DD299310A5

DD299310A5 - Tgf-beta-protein-mischungen zur hemmung der zellproliferation

Info

Publication number: DD299310A5
Application number: DD90343920A
Authority: DD
Inventors: Dennis M Brown; Edward Luck; Daniel R Twardzik; Antony F Purchio
Original assignee: ��@��@��Kk��; ��@��@��k��
Priority date: 1989-09-11
Filing date: 1990-09-10
Publication date: 1992-04-09
Also published as: AU646820B2; IL95500A0; WO1991003491A1; AU6507490A; JPH05500225A; GR900100681A; KR920703638A; EP0485530A4; PT95285A; IE903275A1; FI921036A0; NZ235167A; CA2066228A1; IL95500A; PT95285B; US5597578A; EP0485530A1

Abstract

Es werden antiproliferative Mischungen geschaffen, die in der Lage sind, ein antiproliferatives Mittel, insbesondere einen TGF-b an einer Stelle in der Naehe einer Zielzelle langsam ueber eine laengere Zeit freisetzen zu koennen. Die Mischungen sind zur Hemmung der Zielzelle besonders dann wirksam, wenn sie in Verbindung mit einem vasokonstriktiven Mittel eingesetzt werden.{TGF-b-Polypeptid; Teilsequenz; Zellproliferation; wachstumshemmende Wirkung; proteinhaltige Matrix; Kollagenmatrix; pharmazeutisches Mittel; Medizin; Tumorbekaempfung}

Description

Hierzu 2 Seiten Zeichnungen »

Anwendungsgebiet der Erfindung

Das Anwendungsgebiet der vorliegenden Erfindung betrifft Methoden zur Hemmung der Zeilproliferation mit Hilfe eines Polypeptide mit einer wachstumshemmenden Wirkung in einem physiologisch verträglichen Trägermittel, das eine proteinhaltige Matrix, insbesondere eins Kollagenmatrix besitzt.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Das Ziel eines Arzneimittelträgersystems besteht darin, eine therapeutische Menge eines Arzneimittels an einer Stelle im Körper bereitzustellen, die das vorgesehene Ziel für die Arzneimitteltherapie ist, und eine gewünschte Arzneimittelkonzantration für den Zeitraum aufrechtzuerhalten, der erforderlich ist, um ein gewünschtes Ergebnis zu erzielen. Die beiden wichtigsten Aspekte dieses Zieles sind der gezielte Einsatz des Arzneimittels bei einem spezifischen Organ oder Gewebe (räumliche Plazierung) und die Steuerung der Geschwindigkeit der Arzneimittelabgabe (und infolgedessen der Konzentration am Zielobjekt) an das Zielobjekt (temporale Abgabe).

Die Familie der Peptide, die als ,Transforming Growth-Factor" (Umwandlungswachstumsfaktor) vom Typ β (TGF-ß), wozu auch TGF-ß 1 und TGF-ß2 gehören, bekannt sind, regulieren das Zellwachstum und die Zelldifferenzierung. Diese wachstumsregulierenden Polypeptide können die Zellproliferation sowohl stimulieren als auch hemmen, wobei das in hohem Maße vom Zelltyp abhängig ist.

TGF-ß 1 und TGF-ß 2 weisen einen allgemeinen antiproliferativen Einfluß zum Beispiel auf das Epithelzellwachstum sowie einen hohen Grad an Rezeptorkreuzreaktivität auf. Es kann somit ein bestimmter Grad an räumlicher Plazierung bei der Steuerung des Zellwachstums, insbesondere des Tumorzellwachstums erreicht werden, während gleichzeitig die Auswirkungen auf normale Zellen durch die Verwendung solcher Wachstumsfaktoren, wie z. B. Antiproliferationsmittel, auf ein Minimum verringert werden. Die Halbwertzeit dee Wachstumsfaktors TGF-ß beträgt dann, wenn er mit herkömmlichen Mitteln verabreicht wird, aufgrund z. B. der zersetzenden Enzymaktivität oder Beseitigung durch Bindung an serumbindende Proteine 2 bis 5min. Die temporale Abgabe dieser Polypeptide ist somit schwer zu steuern.

Es sind eine Reihe von Systemen für die räumliche Plazierung eines Arzneimittels vorgeschlagen worden. Dazu gehören die Verwendung von gezielt eingesetzten Trägersystemen, wie z. B. Nanopartikel, Liposome und neuversiegelte Erythrozyten sowie die Verwendung von Mischungen mit einem Bestandteil für den gezielten Einsatz, wie z. B. einem Antikörper für ein spezifisches Zeilantigen, und mit einem therapeutischen Bestandteil, wie z. B. einem zytotoxischen Mittel. Eine gewisse räumliche Plazierung kann auch in speziellen Situationen erreicht werden, wie z. B. durch den Einsatz von intraokularen sowie intravaginalen und intrauterinon Hilfsmitteln. Eine räumliche Plazierung kann auch durch die Verwendung von Arzneimitteln oder natürlich vorkommenden Verbindungen, die eine größere Affinität für eine Art von Zelle gegenüber einer anderen aufweisen, z. B. Sterold- oder Peptidhormone und deren Verwandte, die mit spezifischen Rezeptoren in/an der Zielzelle in Wechselwirkung treten. Die temporale Abgabe eines Arzneimittels wird durch die herkömmlichen Arzneiformen (wie z. B. Lösungen, Suspensionen, Kapseln, Tabletten, Emulsionen, Aerosole, Überzüge, Salben und Zäpfchen) nicht gut gesteuert. Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt in der Abgabe eines Arzneimittels im vorgesehenen Zielbereich ist im allgemeinen die Absorption des Arzneimittels durch eine biologische Membran, wie z. B. die intestinal Epithel- oder Endothelzellonauskleidung der Gefäße. Eine Möglichkeit zur Verlängerung der biologischen Verfügbarkeit einer verabreichten Mischung besteht darin, sie in einer Form bereitzustellen, in der sie ohne Schwierigkeiten eine Zellmembran durchdringen kann. Eine alternative Möglichkeit besteht darin, eine nichtsofortige Freisetzung aus der Arzneiform vorzusehen, so daß die Freisetzung des Arzneimittels zum geschwindigkeitsbestimmenden Schritt in der Abgabe des Arzneimittels in einem bestimmten Zielbereich wird. Trägersysteme mit nichtsofortiger Freisetzung der Arzneimittel können verschiedene Formen haben. Dazu gehören u.a. Trägersysteme mit langsamer Arzneimittelfreisetzung, bei denen das Arzneimittelträgersystem die Wirkstoffe des Arzneimittels langsam über einen längeren Zeitraum freisetzt.

Die Verwendung eines Systems mit langsamer Arzneimittelfreisetzung kann die biologische Verfügbarkeit von Verbindungen, wie z. B. Polypeptiden, die für eine enzymatische Inaktivierung anfällig sind, verbessern. Das System mit langsamer Arzneimittelfreisetzung kann lokal eingesetzt werden, wodurch eine weitere gezielte Hemmung der Zellproliferation erreicht werden kann, da die Konzentration des Arzneimittels an der Zielstelle hoch, im Körper jedoch niedrig sein wird. Das ist besonders vorteilhaft für Arzneimittel, die einen niedrigen therapeutischen Index aufweisen, da potentielle Nebenwirkungen durch die Verwendung von Systemen mit langsamer Arzneimittelfreisetzung verringert werden. Es können geringere Gesamtmengen des Arzneimittels verwendet werden, d. h. vorzugsweise weniger als LD₆₀ des Arzneimittels. Es ist deshalb von Interesse, Methoden und Mischungen für die gezielte Hemmung der Zellproliferation durch den Einsatz eines Arzneimittelträgersystems zu entwickeln, die sowohl eine räumliche Plazierung als auch eine temporale Abgabe von Wachstumsfaktoren mit antiproliferativer Wirkung ermöglichen. Derartige Trägersysteme können eine wirksamere Behandlung liefern und dennoch eine antiproliferative Wirkung bei niedrigeren Gesamtkonzentrationen von Arzneimitteln erzielen.

Fachliteratur auf diesem Gebiet

Die US-PS 4322398,4347234,4349530,4391797 und 4619913 beschreiben Implantate und die gesteuerte Freisetzung von Arzneimitteln. Die Implantation von Arzneimitteln in Läsionen wird beschrieben in Maiigh, Science (1981) 212:1128-1129; Macek et al., Abstracts of Immunology, 4109, S. 1053; Miyata et al., Cancer Research (1983) 43:4670-4675; McLaughlin et al., Cancer Research (1978) 38:1311-1316 und Bier et al.. Cancer (1979) 44:1194-1200.

Die Reindarsteflung und die anfängliche Charakterisierung des menschlichen Wachstumsfaktors TGF-ß 2 aus einem Adenokarzinomzellenstamm werden von Ikeda et al.. Biochemistry (1987) 26:2406-2410, und aus Schweineblutplättchen von Cheifetz et al., Cell (1987) 48:409-415, beschrieben. Das Auftreten von ausgereiftem und Vorläufer-TGF-ß 1 in Eierstockzellen von chinesischen Hamstern wird von Gentry et al., Molec. and Cell BIoI. (1987) 7:3418-3427, beschrieben. Über die Reindarstellung von TGF-ß berichten Gentry et al., Molec. and Cell Biol. (1988) 8:4162-4168.

Ein Überblick über die Familie der Verbindungen unter der Bezeichnung TGF-ß wird von Sporn et al., Science (1986) 233: 532-534, gegeben. Die Struktur- und funktionalen Beziehungen zwischen CIF-B (Abk. für „Cartilage-Inducing Factor B" verknorpelungenai slösender Faktor B) und TGF-ß werden von Seydin et al., J. Biol. Chem. (1987) 262:1946-1949, beschrieben. Siehe auch Seydin et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1985) 82:2267-2271; Twardzik und Sherwin, J. Cell. Blechern. (1985) 28: 289-297.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, Methoden und Mischungen zur Hemmung des Wachstums von Zellen, wie z. B. von Tumorzellen, zu schaffen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Es werden neuartige Mischungen und Methoden für ihren Einsatz zur Hemmung des Zellwachstums vorgeschlagen. Es werden bei diesen Methoden Polypeptidemischungen verwendet, die wenigstens einen TGF-ß oder einen Teil davon enthalten, der dadurch gekennzeichnet ist, daß er eine antiproliferative Wirkung auf Zellen hat, wobei das Polypeptid in einer proteinhaltigen

Matrix verteilt ist. Bei einem Einsatz In vivo werden die Mischungen in der Nähe der Zielzellen implantiert. Da β Polypeptid wird kontinuierlich aus der Matrix freigesetzt, wodurch eine hohe Polypeptidkonzentration in der Nähe der Zielzellen entsteht. Die Mischung wird vorzugsweise zusammen mit einem vasokonstriktiven Mittel eingesetzt. Die Methode und die zur Behandlung eingesetzten Mischungen sind zur Hemmung der Proliferation von Zellen, insbesondere von Tumorzellen wirksam. Es sind im allgemeinen wesentlich geringere Polypeptidgesamtmengen zur Hemmung der Zeilproliferation als bei herkömmlichen Trägersystemen erforderlich.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen In den Zeichnungen zeigen

Fig. 1: eine grafische Darstellung der Freisetzung von radioaktivmarkiertem TGF-ß aus CM-TGF-ß (CM- oder

Kollagenmatrixkonzentration: 40,30,20 oder 20mg/ml, gegenüber der Zeit und Fig. 2: eine grafische Darstellung des Austritts von TGF-ß aus CM-TGF-ß (CM-Konzentration: 40mg/ml) in Prozent, gemessen an der Zeilwachstumshemmung, gegenüber der Zeit.

Die Methode beruht auf der lokalen Applikation einer Behandlungsmischung, in der die aktjve Komponente wenigstens einen TGF-ß oder einen Teil davon enthält, wobei der TGF-ß in einer protelnhaltigen Matrix, im besonderen in einer Kollagenmatrix verteilt ist. Die Matrix begrenzt die Diffusion des TGF-ß, der in der Nähe der Zielzellen implantiert werden kann, wodurch die Zersetzung, insbesondere die enzymatische Zersetzung, din durch Einwirkungen auf den Körper entstehen kann, verringert wird. Der TGF-ß wird kontinuierlich aus der Matrix freigesetzt, wodurch eine höhere Konzentration des TGF-ß in der unmittelbaren Nähe der Tumorzellen als in anderen Bereichen entsteht. Um zu verhindern, daß das Arzneimittel von der Freisetzungsstelle abgeleitet wird, können die Mischungen in Verbindung mit einem vasokonstriktiven Mittel, wie ζ. Β Epinephrin, verabreicht werden.

Die Sequenz der betreffenden Mischungen wird gewöhnlich mit einer Sequenz eines Sequontes des TGF-ß-Moleküls vergleichbar sein, wobei dazu auch die Vorläuferpolypeptlde von TGF-ß gehören. Die Mischungen werden eine Sequenz enthalten, die im wesentlichen dem Teil des Moleküls entspricht, der für die beobachtete biologische Wirkung von TGF-ß zur Hemmung der Proliferation von Epidermeszellen, insbesondere von Keratinozyten, verantwortlich ist. Die Mischungen gemäß der vorliegenden Erfindung werden als aktive Komponente wenigstens etwa 8 Aminosäuren, gewöhnlich jedoch wenigstens etwa 25 Aminosäuren, häufiger aber wenigstens etwa 35 Aminosäuren bis zur vollen Länge eines TGF-ß oderTGF-ß-Vorläuferpolypeptids enthalten. Die Mischung enthält vorzugsweise TGF-ß-Homodimere. Mit Homodimeres ist ein Polypeptid gemeint, das zwei identische Amlnosäurenkotten mit jeweils wenigstens 8 Aminosäuren besitzt. Eine bevorzugte Methode zur Verbindung dieser beiden Ketten ist die Schaffung einer Disulfidbindung zwischen den Ketten, wobei jede Kette wenigstens ein Cystin enthält, obwohl andere Verkettungen möglich sind.

TGF-ß 1 besitzt folgende Sequenz:

5 10 15 20 25 30 35 40

A-L-D-T-N-Y-C-F-S-S-T-E-K-N-C-C-V-R-Q-L-Y-kD-F-R-K-D-L-G-W-K-W-hH-E-P-K-G-Y-H-

45 50 55 60 65 70 75 80

A-N-F-C-L-G-iP-C-P-Y-hW-S-L-D-T-Q-Y-S-K-V-L-A-L-Y-N-Q-H-N-P-G-A-S-A-A-P-C-C-V-P-

85 90 90 100 105 110

Q-A-L-E-P-L-P-I-V-Y-Y-V-G-R-K-P-K-V-E-O-L-S-N-M-I-V-R-S-C-K-C-S TGF-ß 2 besitzt folgende Sequenz;

5 10 15 20 25 30 35 40 45

A-L-D-A-A-Y-C-F-R-N-V-Q-D-N-C-C-L-R-P-L-Y-I-D-F-K-R-D-L-G-W-K-W-I-H-E-P-K-G-Y-N-A-N-F-C-A

50 55 60 65 70 75 80 85 90 G-A-C-P-Y-L-W-S-S-D-T-Q-H-S-R-V-L-S-L-Y-N-T-hN-P-E-A-S-A-S-P-C-C-V-S-Q-D-L-E-P-L-T-kL-Y

95 100 105 110 Y-I-G-K-T-P-K-I-E-Q-L-S-N-M-I-V-K-S-C-K-C-S

Die aus einem Buchstaben bestehenden Bezeichnungen für die verschiedenen Aminosäuren haben folgende Bedeutung: A = Alanin, R = Arginin, N = Asparagin, D = Asparaginsäure, C = Cystein, Q = Glutamin, E = Glutaminsäure, G = Glycin, H = Histidin, I = Isoleucin, L = Leucin, K = Lysin, M = Methionin, F = Phenylalanin, P = Prolin, S = Serin, T = Threonin, W = Tryptophan, Y = Tyrosin und V = Valin.

Es versteht sich, daß die Amelsensäuresequenz nicht genau den oben angegebenen Sequenzen zu entsprechen braucht, sondern durch 1 bis 4 konservative oder nichtkonservative Substitutionen modifiziert sein kann, zu denen Weglassungen und Einfügungen gehören, die gewöhnlich höchstens etwa eine Aminosäure betreffen, wobei die Modifizierungen D-Aminosäuren mit einschließen können, ohne daß dabei die Wirksamkeit des Produktes stark beeinträchtigt wird. Die betreffenden Polypeptide können infolgedessen verschiedenen Veränderungen, wie z.B. Einfügungen, Weglassungen und Substitutionen, die entwedor konservativ oder nicht-konservativ sind, unterzogen werden, wobei diese Veränderungen bestimmte Vorteile bei ihrem Einsatz liefern können. Konservative Substitutionen sind Kombinationen, wie z. B. G und A, V, I und L, D und E, N und Q, Fund T, K und R sowie S, Y und W.

Von besonderem Interesse sind die natürlich vorkommenden TGF-β und Teile davon, die wonigstens im wesentlichen frei Von anderen Zellbestandteilen sind und in einem Reinheitsgrad von gewöhnlich wenigstens etwa 90%, vorzugsweise jedoch von 95% und besser noch von 99% vorliegen. Die TGF-ß können von natürlichen Quellen isoliert, oder, sofern zutreffend, synthetisiert oder nach Rekombinationsverfahren hergestellt werden. Von besonderem Interesse sind TGF-ß von Säugetieren, insbesondere von Primaten und besonders ähnliche TGF-ß. Sie können einzeln, miteinander oder mit anderen antiproliferativen Mischungen kombiniert eingesetzt werden.

Die Polypeptide oder Teile davon können mit der proteinhaltigen Matrix nach herkömmlichen Verfahren konjugiert werden. Die zu diesem Zweck verwendeten Vernetzungreagenzien sind im allgemeinen bifunktionelle Moleküle, die als A-R'-B dargestellt werden, wobei R' die Komponente ist, die die beiden funktioneilen Gruppen A und B miteinander verbindet, die eine Reaktion mit anderen Gruppen eingehen können, wie z. B. mit Aminogruppen (NH₂), Carboxylgruppen (CO₂H) und Sulfhydrylgruppen (SH), die im Polypeptide oder in der festen Trägersubstanz vorhanden sein können. Der Verbindyngsteil R' verleiht der Querverbindung die entsprechenden Eigenschaften, wie z.B. eine geeignete Spacer-Länge oder Konformation. Der Verbindungsteil R' kann eine Alkylenkette -(CHHn- oder eine Kette sein, die mit anderen Substituenten versehen ist, -(CHj)_mQ(CH₂)_n-. Der Substituent Q kann bestehen aus ungesättigten Gruppen, wie z.B. -CH=CH- und-CsC-, aromatischen Gruppen, wie z. B. Phenylen -C₈H₄- (das in der ortho-, meta- oder para-Stellung verbunden ist), heteroaromatischen Gruppen, wiez. B. die Gruppen, die von Pyridin, Imidazol oder Indol abgeleitet wurden, oder polycyclischen Formen von aromatischen und heteroaromatischen Ringsystemen. Die Ringsysteme können weitere Substituenten, wie z. B. Halogen-, Methyl- und Nitrogruppen, besitzen, die jedoch nicht nur auf diese Beispiele begrenzt sind. Es können in gleicher Weise zusätzliche Substituenten vorhanden sein, die ein oder mehrere H in den Methylenketten -(CH₂I_n,- und -(CH₂I_n- ersetzen. Vernetzungsreagenzien, bei denen A und B gleich sind, werden als homobifunktionelle Reagenzien bezeichnet. Querverbindungsreagenzien, bei denen A und B verschieden sind, werden als heterofunktionelle Reagenzien bezeichnet. Wenn A und B verschieden sind, dann erfolgt die Reaktion zur Herstellung einer Vernetzung zwischen den beiden Komponenten, d. h. zwischen dem Peptid und der Trägersubstanz, im allgemeinen schrittweise. Eine schrittweise Reaktion ist auch dann möglich, wenn A und B gleich sind und zuerst eine Gruppe aktiviert wird und die andere Gruppe inaktiviert oder in einer blockierten oder geschützten Form bleibt. Wenn A und B gleich sind, dann ist eine gleichzeitige Reaktion mit den beiden Komponenten möglich. Das ist direkter, kann jedoch weniger selektiv als eine schrittweise Reaktionsfolge sein.

Bei einer Vernetzung mit Aminen können die reaktionsfähigen funktionellen Gruppen A und B Carboxylsäuren (die auf irgendeine Weise aktiviert wurden), Aldehyde oder Änderungsmittel sein.

Wenn A eine Carboxylsäure ist, dann gibt es verschiedene Möglichkeiten, diese für eine Reaktion mit Aminen zur Bildung von Amiden zu aktivieren. Das wird allgemein in der Fachliteratur für organische Chemie, wie z. B. von F. A. Carey und R. J. Sundberg in Advanced Organic Chemistry (1983) 2:118ff., und eingehend in Fachbüchern, die sich mit Peptiden befassen, wie z. B. von E.Gross und J. Meienhofer in The Peptides (1979) 1 und von M.Bodanszky in Peptide Chemistry (1988), erläutert. Eine Liste der Reagenzien, die zur Bildung einer Peptidbindung führen, befindet sich im Glossar des Buches von Pettit (G. R. Pettit, Synthetic Peptides [1970] 1). Es werden deshalb hier nur einige allgemeine Möglichkeiten zur Aktivierung von Carboxylgruppen erläutert.

Die Gruppen A=CO₂H können zu C-X aktiviert und in eine Reaktion mit Aminogruppen zur Bildung einer Peptidbindung gebracht werden:

O O »

D I

-C-X + H₂N-R -* -C-NHR + NX

Carboxylsäuren können zu Acylhalogeniden und -pseudohalogeniden aktiviert werden

(C-X, wobei X für Br, Cl, CN oder N₃) steht, die mit Anhydriden und aktivierten Estern gemischt wurden. Eine Aktivierung durch Additionsreaktionen unter Verwendung von Carbodiimiden und Isoxazoliurnreagenzien wird ebenfalls angewendet.

In gemischten Anhydriden wird das X von C-X von einer anderen Carboxylsäure, einer Kohlensäure, einer Sulfonsäure oder einer phosphorhaltigen Säure erhalten. Viele Beispiele sind möglich (siehe dazu die Literaturhinweise). Diese Beispiele sind repräsentativ:

OOOO O Olli I

-C-O-CCF₃-C-O-C-O^-C-O-SO₂R (R = CF₃ C₈H₆, usw.

OO > I -C-O-P-R (R = Pr oder OEt)

C-X besitzt in aktiven Estern X=OR, das von ε ihr elektronegativen Phenolen (R=C₆F₆, C₆CIg, C₆H₃(NO₂I₂ usw.) oder N-Hydroxylverbindungen, wie z. B. N-Hydroxysuccinimid und N-Hydroxybenzotriazol, erhalten wird.

Die Aktivierung von Carboxylgruppen durch Carbodiimide erfolgt über ein Zwischenprodukt, das eine Reaktion mit der Amidogruppe eingeht:

O O HNR H₂NR¹O O

-C-OH + R-N=C=N-R ->-C-O-C=NR-*-C-NHR' + C(NHR)₂

Wenn das Zwischenprodukt in Gegenwart von N-Hydroxysuccinlmid oder N-Hydroxybenzotriazol gebildet wird, dann entsteht vermutlich ein aktiver Ester (s. oben), der dann eine Reaktion mit der Aminogruppe eingeht.

Wenn A ein Aldehyd ist, dann ist das Vernetzungsreagenz ein Dialdehyd. Eine Art wird dargestellt durch O=CH-(CH₂)_n-CH=O. Das geht eine Reaktion mit dem Polypeptid (R²NH₂) und derTrSgereubetanz R³NH₂ auf folgende Weise ein:

R²NH₂ - R³NH₂ + O=CH(CH₂)_nCHO-> R²N=C(CH₂J_nCH=NR³ + 2H₂O Glutnraldehyd mit η = 2 ist ein allgemein verwendetes Vernetzungsreagenz. Wenn η größer gewählt wird, dann wird dar Spacer

zwischen dem gekoppelten Peptid und der festen Trägersubstanz länger. Es gibt im allgemeinen einen optimalen Bereich für die

Spacer-Länge. Die Dialdehyde können ebenfalls von aromatischen oder heteroaromatischen Verbindungen abgeleitet werden, wie es an

diesem Beispiel von Phthalaldehyd gezeigt wird.

Eine Substitution in ortho-, para- oder meta-Stellung wird zusammen mit verschiedenen Längen von Seitenketten in der Struktur 2 gezeigt. Die Benzenringe in 2 können durch andere Ringsysteme, die polycyclisch oder heterocyclisch sind, ersetzt werden. Es können auch andere Substituenten, wie z. B. Halogen-, Nitro- oder Alkylgruppen, boi diesen Ringsystemen vorhanden sein. Obwohl Formaldehyd kein bifunktionelles Aldehyd ist, kann es eine Reaktion mit zwei Aminogruppen eingehen und als Vernetzungsreagenz verwendet werden.

R²NH₂ + R³NH₂ + CH₂O-* R²NH-CH₂-NHR³ + H₂O

Bifunktionelle Vernetzungsreagenzien, die von Alkylierungsmltteln (A-R'-B, wobei A und B Alkylierungsgruppen sind) abgeleitet wurden, werden nicht häufig zur Schaffung einer Peptidvernetzung verwendet, obwohl sie zur Vernetzung anderer Arten von Polymeren und Trägersubstanzen verwendet werden. Zwei Beispiele sind Sulfonatester und Epoxide, wie es anhand der folgenden Beispiele gezeigt wird:

A=OSO₂CF₃ und A= CH₃-CH-

^n₃-

^BaSe

R⁴NH, + R^JNH, + CF₃SO₃R¹SO₃CF₃ > R²NH-R^NHR³

-CH-R -CH-CH₂ ^P Q^/ V

A/"¹U

CH-R¹CH-CH₃NHR³

I I ²

HO OH

Diese Reagenzien können auch eine Reaktion mit Sulfhydrylgruppen eingehen: RSH + CrVCH-h^-B —> RS-CH₉-CH-R¹B

\/ OH

Andere funktioneile Vernetzungsreagenzian, die eine Reaktion mit Sulfhydrylgruppen eingehen können, können A = MaleimidogruppooderA = ICH₂C-besitzen.

R²SH +

R²SH + ICH₂C-R-B > R²SCH₂CR-B

Bifunktionelle Vernetzungsreagenzien, die eine Reaktion mit Carboxylgruppen bei den zu koppelnden Komponenten (dem Peptid oder der Trägersubstanz) eingehen können, können A = Aminogruppe besitzen:

Aktivierung H₂N-R¹^-B π _R»C0₂H * R¹COX > R²CNHR¹B

Wenn B ebenfalls eine Aminogruppe ist oder wenn Aminogruppen in der zu koppelnden Komponente (Polypeptid oder Trägersubstenz) vorhanden sind, dann müssen diese Aminogruppen vor der Reaktion blobkiert oder geschützt und diese Blockierung später wieder aufgehoben werden.

Einige bifunktionelle Vernetzungsreagenzien sind im Handel erhältlich. Zum Beispiel sind eine Reihe von homobifunktionellen Vernetzungsreagenzien (für ein Beispiel siehe3) und heterobifunktionellen Vernetzungsreagenzien (fürein Beispiel s. 4) von der Pierce Chemical Company erhältlich.

Bei der Vernetzung von zwei Komponenten, d. h. Peptid und Trägersubstanz, besteht die Möglichkeit, Querverbindungen innerhalb der Komponenten anstelle der gewünschten Querverbindungen zwischen den Komponenten zu bilden. Derartige Nebenreaktionen können durch die Auswahl der Reagenzien und der Reaktionsbedingungen sowie durch die Verwendung von Blockierungsgruppen, die wieder beseitigt werden können, auf ein Minimum verringert werden.

Es können verschiedene feste Trägersubstanzen zur Herstellung der Mischungen, die Gegenstand der Erfindung sind, verwendet werden. Die betreffenden Mischungen sind amorph, injizierbar und viskos, so daß im wesentlichen eine örtlich begrenzte Applikation ohne beträchtliche Ausbreitung weg von der Verabreichungsstelle erreicht wird. Die Mischungen können unter mäßigem Druck fließen, werden sich jedoch nicht mehr welter ausbreiten, nachdem sie an einer bestimmten Stelle appliziert worden sind. Die proteinhaltige Matrix wird die antiproliferativen Polypeptide kovalent oder nicht-konvalent binden können, ohne daß ihre therapeutische Wirkung beeinträchtigt wird, und dabei gleichzeitig dazu beitragen, daß die aktiven Stoffe an der Einführungsstelle zurückgehalten werden oder die Übertragung der aktiven Stoffe von der Einführungs4telle verzögert wird.

Die Mischung wird vorzugsweise eine beträchtliche Menge der proteinhaltigen Matrix enthalten, um die gewünschten Mischungseigenschaften bereitzustellen. Die Matrix kann aus einzelnen Peptiden oder Kombinationen von Peptiden oder Proteinen, d. h. zum Beispiel aus Strukturproteinen, wie z. B. Kollagen und Fibrinogen oder Albumin oder anderem Protein, die eine beständige Plazierung ermöglichen, oder ihren Kombinationen bestehen. Von besonderem Interesse sind Kollagen, Fibrinogen und deren Abkömmlinge.

Proteinhaltige Matrizen im Arzneimittelträgersystem, die etwa 5Ma.-%, vorzugsweise jedoch wenigstens etwa 10Ma.-% und bis zu 50 Ma.-% oder mehr Fibrinogen enthalten, sind von besonderem Interesse, wenn sie in Verbindung mit Thrombin oder dessen enzymatischen Äquivalent eingesetzt werden. Auf diese Art und Weise wird Fibrinogen enzymatisch zu Fibrin modifiziert, wodurch die Eigenschaft der Mischung, sich nicht auszubreiten, verstärkt und gleichzeitig eine Matrix aus Fibrillen zur weiteren Stabilisierung der Mischung gebildet wird.

Das Thrombin kann mit einem Fibrinogen, das eine proteinhaltige Mischung enthält, unmittelbar vor dem Einsatz oder kurz nach der Injektion gemischt werden. Die verwendete Thrombinmenge (etwa 1 bis 1000 ΙΕ/mg) entspricht im allgemeinen je nach dem Zeitpunkt der Verwendung, der gewünschten Geschwindigkeit zur Bildung einer festen Matrix, der Menge anderer Komponenten, dem Einfluß des Arzneimittels auf die Wirksamkeit von Thrombin und dergleichen etwa 0,1 bis 10Ma.-% des vorhandenen Fibrinogens.

Das proteinhaltige und im besonderen kollagen- oder fibrinogenhaltige Material, das verwendet wird, kann von einer Säugetierwirtsquelle, wie z. B. vom Rind, Schwein oder Menschen, stammen oder, sofern möglich, nach anderen Verfohren, wie z.B. DNS-Rekombinationsverfahren, hergestellt sein. Das verwendete Kollagen kann natürliches Kollagen oder modifiziertes Kollagen, wie z. B. Tropokollagen, Atropokollagen oder dergleichen, sein. Das Kollagen kann nichtimmunogen, Immunogen oder nur geringfügig immunogen sein.

Es sind in der Fachliteratur verschiedene Methoden zur Schaffung von Kollagen oder dessen Abkömmlingen in gereinigter Form für die Verabreichung bei einem Säugetier bekannt. Angaben über diese Methoden befinden sich in solchen Patentschriften wie z. B. in der US PS 3949073, und in den darin angegebenen Literaturstellen. Von Interesse Ist Rinderkollagen, das rein dargestellt und von jungen Kühen oder Kälbern erhalten wird. Die Reindarstellung erfordert normalerweise eine Dispersion oder Präzipitation aus verschiedenen Medien, wie z. B. aus verdünnter Essigsäure. In einigen Situationen wird xenogenes Kollagen verwendet, um eine immunogene Reaktion im Injektionsbereich zu fördern, oder, es können immunogene Adjuvanzien verwendet werden.

Außerdem kann (können) das (die) Arzneimittel in Liposomen oder anderen Stoffen mit einer gesteuerten Freisetzungsgeschwindigkeit eingekapselt verwendet werden, die In der proteinhaltlgen Mischung enthalten sind, so daß getrennte und verschiedene Freisetzungsgoschwindigkeiten des Arzneimittels erreicht werden. Auf diese Weise können Mehrphasenmischungen hergestellt werden, so daß eine langsame Freisetzung des Arzneimittels über lange Zeiträume möglich wird. Die Bildung von Liposomen unter Einschluß verschiedener Stoffe wird beschrieben in Papahadjopoulos (1978), Annals of the N. Y. Academy of Science, 308; Gregoriadis und Allison (1980), Liposomes In Biological Systems (John Wiley and Sons); Leserman et al., Nature (1981) 293:226-228; Barhet et al., Supramol. Struct. Cell Bio. Chem. (1981) 16:243-258, und Heath et al., Science (1980) 255:8015-8018. Es können in alternativer Weise andere Einkapselungsmethoden angewendet werden, wenn das Arzneimittel in einer biologisch abbaubaren Substanz eingekapselt wird und dabei die Freisetzungsgeschwindigkeit mit der Dicke des biologisch abbaubaren Überzugs in Beziehung steht.

Die Mischungen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind und die proteinhaltige Matrix und das antiproliferative Mittel enthalten, können In vitro oder in vivo eingesetzt werden. Für den Einsatz in vitro können sie zur gezielten Hemmung der Proliferation von Zellen eingesetzt werden, die gegenüber den wachstumshemmenden Wirkungen eines TGF-ß empfindlich sind. Die betreffenden Mischungen können so hergestellt werden, daß die Menge der aktiven Komponente, die aus der proteinhaltigen Matrix diffundiert, so groß ist, daß die Proliferation von unerwünschten empfindlichen Zellen gehemmt wird. Die Menge der aktiven Komponente, die je Zeiteinheit aus der Matrix freigesetzt wird, kann variiert und für bestimmte Situationen dadurch optimiert werden, daß die Menge oder die Konzentration entweder der aktiven Komponente oder der proteinhaltigen Matrix in der Mischung verändert wird.

In vivo kann die Mischung direkt in einen Bereich mit einer Hyperproliferation von Zellen oder in einem Zelläsionsbereich oder an einer Stelle unmittelbar neben derartigen Bereichen implantiert werden, so daß eine höhere Konzentration der aktiven Komponente in der unmittelbaren Nähe der sich ausbreitenden Zellen als im umgebenden Gewebe entsteht. Die Menge der aktiven Komponente, die aus der festen Trägersubstanz freigesetzt wird, kann je nach der Art des Zeilwachstums, das beeinflußt werden soll, der Größe der Zellpopulation, der Empfindlichkeit der Zelle gegenüber der aktiven Komponente, der Wirksamkeit der aktiven Komponente und dergleichen verändert werden. Die Menge des TGF-ß, die an der festen Trägersubstanz gebunden ist, entspricht im allgemeinen 1 ng/ml bis 10mg/ml Kollagen (10 bis 40mg/ml), gewöhnlich jedoch 10ng/ml bis 1 mg/ml, vorzugsweise aber 10 ng/ml bis 100Mg. i\. Die Menge des TGF-ß, die aus der festen Trägersubstanz freigesetzt wird, beträgt gewöhnlich etwa 1 bis etwa 60% während der ersten 4 bis 6h der Freisetzung und erreicht danach einen konstanten Wert von etwa 1 bis 20% pro Tag.

Der TGF-ß, der mit der Matrix verbunden ist, kann einzeln oder mit anderen antiproliferativen Mitteln kombiniert eingesetzt werden, wobei das von der Art des Mittels, der Art der in ihrem Wachstum zu hemmenden Zellen und davon abhängig ist, ob eine kooperative Wirkung pharmakologisch indiziert ist. Die Mischung, die Gegenstand der Erfindung ist, kann dadurch weiter modifiziert werden, daß die aktive Komponente, insbesondere durch Bindungen, die eine Enzymspaltung, wie z. B. eine Hydrolyse, zulassen, modifiziert wird oder Stoffe in die Mischung aufgenommen werden, die dazu beitragen, daß die aktive Komponente an der Einführungsstelle zurückgehalten wird.

Es können verschiedene Verfahrensweisen angewendet werden, um die Wanderung des antiproliferativen Mittels aus der proteinhaltigen Matrix z. B. dadurch zu verringern, daß das Mittel mit bestimmten Liganden, wie z. B. mit Lipiden, Phosphorlipiden, Peptiden, Aminosäuren, Zuckern oder dergleichen, gekoppelt wird. Diese Modifizierungen sind von dem einzelnen Mittel abhängig, verändern die Löslichkeit des Mittels im wäßrigen Medium und ermöglichen kovalente oder nichtkovalente Wechselwirkungen mit der proteinhaltigen Matrix. Es können außerdem verschiedene physiologisch,verträgliche Füll- oder Konzentrationsmittel verwendet werden, die zur Schaffung von Wechselwirkungen zwischen Arzneimittel und Matrix dienen und zu einer Verringerung der Geschwindigkeit der Arzneimittelfreisetzung führen. Zu den Stoffen, die das veranschaulichen, gehören anorganische Substanzen, wie z. B. Hydroxyapatit, und organische Substanzen, wie z. B. Kohlenhydrate, d. h. zum Beispiel Agarose, Cellulose, Mucopolysaccharide, Hyaluronsäure, Chondroitonsulfat und dergleichen. Weitere Arzneimittel für den Einsatz in Verbindung mit den antiproliferativen Mitteln sind Arzneimittel, die die Diffusion weg von der Implantationsstelle des antiproliferativen Mittels verzögern. Das dient dazu, den physiologischen Krankheitszustand zu verbessern und die therapeutische Wirkung zu fördern. Von besonderem Interesse als Antidiffusanzien sind Mittel, die die regionalen Gefäße entweder in bezug auf das Wachstum und/oder die Durchlaßöffnung verengen, wie t. B. vasokonstriktive Mittel oder Sympathikomimetika. Zu diesen Mitteln können Catecholamine, wie z.B. Epinephrin und Norepinephrin, Mutterkornalkaloide, Prostaglandine, Angiotensin oder dergleichen gehören. Weitere Mittel, die den Gewebeaufbau beeinträchtigen können, sind u. a. Enzyme, die das Strome beschädigen, wie z. B. die Peptidasen, d. h. z. B. Papein, Chymopapein, Trypsin, Amylase, Collagenase und Chymotrypsin. Oder es können Mittel verwendet werden, die die Zelldurchlässigkeit beeinträchtigen, wie z. B. nichtionogene Detergenzien, z. B. Tween 80, Amphotericin B, DimethyUulfoxid und Anästhetika, wie z.B. Procain. Weitere Mittel, die Verwendung finden können, sind die Mittel, die an der DNS-Reparaturhemmung und der DNS- oder RNS-Synthesehemmung beteiligt sind.

Von besonderem Interesse als Zielzellen sind Tumorzellen, die gegenüber den wachstumshemmenden Wirkungen der aktiven Komponente (antiproliferativer Wachsturmi'aktor), die mit der Matrix verbunden ist, empfindlich sind. Die Mischungen, die Gegenstand der Erfindung sind, finden besondere Verwendung bei Karzinomen, die ohne Schwierigkeiten für eine Implantation zugängig und gegenüber der aktiven Komponente empfindlich sind, wobei dazu Lungenkrebs, Plattenzellen- und Basalzellenkarzinom, Brustkrebs, Melanom sowie Tumore mit Endothel- und Fibroblastursprung, wie z. B. Sarkome, d. h. zum Beispiel Osteosarcom und Lymphom, gehören.

Wie bereits angegeben, k «nn das Verhältnis der Trockenstoffe in der Mischung sehr unterschiedlich sein. Der Anteil des Proteinmatrixmaterials im Arzneimittelträgersystem wird jedoch gewöhnlich nicht kleiner als 30 Ma.-% und nicht größer als etwa 95Ma.-%, im allgemeinen jedoch von etwa 40Ma.-% bis 90Ma₁-Vo, häufiger aber von etwa B0Ma.-% bis 90Ma.-% betragen. Davon werden vorzugsweise 10% bis 100% aus Kollagen und/oder Fibrinogen bestehen. Das (Die) antiproliferative(n) Arzneimittel wird (werden) normalerweise eine Flüssigkeit oder ein fester Stoff sein oder in fester Form vorliegen und allgemein wenigstens etwa 0,0001 Ma.-% bis etwa 5Ma.-%, häufiger jedoch von 0,001 Ma.-% bis 1 Ma.-%, allgemein aber von etwa 0,001 Ma.-% bis 0,1 Ma.-% proteinhaltiges Material enthalten.

Weitere Hilfszusätze oder zusätzliche Mittel werden in einer Gesamtmenge von etwa 0,005Ma.-% bis 15Ma.-% gewöhnlich, jedoch von etwa 0,01 Ma.-% bis 10Ma.-% bezogen auf die Trockenmasse der Gesamtmischung vorhanden sein. Die Mischung ist gleichmäßig in einem physiologisch verträglichen wäßrigen Medium verteilt, wie z. B. in physiologischer Kochsalzlösung, phosphatgepufferter Kochsalzlösung, destilliertem Wasser, Wasser für die Injektion usw. Das wäßrige Medium wird ausreichend sein, um eine amorphe Dispersion zu schaffen, die unter mäßigem Druck fließen kann. Das flüssige wäßrige Medium wird gewöhnlich wenigstens 90Ma.-%, häufiger jedoch wenigstens 95Ma.-% und höchstens etwa 99,8Ma.-%, gewöhnlich jedoch höchstens etwa 99,5Ma.-% der Gesamtmischung ausmachen, damit eine fließfähige Mischung erhalten wird. Die Menge ist je nach Art des Arzneimittels (der Arzneimittel), der Art des Matrixmaterials, dem Vorhandensein anderer Stoffe und dergleichen verschieden. Die Proteinkonzentration Im wäßrigen Medium wird im Bereich von etwa 5mg/ml bis 75mg/ml liegen.

Zusätzlich zu den Hauptkomponenten können außerdem eine Reihe von Nebenkomponenten für eine Vielzahl von Zwecken enthalten sein. Diese Mittel werden zum größten Teil Eigenschaften verleihen, die die Beständigkeit der Mischung schützen, den pH-Wert steuern oder dergleichen. Zu den Mitteln, die das veranschaulichen, gehören Phosphat- oder Acetatpuffer, Methyl- oder Propylparaben, Polyethylengluycole usw. Diese Mittel werden im allgemeinen in einer Menge vorhanden sein, die kleiner als etwa 2 Ma.-%, gewöhnlich jedoch kleiner als etwa 1 Ma.-% der Gesamtmischung ist, und können einzeln etwa 0,001 Ma.-% bis etwa 1 Ma.-%der Gesamtmischung ausmachen.

Wie bereits angegeben, wird das Arzneimittel in einigen Fällen besonders in Liposomen eingekapselt. Liposome werden aus einer Vielzahl von lamellenbildenden Lipiden hergestellt, zu denen Phosphoriipide, wie z. B. Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin usw., Ganglioside, Sphigomyellne, Steroide, wie z. B. Cholesterol usw. gehören. Die Masse der Lipide beträgt gewöhnlich gegenüber der Masse des Arzneimittels 1 bis Bl des eingeschlossenen Arzneimittels je Mol des amphipathischen Lipids.

Die Mischung kann dadurch hergestellt werden, daß die verschiedenen Komponenten unter sterilen Bedingungen zusammengebracht werden. Die Matrix wird in einer zweckmäßigen Form vorbereitet, d. h. gewöhnlich wenigstens mit einem Teil der Gesamtmenge des zu verwendenden wäßrigen Mediums gemischt. Die Mischung wird eine so hohe Bearbeitbarkeit aufweisen, daß nach der Zugabe der anderen Mittel eine gleichmäßige Dispersion erhalten werden kann. Wenn Kollagen oder ein Abkömmling von Kollagen verwendet wird, dann wird das Kollagenmaterial in normaler Form (in einer monomeren oder polymeren, besonders jedoch di- oder trimeren Form) oder als eine gleichmäßige Dispersion von Kollagenfibrillen in einem wäßrigen Medium verwendet, wobei das Kollagenmaterial in einer Menge von etwa 5 mg/ml bis höchstens 100 mg/ml, gewöhnlich jedoch höchstens 75 mg/ml verwendet wird. Das Arzneimittel kann dann unter Rühren zu der Kollagendispersion gegeben werden, so daß die gleichmäßige Verteilung des Arzneimittels in der entstehenden Mischung sichergestellt wird. Andere Stoffe können, sofern zutreffend, gleichzeitig oder nacheinander hinzugegeben werden. Nachdem die gleichmäßige Verteilung der verschiedenen Komponenten in der Mischung sichergestellt ist, kann die Mischung sterilisiert und in einem entsprechenden Behälter luftdicht verschlossen untergebracht werden. Die Sterilisation wird gewöhnlich dadurch erreicht, daß aseptische Methoden und aseptische Bedingungen bei der Zugabe aller sterilen Bestandteile angewendet werden.

Versuche

Kollagen zur Herstellung der Kollagenmatrix wurde im wesentlichen so erhalten, wie es in der US PS 3949073 und in der dort angegebenen Literatur beschrieben wird, deren Offenlegungen hiermit als Bezugnahme mit aufgenommen werden. Für die Herstellung von CM-TGF-ß wurde zuerst eine pH-neutrale Mischung mit 6,5% (Masseanteile/Volumenanteile) Kollagen hergestellt. Unmittelbar vor der Verwendung oder innerhalb 1 h vor der Verwendung wurde der Wachstumsfaktor TGF-ß (Oncogen) nach den Anweisungen des Herstellers durch erneute Suspension in einer phosphatgepufferten Lösung in einer solchen Konzentration hergestellt, daß das gewünschte schließliche Verhältnis zwischen TGF-ß und Kollagen im allgemeinen 1 ng/ml bis 10mg/ml Kollagen beträgt. Der TGF-ß und Kollagen wurden dann mit Hilfe eines Luerlock-Doppelmischers gemischt. Es wurde jeweils eine Injektionsspritze mit Kollagen und mit TGF-ß gefüllt. Der Inhalt der beiden Injektionsspritzen wurde dadurch miteinander vermischt, daß der Kolben der Injektionsspritzen wiederholt bei Raumtemperatur etwa 20mal hineingedrückt und wieder herausgezogen wurde, bis die Suspension homogen war, wie eine Sichtprüfung ergab, Der CM-TGF-ß wurde bis zu 1 h bei einer Temperatur von 4°C oder bei Raumtemperatur bis zur Verwendung aufbewahrt.

Ausführungsbeispiele Beispiel I Freisetzung von TGF-ß aus einer Kollagenmatrix (CM) In vitro

¹²⁶I-TGF-P (2 MCi) wurde zu kaltem TGF-ß gegeben, so daß eine schließliche TGF-ß-Konzentration von 400 ng/ml in

CM-Konzentrationen von 10mg/ml, 20mg/ml, 30mg/ml oder 40mg/ml erhalten wurde. Es wurden etwa 0,7 ml jeder CM-Mischung mit ^l2el-TGF-ß auf den Boden von Einwegreagenzröhrchen aus Plast gegeben und die Radioaktivität des CM-TGF-ß mit einem Gammastrahlenmeßgerät ermittelt. Danach wurden etwa 1,4ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung vorsichtig auf das TGF-ß-Pellet im Reagenzröhrchen gegeben. Die phosphatgepufferte Kochsalzlösung wurde in Abhängigkeit von der Zeit aus dem Reagenzröhrchen entfernt. Das TGF-ß-Pellet wurde erneut einer Messung der Radioaktivität

zu jedem Zeitpunkt unterzogen.

Die Freisetzung von ¹²⁶I-TGF-P aus dem CM-Träger schien durch die CM-Konzentration beeinflußt zu werden. Die anfängliche Freisetzung von TGF-ß erfolgte bei der Mischung mit 10mg/ml Kollagenmatrix (CM) am ersten Tag schneller als bei den anderen untersuchten Mischungen. Die konstante Freisetzung von TGF-ß aus allen Mischungen schien sich so zu stabilisieren, daß täglich etwa 1 % TGF-ß während der übrigen sechs Tage des Versuches bei allen untersuchten Gruppen freigesetzt wurde. Diese Daten werden in Fig. 1 gezeigt.

Beispiel Il

Aktivierung und Austrittskinetik von TGF-ß aus einer Kollagenmatrix (40 mg/ml)

Die biologische Aktivität und die Freisetzungsgeschwindigkeit von TGF-ß aus einem Rinderkollagenträger wurden wie folgt

untersucht.

500ng TGF-ß vom Menschenaffen (Oncogen) in 0,4ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung wurden mit 0,8ml Kollagenmatrix (CM) (65mg/ml) (Matrix Pharmaceutical, Inc., Menlo Park, Kalifornien) gemischt, wobei eine schließliche Mischung mit 417ng/ ml TGF-ß und CM (43mg/mI) erhalten wurde. 500ng TGF-ß in 1,2ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung, die417ng/ml TGF-ß

in phosphatgepufferter Kochsalzlösung ergab, diente als Kontrollprobe.

1 ml TGF-ß und CM wurde auf den Boden eines Reagenzroiirchens gegeben. 2 ml DMEM (Abk. f. „Dulbecco's Minimal Essential Medium" - mindesterforderliches Medium nach Dulbecco) wurden vorsichtig oben auf die Mischung gegeben. Die

Kontrollprobe wurde ähnlich verdünnt.

Zu jedem Zeitpunkt wurde eine 300Ml-Aliquote der überstehenden Flüssigkeit entnommen. Die Zeitpunkte wurden wie folgt

gewählt: <

0min 10min 20min 30min 1h3h 8h 17h 24h72h

Aus jed6.- Probe wurde eine 50-pl-Aliquote entnommen und in Jeweils drei Felder einer aus mehreren Feldern bestehenden Gewebekulturplatte gegeben, die 3000 Lungenzellen A549 vom Menschen je Feld enthielt. Drei bis fünf Tage später wurden die Felder mit "⁶I-Thymidin Impulsmarkiert, um die Resorptionsmenge von Thymidin in den sich aktiv vermehrenden Zellen A549 zu messen. Die Zellen wurden bei 37⁰C in 5% CO₂ und 95% Luft inkubiert. Alle Schritte und Maßnahmen wurden unter aseptischen Bedingungen durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, daß TGF-ß langsam aus der Kollagenmatrix (CM) in logarithmisch-linearer Form während der ersten 8h freigesetzt wurde. Die zunehmenden Konzentrationen von TGF-ß, die aus der CM freigesetzt wurden, führten zu einer verstärkten Hemmung des Zellwachstums, wenn sie mit gegenüber TGF-ß empfindlichen Zellen A549 verglichen wurden, wobei innerhalb 1 h eine so große Arzneimittelmenge freigesetzt wurde, daß eine Hemmung des Zellwachstums um 50% erreicht wurde. Eine vollständige Hemmung wurde nach 8h beobachtet. Sie blieb während der gesamten 72h des Versuches konstant. TGF-ß in phosphatgepufferter Kochsalzlösung ohne den CM-Träger hemmte etwa 80% der Zellproliferationsaktivität während des gesamten Versuches. Diese Daten werden in Fig. 2 gezeigt.

Beispiel III

Einfluß der durch eine Kollagenmatrix vermittelten Abgabe von TGF-ß 1 auf das Wachstum von Lungentumorzellen A 549 vom Menschen in Nacktmäusen

Männliche Nacktmäuse (Balb/c-nu+/nu+) im Alter von 12 Wochen wurden im hinteren Nackenbereich subcutan mit 1,3 χ 10^β Lungenkarzinomzellen vom Menschen (A549) in 0,2 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung injiziert. Innerhalb von 20 Tagen hatten sich bei etwa 60%der Tieretastbare Tumore (giOmrn³ - 3mm x 3mm x 1mm) entwickelt. Die Tumorgröße wurde mit Gabellehren in drei Durchmessern gemessen. Die Tiere mit Tumoren wurden dann zufällig verschiedenen Behandlungsgruppen zugewiesen. Der erste Behandlungstag entspricht dem ersten Tag, an dem die Tiere behandelt wurden, nachdem sich meßbare Tumore entwickelt hatten. TGF-ß 1 wurde bis zum Erreichen von Homogenität aus Eierstöcken von chinesischen Hamstern, die den Rekombinations-TGF-ß1 vom Menschenaffen hervorbrachten (Angaben über die Darstellung sind der USSN-Publikation 147842 zu entnehmen, die am 25. Januar 1988 angemeldet wurde und deren Offenlegung hiermit als Bezugnahme mit aufgenommen wird) rein dargestellt und mit einem 10fachen Überschuß von Rinderserumalbumin stabilisiert wurde. Die Gesamtmengen jedes Faktors, die während der Dauer dieses besonderen Versuches verabreicht wurden, entsprechen den Angaben in der Spalte „Behandlung" der folgenden Tabelle.

Die Wirksamkeit der über die Kollagenmatrix erfolgten Abgabe von TGF-ß 1 an die Tumorumgebung wurde gegenüber einem Kochsalzlösungsträger wie folgt untersucht. Versuchsgruppen (s. Tab. 1) erhielten TGF-ß 1 in einer Dosis von entweder 2 Mg, die der Tumorumgebung einmal verabreicht wurden, oder 400 ng, die fünfmal in Abständen von zwei bis drei Tagen verabreicht wurden. Die Wirksamkeit von CM-TGF-ß 1 mit oder ohne dem gefäßaktiven Modifizierungsmittel Epinephrin wurde gegenüber dem Träger allein (CM [30mg/m!]), der phosphatgepufferten Kochsalzlösung, allein oder CM (30mg/ml) allein untersucht. Es wurde der sechzehnte Tag als Endpunkt gewählt und der Anteil der behandelten Tumore gegenüber dem Anteil der unbehandelten Kontrolltumore ermittelt, wie es in Tab. 1 gezeigt wird.

Tabelle 1

Die Wirkung von TGF-ß 1 bei einer Verabreichung entweder allein oder zusammen mit einer Kollagenmatrix und Epinephrin auf

das Wachstum von A549-Tumoren in Nacktmäusen

Gruppe Behandlung

1 Kontrollprobe mit Kochsalzlösung

2 CM(30mg/ml)0,1mlsk²xi

3 TGF-ß(400ng/0,1ml)skx 5(inAbständenvon2-3Tagen)

4 TGF-ß(2Mg/0,1ml)skx 1

5 TGF-ß 1 (2 Mg/0,1 ml)+ CM₁SkXI

6 TGF-ß (2 Mg/0,1 ml) + CM + Epi (25 Mg/0,1 ml) sk x 1

¹ Tumormenge am sechzehnten Tag in %, bezogen auf die Tumormenge bei der Kontrollprobe In Kochsalzlösung.

² sk bezeichnet eine subcutane Injektion in die Tumorumgebung.

Anzahl	Tumor
der Mäuse	wachstum¹
5	100
5	84
5	57
5	72
5	84
5	63

Wie im vorhergehenden gezeigt wird, bestand die wirksamste Behandlung mit TGF-ß 1 darin, den TGF-ß 1 peritumorai in fünf Dosen von jeweils 400 ng in Abständen von jeweils zwei bis drei Tagen zu verabreichen (Gruppe 3). Die Ergebnisse lassen weiterhin vermuten, daß eine wiederholte Einwirkung von TGF-ß 1 auf die Tumorzellen wirksamer als eine einzige Verabreichung einergrößeren Dosis (2pg) ist (Gruppe 4). Wenn jedoch TGF-ß mit CM in Verbindung mit dem gefäßaktiven Modifizierungsmittel Epinephrin verabreicht wurde (Gruppe 6), dann führte eine einzige Injektion zur Unterdrückung des Tumorzellwachstums, ähnlich wie es bei mehreren kleinen Dosen von TGF-ß 1 zu beobachten war (Gruppe 3). Der Tumor wurde vermutlich einer chronischen geringen Dosis von TGF-ß 1 ausgesetzt, wenn TGF-ß 1 aus der Kollagenmatrix (CM) an der vorgesehenen Stelle freigesetzt wurde.

Die oben beschriebenen Ergebnisse zeigen, daß CM-TGF-ß 1 besondere In Verbindung mit einem gefäßaktiven Mittel zur * Hemmung der Zeilproliferation wirksam Ist. Wie aus vorhergehender Offenlegung zu entnehmen ist, werden Mischungen beschrieben, die eine langsame Freisetzung eines antiproliferativen Mittels in der Nähe einer Zielzelle ermöglichen. Alle Publikationen und Patentanmeldungen, die in der vorliegenden Patentschrift erwähnt sind, verkörpern den Stand der Kenntnisse von Fachleuten auf dem Gebiet, auf das sich die vorliegende Erfindung bezieht. Alle Publikationen und Patentanmeldungen werden hier als verwendete Fachliteratur in gleichem Maße mit aufgenommen, als ob jede einzelne Publikation oder Patentanmeldung im besonderen und einzeln als mit aufzunehmende verwendete Fachliteratur angegeben wäre.

Nachdem die Erfindung jetzt ausführlich beschrieben worden ist, w'rd es für den Fachmann auf diesem Gebiet offensichtlich sein, daß Veränderungen und Modifizierungen vorgenommen werden können, ohne dabei vom geistigen Gehalt oder Schutzumfang der beigefügten Patentansprüche abzuweichen. ,

Claims

1. Mischung, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine proteirhaltige Matrix und wenigstens acht
aufeinanderfolgende Aminosäuren von einem TGF-ß umfaßt.

2. Mischung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der TGf-ß ein TGF-ß 1 oder TGF-ß2 ist.

3. Mischung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die proteinhaltige Matrix wenigstens eine Matrix aus Kollagen und Fibrinogen ist.

4. Mischung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die proteinhaltige Matrix aus Kollagen mit einer Kollagenkonzentration von etwa 10mg/ml bis 40mg/ml besteht.

5. Mischung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Kollagenkonzentration etwa
30 mg/ml Kollagen beträgt.

6. Mischung, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Kollagenmatrix in einer Konzentration von etwa 10 mg/ml bis etwa 40mg/ml Kollagen und mit TGf-ß in einer Konzentration von etwa 1 mg/ml bis 10mg/ml Kollagen umfaßt.

7. Mischung nach Anspruch 6, dadurch gekonnzeichnet, daß der TGF-ß ein TGF-ß vom
Menschenaffen ist. ·

8. Mischung, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Kollagenmatrix und wenigstens entweder
TGF-ß 1 oderTGF-ß 2 in einer εο großen Menge, daß dann, wenn er aus der Matrix freigesetzt wird, die Proliferation einer Zielzelle gehemmt wird, umfaßt.

9. Bei einer Methode zur Herrn · ng der Proliferation von Zellen, die gegenüber TGF-ß empfindlich sind, durch Zusammenbringen dieser Zelle mit einer antiproliferativen Mischung erzielte
Verbesserung, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine antiproliferative Mischung mit einer
proteinhaltigen Matrix und wenigstens einem TGF-ß in einer so großen Menge, daß dann, wenn er aus der Matrix freigesetzt wird, die Proliferation dieser Zellen gehemmt wird, umfaßt.

10. Methode nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die proteinhaltige Matrix wenigstens
eine Matrix aus Kollagen und Fibrinogen umfaßt.

11. Methode nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der TGF-ß ein TGF-ß vom
Menschenaffen ist.

12. Methode nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Kollagen TGF-ß 1 in einer
Konzentration von etwa 1 ng/ml bis etwa 10 mg/ml Kollagen enthält.

13. Methode nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des Kollagens etwa 10 mg/ml bis40mg/ml beträgt.

14. Methode nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die antiproliferative Mischung
weiterhin ein vasokonstriktives Mittel in einer so großen Menge enthält, daß es die Diffusion des TGF-ß aus der proteinhaltigen Matrix verzögert.

15. Methode nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das vasokonstriktive Mittel Epinephrin ist.