DE60313982T2

DE60313982T2 - Dimere von thrombinpeptidderivaten

Info

Publication number: DE60313982T2
Application number: DE60313982T
Authority: DE
Inventors: Darrell H. Dickinson Carney
Original assignee: Orthologic Corp
Current assignee: Capstone Therapeutics Corp
Priority date: 2002-07-02
Filing date: 2003-07-01
Publication date: 2008-01-17
Anticipated expiration: 2023-07-02
Also published as: US20090124550A1; JP4668612B2; US7919457B2; DE60313982D1; ATE362939T1; AU2003247848A1; EP1539800B1; EP1539800A4; AU2003247848B2; EP1539800A2; CA2491135A1; AU2003247848C1; US7456250B2; WO2004005317A3; US20050153893A1; WO2004005317A2; JP2006507229A

Description

Hintergrund der Erfindung
Über Thrombin, ein multifunktionales Enzym, das bereits für dessen Blutgerinnungsaktivität bekannt ist, wurde vor kurzem berichtet, dass es ein wichtiger Zellwachstumsfaktor ist. Beispielsweise wurde gezeigt, dass Thrombin Angiogenese, die Entwicklung neuer Blutgefäße, fördert und Endothelzellproliferation stimuliert. Diese Prozesse sind ein Angelpunkt bei der Heilung von Wunden.
Thrombinpeptidderivate sind Moleküle, die eine zumindest teilweise von der von Thrombin abgeleitete Aminosäuresequenz aufweisen, die an bestimmten Thrombinrezeptoren aktiv sind. Beispielsweise wurde für Thrombinpeptidderivate aus den Aminosäuren 508–530 von humanem Prothrombin durch die Erfinder der vorliegenden Erfindung beschrieben, dass sie eine durch den Thrombinrezeptor vermittelte Zellstimulierung fördern und bei der Behandlung von Wunden verwendet werden und Angiogenese stimulieren (siehe beispielsweise US-Patent 5 500 412 oder 5 352 664 ). Wegen ihrer biologischen Aktivität zeigen diese Thrombinpeptidderivate großes Potential als Arzneimittel. TP508 ist ein derartiges Beispiel für ein Thrombinpeptidderivat und es weist die Aminosäuresequenz H-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-NH₂ (SEQ ID NO: 1) auf.
Strenge Vorschriften durch die Food and Drug Administration (FDA) erfordern einen hohen Reinheitsgrad biologisch aktiver Mittel, wenn diese als Arzneimittel verwendet werden. Es ist daher notwendig, aktive Thrombinpeptidderivate zu erhalten, die ihre Reinheit über längere Zeiträume beibehalten, wenn diese Verbindungen zur Behandlung von Menschen verwen det werden. Beispielsweise verringert sich die Reinheit von T2508 wegen Dimerisierung im Laufe der Zeit. Beispielsweise weist TP508 eine Halbwertszeit von etwa 2 bis etwa 4 h in gepufferten Lösungen bei neutralem pH-Wert auf.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Peptiddimer gemäß dem angehängten Anspruch 1 und die Verwendung desselben gemäß den Ansprüchen 21 und 29 bereit.
Es wurde nun ermittelt, dass Thrombinpeptidderivatdimere Aktivität gegenüber Thrombinrezeptoren beibehalten. Thrombinpeptidderivatdimere können im Wesentlichen frei von einem Monomer hergestellt werden und sie weisen etwa den gleichen Aktivitätsgrad gegenüber dem Thrombinrezeptor wie TP508 auf (siehe Beispiel 3). Die Thrombinpeptidderivatdimere behalten ferner ihre Reinheit mit minimaler Rückumwandlung in das Monomer bei (siehe Beispiel 2). Auf der Basis dieser Entdeckung stellt die Erfindung neue Peptiddimere, diese Peptiddimere umfassende pharmazeutische Zusammensetzungen und Verfahren, die zur Behandlung eines Subjekts mit Bedarf an einer Behandlung mit einem Thrombinrezeptoragonisten verwendbar sind, bereit.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Thrombinpeptidderivatdimer, das zwei Thrombinpeptidderivate umfasst. Jedes Thrombinpeptidderivat umfasst unabhängig voneinander ein Polypeptid, das die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2: Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val oder ein C-terminal gestutztes Fragment derselben mit mindestens sechs Aminosäuren aufweist. Null, eine, zwei oder drei Aminosäuren in dem Polypeptid unterscheiden sich von der entsprechenden Position von SEQ ID NO: 2. Vorzugsweise ist der Unterschied konservativ. Die Thrombinpeptidderivate sind optional am C-Terminus amidiert und/oder am N-Terminus acyliert.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ferner pharmazeutische Zusammensetzungen, die einen Thrombinrezeptoragonisten oder ein Thrombinpeptidderivatdimer, die hierin beschrieben sind, und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger oder ein pharmazeutisch akzeptables Verdünnungsmittel umfassen.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Subjekts, das einen Thrombinrezeptoragonisten benötigt.
Vorteile der Thrombinpeptidderivatdimere der vorliegenden Erfindung umfassen eine längere Aufbewahrungslebensdauer in Lösung im Vergleich mit dem Monomer TP508. Daher ist es möglich, präzise und reproduzierbare Dosierungen mit den offenbarten Peptiden auch nach Aufbewahrung über längere Zeiträume zu liefern. Die hierin beschriebenen Thrombinpeptidderivatdimere sind auch kostengünstig herzustellen. Die Thrombinpeptidderivatdimere können bei der Behandlung und/oder Prävention von Erkrankungen und/oder Zuständen, bei denen Angiogenese und Zellproliferation vorteilhaft sind, verwendet werden. Die Thrombinpeptidderivate können zur Unterstützung einer Behandlung von beispielsweise Wunden, wie diabetischen Ulcera, Knochenbrüchen und Knorpelschädigung, verwendet werden. Die Thrombinpeptidderivatdimere können auch zur Prävention einer Restenose bei Patienten nach Angioplastik und zur Regeneration von Blutgefäßen in Herzgewebe verwendet werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Diagramm, das die Umwandlung von TP508 in ein Dimer über die Zeit zeigt. Das Diagramm zeigt die Messungen der HPLC-Peakfläche von TP508-Monomer, TP508-Dimer und unbekannten Stoffen, die in Proben einer TP508-Koch salzlösung (5 mg/ml, bei 4°C inkubiert), die in Abständen über einen Zeitraum von 6 Monaten genommen wurden, gefunden wurden. Die Peakfläche ist als Prozent angegeben. Die Zeit wird als Tage angegeben. Monomer wird als
angegeben. Diemer wird als
angegeben. Unbekante Stoffe werden als
angegeben.
2 ist ein Diagramm, das zeigt, dass das Thrombinpeptiddimer die biologische Aktivität von TP508 im Hinblick auf die Beschleunigung der Wundheilung beibehält. Das Diagramm zeigt Wundflächenmessungen (in mm² angegeben) am Rücken von männlichen Sprague-Dawley-Ratten von Tag 7 und Tag 10 nach der Verwundung. Die Kochsalzvehikelkontrolle wird als "Vehikel" angegeben, die TP508-Kontrolle wird als "TP508" angegeben, Thrombinpeptiddimer niedriger Dosis wird als "lo-di" angegeben und Thrombinpeptiddimer hoher Dosis wird als "hi-di" angegeben.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Anmelder ermittelten, dass die Thrombinpeptidderivatdimere der vorliegenden Erfindung sich im Wesentlichen nicht in Monomere zurückumwandeln und immer noch etwa die gleiche biologische Aktivität wie die Thrombinpeptidderivate des Standes der Technik aufweisen. Ein "Thrombinpeptidderivatdimer" ist ein Molekül, das zwei Thrombinpeptidderivate durch eine kovalente Bindung, vorzugsweise eine Disulfidbindung zwischen Cysteinresten, verknüpft umfasst. Thrombinpeptidderivatdimere sind typischerweise im Wesentlichen frei von dem entsprechenden Monomer, beispielsweise mehr als 95% frei, bezogen auf das Gewicht, und vorzugsweise mehr als 99% frei, bezogen auf das Gewicht. Vorzugsweise sind die Polypeptide die gleichen und durch eine Disulfidbindung kovalent verknüpft.
Selbstverständlich können die hierin offenbarten Thrombinpeptidderivate C-terminale Amide aufweisen. Ein "C-termi nales Amid" ist ein Amid am C-terminalen Aminosäurerest, wobei die α-Carbonsäure durch ein Amid ersetzt ist. Beispielsweise weisen C-terminale Aminosäureamidreste die Formel -NH-CH(R_a)-C(O)-NR_bR_c auf. R_a steht für eine Aminosäureseitenkette. Eine Aminosäureseitenkette kann Wasserstoff, eine substituierte oder unsubstituierte aliphatische C₁-C₁₀-Gruppe oder eine substituierte oder unsubstituierte aromatische C₁-C₁₀-Gruppe sein. Vorzugsweise ist R_a eine Aminosäureseitenkette, die natürlich vorkommenden Aminosäuren entspricht. R_b und R_c stehen unabhängig voneinander für Wasserstoff, eine substituierte oder unsubstituierte aliphatische C₁-C₁₀-Gruppe, oder R_b und R_c bilden zusammengenommen mit dem Stickstoff, an den sie gebunden sind, eine nicht-aromatische heterocyclische C₁-C₁₀-Gruppe_. Vorzugsweise ist das C-terminale Amid -C(O)NH₂ (Carboxamid). Das hierin verwendete "-NH₂" am C-Terminus zeigt C-Terminus-Carboxamid an; "-OH" am C-Terminus zeigt an, dass das Peptid einen freien C-Terminus aufweist; und keine Bezeichnung am C-Terminus zeigt an, dass das Peptid am C-Terminus amidiert ist oder einen freien C-Terminus aufweist.
Selbstverständlich können die hierin offenbarten Thrombinpeptidderivate einen acylierten N-Terminus aufweisen. Ein "acylierter N-Terminus" ist ein N-terminaler Aminosäurerest, in dem der Stickstoff des N-terminalen Aminosäurerests acyliert ist. Beispielsweise weisen acylierte N-terminale Aminosäurereste die Formel R_dC(O)-NH-CHR_a-C(O)- auf. R_d steht für Wasserstoff, eine substituierte oder unsubstituierte aliphatische C₁-C₁₀-Gruppe oder eine substituierte oder unsubstituierte aromatische C₁-C₁₀-Gruppe. Acetyl ist eine bevorzugte Acylgruppe. "-H" am N-Terminus zeigt an, dass der N-Terminus unsubstituiert ist; und keine Bezeichnung am N-Terminus zeigt an, dass der Terminus acyliert oder unsubstituiert ist.
Vorzugsweise ist der N-Terminus eines Thrombinpeptidderivats frei (d. h. unsubstituiert) und der C-Terminus frei (d. h. unsubstituiert) oder amidiert, vorzugsweise ein Carboxamid (d. h. -C(O)NH₂).
Es wird angenommen, dass Thrombinpeptidderivate Zellen durch Binden an einen Zelloberflächenthrombinrezeptor hoher Affinität, der als der nicht-proteolytisch-aktivierte Thrombinrezeptor (im Folgenden "NPAR") bekannt ist, aktivieren (R. Horvat et al., J. Cell Sci. 108, 1155–1164, 1995). Verbindungen, die NPAR stimulieren, werden als Thrombinrezeptoragonisten bezeichnet. Die NPAR-Aktivierung kann auf der Basis der Fähigkeit von Molekülen, Zellproliferation zu stimulieren, wenn sie zu Fibroblasten in Gegenwart von submitogenen Konzentrationen von Thrombin oder Molekülen, die Proteinkinase C aktivieren oder mit ¹²⁵I-Thrombin um die Bindung an Thrombinrezeptoren mit hoher Affinität konkurrieren, gegeben werden, getestet werden, gemäß der Offenbarung in US-Patent 5 352 664 und 5 500 412 und in Glenn et al., J. Peptide Research 1:65 (1988).
Thrombinpeptidderivate stimulieren NPAR und sie weisen weniger als 50 Aminosäuren, vorzugsweise weniger als 33 Aminosäuren auf. Thrombinpeptidderivate weisen auch so ausreichende Homologie zu dem Fragment von humanem Thrombin, das den Prothrombin-Aminosäuren 508–530: Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val (SEQ ID NO: 3) entspricht, auf, dass das Polypeptid NPAR aktiviert. Die hierin beschriebenen Thrombinpeptidderivatdimere werden aus Polypeptiden gebildet, die typischerweise mindestens 6 Aminosäuren und vorzugsweise zwischen 12 und 33 Aminosäuren, noch besser zwischen 12 und 23 Aminosäuren aufweisen.
In einer ersten bevorzugten Ausführungsform umfasst jedes Thrombinpeptidderivat ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 4: Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-X₁-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X₂-Val oder ein C-terminal verkürztes Fragment derselben mit mindestens 6 Aminosäuren. Noch günstiger weist jedes Thrombinpeptidderivat die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 5: Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val oder ein Fragment derselben, das die Aminosäuren 10–18 von SEQ ID NO: 5 umfasst, auf. Noch besser weist das Thrombinpeptidderivat die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 6: Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-X₁-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X₂-Val oder ein Fragment derselben, das die Aminosäuren 10–18 von SEQ ID NO: 6 umfasst, auf. X₁ steht für Glu oder Gln und X₂ für Phe, Met, Leu, His oder Val. Vorzugsweise steht X₁ für Glu und X₂ für Phe. Ein Beispiel für ein Thrombinpeptidderivat dieses Typs ist ein Polypeptid mit Aminosäuresequenz Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val (SEQ ID NO: 3). Ein weiteres Beispiel für ein Thrombinpeptidderivat dieses Typs ist ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz H-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-NH₂ (SEQ ID NO: 1). Null, eine, zwei oder drei Aminosäuren in dem Thrombinpeptidderivat unterscheiden sich von der Aminosäure an der entsprechenden Position von SEQ ID NO: 1, 3, 4, 5 oder 6. Vorzugsweise ist der Unterschied konservativ.
Ein Beispiel für ein Thrombinpeptidderivatdimer der vorliegenden Erfindung wird durch die Formel I dargestellt:
In einer zweiten bevorzugten Ausführungsform umfasst jedes Thrombinpeptidderivat ein Polypeptid mit der Aminosäure sequenz SEQ ID NO: 7: Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-Met-Lys-Ser-Pro-Phe-Asn-Asn-Arg-Trp-Tyr oder ein C-terminal verkürztes Fragment desselben mit mindestens 23 Aminosäuren. Noch günstiger weist jedes Thrombinpeptidderivat die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 8: Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-X₁-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X₂-Val-Met-Lys-Ser-Pro-Phe-Asn-Asn-Arg-Trp-Tyr oder ein C-terminal verkürztes Fragment desselben mit mindestens 23 Aminosäuren auf. X₁ steht für Glu oder Gln und X₂ für Phe, Met, Leu, His oder Val. Vorzugsweise steht X₁ für Glu und X₂ für Phe. Ein Beispiel für ein Thrombinpeptidderivat dieses Typs ist ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-Met-Lys-Ser-Pro-Phe-Asn-Asn-Arg-Trp-Tyr (SEQ ID NO: 9). Ein weiteres Beispiel für ein Thrombinpeptidderivat dieses Typs ist ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz H-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-Met-Lys-Ser-Pro-Phe-Asn-Asn-Arg-Trp-Tyr-NH₂ (SEQ ID NO: 10). Null, eine, zwei oder drei Aminosäuren in dem Thrombinpeptidderivat unterscheiden sich von der Aminosäure an der entsprechenden Position von SEQ ID NO: 7, 8, 9 oder 10. Vorzugsweise ist der Unterschied konservativ.
Eine "konservative Substitution" ist der Austausch einer Aminosäure durch eine andere Aminosäure, die die gleiche Nettoelektronenladung und etwa die gleiche Größe und Form aufweist. Aminosäuren mit aliphatischen oder substituierten aliphatischen Aminosäureseitenketten weisen etwa die gleiche Größe auf, wenn die Gesamtzahl der Kohlenstoff- und Heteroatome in deren Seitenketten sich um nicht mehr als etwa vier unterscheidet. Sie weisen etwa die gleiche Form auf, wenn die Zahl der Verzweigungen in deren Seitenketten sich um nicht mehr als eines unterscheidet. Aminosäuren mit Phenyl- oder substituierten Phenylgruppen in deren Seitenketten werden als etwa die gleiche Größe und Form aufweisend be trachtet. Im Folgenden werden fünf Gruppen von Aminosäuren aufgelistet. Der Austausch einer Aminosäure in einem Polypeptid durch eine andere Aminosäure aus der gleichen Gruppe führt zu einer konservativen Substitution:

Gruppe I: Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Serin, Threonin, Cystein und nicht natürlich vorkommende Aminosäuren mit aliphatischen C1-C4- oder hydroxylsubstituierten aliphatischen C1-C4-Seitenketten (geradkettig oder monoverzweigt).
Gruppe II: Glutaminsäure, Asparaginsäure und nicht natürlich vorkommende Aminosäuren mit carbonsäuresubstituierten aliphatischen C1-C4-Seitenketten (unverzweigt oder ein Verzweigungspunkt).
Gruppe III: Lysin, Ornithin, Arginin und nicht natürlich vorkommende Aminosäuren mit amin- oder guanidinosubstituierten aliphatischen C1-C4-Seitenketten (unverzweigt oder ein Verzweigungspunkt).
Gruppe IV: Glutamin, Asparagin und nicht natürlich vorkommende Aminosäuren mit amidsubstituierten aliphatischen C1-C4-Seitenketten (unverzweigt oder ein Verzweigungspunkt).
Gruppe V: Phenylalanin, Phenylglycin, Tyrosin und Tryptophan.

Eine "hoch konservative Substitution" ist der Austausch einer Aminosäure durch eine andere Aminosäure, die die gleiche funktionelle Gruppe in der Seitenkette und nahezu die gleiche Größe und Form aufweist. Aminosäuren mit aliphatischen oder substituierten aliphatischen Aminosäureseitenketten weisen nahezu die gleiche Größe auf, wenn die Gesamtzahl der Kohlenstoff- und Heteroatome in deren Seitenketten sich um nicht mehr als zwei unterscheidet. Sie weisen nahezu die gleiche Form auf, wenn sie die gleiche Zahl von Verzweigungen in ihren Seitenketten aufweisen. Beispiele für hoch konservative Substitutionen umfassen Valin für Leucin, Threonin für Serin, Asparaginsäure für Glutaminsäure und Phenylglycin für Phenylalanin. Beispiele für Substitutionen, die nicht hoch konservativ sind, umfassen Alanin für Valin, Alanin für Serin und Asparaginsäure für Serin.
Ein "N-terminal verkürztes Fragment" bezeichnet ein Fragment, das nach Entfernen von einer Aminosäure oder einem Block von Aminosäuren vom N-Terminus, vorzugsweise einem Block von nicht mehr als sechs Aminosäuren, noch besser einem Block von nicht mehr als drei Aminosäuren verbleibt. Optional ist ein N-terminal verkürztes Fragment wie oben beschrieben acyliert und/oder amidiert.
Ein "C-terminal verkürztes Fragment" bezeichnet ein Fragment, das nach Entfernen von einer Aminosäure oder einem Block von Aminosäuren vom C-Terminus, vorzugsweise einem Block von nicht mehr als sechs Aminosäuren, noch besser einem Block von nicht mehr als drei Aminosäuren verbleibt. Optional ist ein C-terminal verkürztes Fragment wie oben beschrieben amidiert und/oder acyliert.
Die hierin verwendete "nicht-aromatische heterocyclische Gruppe" ist ein nicht-aromatisches carbocyclisches Ringsystem, das 3 bis 10 Atome aufweist und mindestens ein Heteroatom, wie Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel, umfasst. Beispiele für nicht-aromatische heterocyclische Gruppen umfassen Piperazinyl, Piperidinyl, Pyrrolidinyl, Morpholinyl und Thiomorpholinyl.
Der hierin verwendete Ausdruck "Arylgruppe" umfasst sowohl carbocyclische als auch heterocyclische aromatische Ringsysteme. Beispiele für Arylgruppen umfassen Phenyl, Indolyl, Furanyl und Imidazolyl.
Eine "aliphatische Gruppe" ist ein geradkettiger, verzweigter oder cyclischer nicht-aromatischer Kohlenwasserstoff. Eine aliphatische Gruppe kann vollständig gesättigt sein oder eine oder mehrere Nichtsättigungseinheiten (beispielsweise Doppel- und/oder Dreifachbindungen) enthalten, doch ist sie vorzugsweise gesättigt, d. h. eine Alkylgruppe. Typischerweise weist eine geradkettige oder verzweigte aliphatische Gruppe 1 bis 10 Kohlenstoffatome, vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatome auf und eine cyclische aliphatische Gruppe 3 bis 10 Kohlenstoffatome, vorzugsweise 3 bis 8 Kohlenstoffatome auf. Aliphatische Gruppen umfassen beispielsweise Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, sek-Butyl, tert-Butyl, Pentyl, Cyclopentyl, Hexyl, Cyclohexyl, Octyl und Cyclooctyl.
Geeignete Substituenten für eine aliphatische Gruppe, eine Arylgruppe oder eine nicht-aromatische heterocyclische Gruppe sind diejenigen, die die therapeutische Aktivität des Thrombinpeptidderivats nicht signifikant verringern, beispielsweise diejenigen, die an natürlich vorkommenden Aminosäuren gefunden werden. Beispiele umfassen -OH, ein Halogen (-Br, -Cl, -I und F), -O(R_e), -O-CO-(R_e), -CN, -NO₂, -COOH, =O, -NH₂, -NH(R_e), -N(R_e)₂, -COO(R_e), -CONH₂, -CONH(R_e), -CON(R_e)₂, -SH, -S(R_e), eine aliphatische Gruppe, eine Arylgruppe und eine nicht-aromatische heterocyclische Gruppe. Jedes R_e steht unabhängig voneinander für eine Alkylgruppe oder eine Arylgruppe. Eine substituierte aliphatische Gruppe kann mehr als einen Substituenten aufweisen.
Ein "Subjekt" ist vorzugsweise ein Mensch, doch kann es auch ein Tier mit Bedarf an einer Behandlung mit einem Thrombinrezeptoragonisten, beispielsweise Begleitertiere (beispielsweise Hunde, Katzen und dergleichen), Hoftiere (beispielsweise Kühe, Schweine, Pferde und dergleichen) und Labortiere (beispielsweise Ratten, Mäuse, Meerschweinchen und dergleichen), sein.
Subjekte "mit Bedarf an einer Behandlung" mit einem Thrombinrezeptoragonisten sind Subjekte mit Erkrankungen und/oder Zuständen, die mit Thrombinrezeptoragonisten und Thrombinpeptidderivatdimeren unter Erreichen eines vorteilhaften therapeutischen und/oder prophylaktischen Ergebnisses behandelt werden können. Ein vorteilhaftes Ergebnis umfasst eine Verringerung der Schwere von Symptomen oder eine Verzögerung des Einsetzens von Symptomen, erhöhte Lebensdauer und/oder eine schnellere oder vollständigere Aufhebung der Erkrankung oder des Zustands. Beispielsweise benötigt ein Subjekt mit Bedarf an einer Behandlung Zellproliferation, die Chondrozyten umfasst, Angiogenese, Knochenwachstum, Herzreparatur, Wundheilung oder die Hemmung von Restenose.
Es wurde gezeigt, dass Thrombinpeptidderivate die Proliferation von Endothelzellen, Fibroblasten und Keratinozyten stimulieren (siehe beispielsweise US-Patent 5 500 412 oder 5 352 664 ). Die offenbarten Thrombinpeptidderivatdimere können daher zur Förderung der Heilung bei akuten Wunden, wie Verbrennungen, Hautwunden, Operationswunden und Knochenbrüchen, verwendet werden. Ferner wurde vor kurzem gezeigt, dass Thrombinpeptidderivate besonders wirksam bei der Förderung der Heilung von chronischen Wunden, wie diabetischen Ulcera, venösen Ulcera und Dekubitus, sind (siehe beispielsweise WO 03/013569 , dessen Inhalt hierin als Bezug in dessen Gesamtheit aufgenommen ist). Es wurde auch gezeigt, dass Thrombinpeptidderivate das Wachstum von Chondrozyten stimulieren (siehe beispielsweise WO 02/07748 , dessen Inhalt hierin als Bezug in dessen Gesamtheit aufgenommen ist). Daher können Thrombinpeptidderivate, die die Verbindungen der vorliegenden Erfindung umfassen, zur Stimulation von Chondrozytenwachstum und -wiederherstellung bei beispielsweise Patienten mit Osteoarthritis oder Gelenkläsionen verwendet werden. Andere Verwendungsmöglichkeiten für Thrombinpeptidderivate, die diejenigen der vorliegenden Erfindung umfassen, umfassen die Stimulation von Knochenwachstum zur Förderung der Heilung von einfachen Brüchen, Pseudoarthrose, Hohlräumen und Lücken in Knochen und Knochentransplantaten, Verhinderung von Restenose bei Patienten nach einer Angioplastik und Förderung der Regeneration von Blutgefäßen in Herzgewebe (siehe beispielsweise WO 02/005836 und WO 02/004008 ).
Eine "wirksame Menge" ist die Menge eines Thrombinpeptidderivatdimers, die zu einem verbesserten klinischen Ergebnis des mit dem Thrombinpeptidderivatdimer zu behandelnden Zustands im Vergleich mit dem Fehlen einer Behandlung führt. Die verabreichte Menge des Thrombinpeptidderivatdimers hängt von dem Grad, der Schwere und der Art der Erkrankung oder des Zustands, dem Grad der gewünschten Therapie und den Freisetzungseigenschaften der pharmazeutischen Formulierung ab. Sie hängt auch von der Gesundheit, Größe, dem Gewicht, Alter, Geschlecht und der Arzneistofftoleranz des Subjekts ab. Typischerweise wird der Agonist über einen zum Erreichen der gewünschten therapeutischen Wirkung ausreichenden Zeitraum verabreicht. Typischerweise werden zwischen etwa 1 μg pro Tag und etwa 1 mg pro Tag (vorzugsweise zwischen etwa 5 μg pro Tag und etwa 100 μg pro Tag) des Thrombinpeptidderivats dem Subjekt mit Bedarf an einer Behandlung verabreicht.
Das Thrombinpeptidderivatdimer kann auf jedem geeigneten Weg, lokal oder systemisch, was beispielsweise parenterale Verabreichung umfasst, verabreicht werden. Parenterale Verabreichung kann beispielsweise intramuskuläre, intravenöse, subkutane oder intraperitoneale Injektion umfassen. Topische Verabreichung zur Behandlung von Wunden kann beispielsweise Cremes, Gele, Salben oder Aerosole umfassen. Eine Atemwegsverabreichung kann beispielsweise Inhalation oder Nasentropfen umfassen. Für bestimmte Indikationen, wie Stimulation von Knochenwachstum, Knorpelwiederherstellung, Herzwiederherstellung und Behandlung von Restenose, ist es vorteilhaft, das Thrombinpeptidderivat direkt an der Behandlungsstelle zu injizieren oder zu implantieren. Das Thrombinpeptidderivatdimer kann auch in vorteilhafter Weise in einer Formulierung mit nachhaltiger Freisetzung verabreicht werden.
Das Thrombinpeptidderivatdimer kann dem Subjekt in Verbindung mit einem akzeptablen pharmazeutischen Träger als Teil einer pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht werden. Die Formulierung der pharmazeutischen Zusammensetzung variiert entsprechend dem gewählten Verabreichungsweg. Geeignete pharmazeutische Träger können inerte Bestandteile, die mit der Verbindung nicht Wechselwirken, enthalten. Die Träger sollten biologisch kompatibel, d. h. nicht-toxisch, nicht-inflammatorisch, nicht-immunogen und frei von anderen unerwünschten Reaktionen an der Verabreichungsstelle, sein. Beispiele für pharmazeutisch akzeptable Träger umfassen beispielsweise Kochsalzlösung, Aerosole, im Handel erhältliche inerte Gele oder Flüssigkeiten, die mit Albumin ergänzt sind, Methylcelllulose oder eine Collagenmatrix. Pharmazeutische Standardformulierungstechniken können verwendet werden, beispielsweise diejenigen gemäß der Beschreibung in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA.
Für Indikationen wie Knochenwachstum, Knorpelwiederherstellung, Herzwiederherstellung und Hemmung von Restenose kann es vorteilhaft sein, das Thrombinpeptidderivat in einer Formulierung mit nachhaltiger Freisetzung zu verabreichen. Polymere werden häufig zur Bildung von Formulierungen mit nachhaltiger Freisetzung verwendet. Beispiele für diese Polymere umfassen Poly-α-hydroxyester, wie Polymilchsäure/Polyglykolsäure-Homopolymere und -Copolymere, Polyphosphazene (PPHOS), Polyanhydride und Poly(propylenfumarate).
Polymilchsäure/Polyglykolsäure(PLGA)-Homo- und -Copolymere sind einschlägig als Vehikel mit nachhaltiger Freisetzung bekannt. Die Freisetzungsrate kann durch den erfahrenen Techniker durch Variation des Verhältnisses von Polymilchsäure zu Polyglykolsäure und des Molekulargewichts des Po lymers eingestellt werden (siehe Anderson, et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 28:5 (1997), dessen gesamte Lehren hierin als Bezug aufgenommen sind). Die Einarbeitung von Poly(etylenglykol) in das Polymer als Gemisch zur Bildung von Mikroteilchenträgern ermöglicht eine weitere Änderung des Freisetzungsprofils des Wirkstoffs (siehe Cleek et al., J. Control Release 48:259 (1997), dessen gesamte Lehren hierin als Bezug aufgenommen sind). Keramiken, wie Calciumphosphat und Hydroxyapatit, können ebenfalls in die Formulierung zur Verbesserung mechanischer Eigenschaften eingearbeitet werden.
PPHOS-Polymere enthalten abwechselnd Stickstoff und Phosphor ohne Kohlenstoff in dem Polymergerüst, wie im Folgenden in Strukturformel (II) gezeigt ist:
Die Eigenschaften des Polymers können durch geeignete Variation der Seitengruppen R und R', die an das Polymergerüst gebunden sind, eingestellt werden. Beispielsweise kann der Abbau und die Arzneistofffreisetzung durch PPHOS durch Variation der Menge von hydrolytisch instabilen Seitengruppen gesteuert werden. Bei größerem Einbau von entweder imidazolyl- oder ethylglykolsubstituiertem PPHOS wird beispielsweise eine Zunahme der Abbaurate beobachtet (siehe Laurencin et al., J Biomed Mater. Res. 27:963 (1993)), wodurch die Rate der Arzneistofffreisetzung erhöht wird.
Polyanhydride, die in der Strukturformel (III) gezeigt sind, weisen klar definierte Abbau- und Freisetzungseigenschaften auf, die durch das Einarbeiten variierender Mengen von hydrophoben oder hydrophilen Monomeren, wie Sebacinsäure und 1,3-Bis(p-carboxyphenoxy)propan, gesteuert werden können (siehe Leong et al., J. Biomed. Mater. Res. 19:941 (1985)). Zur Verbesserung mechanischer Festigkeit werden Anhydride häufig mit Imiden unter Bildung von Polyanhydrid-co-imiden copolymerisiert. Beispiele für Polyanhydrid-co-imide, die für orthopädische Anwendungen geeignet sind, sind Poly(trimellitylimido-glycin-co-1,6-bis(carboxyphenoxy)hexan- und Pyromellitylimidoalanin:1,6-bis(p-carboxyphenoxy)hexan-Copolymere.
Träger zur Stimulation von Knochen- oder Knorpelwachstum umfassen vorteilhafterweise poröse Matrices, die dann als Gerüst für Knochen- und Gewebewachstum dienen können, auf das Knochenvorläuferzellen und osteogene Zellen wandern und sich daran anheften können. Derartige Träger werden als osteokonduktiv bezeichnet. Für bestimmte Anwendungen sollte der Träger ausreichende mechanische Festigkeit aufweisen, um dessen dreidimensionale Struktur beizubehalten und die Immobilisierung der Knochen- oder Gewebesegmente, die vereinigt oder zusammengepfropft werden sollen, zu unterstützen.
Beispiele für geeignete osteokonduktive Träger umfassen Collagen (beispielsweise Rindercollagen), Fibrin, Calciumphosphat, Keramiken (beispielsweise Hydroxyapatit und Tricalciumphosphat), Calciumsulfat, guanidinextrahierten allogenen Knochen und Kombinationen derselben. Eine Zahl geeigneter Träger ist im Handel erhältlich, beispielsweise COLLAGRAFT^® (Cohension Technologies, Inc., Palo Alto, CA), das ein Gemisch aus Hydroxyapatit, Tricalciumphosphat und fibrillärem Collagen ist, und PRO OSTEON 500^TM (Interpore Cross International, Irvine, CA), das eine Hydroxyapatitbiomatrix ist, die durch die Umwandlung von Calciumcarbonat von Meereskorallen in kristallines Hydroxyapatit gebildet wurde.
Beschreibungen synthetischer biologisch abbaubarer Polymere, die als osteokonduktive Träger mit Eigenschaften nachhaltiger Freisetzung dienen können, können in Behravesh et al., Clinical Orthopaedics 367:5118 (1999) und Lichun et al., Polymeric Delivery Vehicles for Bone Growth Factors in "Controlled Drug Delivery – Designing Technologies for the Future" Park und Mrsny, Hrsg., American Chemical Society, Washington, DC (2000), gefunden werden. Beispiele für diese Polymere umfassen Poly-α-hydroxyester, wie Polymilchsäure/Polyglykolsäure-Homopolymere und -Copolymere, Polyphosphazene (PPHOS), Polyanhydride und Poly(propylenfumarate), die oben detailliert beschrieben sind.
Implantierbare pharmazeutische Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind besonders günstig, da sie an einer Stelle, die Knochenwachstum benötigt, verabreicht werden können. "Implantation" oder "Verabreichung an einer Stelle" bedeutet in ausreichender Nähe zu der eine Behandlung benötigenden Stelle, so dass Knochenwachstum an der Stelle erfolgt (beispielsweise mehr Knochenwachstum in Gegenwart des Arzneistoffs als bei dessen Fehlen), wenn das Thrombinpeptidderivatdimer aus der pharmazeutischen Zusammensetzung freigesetzt wird. Diese pharmazeutischen Zusammensetzungen können nach Wunsch in Vorwegnahme der Operation geformt werden oder durch den Arzt oder Techniker während einer Operation geformt werden. Vorzugsweise wird die Matrix derart geformt, dass ein Gewebedefekt überspannt wird und sie die gewünschte Form des neuen Gewebes erhält. Im Falle von Knochenwiederherstellung eines Pseudoarthrosedefekts ist es beispielsweise günstig, Abmessungen zu verwenden, die die Pseudoarthrose überspannen. Bei Knochenbildungsverfahren wird das Material langsam durch den Körper absorbiert und durch Knochen in der Form von oder sehr nahe der Form des Implantats ersetzt. Alternativ können die pharmazeutischen Zusammensetzungen an der Stelle in der Form von Mikroteilchen oder Mikrokügelchen verabreicht werden. Die Mikroteilchen werden in Kontakt oder in der Nähe zu der Stelle, die Osteokonduktion benötigt, entweder durch chirurgisches Freilegen der Stelle und Applizieren der Mikroteilchen an der oder in enger Nähe zu der Stelle durch Aufstreichen, Pipettieren, Sprühen, Injizieren oder dergleichen platziert. Mikroteilchen können der Stelle auch durch Endoskopie oder Laparoskopie zugeführt werden.
Poly(propylenfumarate) (PPF) sind hoch erwünschte biologisch kompatible implantierbare Träger zur Verwendung bei der Wiederherstellung von Knochendefekten, da sie ein injizierbares, in situ polymerisierbares, biologisch abbaubares Material sind. "Injizierbar" bedeutet, dass das Material durch eine Spritze durch eine Standardnadel, die zur Injektion von Pasten und Gelen verwendet wird, injiziert werden kann. PPF, das mit einem Vinylmonomer (N-Vinylpyrrolidinon) und einem Initiator (Benzoylperoxid) kombiniert ist, bildet eine injizierbare Lösung, die in situ polymerisiert werden kann. Es ist besonders geeignet zum Füllen von Skelettdefekten einer breiten Vielzahl von Größen und Formen (siehe Suggs et al., Macromolecules 30:4318 (1997), Peter et al., J. Biomater. Sci. Poly, Hrsg. 10:363 (1999), und Yaszemski et al., Tissue Eng. 1:41 (1995)). Die Zugabe von Festphasenkomponenten, wie β-Tricalciumphosphat und Natriumchlorid, kann die mechanischen Eigenschaften von PPF-Polymeren verbessern (siehe Peter et al., J. Biomed. Mater. Res. 44:314 (1999)).
In einer noch weiteren Alternative kann die pharmazeutische Zusammensetzung in eine tragende physikalische Struktur, wie ein Netz, eine Drahtmatrix, einen Edelstahlkäfig, einen Interbody Fusion Cage mit Gewinde und dergleichen vor Verab reichung an der Stelle, die Knochenwachstum benötigt, partiell eingeschlossen werden.
Injizierbare Abgabeformulierungen können intravenös oder direkt an der Stelle, die eine Behandlung benötigt, verabreicht werden. Der injizierbare Träger kann eine viskose Lösung oder ein Gel sein.
Zufuhrlösungen umfassen physiologische Kochsalzlösung, bakteriostatische Kochsalzlösung (Kochsalzlösung, die etwa 0,9% mg/ml Benzylalkohol enthält), phosphatgepufferte Kochsalzlösung, Hank-Lösung, Ringer-Lactat oder Flüssigkeiten, die mit Albumin, Methylcellulose oder Hyaluronsäure ergänzt sind. Injizierbare Matrices umfassen Polymere von Poly(ethylenoxid) und Copolymere von Ethylen und Propylenoxid (siehe Cao et al., J. Biomater. Sci 9:475 (1998), und Sims et al., Plast Reconstr. Surg. 98:843 (1996)).
Andere Zusammensetzungen, die injizierbare Matrices sind, umfassen die oben beschriebenen Lösungen von Poly(propylenfumarat)copolymeren und Pasten von Calciumphosphatkeramiken (siehe Schmitz et al., J. Oral Maxillofacial Surgery 57:1122 (1999)). Injizierbare Matrices können direkt an der Stelle, die Knochenwachstum benötigt, injiziert werden und günstigerweise zum Füllen von Hohlräumen und Fusionieren von Knochen ohne die Notwendigkeit eines invasiven Eingriffs verwendet werden.
Verfahren zur Verkapselung von Zusammensetzungen (beispielsweise in einem Überzug aus Hartgelatine oder Cyclodextran) sind einschlägig bekannt (Baker et al., "Controlled Release of Biological Active Agents", John Wiley and Sons, 1986).
Salben werden typischerweise unter Verwendung einer ölhaltigen Grundlage, die beispielsweise Fettöle oder Kohlenwasserstoffe, wie weiße Vaseline oder Mineralöl, enthält, oder einer absorbierenden Grundlage, die beispielsweise aus einer absorbierenden wasserfreien Substanz oder absorbierenden wasserfreien Substanzen, beispielsweise wasserfreiem Lanolin, besteht, hergestellt. Nach der Bildung der Grundlage werden die Wirkstoffe in der gewünschten Konzentration zugegeben.
Cremes umfassen allgemein eine Ölphase (innere Phase), die typischerweise Fettöle, Kohlenwasserstoffe und dergleichen, wie Wachse, Vaseline, Mineralöl und dergleichen enthält, und eine wässrige Phase (kontinuierliche Phase), die Wasser und beliebige wasserlösliche Substanzen, wie zugesetzte Salze, umfasst. Die zwei Phasen werden durch Verwendung eines Emulgators, beispielsweise eines oberflächenaktiven Mittels, wie Natriumlaurylsulfat; hydrophile Kolloide, wie Akaziengummi, kolloide Tone, Bienenwachs und dergleichen, stabilisiert. Bei Bildung der Emulsion werden die Wirkstoffe in der gewünschten Konzentration zugegeben.
Gele bestehen aus einer Grundlage, die aus einer ölhaligen Grundlage, Wasser oder einer Emulsionssuspensionsgrundlage, die zuvor beschrieben sind, ausgewählt ist. Zu der Grundlage wird ein Geliermittel gegeben, das in der Grundlage eine Matrix bildet, wobei deren Viskosität zu einer halbfesten Konsistenz erhöht wird. Beispiele für Geliermittel sind Hydroxypropylcellulose, Acrylsäurepolymere und dergleichen. Die Wirkstoffe werden zu der Formulierung in der gewünschten Konzentration an einem Punkt vor der Zugabe des Geliermittels gegeben.
Erkrankungen und Zustände, die mit Thrombinpeptidderivatdimeren behandelbar sind, beispielsweise Wunden und Angioplastik, werden häufig von Symptomen und Krankheitserscheinungen, wie Schmerz und Infektion, begleitet. In bestimmten Fällen kann es vorteilhaft sein, ein oder mehrere zusätzliche pharmakologisch aktive Mittel zusammen mit dem Thrombinpeptidderivatdimer gleichzeitig zu verabreichen, um derartige Probleme zu behandeln. Beispielsweise kann eine Behandlung von Schmerz und Entzündung die Coverabreichung mit Analgetika oder entzündungshemmenden Mitteln erfordern. Die Behandlung einer Infektion kann die Coverabreichung mit antimikrobiellen Mitteln, Antibiotika oder Desinfektiva erfordern.
Thrombinpeptidderivate können durch ein Festphasenpeptidsyntheseverfahren (beispielsweise BOC- oder FMOC-Verfahren), durch Lösungsphasensynthese oder durch andere geeignete Techniken, die Kombinationen der im Vorhergehenden genannten Verfahren umfassen, synthetisier werden. Die BOC- und FMOC-Verfahren, die bekannt sind und in weitem Umfang verwendet werden, sind in Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 88:2149 (1963); Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides, C. H. Li, Hrsg., Academic Press, 1983, S. 48–267; und Barany und Merrifield, in The Peptides, E. Gross und J. Meienhofer, Hrsg., Academic Press, New York, 1980, S. 3–285, beschrieben. Verfahren der Festphasenpeptidsynthese sind in R. B. Merrifield, Science, 232:341 (1986); L. A. Carpino und G. Y. Han, J. Org. Chem., 37:3404 (1972); und H. Gauspohl et al., Synthesis, 5:315 (1992), beschrieben.
Thrombinpeptidderivatdimere können durch Oxidation des Monomers hergestellt werden. Thrombinpeptidderivatdimere können durch Umsetzung des Thrombinpeptidderivats mit einem Überschuss eines Oxidationsmittels hergestellt werden. Ein bekanntes geeignetes Oxidationsmittel ist Iod. Spezielle Bedingungen sind in den Beispielen 1 und 2 angegeben.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert, die in keinster Weise beschränkend sein sollen.
Beispiele
Beispiel 1. Bildung von Thrombinpeptiddimer
TP508 wurde in einer Lösung von sechs Teilen Essigsäure und einem Teil Wasser gelöst. Ein zehnfacher molarer Über schuss an Iod wurde zugegeben und die Reaktion wird 90 min bei Raumtemperatur unter Rühren ablaufen gelassen. Oberschüssiges Iod wurde durch Extraktion mit CCl₄ (3- bis 4-mal) entfernt. Das dimerisierte Peptid wurde durch HPLC auf einer C18-Umkehrphasensäule zur Entfernung nicht-umgesetzter Monomere gereinigt.
Beispiel 2. TP508-Dimer
Umwandlung von TP508 in das Dimer über die Zeit TP508 wurde mit 5 mg/ml in Kochsalzlösung (sterile 0,9 %ige injizierbare Natriumchloridlösung) gelöst und bei 4°C inkubiert. Über einen Zeitraum von 6 Monaten wurden in Abständen aus der Lösung dreifache Proben entnommen. Die Proben wurden durch HPLC unter Trennung von TP508-Monomer, TP508-Dimer und unbekannten Stoffen analysiert. Die Peakfläche des TP508-Dimers zeigte nach 3 Monaten keine Abnahme über die Zeit. Keine Zunahme der unbekannten Peaks wurde beobachtet. Die Ergebnisse von 1 zeigen, dass sich das TP508-Dimer über die Zeit nicht in das Monomer zurückumwandelt.
Die Flächenprozent der einzelnen HPLC-Peaks wurden in 1 aufgetragen. Der Peakflächenprozentsatz entspricht direkt dem Prozentsatz des Materials in der Lösung. Die Peakfläche des TP508-Monomers nahm über die Zeit ab, während die Peakfläche des TP508-Dimers über die Zeit zunahm. Keine Zunahme der unbekannten Peaks wurde beobachtet. Die Ergebnisse von 1 zeigen, dass sich TP508 über die Zeit in das Dimer umwandelt.
Das TP508-Dimer wandelt sich über die Zeit nicht in das Monomer um.
Die Peakfläche des TP508-Dimers zeigte nach drei Monaten keine Verringerung über die Zeit. Keine Zunahme unbekannter Peaks wurde beobachtet. Die Ergebnisse von 1 zeigen, dass sich das TP508-Dimer über die Zeit nicht in das Monomer zurückumwandelt.
Beispiel 3. Wundheilungsaktivität des Thrombinpeptiddimers Methodik und Untersuchungsgestaltung
Aufgabe dieser Untersuchung war die Beurteilung der Wundheilungsaktivität der dimerisierten Form des Thrombinpeptids TP508. Die Untersuchung stellte die Wirkung des Thrombinpeptiddimers auf den Wundverschluss fest.
Zwei Schnitte voller Dicke eines Durchmessers von 2 cm wurden auf dem Rücken von männlichen Sprague-Dawley-Ratten erzeugt. Beide Wunden an einer gegebenen Ratte wurden zusammen mit entweder Vehikel mit einer niedrigen Dosis eines Thrombinpeptidimers, Vehikel mit einer hohen Dosis eines Thrombinpeptiddimers, Vehikel allein (negative Kontrolle) oder Vehikel mit TP508 (positive Kontrolle) behandelt, wobei insgesamt vier Behandlungsgruppen erhalten wurden. Jede Gruppe enthielt 6 Ratten. Die Aktivitäten der hohen und der niedrigen Dosis eines Thrombinpeptiddimers wurden mit Vehikel allein und mit TP508 verglichen. Die Wundengröße wurde an den Tagen 3, 7 und 10 nach der Verwundung durch Übertragen des Perimeters der Wunde auf eine Acetatfolie und Verwendung von Digitalanalyse zur Berechnung der Oberfläche der einzelnen Wunde bestimmt.
Herstellung von Behandlungslösungen
Kochsalzlösung
D-Mannit (20 mg) wurde in 12,5 ml Kochsalzlösung (sterile 0,9 %ige injizierbare Natriumchloridlösung) gelöst, wobei eine Lösung von 8,9 mM D-Mannit in Kochsalzlösung erhalten wurde. Diese Lösung wurde als Vehikelkontrolle für dieses Experiment verwendet.
P508-Lösung
Lyophilisiertes TP508 (1 mg) wurde in 1 ml des D-Mannit/Kochsalzlösung-Vehikels gelöst. Die Stammlösung (1 mg/ml) wurde ferner in Vehikel verdünnt, wobei eine Arbeitslösung von 2,5 μg/ml erhalten wurde. Die Arbeitslösung wurde während des Experiments auf Eis gehalten.
Thrombinpeptiddimerlösung
Hohe Dosis
TP508 (12,5 μg) und 2 mg D-Mannit wurden in 1,25 ml Kochsalzlösung (ohne D-Mannit) gelöst, wobei eine Stammlösung von 10 μg TP508 pro ml von 8,9 mM D-Mannit in Kochsalzlösung erhalten wurde. Die Stammlösung wurde direkt als die hohe Behandlungsdosis verwendet (0,4 μg pro 40 μl pro Wunde). Die Stammlösung wurde während des Experiments auf Eis gehalten.
Niedrige Dosis
Die niedrige Behandlungsdosis wurde durch weitere Verdünnung der Stammdimerlösung in dem D-Mannit/Kochsalzlösungsvehikel unter Bildung einer Arbeitslösung von 2,5 μg pro ml hergestellt (0,1 μg pro 40 μl pro Wunde). Die Arbeitslösung wurde während des Experiments auf Eis gehalten.
Wundbehandlung
Beide Wunden an einem gegebenen Tier erhielten die gleiche Behandlung: eine einzige topische Applikation eines Volumens von 40 μl, das Vehikel allein, Vehikel mit TP508 (0,1 μg/ml) oder Vehikel mit Thrombinpeptiddimer (0,1 μg/ml oder 0,4 μg/ml) enthielt.
Beobachtungen und Wundgrößenanalyse
Die Ratten wurden 10 Tage nach der Verwundung beobachtet und es wurden keine klinischen Zeichen von anomalem Verhalten, einer Infektion oder Toxizität festgestellt. An den Tagen 3, 7 und 10 nach der Verwundung wurden die Wunden durch Übertragen des Wundenperimeters auf eine flexible Acetatfolie, dann Bestimmen der Wundfläche mit Digitalanalysesoftware beurteilt.
Die Ergebnisse des Experiments sind in 2 angegeben. 2 zeigt Wundflächenmessungen von Tag 7 und Tag 10 nach der Verwundung. Keine Unterschiede der Wundengröße zwischen den Gruppen waren am Tag 3 nach der Verwundung vorhanden. Jeder Datenpunkt stellt den Mittelwert und die Standardabweichung des Mittelwerts von 12 Wunden von 6 Ratten dar. Statistische Vergleiche zwischen Gruppen erfolgten unter Verwendung der Varianzanalyse wiederholter Messungen; Fischer-LSD wurde für Post-Hoc-Tests zwischen Gruppen verwendet.
In diesem Experiment ergaben sowohl TP508 als auch Thrombinpeptiddimer signifikant kleinere Wunden als Vehikel allein am Tag 7 nach der Verwundung. TP508-behandelte Wunden wiesen eine 21,3% kleinere Fläche als Vehikelkontrollen auf, während mit der gleichen Dosis von Thrombinpeptiddimer (0,1 μg pro Wunde) behandelte Wunden eine 29,2% kleinere Fläche als Vehikelkontrollen aufwiesen. Der Unterschied zwischen TP508- und Thrombinpeptiddimerbehandlungen war statistisch nicht signifikant.
Am Tag 10 wie auch am Tag 7 ergaben TP508 und beide Dosen von Thrombinpeptiddimer Wunden, die signifikant kleiner als die der Kontrollen waren. Ferner wurde ein statistisch signifikanter Unterschied am Tag 10 zwischen der TP508-behandelten Gruppe und den mit dem Thrombinpeptiddimer behandelten Gruppen ermittelt (p < 0,05). Am Tag 10 waren TP508- behandelte Wunden von 23,1% kleinerer Fläche als Vehikelkontrollen, während mit der gleichen Dosis von Thrombinpeptiddimer (0,1 μg pro Wunde) behandelte Wunden eine 41,4% kleinere Fläche als Vehikelkontrollen aufwiesen.
In der Gruppe niedriger Dosis wurde das Thrombinpeptiddimer mit einem zur TP508-Gruppe äquivalenten Gewicht verabreicht. Das heißt, jede dieser Gruppen erhielt 0,1 μg Peptid pro Wunde, was dazu führte, dass in diesen zwei Gruppen die halbe Molzahl von Dimeren gegenüber Monomeren Wunden verabreicht wurde.
Die Ergebnisse zeigten, dass das Thrombinpeptiddimer in Bezug auf eine Beschleunigung des Wundverschlusses biologisch aktiv ist. Im Hinblick auf den "Wundverschluss" ergab das Thrombinpeptiddimer eine statistisch signifikante Wirkung auf die Heilung, die der Wirkung von TP508 äquivalent war.
Zwar wurde diese Erfindung unter Bezug auf bevorzugte Ausführungsformen derselben speziell angegeben und beschrieben, doch es ist klar, dass der Umfang der Erfindung von den angehängten Ansprüchen umfasst wird.
Sequenzprotokoll

Claims

Peptiddimer, das zwei Thrombinpeptidderivate umfasst, wobei jedes Thrombinpeptidderivat weniger als fünfzig Aminosäuren aufweist, wobei die Thrombinpeptidderivate unabhängig voneinander den nicht-proteolytisch-aktivierten Thrombinrezeptor (NPAR) stimulieren und ein Polypeptid, das aus der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 (Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val) oder einem C-terminal verkürzten Fragment derselben mit mindestens sechs Aminosäuren besteht, wobei null, eine, zwei oder drei Aminosäuren in dem Polypeptid von der entsprechenden Position von SEQ ID NO: 2 verschieden sind, umfassen; wobei die Thrombinpeptidderivate optional ein C-terminales Amid umfassen und die Thrombinpeptidderivate optional einen acylierten N-Terminus umfassen, wobei das Dimer im Wesentlichen frei von einem Monomer ist.
Dimer nach Anspruch 1, wobei die Thrombinpeptidderivate die gleichen sind.
Dimer nach Anspruch 2, wobei die Thrombinpeptidderivate über eine Disulfidbindung kovalent verbunden sind.
Dimer nach Anspruch 3, wobei die Thrombinpeptidderivate aus zwischen 12 und 23 Aminosäuren bestehen.
Dimer nach Anspruch 3, wobei die Thrombinpeptidderivate aus zwischen 12 und 33 Aminosäuren bestehen.
Dimer nach Anspruch 4 oder Anspruch 5, wobei die Thrombinpeptidderivate ein C-terminales Amid umfassen und optional einen acylierten N-Terminus umfassen, wobei das C-terminale Amid durch -C(O)NR_bR_c, worin R_b und R_c unabhängig voneinander für Wasserstoff, eine substituierte oder unsubstituierte aliphatische C₁-C₁₀-Gruppe stehen oder R_b und R_c zusammengenommen mit dem Stickstoff, an den sie gebunden sind, eine nicht-aromatische heterocyclische C₁-C₁₀-Gruppe bilden, dargestellt wird und die N-terminale Acylgruppe durch R_dC(O)-, worin R_d für Wasserstoff, eine substituierte oder unsubstituierte aliphatische C₁-C₁₀-Gruppe oder eine substituierte oder unsubstituierte aromatische C₁-C₁₀-Gruppe steht, dargestellt wird.
Dimer nach Anspruch 6, wobei die Thrombinpeptidderivate einen N-Terminus, der unsubstituiert ist, und einen C-Terminus, der unsubstituiert ist, oder ein C-terminales Amid, das durch -C(O)NH₂ dargestellt wird, umfassen.
Dimer nach Anspruch 7, wobei die Thrombinpeptidderivate ein Polypeptid umfassen, das aus der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 (Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val) oder einem C-terminal verkürzten Fragment derselben mit mindestens sechs Aminosäuren besteht, wobei null, eine oder zwei der Aminosäuren in dem Thrombinpeptidderivat konservative Substitutionen der entsprechenden Aminosäure in SEQ ID NO: 2 sind.
Dimer nach Anspruch 7, wobei die Thrombinpeptidderivate ein Polypeptid umfassen, das aus der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 4 (Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-X₁-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X₂-Val, worin X₁ Glu oder Gln ist und X₂ Phe, Met, Leu, His oder Val ist) besteht.
Dimer nach Anspruch 7, wobei die Thrombinpeptidderivate die Aminosäuresequenz Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly- Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val (SEQ ID NO: 5) oder ein Fragment derselben, das die Aminosäuren 10–18 von SEQ ID NO: 5 umfasst, aufweisen, wobei null, eine, zwei oder drei Aminosäuren in den Thrombinpeptidderivaten von der Aminosäure an der entsprechenden Position von SEQ ID NO: 5 verschieden sind.
Dimer nach Anspruch 7, wobei die Thrombinpeptidderivate die Aminosäuresequenz Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val (SEQ ID NO: 5) oder ein Fragment derselben, das die Aminosäuren 10–18 von SEQ ID NO: 5 umfasst, aufweisen, wobei null, eine oder zwei Aminosäuren in den Thrombinpeptidderivaten konservative Substitutionen der Aminosäure an der entsprechenden Position von SEQ ID NO: 5 sind.
Dimer nach Anspruch 7, wobei die Thrombinpeptidderivate die Aminosäuresequenz Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-X₁-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X₂-Val (SEQ ID NO: 6), worin X₁ Glu oder Gln ist und X₂ Phe, Met, Leu, His oder Val ist, oder ein Fragment derselben, das die Aminosäuren 10–18 von SEQ ID NO: 6 umfasst, aufweisen.
Dimer nach Anspruch 7, wobei die Thrombinpeptidderivate die Aminosäuresequenz Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-X₁-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X₂-Val (SEQ ID NO: 6), worin X₁ Glu oder Gln ist und X₂ Phe, Met, Leu, His oder Val ist, aufweisen.
Dimer nach Anspruch 7, wobei die Thrombinpeptidderivate die Aminosäuresequenz H-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-X₁-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X₂-Val-NH₂ (SEQ ID NO: 11), worin X₁ Glu oder Gln ist und X₂ Phe, Met, Leu, His oder Val ist, aufweisen.
Dimer nach Anspruch 13 oder Anspruch 14, wobei X₁ Glu ist und X₂ Phe ist.
Peptiddimer, das zwei Thrombinderivate aufweist, die jeweils aus der Aminosäuresequenz Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val (SEQ ID NO: 3) bestehen, wobei die Thrombinpeptidderivate durch eine Disulfidbindung kovalent verbunden sind; die Thrombinpeptidderivate optional ein C-terminales Amid umfassen und die Thrombinpeptidderivate optional einen acylierten N-Terminus umfassen, wobei das Dimer im Wesentlichen frei von einem Monomer ist.
Peptiddimer der folgenden Strukturformel:
wobei das Dimer im Wesentlichen frei von einem Monomer ist.
Dimer nach Anspruch 7, wobei die Thrombinpeptidderivate die Aminosäuresequenz Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-Met-Lys-Ser-Pro-Phe-Asn-Asn-Arg-Trp-Tyr (SEQ ID NO: 7) oder ein C-terminal verkürztes Fragment derselben mit mindestens 23 Aminosäuren aufweisen, wobei null, eine, zwei oder drei Aminosäuren in den Thrombinpeptidderivaten von der entsprechenden Aminosäure in SEQ ID NO: 7 verschieden sind.
Dimer nach Anspruch 7, wobei die Thrombinpeptidderivate die Aminosäuresequenz Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe- Val-Met-Lys-Ser-Pro-Phe-Asn-Asn-Arg-Trp-Tyr (SEQ ID NO: 7) oder ein C-terminal verkürztes Fragment derselben mit mindestens 23 Aminosäuren aufweisen, wobei null, eine, zwei oder drei Aminosäuren in den Thrombinpeptidderivaten konservative Substitutionen der entsprechenden Aminosäure in SEQ ID NO: 9 sind.
Dimer nach Anspruch 7, wobei die Thrombinpeptidderivate die Aminosäuresequenz Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-Met-Lys-Ser-Pro-Phe-Asn-Asn-Arg-Trp-Tyr (SEQ ID NO: 7) oder ein C-terminal verkürztes Fragment derselben mit mindestens 23 Aminosäuren aufweisen.
Verwendung eines Peptiddimers nach einem der Ansprüche 1 bis 20 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Subjekts, das eine Behandlung mit einem Thrombinrezeptoragonisten benötigt.
Verwendung nach Anspruch 21, wobei das Subjekt eine Behandlung zur Förderung einer Herzreparatur benötigt.
Verwendung nach Anspruch 21, wobei das Subjekt eine Behandlung zur Förderung von Knorpelwachstum oder -reparatur benötigt.
Verwendung nach Anspruch 21, wobei das Subjekt Knochenwachstum an einer Stelle in dem Subjekt benötigt.
Verwendung nach Anspruch 24, wobei die Stelle ein Knochentransplantat benötigt.
Verwendung nach Anspruch 24, wobei die Stelle ein einfacher Bruch, eine Segmentlücke in einem Knochen, ein Knochenhohlraum ist oder bei einem Pseudoarthrose-Bruch liegt.
Verwendung nach Anspruch 21, wobei das Subjekt eine Behandlung zur Förderung der Wundheilung benötigt.
Verwendung nach Anspruch 21, wobei das Subjekt eine Behandlung zur Hemmung von Restenose benötigt.
Peptiddimer nach einem der Ansprüche 1 bis 20 zur Verwendung in der Medizin.