DE2540545C2 - (1-46)-Urogastron und das entsprechende durch Reduktion der Disulfidbindungen erhältliche Polypeptid, Verfahren zu deren Herstellung und diese Polypeptide enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen - Google Patents

Description

ι— Tyr-Gly-Val-Val-Cys-Asn «-I

L+U^Gly-Glu-Arg-Cys-Gln-Tyr-Aig-Aip-OH

und das entsprechende durch Reduktion der Disulfidbindungen erhältliche Polypeptid.

2. Verfahren zur Herstellung der Polypeptide gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das der angegebenen Aminosäuresequenz entsprechende, C-terminal den Leucylrest aufweisende, als (l-47)-Urogastron bezeichnete Polypeptid in einem wäßrigen Medium in Gegenwart von Carboxypeptidase A bei einem pH-Wert von 5 bis 10 und einer Temperatur von 10 bis 45° C hydrolytisch spaltet, das (1 -46)-Urogastron isoliert und gegebenenfalls mit einem in der Peptidchemie zur Reduktion von Disulfidbindungen üblichen Reduktionsmittel reduziert.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die hydrolytische Spaltung bei einer Konzentration des Ausgangspolypeptids von 1 mg/ml aufwärts, einem pH von 7 bis 9. einer Temperatur von 25 bis 40⁰C und einem Enzym/Substrat-Verhältnis von 1 Teil Enzym auf 100 Teile Substrat bis 1 Teil Enzym auf 10 Teile Substrat durchführt.

4. Pharmazeutische Zusammensetzungen, enthaltend eines der Polypeptide gemäß Anspruch 1 und übliche Verdünnungsmittel oder Trägermittel.

Die Erfindung betrifft die im Anspruch 1 bezeichneten Polypeptide, weiche die Eigenschaft besitzen, die Sekretion von saurem Magensaft zu inhibieren.

Es ist seit vielen jähren bekannt, daß Extrakte von menschlichem Urin eine Inhibierung der Sekretion von saurem Magensaft bei Warmblütern verursachen können. Die Isolierung zweier der aktiven Komponenten in reiner Form ist in der DE-OS 23 59 564 beschrieben. Diese beiden reinen Komponenten sind als /i-Urogastron bzw. ^-Urogastron bekannt. Die Grundlage der vorliegenden Erfindung ist die Feststellung, daß der enzymatische Abbau von ß- oder/-UrogastiOn zu einem neuen Polypeptid führt und daß dieses neue Polypeptid und sein Reduktionsprodukt kräftige Inhibitoren für die Sekretion von saurem Magensaft sind.

Bei dem erfindungsgemäßen (1-46)-Urogastron handelt es sich um ein weißes, wasserlösliches, saures Polypeptid, das aus einer einzigen Polypeptidkette mit drei inneren Disulfidbindungen besteht; am N-Ende nach Dansylierung Asparaginsäure aufweist; ein Molekulargewicht von ungefähr 5500 besitzt; die folgenden physikalischen Eigenschaften zeigt:

Papierchromatografie in n-Butanol zu Essigsäure zu Pyridin zu Wasser (30 :6 :24 :20) — ein einziger Fleck mit Ri 0,62;

Papierelektrophorese in Essigsäure/Ameisensäure mit einem pH-Wert von 2,1 — ein »Komet« mit einer Frontmobilität von 1,67 relativ zu 6-DNP-Lysin; \f

Acrylamidgelelektrophorese in 0,1 mTris/Salzsäure-Puffer mit einem pH-Wert 8,9 - ein einziger Fleck, ,It₁

der sich mit einer Mobilität von 0,77 relativ zu Bromphenolblau zur Anode bewegt; '·"?

und eine biologische Wirkung, wie weiter unten definiert, im Bereich von 0,2 bis 1 μ§Λ^; aufweist. < _f

Die Erfindung betrifft weiterhin Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen gemäß den ;,

obigen Ansprüchen 2 und 3. ', ^s

Der Fortschritt der Reaktion kann dadurch verfolgt werden, daß man Proben des Reaktionsmediums unter ,>"

Verwendung eines automatischen Aminosäureanalysators zur Bestimmung der Menge des abgespaltenen Leu- ijjs

eins unterwirft, oder dadurch, daß man die Proben der »Dansylierungstechnik« unterwirft, wobei ein 1-Dimethy- ) ^

laminonaphthalin-S-sulfonylchlorid (Hartley, Biochem. J. 1970, 119, 805) verwendet wird, und die Menge des _:,

gebildeten N-Dansyl-L-Ieucins bestimmt. Dadurch kann der Einfluß jeder Veränderung der Reaktionsbedingun- i},'

gen bestimmt werden. , ·|

Die Disulfidbindungen können beispielsweise mit einem Thiol, wie z. B. Mercaptoäthanol oder Dithiothreitol ',,

reduziert werden. Bevorzugte Bedingungen zur Erzielung der gewünschten Spaltung des Ausgangspolypeptids in einer verhältnismäßig kurzen Zeit, beispielsweise 12 Stunden, sind eine Konzentration des Ausgangspolypep- ^l '

lids von I mg/ml aufwärts, ein pH von 7 bis 9, eine Temperatur von 2¹S bis 40"C und ein Enzym/Substrat-Verhältnis von I Teil Enzym aul 100 Teile Substrat bis 1 Teil Enzym auf 10 Teile Substrat.

(i5 Das erfindungsgemäUe Polypeptid kann aus dem Reaktionsgemisch durch jede herkömmliche Technik für die Abtrennung von Polypeptiden isoliert werden, jedoch ist die Anwendung von Gclchroinatografie besonders zweckmäßig. So ist es möglich, das nach der Abspaltung des l.eucins aus dem Aiisgangspolypeplid erhaltene wäßrige Medium durch eine Kolonne eines vernetzten Dcxirangels oder eines Polyacrylamidgels zu filtrieren

und die Kolonne mit einem Puffer, der aus Komponenten besteht die bei der Gefriertrocknung unter Hochvakuum flüchtig sind, wie z. B. eine wäßrige Ammoniumacetatlösung mit einem pH-Wert von 7.2, zu eluieren, wobei das gewünschte Produkt erhalten wird, das durch Gefriertrocknung des Eluats isoliert wird.

Wenn das Reduktionsprodukt gewünscht wird, dann wird das erfindungsgemäße Polypeptid zweckmäßig in einem wäßrigen Puffer mit einem pH-Wert von 7 bis 10 unter Ausfluß von Sauerstoff und Licht reduziert. Das Produkt kann wiederum unter Verwendung von Gelchromatographie isoliert werden.

Wie oben bereits angedeutet, kann das Ausgangspolypeplid aus entweder ji- oder /-Urogastron durch Inkubierung des ß- oder ;«-Urogastrons mit einer Lysinspezifischen Aminoendopepiidase erhallen werden. Kin besonders geeignetes derartiges Enzym ist AM-Protease, die aus reifen Fruchtkörpern des Pilzes Armillaria mellea erhalten werden kann, wie es näher in der GB-PS 12 63 956 beschrieben ist. Bevorzugte lnkubationsbedingungen sind eine Urogastronkonzentration von 1 mg/ml aufwärts, ein pH von 6 bis 9, eine Temperatur von 20 bis 40⁰C und ein Enzym/Substrat-Verhältnis von 1 :8 bis 1 :100. Nach beendeter Inkubation wird das gewünschte biologisch aktive Polypeptid durch Gelchromatografie unter Verwendung eines vernetzten Dextrangels oder eines Polyacrylamidgels isoliert.

Wie oben angegeben, sind das erfindungsgemäße Polypeptid und sein Reduktionsproduki kräftige Inhibitoren für die Sekretion von saurem Magensaft bei Warmblütlern. Diese Eigenschaft kann dadurch demonstriert werden, daß sie die Sekretion von spurem Magensaft bei Hunden inhibieren, die mit einer Heidenhain-Tasche versehen sind und deren Magensaftsekretion mit Histamin stimuliert worden ist. Dieser Test wird zur Bestimmung der biologischen Wirkung der Produkte verwendet. Die biologische Wirkung wird definiert als die Menge des Produkts, die bei Verabreichung durch intravenöse Injektion an einen Hund, der mit einer Heidenhain-Tasehe versehen ist und dessen Magensäuresekretion durch Infusion von Histamin auf 60 bis 30% des maximalen Sekretionswerts stimuliert ist, eine 50- bis 70%ige Inhibierung dieser Säuresekretion verursacht. Eine gewisse Variation der biologischen Wirkung einer bestimmten Probe wird gefunden, wenn sie zu verschiedenen Gelegenheiten bei verschiedenen Hunden gemessen wird, weshalb das Ergebnis am besten als Dosierungsbereich ausgedrückt wird. Die physiologische Wirkung der Inhibierung der Sekretion des sauren Magensafts ist bei der Behandlung von Duodenalgeschwüren von Wert. Unter den Testbedingungen wurden keine ernst zu nehmenden toxischen Wirkungen festgestellt. Die Polypeptide zeigen außerdem bei einem Standardtest Geschwürheilungseigenschaften.

Bei Verwendung zur Erzielung einer Inhibierung der Sekretion von saurem Magensaft bei Warmblütlern kann eine große Reihe von Dosierungen verwendet werden, wie z. B von 0,05 bis 10ng/kg, je nach den Umständen und dem Ausmaß der gewünschten Inhibierung. Die Dosis kann durch Injektion, insbesondere intravenöse oder subkutane Injektion, oder durch intravenöse Infusion verabreicht werden. Die Wirkung einer einzigen intravenösen Injektion dauert ungefähr I¹/? Stunden, und die Wirkung einer Infusion wahrt ungefähr IV2 Stunden nach Beendigung der Infusion, so daß die Aufrechterhaltung eines niedrigen Aciditätswerts es erfordert, daß entweder die Dosis wiederholt wird oder daß ein Depotpräparat injiziert wird, aus welchem der aktive Bestandteil langsam während einer längeren Zeit in Freiheit gesetzt wird. Bei der Verwendung beim Menschen liegt eine typische Einzeldosis zwischen 5 und 500 μg/Mensch, verabreicht durch Injektion oder Infusion.

Das erfindungsgemäße Polypeptid oder Reduktionsprodukt kann in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht werden, so daß gemäß der Erfindung weiterhin eine pharmazeutische Zusammensetzung vorgeschlagen wird, die das Polypeptid oder das Reduktionsprodukt, wie sie oben definiert sind, und ein pharmazeutisch zulässiges Verdünnungsmittel oder Trägermittel enthält.

Bevorzugte Zusammensetzungen sind solche, die sich für parenterale Verabreichung eignen, wie z. B. sterile, injizierbare Lösungen oder Suspensionen und sterile, injizierbare Depotpräparate oder Präparate mit langsamer Abgabe. Eine injizierbare Lösung oder Suspension kann 0,5 bis 500 μg/mI enthalten, wobei die verdünnteren Lösungen durch Infusion verabreicht werden. Ein injizierbarcs Depotpräparat oder ein Präparat mit langsamer Abgabe kann dagegen bis zu 2 mg des aktiven Bestandteils je Dosis enthalten. Besonders zweckmäßige sterile, injizierbare Lösungen werden in isotonischen Salz- oder isotonischen Dextroselösungen hergestellt, die nötigenfalls auf einen pH-Wert von 5 bis 9 gepuffert sind und 1 bis 100 μg/ιτll enthalten können.

Die oben erwähnten sterilen, injizierbaren Zusammensetzungen können als solche hergestellt und gelagert werden, oder sie können unmittelbar vor der Verwendung hergestellt werden, indem ein steriles Medium, wie z. B. Wasser, zu einem bekannten Gewicht, wie z. B. bis 200 μg, des sterilen Bestandteils zugegeben wird, der in einem Behälter, wie z. B. einer Phiole oder Ampulle, welche die Sterilität aufrechterhält, eingeschlossen ist. Das bekannte Gewicht an sterilem Bestandteil kann auch ausreichend sterile Dextrose oder ausreichend steriles Natriumchlorid enthalten, so daß nach Verdünnung mit dem sterilen Medium eine isotonischc Lösung entsteht.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert. Die chromatografischen Materialien sind mit der Bezeichnung des Herstellers benannt,

ein poröses Polyacrylamidgel: Biogel P6;

ein poröses vernetztes Dextrangel: SephadexG-25; t,o

Carboxypeptidase-A: Carboxypeptidasc-A-DFP.

Bei den Verfahren, bei denen eine Chromatografiekolonne verwendet wurde, wurde das Eluat in Fraktionen aus einer bestimmten Anzahl von Tröpfchen gesammelt, wobei ein Ultrorac LKB 7000-Fraktionssammler verwendet wurde und wobei diese Fraktionen durch Messung der UV-Absorption bei 280 ιημ auf Pcptidrnateri- b5 al untersucht wurden. Das Material wurde in Fraktionen gesammelt. Die biologische Aktivität wurde wie folgt bestimmt:

Hunde wurden mit gesonderten entnervten Fundustaschen versehen, und es wurde eine subkutane Infusion

von Histamin verwendet, eine Magensaftsekretion von annähernd 60 bis 80% Jer MaxLnalgeschwindigkeit zu stimulieren (üblicherweise war eine Infusion einer Lösung von 600 μg Histamin (ausgedrückt als Base) in 0,48 ml je Stunde ausreichend). Eine bekannte Menge Testmaterial wurde in isotonischer Salzlösung aufgelöst, und nachdem der Hund Magensaft mit stetiger Geschwindigkeit sekretierte, wurde eine einzige intravenöse Injektion dieses Materials verabreicht Die Inhibierung der Magensaftsekretion wurde für die jeweils getestete Dosis notiert

Die spezifische Aktivität kann aus den für die verschiedenen Dosen erhaltenen Resultaten bestimmt werden.

Aminosäureanalysen wurden unter Verwendung eines Locarte-Aminosäure-Analysators ausgeführt.

Alle Kolonnenchromatografien wurden bei 4° C ausgeführt, und alle Pufferlösungen waren mit Toluol gesättigt

Beispiel !

216 μg eines Polypeptids mit 47 Aminosäureresten in den weiter unten angegebenen Verhältnissen, die eine einzige Polypeptidkette mit drei inneren Disulfidbindungen darstellte und die weiter unten angegebenen Eigenschaften zeigte, wurden in 116 μΙ 0,1 m Ammoniumbicarbonatlösung aufgelöst, worauf eine Lösung von 4 μg Carboxypeptidase-A (Carboxypeptidase-A-DFP) in 4 μΐ 0,1 m Ammoniumbicarbonatlösung zugegeben wurde. Das Gemisch wurde 3 Stunden bei 37⁰C inkubiert, und eine Probe wurde der Aminosäureanalyse unterworfen. Eine weitere Menge von 12 μg des Enzyms wurde zugegeben, und die Inkubation wurde weitere 3 Stunden fortgesetzt, worauf eine weitere Pr jbe der Aminosäureanalyse unterworfen wurde. Jede Analyse zeigte die Anwesenheit von freiem Leucin im Reaktionsgemisch. Die zweite Analyse zeigte eine Menge entsprechend einem Viertel des Leucingehalts im Ausgangspolypeptid, woraus sich ergibt, daß das Enzym vom C-Ende des Ausgangspolypeptids einen Leucinrest abgespalten hatte, wobei ein Polypeptid mit 46 Aminosäureresten zurückblieb, das sich, vom Ausgangspolypeptid im Aminosäureverhältnis nur dadurch unterschied, daß drei Leucinreste anstelle der vier Leucinreste im Ausgangspolypeptid vorhanden waren.

Eine Probe der Lösung des so erhaltenen Polypeptids ergab bei einer Einfachbestimmung eine biologische Aktivität entsprechend einer 42%igen Inhibierung, wenn eine Dosis entsprechend 0,6 μg/kg des Ausgangsmaterials verwendet wurde.

Das als Ausgangsmaterial verwendete Polypeptid wurde wie folgt erhalten:

Eine Lösung von 1,0 mg/MJrogastron in einem Gemisch aus 200 μΙ eines 0,1 m Ammoniumbicarbonatpuffers mit einem pH-Wen von 8,2 und 50 μΙ einer 0.01 m Magnesiumchloridlösung wurde mit 60 μg AM-Protease in 200 μΐ Wasser 16 Stunden bei 37"C inkubiert. Die erhaltene Lösung wurde auf eine Kolonne (35 χ 1 cm) eines porösen vernetzten Dcxtrangels (Sephadex G-25) aufgebracht, und die Kolonne wurde mit 0,05 m Ammoniumacetat mit einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/st entwickelt. Fraktionen von 1 ml wurden gesammelt, und peptidisches Material wurde in den Fraktionen 12 — 20 und 38 — 52 festgestellt.

Das Material in den Fraktionen 38 — 52 war biologisch inaktiv, und Proben wurden mit Säure, Base oder Leucinaminopeptidase hydrolysiert. Analyse der resultierendenLösungen zeigte, daß das ursprüngliche Peptid Aminosäuren in den folgenden Verhältnissen enthielt: GIu 1, Leu 1, Lys 1, Trp 2, Arg 1. Dansylierung ergab die Anwesenheit von Lysin am N-Ende.

Das Material aus den Fraktionen 12-20 war biologisch aktiv, und diese Fraktionen wurden vereinigt und lyophilisiert, wobei ein weißes, wasserlösliches, saures Polypeptid mit den folgenden Eigenschaften erhalten wurde:

1. biologische Aktivität bei einer Einzelbestimmung: 30% Inhibicrung bei einer Dosis entsprechend 0,7 μg/kg Ausgangsmaterial:

2. Aminosäureverhältnisse bei einer Analyse eines Hydrolysats:

Asp 7, Ser 3, GIu 4, Pro 1, GIy 4. AIa 2. VaI 3, Cys 6, Met 1. He 2, Leu 4,Tyr 5, His 2, Lys 1, Arg 2;

3. einziger Fleck mit einer Mobilität von 0,90 im Verhältnis zu Phenylalanin bei Papierchromatografie in n-Butanol zu Essigsäure zu Pyridin zu Wasser (30 : 6 : 24 : 20);

4. ein »Komet« mit einer Frontmobilität von 1,58 relativ zu6-DNP-Lysin bei Papierelektrophorese in Essigsäure/Ameisensäure mit pH-Wert 2,1 (20 ml Ameisensäure. 80 ml Essigsäure, mit Wasser auf 1 1 gebracht);
5. einziger Fleck mit einer Mobilität von 0,81 relativ zu Bromphenolblau bei Acrylamidgelelektrophorese in 0,1 rn Tris/Salzsäure-Puffer mit pH-Wert 8,9.

Dansylicrung des Produkts zeigte die Anwesenheit von Asparaginsäure am N-Ende.

Beispiel 2

1,5 mg eines Polypeptids mit 47 Aminosäureresten in den im zweiten Teil von Anspruch 1 angegebenen

M) Verhältnissen, welche eine einzige Polypeptidkette mit drei inneren Disulfidbindungen bildete und die in Beispiel 1 angegebenen Eigenschaften zeigte, wurden in 200 μΙ 0,1 in Ammoniumbicarbonat aufgelöst, worauf eine Lösung von 60 μg Carboxypeptidase-A (Carboxypeptidasc-A-DFP) in 60 μΙ 0,1 m Ammoniumbicarbonatlösung zugegeben wurde. Das Gemisch wurde 20 Stunden bei 37' C inkubiert, worauf eine weitere Menge von 60 μg Enzym zugegeben wurde und die Inkubierung weitere 20 Stunden fortgesetzt wurde. Die erhaltene Lösung b5 wurde auf eine Kolonne (100 χ 0,9 cm) eines porösen Polyacrylamidgels (Biogel Ρ6,75-40μιτι Durchmesser) das mit 0,05 m Ammoniumacetat ins Gleichgewicht gebracht worden war, aufgegeben. Die Kolonne wurde mit den gleichen Lösungsmitteln entwickelt, und es wurden Fraktionen von 1 ml gesammelt. Das biologisch aktive Material wurde in den Fraktionen von 27 — 34 entdeckt, die vereinigt und lyophilisiert wurden, wobei ein weißes,

wasserlösliches, saures Polypeptid mit den folgenden Eigenschaften erhallen wurde:

1. Aminosäureverhältnis bei Analyse eines Hydrolysais:

Asp 7, Ser 3, GIu 4, Pro 1,GIy 4, AIa 2, VaI 3,Cys6, Met I₁IIe 2, Leu J.Tyr 5. Mis 2, Ly s I.Arg 2:

2. einziger Fleck Ri 0,62 bei Papierchromatografie in n-Butanol /.u Essigsäure zu Pyridin zu Wasser ·-, (30 : 6 : 24 : 20);

3. ein »Komet« mit einer Frontmobilität von 1.67 relativ zu6 -DNP-Lysin bei Papicrclckiropliorese in Essigsäure/Ameisensäure mit einem pH-Wert von 2.1 (20 ml Ameisensäure. 80 ml Essigsäure mil Wasser auf 1 I gebracht);

4. einziger Fleck mit einer Mobilität von 0.77 relativ zu Bromphenolblaii bei Acrylamidgelelektrophorese in 0,1 m Tris/Salzsäure-Puffer mit einem pH-Wert von 8,9.

Beispiel 3

300 μ§ des in Beispiel 2 erhaltenen Polypeptids wurden in Wasser aufgelöst, worauf 25 mg Harnstoff, 0,5 mg ι j Äthylendiamin-tetra-essigsäure und 25 μΙ 1,5 m Tris/Salzsäure-Puffer mit pH 8,6 zugegeben wurden. Die Lösung wurde mit Wasser auf 60 μΐ verdünnt, mit Stickstoff, der keinen Sauerstoff enthielt, gespült und dann mit 1 μΙ Mercaptoäthanol versetzt. Die erhaltene Lösung wurde 3 Stunden im Dunkeln gehalten und dann in zwei gleiche Portionen geteilt.

Die erste Portion wurde auf eine Kolonne (100 χ 0,9 cm) eines porösen Polyacrylamidgcls (Biogel P6: >(i 75 — 40μιτι Durchmesser) aufgebracht, und die Kolonne wurde mit 0,05 m Ammoniumacetat entwickelt, wobei eine Lösung eines Polypeptids erhalten wurde, worin die Cystinreste in Cysteinreste reduziert waren.

Der zweite Teil wurde mit einer Lösung von 3,6 mg '"'C-Jodoacetamid in 10 μΙ Wasser 30 Minuten bei Raumtemperatur behandelt. Die erhaltene Lösung wurde auf eine Kolonne (35 χ 1 cm) eines porösen vernetzten Dextrangels (Sephadex G-25) aufgebracht, und die Kolonne wurde mit 0.05 m Ammoniumacetat entwickelt. Es wurde ein einziges radioaktives Produkt festgestellt, und dieses Produkt ergab bei einer Aminosäureanalyse eines Säurehydrolysats Carboxymethylcystein und nicht Cystin, wodurch demonstriert wurde, daß die Reaktion mit Mercaptoäthanol ein Polypeptid ergab, worin die Cystinreste in Cysteinreste reduziert worden waren.

B e i s ρ i e I 4

Das in Beispiel 1 oder 2 beschriebene Polypeptid oder ein Reduktionsprodukt davon, bei weichem die ursprünglichen Cystinreste in Cystein reduziert sind, wird in einer pyrogenfreien 5%igcn (G/V) Dextroselösung aufgelöst, so daß eine Endkonzentration von 40 ug/ml erhalten wird. Diese Lösung wird in Mengen von 2,5 ml in Phiolen eingebracht, und zwar jeweils durch ein sterilisierendes Membranfiltrationssystem, wie z. B. ein 0,22 ΐημ Millipore®-Filter. Der Inhalt einer jeden Phicle wird dann lyophilisieri, und die Phiolen werden unter sterilen Bedingungen verschlossen und zugeschmolzen. Die Phiolen, die ein steriles Gemisch aus Polypeptid und Dextrose enthalten, werden bei 4° C gelagert.

B e i s ρ i e I 5

In eine Phiole, die gemäß Seispie! 4 hergestellt worden ist, werden unmittelbar vor der Verwendung 2.5 ml steriles Wasser eingebracht, wobei eine sterile, injizierbare Lösung von 40 μg/ml iines Polypeptids in einer 5%igen (G/V) Dextroselösung erhalten wird.

45 Beispiel 6

10 mg des in Beispiel 1 oder 2 beschriebenen Polypeptids oder eines Reduktionsprodukts davon, bei welchem die ursprünglichen Cystinreste in Cystein reduziert sind, werden in 50 ml pyrogenfreiein Wasser aufgelöst, und die Lösung wird durch ein sterilisierendes Mernbranfiltrationssystem filtriert, wie z. B. durch ein 0,22 ιημ Millipore®-Filter, wobei das Filtrieren in Ampullen erfolgt, so daß jede Ampulle 0.5 ml aufnimmt. Der Inhalt einer jeden Ampulle wird dann lyophilisien. und die Ampullen werden unter sterilen Bedingungen verschlossen. Die .Ampullen, von denen jede 100 μg des sterilen Polypeptids enthält, werden bei —20"C gehalten.

B e i s ρ i e I 7

Der inhalt einer Ampulle, die wie in Beispiel 6 hergestellt worden ist. wird in steriler, pyrogenfreier, 5%iger (G/V) Dextroselösung aufgelöst, so daß eine Lösung erhalten wird, die 1 bis 5 μg/ml Polypeptid in 5°/oiger (G/V) Dextroselösung enthält Diese Lösung eignet sich für die Verabreichung durch Infusion.

Wenn eine für Injektion geeignete Lösung gewünscht wird, dann wird der Inhalt einer Ampulle mit steriler, pyrogenfreier 5°/oiger (G/V) Dextroselösung verdünnt, so daß eine Lösung erhalten wird, die 5—50 μg/ml des Polypeptids enthält

Alternativ kann die 5%ige (G/V) Dextroselösung durch isotonische Salzlösung ersetzt werden.

Claims (1)

1. Patentansprüche:

   l.(l-46)-Urogastron der Formel

   H-Asn-Ser-Asp-Ser-Glu-Cys-Pro-Leu-Ser-His-Asp-Gly

   i— Tyr-Met-Cys-Val-Gly-Asp-His-Leu-Cys-Tyr <

   Γ ι

   ¹—> Ue-Glu-Ala-Leu-Asp-Lys-Tyr-Ala-Cys —>