DE60105772T2

DE60105772T2 - Stimulation des knorpelwachstums mit agonisten des nicht-proteolytisch aktivierten thrombin rezeptors

Info

Publication number: DE60105772T2
Application number: DE60105772T
Authority: DE
Inventors: H. Darrell CARNEY; S. Roger CROWTHER; Janet Stiernberg; John Bergmann
Original assignee: University of Texas System
Current assignee: University of Texas System
Priority date: 2000-07-20
Filing date: 2001-07-19
Publication date: 2006-02-16
Anticipated expiration: 2021-07-20
Also published as: CA2416404A1; ATE277174T1; ES2232647T3; JP2004504354A; US20050181996A1; DE60105772D1; EP1259598A2; HK1052367A1; CN1458974A; EP1259598B1; JP2005053930A; US6815416B2; US20020198154A1; AU7356101A; AU2001273561B2; WO2002007748A2; US20020042373A1; US6855687B2; JP3634844B2; WO2002007748A3

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Im Gegensatz zu den meisten Geweben repariert sich Knorpel nach einer Verletzung nicht selbst. Knorpel ist ein avaskuläres Gewebe, das zum großen Teil aus Zellen, die für Knorpelspezifisch sind, den Chondrocyten, speziellen Kollagenarten und Proteoglycanen besteht. Die Unfähigkeit von Knorpel, sich nach einer Verletzung, Erkrankung oder einer Operation selbst zu reparieren, ist der hauptbegrenzende Faktor bei der Rehabilitation von sich abbauenden Gelenkoberflächen und einer Verletzung des Meniskusknorpels. Osteoarthritis, die hauptsächliche degenerative Erkrankung von gewichttragenden Gelenkoberflächen, wird durch erodierende oder geschädigte Knorpeloberflächen verursacht und besteht bei etwa 25 % der über 50 Jahre alten Bevölkerung. In den Vereinigten Staaten leiden mehr als 20 Millionen Personen an Osteoarthritis, mit jährlichen Gesundheitskosten von mehr als 8,6 Milliarden Dollar. Außerden übersteigen die Kosten für Knorpelreparaturen ausgehend von einer akuten Gelenkverletzung (Meniskusläsionen, Schädigung der Facies patellaris und Chondromalacia) jährlich eine Milliarde Dollar. Daher werden neue therapeutische Ansätze zur Heilung von Knorpelläsionen, die durch eine Degeneration oder ein akutes Trauma verursacht sind, benötigt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es wurde nun ermittelt, dass aus artikulärem Knorpel isolierte Chondrocyten auf Verbindungen ansprechen, die den nicht-proteolytischen Thrombin-Zelloberflächenrezeptor (im folgenden "NPAR") aktivieren. Beispielsweise exprimieren Chondrocyten etwa 233 000 Thrombin-Bindungsstellen pro Zelle mit scheinbaren Affinitäten von etwa 0,1 nM (3000 Stellen) und 27 nM (230 000 Stellen) (Beispiel 1). Ferner stimuliert die Verbindung TP508, ein Agonist des nicht-proteolytischen Thrombin-Rezeptors, die Proliferation von Rinderchondrocyten in Kultur in Gegenwart von Thrombin als Comitogen (Beispiel 2A) und die Proliferation von Rattenchondrocyten, die in einer dreidimensionalen Matrixkultur gezüchtet werden, von sich aus (Beispiel 3A). Diese gleiche TP508-Verbindung stimuliert auch eine Proteoglycansynthese, was durch den Einbau von ³⁵S-Sulfat in sowohl Rinderchondrocyten (Beispiel 2B) als auch dreidimensionalen Kulturen von Rattenchondrocyten (Beispiel 3B) ermittelt wurde. Diese Invitro-Experimente belegen, dass NPAR-Agonisten die Proliferation und Matrixproduktion in aus artikulärem Knorpel isolierten Chondrocyten stimulieren können. Weitere In-vivo-Experimente belegen, dass die Zufuhr von TP508 in einer Formulierung mit nachhaltiger Freisetzung zu Fovea trochlearis-Knorpeldefekten bei Kaninchen, die sich in den subchondralen Knochen erstrecken, zur Reparatur des Knorpeldefekts einschließlich der Reparatur von subchondralem Knochen, Wiederherstellung einer normalen Knorpeloberfläche und Integration des neu gebildeten Knorpels mit nicht-verletztem Knorpel außerhalb des Defektbereichs führt (Beispiel 5).
Auf der Basis der im vorhergehenden Absatz angegebenen Ergebnisse werden hier neue Verfahren zur Stimulierung von Chondrocytenwachstum in vivo und Knorpelreparatur bei einem Subjekt und neue Zufuhrverfahren zur Zufuhr pharmazeutischer Zusammensetzungen zu artikulären Defekten zur Unterstützung der Oberflächenreparatur und zur Verhinderung von artikulärem Abbau offenbart.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines Agonisten des nicht-proteolytisch aktivierten Thrombin-Re zeptors bei der Herstellung eines Medikaments zur Stimulierung von Knorpelwachstum, -regeneration oder -reparatur.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Stimulierung der Proliferation und Expansion von Chondrocyten in vitro. Das Verfahren umfasst das Züchten von Chondrocyten in Gegenwart einer stimulierenden Menge eines NPAR-Agonisten.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Stellen, die Knorpelwachstum, -reparatur oder -regeneration benötigen, finden sich bei Subjekten mit Osteoarthritis. Osteoarthritis oder degenerative Gelenkerkrankung ist eine langsam fortschreitende, irreversible, häufig monoartikuläre Erkrankung, die durch Schmerz und Funktionsabnahme gekennzeichnet ist. Die zugrundeliegende Ursache des Schmerzes und der Schwächung ist der Knorpelabbau, der eines der Hauptsymptome der Erkrankung ist. Hyaliner Knorpel ist ein flexibles Gewebe, das die Enden von Knochen bedeckt und zwischen Gelenken, wie dem Knie, liegt. Er findet sich auch zwischen den Knochen längs des Rückgrats. Knorpel ist glatt, wobei er eine stabile flexible Bewegung mit minimaler Reibung ermöglicht, jedoch auch kompressionsbeständig und zur Verteilung von angewandten Drücken fähig. Wenn eine Osteoarthritis fortschreitet, werden Oberflächen von Knorpel und freigelegtem darunterliegendem Knochen unregelmäßig. Statt einem glatten Gleiten reiben knochige Gelenkoberflächen gegeneinander, was zu Steifheit und Schmerz führt. Eine Regeneration von geschädigtem Knorpel und das Wachstum von neuem Knorpel an diesen Arthrosestellen würde den Schmerz lindern und die mit Osteoarthritis verbundene verlorene Funktion wiederherstellen.
Eine Knorpelschädigung kann auch aufgrund eines Traumas infolge einer Verletzung oder Operation erfolgen. Sportverletzungen sind eine häufige Ursache einer Knorpelschädigung, insbesondere von Gelenken, wie dem Knie. Eine Verletzung eines Knorpels kann zur gleichen Art einer funktionalen Beeinträchtigung führen. Daher benötigen Stellen in einem Subjekt mit Knorpel, der durch ein Trauma oder eine Erkrankung geschädigt wurde, eine Behandlung zur Wiederherstellung oder Förderung des Knorpelwachstums.
Die Anmelder ermittelten, dass Verbindungen, die den nicht-proteolytisch aktivierten Thrombin-Rezeptor (im folgenden "NPAR") stimulieren oder aktivieren, die Proliferation von Chrondrocyten stimulieren können. Chondrocyten sind Zellen, die etwa ein Prozent des Volumens von Knorpel ausmachen und die abgebaute Matrixmoleküle unter Beibehalten des korrekten Volumens und der mechanischen Eigenschaften des Gewebes ersetzen. Die Anmelder ermittelten auch, dass Verbindungen, die NPAR stimulieren oder aktivieren, eine Proteoglycansynthese in Chrondrocyten stimulieren. Proteoglycan ist eine Hauptknorpelkomponente. Auf der Basis dieser Ergebnisse führten die Anmelder den NPAR-Agonisten TP508, der in einer Formulierung mit nachhaltiger Freisetzung zubereitet wurde, Defekten in Fovea trochlearis-Knorpel bei Kaninchen zu, und sie ermittelten, dass das Peptid die Reparatur des Defekts stimulierte, was die Bildung von neuem Knorpel mit einer neuen Knorpeloberfläche umfasste. Das Peptid stimulierte auch eine Schichtbildung und Integration dieses neuen Knorpels in angrenzendem nicht-verletztem Knorpel und die Wiederherstellung des subchondralen Knochens. Es wird gefolgert, dass NPAR-Agonisten Knorpelwachstum und -reparatur induzieren können, wenn sie an Stellen, die Knorpelwachstum und/oder -reparatur benötigen, verabreicht werden.
Verbindungen, die NPAR stimulieren oder aktivieren, werden als NPAR-Agonisten bezeichnet. NPAR ist ein hochaffiner Thrombin-Rezeptor, der auf der Oberfläche der meisten Zellen vorhanden ist. NPAR ist in großem Umfang für eine hochaffine Bindung von Thrombin, proteolytisch inaktiviertem Thrombin und von Thrombin abgeleiteten Peptiden an Zellen verantwortlich. NPAR-Agonisten und -Antagonisten können um die affine Bindung mit Thrombin an Zellen konkurrieren (siehe beispielsweise Glenn et al., J. Peptide Research 1: 65 (1988)). NPAR scheint eine Zahl von zellulären Signalen, die durch Thrombin unabhängig von dessen proteolytischer Aktivität initiiert werden, zu vermitteln. Ein Beispiel für ein derartiges Signal ist die Aufregulierung von Annexin V und anderen Molekülen, die durch subtraktive Hybridisierung identifiziert wurde (siehe Sower et al., Experimental Cell Research 247: 422 (1999)). NPAR ist daher durch dessen hochaffine Wechselwirkung mit Thrombin an Zelloberflächen und dessen Aktivierung durch proteolytisch inaktive Derivate von Thrombin und von Thrombin abgeleiteten Peptidagonisten, wie im folgenden beschrieben, gekennzeichnet. Eine NPAR-Aktivierung kann auf der Basis der Fähigkeit von dessen Agonisten zur Stimulierung der Zellproliferation bei Zugabe zu Fibroblasten in Gegenwart von submitogenen Konzentrationen von Thrombin oder Molekülen, die Proteinkinase C aktivieren, gemäß der Offenbarung in US-Patent Nr. 5 352 664 und 5 500 412 getestet werden.
NPAR ist von anderen Thrombin bindenden Proteinen und der klonierten Familie von proteolytisch aktivierten Rezeptoren für Thrombin, die die Rezeptoren PAR1, PAR2, PAR3 und PAR4 umfasst, zu unterscheiden. PAR1 besitzt eine spezifische Thrombinspaltungsstelle, die eine Thrombinspaltung unter Freilegung einer neuen Aminoterminusdomäne, die als Verknüpfungsligand, der sich auf sich selbst unter Induktion von dessen Aktivierung zurückfaltet, wirkt, ermöglicht (siehe Vu et al., Cell, 64: 1057 (1991)). PAR2 besitzt einen ähnlichen Mechanismus zur Aktivierung, er wird jedoch prinzipiell durch trypsinähnliche Enzyme aktiviert (siehe Zhong et al., J. Biol. Chem. 267: 16975 (1992)). PAR3 besitzt ebenfalls einen ähnlichen Aktivierungsmechanismus und scheint als zweiter Thrombinrezeptor bei Plättchen zu fungieren (siehe Ishihara et al., Nature, 386: 502 (1997)). PAR4 wurde in Mausmegacaryocyten nachgewiesen, und Untersuchungen legen nahe, dass es auch bei humanen Plättchen funktioniert (siehe Kahn et al., Nature 394: 690 (1998)). Im Gegensatz zu diesen PAR-Rezeptoren erfordert die Aktivierung von NPAR keine proteolytische Spaltung.
Mehrere Beweislinien zeigen, dass NPAR von PAR-Rezeptoren verschieden ist:

(1) eine Population von Zellen wurde isoliert, die vollfunktionale PAR1-Rezeptoren exprimieren, jedoch auf Thrombin aufgrund eines Defekts in dem NPAR-Signalübermittlungsweg nicht ansprechen (siehe Kim et al., J. Cell. Physiol. 160: 573 (1994));
(2) Neutrophile binden ¹²⁵I-Thrombin mit hoher Affinität und ihre Chemotaxis wird durch proteolytisch inaktiviertes Thrombin oder NPAR-Agonisten stimuliert (siehe Ramakrishnan und Carney, Mol. Biol. Cell 4: 1993 (1993)), dennoch exprimieren sie PAR1 nicht (siehe Jenkins et al., J. Cell Sci. 108: 3059 (1995));
(3) IIC9-Fibroblasten überexprimieren PAR1, binden jedoch kein Thrombin mit hoher Affinität (siehe D. Kim, Ph. D. Dissertation, The University of Texas Medical Branch, Galveston, 1995; und Low et al., "Cancer Cells 3/Growth Factors and Transformation", Cold Spring Harbor Laboratory, New York); und
(4) NPAR-Agonisten haben unterschiedliche Wirkungen auf die Genexpression als die PAR-Rezeptoragonistenpeptide (siehe Sower et al., Experimental Cell Research 247: 422 (1999)).

Ein Beispiel für einen NPAR-Agonisten ist ein Thrombinpeptidderivat, d.h. ein Polypeptid mit nicht mehr als etwa 50 Aminosäuren, vorzugsweise nicht mehr als etwa 30 Aminosäuren, das ferner eine so ausreichende Homologie mit dem Fragment von humanem Thrombin, das den Prothrombin-Aminosäuren 508–530 (SEQ ID NO. 5) entspricht, dass das Polypeptid NPAR aktiviert, aufweist. Die hier beschriebenen Thrombinpeptidderivate besitzen zweckmäßigerweise zwischen etwa 12 und 23 Aminosäuren, vorzugsweise zwischen etwa 19 und 23 Aminosäuren. Ein Beispiel eines Thrombinpeptidderivats umfasst eine Einheit der Strukturformel (I): Asp-Ala-R (I)
R ist eine konservierte Serinesterasedomäne. Serinesterasen, beispielsweise Trypsin, Thrombin, Chymotrypsin und dgl., besitzen eine Region, die hochkonserviert ist. "Konservierte Serinesterasedomäne" bezeichnet ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von einer dieser konservierten Regionen oder sie ist so ausreichend homolog zu einer dieser konservierten Regionen, dass das Thrombinpeptidderivat NPAR-Aktivierungsfähigkeit behält.
In einer Ausführungsform besitzt die konservierte Serinesterasesequenz die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 (Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val) oder eines C-terminal gestutzten Fragments eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1. Es ist jedoch klar, dass null, eine, zwei oder drei Aminosäuren in der konservierten Serinesterasesequenz von der entsprechenden Aminosäure in SEQ ID NO: 1 verschieden sein können. Zweckmäßigerweise sind die Aminosäuren in der konservierten Serinesterasesequenz, die von der entsprechenden Aminosäure in SEQ ID NO: 1 verschieden sind, konservative Substitutionen und vorzugsweise hochkonservative Substitutionen. "C-terminal gestutztes Fragment" bezeichnet ein Fragment, das nach dem Entfernen einer Aminosäure oder eines Blocks von Aminosäuren vom C-Terminus verbleibt, wobei das Fragment mindestens 6 und vorzugsweise mindestens 9 Aminosäuren aufweist.
Vorzugsweise besitzt die konservierte Serinesterasesequenz die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 (Cys-X₁-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X₂-Val; X₁ bedeutet Glu oder Gln und X₂ bedeutet Phe, Met, Leu, His oder Val) oder einem C-terminal gestutzten Fragment derselben mit mindestens 6 Aminosäuren, vorzugsweise mindestens 9 Aminosäuren.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Thrombinpeptidderivat eine konservierte Serinesterasesequenz und ein Polypeptid mit einer spezielleren Thrombinaminosäuresequenz Arg-Gly-Asp-Ala (SEQ ID NO: 3). Ein Beispiel für ein Thrombinpeptidderivat dieses Typs umfasst Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-X₁-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X₂-Val (SEQ ID NO: 4). X₁ und X₂ sind wie oben definiert. Wenn das Thrombinpeptidderivat SEQ ID NO: 4 umfasst, hat es vorzugsweise die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 5 (Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val) oder einem N-terminal gestutzten Fragment derselben, wobei null, eine, zwei oder drei Aminosäuren an den Positionen 1–9 in dem Thrombinpeptidderivat von der Aminosäure an der entsprechenden Position von SEQ ID NO: 5 verschieden sind. Zweckmäßigerweise sind die Aminosäuren in dem Thrombinpeptidderivat, die von der entsprechenden Aminosäure in SEQ ID NO: 5 verschieden sind, konservative Substitutionen und vorzugsweise hochkonservative Substitutionen. Ein "N-terminal gestutztes Fragment" bezeichnet ein Fragment, das nach dem Entfernen einer Aminosäure oder eines Blocks von Aminosäuren von dem N-Terminus, zweckmäßigerweise eines Blocks von nicht mehr als sechs Aminosäuren, vorzugsweise eines Blocks von nicht mehr als drei Aminosäuren, verbleibt.
TP508 ist ein Beispiel für ein Thrombinpeptidderivat und es besitzt die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 5.
Eine "konservative Substitution" ist das Ersetzen einer Aminosäure durch eine andere Aminosäure, die die gleiche Nettoelektronenladung und etwa die gleiche Größe und Form aufweist. Aminosäuren mit aliphatischen oder substituierten aliphatischen Aminosäureseitenketten besitzen etwa die gleiche Größe, wenn sich die Gesamtzahl an Kohlenstoff- und Heteroatomen in deren Seitenketten um nicht mehr als etwa vier unterscheidet. Sie besitzen etwa die gleiche Form, wenn sich die Zahl der Verzweigungen in ihren Seitenketten um nicht mehr als eins unterscheidet. Aminosäuren mit Phenyl- oder substituierten Phenylgruppen in deren Seitenketten werden als etwa die gleiche Größe und Form aufweisend betrachtet. Im folgenden werden fünf Gruppen von Aminosäuren aufgelistet. Das Ersetzen einer Aminosäure in einem Polypeptid durch eine andere Aminosäure aus der gleichen Gruppe führt zu einer konservativen Substitution:

Gruppe I: Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Serin, Threonin, Cystein und nicht natürlich vorkommende Aminosäuren mit alphatischen C1-C4- oder hydroxylsubstituierten aliphatischen C1-C4-Seitenketten (geradkettigen oder einfach verzweigten).
Gruppe II: Glutaminsäure, Asparaginsäure und nicht natürlich vorkommende Aminosäuren mit carbonsäuresubstituierten aliphatischen C1-C4-Seitenketten (unverzweigt oder ein Verzweigungspunkt).
Gruppe III: Lysin, Ornithin, Arginin und nicht natürlich vorkommende Aminosäuren mit amin- oder guanidinosubstituierten aliphatischen C1-C4-Seitenketten (unverzweigt oder ein Verzweigungspunkt).
Gruppe IV: Glutamin, Asparagin und nicht natürlich vorkommende Aminosäuren mit amidsubstituierten aliphatischen C1-C4-Seitenketten (unverzweigt oder ein Verzweigungspunkt).
Gruppe V: Phenylalanin, Phenylglycin, Tyrosin und Tryptophan.

Eine "hochkonservative Substitution" ist das Ersetzen einer Aminosäure durch eine andere Aminosäure, die die gleiche funktionelle Gruppe in der Seitenkette und nahezu die gleiche Größe und Form aufweist. Aminosäuren mit aliphatischen oder substituierten aliphatischen Aminosäureseitenketten besitzen nahezu die gleiche Größe, wenn die Gesamtzahl der Kohlenstoff- und Heteroatome in deren Seitenketten sich um nicht mehr als zwei unterscheidet. Sie besitzen nahezu die gleiche Form, wenn sie die gleiche Zahl von Verzweigungen in deren Seitenketten aufweisen. Beispiele für hochkonservative Substitutionen umfassen Valin für Leucin, Threonin für Serin, Asparaginsäure für Glutaminsäure und Phenylglycin für Phenylalanin. Beispiele für Substitutionen, die nicht hochkonservativ sind, umfassen Alanin für Valin, Alanin für Serin und Asparaginsäure für Serin.
Andere NPAR-Agonisten umfassen kleine organische Moleküle, die NPAR binden und aktivieren. Agonisten dieses Typs können in geeigneter Weise mit High-Throughput-Screening, beispielsweise mit Tests, die die Fähigkeit von Molekülen zur Stimulierung der Zellproliferation bei Zugabe zu Fibroblasten in Gegenwart von submitogenen Konzentrationen von Thrombin oder Molekülen, die Proteinkinase C aktivieren, feststellen, oder mit Tests, die die Fähigkeit dieser Moleküle zur Konkurrenz mit ¹²⁵I-Thrombin an Zellen mit Oberflächen-NPAR-Rezeptoren feststellen, gemäß der Offenba rung bei Glenn et al., aaO, US-Patent Nr. 5 352 664 und 5 500 412 identifiziert werden. Die gesamten Lehren von Glenn et al. und US-Patent Nr. 5 352 664 und 5 500 412 werden hier als Bezug aufgenommen.
Der Ausdruck "NPAR-Agonist" umfasst auch Verbindungen und Kombinationen von Verbindungen, von denen bekannt ist, dass sie NPAR aktivieren. Beispiele sind in US-Patent Nr. 5 352 664 und 5 500 412 offenbart und umfassen Thrombin und DIP-alpha-Thrombin.
In der vorliegenden Erfindung verwendete NPAR-Agonisten werden typischerweise als eine Komponente in einer pharmazeutischen Zusammensetzung der Stelle, die Knorpelwachstum, -reparatur oder -regeneration benötigt, verabreicht. Eine Verabreichung an der eine Behandlung benötigenden Stelle bedeutet, dass die den NPAR-Agonisten enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung in einer so ausreichenden Nähe zu der eine Behandlung benötigenden Stelle verabreicht wird, dass ein Knorpelwachstum oder eine Knorpelregeneration (beispielsweise eine größere Menge an Knorpelwachstum oder bessere Qualität von Knorpelwachstum in Gegenwart des NPAR-Agonisten als bei dessen Abwesenheit) an der Stelle erfolgt.
Bei einer Verabreichungsweise ist die pharmazeutische Zusammensetzung eine Lösung, die den NPAR-Agonisten und einen geeigneten Träger umfasst. Die Lösung wird direkt an oder in enger Nachbarschaft der eine Behandlung benötigenden Stelle appliziert. Die Verabreichung der Lösung kann beispielsweise intraartikulär durch eine Spritze in enger Nachbarschaft zu dem geschädigten Gewebe durch eine Spritze oder durch eine chirurgische Öffnung in geeigneter Weise durchgeführt werden. Pharmazeutische Standardformulierungstechniken, beispielsweise solche gemäß der Beschreibung in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA, können verwendet werden. Geeignete pharmazeutische Träger umfassen beispielsweise physiologische Kochsalzlösung, bakteriostatische Kochsalzlösung (Kochsalzlösung, die etwa 0,9 % (mg/ml) Benzylalkohol enthält), phosphatgepufferte Kochsalzlösung, Hank-Lösung, Ringer-Lactat und dgl.
Bei einer anderen Verabreichungsweise umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung den NPAR-Agonisten und einen implantierbaren biologisch kompatiblen Träger. Ein biologisch kompatibler Träger sollte nichttoxisch, nicht-entzündlich, nicht immunogen und frei von anderen unerwünschten Reaktionen an der Implantationsstelle sein. Geeignete Träger ergeben auch eine Freisetzung des Wirkstoffs und vorzugsweise eine langsame nachhaltige Freisetzung über die Zeit an der Implantationssstelle.
Eine Zahl synthetischer biologisch abbaubarer Polymere kann als Träger mit den Eigenschaften einer nachhaltigen Freisetzung dienen. Beispiele für diese Polymere umfassen Poly-α-hydroxyester, wie Polymilchsäure/Polyglykolsäure-Copolymere und Polyanhydride.
Polymilchsäure/Polyglykolsäure(PLGA)-Homo- und -Copolymere sind als Vehikel mit nachhaltiger Freisetzung einschlägig bekannt. Die Freisetzungsrate kann durch den erfahrenen Fachmann durch Variation des Verhältnisses von Polymilchsäure zu Polyglykolsäure und des Molekulargewichts des Polymers eingestellt werden (siehe Anderson et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 28: 5 (1997), dessen gesamte Lehren als Bezug aufgenommen sind). Der Einbau von Poly(ethylenglykol) in das Polymergemisch ermöglicht eine weitere Abschwächung des Freisetzungsprofils des Wirkstoffs (siehe Cleek et al., J. Control Release 48: 259 (1997), dessen gesamte Lehren hier als Bezug aufgenommen sind). Geeignete implantierbare PLGA-Polymere zur Verwendung als Träger für Knorpelwachstumsfaktoren sind in US-Patent Nr. 6 013 853, 5 607 474 und 5 876 452 beschrieben, deren gesamte Lehren hier als Bezug aufgenommen sind.
Polyanhydride, die in der Strukturformel (II) angegeben sind, besitzen gut definierte Abbau- und Freisetzungseigenschaften, die durch den Einbau variierender Mengen von hydrophoben oder hydrophilen Monomeren, wie Sebacinsäure und 1,3-Bis(p-carboxyphenoxy)propan, gesteuert werden können (siehe Leong et al., J. Biomed. Mater. Res. 19: 941 (1985), deren gesamte Lehren hier als Bezug aufgenommen sind). Zur Verbesserung der mechanischen Festigkeit werden Anhydride häufig mit Imiden copolymerisiert, wobei Polyanhydrid-co-imide gebildet werden. Beispiele für Polyanhydrid-co-imide, die für orthopädische Anwendungen geeignet sind, sind Poly(trimellitylimido-glycin-co-1,6-Bis(carboxyphenoxy)hexan- und Pyromellitylimidoalanin:1,6-Bis(p-carboxyphenoxy)hexan-Copolymere.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können nach Wunsch im Vorfeld einer Operation geformt werden oder durch den Arzt oder Techniker während einer Operation geformt werden. Vorzugsweise wird die Matrix so geformt, dass ein Gewebede fekt überspannt und die gewünschte Form des neuen Gewebes erhalten wird. Im Falle einer Knorpelreparatur großer Defekte ist es günstig, Abmessungen zu verwenden, die den Defekt überspannen. Nach der Implantation wird das Material durch den Körper langsam absorbiert und durch Knorpel in der Form des Implantats oder einer diesem sehr nahen Form ersetzt.
In einem Aspekt ist der Träger eine porenhaltige Matrix, in die Nachkommenzellen wandern können. Zellen können sich häufig an derartige porenhaltige Matrizes heften, die dann als Gerüst für Gewebewachstum dienen und dadurch die Geschwindigkeit von Knochenwachstum beschleunigen können. Chondrocyten können auf derartige Matrizes vor einer Implantation appliziert werden, um das Heilen weiter zu beschleunigen. Kollagen oder ein Kollagengel ist ein Beispiel für eine geeignete porenhaltige Matrix.
In einem weiteren Aspekt ist der Träger eine viskose Lösung oder ein Gel, die intraartikulär oder an der eine Behandlung benötigenden Stelle injizierbar sind. Hyaluronsäure ist ein Beispiel für einen Träger dieses Typs. Hyaluronsäureprodukte sind im Handel erhältlich und umfassen ORTHOVISC, das von Anika entwickelt wurde, SYNVISC, das von Biomatrix entwickelt wurde, HYALGAN, das von Fidia entwickelt wurde, und ARTZ, das von Seikagaku entwickelt wurde. Pluronic-Gel ist ein weiteres Beispiel für diesen Trägertyp. Pluronic-Gele sind nichttoxische Blockcopolymere von Ethylenoxid und Propylenoxid. Sie zeigen wärmehärtende Eigenschaften, die es ermöglichen, dass sie bei Raumtemperatur als viskose Flüssigkeiten, jedoch bei Körpertemperaturen als Gele existieren. Injizierbare Zusammensetzungen können direkt an der eine Behandlung benötigenden Stelle ohne die Notwendigkeit eines invasiven Eingriffs appliziert werden. Polymere von Poly(ethylenoxid) und Copolymere von Ethylen und Propylenoxid sind ebenfalls als injizierbare Matrizes geeignet (siehe Cao et al., J. Biomater. Sci. 9: 475 (1998), und Sims et al., Plast. Reconstr. Surg. 98: 843 (196), deren gesamte Lehren hier als Bezug aufgenommen sind).
Eine "therapeutisch wirksame Menge" ist die Menge eines NPAR-Agonisten (oder von Chondrocyten), die zu einem größeren Knorpelwachstum oder einer größeren Knorpelreparatur in Gegenwart des NPAR-Agonisten als bei dessen Abwesenheit führt. Alternativ oder zusätzlich ist eine "therapeutisch wirksame Menge" die Menge eines NPAR-Agonisten (oder von Chondrocyten), die zur Linderung des Schmerzes und/oder des Funktionsmangels, die mit der Knorpelschädigung verbunden sind, führt. Typischerweise werden der Agonist (oder Chondrocyten) über einen so ausreichenden Zeitraum verabreicht, dass die gewünschte therapeutische Wirkung erreicht wird. Die verabreichte Menge hängt von der gewünschten Menge des Knorpelwachstums, der Gesundheit, Größe, dem Gewicht, Alter und Geschlecht des Subjekts und den Freisetzungseigenschaften der pharmazeutischen Formulierung ab. Typischerweise werden zwischen etwa 0,1 μg pro Tag und etwa 1 μg pro Tag des NPAR-Agonisten (vorzugsweise zwischen etwa 5 μg pro Tag und etwa 100 μg pro Tag) durch kontinuierliche Freisetzung oder durch direkte Applikation an der ein Knorpelwachstum oder eine Knorpelreparatur benötigenden Stelle verabreicht.
Ein "Subjekt" ist vorzugsweise ein Mensch, es kann jedoch auch ein eine Behandlung benötigendes Tier, beispielsweise Begleittiere (beispielsweise Hunde, Katzen und dgl.), Hoftiere (beispielsweise Kühe, Schweine, Pferde und dgl.) und Labortiere (beispielsweise Ratten, Mäuse, Meerschweinchen und dgl.), sein.
NPAR-Agonisten können zur Beschleunigung des Wachstums oder zum Aufrechterhalten der Funktionalität von isolierten Chondrocyten verwendet werden. In einer Ausführungsform können NPAR-Agonisten zu Gewebekulturmedium zur Stimulierung der Proliferation und zur Bereitstellung einer rascheren Proliferation und/oder zur Verhinderung von apoptotischem Absterben oder der Alterung von Zellen, die häufig auftreten, wenn Primärzellenisolate in Kultur gegeben werden, gegeben werden. In einer weiteren Ausführungsform könnten derartige NPAR-Agonisten, da die NPAR-Agonisten die Matrixproduktion zu stimulieren scheinen, dazu verwendet werden, die differenzierte Funktionalität von Chondrocyten in Kultur aufrechtzuerhalten. NPAR-Agonisten können allein in definiertem Standardgewebekulturmedium oder als Ergänzung zu Gewebekulturmedium, das Serum oder einen anderen Wachstumsfaktor enthält, zur Bereitstellung von additiven oder synergistischen Wirkungen auf die In-vitro-Produktion oder das Halten von Chondrocyten verwendet werden. Eine ausreichende Menge des NPRR-Agonisten, um ein gegenüber der Abwesenheit des Agonisten rascheres Wachstum zu erhalten oder größere Funktionalität der Chondrocyten beizubehalten, d.h. eine "stimulatorische Menge" wird zu der Kultur gegeben. Typischerweise werden zwischen etwa 0,1 μg/ml und etwa 100 μg/ml des NPAR-Agonisten verwendet.
In Gegenwart eines NPAR-Agonisten kultivierte Chondrocyten können auch zur Behandlung einer Knorpelschädigung durch Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge der Chondrocyten an die eine Behandlung benötigende Stelle verwendet werden. Im Hinblick auf Chondrocyten bedeutet "therapeutisch wirksam" ebenfalls zu einem größeren Knorpelwachstum oder einer größeren Knorpelreparatur mit der Behandlung als bei deren Abwesenheit führend. Die Verabreichung von Chondrocyten zur Behandlung einer Knorpelschädigung ist in US-Patent Nr. 4 846 835, dessen gesamte Lehren hier als Bezug aufgenommen sind, beschrieben.
Thrombinpeptidderivate können durch ein Festphasenpeptidsynthese(beispielsweise BOC- oder FMOC-)Verfahren, durch Lösungsphasensynthese oder durch andere geeignete Techniken, die Kombinationen der im vorhergehenden genannten Verfahren umfassen, synthetisiert werden. Die BOC- und FMOC-Verfahren, die etabliert sind und in breitem Umfang verwendet werden, sind bei Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 88: 2149 (1963); Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides, C.H. Li, Hrsg., Academic Press, 1983, S. 48–267; und Barany und Merrifield, in The Peptides, E. Gross und J. Meienhofer, Hrsg., Academic Press, New York, 1980, S. 3–285, beschrieben. Verfahren der Festphasenpeptidsynthese sind bei R.B. Merrifield, Science, 232: 341 (1986); L.A. Carpino und G.Y. Han, J. Org. Chem , 37: 3404 (1972); und H. Gauspohl et al., Synthesis, 5: 315 (1992)) beschrieben. Die Lehren dieser sechs Artikel sind hier in ihrer Gesamtheit als Bezug aufgenommen.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele, die in keinster Weise beschränkend sein sollen, erläutert.
BEISPIELE
EINZELHEITEN DER VERSUCHE
Chondrocyten sind der primäre Zelltyp, der in Knorpel gefunden wird. In Knorpel sind diese Zellen normalerweise ruhend oder nicht-proliferativ und sie besitzen relativ niedrige Metabolisierungsraten. Nach einer Verletzung des Knorpels nehmen diese Zellen nicht ohne weiteres am Reparaturprozess teil. Aufgrund der avaskulären Natur von Knorpel sehen diese Zellen Thrombin als Initiator des Reparaturprozesses vermutlich nicht. Die folgenden Beispiele belegen, dass Chondrocyten Thrombinrezeptoren besitzen und dass Verbindungen, die NPAR aktivieren, die Chondrocytenproliferation und Synthese von Matrixproteoglycanen stimulieren.
Beispiel 1: Thrombinbindung an Rattenchondrocyten
Primärkulturen von artikulären Chondrocyten von Ratten wurden isoliert und zur In-vitro-Analyse unter Verwendung geläufiger Verfahren (siehe K.E. Kuettner et al., J. Cell Biology 93: 743–750, 1982) vorbereitet. Kurz gesagt, wurden Knorpelstücke aus der Schulter von Ratten herausseziert und die Stücke mit Trypsin 1 h und mit Kollagenase 3 h in Gewebekulturmedium (DMEM) bei 37 °C unter Rühren verdaut. Die Zellen wurden in Kolben mit hoher Dichte (50000 Zellen/cm²) ausplattiert und in DMEM, das Antibiotika und Ascorbinsäure enthielt, bei 37 °C in einer Atmosphäre von 5 % CO₂ kultiviert.
Die spezifische Bindung von ¹²⁵I-Thrombin an Chondrocyten wurde unter Verwendung etablierter Thrombin-Rezeptor-Bindungstests gemäß der Offenbarung in US-Patent 5 352 664 und D.H. Carney und D.D. Cunningham, Cell, 15: 1341–1349, 1978, durchgeführt. Kurz gesagt, wurde hochgereinigtes humanes Thrombin iodiert und zu Kulturen von Chondrocyten mit nichtmarkiertem Thrombin oder ohne dieses gegeben, um um die nichtspezifische Bindung zu korrigieren. Durch Inkubation von Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen von markiertem Thrombin und Ermitteln der Menge von an Zellen gebundenem Thrombin und der Menge von freiem Thrombin in dem Medium ist es möglich, die Zahl der Rezeptoren pro Zelle und die Affinität von Thrombin für diese Bindungsstelle abzuschätzen.
Eine Scatchard-Analyse der Bindung von markiertem Thrombin von drei getrennten Experimenten legt nahe, dass Rattenchondrocyten einen Mittelwert von 3000 Bindungsstellen sehr hoher Affinität (Affinität 100 pM) und 230 000 Stellen hoher Affinität (27 nM) exprimieren.
Beispiel 2A: NPAR-Agonistenstimulation der Rinderchondrocytenproliferation
Primärkulturen von Rinderchondrocyten wurden unter Verwendung des für Rattenchondrocyten in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens vorbereitet. Die Kulturen wurden in 24-Vertiefungen-Plastikschalen mit einer niedrigen Dichte subkultiviert und in 1%-iges Serum gegeben. Die Zugabe des NPAR-Agonisten TP508 zu diesen Kulturen in Konzentrationen von 1,0 oder 10 μg/ml allein stimulierte die Zellproliferation nicht. Im Gegensatz dazu führte die Zugabe dieser Konzentrationen von TP508 zusammen mit einer kleinen Menge eines Thrombin-co-mitogens zu einer kleinen, jedoch signifikanten (p < 0,05) Zunahme der Zellzahl bezogen auf die, die bei Thrombin allein nach drei Tagen in Kultur beobachtet wurde.
Beispiel 2B: NPAR-Agonistenstimulation der Rinderchondrocyten-Proteoglycansynthese
Zur Bestimmung der Wirkung von NPAR-Agonisten auf die Proteoglycansynthese wurden Rinderchondrocyten in 96-Vertiefungen-Platten mit einer Dichte von 2 × 10⁵ Zellen pro Vertiefung ausgesät und in DMEM mit 10%-igem fetalem Kälberserum kultiviert. Nach der Einrichtung dieser mehrlagigen Kulturen wurde das Medium täglich durch DMEM, das 1 % Serum mit den angegebenen Konzentrationen von TP508 von 1 bis 100 μg pro ml (Tabelle 1) enthielt, ersetzt. Nach sechs Tagen in Kultur mit täglicher Änderung des Kulturmediums mit oder ohne TP508 wurde ³⁵S-Sulfat zu dem Medium gegeben und die Inkubation weitere 24 h fortgesetzt. Wie in Tabelle 1 gezeigt, erhöhte eine Behandlung mit hohen Konzentrationen von TP508 (100 μg pro ml) den Einbau von ³⁵S-Sulfat in Bezug auf unbehandelte Zellen um das mehr als 10-fache.
Tabelle 1. Wirkung des NPAR-Agonisten TP508 auf den Einbau von ³⁵S-Sulfat in Rinderchondrocytenkulturen
Beispiel 3A: NPAR-Agonistenstimulation der Proliferationssynthese in kultivierten artikulären Chondrocyten von Ratten
Artikuläre Chondrocyten von Ratten wurden aus Schnitten von artikulärem Schulterknorpel von Ratten unter Verwendung von Trypsin- und Kollagenaseverdauungen gemäß der Beschreibung in Beispiel 1 isoliert. Zubereitungen von "dreidimensionalen" Alginatperlenkulturen von Chondrocyten wurden unter Verwendung etablierter Techniken gemäß der Beschreibung bei Guo et al. (Conn. Tiss. Res. 19: 277–297, 1998) hergestellt. Nach der Entfernung von Zellen aus Gewebekulturkolben mit Trypsin wurden die Zellen in einem Alginatgel (1,2 (Gew/V)) suspendiert und langsam durch eine 22er Nadel tropfenweise in 102 mM CaCl₂ hinausgepresst. Wenn der Tropfen mit dem CaCl₂ in Berührung kommt, erfolgt eine nahezu sofortige Polymerisation des Alginats unter Bildung einer Gelperle. Die Perlen werden dann dreimal in DMEM-Kulturmedium gewaschen und in 35-mm-Schalen überführt und bei 37 °C in einer Atmosphäre mit 5 % CO₂ durch Zuführen von Kulturmedium alle zwei Tage in Kultur gehalten.
Die Wirkung des NPAR-Agonisten TP508 auf die Chondrocytenzellproliferation nach drei Tagen in einer dreidimensionalen Alginatkultur wurde durch Entfernen von Perlen aus 35-mm-Schalen, Waschen derselben mit 0,9%-iger Kochsalzlösung und Auflösen der Alginatperlen durch Zugabe von 1 ml von 55 mM Natriumcitrat, 0,15 M NaCl bei 37 °C während 10 min bestimmt. Die Zellzahl wurde durch Verdünnen des 1 ml gelöster Perlen 1:10 mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und anschließendes Zählen der Zellen mit einem Coulter Counter der Z-Reihe bestimmt. Wie in Tabelle 2 gezeigt, stimulierte TP508 selbst die Proliferation von Chondrocyten in einer dreidimensionalen Kultur.
Tabelle 2. Wirkung des NPAR-Agonisten TP508 auf die Proliferation von Rattenchondrocyten in einer dreidimensionalen Perlenkultur
Beispiel 3B: NPAR-Agonistenstimulation der Proteoglycansynthese in kultivierten artikulären Chondrocyten von Ratten
Zur Bestimmung der Wirkung des NPAR-Agonisten TP508 auf die Proteoglycansynthese wurden dreidimensionale Alginatkulturen wie oben beschrieben hergestellt und auf den Einbau von [³⁵S]-Sulfat getestet. Perlenkulturen wurden angegebenen Konzentrationen von TP508 sowie [³⁵S]-Sulfat (20 μ Ci/ml) und ferner einem täglichen Mediumaustausch ausgesetzt und am Tag 7 geerntet, um den Einbau von [³⁵S]-Sulfat zu testen. An jedem Zeitpunkt wurden 5–10 Perlen entfernt, dreimal mit 0,9%-iger Kochsalzlösung gewaschen, durch Zugabe von 0,5 ml 55 mM Natriumcitrat, 0,15 M NaCl bei 37 °C während 10 min wie oben beschrieben gelöst und in einem Flüssigszintillationszähler ausgezählt. Der Einbau von [³⁵S]-Sulfat wurde in jeder Probe hinsichtlich der Zahl der zugesetzten Perlen genormt. Wie in Tabelle 3 gezeigt, stimulierte eine Behandlung mit TP508 allein mit einer Konzentration von 300 nM (etwa 0,7 μg pro ml) den Einbau von [³⁵S]-Sulfat zu etwa 50 über den Kontrollen. Es gab auch eine große Stimulation durch 30 μM TP508 (etwa 70 μg pro ml), jedoch gab es bei Messungen bei dieser Konzentration eine große relative Standardabweichung.
Tabelle 3. Wirkung des NPAR-Agonisten TP508 auf den Einbau von [³⁵S]-Sulfat in Proteoglycane
Beispiel 4: Herstellung von Polymilchsäure/Polyglykolsäure-Copolymer-Mikrokügelchen von TP508
Eine Doppelemulsionstechnik wurde zur Herstellung von Mikrokügelchen von TP508 enthaltendem Polymilchsäure/Poly glykolsäure-Copolymer (PLGA) verwendet. Kurz gesagt, wurden die Matrixkomponenten in Methylenchlorid gelöst und TP508 in Wasser gelöst. Die beiden wurden allmählich zusammengemischt, während eine Verwirbelung durchgeführt wurde, um eine Wasser-in-Öl (W/O)-Emulsion zu bilden. Polyvinylalkohol (0,3 % in Wasser) wurde zu der Emulsion mit weiterem Verwirbeln gegeben, um die zweite Emulsion (O/W) zu bilden, wodurch eine doppelte Emulsion gebildet wurde: eine aus PLGA-Tröpfchen bestehende O/W-Emulsion und in diesen Tröpfchen eine zweite disperse Phase, die aus TP508 in Wasser bestand. Bei der Phasentrennung bildeten die PLGA-Tröpfchen diskrete Mikrokügelchen, die TP508 enthaltende Hohlräume enthielten. Zum Bewirken der Phasentrennung der Mikrokügelchen wurde eine 2%-ige Isopropylalkohollösung zugesetzt. Die Teilchen wurden durch Zentrifugation gewonnen und dann lyophilisiert, um verbliebene Feuchtigkeit zu entfernen. Die Zusammensetzung der Matrix wurde variiert, wobei Mikrokügelchen mit unterschiedlichen Freisetzungskinetiken gebildet wurden (Tabelle 4).
Tabelle 4. Zusammensetzung unterschiedlicher Mikrokügelchenformulierungen
Der mittlere Durchmesser der Mikrokügelchen wurde in einem Coulter Counter ermittelt und die Arzneimitteleinfangeffizienz wurde durch einen spektrophotometrischen Test bei 276 nm nach dem Auflösen einer abgewogenen Mikrokügelchenprobe in Methylenchlorid und Extraktion des freigesetzten Arzneimittels in Wasser ermittelt (Tabelle 5).
Tabelle 5. Formulierungsdurchmesser und Arzneimitteleinfangeffizienz
Zur Ermittlung der Freisetzung von TP508 aus den unterschiedlichen PLGA-Matrizes wurden 20 mg der Mikrokügelchen in 1,0 ml PBS, das in 1,5-ml-Polypropylenmikrozentrifugenröhrchen enthalten war, gegeben. Die Röhrchen wurden bei 37 °C inkubiert und mit 60 rpm geschüttelt. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden die Röhrchen zentrifugiert und der Überstand, der freigesetztes TP508 enthielt, entfernt und für eine anschließende Analyse eingefroren. Frisches PBS wurde zu den Mikrokügelchen gegeben und die Inkubation wurde fortgesetzt. TP508 in dem Überstand wurde durch die Extinktion bei 276 nm ermittelt. Für jede Formulierung wurden vierfache Bestimmungen der Freisetzung durchgeführt. Die Formulierungen B und D zeigten während 28 Tagen Inkubation bei 37 °C keine nachweisbare Arzneimittelfreisetzung. Die übrigen Formulierungen setzten alle nachweisbare Mengen von TP508 frei, obwohl in allen Fällen die freigesetzte Arzneimittelmenge innerhalb von 3–4 Tagen unter nachweisbare Grenzen (< 1 μg/mg Matrix/Tag) fiel. Die Formulierungen A und C zeigten die größte Freisetzung von TP508, wobei 60–80 des eingefangenen Arzneimittels über 3–4 Tage freigesetzt wurde. Die Formulierung C zeigte die schnellste Freisetzungskinetik und wurde zum Testen in dem in Beispiel 5 beschriebenen Kaninchenknorpeldefektmodell gewählt.
Beispiel 5: Der NPAR-Agonist TP508 stimuliert das Knorpelwachstum in Kaninchenmodellen
Junge männliche New Zealand-Kaninchen (2–3 kg) (n = 15) wurden anästhesiert und erhielten bilateral medial longitudinale parapatellare Arthrotomien. Die Haut, das subkutane Gewebe und die Gelenkkapsel wurden unter Verwendung von Elektrokauterisierung zur Minimierung des Blutens eingeschnitten. Die Gelenkoberfläche wurde durch laterale Dislokation der Patella freigelegt. Ein Defekt voller Dicke eines Durchmessers von 3 mm und einer Tiefe von 1–2 mm wurde in der Fovea trochlearis des Femurs unter Verwendung eines chirurgischen Bohrers und eines gespitzen Bohreinsatzes aus nichtrostendem Stahl hergestellt. Das Ziel war eine Ausweitung des Defekts in die subchondrale Platte ohne Durchstoßen des subchondralen Knochens.
Die Kaninchen wurden in drei Gruppen geteilt. Bei jedem Kaninchen wurden sowohl der rechte als auch der linke Fovea trochlearis-Defekt mit der gleichen Behandlung gefüllt. Für diese Untersuchung wurde TP508 in PLGA-Mikrokügelchen mit gesteuerter Freisetzung, die wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt wurden (Formulierung C), formuliert. Die Mikrokügelchen wurden mit ausreichendem Pluronic F68-Gel (5 (Gew/V)) gemischt, um die Kügelchen zu einer pastenähnlichen Konsistenz, die problemlos in den Defekt gepackt werden konnte, zusammenzubinden. Die Kontrollgruppe erhielt PLGA-Mikrokügelchen ohne TP508 in beiden Defekten. Die behandelten Gruppen erhielten Mikrokügelchen, die entweder 10 oder 50 mg von TP508/Defekt enthielten. Ein Kaninchen von jeder Gruppe wurde nach 4 Wochen getötet, 2 von jeder Gruppe wurden nach 6 Wochen getötet und die übrigen Tiere wurden nach 9 Wochen getötet. Proben wurden fixiert und zur histologischen Analyse verarbeitet.
Zum Zeitpunkt der Tötung schien in den Kontrolldefekten beträchtliches faserartiges Granulationsgewebe und kein Anzeichen für weißes knorpelähnliches Material vorhanden zu sein. Im Gegensatz dazu wies der Defekt ein nahezu gleichförmiges dichtes weißes Material auf, das die Defekte von der mit 10 μg behandelten Gruppe und mit 50 μg behandelten Gruppe füllte. 6 Wochen nach der Operation waren die makroskopischen Unterschiede zwischen behandelten und Kontrolldefekten nicht so ausgeprägt.
Die Histologie der Proben von 4 Wochen zeigte, dass die Kontrolldefekte tatsächlich mit etwas gefüllt waren, das frühes Granulationsgewebe einschließlich entzündlicher und Fibroblastenzellen darzustellen schien. Im Gegensatz dazu schienen die mit 10 und 50 Mikrogramm behandelten Defekte eine große Zahl von Chondrocyten und frühe Zeichen einer Knorpelbildung aufzuweisen. Diese Wirkung wurde nach 6 Wochen drastischer beobachtet. Kontrollen zeigten eine geringe Menge Bindegewebe, jedoch wenig Anzeichen einer Knorpelreparatur. Im Gegensatz dazu schien bei sowohl den mit 10 μg als auch 50 μg behandelten Defekten eine gute Integration mit hyalinem Knorpel, der sich an der Oberseite des Defekts bildete, und eine ausgedehnte Reparatur von subchondralem Knochen vorhanden zu sein.
Neun Wochen mit TP508 behandelte Defekte zeigten eine vorwiegend hyaline Matrix mit Anzeichen für einen signifikanten Aggrecangehalt, was durch positive Safranin-O-Anfärbung gezeigt wurde. In den meisten Fällen bestand kein Unter schied des Aggrecangehalts zwischen der Reparaturstelle und nativem Gewebe. Histologische Ergebnisse wurden quantitativ unter Verwendung eines Gradierungssystems, das von Freed et al., J. Biomed. Materials Res. 28: 891–899 (1944) ausgehend von dem Schema von O'Driscoll et al., J. Bone Joint Surg. 126: 1448–1452 (2000) angepasst wurde, mit einer maximalen Punktezahl von 25 für normalen artikulären Knorpel festgestellt. Experimentelle, mit TP508 behandelte Defekte erreichten mittlere Durchschnittswerte der Punktezahlen, die signifikant höher als die von Kontrolldefekten waren (Tabelle 6). Tabelle 6. Histologiepunktbewertung für die Untersuchung artikulärer Defekte

Milligramm TP508 Reparaturpunktezahl ± Standardabweichung

0 9,4 ± 1,6

10 18,6 ± 1,4

50 19,8 ± 1,0
Mit Peptid behandelte Defekte wurden mit glatten artikulären Oberflächen repariert und waren an der Verbindungsstelle zwischen Reparatur- und nativem Gewebe gut verbunden. Die Qualität von Kontrollreparaturgewebe wurde als hauptsächlich Faserknorpel mit Gelenkoberflächen schlechter Qualität charakterisiert. Die Integration an der Verbindungsstelle zwischen Reparatur- und nativem Gewebe war üblicherweise schlecht. Insgesamt war die Qualität von mit TP508 repariertem Knorpel gegenüber unbehandelten Kontrolldefekten signifikant erhöht. Diese verbesserte Qualität von Reparaturgewebe sollte zu einer dauerhafteren und funktionalen Wiederherstellung der Gelenkbiomechanik und einer Verringerung des Auftretens von Osteoarthritis bei an Knorpelverletzungen leidenden Patienten führen.

Claims

Verwendung eines Agonisten des nicht-proteolytisch aktivierten Thrombin-Rezeptors bei der Herstellung eines Medikaments zur Stimulierung von Knorpelwachstum oder -reparatur an einer Stelle in einem Subjekt, die solches Wachstum oder eine solche Reparatur benötigt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Stelle ein arthritisches Gelenk ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Stelle wegen Knorpelschädigung oder -abnahme behandelt wird.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Stelle wegen Knorpelschädigung oder -abnahme aufgrund einer Verletzung behandelt wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Agonist ein Thrombinpeptidderivat ist.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei der Agonist ein Thrombinpeptidderivat ist, das ein Polypeptid der folgenden Strukturformel: Asp-Ala-R, worin R eine konservierte Serinesterasesequenz ist, umfasst.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei das Thrombinpeptidderivat die Aminosäuresequenz Arg-Gly-Asp-Ala (SEQ ID NO: 3) umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei das Thrombinpeptidderivat zwischen 12 und 23 Aminosäuren aufweist.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei die konservierte Serinesterasesequenz die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 (Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val) oder eines C-terminal gestutzten Fragments derselben mit mindestens sechs Aminosäuren besitzt, wobei null, eine, zwei oder drei Aminosäuren in der konservierten Serinesterasesequenz von der entsprechenden Position von SEQ ID NO: 1 verschieden sind.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei die konservierte Serinesterasesequenz die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 (Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val) oder eines C-terminal gestutzten Fragments derselben mit mindestens neun Aminosäuren besitzt, wobei null, eine oder zwei Aminosäuren in der konservierten Serinesteraseregion konservative Substitutionen der entsprechenden Aminosäure in SEQ ID NO: 1 sind.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei die konservierte Serinesterasesequenz die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 (Cys-X₁-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X₂-Val, worin X₁ Gly oder Gln bedeutet und X₂ Phe, Met, Leu, His oder Val bedeutet) oder eines C-terminal gestutzten Fragments von SEQ ID NO: 2 besitzt, wobei das Fragment mindestens sechs Aminosäuren besitzt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 5 bis 8, wobei das Thrombinpeptidderivat die Aminosäuresequenz Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-X₁-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X₂-Val (SEQ ID NO: 4), worin X₁ Glu oder Gln bedeutet und X₂ Phe, Met, Leu, His oder Val bedeutet, umfasst.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei das Thrombinpeptidderivat die Aminosäuresequenz Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val- (SEQ ID NO: 5) oder eines N-terminal gestutzten Fragments derselben besitzt, wobei null, eine, zwei oder drei Aminosäuren an den Positionen 1–9 in dem Thrombinpeptidderivat von der Aminosäure an der entsprechenden Position von SEQ ID NO: 5 verschieden sind.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei das Thrombinpeptidderivat die Aminosäuresequenz Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val- (SEQ ID NO: 5) oder eines N-terminal gestutzten Fragments derselben besitzt, wobei null, eine oder zwei Aminosäuren an den Positionen 1–9 in dem Thrombinpeptidderivat konservative Substitutionen der Aminosäure an der entsprechenden Position von SEQ ID NO: 5 sind.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei das Thrombinpeptidderivat die Sequenz Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val (SEQ ID NO: 5) besitzt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei das Medikament eine pharmazeutische Zusammensetzung ist, die zusätzlich einen implantierbaren biologisch kompatiblen Träger umfasst.
Verwendung nach Anspruch 16, wobei der Träger ein Polymilchsäure/Polyglykolsäure-Homopolymer oder -Copolymer umfasst.
Verfahren zum Züchten von Chondrocyten in vitro, das das Züchten der Chondrocyten in Gegenwart einer stimulierenden Menge eines Agonisten des nicht-proteolytischen Thrombin-Zelloberflächenrezeptors umfasst.