Beschreibung
Hitze- und schüttelstabile Insulinzubereitungen Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer wässrigen, pharmazeutischen Formulierung enthaltend ein Insulin, ein Insulinanalogon oder ein Insulinderivat, wobei die gebrauchsfertige Formulierung unmittelbar durch Lösen des Insulins, des
Insulinanalogons oder des Insulinderivats als Feststoff mit einem geeigneten
Lösemittelgemisch erfolgt.
Weltweit leidet eine zunehmende Zahl an Menschen an Diabetes mellitus. Darunter sind viele sogenannte Typ I-Diabetiker, für die die Substitution der fehlenden
endokrinen Insulinsekretion die einzige derzeit mögliche Therapie darstellt. Die
Betroffenen sind lebenslang, in der Regel mehrmals täglich, auf Insulininjektionen angewiesen. Im Gegensatz zum Typ I-Diabetes besteht beim Typ Il-Diabetes nicht grundsätzlich ein Mangel an Insulin, jedoch wird in einer Vielzahl von Fällen, vor allem im fortgeschrittenen Stadium, die Behandlung mit Insulin, gegebenenfalls in
Kombination mit einem oralen Antidiabetikum, als günstigste Therapieform angesehen. Beim Gesunden ist die Insulinfreisetzung durch den Pankreas strikt an die
Konzentration der Blutglucose gekoppelt. Erhöhte Blutglucosespiegel, wie sie nach Mahlzeiten auftreten, werden durch eine entsprechende Steigerung der
Insulinsekretion rasch kompensiert. Im nüchternen Zustand sinkt der
Plasmainsulinspiegel auf einen basalen Wert ab, der ausreicht, eine kontinuierliche Versorgung insulinsensitiver Organe und Gewebe mit Glucose zu gewährleisten und die hepatische Glucoseproduktion in der Nacht niedrig zu halten. Der Ersatz der körpereigenen Insulinsekretion durch exogene, meist subcutane Applikation von Insulin erreicht in der Regel die oben beschriebene Qualität der physiologischen Regulation der Blutglucose nicht annähernd. Häufig kommt es zu Entgleisungen der Blutglucose nach oben oder unten, die in ihren schwersten Formen lebensbedrohlich sein können. Daneben stellen jedoch auch über Jahre erhöhte Blutglucosespiegel ohne anfängliche Symptome ein erhebliches Gesundheitsrisiko dar. Die großangelegte DCCT-Studie in den USA (The Diabetes Control and Complications Trial Research
Group (1993) N. Engl. J. Med. 329, 977-986) wies eindeutig nach, daß chronisch erhöhte Blutglucosespiegel wesentlich für die Entwicklung diabetischer Spätschäden verantwortlich sind. Diabetische Spätschäden sind mikro- und makrovaskuläre Schädigungen, die sich u.U. als Retino-, Nephro-, oder Neuropathie manifestieren und zu Erblindung, Nierenversagen sowie dem Verlust von Extremitäten führen und darüber hinaus mit einem erhöhten Risiko für Herz/Kreislauferkrankungen
einhergehen. Daraus ist abzuleiten, daß eine verbesserte Therapie des Diabetes in erster Linie darauf abzielen muß, die Blutglucose möglichst eng im physiologischen Bereich zu halten. Nach dem Konzept der intensivierten Insulintherapie soll dies durch mehrmals tägliche Injektionen von schnell und langsam wirkenden
Insulinzubereitungen erreicht werden. Rasch wirkende Formulierungen werden zu den Mahlzeiten gegeben, um den postprandialen Anstieg der Blutglucose auszugleichen. Langsam wirkende Basalinsuline sollen die Grundversorgung mit Insulin insbesondere während der Nacht sicherstellen, ohne zu einer Hypoglykämie zu führen.
Insulin ist ein Polypeptid aus 51 Aminosäuren, die sich auf 2 Aminosäureketten verteilen: die A Kette mit 21 Aminosäuren und die B-Kette mit 30 Aminosäuren. Die Ketten sind durch 2 Disulfidbrücken miteinander verbunden. Insulinzubereitungen werden seit vielen Jahren zur Diabetestherapie eingesetzt. Dabei werden nicht nur natürlich vorkommende Insuline verwendet, sondern neuerdings auch Insulinderivate und -analoga.
Insulinanaloga sind Analoga von natürlich vorkommenden Insulinen, nämlich
Humaninsulin oder tierischen Insulinen, welche sich durch Substitution wenigstens eines natürlich auftretenden Aminosäurerestes mit anderen Aminosäuren und/oder Addition/Entfernen wenigstens eines Aminosäurerestes von dem entsprechenden, ansonsten gleichen natürlich vorkommenden Insulin unterscheiden. Es kann sich dabei auch um Aminosäuren handeln, die nicht natürlich vorkommen. Insulinderivate sind Derivate von natürlich vorkommendem Insulin oder einem
Insulinanalogon, welche durch chemische Modifizierung erhalten werden. Die chemische Modifikation kann z.B. in der Addition einer oder mehrerer bestimmter
chemischer Gruppen an eine oder mehrere Aminosäuren bestehen. In der Regel haben Insulinderivate und Insulinanaloga gegenüber humanem Insulin eine etwas veränderte Wirkung. Insulinanaloga mit beschleunigtem Wirkungseintritt werden in EP 0 214 826,
EP 0 375 437 und EP 0 678 522 beschrieben. EP 0 124 826 bezieht sich u.a. auf Substitutionen von B27 und B28. EP 0 678 522 beschreibt Insulinanaloga, die in der Position B29 verschiedene Aminosäuren, vorzugsweise Prolin, aufweisen, jedoch nicht Glutaminsäure.
EP 0 375 437 umfaßt Insulinanaloga mit Lysin oder Arginin in B28, die optional zusätzlich in B3 und/oder A21 modifiziert sein können.
In der EP 0 419 504 werden Insulinanaloga offenbart, die gegen chemische
Modifikationen geschützt sind, in dem Asparagin in B3 und wenigstens eine weitere Aminosäure in den Positionen A5, A15, A18 oder A21 verändert sind.
In der Regel haben Insulinderivate und Insulinanaloga gegenüber humanem Insulin eine etwas veränderte Wirkung. In der WO 92/00321 werden Insulinanaloga beschrieben, bei denen wenigstens eine Aminosäure der Positionen B1 -B6 durch Lysin oder Arginin ersetzt ist. Derartige Insuline weisen gemäß WO 92/00321 eine verlängerte Wirkung auf. Eine verzögerte Wirkung weisen auch die in der EP-A 0 368 187 beschriebenen Insulinanaloga auf. Das Konzept der intensivierten Insulintherapie versucht das Gesundheitsrisiko abzumindern, indem eine stabile Kontrolle des Blutzuckerspiegels durch frühe Gabe von Basalinsulinen angestrebt wird. Ein Beispiel für ein gängiges Basalinsulin ist das Medikament Lantus® (Wirkstoff: Insulin Glargin = GIy (A21 ), Arg (B31 ), Arg (B32) Humaninsulin). Generell gilt es, bei der Entwicklung neuer, verbesserter Basalinsuline die Zahl hypoglykämischer Ereignisse zu minimieren. Ein ideales Basalinsulin wirkt dabei sicher in jedem Patienten mindestens 24 Stunden. Idealerweise setzt die
Insulinwirkung verzögert und mit einem möglichst flachen Zeit- / Wirkungsprofil ein, so dass die Gefahr einer kurzfristigen Unterzuckerung deutlich minimiert ist und die
Applikation sogar ohne vorherige Einnahme von Nahrungsmitteln erfolgen kann. Eine gute Versorgung mit Basalinsulin ist dann gegeben, wenn die Insulinwirkung möglichst lange gleichbleibend anhält, d.h. der Körper mit einer konstanten Menge Insulin versorgt wird. Damit ist die Gefahr hypoglykämischer Ereignisse gering und eine patienten- und tagesspezifische Variabilität minimiert. Das pharmakokinetische Profil eines idealen Basalinsulins sollte also durch einen verzögerten Wirkeintritt und durch eine verzögerte, d.h. lang anhaltende und gleichmäßige Wirkung gekennzeichnet sein.
Die auf dem Markt befindlichen Insulinzubereitungen von natürlich vorkommenden Insulinen zur Insulinsubstitution unterscheiden sich in der Herkunft des Insulins (z.B. Rind, Schwein, Humaninsulin), sowie der Zusammensetzung, womit das Wirkprofil (Wirkeintritt und Wirkdauer) beeinflusst werden kann. Durch Kombination
verschiedener Insulinpräparate lassen sich unterschiedlichste Wirkprofile erzielen und möglichst physiologische Blutzuckerwerte einstellen. Die rekombinante DNA
Technologie ermöglicht heutzutage die Herstellung von solchen modifizierten
Insulinen. Hierzu zählt Insulin Glargin (Gly(A21 )-Arg(B31 )-Arg(B32)-Humaninsulin) mit einer verlängerten Wirkdauer. Insulin Glargin wird als saure, klare Lösung injiziert und fällt aufgrund seiner Lösungseigenschaften im physiologischen pH-Bereich des
Subkutangewebes als stabiles Hexamerassoziat aus. Insulin Glargin wird einmal täglich injiziert und zeichnet sich gegenüber anderen langwirksamen Insulinen durch sein flaches Serumprofil und die damit verbundene Reduktion der Gefahr nächtlicher Hypoglykämien aus (Schubert-Zsilavecz et al., 2:125-130(2001 )). Die spezifische Zubereitung des Insulin Glargins, die zur verlängerten Wirkdauer führt, ist im
Gegensatz zu bisher beschriebenen Zubereitungen durch einen klare Lösung mit saurem pH-Wert gekennzeichnet. Gerade bei saurem pH-Wert zeigen Insuline jedoch eine verringerte Stabilität und eine erhöhte Aggregationsneigung bei thermischer und physikalisch-mechanischer Belastung, die sich in Form von Trübungen und
Ausfällungen (Partikelbildungen) bemerkbar machen kann (Brange et al., J. Ph. Sei 86:517-525(1997)).
Flüssige Insulinzubereitungen haben bei einer Lagerung bei 2-8°C eine Haltbarkeitsdauer von ca. 2 Jahren. Die Haltbarkeit in Gebrauch erlaubt eine Lagerung bei bis zu 25°C und wird mit 4 Wochen angegeben, mechanischer Streß (Schütteln) ist zu
vermeiden. Die Patienten müssen hierbei generell darauf achten, dass die Insulinzubereitung eine klare Lösung bleibt, da es in Ausnahmefällen zu Präzipitation des Insulins kommen kann, teilweise durch Bildung sogenannter„Fibrillen". Dadurch besteht die Gefahr, dass eine hinreichende Dosierung des Arzneimittels nicht gewährleistet ist.
Es besteht also der Bedarf, hitze- und schüttelstabilen stabile Insuline bzw. hitze- und schüttelstabilen stabile Insulinzubereitungen zur Behandlung des Typ 2 und Typ 1 Diabetes zu entwickeln. Dies ist im Rahmen der hier beschriebenen Erfindung erfolgt. Die erfindungsgemäßen 2-Komponenten-lnsulinzubereitungen unterscheiden sich von herkömmlichen durch ihre Hitzestabilität und ihrer Stabilität gegenüber mechanischem Steß. Im Gegensatz zu auf den Markt befindlichen flüssigen Insulinformulierungen beruht die Hitze- und Schüttelstabilität auf der Aufbewahrung von Insulin als Feststoff bis kurz vor der Darreichung. Es konnte gezeigt werden, daß festes Insulin bei Hitzestress gegenüber Degradation (Veränderung der Molekülstruktur) stabiler ist als gelöstes. Weiterhin präzipitiert gelöstes Insulin; dies stellt einen biophysikalischen Vorgang dar, welcher im festen Zustand nicht stattfinden kann. In der Folge steht bei vergleichbarem Hitzestress mehr bioverfügbares Insulin einer Insulinzubereitung zur Verfügung, wenn der Lösevorgang nach dem Hitzestress stattfindet.
Wäßrige Insulinzubereitungen zeigen weiterhin bei mechanischem Streß (Schütteln) die Neigung, Insulin zu präzipitieren. Die Menge des bioverfügbaren Insulins nach Schüttelstreß ist somit unbekannt und stellt eine Beeinträchtigung der
Patientensicherheit dar. Zudem besteht somit außer hitzestabilen Insulinzubereitungen Bedarf an solchen, die auch gegenüber mechanischem Streß (z.B. Schütteln) stabil sind. Es konnte gezeigt werden, daß festes Insulin gegenüber Schütteln stabiler ist als gelöstes Insulin. Der biophysikalische Vorgang des Präzipitierens bei Schüttelstreß findet ausschließlich in gelöstem Insulin statt. In der Folge steht bei vergleichbarem Schüttelstreß bioverfügbares Insulin in unbeeinträchtiger Menge zur Verfügung, wenn der Lösevorgang nach dem Schüttelstreß stattfindet.
Üblicherweise werden Insuline in wäßrigen Systemen, die Hilfs-und Zusatzstoffe wie beispielsweise Antibakterizide, isotonisierende Agenzien, Puffersubstanzen, und/oder Tenside enthalten (= im folgenden„Lösemittel" genannt) auf dem Markt angeboten. Das Auflösen von Insulinen zur Herstellung pharmakologischer Zubereitung wird im Allgemeinen dadurch gewährleistet, daß die Insuline zunächst sauer angelöst werden, um dann in weiteren Schritten auf die erforderliche Konzentration und pH-Wert der Lösung eingestellt zu werden (The Wellcome Foundation Limited te London,
Octrooiraad Nederland, Octrooiannnvrage No. 6506714, 26.05.1965 "Werkwijze voor het bereiden van insulinepreparaten").
Alternativ ist ein Anlösen von Insulinen im Alkalischen und anschließender pH-Wert- Einstellung einhergehend mit einer leicht erhöhten Stabilität der Insulinzubereitungen beschrieben (WO 2004/096266). Somit ist jeweils ein mehrstufiger Prozeß zur Herstellung einer gebrauchsfertigen Insulinzubereitung nötig, der u.a. die Einstellung des pH-Werts umfasst.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass sich gebrauchsfertige
Insulinzubereitungen durch ein einstufiges Verfahren herstellen lassen, bei dem das Insulin (oder ein Analog oder Derivat davon) mit einer Pufferlösung
zusammengegeben wird und durch Auflösen des Insulins (oder des Analogs oder des Derivats davon) die gebrauchsfertige Insulinzubereitung innerhalb weniger Minuten entsteht. Somit kann das Auflöseverfahren des festen Insulins vor Ort durch den Patienten bzw. seiner betreuenden Personen erfolgen, beispielsweise in einer Zwei-Kammer-Ampulle oder anderen geeigneten Vorrichtungen. Entsprechende Versuche, Insuline in den geeigneten Lösemitteln und Konzentrationen in einer adäquaten Dauer (~10min) komplett zu lösen, sind erfolgreich verlaufen. Im wesentlichen hängt hierfür der Erfolg vom geeigneten pH-Wert des Lösemittels ab. Die prinzipielle Komposition der
Lösemittel (Hilfsmittel, Zusatzstoffe etc.) unterscheidet sich dabei von den bereits auf dem Markt befindlichen Formulierungen nicht oder nicht notwendigerweise.
Hitze- und mech. streßstabile und Insuline bieten somit folgende Vorteile:
- Notwendige Kühlkette wird obsolet
- Lagervorhaltung in warmen Ländern vereinfacht
- Verbesserte Arzneimittelsicherheit beim Patienten
- Generelle verlängerte Haltbarkeitsdauer des Arzneimittels
- Verringerter Rücklauf von Ampullen mit präzipitiertem Insulin
Die erfindungsgemäßen 2-Komponenten-lnsulinzubereitungen bieten oben genannte Vorteile. Patienten mit keinem oder mangelhaftem Zugang zu geeigneten Kühlgeräten können auf diese Weise geeignete Mengen Insulin vorrätig halten; auch ist die
Verwendung solcher Zubereitungen in Ländern mit warmem Klima besonders vorteilhaft. Durch geeignete Ampullengrößen im Sinne der erfindungsgemäßen 2-Komponenten- Insulinzubereitungen kann auch die Menge der Insulinlösung beim Patienen so verringert werden, daß die notwendige Lagerungsdauer in Gebrauch auf ein minimales Maß reduziert werden kann. Dadurch kann der Zusatz von antimikrobiellen
Zusatzstoffen wie beispielsweise m-Kresol oder anderen Phenolen verringert oder sogar obsolet werden.
Die Zubereitungen können für alle bekannten Insuline, Insulinanaloga und
Insulinderivate hergestellt werden. Dazu zählen auch Zubereitungen mit wünschenswerten basalen Zeit- /
Wirkungsprofilen, bei denen die Insulinanaloga durch die Merkmale charakterisiert sind, dass
• das B- Kettenende aus einem amidierten basischen Aminosäurerest wie Lysin bzw.
Argininamid besteht, d.h. bei dem amidierten basischen Aminosäurerest am B- Kettenende liegt die Carboxylgruppe der endständigen Aminosäure in ihrer amidierten
Form vor, und
• der N-terminale Aminosäurerest der Insulin A-Kette ein Lysin- oder Argininrest ist, und
• die Aminosäureposition A8 durch einen Histidinrest besetzt wird, und
• die Aminosäureposition A21 durch einen Glycinrest besetzt wird, und
• zwei Substitutionen neutraler Aminosäuren durch saure Aminosäuren, zwei
Additionen negativ geladener Aminosäurereste oder je eine solche Substitution und eine solche Addition jeweils in den Positionen A5, A15, A18, B-1 , BO, B1 , B2, B3 und B4 erfolgt sind. Ein Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung einer wässrigen, pharmazeutischen Formulierung enthaltend ein Insulin, ein Insulinanalogon oder ein Insulinderivat, oder ein pharmakologisch tolerierbares Salz davon, wobei die
gebrauchsfertige Formulierung unmittelbar durch Lösen des Insulins, des
Insulinanalogons oder des Insulinderivats als Feststoff mit einem geeigneten
Lösemittelgemisch erfolgt, vorzugsweise bei dem die Zusammensetzung des geeigneten Lösemittelgemischs ermittelt wird, indem
(a) Lösemittelgemische unterschiedlichen pH-Werts mit Konzentrationen von
Exzipienten zubereitet werden, welche der Endkonzentration der Exzipienten der Formulierung enthaltend ein Insulin, ein Insulinanalogon oder ein Insulinderivat entsprechen und
(b) durch Lösen des gewünschten Insulins, Insulinanalogons oder Insulinderivats dasjenige Lösemittelgemisch ermittelt wird, welches nach Lösen des Feststoffes von Insulin, Insulinanalogon oder Insulinderivat den gewünschten pH-Wert der
gebrauchsfertigen Formulierung hervorbringt.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren wie oben beschrieben, wobei das Insulin, das Insulinanalogon oder das Insulinderivat als kristalliner oder amorpher Feststoff vorliegt. Ein Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren wie oben beschrieben, wobei das
Insulin ausgewählt wird aus einer Gruppe enthaltend menschliches Insulin, Schweine- Insulin und Insulin des Rindes.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren wie oben beschrieben, wobei das Insulinanalogon ausgewählt wird aus einer Gruppe enthaltend Gly(A21), Arg(B31), Arg(B32)-Humaninsulin, Lys(B3), Glu(B29)-Humaninsulin, Asp(B28)-Humaninsulin, Lys(B28) Pro(B29)-Humaninsulin und Des(B30)-Humaninsulin.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Insulinanalogon ausgewählt wird aus einer Gruppe enthaltend ein Insulinanalogon der Formel I
S S
1 5 | 10| 15 20
AO G I V E A5 C C H S I C S L Y A15 L E A18 Y C G
I (SEQ ID NO: 1) \ A-Kette
B-I BO Bl B2 B3 B4 H L C G S H L V E A L Y L V C G E R G F F Y
1 5 10 15 20 25
T P B29 B30 B31 B32 (SEQ ID NO: 2)
B-Kette
30 wobei
AO Lys oder Arg; A5 Asp, GIn oder GIu;
A15 Asp, GIu oder GIn;
A18 Asp, GIu oder Asn;
B-1 Asp, GIu oder eine Aminogruppe;
BO Asp, GIu oder eine chemische Bindung;
B1 Asp, GIu oder Phe;
B2 Asp, GIu oder VaI;
B3 Asp, GIu oder Asn;
B4 Asp, GIu oder GIn; B29 Lys oder einer chemischen Bindung; B30 Thr oder einer chemischen Bindung;
B31 Arg, Lys oder einer chemischen Bindung;
B32 Arg-Amid, Lys-Amid oder einer Aminogruppe entspricht, wobei zwei Aminosäurereste der Gruppe enthaltend A5, A15, A18, B-1, BO, B1, B2, B3 und B4 gleichzeitig und unabhängig voneinander Asp oder GIu
entsprechen, oder ein pharmakologisch tolerierbares Salz davon, vorzugsweise, bei der das Insulinanalogon ausgewählt ist aus einer Gruppe enthaltend:
Arg (AO), His (A8), GIu (A5), Asp (A18), GIy (A21), Arg (B31), Arg (B32)- NH2 Humaninsulin, Arg (AO), His (A8), GIu (A5), Asp (A18), GIy (A21), Arg (B31), Lys (B32)- NH2 Humaninsulin, Arg (AO), His (A8), GIu (A15), Asp (A18), GIy (A21), Arg (B31), Arg (B32)- NH2 Humaninsulin, Arg (AO), His (A8), GIu (A15), Asp (A18), GIy (A21), Arg (B31), Lys (B32)- NH2 Humaninsulin, Arg (AO), His (A8), Glu(A5), GIu (A15), GIy (A21), Arg (B31), Arg (B32)- NH2 Humaninsulin, Arg (AO), His (A8), GIu (A5), GIu (A15), GIy (A21), Arg (B31), Lys (B32)- NH2 Humaninsulin, Arg (AO), His(A8), GIu (A5), GIy (A21), Asp (B3), Arg (B31), Arg (B32)- NH2 Humaninsulin, Arg (AO), His(A8), GIu (A5), GIy (A21), Asp (B3), Arg (B31), Lys (B32)- NH2 Humaninsulin, Arg (AO), His (A8), GIu (A15), GIy (A21), Asp (B3), Arg (B31), Arg (B32)- NH2 Humaninsulin, Arg (AO), His (A8), GIu (A15), GIy (A21), Asp (B3), Arg (B31), Lys (B32)- NH2 Humaninsulin, Arg (AO), His (A8), Asp (A18), GIy (A21), Asp (B3), Arg (B31), Arg (B32)- NH2 Humaninsulin, Arg (AO), His (A8), Asp (A18), GIy (A21), Asp (B3), Arg (B31), Lys (B32)- NH2 Humaninsulin,
Arg (AO), His(A8), GIy (A21), Asp (B3), GIu (B4), Arg (B31), Arg (B32)- NH2 Humaninsulin, Arg (AO), His (A8), GIy (A21), Asp (B3), GIu (B4), Arg (B31), Lys (B32)- NH2 Humaninsulin, Arg (AO), His (A8), GIu (A5), GIy (A21), GIu (B4), Arg (B31), Arg (B32)- NH2 Humaninsulin, Arg (AO), His (A8), GIu (A5), GIy (A21), GIu (B4), Arg (B31), Lys (B32)- NH2 Humaninsulin, Arg (AO), His (A8), GIu (A15), GIy (A21 ), GIu (B4), Arg (B31 ), Arg (B32) - NH2 Humaninsulin, Arg (AO), His (A8), GIu (A15), GIy (A21), GIu (B4), Arg (B31), Lys (B32)- NH2 Humaninsulin, Arg (AO), His (A8), Asp (A18), GIy (A21), GIu (B4), Arg (B31), Arg (B32) - NH2 Humaninsulin, Arg (AO), His (A8), Asp (A18), GIy (A21), GIu (B4), Arg (B31), Lys (B32) - NH2 Humaninsulin, Arg (AO), His (A8), GIu (A5), GIy (A21), GIu (BO), Arg (B31), Arg (B32)- NH2 Humaninsulin, Arg (AO), His (A8), GIu (A5), GIy (A21), GIu (BO), Arg (B31), Lys (B32)- NH2 Humaninsulin, Arg (AO), His (A8), GIu (A15), GIy (A21 ), GIu (BO), Arg (B31 ), Arg (B32) - NH2 Humaninsulin, Arg (AO), His (A8), GIu (A15), GIy (A21 ), GIu (BO), Arg (B31 ), Lys (B32) - NH2 Humaninsulin, Arg (AO), His (A8), Asp (A18), GIy (A21), GIu (BO), Arg (B31), Arg (B32) - NH2 Humaninsulin, Arg (AO), His (A8), Asp (A18) ,GIy (A21), GIu (BO), Arg (B31), Lys (B32) - NH2 Humaninsulin, Arg (AO), His (A8), GIu (A5), GIy (A21), Asp (B1), Arg (B31), Arg (B32)- NH2 Humaninsulin, Arg (AO), His (A8), GIu (A5), GIy (A21), Asp (B1), Arg (B31), Lys (B32)- NH2 Humaninsulin, Arg (AO), His (A8), GIu (A15), GIy (A21 ), Asp (B1 ), Arg (B31 ), Arg(B32) - NH2 Humaninsulin, Arg (AO), His (A8), GIu (A15), GIy (A21), Asp (B1), Arg (B31), Lys (B32) - NH2 Humaninsulin, Arg (AO), His (A8), Asp (A18), GIy (A21), Asp (B1), Arg (B31), Arg (B32)- NH2 Humaninsulin, Arg (AO), His (A8), Asp (A18), GIy (A21), Asp (B1), Arg (B31), Lys (B32)- NH2 Humaninsulin, Arg (AO), His (A8), GIy (A21), GIu (BO), Asp (B1), Arg (B31), Arg (B32) - NH2 Humaninsulin, Arg (AO), His (A8), GIy (A21 ), GIu (BO), Asp (B1 ), Arg (B31 ), Lys (B32) - NH2 Humaninsulin, Arg (AO), His (A8), Asp (A18), GIy (A21), Asp (B3), Arg (B30), Arg (B31)- NH2 Humaninsulin, Arg (AO), His (A8), Asp (A18), GIy (A21), Asp (B3), Arg (B30), Lys (B31)- NH2 Humaninsulin.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren wie oben beschrieben, wobei das Insulinanalogon ausgewählt wird aus einer Gruppe enthaltend
ein Insulinanalogon der Formel Il
S S
5 I 10 I 15 20
A-I AO Al I V E A5 C C H S I C S L Y A15 L E Al 8 Y C A21
I I
B-I BO Bl V B3 B4 H L C G S H L V E A L Y L V C G E R G F F Y
1 5 10 15 20 25
T P B29 B30 B31 B32 (SEQ ID NO: 4) B-Kette
30 wobei
A-1 Lys, Arg oder einer Aminogruppe;
AO Lys, Arg oder einer chemischen Bindung;
A1 Arg oder GIy; A5 Asp, GIu oder GIn;
A15 Asp, GIu oder GIn;
A18 Asp, GIu oder Asn;
A21 AIa, Ser, Thr oder GIy;
B-1 Asp, GIu oder eine Aminogruppe; BO Asp, GIu oder eine chemische Bindung;
B1 Asp, GIu, Phe oder eine chemische Bindung;
B3 Asp, GIu oder Asn;
B4 Asp, GIu oder GIn;
B29 Arg, Lys oder einer Aminosäure ausgewählt aus einer Gruppe enthaltend die Aminosäuren Phe, AIa, Thr, Ser, VaI, Leu, GIu oder Asp, oder einer chemischen Bindung;
B30 Thr oder einer chemischen Bindung; B31 Arg, Lys oder einer chemischen Bindung; B32 Arg-Amid oder Lys-Amid entspricht, wobei nicht mehr als ein Aminosäurerest der Gruppe enthaltend A5, A15, A18, B-1 , BO, B1 , B2, B3 und B4 gleichzeitig und unabhängig voneinander Asp oder GIu entsprechen, vorzugsweise bei der das Insulinanalogon ausgewählt ist aus einer Gruppe enthaltend:
Arg (A-1 ), Arg (AO), GIu (A5), His (A8), GIy (A21 ), Arg (B30) - NH2 Humaninsulin, Arg (A-1 ), Arg (AO), GIu (A5), His (A8), GIy (A21 ), Lys (B30) - NH2 Humaninsulin, Arg (A-1 ), Arg (AO), GIu (A15), His (A8), GIy (A21 ), Arg (B30) - NH2 Humaninsulin, Arg (A-1 ), Arg (AO), GIu (A15), His (A8), GIy (A21 ), Lys (B30) - NH2 Humaninsulin, Arg (A-1 ), Arg (AO), Asp (A18), His (A8), GIy (A21 ), Arg (B30) - NH2 Humaninsulin, Arg (A-1 ), Arg (AO), Asp (A18), His (A8), GIy (A21 ), Arg (B30) - NH2 Humaninsulin, Arg (A-1 ), Arg (AO), His (A8), GIy (A21 ), GIu (BO), Arg (B30) - NH2 Humaninsulin, Arg (A-1 ), Arg (AO), His (A8), GIy (A21 ), GIu (BO), Lys (B30) - NH2 Humaninsulin, Arg (A-1 ), Arg (AO), His (A8), GIy (A21 ), Asp (B3), Arg (B30) - NH2 Humaninsulin, Arg (A-1 ), Arg (AO), His (A8), GIy (A21 ), Asp (B3), Lys (B30) - NH2 Humaninsulin, Arg (A-1 ), Arg (AO), His (A8), GIy (A21 ), GIu (B4), Arg (B30) - NH2 Humaninsulin, Arg (A-1 ), Arg (AO), His (A8), GIy (A21 ), GIu (B4), Lys (B30) - NH2 Humaninsulin, Arg (AO), His (A8), GIy (A21 ), Arg (B31 ), Arg (B32) - NH2 - Humaninsulin,
Arg (AO), His (A8), GIy (A21 ), Arg (B31 ), Lys (B32) - NH2 - Humaninsulin,
Arg (AO), GIu (A5), His (A8), GIy (A21 ), Arg (B31 ), Arg (B32) - NH2 - Humaninsulin,
Arg (AO), GIu (A5), His (A8), GIy (A21 ), Arg (B31 ), Lys (B32) - NH2 - Humaninsulin, Arg (AO), Asp (A18), His (A8), GIy (A21 ), Arg (B31 ), Arg (B32) - NH2 - Humaninsulin, Arg (AO), Asp (A18), His (A8), GIy (A21 ), Arg (B31 ), Lys (B32) - NH2 - Humaninsulin, Arg (AO), GIu (A15), His (A8), GIy (A21 ), Arg (B31 ), Arg (B32) - NH2 - Humaninsulin, Arg (AO), GIu (A15), His (A8), GIy (A21 ), Arg (B31 ), Lys (B32) - NH2 - Humaninsulin, Arg (AO), His (A8), GIy (A21 ), Asp (B3), Arg (B31 ), Arg (B32) - NH2 - Humaninsulin, Arg (AO), His (A8), GIy (A21 ), Asp (B3), Arg (B31 ), Lys (B32) - NH2 - Humaninsulin, Arg (AO), His (A8), GIy (A21 ), GIu (B4), Arg (B31 ), Arg (B32) - NH2 - Humaninsulin, Arg (AO), His (A8), GIy (A21 ), GIu (B4), Arg (B31 ), Lys (B32) - NH2 - Humaninsulin, Arg (AO), His (A8), GIy (A21 ), GIu (BO), Arg (B31 ), Arg (B32) - NH2 - Humaninsulin, Arg (AO), His (A8), GIy (A21 ), GIu (BO), Arg (B31 ), Lys (B32) - NH2 - Humaninsulin, Arg (AO), His (A8), GIy (A21 ), Arg (B30) - NH2 - Humaninsulin,
Arg (AO), His (A8), GIy (A21 ), Lys (B30) - NH2 - Humaninsulin,
Arg (A-1 ), Arg (AO), His (A8), GIy (A21 ), Arg (B30) - NH2 - Humaninsulin,
Arg (A-1 ), Arg (AO), His (A8), GIy (A21 ), Lys (B30) - NH2 - Humaninsulin,
Arg (AO), Arg (A1 ), His (A8), GIy (A21 ), Arg (B30) - NH2 - Humaninsulin,
Arg (AO), Arg (A1 ), His (A8), GIy (A21 ), Lys (B30) - NH2 - Humaninsulin,
His (A8), GIy (A21 ), Arg (B31 ), Arg (B32) - NH2 - Humaninsulin. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Insulinderivat ausgewählt wird aus einer Gruppe enthaltend B29-N-myristoyl-des(B30) Humaninsulin, B29-N-palmitoyl-des(B30) Humaninsulin, B29-N-myhstoyl Humaninsulin, B29-N-palmitoyl Humaninsulin, B28-N- myristoyl LysB28ProB29 Humaninsulin, B28-N-palmitoyl-LysB28ProB29 Humaninsulin, B30-N-myhstoyl-ThrB29LysB3° Humaninsulin, B30-N-palmitoyl- ThrB29LysB30
Humaninsulin, B29-N-(N-palmitoyl-Y-glutamyl)-des(B39) Humaninsulin, B29-N-(N- lithocholyl-Y-glutamyl)-des(B30) Humaninsulin, B29-N-(ω-carboxyheptadecanoyl)- des(B30) Humaninsulin and B29-N-(ω-carboxyheptadecanoyl) Humaninsulin.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren wie oben beschrieben, wobei in der Formulierung ein Konservierungsmittel ausgewählt aus einer Gruppe enthaltend Phenol, m-Cresol, Chlorkresol, Benzylalkohol, Parabene vorhanden ist.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren wie oben beschrieben, wobei in der Formulierung ein Isotonisierungsmittel ausgewählt aus einer Gruppe enthaltend Mannitol, Sorbitol, Lactose, Dextrose, Trehalose, Natriumchlorid, Glycerol vorhanden ist.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren wie oben beschrieben, wobei das Insulin, das Insulinanalogon und/oder das Insulinderivat in einer Konzentration von 240 - 3000 nmol/ml vorliegt
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren wie oben beschrieben, wobei in der Formulierung zusätzlich ein Glucagon-Like Peptide-1 (GLP1 ) oder ein Analogon oder Derivat davon, oder Exendin-3 bzw. -4 oder ein Analogon oder Derivat davon enthalten ist, vorzugsweise bei dem ein Analogon von Exendin-4 ausgewählt wird aus einer Gruppe enthaltend
H-desPro36-Exendin-4-Lys6-NH2,
H-des(Pro36 37)-Exendin-4-l_ys4-NH2 und
H-des(Pro36 37)-Exendin-4-Lys5-NH2,
oder ein pharmakologisch tolerierbares Salz davon.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren wie oben beschrieben, bei dem ein Analogon von Exendin-4 ausgewählt wird aus einer Gruppe enthaltend desPro36 [Asp28] Exend in-4 (1 -39),
desPro36 [IsoAsp28] Exend in-4 (1 -39),
desPro36 [Met(O)14, Asp28] Exend in-4 (1 -39),
desPro36 [Met(O)14, IsoAsp28] Exend in-4 (1 -39),
desPro36 [Trp(O2)25, Asp28] Exend in-2 (1 -39),
desPro36 [Trp(O2)25, IsoAsp28] Exend in-2 (1 -39),
desPro36 [Met(O)14Trp(O2)25, Asp28] Exend in-4 (1 -39) und
desPro36 [Met(O)14Trp(O2)25, IsoAsp28] Exend in-4 (1-39),
oder ein pharmakologisch tolerierbares Salz davon, vorzugsweise bei denen an die C- Termini der Analoga von Exendin-4 das Peptid -Lys6-NH2 angefügt ist.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine pharmazeutische Formulierung wie oben beschrieben, bei dem ein Analogon von Exendin-4 ausgewählt wird aus einer Gruppe enthaltend
H-(LyS)6- des Pro36 [Asp28]Exendin-4(1 -39)-Lys6-NH2
des Asp28Pro36, Pro37, Pro38 Exendin-4(1 -39) -NH2,
H-(LyS)6- des Pro36, Pro37, Pro38 [Asp28]Exendin-4(1 -39) -NH2,
H-Asn-(Glu)5 des Pro36, Pro37, Pro38 [Asp28] Exend in-4(1 -39) -NH2,
des Pro36, Pro37, Pro38 [Asp28]Exendin-4(1 -39)-(Lys)6-NH2,
H-(LyS)6- des Pro36, Pro37, Pro38 [Asp28]Exendin-4(1 -39)-(Lys)6-NH2,
H-Asn-(Glu)5- des Pro36, Pro37, Pro38 [Asp28]Exendin-4(1 -39)-(Lys)6-NH2,
H-(LyS)6- des Pro36 [Trp(O2)25, Asp28]Exendin-4(1 -39)-Lys6-NH2,
H- des Asp28 Pro36, Pro37, Pro38 [Trp(O2)25] Exend in-4(1 -39) -NH2,
H-(LyS)6- des Pro36, Pro37, Pro38 [Trp(O2)25, Asp28]Exendin-4(1 -39) -NH2,
H-Asn-(Glu)5- des Pro36, Pro37, Pro38 [Trp(O2)25, Asp28]Exendin-4(1 -39) -NH2, des Pro36, Pro37, Pro38 [Trp(O2)25, Asp28]Exendin-4(1 -39)-(Lys)6-NH2,
H-(LyS)6- des Pro36, Pro37, Pro38 [Trp(O2)25, Asp28]Exendin-4(1 -39)-(Lys)6-NH2, H-Asn-(Glu)5- des Pro36, Pro37, Pro38 [Trp(O2)25, Asp28]Exendin-4(1 -39)-(Lys)6-NH2, H-(LyS)6- des Pro36 [Met(O)14, Asp28]Exendin-4(1 -39)-Lys6-NH2,
des Met(O)14 Asp28 Pro 36, Pro37, Pro38 Exendin-4(1 -39) -NH2,
H-(LyS)6- des Pro36, Pro 37, Pro38 [Met(O)14, Asp28]Exendin-4(1 -39) -NH2,
H-Asn-(Glu)5- des Pro36, Pro37, Pro38 [Met(O)14, Asp28] Exendin-4(1 -39) -NH2, des Pro36, Pro37, Pro38 [Met(O)14, Asp28]Exendin-4(1 -39)-(Lys)6-NH2,
H-(LyS)6- des Pro36, Pro37, Pro38 [Met(O)14, Asp28]Exendin-4(1 -39)-Lys6-NH2,
H-Asn-(Glu)5 des Pro36, Pro37, Pro38 [Met(O)14, Asp28] Exendin-4(1 -39)-(Lys)6-NH2, H-(LyS)6- des Pro36 [Met(O)14, Trp(O2)25, Asp28]Exendin-4(1 -39)-Lys6-NH2,
des Asp28 Pro36, Pro37, Pro38 [Met(O)14, Trp(O2)25]Exendin-4(1 -39) -NH2,
H-(LyS)6- des Pro36' Pro37, Pro38 [Met(O)14, Trp(O2)25, Asp28]Exendin-4(1 -39) -NH2, H-Asn-(Glu)5- des Pro36, Pro37, Pro38 [Met(O)14, Asp28] Exendin-4(1 -39) -NH2, des Pro36, Pro37, Pro38 [Met(O)14, Trp(O2)25, Asp28]Exendin-4(1 -39)-(Lys)6-NH2,
H-(LyS)6- des Pro36' Pro37, Pro38 [Met(O)14, Trp(O2)25, Asp28] Exend in-4(1 -39)-(Lys)6- NH2,
H-Asn-(Glu)5- des Pro36, Pro37, Pro38 [Met(O)14, Trp(O2)25, Asp28] Exendin-4(1 -39)- (LyS)6-NH2,
oder ein pharmakologisch tolerierbares Salz davon.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren wie oben beschrieben, wobei in der Formulierung zusätzlich Arg34, Lys26 (Nε(γ-glutamyl(Nα-hexadecanoyl))) GLP-1 (7-37) [liraglutide] oder ein pharmakologisch tolerierbares Salz davon enthalten ist.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren wie oben beschrieben, wobei in der Formulierung noch ein Zinksalz enthalten ist.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines Verfahrens wie oben beschrieben bei der großtechnischen Herstellung eines Insulins, Insulinanalogs oder Insulinderivats.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein zweiteiliger Satz von Behältern, in denen einer der Behälter ein Insulin, ein Insulinanalogon oder ein Insulinderivat als Feststoff und der andere Behälter ein Lösemittelgemisch eines bestimmten pH-Werts mit der Endkonzentration der Exzipienten einer gewünschten Formulierung eines Insulins, eines Insulinanalogons oder eines Insulinderivats enthält; zur hitze- und schüttelstabilen Aufbewahrung des Insulins, des Insulinanalogons oder des
Insulinderivats für das spätere Herstellen einer gebrauchsfertigen Formulierung durch Lösen des Feststoffs in dem Lösemittelgemisch wie oben beschrieben.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Zweikammerinjektionssystem, bei dem eine Kammer ein Insulin, ein Insulinanalogon oder ein Insulinderivat als Feststoff und die andere Kammer
ein Lösemittelgemisch eines bestimmten pH-Werts mit der Endkonzentration der Exzipienten einer gewünschten Formulierung eines Insulins, eines Insulinanalogons oder eines Insulinderivats enthält; zur hitze- und schüttelstabilen Aufbewahrung des
Insulins, des Insulinanalogons oder des Insulindehvats für das spätere Herstellen einer gebrauchsfertigen Formulierung durch Lösen des Feststoffs in dem Lösemittelgemisch wie oben beschrieben. In dieser Beschreibung werden die Begriffe„Formulierung" und„Zubereitung" synonym verwendet.
Figurenlegende:
Fig. 1 : Blutzuckersenkende Wirkung von neuen Insulinanaloga gemäß Formel I in Ratten
Fig. 2: Blutzuckersenkende Wirkung von neuen Insulinanaloga gemäß Formel I im
Hund
Fig. 3: Blutzuckersenkende Wirkung von YKL205 im Hund
Fig. 4: Zinkabhängigkeit der hypoglykämischen Wirkung von YKL205 im Hund
Fig. 5: Blutzuckersenkende Wirkung von erfindungsgemäßen Insulinanaloga der
Formel Il in Ratten
Fig. 6: Blutzuckersenkende Wirkung von Insulin Glargin in Ratten
Beispiele:
Die folgenden Beispiele sollen den Erfindungsgedanken näher erläutern, ohne beschränkend zu wirken. Beispiel 1 : Vereinfachtes Auflösen von Insulinen in einem Schritt (Auflösetest)
Üblicherweise werden Insuline in wäßrigen Systemen, die Hilfs-und Zusatzstoffe wie beispielsweise Antibakterizide, isotonisierende Agenzien, Puffersubstanzen, und/oder Tenside enthalten (= im folgenden„Lösemittel" genannt) auf dem Markt angeboten. Das Auflösen von Insulinen zur Herstellung pharmakologischer Zubereitung wird im Allgemeinen dadurch gewährleistet, daß die Insuline zunächst sauer angelöst werden, um dann in weiteren Schritten auf die erforderliche Konzentration und pH-Wert der
Lösung eingestellt zu werden (The Wellcome Foundation Limited te London,
Octrooiraad Nederland, Octrooiannnvrage No. 6506714, 26.05.1965 "Werkwijze voor het bereiden van insulinepreparaten"). Alternativ ist ein Anlösen von Insulinen im Alkalischen einhergehend mit einer leicht erhöhten Stabilität der Insulinzubereitungen beschrieben (WO 2004/096266
PCT/DK2004/000300, "Improved Physical Stability of Insulin Formulations").
Auflösetest:
Um der komplizierten Prozedur des Auflösens von Insulinen zu entgehen (siehe oben), wurde getestet, ob sich Insuline als Feststoffe so auflösen lassen, daß ihre auf dem Markt befindlichen Formulierung in einem Schritt erreicht wird. Ziel war es, die
Komposition der Marktformulierung beizubehalten, d.h. unter Berücksichtigung der Konzentration aller Hilfs-und Zusatzstoffe und des pH-Wertes.
Es wurden untersucht:
a. Lantus® (Hilfs-und Zusatzstoffe Zinkchlorid, m-Kresol, Glyzerin, pH 4) b. Insuman® (Hilfs-und Zusatzstoffe Nathumhydrogenphosphat, m-Kresol, Glyzerin, pH 7.3)
Es wurden verschiedene Lösemittelgemische zubereitet, welche der Endkonzentration der Exzipienten für die beiden Insuline Lantus® und Insuman® entsprachen. Hierbei wurde der pH-Wert des Lösemittels variiert. a. Lantus® erforderte einen pH-Wert des Lösemittels von pH 2.85, um eine komplette Auflösung mit dem erforderlichen End-pH-Wert von pH 4 zu erreichen. Die
Auflösegeschwindigkeit (Endvolumen 1 mL) lag unter 10min. b. Insuman® erforderte einen pH-Wert des Lösemittels von pH 7.6, um eine komplette Auflösung mit dem erforderlichen End-pH-Wert von pH 7.3 zu erreichen. Die
Auflösegeschwindigkeit (Endvolumen 1 mL) lag unter 10min.
LC-UV/MS-Analyse der Proben im Anschluß an die vereinfachte Auflösung mit anschließender Auswertung des UV-Chromatograms ergab mit den
Marktformulierungen identische Spektren (UV-Signal des m-Kresols und des jeweiligen Insulins hinsichtlich Retentionszeit und Peakfläche).
Schlußfolgerung: Es ist möglich, Insuline in einem Schritt zu lösen, d.h. ohne vorheriges Anlösen im sauren oder alkalischen pH. Als Schlüsselfaktor wurde die Anpassung des pH-Werts des Lösemittels auf die jeweils zu erzielende Konzentration sowie den pH-Wert des fertigen Produktes in Abhängigkeit der intrinsischen, den pH- Wert verändernden Eigenschaften der zu lösenden Insuline identifiziert. Unter
Anpassung dieser empirisch ermittelten Parameter konnte der Auflöseprozeß für die Insuline in einem angemessenen Zeitrahmen (<10 min) realisiert werden.
Beispiel 2: Hitzestabilität von Feststoffen (Hitzestresstest, Schütteltest, Amorphe Feststoffe)
Die Hitzestabilität von wäßrigen Insulinzubereitungen ist Gegenstand zahlreicher Untersuchungen (Literatur: A. Krogh, A. M. Hemmingsen, Biochem. J. (1928) 22, 1231 -1238 "The destructive action of heat on insulin Solutions").
Es ist bekannt, daß Zusatzstoffe unterschiedlich zur thermischen Stabilität des gelösten Insulins beitragen, z.B. die Zinkkonzentration oder der pH-Wert (N. R.
Stephenson, R. G. Romans; Journal of Pharmacy and Pharmacology (1960), 12 372- 376 "Thermal Stability of Insulin made from Zinc Insulin Crystals").
Bei der Untersuchung von Hitzestabilität von hauseigenen, marktfertigen Lösungen, welche alle Hilfs-und Zusatzstoffe enthielten, konnte auch in eigenen Studien die Präzipitation - neben der Bildung von Degradationsprodukten - als Hauptursache für den Verlust von biologisch aktivem Insulinmaterial identifiziert werden (B.V. Fisher, P.B. Porter; J. Pharm. Pharmacol. (1981 ), 33 203-206 "Stability of bovine Insulin").
Aufgrund dieser Beobachtungen wurde die Hitzestabiliät des Insulinfeststoffes überprüft, wobei im folgenden die verwendeten Markennamen der fertigen, wäßrigen Formulierungen auch für die jeweiligen Insulinfeststoffe (Wirkstoffe) verwendet wurden:
Hitzestresstest:
I) Verschiedene Insulinfeststoffe wurden bei unterschiedlichen Temperaturen (500C, 600C und 80°C) (Ausschluß von Licht) zwei Wochen lang gelagert. a. Lantus® (kristallin) ; b. Insuman® (kristallin); c. Apidra® (amporph)
II) Verschiedene Insulinfeststoffe wurden bei 600C unterschiedlich lang
gelagert (14 Tage, 1 Monat, 2 Monate, 3 Monate).
a. Lantus® (kristallin) ; b. Insuman® (kristallin); c. Apidra® (amporph)
III) Feststoffe von Arg (AO), His (A8), GIu (A15), Asp (A18), GIy (A21 ), Arg
(B31 ), Arg (B32) Humaninsulinamid und Lantus®, beide in amorphem Zustand, wurden zwei Wochen lang bei 60°C gelagert. Nach Beendigung der Hitzestressphasen wurden die Feststoffe aufgelöst, so daß sich eine identische Konzentration wie die Marktformulierungen ergab.
Als Vergleichsproben wurden Insulinlösungen mit gleicher Konzentration direkt vor der Messung gelöst.
Zusätzlich wurden Lantus®, Insuman® und Apidra® in marktfertigen Zubereitungen/
Behältnissen (Quelle: Produktion) für 14 Tage bei 60°C gestreßt. Als Vergleichsproben wurden Behältnisse aus der gleichen Produktionscharge bei 4°C gelagert und zusammen mit den gestreßten Proben analysiert. Schlußfolgerung: Die Hitzestabilität von Insulinen bei Lagerung als Feststoff für 14 Tage erwies sich als temperaturabhängig. Der Grad der Stabilität war insulinabhängig.
Die Lagerung als Feststoff erwies sich als hitzestabiler als die Lagerung in marktfertiger Lösung.
(I) LC-UV/MS-Analyse der Proben mit anschließender Auswertung des UV-Chroma- tograms ergab folgende Werte:
Schlußfolgerung: Die Hitzestabilität von Insulinen bei Lagerung als Feststoff für 14 Tage erwies sich als temperaturabhängig. Der Grad der Stabilität warinsulinabhängig. Die Lagerung als Feststoff erwies sich als hitzestabiler als die Lagerung in
marktfertiger Lösung. (II) LC-UV/MS-Analyse der Proben mit anschließender Auswertung des UV-Chroma- tograms ergab folgende Werte:
Lantus®:
Apidra®:
Schlußfolgerung: Die Hitzestabilität von Insulinen bei Lagerung als Feststoff bei 600C erwies sich als zeitabhängig. Der Grad der Stabilität war insulinabhängig. (III) LC-UV/MS-Analyse der Proben mit anschließender Auswertung des UV-Chroma- tograms ergab folgende Werte:
Schlussfolgerung: Die Hitzestabilität von Insulinen bei Lagerung als Feststoff bei 60°C erwies sich als zeitabhängig. Der Grad der Stabilität war insulinabhängig. Beide
untersuchten langwirksamen Insuline erwiesen sich auch in amorphem Zustand als relativ hitzestabil.
Schütteltest:
Es ist bekannt, daß wäßrige Insulinzubereitungen gegenüber Schütteln instabil sind (A. Oliva, J.B. Farina, M. Llabres; Int. J. Of Pharmaceutics (1996), 143 143-170
"Influence of temperature and shaking on stability of insulin preparations: degradation kinetics"). Verschiedene Insulinformulierungen wurden bei Raumtemperatur (Ausschluß von Licht) 100h lang bei 1400rpm geschüttelt. a) Lantus®, Insuman® und Apidra® in marktfertigen Zubereitungen/Behältnissen (Quelle: Produktion)
Lantus (Kartusche ohne Polysorbat 20, vial ohne Polysorbat 20, vial mit
Polysorbat 20), Insuman® (Kartusche, vial), Apidra® (Kartusche, vial) b) Lantus®, Insuman® und Apidra® als Feststoff (separat geschüttelt: Lösemittel zum direkten Auflösen in einem Schritt, siehe„Direktes Auflösen von
Insulinfeststoff").
Nach Beendigung der Schüttelphase wurden die Feststoffe (Proben b) aufgelöst, so daß sich eine identische Konzentration wie die Marktformulierungen ergab. c) Als Vergleichsproben wurden die entsprechenden Marktformulierungen auch 100h bei Raumtemperatur unter Ausschluß von Licht gelagert.
LC-UV/MS-Analyse der Proben mit anschließender Auswertung des UV-Chroma- tograms ergab folgende Werte (Referenz: Proben c):
Schlußfolgerung: Mechanischer Streß durch Schütteln bewirkte auf Insulinlösungen eine Prezipitation von Insulin. Das Ausmaß ist insulinabhängig: Insuman® zeigte hierbei die größte Instabilität.
Mechanischer Streß zeigte auf Insulin-Feststoff keine negative Auswirkungen: der Feststoff ließ sich anschließend zu 100% auflösen, auch wenn die Lösungen separat mitgeschüttelt wurden.
Beispiel 3: Mögliche Anwendungen (großtechnische Herstellung von
Insulinzubereitungen, hitze- und schüttelstabile Darreichungsform in einem Zwei- Komponenten-System) Großtechnische Herstellung von Insulinzubereitungen:
Bei einer Auflösung in einem Schritt handelt es sich um ein vereinfachtes Verfahren mit folgenden Vorteilen: Es sind weniger Schritte mit weniger Zwischenanalysen (z.B. pH-Wert) zu erstellen, d.h. die Herstellung der Insulinzubereitungen kann schneller erfolgen. Außerdem ist die Herstellung weniger kompliziert, was eine vereinfachte Einarbeitung der Mitarbeiter mit sich bringt (weniger komplizierte SOPs). Zudem sind weniger Behälter zu reinigen, was wiederum Arbeitszeit und -material spart.
Hitze- und Schüttelstabile Darreichungsform in einem Zwei-Komponenten-System: Es zeigte sich, daß feste Insuline - auch über einen längeren Zeitraum - bei
Hitzestress stabiler sind als gelöste. Es fand in geringem Ausmaß Degradationen statt, ein Verlust durch Präzipitation entfiel jedoch, so daß in der Folge bei vergleichbarem Hitzestress mehr bioverfügbares Insulin zur Verfügung stand, wenn der Lösevorgang erst nach dem Hitzestress stattfand. Präzipitation und Degradation, induziert durch starkes Schütteln der festen Insuline, konnte nicht beobachtet werden.
Eine Darreichung in fester Form kann somit als generell temperaturstabiler sowie robuster gegenüber Schütteln und in Folge dessen als sicherer beschrieben werden. Darüberhinaus bietet eine Darreichung der Insuline in fester Form (Pulver) den zusätzlichen Vorteil, daß ein versehentliches Einfrieren durch den Patienten zu keiner Komplikation führen kann; feste Insuline werden bekanntermaßen in gefrorenem Zustand gelagert.
Mögliche Anwendung: Insulinpulver statt gelöste Insuline werden mit geeignetem Lösemittel (im allgemeinen wäßrige Systeme, die Hilfs-und Zusatzstoffe wie
beispielsweise Antibakterizide, isotonisierende Agenzien, Puffersubstanzen, und/oder Tenside enthalten = im folgenden„Lösemittel" genannt) in einem Zwei-Komponenten- System angeboten. Ein Zwei-Kammer-System ist beispielsweise beschrieben in WO2007/038773 A1.
Dadurch erhöht sich der tolerierbare Temperaturbereich (sowohl in Richtung tieferer als auch höherer Temperaturen). Außerdem erhöht sich die Stabilität gegenüber mechanischem Streß wie zum Beispiel starke Erschütterungen. In der Folge sind längere Haltbarkeitsdauern, geringere Kosten für Lagerung und Transport und eine sicherere Arzneimittelanwendung zu erwarten.
Durch das vereinfachte Auflösen in einem Schritt ist die Anwendbarkeit durch den Patienten gewährleistet.
Beispiel 4: Formulierung der amidierten Indulinderivate
Die Beispiele 4 bis 8 dienen nur zur Bestimmung der biologischen, pharmakologischen und physikalisch-chemischen Eigenschaften von Insulinanaloga gemäß Formel I indem zunächst Formulierungen davon bereitgestellt wurden (Beispiel 4) und dann entsprechende Tests vorgenommen wurden (Beispiele 5 bis 8). Es wurde von den Verbindungen wie folgt eine Lösung hergestellt: Das erfindungsgemäße Insulinanalog wurde mit einer Zielkonzentration von 240 ± 5 μM in 1 mM Salzsäure mit 80 μg/mL Zink (als Zinkchlorid) aufgelöst. Als Lösungsmedium wurden folgende Zusammensetzungen verwendet:
a) 1 mM Salzsäure
b) 1 mM Salzsäure, 5 μg/mL Zink (als Zinkchlorid oder Salzsäure zugesetzt) c) 1 mM Salzsäure, 10 μg/mL Zink (als Zinkchlorid oder Salzsäure zugesetzt) d) 1 mM Salzsäure, 15 μg/mL Zink (als Zinkchlorid oder Salzsäure zugesetzt) e) 1 mM Salzsäure, 30 μg/mL Zink (als Zinkchlorid oder Salzsäure zugesetzt) f) 1 mM Salzsäure, 80 μg/mL Zink (als Zinkchlorid oder Salzsäure zugesetzt) g) 1 mM Salzsäure, 120 μg/mL Zink (als Zinkchlorid oder Salzsäure zugesetzt)
Hierzu wurde von dem gefriergetrockneten Material zunächst eine um etwa 30% höhere Menge als aufgrund des Molekulargewichts und der angestrebten
Konzentration benötigt eingewogen. Danach wurde die vorliegende Konzentration mittels analytischer HPLC bestimmt und die Lösung anschließend auf das zur
Erreichung der Zielkonzentration erforderliche Volumen mit 5 mM Salzsäure mit 80 μg/mL Zink aufgefüllt. Falls erforderlich, wurde dabei der pH-Wert auf 3,5 ± 0,1 nachjustiert. Nach der endgültigen Analyse durch HPLC zur Absicherung der
Zielkonzentration von 240 ± 5 μM wurde die fertige Lösung mittels einer Spritze mit einem 0,2 μm Filtervorsatz in ein mit einem Septum und einer Bördelkappe
verschlossenes steriles Fläschchen überführt. Für die kurzfristige, einmalige Testung der erfindungsgemäßen Insulinderivate wurde keine Optimierung der Formulierungen, z.B. hinsichtlich eines Zusatzes isotonischer Agentien, Konservierungsmittel oder Puffersubstanzen, vorgenommen.
Beispiel 5: Evaluierung der blutzuckersenkenden Wirkung von neuen Insulinanaloga in der Ratte Die blutzuckersenkende Wirkung von ausgewählten neuen Insulinanaloga wird in männlichen, gesunden, normoglykämischen Wistarratten geprüft. Männlichen Ratten wird eine Dosis von 9 nmol/kg eines Insulinanalogons subkutan injiziert. Unmittelbar vor der Injektion des Insulinanalogons und in regelmäßigen Abständen bis zu acht Stunden nach der Injektion werden den Tieren Blutproben entnommen und darin der Blutzuckergehalt bestimmt. Das Experiment zeigt deutlich (vgl. Fig. 1 ), dass das eingesetzte erfindungsgemäße Insulinanalogon zu einem deutlich verzögerten
Wirkeintritt und einer längeren, gleichmäßigen Wirkdauer führt.
Beispiel 6: Evaluierung der blutzuckersenkenden Wirkung von neuen Insulinanaloga im Hund
Die blutzuckersenkende Wirkung von ausgewählten neuen Insulinanaloga wird in männlichen, gesunden, normoglykämischen Beaglehunden geprüft. Männlichen Tieren wird eine Dosis von 6 nmol/kg eines Insulinanalogons subkutan injiziert. Unmittelbar vor der Injektion des Insulinanalogons und in regelmäßigen Abständen bis zu achtundvierzig Stunden nach der Injektion werden den Tieren Blutproben entnommen
und darin der Blutzuckergehalt bestimmt. Das Experiment zeigt deutlich (vgl. Fig. 2), dass das eingesetzte erfindungsgemäße Insulinanalogon zu einem deutlich
verzögerten Wirkeintritt und einer längeren, gleichmäßigen Wirkdauer führt.
Beispiel 7: Evaluierung der blutzuckersenkenden Wirkung am Hund bei
zweifach erhöhter Dosis
Die blutzuckersenkende Wirkung von ausgewählten neuen Insulinanaloga wird in männlichen, gesunden, normoglykämischen Beaglehunden geprüft. Männlichen Tieren wird eine Dosis von 6 nmol/kg und 12nmol/kg eines Insulinanalogons subkutan injiziert. Unmittelbar vor der Injektion des Insulinanalogons und in regelmäßigen Abständen bis zu achtundvierzig Stunden nach der Injektion werden den Tieren Blutproben entnommen und darin der Blutzuckergehalt bestimmt.
Das Experiment zeigt deutlich (vgl. Fig. 3), dass das eingesetzte erfindungsgemäße Insulinanalogon dosisabhängig wirkt, dass aber trotz zweifach erhöhter Dosis der Wirkungsverlauf flach verläuft, d.h. kein ausgeprägter Tiefpunkt (Nadir) beobachtet wird. Daraus lässt sich ableiten, dass die erfindungsgemäßen Insuline im Vergleich zu bekannten Verzögerungsinsulinen zu deutlich weniger hypoglykämischen Ereignissen führen.
Beispiel 8: Evaluierung der blutzuckersenkenden Wirkung am Hund bei verschiedenen Zinkkonzentrationen in der Formulierung
Die Experimente wurden, wie in Beispiel 35 beschrieben, durchgeführt. Figur 4 zeigt das Ergebnis. Danach lässt sich die Zeit - Wirkungskurve des erfindungsgemäßen Insulinanalogons durch den Gehalt an Zinkionen in der Formulierung bei gleicher Insulinkonzentration in der Weise beeinflussen, dass man bei null oder geringem Zinkgehalt einen schnellen Wirkungseintritt beobachtet und die Wirkung über 24 Stunden anhält, während bei höherem Zinkgehalt ein flacher Wirkungseintritt beobachtet wird und die Insulinwirkung deutlich länger als 24 Stunden anhält.
Beispiel 9: Formulierung der amidierten Insulinderivate
Die Beispiele 9 bis 11 dienen nur zur Bestimmung der biologischen,
pharmakologischen und physikalisch-chemischen Eigenschaften von Insulinanaloga gemäß Formel Il indem zunächst Formulierungen davon bereitgestellt wurden
(Beispiel 9) und dann entsprechende Tests vorgenommen wurden (Beispiele 10 und 11 ). Das erfindungsgemäße Insulinanalog wurde mit einer Zielkonzentration von 240 ± 5 μM in 1 mM Salzsäure mit 80 μg/mL Zink (als Zinkchlorid) aufgelöst. Hierzu wurde von dem gefriergetrockneten Material zunächst eine um etwa 30% höhere Menge als aufgrund des Molekulargewichts und der angestrebten Konzentration benötigt eingewogen. Danach wurde die vorliegende Konzentration mittels analytischer HPLC bestimmt und die Lösung anschließend auf das zur Erreichung der Zielkonzentration erforderliche Volumen mit 5 mM Salzsäure mit 80 μg/mL Zink aufgefüllt. Falls erforderlich, wurde dabei der pH-Wert auf 3,5 ± 0,1 nachjustiert. Nach der endgültigen Analyse durch HPLC zur Absicherung der Zielkonzentration von 240 ± 5 μM wurde die fertige Lösung mittels einer Spritze mit einem 0,2 μm Filtervorsatz in ein mit einem Septum und einer Bördelkappe verschlossenes steriles Fläschchen überführt. Für die kurzfristige, einmalige Testung der erfindungsgemäßen Insulinderivate wurde keine Optimierung der Formulierungen, z.B. hinsichtlich eines Zusatzes isotonischer Agentien, Konservierungsmittel oder Puffersubstanzen, vorgenommen.
Beispiel 10: Evaluierung der blutzuckersenkenden Wirkung von neuen Insulinanaloga in der Ratte
Die blutzuckersenkende Wirkung von ausgewählten neuen Insulinanaloga wird in männlichen, gesunden, normoglykämischen Wistarratten geprüft. Männlichen Ratten wird eine Dosis von 9 nmol/kg eines Insulinanalogons subkutan injiziert. Unmittelbar vor der Injektion des Insulinanalogons und in regelmäßigen Abständen bis zu acht Stunden nach der Injektion werden den Tieren Blutproben entnommen und darin der Blutzuckergehalt bestimmt. Das Experiment zeigt deutlich (vgl. Fig. 5), dass das
erfindungsgemäße Insulinanalogon zu einem deutlich verzögerten Wirkeintritt und einer längeren, gleichmäßigen Wirkdauer führt.
Beispiel 11 : Evaluierung der blutzuckersenkenden Wirkung von neuen Insulinanaloga im Hund
Die blutzuckersenkende Wirkung von ausgewählten neuen Insulinanaloga wird in männlichen, gesunden, normoglykämischen Beaglehunden geprüft. Männlichen Tieren wird eine Dosis von 6 nmol/kg eines Insulinanalogons subkutan injiziert. Unmittelbar vor der Injektion des Insulinanalogons und in regelmäßigen Abständen bis zu achtundvierzig Stunden nach der Injektion werden den Tieren Blutproben entnommen und darin der Blutzuckergehalt bestimmt. Das Experiment zeigt deutlich, dass das erfindungsgemäße Insulinanalogon zu einem deutlich verzögerten, flachen Wirkeintritt und einer längeren, gleichmäßigen Wirkdauer führt.