DE69016867T2

DE69016867T2 - Acylierter Epidermis-Wachstumsfaktor.

Info

Publication number: DE69016867T2
Application number: DE69016867T
Authority: DE
Inventors: Francois K Njieha; Shalaby W Shalaby
Original assignee: Ethicon Inc
Current assignee: Ethicon Inc
Priority date: 1989-07-24
Filing date: 1990-07-23
Publication date: 1995-06-14
Anticipated expiration: 2010-07-24
Also published as: EP0410671A1; JP2894632B2; DE69016867D1; US5070188A; EP0410671B1; JPH03115297A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft chemisch modifizierte Formen des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF), in denen der EGF durch Acylierung modifiziert ist. Die Erfindung betrifft auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die acetylierten EGF enthalten, die eine erhöhte biologische Stabilität und Resistenz gegenüber proteolytischem Abbau aufweisen.
Menschlicher EGF (auch als Urogastron bekannt) ist ein Polypeptid-Wachstumsfaktor mit 53 Aminosäuren, der für verschiedene Typen von Zellen, einschließlich epithelialen und mesenchymalen Zellen, mitogene Aktivität aufweist. Es sind auch Varianten des menschlichen EGF-Polypeptids berichtet worden, wie das Gamma-Urogastron mit 52 Aminosäuren. Es ist auch berichtet worden, daß EGF aufgrund seiner mitogenen Aktivität zum Erhöhen der Geschwindigkeit der Wundheilung brauchbar ist. Es ist auch berichtet worden, daß EGF zum Behandeln von Magengeschwüren, cerebraler Ischämie und Psoriasis verwendbar ist. Eine Übersicht über EGF geben Carpenter et al. in "Epidermal Growth Factor, Its Receptor and Related Proteins,", Experimental Cell Research, 164: 1-10 (1986).
Die topische oder orale therapeutische Verabreichung von Proteinen und Peptiden ist im allgemeinen aufgrund des raschen proteolytischen Abbaus und der geringen Absorption an den Applikationsstellen behindert. EGF wird derzeit topisch zum Behandeln von Wunden verwendet, einschließlich Verbrennungen, Spenderwundstellen und Geschwüren. EGF wird auch bei der Behandlung von Krankheitszuständen, wie Magengeschwüren und Ischämie und Wiederdurchblutungsschäden bzw. -schädigungen. Die Verabreichung von EGF an Patienten entweder parenteral mit implantierten Vorrichtungen, topisch oder oral war nicht so erfolgreich wie erwartet. Es wird angenommen, daß dies das Ergebnis eines Verlustes biologischer Aktivität oder enzymatischen Abbaus des EGF-Moleküls sein kann. Bis heute sind Bemühungen, die zur Entwicklung von Dosierungsformen für mucosale (z. B. nasale oder buccale) oder orale Verabreichung unternommen worden sind, insbesondere aufgrund von entweder geringer Absorption und/oder der erwarteten Inaktivierung durch proteolytische Enzyme nicht ermutigend. Auch für Indikationen, bei denen wäßrige Lösungen von EGF die bevorzugte Dosierungsform waren, war die tatsächliche Haltbarkeit solcher Formulierungen fraglich.
Eine begrenzte Anzahl von Berichten über die Wirksamkeit von EGF zum Behandeln von durch Pepsin ausgelöster Geschwürbildung und die Heilung von chronischen Magengeschwüren unterstützen die Schutz- und Heilwirkungen von EGF in diesen Applikationen. Das volle pharmakologische Potential von EGF konnte in diesen Anwendungen jedoch selbst dann nicht ausgeschöpft werden, wenn der Arzneistoff intravenös verabreicht wurde. Von einem beschränkten Erfolg wurde berichtet, wenn EGF in außergewöhnlich großen oralen Dosen verabreicht wird. Wie zuvor erwähnt wurde, könnte dies teilweise aufgrund der Ergebnisse des proteolytischen Abbaus und/oder einer geringen Absorption von EGF aus den jeweiligen Dosierungsformen und/oder schlecht zum Zielort duodenale Mucosa gelangende Dosierungsformen erklärt werden.
Es wird auch angenommen, daß in topischen Dosierungsformen EGF durch Wundproteinasen oder Proteinasen aus kontaminierender Wundenmikroflora einem proteolytischem Abbau leicht zugänglich ist. Für Applikationen zur Wundheilung weisen topische Dosierungsformen, die einen proteolytisch weniger empfindlichen EGF enthalten, eine verlängerte therapeutische Wirksamkeit auf.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt eine chemisch modifizierte Form von EGF bereit, die die Nachteile des unmodifizierten nativen EGF, der vor der vorliegenden Erfindung verwendet wurde, überwindet. Der modifizierte EGF der vorliegenden Erfindung ist an einer oder mehreren der primären Aminosäuren an den Resten Asparagin 1, Lysin 28 oder Lysin 48 acyliert. Vorzugsweise ist der EGF menschlicher EGF und wird in einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Behandeln von Wunden, Magengeschwüren, cerebraler Ischämie oder Psoriasis verwendet. Es wurde gefunden, daß EGF durch Acetylierung ohne einen nachweisbaren Verlust in seiner biologischen Aktivität, nämlich mitogenen Aktivitäten für epitheliale und mesenchymale Zellen und Inhibierung von Magensäuresekretion, modifiziert werden kann. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann EGF mit Acylgruppen acyliert werden, die die allgemeine Formel aufweisen:
R - -
- wobei R ein aliphatischer oder aromatischer Rest ist.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Als EGF wird nativer EGF und biologisch aktive Fragmente und Varianten davon bezeichnet. Als menschlicher EGF wird der EGF bezeichnet, der diejenige Polypeptidsequenz oder einen beliebigen wesentlichen Teil davon aufweist, die in Urdea. M.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 6461 - 6465 (1983) beschrieben sind. Als nativer menschlicher EGF wird daher der in Undea et al. dargestellt EGF bezeichnet, der die Sequenz mit 53 Aminosäuren aufweist. Als menschlicher EGF werden auch beliebige Varianten von menschlichem EGF bezeichnet, wie Gamma-Urogastron und biologisch aktive Fragmente, die das N-terminale Asparagin, Lysin 28 oder Lysin 48 enthalten. Der in der vorliegenden Erfindung verwendbare EGF kann aus natürlichen Quellen isoliert werden, unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken erzeugt oder durch chemische Synthese hergestellt werden. Aus jeder dieser Quellen erhaltener EGF kann dann gemäß den hier beschriebenen Verfahren acyliert werden und dann in Applikationen zur Wundheilung oder zur Heilung von Magengeschwüren verwendet werden.
Als "Acylierung" wird hier die Einführung von einer oder mehreren Acylgruppen in das EGF-Molekül bezeichnet. Die Acylgruppen sind kovalent an einer oder mehrere der primären Aminosäuren auf Resten am N-terminalen Ende (z. B. Asparagin 1), Lysin 28 oder Lysin 48 gebunden. Eine Acylgruppe ist jede organische Säuregruppe, in der die Hydroxylgruppe einer Carboxylgruppe durch einen anderen Substituenten ersetzt ist. Eine Acylgruppe weist daher die allgemeine Formel
R - -
- auf, wobei R ein aliphatischer oder aromatischer Rest ist. Übliche Beispiele für Acylgruppen umfassen CH&sub3;CO - (eine Acetylgruppe) und C&sub6;H&sub5;CO- (eine Benzoylgruppe). Beispiele aliphatischer (geradkettig und cyclisch) und aromatischer Reste, durch die R in den in der vorliegenden Erfindung verwendbaren Acylgruppen substituiert werden kann, sind CH&sub3;-; CnH2n+1 (wobei n = 2 bis 20); cyclisches CnH2n-1 (wobei n = 3 bis 6); substituiertes oder unsubstituiertes Phenyl, Pyridyl oder Naphthyl; R¹-CH2', wobei R¹ für CH&sub3;O - oder eine Alkylenoxidkette mit niedrigem bis hohem Molekulargewicht steht; halogeniertes Alkyl; oder ein Mono- oder Polysaccharid.
EGF kann auch mit bifunktionellen Acylierungsmitteln acyliert werden, die die allgemeine Formel HOOC - (CH&sub2;)n - COOH aufweisen, wobei n = 0 - 14. Der erhaltene acylierte EGF besteht danna us zwei verbrückten EGF-Molekülen und weist die Formel auf:
EGF - - (CH&sub2;)n - - EGF.
Die vorliegenden Verfahren können dazu verwendet werden, EGF an jedem beliebigen seiner reaktiven primären Amine selektiv zu acylieren, um ein breites Spektrum von monoacylierten, diacylierten oder triacylierten Versionen von EGF herzustellen. In jedem Fall ist die Acylgruppe kovalent an eines oder an mehrere der primären Amine auf den Aminosäureresten Asparagin 1 (oder welcher N-terminale Aminosäurerest vorliegt), Lysin 28 und Lysin 48 gebunden. Eine selektive Acylierung kann durch die Verwendung von schützenden Blockierungsgruppen erreicht werden, um diejenigen reaktiven primären Amine zu blockieren, die nicht acyliert werden sollen. Die Verwendung solcher Blockierungsgruppen ist im Stand der Technik allgemein bekannt, wie beispielsweise in J.F.W. McOmie, Protective Groups and Organic Chemistry, Plenum Press, New York, 1973, beschrieben ist.
Am N-Terminus monoacylierter EGF kann durch die folgende Formel dargestellt werden:
R - - EGF
in der die Acylgruppe kovalent an die primäre Aminogruppe der N-terminalen Aminosäure bindet. Monoacylierte und diacylierte Versionen von EGF, in denen die Acylgruppe an die primäre Epsilon-Aminogruppe von Lysin 28 und/oder Lysin 48 gebunden ist, kann durch die Formeln dargestellt werden:
Selbstverständlich können die Acylgruppen in jeder beliebigen Kombination an den zuvor erwähnten drei reaktiven primären Aminen vorliegen, wobei ein breites Spektrum von mono-, di- und triacylierten EGF-Molekülen gebildet wird. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der EGF mit derselben Acylgruppe triacyliert.
Der erfindungsgemäße acylierte EGF ist dem unmodifizierten, nativen EGF dadurch überlegen, daß der acylierte EGF unerwarteterweise seine biologische Aktivität unter physiologischen Bedingungen behält. Acylierter EGF ist gegenüber proteolytischem Abbau resistent. Daher ist er sowohl in parenteralen Formulierungen als auch in topischen Formulierungen verwendbar. Es wird angenommen, daß der acylierte EGF, wenn er in einer pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet wird, lipophiler ist und eine Form von EGF bereitstellt, die länger wirkt und kontrolliert freigesetzt wird. Die Acylierung kann durch jedes der in der Peptidchemie angewendeten Standardverfahren durchgeführt werden, einschließlich der Verwendung von aktivierten Estern, Säurehalogeniden, acylierten heterocylischen Stickstoffverbindungen oder Anhydriden. Beispiele von Acylierungsmitteln, die zur Herstellung des erfindungsgemäßen EGFs verwendbar sind, die zur Herstellung des erfindungsgemäßen EGFs verwendbar sind, umfassen Acet-, Succin-, Malein- oder Methylmaleinanhydride; Ester von N-Hydroxysuccinimid, N-Acylimidazole und N-Acylpyrrazole. Allgemeine Acylierungsverfahren sind in Methods In Enzymology, 25: 494 - 499 (1972) beschrieben, das hiermit durch Bezugnahme aufgenommen wird.
Die Acylierungsreaktionen, die zur Herstellung von acyliertem EGF verwendet werden, werden zweckmäßigerweise in wäßrigen gepufferten Medien durchgeführt (einschließlich solcher mit DMSO, die beschränkte Konzentrationen wäßriger Pufferlösung enthalten), und zwar bei einem pH-Bereich, der für den EGF, das Acylierungsmittel oder den acylierten EGF nicht schädlich ist, z. B. von pH 6,5 bis pH 9,5 und vorzugsweise bei etwa pH 7,5. Die Reaktion wird im allgemeinen durch Mischen des Acylierungsmittels mit EGF bei einer mäßigen Temperatur, die im Bereich von 20 bis 40 ºC liegt, ausgeführt. Die Konzentration des verwendeten Acylierungsmittels wird gemäß der Reaktivität des Mittels, seiner Löslichkeit und dem gewünschten Acylierungsgrad eingestellt. Die Zeit, die man die Reaktion ablaufen läßt, ist abhängig von dem verwendeten Acylierungsmittel und der Temperatur, bei der die Reaktion durchgeführt wird. Eine angemessene Zeit beträgt etwa 1 Stunde bis etwa 12 Stunden bei etwa 30 ºC, jedoch kann man die Reaktion für einen längeren Zeitraum fortsetzen.
Nachdem die Acylierungsreaktion beendet ist, wird das acylierte EGF-Derivat mittels Standardverfahren, wie Dialyse, Affinitätschromatographie und Ultrafiltration, gereinigt, und danach mittels Standardverfahren, wie Gefriertrocknen, aus wäßrigen Medien wiedergewonnen. Wenn notwendig, kann der acylierte EGF, besipielsweise durch Sterilisation, für eine intravenöse Verabreichung an Menschen adaptiert werden.
Die Acylierung von EGF führt zu einer modifizierten Form von EFG, die eine höhere Ladungsdichte aufweist als nativer EGF und die zur kontrollierten Abgabe durch Iontophorese verwendbar ist. Durch Blockieren der Amingruppen mit Acylgruppen wird die Nettoladung des EGF erhöht und sein isoelektrischer Punkt wird erniedrigt. Dies wiederum erhöht die Mobilität des acylierten EGFs in Transportprozessen, die durch elektrische Ladung ablaufen, wie Iontophorese.
Es ist davon auszugehen, daß die anderen Wachstumsfaktoren, wie Fibroblasten-Wachstumsfaktoren, sogenannte platelet- derived growth factors und Insulin oder sog. insulin-like growth factors, gemäß den Lehren der vorliegenden Erfindung modifiziert werden können. Es wird ebenfalls davon ausgegangen, daß die Stabilisierung von EGF, Wachstumsfaktoren und anderen Proteinen in ähnlicher Weise durch Phosphorylierung und Veresterung von reaktiven Aminosäureresten erreicht werden kann. Da Argininreste eine Stelle für die proteolytische Spaltng, wie durch Trypsin-Spaltung, darstellen, kann das Blockieren der Arginin-Guanidin-Gruppe via Cycloalkylierung (unter Verwendung eines Vinylketons) solchen Molekülen Stabilität verleihen.
Die acylierten EGF-Derivate der vorliegenden Erfindung werden vorzugsweise an Menschen als pharmazeutische Zusammensetzungen verabreicht. Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung auch eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die ein acyliertes EGF-Derivat in einer pharmazeutisch wirksamen Menge in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger bereitstellt. Derartige Zusammensetzungen werden nach Routineverfahren formuliert, die zum Zubereiten von pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Verabreichung an Menschen verwendet werden. Typischerweise sind Zusammensetzungen zur intravenösen Verabreichung Lösungen von sterilem acyliertem EGF und sterilem isotonem wäßrigen Puffer. Wenn notwendig, kann die Zusammensetzung auch ein solubilisierendes Mittel enthalten, um das Derivat in Lösung zu halten.
Als eine "pharmazeutisch wirksame Menge" von acyliertem EGF wird diejenige Menge bezeichnet, die bei verschiedenen Verabreichungsweisen einen therapeutischen Effekt vewirkt. Bei der Verwendung für Wundheilungsprozesse ist dies beispielsweise diejenige Menge, die notwendig ist, um die Heilungsgeschwindigkeit der Wunde zu beschleunigen. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können so hergestellt werden, daß sie Mengen von acyliertem EGF innerhalb des Bereichs von etwa 0,01 bis etwa 1000 Mikrogramm pro Milliliter einen wäßrigen oder nicht-wäßrigen Formulierung enthalten. Vorzugsweise liegt die Konzentration im Bereich 1 - 500 Mikrogramm pro Milliliter und noch bevorzugter im Bereich 1 - 100 Mikrogramm pro Milliliter.
Da EGF als hilfreich bei der Wundheilung und der Behandlung von Magengeschwüren beschrieben wurde, können die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, die acylierten EGF enthalten, zur Behandlung von Wunden und Magengeschwüren verwendet werden, um deren Heilungsgeschwindigkeit zu erhöhen. Die Arten von Wunden, die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen geheilt werden können, sind solche, die von Verletzungen durch Unfälle oder von medizinischen Verletzungen herrühren, die einen epithelialen Schaden verursachen, wie Augenwunden, wie solche, die von Hornhautabschabungen, Corneageschwüren, radialer Keratotomie, Hornhauttransplantationen, Epikeratophakia und anderen chirurgisch verursachten Wunden in den Augen herrühren; und Hautwunden, wie Verbrennungswunden, Spenderwundstellen von Hauttransplantaten und Geschwüren (kutan, Dekubitus, venöse Stauung und diabetisch). Zusätzlich können dermatologische Leiden, bei denen die Haut geschädigt worden ist, wie Psoriasis, Sonnenbrand und Hautausschläge, mit den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen behandelt werden. Die Applikation der Zusammensetzungen an die Wundstelle kann entweder topisch oder innerlich erfolgen, je nach Art der Wunde. Zusätzlich zu den zuvor genannten Applikationen der Wundheilung können die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen in der Krebstherapie, zum Schutz des Gastrointestinaltrakts während einer Magengeschwür-Behandlung und zur Behandlung von Magengeschwüren hilfreich sein.
Verfahren zum Erhöhen der Geschwindigkeit der Wundheilung umfassen, daß die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung direkt auf die Wunde aufgetragen oder mit dieser in Kontakt gebracht werden, indem die Zusammensetzung an einer Wundstelle topisch verabreicht wird. Man läßt die Zusammensetzung mit der Wunde für eine Zeitspanne in Kontakt, die ausreicht, die Geschwindigkeit des Zellwachstums an der Wundstelle zu erhöhen. Derartige Verfahren umfassen, daß man eine bliebige erfindungsgemäße Zusammensetzung in eine Creme, ein Gel, Aerosolspray, Mikrokapseln, Filme oder lyophilisierte Schäume oder wäßrige Formulierungen, oder daß man einen Gazeverband mit einer wäßrigen Lösung der Zusammensetzung durchtränkt und daß solche Formulierungen oder Verbande dann auf die Wundstelle aufgebracht werden.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen sind verwendbar in Formulierungen für Augentropfen, Augengele, Augencremes, Liposome- oder Micellenformulierungen, wäßrige Vehikel zum Durchtränken von Gazeverbänden, Brandbindenverbände, künstliche Haut, Nähte bzw. Nahtmaterialien und Ösen- oder Klammerbeschichtungen, Salben oder Cremes (wäßrig oder nicht-wäßrig), Gelformulierungen, Schäume und dergleichen. Weitere Materialien, wie Puffer, Konservierungsmittel, Tonus einstellende Mittel, Antioxidantien, Polymere zum Einstellen der Viskosität oder zur Verwendung als Streckmittel, und Exzipientien, können in den Zusammensetzungen verwendet werden. Spezielle Beispiele zur Veranschaulichung von solchen anderen Materialien umfassen Acetat- oder Boratpuffer; Thimerosol, Sorbinsäure, Methyl- oder Propylparaben- und Chlorbutanolkonservierungsmittel; Natriumchlorid und/oder Zucker zum Einstellen des Tonus; und Exzipientien, wie Mannitol, Lactose oder Sucrose.
Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung veranschaulichen. Die Erfindung soll durch diese Beispiele nicht beschränkt sein, sondern lediglich durch die beigefügten Ansprüche.

BEISPIEL 1

Herstellung von acyliertem EGF

Es wurden verschiedene acylierte EGF-Moleküle nach dem folgenden Verfahren hergestellt, wobei Acylgruppen von Acetyl (C&sub2;) bis Stearoyl (C&sub1;&sub8;) verwendet wurden. Rekombinant hergestellter menschlicher EGF (erhältlich von Chiron Corporation, Emeryville, Kalifornien) wurde mit Mannitol als einem Strekkungsmittel lyophilisiert. Der lyophilisierte EGF wurde dann zur Herstellung von acyliertem EGF verwendet. Der lyophilisierte EGF wird in einem gepufferten wäßrigen oder nicht- wäßrigen Medium bei Konzentrationen von 0,5 bis 2 mg/ml aufgelöst. Vorzugsweise ist das Medium ausgewählt nach der Löslichkeit der zuvor genannten modifizierenden Reagenzien und ist mit polyionischen Reagenzien gepuffert, die gemäß ihrer Löslichkeit in den Medien ausgewählt sind. Für langkettige Acylgruppen ist das bevorzugte Medium DMSO, das mit Triethanolamin oder Ammoniumacetat auf einen End-pH von 7,5 bis 8,5 gepuffert ist. Ammoniumacetat wird ebenfalls allgemein für wäßrige Puffersysteme von Reaktionen verwendet, obwohl Tris-Base HEPES, TES und Phosphatpuffer ebenfalls verwendet werden können.
Üblicherweise werden 5 mg EGF in 600 mg Mannitol in 10 ml DMSO aufgelöst, das 100 Mikroliter Ethanolamin enthält. Unter Rühren werden insgesamt 300 Mikroliter Acetanhydrid langsam in drei verschiedenen Aliquoten während eines Zeitraums von zwei bis drei Stunden bei 30 ºC zugegeben. Der pH der Lösung wird kontinuierlich auf 7,5 mit überschüssigem Triethanolamin eingestellt. Nach einer 1,5-stündigen Inkubation unter denselben Bedingungen werden Aliquote entfernt und auf den primären Amingehalt getestet. Zu diesem Zweck werden Aliquote auf 5 bis 15 Mikrogramm/ml verdünnt und mit Metoxydiphenylfuranon (Poly Science) in Natriumboratpuffer umgesetzt. Der Fluoreszenzgehalt der behandelten Probe wird mit derjenigen der Kontrollprobe verglichen, die ohne die Acylierungsreagenzien inkubiert wurde. Die Modifizierung wird dann als vollständig angesehen, wenn weniger als 10 %, vorzugsweise 5 %, der ursprünglichen Fluoreszenzintensität in einem typischen Reaktionsgemisch beobachtet wird. Ansonsten wird die Inkubationszeit verlängert und/oder überschüssiges modifizierendes Reagenz zugesetzt. Alternativ wird das Ausmaß der Reaktion durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) der verdünnten Aliquote auf einer Kationenaustauschersäule bestimmt. die Retentionszeiten der modifizierten Spezies werden mit denjenigen von unmodifiziertem EGF verglichen. Unter diesen Bedingungen wird der Modifizierungsgrad aus dem Chromatrogramm der Proben berechnet. Die Reaktion wird wie zuvor validiert.
Das Volumen des Reaktionsgemisches wird mit kaltem destilliertem, entionisiertem, pyrogenfreiem Wasser auf 30 ml eingestellt. Das verdünnte Gemisch wird auf einen geeigneten Dialysierschlauch (Sprectrum) überführt und dreimal gegen zwei Liter mit jeweils 0,5 M NH&sub4;HCO&sub3;-Puffer, pH 7,5, und einmal gegen 50 mM NH&sub4;HCO&sub3;-Puffer für 8 - 12 Stunden pro Wechsel dialysiert. Die Dialyse wird bei 4 - 20 ºC durchgeführt, vorzugsweise bei 4 ºC. Die Dialyseproben werden durch Lyophilisieren und Rekonstituieren in einer geringen Menge von 0,5 M NH&sub4;HCO&sub3;-Puffer bei einer Konzentration von 0,1 bis 0,5 mg/ml konzentriert. Die letzte Chromatographie wird auf einer Ex-Cellulose (Pierce)-Entsalzungssäule durchgeführt. Das Gemisch wird vorzugsweise auf einer präparativen Kationenaustauschersäule fraktioniert. Die Eluierungsmittel werden auf einem Frac-200 (Pharmacia)-Fraktionssammler gesammelt. Peakfraktionen, die Moleküle mit verschiedenen Modifizierungsgraden darstellen, werden gepoolt und durch Dialyse entsalzt. Nach Sterilisation durch Filtration werden Aliquote dispensiert oder lyophilisiert in Gegenwart von Mannitol.
Die Proteinkonzentration wird durch UV-Spektrophotometrie bei 278 nm bestimmt, wobei der Extinktionskoeffizient von 23,6 für eine 1 %-ige Lösung oder eine Standardkurve, wobei der unmodifizierte EGF als der Standard verwendet wird, verwendet wird. Auf ähnliche Weise werden EGF und die modifizierten Derivate durch Fluoreszenzspektrophotometrie mit einer Anregung/Emission bei 225/350 oder bei 280/350 nm bestimmt.
Die Proben werden darüber hinaus analysiert, indem die biologische Aktivität im Rezeptorbindungstest-(RBA)-System und/oder in einem Mitogentestsystem nach dem Standardverfahren gestestet wird. Unter diesen Bedingungen wurde der Grad der Aktivität von modifiziertem EGF mit demjenigen von unmodifiziertem EGF auf der Basis Gewicht pro Gewicht verglichen. Ein ähnlicher Test wird verwendet, um die Stabilität von EGF-Produkten zu verfolgen. Der RBA ist in Savage et al., Analytical Biochem, 111, Seiten 195 ff (1981) und im US- Patent Nr.4,717,717 beschrieben. Für RBA-Studien wird eine Zellinie mit einer hohen Rezeptorendichte für EGF in Mikrotiterplatten zur Konfluenz wachsen gelassen. Nach dem Entfernen der Wachstumsmedien und leichtem Fixieren der Zellen wird das Binden von modifiziertem EGF an die Zelloberfläche in Gegenwart von konkurrierendem jodiertem EGF verglichen mit dem Binden von nicht radioaktivem unmodifiziertem EGF unter denselben Bedingungen. Die Konzentration von modifiziertem EGF wird aus der Standardkurve, die für unmodifizierten EGF erstellt wurde, extrapoliert. Acylierter EGF mit Acylseitenketten, die von C&sub2; bis C&sub8; variieren, behielt gemäß dem RBA biologische Aktivität.
Für Mitogentestsysteme läßt man eine EGF-sensitive Zellinie auf dem Boden von Mikrotiterplatten zur Konfluenz wachsen. Nach Ersetzten der regulären Wachstumsmedien mit Wachstumsfaktor-armen Medien wird modifizierter EGF mit Tritium-markiertem Thymidin zugegeben. Der Umfang des Einbaus von Tritium-markiertem Thymidin in Gegenwart und Abwesenheit von Wachstumsfaktoren wird dann gewogen. Die Wirkungen von modifiziertem EGF werden mit denjenigen von unmodifiziertem EGF unter demselben System verglichen. In dem Mitogentest war acylierter EGF mit einer C&sub1;&sub2;-Acylseitenkette nahezu so reaktiv wie mit einer C&sub2;-Kette.

BEISPIEL II

In vitro-Empfindlichkeit von acyliertem EGF gegenüber proteolytischem Abbau

Dieses Beispiel betrifft die Stabilität von acyliertem EGF (C&sub2;-EGF) gegenüber Trupsin. Der C&sub2;-EGF wurde mit Acetylgruppen triacyliert. Die Ergebnisse zeigen, daß über 75 % des C&sub2;-EGF gegenüber proteolytischer Spaltung an zwei der empfindlichen Bindungen beständig war, nämlich Arg 41 und Arg 45, und zwar für über 4 Stunden Inkubation bei 30 ºC. Unter ähnlichen Bedingungen erfuhr nativer EGF über 65 % Spaltung innerhalb eines Zeitraums von 5 Minuten nach der Inkubation. Die verbleibenden 35 % des nativen Moleküls wurden innerhalb eines Zeitraums von 2 Stunden nach Inkubation gespalten. Die Beständigkeit von C&sub2;-EGF kann mit der Acylierung der Lysinreste in Verbindung gebracht werden, und insbesondere mit Lysin 48, da Trypsin Peptidbindungen am Carbonylende von Arginin- oder Lysinresten spaltet. In nativem EGF wurde Arginin 48 durch Trupsin schneller abgespalten. Die Trypsinspaltung von nativem EGF, acyliertem EGF (C&sub2;-EGF) und des Gemischs von C&sub2;-EGF und nativem EGF wurden mittels HPLC (Waters-845) auf einer Polysulfoethylaspartamid (Nest Group)-Kationenaustauschersäule analysiert. Die Ergebnisse zeigen, daß Trypsin-Fragmente von nativem EGF ohne weiteres von den nativen Molekülen abgespalten werden können. Unter ähnlichen Bedingungen bildete Trypsin von dem C&sub2;-EGF kein Fragment, das allgemein rascher eluiert wurde als das native EGF oder zwei der Hauptfragmente von dem N-terminalen Ende von nativem EGF. Das Gemisch von C&sub2;-EGF und nativem EGF bei einem Verhältnis von 1,5 zu 1 wurde mit TPCK-Trypsin (Worthington Biochem Corp.) inkubiert. In zeitlichen Intervallen wurden Aliquote entfernt und analysiert. Die Ergebnisse zeigten eine rasche Abnahme der Peaks von nativem EGF mit einer Zunahme der Peaks für native EGF-Fragmente. Innerhalb von etwa 20 Minuten waren über 85 % des nativen EGFs verdaut. Im Gegensatz dazu verlor C&sub2;-EGF lediglich etwa 20 % seiner ursprünglichen Menge innerhalb 2,5 Minuten nach Inkubation. Die verbleibenden 75 - 80 % widerstanden einer Proteolyse bis zu 4 Stunden Inkubation.
Diese Ergebnisse zeigen, daß eine einfache Acylierung der primären Amingruppen in EGF die Moleküle gegen Abbau durch Trypsin, ein Beispiel für eine Endopeptidase des oberen Gasgrointestinaltrakts, schützen. Basierend auf diesen Ergebnissen wird angenommen, daß die Acylierung dem EGF Stabilität verleiht und daher seine verlängerte Aktivität die Verwendung bei der Behandlung nicht nur von Verdauungsgeschwüren, sondern auch in topischen Anwendungen zur Wundheilung erlaubt.

BEISPIEL III

Lagerstabilität von acyliertem EGF

Die Lagerstabilität von EGF und acylierten EGF-Derivaten mit unterschiedlichen Modifikationsgraden und Acylseitenketten wurde untersucht, wobei das Rezeptorbindungstest-(RBA)-System verwendet wurde. Die Ergebnisse zeigten, daß acylierter EGF über 30 % mehr Aktivität behielt, wenn er bei 37 ºC gelagert wurde, als die unmodifizierten nativen EGF-Kontrollen. In Tabelle I unten sind die Ergebnisse angegeben. TABELLE I Gelagerte Zeit/Temperatur Materialien Monate EGF-Kontrolle
Der Kontroll-EGF behielt während der 2-monatigen Lagerungsperiode 81 % der ursprünglichen Aktivität, wenn er bei 4 º C gelagert wurde, und lediglich 58 % bei 37 ºC. Acylierter EGF (C&sub2;-EGF) behielt während derselben Periode 81 % seiner Aktivität bei 4 ºC und 88 % bei 37 ºC. Dies ergibt eine Verbesserung von 30 % gegenüber der Kontrolle auf der Basis der Daten bei 37 ºC. Die höhere Stabilität von acyliertem EGF verglichen mit der Kontrolle korreliert mit dem hohen Grad der Modifikation und Beständigkeit gegenüber proteolytischem Abbau, wie bereits berichtet wurde.
Die Erfindung wurde hier unter Bezugnahme auf bestimmte bevorzugte Ausfürhungsformen und Beispiele beschrieben. Da offensichtliche Variationen dem Fachmann ersichtlich sind, wird die Erfindung nicht als darauf, sondern lediglich auf die folgenden Ansprüche beschränkt, betrachtet.

Claims

1. Acylierter epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), der an einem oder mehreren der primären Amine oder Aminosäurereste Asparagin 1, Lysin 28 oder Lysin 48 mit Acylgruppen acyliert ist, die die Formel aufweisen:

R- -

- wobei R ein aliphatischer oder aromatischer Rest ist.

2. EGF nach Anspruch 1, wobei der EGF menschlicher EGF ist.

3. EGF nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei der aliphatische Rest eine C&sub1; - C&sub2;&sub0;-Alkylgruppe ist.

4. EGF nach Anspruch 3, wobei der aliphatische Rest eine C&sub1; - C&sub6;-Alkylgruppe ist.

5. EGF nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei der aliphatische Rest sich von einem Carboxyl-tragenden Mono- oder Polysaccharid ableitet.

6. EGF nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei der aliphatische Rest ein Oxyalkylenrest ist.

7. Pharmazeutische Zusammensetzung, die den EGF nach einem der vorhergehenden Ansprüche umfaßt.