heri betegnet betegnelsen "effektiv mengde" til den mengden av en eller flere insulinanaloger ifølge foreliggende oppfinnelse som er nødvendig for åredusere eller opprettholde blodsukkernivåene enten terapeutisk eller profylaktisk. Denne mengden kan vanligvis variere fra omtrent 10 enheter opp til omtrent 60 enheter eller mer pr. dag (eller omtrent 0,3 til omtrent 2 mg, med antagelse om omtrent 29 enheter pr. mg). Det er å bemerke at mengden av insulinanalogen(e) som blir administrert vil bli bestemt av legen i lys av relevante omstendigheter, inkludert tilstanden som blir behandlet (d.v.s. årsaken til hyperglycemi), den bestemte analogen som blir administrert, valgte parenterale administrasjonsvei, alder, vekt og respons til den individuelle pasienten og alvorligheten av pasientens symptomer. Ovennevnte doseringsområde er derfor ikke ment åbegrense rammen av oppfinnelsen.

Insulinanalogene fremstilt ifølge oppfinnelsen blir administrert til en pasient som trenger disse (d.v.s. en pasient som lider av hyperglycemi) ved hjelp av farmasøytiske sammensetninger inneholdende en effektiv mengde av minst en insulinanalog med formel I i kombinasjon med en eller flere farmasøytisk akseptable hjelpestoffer eller bærere. De farmasøytiske sammensetningene kan vanligvis bli formulert slik at de omtrent inneholder 100 enheter pr. ml eller lignende konsentrasjoner inneholdende en effektiv mengde av insulinanalogen(e). Disse sammensetningene har vanligvis, men ikke nødvendigvis, parenteral natur og kan bli preparert ved en av forskjellige teknikker under anvendelse av konvensjonelle hjelpestoffer eller bærere for parenterale produkter velkjent innenfor fagområdet. Se for eksempel, "Remington's Pharmaceutical Sciences", 17. utgave, Mack Publishing Company, Easton, PA, USA (1985) som er inkorporert heri som referanse. For eksempel kan doseringsformer for parenteral administrasjon bli preparert ved suspendering eller oppløsning av den ønskede mengden av minst en insulinanalog med formel I i en ikke-toksisk flytende bærer egnet for injeksjon, så som et vandig medium og sterilisering av suspensjonen eller oppløsningen. Alternativt kan en målt mengde av forbindelsen bli plassert i en beholder, og beholderen samt innholdet derav kan bli sterilisert og forseglet. En tilleggsbeholder eller bærer kan bli tilveiebrakt for blanding før administrasjon. Farmasøytiske sammensetninger tilpasset parenteral administrasjon anvender fortynningsmidler, hjelpemidler og bærere så som vann og organiske oppløsningsmidler som er blandbare med vann så som glycerin, sesamolje, jordnøttolje, vandig propylenglycol, N,N'-dimetylformamid og lignende. Eksempler på slike farmasøytiske sammensetninger omfatter sterile, isotoniske, vandige saltoppløsninger av insulinanalogene med formel I som kan bli bufferet med en farmasøytisk akseptabel buffer og som er pyrogenfri. I tillegg kan den parenterale farmasøytiske formuleringen inneholde konserveringsmidler, så som meta-cresol eller andre midler for å justere pH til sluttproduktet så som natriumhydroksid eller saltsyre.

Insulinanalogene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse kan også bli formulert til farmasøytiske sammensetninger egnede for intranasal administrasjon. Slike sammensetninger er i detalj beskrevet i Europeisk Patentsøknad nr. 0200383 A3 som er inkorporert heri som referanse. Slike sammensetninger er formulert med en eller flere farmasøytisk akseptable fortynningsmidler, en farmasøytisk akseptabel mengde av et alkalimetallsalt, ammoniumsalt eller fri syre av et vesentlig zink-fritt insulin og eventuelt en absorpsjonsfremmende mengde av minst ett absorpsjonsfremmende middel valgt fra gruppen bestående av (1) oljesyre eller en ester eller et salt derav, (2) en sorbitanfettsyre-ester i flytende form, (3) et polyoksyetylen-derivat i flytende form av en sorbitan-fettsyreester og (4) en hydroksypolyoksyetylen-polyoksypropylen-polyoksyetylen-copolymer i flytende form.

For å demonstrere effektiviteten ved intranasal administrasjon av insulinanalogen Lys(B28), Pro(B29) humaninsulin i forhold til human natriuminsulin ble følgende studie utført. Hannharehunder med vekt på 10 til 12 kg ble opprettholdt i god fysisk tilstand før og i løpet av studien. Hundene ble fastet i 16 timer men hadde adgang til vann for å være forsikret overfor uventede variasjoner i insulinnivåene. I løpet av hele studien ble hundene bedøvet med natriumpentobarbitol og deres kroppstemperatur ble opprettholdt med varmekluter for å minimalisere glukosevariasjon. Insulintest-prøver (d.v.s. Lys(B28), Pro(B29) human insulin og human natriuminsulin) ble løst opp i destillert vann og pH til oppløsningen ble justert til 7,5 med natriumhydroksid. Sluttkonsentrasjonen av insulin var 70 enheter pr. ml. En insulindose på 0,8 enheter pr. kg av Lys(B28), Pro(B29) humaninsulin ble administrert til alle åtte hundene og likeledes ble en dose på 0,8 enheter pr. kg human natriuminsulin administrert til alle fire hundene. Alle dosene ble administrert i nasalhulrommet ved administrering av en spray pr. nesebor med en tilmålt doseforstøver og en modifisert neseapplikator. Blodprøver ble tatt fra jugularvenen 30,15 og 0 minutter før administrasjon og 10, 20,30, 45, 60, 90,120,180 og 240 minutter etter administrasjon for måling av reduksjon av blodglukose. Resultatene av denne studien er vist i tabell IV.

Ved anvendelse av protokollen beskrevet ovenfor ble en sammenligning av blodglukose-reduksjonsprofilen til Lys{B28), Pro(B29) humaninsulin via Intranasal administrasjon sammenlignet med både intravenøs og subkutan administrasjon av analogen som følger. For intravenøs administrasjon ble insulinoppløsningen inneholdende Lys(B28), Pro(B29) human-insulinanalogen administrert ved bolus-injeksjon (0,1 enheter pr. kg) inn i safenusvenen til hver av de fire hundene. Blodprøver ble tatt 30, 15 og 0 minutter før administrasjonen og 5, 10, 15, 20, 30, 45, 60, 90, 120, 180 og 240 minutter etter administrasjonen. For subkutan administrasjon ble insulinoppløsningen inneholdende Lys(B28), Pro(B29) human-insulinanalogen administrert under epidermis (0,2 enheter pr. kg) av den ytre siden av hver av de seks hundene. Blodprøver ble tatt ifølge samme protokoll som beskrevet etter nasal administrasjon som beskrevet ovenfor. Resultatene av denne sammenlignende studie er vist i tabell IV.

Claims

1. Rekombinant fremgangsmåte for fremstilling av en terapeutisk aktiv insulinanalog med formel formel ( Y ) eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, hvor B1 er fenylalanin, asparaginsyre eller er fraværende; B2 er valin eller kan være fraværende når Bl er fraværende; B3 er asparagin eller asparaginsyre; B10 er histidin eller asparaginsyre; B28 er en hvilken som helst aminosyre, B29 er L-prolin; D-lysin, eller L-Lysin; Z er -OH; X er Arg-Arg eller er fraværende; og Y kan være tilstede bare når X er tilstede og, hvis tilstedeværende, er Glu eller en aminosyresekvens som omfatter alle eller en del av sekvensen Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Argog begynner ved N-terminusen Glu til en slik sekvens, kjennetegnet ved å: i) transfomere en vertscelle med DNA som koder for en proinsulin med formel I hvor X, Y og Z er til stede; ii) dyrke den rekombinante vertscellen og isolere en forbindelse som blir kodet av DNA i trinn i) og iii) enzymatisk spalte forbindelsen for å fjerne X, Y og Z for å tilveiebringe en insulinanalog.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert ved at Bl er fenylalanin; B2 er valin; B3 er asparagin; B10 er histidin, B28 lysin, B29 er L-prolin; Z er -OH; X er Arg-Arg: og Y er aminosyresekvensen Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg og begynner ved N-terminusen Glu til en slik sekvens.

3. Mellomprodukt nyttig i en fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert v e d at det omfatter B-kjeden ifølge formel (I) hvor Bl er fenylalanin; B2 er valin; B3 er asparagin; B10 er histidin; B28 lysin; B29 er L-prolin; Z er -OH; X er Arg-Arg; og Y er aminosyresekvensen Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Argog begynner ved N-terminusen Glu til en slik sekvens.