DE2023447A1 - Insulinderivate und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents

Description

DR. MÖLLER-BORG DIPL.-PHYS. DR.MANITZ Dl PL-CHEM. D*. DEUFEL DIPL-ING. FINSTERWALD DIPL-ING. GRÄMKÖW '

PATENTANWÄLTE

Lo/Sv - N 1028 ΐ3· MAI 197B

IiATIOIfAL RESEARCH DEVELOPMENT CORPORATION Iiingsgate House, 66-7^ Victoria Street, London S.W.1, England

Insulinderivate und Verfahren zu ihrer Herstellung

Die Erfindung betrifft Insulinderivate und ein Verfahren zu ihrer Herstellung.

Seit vielen Jahren werden Schweine- und Rinderinsulin zur Behandlung von Diabetes.und anderen Störungen angewandt. Einer der Hachteile dieser Stoffe "besteht jedoch darin, daß es "bei bestimmten Patienten erforderlich ist, die Dosis, nachdem die Behandlung einige Zeit lang durchgeführt wurde, zu steigern, um die gewünschte Wirkung herzustellen. Dies wurde dadurch erklärt, daß diesen tierischen, d.h. nicht humanen, Insulinen antigene Eigenschaften zugeschrieben wurden, welche in ausreichender Menge Antikörper entstehen lassen, um einem Anteil der applizierten Insulindosis entgegenzuwirken.

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Dr. MOIIer-Bore Of. Manitz · Dr. Deufel · Dipl.-Ing. Finsterwald Dipl.-Ing. Grämkow

'33 Braunidiweig, Am Böreerpark 8 8 Möndien22, Roberl-Kodi-Slraße 1 7 Stulteart - Bad Cannilalt

Telefon (0531) 28487 Telefon (OBlIJ 225110, Telex 522050 mbpot Markljtraßs3, Telefon (0711) 547261

Es wurde nun gefunden, daß es möglich ist, die Fähigkeit von Schweine- und Rinderinsulineii, mit einem spezifischen Insulinantikörper zu reagieren,beträchtlich herabzumindern und vielleicht sogar auszuschalten, ohne die gewünschten Eigenschaften dieser Hormone übermäßig zu beeinflussen.

Gemäß der Erfindung sind Insulinderivate, welche eine niedrige Immunisierung besitzen, solche, in denen der endständige Aminorest der B-Kette (B., Phenylalanin) durch einen Acylrest oder einen anderen blockierenden Rest geschützt ist und der Aminorest der Α-Kette (A,,, Glycin) entxfeder frei ist oder durch einen Acylrest oder einen anderen blockierenden Rest, welcher nicht mehr alc vier Kohlenstoffatome und vorzugsweise nicht mehr als drei Kohlenstoffatome besitzt, geschützt ist»

Es wurde nun gefunden, daß Insulinderivate, wie sie oben mit Bezug auf die A,,- und B.-Aminosäuren definiert wurden, die Mängel von Schweine- und Rinderinsulinen, wie sie zuvor verwendet wurden, nicht besitzen. Bevorzugte Verbindungen gemäß der Erfindung sind monosubstituierte Derivate, welche bei B,, geschützt sind, welche'jedoch einen freien Aminorest bei A^ besitzen. Es sei jedoch darauf hingewiesen, daß di- und sogar tri-substituierte Verbindungen (wobei die letzteren die Substitution an der B29-Aminosäure Lysin umfassen) zum Umfang der Erfindung gehören.

Der Schutz der gewünschten Aminoreste wird leicht durch Acylierung-erreicht. Eine große Vielzahl von Acylierungsmitteln kann zur Einführung von Resten wie Formyl, Acetyl, 'Acetoacetyl und anderen aliphatischen Acylresten, Benzoyl und anderen Aroylresten ebenso wie von solchen von Amino-

aDgelerceteir
säuren/einschließlich z.B. Asparaginsäure, Asparagin und Alanin und cyclisiertem Cystein z.B. wie in bestimmten Thiazolidinverbindungen, beispielsweise 2,2-D±methyl-3-formyl-L-thiazolidin-^-carboxylestern, verwendet werden.

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Die Acylierung kann mittels einer beliebigen Standardarbeitsweise, welche in der Peptid-Chemie verwendet wird, durchgeführt werden, einschließlich insbesondere der Yerx^enduiig von aktivierten Estern oder Anhydriden und typischen Carbodiimid-Kupplungsreagentien.'. Acylierende Mittel, die Ester von H-HydroxysucciniBiid sind, sind besonders vorteilhaft.

Um die maximale Ausbeute an am Β^,-Aminorest acyliertem Insulin herzustellen, ist der Anteil an angewandtem Acylierungsmittel vorzugsweise relativ niedrig. Beispielsweise erzeugt die Umsetzung von 1 Mol des Insulins mit etwa eins bis etwa zwei Mol Acylierungsmittel das gewünschte B.-moiiosubstituierte Derivat in beträchtlichen Mengen. Jedoch kann die Mono substitution an anderen Aminoresten ebenfalls auftreten, welche zu Nebenprodukten führt, die weniger brauchbar sind. Darüberhinaus kann nach Substitution bei B. ein gewisses Ausmaß von Disubstituteon und sogar Trisubstitution stattfinden. Es wurde ebenfalls gefunden, daß die Acylierungsreaktion von dem pH-Wert des Reaktionsmediums abhängt. Um die beste Ausbeute vom Monosubstitutionsprodukt an dem B.-Aminorest zu erzeugen, liegt der pH-Wert vorzugsweise bei oder nahe bei 7>0 und vorzugsweise ist er nicht größer als etwa 8. Bei einem pH—Wert von 8,5 fällt z.B. die Ausbeute dieses gewünschten Produktes beträchtlich zugunsten einer zusätzlichen Substitution bei A. und B29 ab. Üblicherweise ist es wünschenswert, das geforderte Derivat mittels Chromatographie, Elektrophorese oder einer beliebigen anderen, konventionellen Arbeitsweise zur Reinigung von Peptiden, welche einer Anwendung in großem Maßstab zugänglich ist, zu isolieren.

Erfindungsgemäße Insulinderivate können als pharmazeutische Präparationen in der gleichen Weise wie die Ausgangsinsuline rezeptiert werden und sie können klinisch in vergleichsweisen oder sogar niedrigeren Dosiswerten angewandt werden. So kann

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das gewünschte Derivat nach der Fraktionierung der Reaktionsmischung und der Entfernung von überschüssigen Salzen, z.B. mittels Dialyse, in gelöster Form oder fester Form gewonnen werden, z.B. durch Gefriertrocknung, woraufhin es auf die gewünschte Konzentration in einem injizierbarem, physiologisch anwendbaren Verdünnungsmittel, wie sterilem, pyrogenfreien Wasser oder Salzlösung, welche geeignete Puffer enthält, gebracht und in Ampullen abgefüllt wird· .

Beispiele von typischen Derivaten, welche gemäß der Erfindung hergestellt wurden, werden im folgenden beschrieben.

Beispiel 1

(a) N-Hydroxysuccinimidester von 2₀2⁸~Dimethyl-3-formyl-Iithiazolidin-A-carbonsäure

3-Formyl-2f2'-dimethyl-L-tHiazolidin-4-caxbonsäure (9,4-6 g; O₅05 Mol) wurden in redestilliertem Dimethylformamid (50 ml) aufgelöst und die Lösung wurde auf 4° abgekühlt. Umkristallisiertes N-Hydroxysuccinimid (5j76 g; 0,05 Mol) wurden zugesetzt, gefolgt von N,N'=> Dicyclohexylcarbodiimid (10,32 g? 0,05 Mol), und die Lösung wurde über Nacht bei 4⁰C und für weitere zwei Stunden bei 25° gerührt* Der gebildete Dicyclohesjylharnstoff wurde abfiltriert und das Dimethylformamid in einem Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck entfernt. Der erzeugte, zusätzliche Niederschlag von Dicyclohexy!harnstoff wurde abfiltriert, und der Harnstoff wurde mit Dichlormethan gewaschen» Zu der überstehenden Flüssigkeit wurde Petroläther (60° - 80°) zugesetzt, bis die Lösung trübe wurde. Die Filtrierung des beim Stehen nach dem Trocknen in einem Exsikkator, welcher Natriumhydroxid und Paraffinwachs enthielt, hergestellten, kristallinen Materials ergab farblose Nadeln des N-Hydroxysuccinimidderivates (13,7 g; 95,7 %). mit einem Fp = 98 - 100°.

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(b) Reaktion von Insulin mit N-Hydroxysuccinimidester von 2,2'-Dimethyl-3-f ormyl-L-thiazolidin-4·-carbonsäure

Zinkinsulin (500 mg; 0,085 mM; vom Schwein), welches 10 mal umkristallisiert war (Novo Industri A/S, Kopenhagen) wurde in Chlorwasserstoffsäure (45 ml; 0,1 N) aufgelöst, und der pH-Wert wurde mit N Natriumhydroxid auf 6,9 im Titrationsbehälter eines Radiometers (Typ QXDT1) pH-stat. eingestellt. Der Hydroxysuccinimidester (22 mg; 0,085 mM) wurde in Dioxan (100 ul) aufgelöst und zu der obengenannten Lösung in-Anteilen von 10 ial, wobei der pH-Wert auf 6,9 durch Zugabe von Alkali konstant gehalten wurde, nach jeweils 30 min gegeben.

Nach der letzten Zugabe des Hydroxybernsteinsäureesters wurde die Reaktionsmischung mit Natriumcarbonat-Natriumbicarbonatpuffer von pH == 9,5 auf 0,2" M eingestellt und über Nacht stehengelassen. Das Material wurde nach starker Dialyse gegen destilliertes Wasser lyophilisiert, um 490 mg des modifizierten Proteins zu erhalten.

In einem zweiten Versuch wurde Zinkinsulin (500-mg; 0,085 mM) mitdem Hydroxybernsteinsäureester (32 mg; 0,127 mM) bei einem pH-Wert von 8,5 in genau derselben Weise, wie oben beschrieben, behandelt. Die Reaktionsgeschwindigkeit, wie sie durch die Aufnahme des Alkali bestimmt wurde, war viel größer als bei pH =6,9 und die gleichen Anteile wurden alle 5 min- zugegeben.

(c) Abtrennung von Thiazolidin-Insulinen

(1) Chromatographie

Die QJhiazolidin-Insuline wurden auf einer Kolonne (2,5 χ W cm) von DEAE-Sephadex A-25 (schwachbasischer Anionenaustauscher mit Diäthylaminoäthyl als funktionel ler Gruppe) getrennt.

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Die Kolonne wurde mit Puffer, welcher 0,01 M Tris *■) und 0,05 M Natriumchlorid in 7 M deionisiertem Harnstoff enthielt, bei pH = 7»29 ins Gleichgewicht gesetzt. Das Thiazolidin-modifizierte Insulin wurde in diesem Puffer aufgelöst (500 mg; 50 mg/ml) und die Säule wurde bei einer Fließgeschwindigkeit von 5^,0 ml/h entwickelt, wobei 12 ml-Sraktionen gesammelt wurden. Nachdem 120 ml Eluat gesammelt worden waren, wurde ein linearer Gradient, der durch Einlaufenlassen von 0,01 M Tris, 0,10 M Natriumchlorid in 7 M deionisiertem Harnstoff (11) bei einem pH-Wert von 7,29 in den'gerührten Vorratsbehälter des Ausgangspuffers erhalten wurde (11) angelegt» *) Tris =s Tris-Gliydroxymethyl)aminomethan Die Proteinkonzentration wurde aus der Absorption der Lösung bei 277 W^- bestimmt.

Geeignete Fraktionen wurden vereinigt und ausgiebig gegen destilliertes Wasser'dialysiert» Das Material wurde lyophilisiert und der Rückstand auf einer Säule (1,5 x 60 cm) von G--10 Sephadex (dreidimensional vernetztes Polsacharid), welches mit 5 %iger Essigsäure ins Gleichgewicht gebracht worden war, deionisiert„ Die Proteinfraktionen wurden gesammelt und lyophilisiert .

Die chromatographische Abtrennung der bei der obengenannten Reaktion gebildeten Insulinderivate ist aus Fig. 1 ersichtlich. Unter Verwendung eines mäßigen Salzgradienten von 0,05 bis 0,1 molarem Natriumchlorid trat eine unvollständige Trennung der Peaks A, B und G auf. Das Material unterhalb der Peaks A, B und C wurde vereinigt und unter genau denselben Bedingungen erneut chromatographiert, wobei das in der Fig. 2 wiedergegebene Elutionsmuster erhalten wurde. Das Material in der Umgebung des Mittelpunktes eines

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jeden Peaks wurde vereinigt■und jeder Peak wurde einzeln einer erneuten Chromatographie unterzogen, wobei drei chromatographisch homogene Fraktionen erhalten wurden. Die den Peaks A, B und C entsprechenden Derivate erwiesen sich als am Phenylalanin, Glycin bzw. Lysin als monasubstituiert. ·

Das Elutionsmuster der Derivate, die erhalten wurden, \irenn Insulin mit einem 1,5 molaren Überschuß des Acylierungsmittels bei pH = 8,5 behandelt wurden, ist aus Fig. 3 ersichtlich. Ein viel einfacheres Elutions- ä muster wurde erhalten und ein dem Derivat A der vorherigen Chromatographie entsprechendes Material war in geringer- Menge vorhanden.

(2) Celluloseacetat-Elektrophorese

Zur Trennung der Thiazolidin-Insuline lagen Bedingungen vor, wie sie von Garpenter und Hayes (Biochemistry, _2 (1963) S.1272) beschrieben wurden, wobei ein Shandon-Elektrophoresetank, der mit einer wassergekühlten Platte (20 χ 20 cm) und einer Stromversorgung von 1 EY ausgerüstet war, verwendet wurde. Der verwendete Puffer bestand aus 0,065 M Phosphat, 7 M Harnstoff bei einem pH- | Wert von 6,5 und die Celluloseacetatstreifen (20 χ 5 cm) wurden in einer 0,2 %igen lösung von Ponceau S in 3 %iger Essigsäure angefärbt.

Die Celluloseacetat-Elektrophorese zeigte, daß die Derivate A, Bund C elektrophoretisch reine Komponenten waren, welche im Vergleich zu unsubstituiertem Insulin und dem zuvor, hergestellten Diacetoacetylirisulin mono substituiert waren.

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- 8 Beispiel 2

Reaktion von Insulin mit Piketen

Zinkinsulin (1,0 g) wie in Beispiel 1 wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,167 mM in 0,1 M HGl (45 ml) aufgelöst, und der pH-Wert wurde mit M UaOH auf 6,9 im Titrationsbehälter eines Radiometers (Typ TTT1) pH-stataressÄs eingestellt, irisch . destilliertes Diketen wurde in Anteilen von 5 f- zugefügt, wobei der pH-Wert auf 6,9 durch Zusatz von Alkali gehalten wurde. Nach Verbrauch von 1 Äquivalent Alkali nach etwa 5 mro- wurde eine Probe zur Analyse mittels Ninhydrin (Moore & Stein_s 1954) entnommen. Weitere Anteile von Diketen wurden zugesetzt, bis die Ninhydrin-Farbausbeute um 30 % abgenommen hatte „ Die Menge an zugesdbztem Diketen betrug 40 ul (Endkonzentration = 0,49 mM).

Die-Reaktionsmischung wurde in NagCO^-NaHCO-z-Puffer, pH = 9,5, 0,2 M 'gemacht und über Nacht stehengelassen. Nach starker Dialyse gegenüber destilliertem Wasser und Gefriertrocknung betrug die Ausbeute· an modifiziertem Protein 950 mg.

Chromatograph!sehe Trennung von Acetoacetyl-Insulinen

'Die Acetoacetyl-lnsuline wurden auf einer Säule von DEAE-Sephadex A-25 (2,5 cm χ 40 cm) getrennt.

Die Säule wurde mit einem Puffer, ins Gleichgewicht gesetzt, welcher 0,01 M Tris und 0,05 M NaCl in 7 M deionisiertem Harnstoff enthielt und der auf ein pH von 7,20 mit M HCl eingestellt war. Acetoacetyl-Insulin (500 mg) wurde in diesem Puffer (50 mg/ml) aufgelöst und die Säule wurde bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 54,0 ml/h entwickelt, wobei 12 ml-Iraktionen gesammelt wurden. Nachdem 120 ml des Eluates gesammelt waren, wurde ein linearer Gradient angelegt, der erhalten wurde, indem 0,01 M Tris, 0,15 M NaCl in 7 M deionisiertem Harnstoff bei pH = 7j20 in dem gerührten Vorratsbehälter des Ausgangspuffers fließen gelassen wurden.

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Die monoacetoacetylierten Insuline wurden auf einer Säule von DEAE-Sephadex A-25 (2,5 cm χ 4-0 cm), wie zuvor beschrieben, erneut chromatographiert, mit der Ausnahme, daß der Ausgangspuffer auf einen pH-Wert von 7,30 mit M HCl eingestellt" worden war. Es wurde ein linearer Gradient angelegt, in dem 0,01 M Tris, 0,10 M Nacl in 7 M deionisiertem Harnstoff bei pH = 7j3O in dem gerührten Vorratsbehälter des Ausgangspuffers laufengelassen wurden.

Die Proteinkonzentration wurde aus der Extinction der Lösung bei 277 nm bestimmt.

Die Ghromatographieergebnisse für Insulin (5Oo mg), welches mit einem dreifachen molaren Überschuß von Diketen behandelt · wurde, sind aus ]?ig.4 ersichtlich. Es sind vier Hauptpeaks unterscheidbar. Die Lage der Elution des nicht-modifizierten Insulinsist in der IPigur angegeben. Die Komponente I war hauptsächlich nicht-modifiziertes Insulin; die Komponente IV (80 mg) war chromatographisch homogen, erforderte eine höhere Salzkonzentration zur Elution und es wurde vermutet, daß sie höher substituiert war. Es wurde kein weiteres Protein eluiert.

Beispiel 3
(a) N-Acety!hydroxysuccinimid ^j

Diese Verbindung wurde nach der Arbeitsweise des Beispieles 1 (a) hergestellt, wobei Essigsäure anstelle der Thiazolidinverbindung verwendet wurde. Das Produkt hatte einen Ip von ⁰C nach seiner Umkr ist alii sation aus Äthylacetat.

Cb). Insulinderivate

Unter Befolgung der in den Beispielen 1 (b) und (c) beschriebenen Arbeitsweisen wurden Monoacetylderivate von Schweineinsulin hergestellt und getrennt. Das gewünschte Monoacetylderivat der B '-Aminosäure wurde isoliert, zur Entfernung überschüssiger Salze dialysiert und gefriergetrocknet. I098A8/1945

Beispiel 4-

Die in den Beispielen Λ, 2 und 3 beschriebenen Arbeitsweisen wurde wiederholt, wobei Rinderinsulin anstelle von Schweineinsulin verwendet wurde. Es wurden praktisch die gleichen Ergebnisse in allen Fällen ahalten»

Die Erfindung betrifft insbesondere auch pharmazeutische Präparationen, welche ein erfindungsgemäßes Insulinderivat enthalten, vorzugsweise, pharmazeutische Präparationen in Form einer injizierbaren wässrigen Lösung des Insulinderivates.

- Patentansprüche -

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Claims (1)

1. — ΊΊ — ■
   Pa-tent a η.-Sprüche

   M, physiologisch annehmbares Insulinderivat, in /welchem \^yäer endständige Aminorest der B-Kette (B., Phenylalanin) durch einen Acylrest oder einen anderen blockierenden.» Rest geschützt ist und der Aminorest der Α-Kette (A^, Glycin) entweder frei ist oder durch einen Acylrest oder einen anderen blockierenden Rest, welcher nicht mehr als vier Kohlenstoffatome und insbesondere nicht mehr als drei Kohlenstoffatome besitzt, geschützt ist. Λ

   2. Insulinderivat nach Anspruch 1, in welchem der B^-Aminorest durch einen aliphatischen Acylrest geschützt ist.

   J. Insulinderivat nach Anspruch 2, in dem der Acylrest Acetyl oder Acetoacetyl -ist.

   4. Insulinderivat nach Anspruch 1, in dem die B,-Aminosäure durch den 2,2'-Dimethyl-3-formyl-L-thiazolidin-4~ carboxylacylrest geschützt ist. -

   p. Insulinderivat nach einem der Ansprüche 1 bis 4 in Form

   eines monosubstituierten Derivates. %

   6. Verfahren zur Herstellung der Insulinderivate nach einem der vorhergehenden Ansprüche unter Herabsetzung der Antigenbildung von Schweine- oder Rinderinsulin, dadurch g ekennzeich.net, daß das Insulin mit einem Acylierungsmittel oder einem anderen blockierenden Reageiiz unter Aiyiiei'ung oder anderer Blockierung des Aminorest es ■ der B^-Aminosäure umgesetzt wird. ,·

   7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß ein monosubstituiertes B.-Amiaßäurenderivat aus der Reaktionsmischung abgetrennt wird.

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   8.. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7» dadurch gekennzeichnet, daß die Acylierung mit 1 bis 2 Mol Acylierungsmittel pro Mol Insulin durchgeführt wird.

   9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch g e k e η η ζ eichnet, daß der pH-Wert des Reaktionsmediums auf 7 bis 8 gehalten wird.

   10. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9, dadurch gekenn ζ eichnet₉ daß ein B^-monosubstituiertes Derivat aus dem Reaktionsmedium durch Chromatographie, Elektrophorese oder andere bekannte Arbeitsweisen zur Fraktionierung abgetrennt und die erhaltene Fraktion gegebenenfalls zur Entfernung von Salzen insbesondere durch Dialyse behandelt wird und die erhaltene Lösung des gewünschten Derivates in eine pharmazeutische Präparation umgewandelt wird., gegebenenfalls nach Gefriertrocknung und anschließender Wiederüberführung in phanazeutische Form»

   11. Verwendung der Insulinderivate nach einem der Ansprüche 1 bis 5 in einer pharmazeutischen Präparation.

   injizierbaren

   12. Verwendung nach Anspruch 11 in Form einer /wässrigen Lösung des Insulinderivates.

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