KR102006036B1 - 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸 및 이의 제조 및 이용 방법 - Google Patents

히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸 및 이의 제조 및 이용 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸 및 이를 만들고 이를 이용하는 분야에 관계한다.

Description

히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸 및 이의 제조 및 이용 방법{HYALURONIC ACID-BINDING SYNTHETIC PEPTIDOGLYCANS, PREPARATION, AND METHODS OF USE}
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 35 U.S.C. § 119(e)에 의거하여 2011년 5월 24일자로 제출된 미국 가출원 61/489,602 및 2011년 10월 24일자로 제출된 미국 가출원 61/550,621을 우선권으로 주장한다. 이들 두 개시내용은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다.
기술 분야
본 발명은 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸 및 이를 만들고 이용하는 방법들의 분야에 관한 것이다.
배경 및 본 발명의 요약
관절 연골은 신체에서 뼈 보호에 중요한 성분이다. 구체적으로, 관절 연골은 뼈 움직임을 위하여 거의-마찰없는 표면을 제공하고, 또한 관절에 또한 압축 강도를 제공함으로써 손상으로부터 관절 뼈를 보호하는 기능을 한다. 관절 연골은 3가지 주요 성분들: 콜라겐 골격, 히알루론산 (HA), 및 어그리칸(aggrecan)으로부터 유도된 세포밖 매트릭스 (ECM)를 광범위하게 포함한다. 관절 연골의 재료 조성물은 조직의 생물학적, 화학적 그리고 기계적 성질들을 드러낸다. 건강한 연골의세포밖 매트릭스 (ECM)는 주로 콜라겐 미소섬유의 네트워트 (15-22% 습식 중량 유형 II 콜라겐), 프로테오글리칸 (4-7% 습식 중량), 당단백질, 물 (60-85%) 그리고 전해질로 주로 구성되는데, 이들은 심도-의존적(depth-dependent) 구조 그리고 기계적 이방성(anisotropy)을 가진 점탄성(viscoelastic) 조직을 낳는다.
연골 퇴화 및 마멸(wear)은 골관절염 (OA)의 특질이다. OA의 초기 단계 동안 연골에서 주요 프로테오글리칸인 어그리칸이 퇴화되는 초기 성분이다. 어그리칸 단량체는 공모양의 도메인 그리고 링크 단백질을 통하여 섬유성 히알루론산에 결합된 공유적으로 부착된 글리코사미노글리칸 (GAG) 측쇄를 가진 단백질 코어다. 프로테아제, 이를 테면 어그리카나제는 특정 부위에서 어그리칸을 절단하여, 단백질 단편들과 HA에 재결합할 수 없는 자유 GAG 쇄를 생성시킨다. 대신, 이들 자유 GAG 쇄들은 매트릭스로부터 압축되고, 이로써 압축 강도가 감소될 뿐만 아니라, 전(pro)-염증성 사이토킨 및 매트릭스 메탈로프로테아제의 증가가 시작된다. 어그리칸의 존재는 하부 콜라겐 섬유들을 단백질분해성 절단으로부터 보호하는 프로테아제의 확산을 감소시킨 것으로 나타났다. 어그리칸의 상실은 정상적인 연골에서도 발생되지만, OA와 당장 연관되지는 않는다. 그러나, 유형 II 콜라겐의 상실은 비가역적인 과정으로 간주되며, 이는 조숙한 마멸로 이어진다.
골관절염은 미국에서만 2천7백만 사람들에게 영향을 끼친 가장 통상적인 형태의 관절염이다. 가장 흔한 골관절염의 증상은 관절에서 헤아릴수 없는 통증, 굳음, 그리고 말랑해진 그리고 염증이 생긴 관절을 포함한다. 골관절염의 진행된 단계는 관절의 못움직임과 하부 뼈에 손상의 원인이 되는 관절 연골의 완전한 퇴화로 이어질 수 있다. 미국에서 관절염에 드는 직접적인 비용은 매년 대략 $1855 억 달러로 예상된다.
골관절염의 치료를 위하여 생활습관의 변화와 다양한 약물이 대개 이용되지만, 결함성 연골의 재생 및 연골 상실로 인한 증상의 완화에는 거의 성공적이지 못하다. 골관절염의 진행을 중단시키고, 그리고 기존 손상을 복구하지 못하는 이러한 무능력으로 인하여 일반적으로 침습성의 최종 단계 연골 대체 수술로 이어진다. 따라서, 골관절염을 위한 대안 치료 선택권이 절실히 요구된다.
본 개시내용은 병에 걸린 환자에서 손상된 연골을 회복시키는데 이용될 수 있는, 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸을 포함하는 연골 재생을 위한 개선된 생물재료와 함께, 합성 펩티도글리칸을 형성하고, 그리고 이용하는 방법들을 기술한다. 더욱이, 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸은 기능적으로 어그리칸을 모방하고, 어그리카나제 퇴화를 저지하고, 그리고 단백질분해성 퇴화를 제한시키도록 기획된다. 어그리칸에서 볼 수 있는 고유한 아미노산 서열의 부재는 이들 분자가 단백질분해성 절단에 덜 민감하도록 만든다.
다음 일련 번호의 구체예들이 고려되지만, 이에 한정되지는 않는다:
1. 글리칸에 접합된(conjugated) 합성 펩티드를 포함하는 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸, 이때 이 합성 펩티드는 히알루론산-결합 서열을 포함한다.
2. 조항 1의 합성 펩티도글리칸에 있어서, 이 합성 펩티드는 공식 B1-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-B2의 아미노산 서열을 포함하고,
이때 X8은 존재하거나 또는 존재하지 않으며,
이때 B1은 염기성 아미노산이고,
이때 B2는 염기성 아미노산이며, 그리고
이때 X1-X8은 비-산성 아미노산이다.
3. 조항 1 또는 2의 합성 펩티도글리칸에 있어서, 이때 이 합성 펩티드는 다음으로 구성된 집단으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다:
Figure 112013117217243-pct00001
상기 펩티드 구체예들 각각에서, 이 펩티드는 이 펩티드의 C-말단에 부착된 글리신-시스테인 (GC), 또는 N-말단에 부찰된 글리신-시스테인-글리신 (GCG)을 보유할 수 있다.
4. 조항 1 내지 3중 임의의 하나의 합성 펩티도글리칸에 있어서, 이 글리칸은 덱스트란, 콘드로이틴, 콘드로이틴 술페이트, 데르마탄, 데르마탄 술페이트, 헤파란, 헤파린, 케라틴, 케라탄 술페이트, 그리고 히알루론산으로 구성된 군으로부터 선택된다.
5. 조항 1 내지 4중 임의의 하나의 합성 펩티도글리칸에 있어서, 글리칸은 콘드로이틴 술페이트 그리고 케라탄 술페이트로 구성된 군으로부터 선택된다.
6. 조항 1 내지 5중 임의의 하나의 합성 펩티도글리칸에 있어서, 합성 펩티도글리칸은 어그리카나제에 저항성이다.
7. 조항 1 내지 6중 임의의 하나의 합성 펩티도글리칸에 있어서, 합성 펩티도글리칸은 동결건조된다.
8. 공식 PnGx의 화합물, 이때 n은 1 내지 20이고;
이때 x는 1 내지 20이고;
이때 P는 히알루론산 결합 서열을 포함하는 약 5 내지 약 40개 아미노산의 합성 펩티드이고; 그리고
이때 G는 글리칸이다.
9. 공식 (PnL)xG의 화합물, 이때 n은 1 내지 20이다;
이때 x는 1 내지 20이고;
이때 P는 히알루론산 결합 서열을 포함하는 약 5 내지 약 40개 아미노산의 합성 펩티드이고;
이때 L은 링커이고; 그리고
이때 G 글리칸이다.
10. 공식 P(LGn)x의 화합물, 이때 n은 1 내지 20이다;
이때 x는 1 내지 20이고;
. 이때 P는 히알루론산 결합 서열을 포함하는 약 5 내지 약 40개 아미노산의 합성 펩티드이고;
이때 L 링커이고; 그리고
이때 G 글리칸이다.
11. 공식 PnGx의 화합물, 이때 n은 MWG/1000이고이고;
이때 MWG는 최대 1 kDa에 가까운 G의 분자량이고;
이때 x는 1 내지 20이고;
이때 P는 히알루론산 결합 서열을 포함하는 약 5 내지 약 40개 아미노산의 합성 펩티드이고; 그리고
이때 G 글리칸이다.
12. 공식 (PnL)xG의 화합물 이때 n은 MWG/1000이고이고;
이때 MWG는 최대 1 kDa에 가까운 G의 분자량이고;
이때 x는 1 내지 20이고;
이때 P는 히알루론산 결합 서열을 포함하는 약 5 내지 약 40개 아미노산의 합성 펩티드이고;
이때 L 링커이고; 그리고
이때 G 글리칸이다.
13. 조항 8 내지 12중 임의의 하나의 화합물에 있어서, 이 합성 펩티드는 공식 B1-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-B2의 아미노산 서열을 포함하고,
이때 X8은 존재하거나 또는 존재하지 않으며,
이때 B1은 염기성 아미노산이고,
이때 B2는 염기성 아미노산이며, 그리고
이때 X1-X8은 비-산성 아미노산이다.
14. 조항 8 내지 13중 임의의 하나의 화합물에 있어서, 이 합성 펩티드는 다음으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다:
Figure 112013117217243-pct00002
상기 각 펩티드 구체예들에 있어서, 이 펩티드는 이 펩티드의 C-말단에 부착된 글리신-시스테인 (GC), 또는 N-말단에 부찰된 글리신-시스테인-글리신 (GCG)을 보유할 수 있다.
15. 조항 8 내지 14중 임의의 하나의 화합물에 있어서, 글리칸은 덱스트란, 콘드로이틴, 콘드로이틴 술페이트, 데르마탄, 데르마탄 술페이트, 헤파란, 헤파린, 케라틴, 케라탄 술페이트, 그리고 히알루론산으로 구성된 군으로부터 선택된다.
16. 조항 8 내지 15중 임의의 하나의 화합물에 있어서, 글리칸은 콘드로이틴 술페이트 그리고 케라탄 술페이트로 구성된 군으로부터 선택된다.
17. 조항 8 내지 16중 임의의 하나의 화합물에 있어서, 이 합성 펩티도글리칸은 어그리카나제에 저항성이다.
18. 중합된 콜라겐, 히알루론산, 그리고 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸을 포함하는 공작된(engineered) 콜라겐 매트릭스.
19. 조항 18의 공작된 콜라겐 매트릭스에 있어서, 콜라겐은 유형 I 콜라겐, 유형 II 콜라겐, 유형 III 콜라겐, 유형 IV 콜라겐, 유형 IX 콜라겐, 유형 XI 콜라겐, 그리고 이의 조합들로 구성된 군으로부터 선택된다.
20. 조항 18 또는 19의 공작된 콜라겐 매트릭스에 있어서, 이 합성 펩티도글리칸의 펩티드 성분은 공식 B1-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-B2의 아미노산 서열을 포함하는데,
이때 X8은 존재하거나 또는 존재하지 않으며,
이때 B1은 염기성 아미노산이고,
이때 B2는 염기성 아미노산이며, 그리고
이때 X1-X8은 비-산성 아미노산이다.
21. 조항 18 내지 20중 임의의 하나의 공작된 콜라겐 매트릭스에 있어서, 이 합성 펩티도글리칸의 펩티드 성분은 다음으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다:
Figure 112013117217243-pct00003
상기 각 펩티드 구체예들에 있어서, 이 펩티드 이 펩티드의 C-말단에 부착된 글리신-시스테인 (GC), 또는 N-말단에 부찰된 글리신-시스테인-글리신 (GCG)을 보유할 수 있다.
22. 조항 18 내지 212중 임의의 하나의 공작된 콜라겐 매트릭스에 있어서, 이 합성 펩티도글리칸의 글리칸 성분은 덱스트란, 콘드로이틴, 콘드로이틴 술페이트, 데르마탄, 데르마탄 술페이트, 헤파란, 헤파린, 케라틴, 케라탄 술페이트, 그리고 히알루론산으로 구성된 군으로부터 선택된다.
23. 조항 18 내지 22중 임의의 하나의 공작된 콜라겐 매트릭스에 있어서, 이 합성 펩티도글리칸의 글리칸 성분은 콘드로이틴 술페이트 그리고 케라탄 술페이트로 구성된 군으로부터 선택된다.
24. 조항 18 내지 23중 임의의 하나의 공작된 콜라겐 매트릭스에 있어서, 이 합성 펩티도글리칸은 어그리카나제에 저항성이다.
25. 조항 18 내지 24중 임의의 하나의 공작된 콜라겐 매트릭스에 있어서, 매트릭스는 조직 이식편으로 효과적이다.
26. 조항 25의 공작된 콜라겐 매트릭스에 있어서, 조직 이식편은 환자에게 이식된다.
27. 조항 18 내지 24중 임의의 하나의 공작된 콜라겐 매트릭스에 있어서, 매트릭스는 겔 형태이다.
28. 조항 27의 공작된 콜라겐 매트릭스에 있어서, 겔은 환자에게 주사로 투여된다.
29. 조항 18 내지 24중 임의의 하나의 공작된 콜라겐 매트릭스에 있어서, 매트릭스는 세포의 시험관 배양물을 위한 조성물로 효과적이다.
30. 조항 29의 공작된 콜라겐 매트릭스에 있어서, 매트릭스는 세포의 외생성 집단을 더 포함한다.
31. 조항 30의 공작된 콜라겐 매트릭스에 있어서, 세포는 연골세포 및 줄기세포로 구성된 군으로부터 선택된다.
32. 조항 31의 공작된 콜라겐 매트릭스에 있어서, 줄기세포는 골아세포(osteoblasts), 골원성 세포(osteogenic cell), 그리고 간엽성(mesenchymal) 줄기세포로 구성된 군으로부터 선택된다.
33. 조항 18 내지 32중 임의의 하나의 공작된 콜라겐 매트릭스에 있어서, 하나 또는 그 이상의 영양제를 더 포함한다.
34. 조항 18 내지 33중 임의의 하나의 공작된 콜라겐 매트릭스에 있어서, 하나 또는 그 이상의 성장 인자를 더 포함한다.
35. 조항 18 내지 34중 임의의 하나의 공작된 콜라겐 매트릭스에 있어서, 이 매트릭스 살균된다.
36. 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸을 포함하는 연골세포 또는 줄기세포의 시험관 배양을 위한 조성물.
37. 조항 36의 조성물에 있어서, 이 합성 펩티도글리칸의 펩티드 성분은공식 B1-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-B2의 아미노산 서열을 포함하는데,
이때 X8은 존재하거나 또는 존재하지 않으며,
이때 B1은 염기성 아미노산이며,
이때 B2는 염기성 아미노산이고, 그리고
이때 X1-X8은 비-산성 아미노산이다.
38. 조항 36 또는 37의 조성물에 있어서, 이 합성 펩티도글리칸의 펩티드 성분은 다음으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다:
Figure 112013117217243-pct00004
상기 각 펩티드 구체예들에 있어서, 이 펩티드 이 펩티드의 C-말단에 부착된 글리신-시스테인 (GC), 또는 N-말단에 부찰된 글리신-시스테인-글리신 (GCG)을 보유할 수 있다.
39. 조항 36 내지 38중 임의의 하나의 조성물에 있어서, 이 합성 펩티도글리칸의 글리칸 성분은 덱스트란, 콘드로이틴, 콘드로이틴 술페이트, 데르마탄, 데르마탄 술페이트, 헤파란, 헤파린, 케라틴, 케라탄 술페이트, 그리고 히알루론산으로 구성된 군으로부터 선택된다.
40. 조항 36 내지 39중 임의의 하나의 조성물에 있어서, 이 합성 펩티도글리칸의 글리칸 성분은 콘드로이틴 술페이트 그리고 케라탄 술페이트로 구성된 군으로부터 선택된다.
41. 조항 36 내지 40중 임의의 하나의 조성물에 있어서, 이 합성 펩티도글리칸은 어그리카나제에 저항성이다.
42. 조항 36 내지 41중 임의의 하나의 조성물에 있어서, 이 줄기세포는 골아세포, 골원성 세포, 그리고 간엽성 줄기세포로 구성된 군으로부터 선택된다.
43. 조항 36 내지 42중 임의의 하나의 조성물은 하나 또는 그 이상의 영양제를 더 포함한다.
44. 조항 36 내지 43중 임의의 하나의 조성물은 하나 또는 그 이상의 성장 인자를 더 포함한다.
45. 조항 36 내지 44중 임의의 하나의 조성물에 있어서, 이 조성물은 살균된다.
46. 기존의 생물재료 연골 또는 골 대체 재료에 추가용으로 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸을 포함하는 생물재료 연골 또는 골 대체 조성물에 대한 첨가제.
47. 조항 46에 있어서, 이 합성 펩티도글리칸의 펩티드 성분은 공식 B1-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-B2의 아미노산 서열을 포함하는데,
이때 X8은 존재하거나 또는 존재하지 않으며,
이때 B1은 염기성 아미노산이며,
이때 B2는 염기성 아미노산이고, 그리고
이때 X1-X8은 비-산성 아미노산이다.
48. 조항 46 또는 47의 첨가제에 있어서, 이 합성 펩티도글리칸의 펩티드 성분은 다음으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다:
Figure 112013117217243-pct00005
상기 각 펩티드 구체예들에 있어서, 이 펩티드 이 펩티드의 C-말단에 부착된 글리신-시스테인 (GC), 또는 N-말단에 부찰된 글리신-시스테인-글리신 (GCG)을 보유할 수 있다.
49. 조항 46 내지 48중 임의의 하나의 첨가제에 있어서, 이 합성 펩티도글리칸의 글리칸 성분은 덱스트란, 콘드로이틴, 콘드로이틴 술페이트, 데르마탄, 데르마탄 술페이트, 헤파란, 헤파린, 케라틴, 케라탄 술페이트, 그리고 히알루론산으로 구성된 군으로부터 선택된다.
50. 조항 46 내지 49중 임의의 하나의 첨가제에 있어서, 이때 글리칸 콘드로이틴 술페이트 그리고 케라탄 술페이트로 구성된 군으로부터 선택된다.
51. 조항 46 내지 50중 임의의 하나의 첨가제에 있어서, 이 합성 펩티도글리칸은 어그리카나제에 저항성이다.
52. 환자의 관절염을 치료하는 방법에 있어서, 전술한 방법은 이 환자에게 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸을 투여하는 단계를 포함하고, 이때 이 합성 펩티도글리칸은 관절염과 연합된 증상을 감소시킨다.
53. 조항 52의 방법에 있어서, 이 합성 펩티도글리칸의 펩티드 성분은공식 B1-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-B2의 아미노산 서열을 포함하고,
이때 X8은 존재하거나 또는 존재하지 않으며,
이때 B1은 염기성 아미노산이고,
이때 B2는 염기성 아미노산이며, 그리고
이때 X1-X8은 비-산성 아미노산이다.
54. 조항 52 또는 53의 방법에 있어서, 이 합성 펩티도글리칸의 펩티드 성분은 다음으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다:
Figure 112013117217243-pct00006
상기 각 펩티드 구체예들에 있어서, 이 펩티드 이 펩티드의 C-말단에 부착된 글리신-시스테인 (GC), 또는 N-말단에 부찰된 글리신-시스테인-글리신 (GCG)을 보유할 수 있다.
55. 조항 52 내지 54중 임의의 하나의 방법에 있어서, 이 합성 펩티도글리칸의 글리칸 성분은 덱스트란, 콘드로이틴, 콘드로이틴 술페이트, 데르마탄, 데르마탄 술페이트, 헤파란, 헤파린, 케라틴, 케라탄 술페이트, 그리고 히알루론산으로 구성된 군으로부터 선택된다.
56. 조항 52 내지 55중 임의의 하나의 방법에 있어서, 글리칸은 콘드로이틴 술페이트 그리고 케라탄 술페이트로 구성된 군으로부터 선택된다.
57. 조항 52 내지 56중 임의의 하나의 방법에 있어서, 이 합성 펩티도글리칸은 어그리카나제에 저항성이다.
58. 조항 52 내지 57중 임의의 하나의 방법에 있어서, 관절염은 골관절염이다.
59. 조항 52 내지 57중 임의의 하나의 방법에 있어서, 관절염은 류마티즘성 관절염이다.
60. 조항 52 내지 59중 임의의 하나의 방법에 있어서, 이 합성 펩티도글리칸은 환자에게 주사에 의해 투여된다.
61. 조항 60의 방법에 있어서, 주사는 관절내 주사이다.
62. 조항 60의 방법에 있어서, 주사는 환자의 관절 캡슐 안으로 주사된다.
63. 조항 52 내지 62중 임의의 하나의 방법에 있어서, 이 합성 펩티도글리칸은 바늘 또는 주입 장치를 이용하여 투여된다.
64. 조항 52 내지 63중 임의의 하나의 방법에 있어서, 이 합성 펩티도글리칸은 윤활제로 작용한다.
65. 조항 52 내지 64중 임의의 하나의 방법에 있어서, 이 합성 펩티도글리칸은 골 관절에서 골 상실 또는연골 상실을 방지한다.
66. 생물재료 또는 골 연골 대체를 준비하는 방법에 있어서, 전술한 방법은 이 합성 펩티도글리칸과 기존의 생물재료 또는 골 연골 대체 재료를 복합하는 단계를 포함한다.
67. 조항 66의 방법에 있어서, 이 합성 펩티도글리칸의 펩티드 성분은공식 B1-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-B2의 아미노산 서열을 포함하는데,
이때 X8은 존재하거나 또는 존재하지 않으며,
이때 B1은 염기성 아미노산이고,
이때 B2는 염기성 아미노산이며, 그리고
이때 X1-X8은 비-산성 아미노산이다.
68. 조항 66 또는 67의 방법에 있어서, 이 합성 펩티도글리칸의 펩티드 성분은 다음으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다:
Figure 112013117217243-pct00007
상기 각 펩티드 구체예들에 있어서, 이 펩티드 이 펩티드의 C-말단에 부착된 글리신-시스테인 (GC), 또는 N-말단에 부찰된 글리신-시스테인-글리신 (GCG)을 보유할 수 있다.
69. 조항 66 내지 68중 임의의 하나의 방법에 있어서, 이 합성 펩티도글리칸의 글리칸 성분은 덱스트란, 콘드로이틴, 콘드로이틴 술페이트, 데르마탄, 데르마탄 술페이트, 헤파란, 헤파린, 케라틴, 케라탄 술페이트, 그리고 히알루론산으로 구성된 군으로부터 선택된다.
70. 조항 66 내지 69중 임의의 하나의 방법에 있어서, 글리칸 콘드로이틴 술페이트 그리고 케라탄 술페이트로 구성된 군으로부터 선택된다.
71. 조항 66 내지 70중 임의의 하나의 방법에 있어서, 이 합성 펩티도글리칸은 어그리카나제에 저항성이다.
72. 환자에게서 히알루론산 퇴화를 감소 또는 예방하는 방법에 있어서, 전술한 방법은 이 환자에게 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸을 투여하는 것을 포함한다.
73. 조항 72의 방법에 있어서, 이 합성 펩티도글리칸의 펩티드 성분은공식 B1-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-B2의 아미노산 서열을 포함하는데,
이때 X8은 존재하거나 또는 존재하지 않으며,
이때 B1은 염기성 아미노산이며,
이때 B2는 염기성 아미노산이고, 그리고
이때 X1-X8은 비-산성 아미노산이다.
74. 조항 72 또는 73의 방법에 있어서, 이 합성 펩티도글리칸의 펩티드 성분은 다음으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다:
Figure 112013117217243-pct00008
상기 각 펩티드 구체예들에 있어서, 이 펩티드 이 펩티드의 C-말단에 부착된 글리신-시스테인 (GC), 또는 N-말단에 부찰된 글리신-시스테인-글리신 (GCG)을 보유할 수 있다.
75. 조항 72 내지 74중 임의의 하나의 방법에 있어서, 이 합성 펩티도글리칸의 글리칸 성분은 덱스트란, 콘드로이틴, 콘드로이틴 술페이트, 데르마탄, 데르마탄 술페이트, 헤파란, 헤파린, 케라틴, 케라탄 술페이트, 그리고 히알루론산으로 구성된 군으로부터 선택된다.
76. 조항 72 내지 75중 임의의 하나의 방법에 있어서, 글리칸 콘드로이틴 술페이트 그리고 케라탄 술페이트로 구성된 군으로부터 선택된다.
77. 조항 72 내지 76중 임의의 하나의 방법에 있어서, 이 합성 펩티도글리칸은 어그리카나제에 저항성이다.
78. 조항 72 내지 77중 임의의 하나의 방법에 있어서, 이 합성 펩티도글리칸은 환자에게 주사에 의해 투여된다.
79. 조항 78에 있어서, 주사는 관절내 주사이다.
80. 조항 78에 있어서, 주사는 환자의 관절 캡슐안으로 주사된다.
81. 조항 72 내지 80중 임의의 하나의 방법에 있어서, 히알루론산 퇴화 속도는 감소된다.
82. 환자에서 조직 결함을 교정 또는 변형시키는 방법에 있어서, 이 방법은 조직 결함 조직으로 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸을 투여하는 것을 포함하고, 이때 결함 교정 또는 변형된다.
83. 조항 82의 방법에 있어서, 이 합성 펩티도글리칸의 펩티드 성분은공식 B1-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-B2의 아미노산 서열을 포함하고,
이때 X8은 존재하거나 또는 존재하지 않으며,
이때 B1은 염기성 아미노산이며,
이때 B2는 염기성 아미노산이고, 그리고
이때 X1-X8은 비-산성 아미노산이다.
84. 조항 82 또는 83의 방법에 있어서, 이 합성 펩티도글리칸의 펩티드 성분은 다음으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다:
Figure 112013117217243-pct00009
상기 각 펩티드 구체예들에 있어서, 이 펩티드 이 펩티드의 C-말단에 부착된 글리신-시스테인 (GC), 또는 N-말단에 부찰된 글리신-시스테인-글리신 (GCG)을 보유할 수 있다.
85. 조항 82 내지 84중 임의의 하나의 방법에 있어서, 이 합성 펩티도글리칸의 글리칸 성분은 덱스트란, 콘드로이틴, 콘드로이틴 술페이트, 데르마탄, 데르마탄 술페이트, 헤파란, 헤파린, 케라틴, 케라탄 술페이트, 그리고 히알루론산으로 구성된 군으로부터 선택된다.
86. 조항 82 내지 85중 임의의 하나의 방법에 있어서, 글리칸 콘드로이틴 술페이트 그리고 케라탄 술페이트로 구성된 군으로부터 선택된다.
87. 조항 82 내지 86중 임의의 하나의 방법에 있어서, 이 합성 펩티도글리칸은 어그리카나제에 저항성이다.
88. 조항 82 내지 87중 임의의 하나의 방법에 있어서, 이 합성 펩티도글리칸은 환자에게 주사에 의해 투여된다.
89. 조항 88의 방법에 있어서, 주사는 피하에 놓는다.
90. 조항 82 내지 89중 임의의 하나의 방법에 있어서, 결함은 미용적 결함이다.
91. 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸을 포함하는 피부 충전물(dermal filler).
92. 조항 91의 피부 충전물에 있어서, 이 합성 펩티도글리칸의 펩티드 성분은 공식 B1-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-B2의 아미노산 서열을 포함하는데,
이때 X8은 존재하거나 또는 존재하지 않으며,
이때 B1은 염기성 아미노산이고,
이때 B2는 염기성 아미노산이며, 그리고
이때 X1-X8은 비-산성 아미노산이다.
93. 조항 91 또는 92의 피부 충전물에 있어서, 이 합성 펩티도글리칸의 펩티드 성분은 다음으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다:
Figure 112013117217243-pct00010
상기 각 펩티드 구체예들에 있어서, 이 펩티드 이 펩티드의 C-말단에 부착된 글리신-시스테인 (GC), 또는 N-말단에 부찰된 글리신-시스테인-글리신 (GCG)을 보유할 수 있다.
94. 조항 91 내지 93중 임의의 하나의 피부 충전물은 히알루론산을 더 포함한다.
95. 콜라겐 퇴화를 감소 또는 예방하는 방법에 있어서,
전술한 방법은
콜라겐 존재하에서 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸에히알루론산을 접촉시키는 단계와,
콜라겐 퇴화를 감소 또는 예방하는 단계를 포함한다.
96. 조항 95의 방법에 있어서, 합성 펩티도글리칸의 펩티드 성분은 공식 B1-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-B2의 아미노산 서열을 포함하며,
이때 X8은 존재하거나 또는 존재하지 않으며,
이때 B1은 염기성 아미노산이고,
이때 B2는 염기성 아미노산이며, 그리고
이때 X1-X8은 비-산성 아미노산이다.
97. 조항 95 또는 96의 방법에 있어서, 이 합성 펩티도글리칸의 펩티드 성분은 다음으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다:
Figure 112013117217243-pct00011
98. 조항 95 내지 97중 임의의 하나의 방법에 있어서, 이 합성 펩티도글리칸의 글리칸 성분은 덱스트란, 콘드로이틴, 콘드로이틴 술페이트, 데르마탄, 데르마탄 술페이트, 헤파란, 헤파린, 케라틴, 케라탄 술페이트, 그리고 히알루론산으로 구성된 군으로부터 선택된다.
99. 조항 95 내지 98중 임의의 하나의 방법에 있어서, 글리칸은 콘드로이틴 술페이트 그리고 케라탄 술페이트로 구성된 군으로부터 선택된다.
100. 조항 95 내지 99중 임의의 하나의 방법에 있어서, 이 합성 펩티도글리칸은 어그리카나제에 저항성이다.
101. 조항 95 내지 100중 임의의 하나의 방법에 있어서, 히알루론산 퇴화 속도는 감소된다.
102. 공작된 콜라겐 매트릭스에서 구멍 크기를 증가시키는 방법에 있어서,
전술한 방법은
콜라겐, 히알루론산, 그리고 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸을 복합하는 단계, 그리고
매트릭스에서 구멍 크기를 증가시키는 단계를 포함한다.
103. 조항 102의 방법에 있어서, 합성 펩티도글리칸의 펩티드 성분은 공식 B1-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-B2의 아미노산 서열을 포함하고,
이때 X8은 존재하거나 또는 존재하지 않으며,
이때 B1은 염기성 아미노산이고,
이때 B2는 염기성 아미노산이며, 그리고
이때 X1-X8은 비-산성 아미노산이다.
104. 조항 102 또는 103의 방법에 있어서, 이 합성 펩티도글리칸의 펩티드 성분은 다음으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다:
Figure 112013117217243-pct00012
105. 조항 102 내지 104중 임의의 하나의 방법에 있어서, 이 합성 펩티도글리칸의 글리칸 성분은 덱스트란, 콘드로이틴, 콘드로이틴 술페이트, 데르마탄, 데르마탄 술페이트, 헤파란, 헤파린, 케라틴, 케라탄 술페이트, 그리고 히알루론산으로 구성된 군으로부터 선택된다.
106. 조항 102 내지 105중 임의의 하나의 방법에 있어서, 글리칸은 콘드로이틴 술페이트 그리고 케라탄 술페이트로 구성된 군으로부터 선택된다.
107. 조항 102 내지 106중 임의의 하나의 방법에 있어서, 이 합성 펩티도글리칸은 어그리카나제에 저항성이다.
108. 조항 102 내지 107중 임의의 하나의 방법에 있어서, 매트릭스는 살균된다.
109. 조항 102 내지 108중 임의의 하나의 방법에 있어서, 매트릭스는 연골세포 또는 줄기세포를 더 포함한다.
110. 조항 109의 방법에 있어서, 줄기세포는 골아세포, 골원성 세포, 그리고 간엽성 줄기세포로 구성된 군으로부터 선택된다.
111. 조항 102 내지 110중 임의의 하나의 방법에 있어서, 매트릭스는 하나 또는 그 이상의 영양제를 더 포함한다.
112. 조항 102 내지 111중 임의의 하나의 방법에 있어서, 매트릭스는 하나 또는 그 이상의 성장 인자를 더 포함한다.
113. 콘드로이틴 술페이트 퇴화를 감소 또는 예방하는 방법에 있어서, 전술한 방법은
콜라겐 존재하에서 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸에히알루론산을 접촉시키는 단계와, 그리고
콘드로이틴 술페이트 퇴화를 감소 또는 예방하는 단계를 포함한다.
114. 조항 113의 방법에 있어서, 합성 펩티도글리칸의 펩티드 성분은 공식 B1-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-B2의 아미노산 서열을 포함하고,
이때 X8은 존재하거나 또는 존재하지 않으며,
이때 B1은 염기성 아미노산이고,
이때 B2는 염기성 아미노산이며, 그리고
이때 X1-X8은 비-산성 아미노산이다.
115. 조항 113 또는 114의 방법에 있어서, 이 합성 펩티도글리칸의 펩티드 성분은 다음으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다:
Figure 112013117217243-pct00013
116. 조항 113 내지 115중 임의의 하나의 방법에 있어서, 이 합성 펩티도글리칸의 글리칸 성분은 덱스트란, 콘드로이틴, 콘드로이틴 술페이트, 데르마탄, 데르마탄 술페이트, 헤파란, 헤파린, 케라틴, 케라탄 술페이트, 그리고 히알루론산으로 구성된 군으로부터 선택된다.
117. 조항 113 내지 116중 임의의 하나의 방법에 있어서, 글리칸은 콘드로이틴 술페이트 그리고 케라탄 술페이트로 구성된 군으로부터 선택된다.
118. 조항 113 내지 117중 임의의 하나의 방법에 있어서, 합성 펩티도글리칸은 어그리카나제에 저항성이다.
119. 조항 113 내지 118중 임의의 하나의 방법에 있어서, 콘드로이틴 술페이트 퇴화 속도는 감소된다.
120. 전술한 조항들중 임의의 하나의 합성 펩티도글리칸, 화합물, 공작된 콜라겐 매트릭스, 조성물, 첨가제, 방법, 또는 피부 충전물에 있어서, 이 합성 펩티도글리칸의 펩티드 성분은 이 펩티드의 C-말단에 부착된 글리신-시스테인 (GC)을 보유한다.
121. 전술한 조항들중 임의의 하나의 합성 펩티도글리칸, 화합물, 공작된 콜라겐 매트릭스, 조성물, 첨가제, 방법, 또는 피부 충전물에 있어서, 이 합성 펩티도글리칸의 펩티드 성분은 이 펩티드의 N-말단에 부착된 글리신-시스테인-글리신 (GCG)을 보유한다.
122. 전술한 조항들중 임의의 하나의 합성 펩티도글리칸, 화합물, 공작된 콜라겐 매트릭스, 조성물, 첨가제, 방법, 또는 피부 충전물에 있어서, 이 합성 펩티도글리칸은 매트릭스 메탈로 프로테아제에 저항성이다.
123. 조항 122의 합성 펩티도글리칸, 화합물, 공작된 콜라겐 매트릭스, 조성물, 첨가제, 방법, 또는 피부 충전물에 있어서, 매트릭스 메탈로 프로테아제는 어그리카나제이다.
124. 전술한 조항들중 임의의 하나의 합성 펩티도글리칸, 화합물, 공작된 콜라겐 매트릭스, 조성물, 첨가제, 방법, 또는 피부 충전물에 있어서, 이 합성 펩티도글리칸의 용량은 약 0.01 uM 내지 약 100 uM 농도 범위에 있다.
125. 전술한 조항들중 임의의 하나의 합성 펩티도글리칸, 화합물, 공작된 콜라겐 매트릭스, 조성물, 첨가제, 방법, 또는 피부 충전물에 있어서, 이 합성 펩티도글리칸의 용량은 약 0.1 uM 내지 약 10 uM 농도 범위에 있다.
도 1은 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸의 구체예의 생산을 위한 반응 개요를 보여준다. 반응 단계들은 굵은 글자로 상세하게 설명된다.
도 2는 주사된 BMPH의 양(mg)에 기초하여 N-[β-말레이미도프로피오닌산]하이드라지드, 트리플로오르아세트산 염 (이하 "BMPH") 흡수도 (215 nm)의 표준 곡선을 보여준다. 표준 곡선은 커플링 반응 동안 소비된 BMPH의 양을 측정하는데 이용되었다.
도 3은 고정된 히알루론산 (HA)에 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸의 결합을 보여준다. 9개의 HA-결합 펩티드 (가령, GAHWQFNALTVRGGGC; 이하 "GAH" 또는 "mAGC")은 기능화된 글리코사미노글리칸 (가령, 콘드로이틴 술페이트, 이하 "CS") 골격에 부착되었다. 합성 펩티도글리칸의 농도는 0.01 μM에서 100 μM까지 증가되었다.
도 4는 유변학적 진동수 스윕 (패널 A)에 의해 측정된 합성 펩티도글리칸의 HA 결합을 보여준다. HA 혼합물의 저장 모듈은 5.012 Hz의 진동 주파수에서 분석되었다. 이 주파수에서, 현저한 로드(load)가 제공되며, 반면 HA 쇄들의 온전성(integrity)은 유지되었다. 통계학적 분석 (α=0.05)에서 HA+CS 및 HA는 유의미적으로 상이하고 (*로 표시됨), 그리고 HA+10.5GAH-CS 및 HA+CS는 유의미적으로 상이하였음(**로 표시됨)을 나타내었다. 패널 B는 패널 A에서 보여준 동일한 데이터의 대안을 나타낸다.
도 5는 콜라겐 미소섬유 형성동안 콜라겐 유형 I + 처리 집단들의 탁도(turbidity)의 정량화를 보여준다. 313 nm에서 흡수도는 매 3분마다 측정되었다. 1시간 후(가령, 시점 번호 20), 모든 처리 집단들은 완벽하게 네트워크를 형성하였다. 최대 흡수도 또는 최대 흡수도의 절반에 이르는 시간에 대해 처리 집단간에 유의미적 차이(α=0.05)는 존재하지 않았다.
도 6은 초당 1%의 적용된 공학 긴장에 근거하여 콜라겐 겔에 의해 견뎌내는 압축 공학 스트레스를 보여준다. 통계학적 분석 (α=0.05)에서 5%, 7.5%, 그리고 10%의 공학 긴장에서 분석된 공학 스트레스에 추가로, 10.5GAH-CS의 추가는 절정의 공학 스트레스에서 유의적인 차이를 가져왔다는 것이 설명되었다.
도 7은 0.5012 Hz의 진동 주파수에서 측정된 콜라겐 혼합물의 저장 모듈을 보여준다. 통계학적 분석 (α=0.05)에서 10.5GAH-CS의 추가는 콜라겐 겔의 저장 모듈에 유의적인 증가를 가져왔다는 것이 설명된다(*로 표시됨).
도 8은 히알루노니다제를 혼합물에 추가함으로써 HA 혼합물의 퇴화 비율을 보여준다(패널 A). 퇴화 비율은 HA 혼합물의 역학 점성(Dynamic viscosity)의 변화로 측정되었다. 역학 점성 측정은 우선 이 혼합물로부터 취하고, 그리고 퇴화 비율을 산출하는 기선으로 삼았다. 0 시간 시점은 히알루노니다제의 추가 후에 취하였으며, 시료들을 충분히 혼합하고, 그리고 유량계 단계에서 피펫팅하고, 그리고 히알루노니다제의 추가와 역학 점성의 측정 사이에 대략 2분이 경과되었다. 통계학적 분석은 0 시간 및 2 시간 시점 모두에서 10.5GAH-CS 시료에 대한 퇴화 비율에서 유의미적 차이(α=0.05)를 설명하였다. 패널 B는 히알루노니다제의 첨가로 인하여 HA 혼합물의 표준화된 역학 점성 (평균 ± SE, n=3)으로 나타낸 동일한 데이터를 보여준다. 역학 점성 측정은 히알루노니다제가 첨가되기에 앞서 혼합물로부터 처음에 취해지고, 그리고 이들 값은 표준화된 역학 점성이 산출되는 기선으로 삼았다. 표준화된 역학 점성은 히알루노니다제의 추가 후 각 측정된 역학 점성을 취하고, 이 값을 이 시료의 최초 역학 점성으로 나누어 측정되었다. 통계학적 분석 (α=0.05)이 실시되었고, 그리고 0 시간 및 2 시간 시점 모두에서 10.5GAH-CS 시료에 대한 퇴화 비율에서 유의미적 차이(α=0.05)를 볼 수 있었다.
도 9는 각 연골 ECM 모사(replicate)와 연합된 CI 골격의 대표적인 cryo-SEM 영상(10,000x 확대, 5 μm 눈금 막대)을 보여준다. 패널 A는 CI 대조군을 나타낸다. 패널 B는 CI+HA+CS를 나타낸다. 패널 C는 CI+HA+10.5GAH-CS를 나타낸다.
도 10은 50 hr 지속기간을 통하여 MMP-I에 노출된 ECM 모사에서 CI의 퇴화 비율(평균 ± SE, n=3)을 보여준다. 상이한 처리의 통계학적 분석 (p<0.05)에서 3가지 처리군(CI 대조군, CI+HA+CS, 그리고 CI+HA+10.5GAH-CS) 모두 서로 유의미적으로 상이한 것이 드러났다.
도 11은 IL-1β로 자극된 그리고 자극없는 배지에서 8일의 배양동안 누적된 콘드로이틴 술페이트 (CS) 상실을 보여준다. CS 상실은 DMMB 분석에 의해 측정되었다. mAGC의 추가는 골격으로부터 CS의 상실에 있어서 유의미적 효과가 있었다(p<0.001). **는 어그리칸 모방체없이 준비된 골격과 mAGC와 함께 준비된 골격들 사이에 통계학적 유의성을 나타낸다. +는 IL-1β로 처리된 골격과 IL-1β없이 처리된 골격 사이에 통계학적 유의성을 나타낸다(p<0.05). 막대는 평균 ± SEM (n=3)을 나타낸다.
도 12는 IL-1β로 자극된 그리고 자극없는 배지에서 8일의 배양 기간에 걸쳐 누적된 콜라겐 분해를 보여준다. 콜라겐 분해는 Sircol 분석에 의해 측정되었다. 어그리칸 모방체의 추가는 골격으로부터 콜라겐 상실에 유의미적인 효과가 있었다(p<0.02). **는 어그리칸 모방체없이 준비된 골격과 mAGC와 함께 준비된 골격들 사이에 통계학적 유의성을 나타낸다. +는 IL-1β로 처리된 골격과 IL-1β없이 처리된 골격 사이에 통계학적 유의성을 나타낸다(p<0.05). 막대는 평균 ± SEM (n=3)을 나타낸다.
도 13은 탈체외(ex vivo) 펩티도글리칸의 효과를 연구하기 위한 플랫폼을 나타낸다. 0.5% 트립신을 이용하여 소의 연골 외식편으로부터 새로운 어그리칸을 제거하였다. 어그리칸의 제거는 DMMB 분석에 의해 확인되었다. 그래프는 양성 대조군과 비교하여 제거된 어그리칸의 양을 나타낸다.
도 14는 연골 매트릭스를 통하여 펩티도글리칸 확산을 감시하기 위한 분석을 보여준다. Y-축은 펩티도글리칸으로 처리된/처리안된 어그리칸-고갈된 연골 플러그로부터 판독된 DMMB 분석 흡수도 값에서 차이를 나타낸다. X-축은 연골의 관절 표면으로부터 연골하(subchondral) 골까지의 거리를 나타낸다. 막대는 평균 차이 ± SEM (n=3)를 나타낸다.
도 15는 소의 연골 외식편의 Safranin O 그리고 아비딘-바이오틴 얼룩을 보여준다. 매트릭스를 통하여 정중시상(midsagittal) 절단을 하였고, 각각 잔류 어그리칸 (상부 패널, 짙은 얼룩) 그리고 바이오틴 (하부 패널, 짙은 얼룩)에 대해 프로브되었다. 콜라겐 유형 II 결합 펩티도글리칸 [WYRGRLGC; "mAG(II)C"]은 외식편을 통하여 확산되었다. 이 조직 편의 더 높은 확대 (20X)에서 mAG(II)C는 조직으로 대략 200 um 침투되었음이 나타났다.
도 16은 연골 외식편의 아비딘-바이오틴 얼룩을 보여준다. 펩티도글리칸 (mAG(II)C 및 mAGC)은 연골 외식편을 통하여 확산되었다. 영상은 각 침투 깊이를 나타낸다(짙은 얼룩).
도 17은 어그리칸 고갈된 (AD) 외식편에 펩티도글리칸을 추가하면 압축 강성(compressive stiffness)이 증가되었음을 보여준다. HA 결합 펩티도글리칸 (mAGC)의 추가는 유의미적으로 콜라겐 유형 II 결합 펩티도글리칸 (mAG(II)C)과 비교하였을 때, 연골 외식편의 강성을 더 높은 정도로 유의미적으로 회복시켰다. *로 표시된 유의성은 AD 와 AD+mACG 보강된 외식편 사이에 압축 강성의 증가를 나타내었다(p<0.005). 데이터는 평균± SEM (n=5)으로 나타낸다.
도 18 (A)는 MMP-13에 결합된 프로브를 나타내는 도식을 보여준다. BHQ-3 블랙 홀 소거물질(quencher) 3 및 CY5.5는 각각 695 nm에서 흡수되고, 방출되었다. 화살표와 이태리체는 절단 부위를 나타낸다. (B)는 MMP-13와 함께 또는 MMP-13 없이 프로브 활성의 농도 프로파일을 보여준다: 좌측, 96-웰 미량적정판의 형광 영상 부분; 우측, 형광 방출 강도의 회복(95 nm).
도 19는 외과술 이후 4주, 6주 및 8주에 펩티도글리칸으로 또는 펩티도글리칸 없이 처리된 Sprague-Dawley 쥐에서 MMP-13 프로브에 의해 나타낸 염증 정도를 나타낸다.
도 20은 OA 유도 이후 6주와 8주에 손상된 무릎 (각각 패널 A 그리고 D), 펩티도글리칸으로 처리된 손상된 무릎(각각 패널 B 그리고 E), 그리고 골관절염 유도 수술 이후 6주에 정상 무릎(패널 C)을 보여주는 Sprague-Dawley 쥐 무릎 관절의 x-선 영상을 보여준다.
도 21은 OA 유도 수술후 6주 및 8주에 새로운 연골의 재-성장을 나타내는 Sprague-Dawley 쥐의 microCT를 보여준다. OA 유도후 6주 및 8주의 손상된 무릎은 각각 패널 A 및 D에 나타낸다. 펩티도글리칸 처리 후 손상된 무릎은 각각 패널 B 및 E에 나타낸다. 정상 무릎은 패널 C에 나타낸다.
도 22는 mAGC를 콜라겐 골격에 추가하면 저장 모듈 및 압축 강성이 증가되었음을 보여준다. 콜라겐 골격에서 주파수 스윕(A)은 0.1-2.0 Hz 범위로 저장 모듈이 증가를 나타내었다. 유사하게, 골격이 mAGC의 추가로 준비된 경우 압축 강성 (B)값의 증가를 보여주었다. 유의성은 * 로 나타낸다(p<0.0001). 데이터는 평균 ± SEM (n=5)로 나타낸다.
도 23은 IL-1β로 자극된 그리고 자극없는 배지에서 8일 배양 기간에 걸쳐 누적 콘드로이틴 술페이트 (CS) 상실을 보여준다. CS 상실은 DMMB 분석으로 측정되었다. 골격 조성물 (A-H)은 표 3에 기술된다. mAGC의 추가는 골격으로부터 CS 상실에 유의미적 효과를 나타내었다(p<0.001). *는 골격 A와 C, 그리고 골격 E와 G 사이에 통계학적 유의성을 나타낸다(p<0.05). 막대는 평균 ± SEM (n=3)을 나타낸다.
도 24는 IL-1β로 자극된 그리고 자극없는 배지에서에서 8일간의 배양 기간에 걸쳐 누적 콜라겐 분해를 나타낸다. 콜라겐 분해는 Sircol 분석에 의해 측정되었다. 골격 조성물 (A-H)은 표 3에 기술된다. 어그리칸 모방체의 추가는 골격으로부터 콜라겐 상실에 유의미적 효과를 나타내었다(p<0.02). *는 골격 A와 C, 그리고 골격 E와 G 사이에 통계학적 유의성을 나타낸다(p<0.05). 막대는 평균 ± SEM (n=3)을 나타낸다.
도 25는 정렬안된 (A) 그리고 정렬된 (B) 콜라겐 골격에서 배양된 소의 연골세포에 의해 발현된 어그리칸과 콜라겐 유형 II에 대한 실시간 PCR 분석을 나타낸다. 값은 내생성 GAPDH 발현에 대해 표준화되었다. mAGC의 추가는 어그리칸과 콜라겐 유형 II 발현 (P어그리칸<0.02 그리고 P콜라겐<0.001)을 각각 통계학적으로 변화시켰다. 정렬안된 골격과 정렬된 골격 사이에서 어그리칸과 콜라겐 유형 II 발현에서 또한 통계학적 차이가 있었다(p<0.001). 유사하게, 어그리칸과 콜라겐 유형 II 발현은 골격 IL-1β로 처리된 그리고 처리안된 골격 사이에서 상이하였다(p<0.01). 골격 조성물 (A-H)은 표 3에 나타낸다. 막대는 평균 ± SEM (n=4)을 나타낸다.
본 명세서에서 이용된 것과 같이, "히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸"은 글리칸에 접합된 합성 펩티드를 의미하고, 이때 이 펩티드는 히알루론산-결합 서열을 포함한다.
본 발명의 다양한 구체예들은 다음과 같이 본 명세서에서 기술된된다. 본 명세서에서 기술된 한 구체예에서, 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸이 제공된다. 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸은 글리칸에 접합된 합성 펩티드를 포함하고, 이때 이 합성 펩티드는 히알루론산-결합 서열을 포함한다.
또다른 구체예에서, 공식 PnGx의 화합물이 기술되는데, 이때 n은 1 내지 20이다; 이때 x는 1 내지 20이고; 이때 P는 히알루론산 결합 서열을 포함하는 약 5 내지 약 40개 아미노산의 합성 펩티드; 그리고 이때 G 글리칸이다.
여전히 또다른 구체예에서, 공식 (PnL)xG의 화합물이 기술되는데,
이때 n은 1 내지 20이다;
이때 x는 1 내지 20이고;
이때 P는 히알루론산 결합 서열을 포함하는 약 5 내지 약 40개 아미노산의 합성 펩티드;
이때 L 링커이고; 그리고
이때 G 글리칸이다.
또다른 구체예에서, 공식 P(LGn)x의 화합물이 기술되며;
이때 n은 1 내지 20이다;
이때 x는 1 내지 20이고;
이때 P는 히알루론산 결합 서열을 포함하는 약 5 내지 약 40개 아미노산의 합성 펩티드;
이때 L 링커이고; 그리고 이때 G 글리칸이다.
여전히 또다른 구체예에서, 공식 PnGx의 화합물이 기술되며;
이때 n은 MWG/1000이고;
이때 MWG는 최대 1 kDa에 가까운 G의 분자량이고
이때 x는 1 내지 20이고;
이때 P는 히알루론산 결합 서열을 포함하는 약 5 내지 약 40개 아미노산의 합성 펩티드; 그리고
이때 G 글리칸이다.
또다른 구체예에서, 공식 (PnL)xG의 화합물이 기술되며;
이때 n은 MWG/1000이고;
이때 MWG는 최대 1 kDa에 가까운 G의 분자량이고;
이때 x는 1 내지 20이고;
이때 P는 히알루론산 결합 서열을 포함하는 약 5 내지 약 40개 아미노산의 합성 펩티드;
이때 L 링커이고; 그리고
이때 G 글리칸이다.
본 개시내용의 목적을 위하여, 앞선 단락들에서 기술된 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸 및 화합물은 집합적으로 "히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸" 또는 "합성 펩티도글리칸"으로 지칭된다.
상기 각 펩티드 구체예들에 있어서, 이 합성 펩티도글리칸은 5-15개의 펩티드 분자 (n은 5-15임), 5-20개의 펩티드 분자 (n은 5-20임), 1-20개의 펩티드 분자 (n은 1-20임) 또는 1-25개의 펩티드 분자 (n은 1-25임)를 포함할 수 있다. 한 구체예에서, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 그리고 25개의 펩티드 분자로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 명세서에서 기술된 또다른 설명적 구체예에서, 공작된 콜라겐 매트릭스가 제공된다. 이 매트릭스는 중합된 콜라겐, 히알루론산, 그리고 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸을 포함한다. 또다른 구체예에서, 연골세포 또는 줄기세포의 시험관 배양용 조성물이 제공된다. 이 조성물은 본 개시내용에서 기술된 임의의 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸을 포함한다.
본 명세서에서 기술된 또다른 구체예에서, 공작된 콜라겐 매트릭스 안에 구멍 크기를 증가시키는 방법이 제공된다. 이 방법은 콜라겐, 히알루론산, 그리고 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸을 복합시키는 단계와 매트릭스 안에 구멍 크기를 증가시키는 단계를 포함한다.
여전히 또다른 설명적 구체예에서, 환자의 연골 마멸 또는 침식을 감소시키는 방법이 제공된다. 이 방법은 이 환자에게 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸을 투여하는 단계를 포함하는데, 이때 이 합성 펩티도글리칸은 연골의 마멸 또는 침식을 감소시킨다. 한 구체예에서, 연골 침식 또는 마멸은 관절염으로 인한 것일 수 있다. 한 구체예에서, 연골 침식 또는 마멸은 노화, 비만, 외상 또는 손상, 해부학적 비정상, 유전 질환들, 대사 불균형, 염증, 또는 이와 유사한 것으로 인한 것일 수 있다.
여전히 또다른 설명적 구체예에서, 환자의 관절염을 치료하는 방법이 제공된다. 이 방법은 이 환자에게 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸을 투여하는 단계를 포함하고, 이때 이 합성 펩티도글리칸 관절염과 연합된 증상을 감소시킨다.
또다른 설명적 구체예에서, 환자에게서 히알루론산 퇴화를 감소 또는 예방하는 방법이 제공된다. 이 방법은 이 환자에게 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸을 투여하는 것을 포함한다.
또다른 설명적 구체예에서, 콜라겐 퇴화를 감소 또는 예방하는 방법이 제공된다. 이 방법은 콜라겐 존재하에서 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸에 히알루론산을 접촉시키고, 그리고 콜라겐 퇴화를 감소 또는 예방하는 단계를 포함한다.
여전히 또다른 설명적 구체예에서, 환자에서 조직 결함을 교정 또는 변형시키는 방법이 제공된다. 이 방법은 조직 결함으로 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸을 투여하는 것을 포함하고, 이때 결함이 교정 또는 변형된다. 본 명세서에서 기술된 또다른 설명적 구체예에서, 피부 충전물이 제공된다. 이 충전물은 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸을 포함한다. 한 구체예에서, 이 충전물은 히알루론산을 더 포함한다.
여전히 또다른 구체예에서, 생물재료 연골 또는 골 대체 조성물용 첨가제가 제공된다. 첨가제는 기존의 생물재료 연골 또는 골 대체 재료에 추가를 위한 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸을 포함한다. 본 명세서에서 기술된 또다른 구체예에서, 생물재료 또는 골 연골 대체물을 준비하는 방법이 제공된다. 이 방법은 합성 펩티도글리칸과 기존의 생물재료 또는 골 연골 대체 재료를 복합하는 단계를 포함한다.
다양한 구체예들에 있어서, 이 합성 펩티도글리칸의 펩티드 성분은 공식 B1-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-B2의 아미노산 서열을 포함하는데,
이때 X8은 존재하거나 또는 존재하지 않으며,
이때 B1은 염기성 아미노산이고,
이때 B2는 염기성 아미노산이며, 그리고
이때 X1-X8은 비-산성 아미노산이다.
또다른 구체예에서, 이 합성 펩티도글리칸의 펩티드 성분은 공식 B1-X1-B2-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-B3의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이러한 아미노산 서열일 수 있으며,
이때 X9 존재하거나 또는 존재하지 않으며,
이때 B1은 염기성 아미노산이고,
이때 B2는 염기성 아미노산이며,
이때 B3은 염기성 아미노산이고, 그리고
이때 X1-X9는 비-산성 아미노산이다.
또다른 구체예에서, 이 합성 펩티드는 공식 B1-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-B2-X9-B3의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이러한 아미노산 서열일 수 있으며,
이때 X8은 존재하거나 또는 존재하지 않으며,
이때 B1은 염기성 아미노산이고,
이때 B2는 염기성 아미노산이며,
이때 B3은 염기성 아미노산이고, 그리고
이때 X1-X9는 비-산성 아미노산이다.
본 명세서에서 이용된 것과 같이, "염기성 아미노산"은 리신, 아르기닌, 또는 히스티딘으로 구성된 군으로부터 선택된다. 본 명세서에서 이용된 것과 같이, "비-산성 아미노산"은 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 그리고 발린으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 명세서에서 기술된 다양한 설명적 구체예들에서, 이 합성 펩티도글리칸의 펩티드 성분은 다음으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함할 수 있다:
Figure 112013117217243-pct00014
상기 각 펩티드 구체예들에 있어서, 이 펩티드는 이 펩티드의 C-말단에 부착된 글리신-시스테인, 및/또는 이 펩티드의 N-말단에 부착된 글리신-시스테인-글리신 (GCG)을 보유할 수 있다. 본 명세서에서 기술된 다양한 구체예들에서, 이 합성 펩티도글리칸의 펩티드 성분은 앞선 단락에서 기술된 임의의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이들 아미노산 서열의 임의의 것에 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 100% 상동성을 가진 아미노산 서열을 포함한다.
히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸의 펩티드 성분으로 포함될 수 있는 추가 펩티드는 참고자료에 통합된 Amemiya et al., Biochem. Biophys. Acta, vol. 1724, pp. 94-99 (2005)에서 기술된 펩티드를 포함한다. 이들 펩티드는 Arg-Arg 모티프를 보유하고, 그리고 다음으로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드를 포함한다:
Figure 112013117217243-pct00015
상기 각 펩티드 구체예들에 있어서, 이 펩티드는 이 펩티드의 C-말단에 부착된 글리신-시스테인을 보유할 수 있다. 상기 각 펩티드 구체예들에 있어서, 이 펩티드는 이 펩티드의 N-말단에 부착된 글리신-시스테인-글리신 (GCG)을 보유할 수 있다. 본 명세서에서 기술된 다양한 구체예들에서, 이 합성 펩티도글리칸의 펩티드 성분은 앞선 단락에서 기술된 임의의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이들 아미노산 서열의 임의의 것에 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 100% 상동성을 가진 아미노산 서열을 포함한다.
기타 구체예들에서, 참고자료에 통합된 Yang et al., EMBO Journal, vol. 13, pp. 286-296 (1994), 그리고 Goetinck et al., J. Cell. Biol., vol. 105, pp. 2403-2408 (1987)에서 기술된 펩티드는 본 명세서에서 기술된 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸에 이용될 수 있는데, 다음으로 구성된 군으로부터 선택된 RDGTRYVQKGEYR, HREARSGKYK, PDKKHKLYGV, 그리고 WDKERSRYDV 펩티드를 포함한다. 이들 각 구체예에서, 이 펩티드는 이 펩티드의 C-말단에 부착된 글리신-시스테인을 보유할 수 있다. 이들 각 구체예에서, 이 펩티드는 이 펩티드의 N-말단에 부착된 글리신-시스테인-글리신 (GCG)을 보유할 수 있다. 기타 구체예들에서, 이 합성 펩티도글리칸의 펩티드 성분은 이들 아미노산 서열의 임의의 것에 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 100% 상동성을 가진 아미노산 서열을 포함한다.
다양한 구체예들에서, 본 명세서에서 기술된 이 합성 펩티도글리칸의 펩티드 성분은 하나 또는 그 이상의 보존성 아미노산 치환을 내포함으로써 변형될 수 있다. 당업계에 공지되어 있는 것과 같이, 보존성 치환에 의해 펩티드의 임의의 비-결정적 아미노산의 변경은 대체 아미노산의 측쇄가 유사한 결합을 형성할 수 있어야 하고, 대체된 아미노산의 측쇄에 접촉을 할 수 있어야 하기 때문에, 이 펩티드의 활성을 유의미적으로 변경시켜서는 안된다. 펩티드의 히알루론산 결합 활성에 과도하게 영향을 주지 않는 한, 비-보존성 치환은 가능하다.
당업계에 공지되어 있는 것과 같이, 아미노산의 "보존성 치환" 또는 펩티드의 "보존성 치환 변이체"은 1) 이 펩티드의 2차 구조; 2) 이 아미노산의 전하 또는 소수성; 그리고 3) 측쇄의 벌크(bulkiness) 또는 이들 특징중 하나 또는 그 이상을 유지하는 아미노산 치환을 지칭한다. 설명하자면, 공지의 용어 "친수성 잔기"는 세린 또는 트레오닌을 지칭한다. "소수성 잔기"는 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 발린 또는 알라닌, 또는 이와 유사한 것을 지칭한다. "양전하를 띈 잔기"는 리신, 아르기닌, 오르니틴, 또는 히스티딘을 지칭한다. "음전하를 띈 잔기"는 아스파르트산 또는 글루타민산을 지칭한다. "벌크(bulky) 측쇄"를 보유한 잔기는 페닐알라닌, 트립토판 또는 티로신, 또는 이와 유사한 것을 지칭한다. 설명을 위한 보존성 아미노산 치환 목록은 표 1에서 제공된다.
아미노산
 대체 아미노산
알라닌
 D-Ala, Gly, Aib, β-Ala, L-Cys, D-Cys
아르기닌
 D-Arg, Lys, D-Lys, Orn D-Orn
아스파라긴
 D-Asn, Asp, D-Asp, Glu, D-Glu Gln, D-Gln
아스파르트산
 D-Asp, D-Asn, Asn, Glu, D-Glu, Gln, D-Gln
시스테인
 D-Cys, S-Me-Cys, Met, D-Met, Thr, D-Thr
글루타민
 D-Gln, Asn, D-Asn, Glu, D-Glu, Asp, D-Asp
글루타민산
 D-Glu, D-Asp, Asp, Asn, D-Asn, Gln, D-Gln
글리신
 Ala, D-Ala, Pro, D-Pro, Aib, β-Ala
이소류신
 D-Ile, Val, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met
류신
 Val, D-Val, Met, D-Met, D-Ile, D-Leu, Ile
리신
 D-Lys, Arg, D-Arg, Orn, D-Orn
메티오닌
 D-Met, S-Me-Cys, Ile, D-Ile, Leu, D-Leu, Val, D-Val
페닐알라닌
 D-Phe, Tyr, D-Tyr, His, D-His, Trp, D-Trp
프롤린
 D-Pro
세린
 D-Ser, Thr, D-Thr, allo-Thr, L-Cys, D-Cys
트레오닌
 D-Thr, Ser, D-Ser, allo-Thr, Met, D-Met, Val, D-Val
티로신
 D-Tyr, Phe, D-Phe, His, D-His, Trp, D-Trp
발린
 D-Val, Leu, D-Leu, Ile, D-Ile, Met, D-Met
한 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 분자들에게 적용가능한 보존성 아미노산 치환은 B1-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-B2 공식, B1-X1-B2-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-B3 공식, B1-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-B2-X9-B3 공식, 또는 Arg-Arg 모티프로 구성된 모티프를 변경시키지 않는다.
본 명세서에서 기술된 다양한 구체예들에서, 본 명세서에서 기술된 합성 펩티도글리칸의 글리칸 (가령 글리코사미노글리칸, 약어 GAG, 또는 폴리사카라이드)은 덱스트란, 콘드로이틴, 콘드로이틴 술페이트, 데르마탄, 데르마탄 술페이트, 헤파란, 헤파린, 케라틴, 케라탄 술페이트, 그리고 히알루론산으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 한 구체예에서, 글리칸은 콘드로이틴 술페이트 및 케라탄 술페이트로 구성된 군으로부터 선택된다. 또다른 설명적 구체예에서, 글리칸은 콘드로이틴 술페이트이다.
본 명세서에서 기술된 한 구체예에서, 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸은 콘드로이틴 술페이트에 접합된 (GAHWQFNALTVRGG)10을 포함하는데, 이때 펩티도글리칸 분자에서 각 펩티드는 콘드로이틴 술페이트에 별도로 링크된다. 본 명세서에서 기술된 또다른 구체예에서, 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸은 콘드로이틴 술페이트에 접합된 (GAHWQFNALTVRGGGC)11을 포함하는데 이때 펩티도글리칸 분자에서 각 펩티드는 콘드로이틴 술페이트에 별도로 링크된다. 상기 각 펩티드 구체예들에 있어서, 이 펩티드 숫자는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 그리고 25개 펩티드 분자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
본 명세서에서 기술된 다양한 구체예들에서, 이 합성 펩티도글리칸은 어그리카나제에 저항성이다. 어그리카나제는 어그리칸을 절단하는 것으로 공지됨 임의의 효소로 당분야에서 특징화된다.
하나의 설명적 측면에서, 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸은 멸균될 수 있다. 본 명세서에서 이용된 것과 같이 "멸균(sterilization)" 또는 "멸균되다(sterilize)" 또는 "멸균된(sterilized)"은 엔도톡신 그리고 감염성 물질들을 포함하나 이에 한정되지 않는, 원치않는 오염물질을 제거함으로써, 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸을 소독한다는 의미다.
다양한 설명적 구체예들에서, 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸은 산화 프로필렌 또는 산화 에틸렌 처리, 기체 플라즈마 멸균, 감마 방사선 (가령, 1-4 Mrads 감마 조사 또는 1-2.5 Mrads의 감마 조사), 전자 빔, 및/또는 페르산, 이를 테면 퍼아세트산으로 멸균을 포함하는 통상적인 멸균 기술을 이용하여 소독 및/또는 멸균된다. 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸의 구조 및 그리고 바이오트로픽 성질들에 부정적 영형을 주지 않는 멸균 기술이 이용될 수 있다. 한 구체예에서, 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸은 하나 또는 그 이상의 멸균 공정을 거칠 수 있다. 또다른 설명적 구체예에서, 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸은 멸균 여과를 거친다. 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸은 플라스틱 랩 또는 포일 랩을 포함하는 임의의 유형의 용기에서 포장될 수 있고, 그리고 추가 멸균될 수 있다. 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸은 예를 들면, 동결건조(lyophilisation)와 같은 멸균 조건하에서 준비될 수 있는데, 당업계에 공지되어 있는 표준 기술을 이용하여 용이하게 실시될 수 있다.
본 명세서에서 기술된 다양한 구체예들에서, 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸은 미네랄, 아미노산, 슈가, 펩티드, 단백질, 비타민(이를 테면 아스코르브산), 또는 라미닌, 콜라겐, 피브로넥틴, 히알루론산, 피브린, 엘라스틴, 또는 어그리칸, 또는 성장 인자 이를 테면 상피 성장 인자, 혈소판-유도된 성장 인자, 형질변형 성장 인자, 또는 섬유아세포 성장 인자, 그리고 이를 테면 덱사메타손 또는 점탄성 변경 물질들, 이를 테면 이온성 그리고 비-이온성 물 가용성 고분자; 아크릴산 고분자; 친수성 고분자 이를 테면 폴리옥시드 에틸렌, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 코폴리머, 그리고 폴리비닐알코올; 셀룰로오즈 고분자 그리고 셀룰로오즈 폴리머 유도체들 이를 테면 하이드록시프로필 셀룰로오즈, 하이드록시에틸 셀룰로오즈, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오즈, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오즈 프탈레이트, 메틸 셀룰로오즈, 카르복시메틸 셀룰로오즈, 그리고 에테르화된 셀룰로오즈; 폴리(락트산), 폴리(글리콜산), 락트산 그리고 글리콜산의 코폴리머, 또는 천연 및 합성 기타 폴리머 물질들과 복합될 수 있다.
본 명세서에서 기술된 다양한 구체예들에서, 이 합성 펩티도글리칸의 펩티드 성분은 당업계에 공지되어 있는 고형 상 펩티드 합성 프로토콜에 따라 합성된다. 한 구체예에서 펩티드 전구물질은 공지의 Fmoc 프로토콜에 따라 고형 지지대 상에서 합성되고, 지지대로부터 트리플로오르아세트산으로 잘라내고, 그리고 당업계 숙련자들에게 공지된 방법에 따라 크로마토그래피에 의해 정제된다.
본 명세서에서 기술된 다양한 구체예들에서, 이 합성 펩티도글리칸의 펩티드 성분은 당업계 숙련자들에게 공지된 생물과학 방법을 이용하여 합성된다. 한 구체예에서 원하는 펩티드에 대한 아미노산 서열 정보를 인코드하는 DNA 서열은 당업계 숙련자들에게 공지된 재조합 DNA 기술에 의해 발현 플라스미드 (예를 들면, 이 펩티드의 친화력 정제를 위하여 친화력 테그가 통합된 플라스미드)에 결찰시키고, 이플라스미드는 발현을 위하여 숙주 유기체 안으로 형질감염되고, 그리고 당업계 숙련자들에게 공지된 방법(가령, 친화력 정제에 의해)에 따라 숙주 유기체 또는 성장 배지로부터 이 펩티드는 단리된다. 재조합 DNA 기술 방법은 여기에 참고자료로 편입된 Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001)에서 기술되고 있고, 당업계 숙련자에게 공지되어 있다.
본 명세서에서 기술된 다양한 구체예들에서, 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸의 펩티드 성분은 당업계 숙련자에게 공지된 방법을 이용하여, 환원 물질 존재하에 글리칸의 알데히드 기능기와 이 펩티드의 자유 아미노 기를 반응시켜 글리칸에 접합되면, 펩티드 글리칸 접합체(conjugate)가 형성된다. 한 구체예에서, 글리칸의 알데히드 기능기 (가령 폴리사카라이드 또는 글리코사미노글리칸)는 당업계 숙련자에게 공지된 방법에 따라 메타과요오드 나트륨과 글리칸을 반응시킴으로써 형성된다.
한 구체예에서, 이 합성 펩티도글리칸의 펩티드 성분은 글리칸의 알데히드 기능기에 3-(2-피리딜디티오)프로피오닐 하이드라지드 (PDPH)를 반응시켜, 중간생성물 글리칸을 만들고, 이 중간생성물 글리칸과 자유 티올 기를 보유하는 펩티드을 반응시켜, 글리칸에 접합되고, 펩티드 글리칸 접합체가 생성된다. 여전히 또다른 구체예에서, 글리칸 또는 또는 글리칸-링커 접합체를 위한 부착 점을 제공하기 위하여, 이 합성 펩티도글리칸의 펩티드 성분의 서열은 글리신-시스테인 분절이 포함되도록 변형될 수 있다. 본 명세서에서 기술된 임의의 구체예들에서, 가교(crosslinker)는 N-[β-말레이미도프로피오닌산]하이드라지드 (BMPH)일 수 있다.
전술한 단락들에서 특정 구체예들이 기술되기는 하였지만, 본 명세서에서 기술된 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸은 이 펩티드를 글리칸 (가령 폴리사카라이드 또는 글리코사미노글리칸)에 접합시키는 임의의 당업계-인정된 방법을 이용하여 만들어질 수 있다. 이 방법은 링크 기 이를 테면 이가(divalent) 링커를 통하여 직접적 또는 간접적 공유, 이온성, 또는 수소 결합을 포함할 수 있다. 접합체는 접합체의 각 성분들의 산, 알데히드, 하이드록시, 아미노, 또는 하이드라조 집단들 사이에 아미드, 에스테르 또는 이미노 결합의 형성을 통하여 이 펩티드가 글리칸에 공유 결합함으로써 일반적으로 형성된다. 이들 방법 모두 당업계에 공지되어 있고, 또는 본 출원의 실시예 부분에서 추가 설명되거나 또는 여기에 참고자료로 편입된 Hermanson G.T., Bioconjugate Techniques, Academic Press, pp.169-186 (1996)에서 설명된다. 링커는 약 1 내지 약 30개의 탄소 원자를 일반적으로 포함하는데, 좀더 전형적으로는 약 2 내지 약 20개의 탄소 원자를 포함한다. 분자량이 더 낮은 링커(가령, 약 20 내지 약 500의 대략 분자량을 포함하는 것들)가 일반적으로 이용된다.
추가적으로, 이 접합체의 링커 영역의 구조적 변형이 본 명세서에서 고려된다. 예를 들면, 아미노산이 링커에 포함될 수 있고, 접합체의 링커 부분에 자연적으로 생성되는 아미노산, 뿐만 아니라 통상적인 합성 방법으로부터 이용가능한 것들을 포함하는 다수의 아미노산이 만들어질 수 있다. 또다른 측면에서, 베타, 감마, 그리고 더 긴 쇄 아미노산이 하나 또는 그 이상의 알파 아미노산을 대신하여 이용될 수 있다. 또다른 측면에서, 이 링커는 링커에 포함된 아미노산의 수를 변경시키거나, 또는 더 많은 또는 더 적은 베타, 감마, 또는 더 긴 쇄 아미노산을 포함함으로써 더 짧아지거나 또는 더 길어질 수 있다. 유사하게, 본 명세서에서 기술된 링커의 기타 화학적 단편들의 길이 및 모양은 변형될 수 있다.
본 명세서에서 기술된 다양한 구체예들에서, 이 링커는 알킬렌, 헤테로알킬렌, 사이클로알킬렌, 사이클로헤테로알킬렌, 아릴렌, 그리고 헤테로아릴렌으로 구성된 군으로부터 선택된 것과는 독립적으로 선택된 하나 또는 그 이상의 이가 단편들을 포함할 수 있고, 이들 각각은 선택적으로 치환된다. 본 명세서에서 이용된 것과 같이 헤테로알킬렌은 선형 또는 분기형 알킬렌 기(group)에서 하나 또는 그 이상의 탄소 원자가 산소, 질소, 인 그리고 황으로부터 각각 독립적으로 선택된 원자로 대체됨으로써 생성된 기를 나타낸다. 대체 구체예에서, 링커는 존재하지 않는다.
본 명세서에서 기술된 한 구체예에서, 공작된 콜라겐 매트릭스가 제공된다. 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸의 이미 설명된 구체예들은 본 명세서에서 기술된 공작된 콜라겐 매트릭스에 적용된다. 한 구체예에서, 공작된 콜라겐 매트릭스는 중합된 콜라겐, 히알루론산, 그리고 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸을 포함한다. 한 구체예에서, 공작된 콜라겐 매트릭스는 중합된 콜라겐과 히알루론-결합 합성 펩티도글리칸. 다양한 설명적 구체예들에서, 가교 물질, 이를 테면 카르보디이미드, 알데히드, 리실-산화효소, N-하이드록시숙시니미드 에스테르, 이미도에스테르, 하이드라지드, 그리고 말레이미드, 뿐만 아니라 게니핀을 포함하는 다양한 천연 가교 물질, 및 이와 유사한 것이 용액내에서 콜라겐의 중합에 앞서, 중합하는 동안, 또는 중합이후에 추가될 수 있다.
다양한 설명적 구체예들에서, 공작된 콜라겐 매트릭스를 준비하기 위하여 본 명세서에서 이용된 콜라겐은 콜라겐 유형 I 내지 XXVIII을 포함하는 임의 유형의 콜라겐 단독이 이용될 수 있거나, 또는 임의의 조합, 예를 들면, 콜라겐 유형 I, II, III, 및/또는 IV가 이용될 수 있다. 일부 구체예들에서, 공작된 콜라겐 매트릭스를 준비하기 위하여 이용된 콜라겐은 유형 I 콜라겐, 유형 II 콜라겐, 유형 III 콜라겐, 유형 IV 콜라겐, 유형 IX 콜라겐, 유형 XI 콜라겐, 그리고 이의 조합들로 구성된 군으로부터 선택된다. 한 구체예에서, 공작된 콜라겐 매트릭스는 상업적으로 이용가능한 콜라겐 (가령, Sigma, St. Louis, MO)으로부터 형성된다. 대체 구체예에서, 콜라겐은 조직 재료 이를 테면 내장, 방광, 또는 위 조직과 같은 점막하부-함유 조직 재료로부터 정제될 수 있다. 추가 구체예에서, 콜라겐은 꼬리 힘줄로부터 정제될 수 있다. 추가 구체예에서, 콜라겐은 피부로부터 정제될 수 있다. 다양한 측면에서, 콜라겐은 콜라겐-결합 합성 펩티도글리칸에 추가적으로 내생성 또는 외부로부터 추가된 비-콜라겐성 단백질을 또한 내포할 수 있는데, 이를 테면 피브로넥틴 또는 실크 단백질, 당단백질, 그리고 폴리사카라이드, 또는 이와 유사한 것이 포함된다. 본 명세서에서 기술된 방법에 의해 준비된 공작된 콜라겐 매트릭스는 이식 또는 주사 부위에 연합된 조직의 특징을 취할 수 있는 조직 이식편(가령, 겔 형태)의 형태일 수 있다. 한 구체예에서, 공작된 콜라겐 매트릭스는 환자에게 이식될 수 있는 조직 이식편이다. 또다른 구체예에서, 공작된 콜라겐 매트릭스는 주사에 의해 환자에게 투여될 수 있다. 어느 쪽 구체예에서, 이 매트릭스는 예를 들면, 겔 형태 또는 분말일 수 있다.
한 구체예에서, 공작된 콜라겐 매트릭스 안에 콜라겐은 이 매트릭스의 약 40 내지 약 90 건중량 (wt)%, 이 매트릭스의 약 40 내지 약 80 건중량 %, 이 매트릭스의 약 40 내지 약 70 건중량 %, 이 매트릭스의 약 40 내지 약 60 건중량 %, 이 매트릭스의 약 50 내지 약 90 건중량 %, 이 매트릭스의 약 50 내지 약 80 건중량 %, 이 매트릭스의 약 50 내지 약 75 건중량 %, 이 매트릭스의 약 50 내지 약 70 건중량 %, 또는 이 매트릭스의 약 60 내지 약 75 건중량 %를 포함한다. 또다른 구체예에서, 공작된 콜라겐 매트릭스 안에 콜라겐은 이 매트릭스의 약 90 건중량 %, 이 매트릭스의 약 85 건중량 %, 이 매트릭스의 약 80 건중량 %, 이 매트릭스의 약 75 건중량 %, 이 매트릭스의 약 70 건중량 %, 이 매트릭스의 약 65 건중량 %, 이 매트릭스의 약 60 건중량 %, 이 매트릭스의 약 50 건중량 %, 이 매트릭스의 약 45 건중량 %, 이 매트릭스의 약 40 건중량 %, 또는 이 매트릭스의 약 30 건중량 %를 포함한다.
구체예에서, 겔 형태의 매트릭스에서 최종 콜라겐 농도는 약 0.5 내지 약 6 mg/mL, 약 0.5 내지 약 5 mg/mL, 약 0.5 내지 약 4 mg/mL, 약 1 내지 약 6 mg/mL, 약 1 내지 약 5 mg/mL, 또는 약 1 내지 약 4 mg/mL이다. 한 구체예에서, 이 매트릭스의 최종 콜라겐 농도는 약 0.5 mg/mL, 약 1 mg/mL, 약 2 mg/mL, 약 3 mg/mL, 약 4 mg/mL, 또는 약 5 mg/mL이다.
한 구체예에서, 공작된 콜라겐 매트릭스에서 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸은 이 매트릭스의 약 2 내지 약 60 건중량 (wt)%, 이 매트릭스의 약 2 내지 약 50 건중량 %, 이 매트릭스의 약 5 내지 약 50 건중량 %, 이 매트릭스의 약 10 내지 약 50 건중량 %, 이 매트릭스의 약 10 내지 약 20 건중량 %, 이 매트릭스의 약 10 내지 약 30 건중량 %, 이 매트릭스의 약 10 내지 약 25 건중량 %, 이 매트릭스의 약 15 내지 약 30 건중량 %, 또는 이 매트릭스의 약 15 내지 약 45 건중량 %를 포함한다. 또다른 구체예에서, 공작된 콜라겐 매트릭스에서 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸은 이 매트릭스의 약 2 건중량 %, 약 5 건중량 %, 약 10 건중량 %, 약 15 건중량 %, 약 20 건중량 %, 약 25 건중량 %, 약 30 건중량 %, 약 35 건중량 %, 약 40 건중량 %, 약 45 건중량 %, 또는 약 50 건중량 %를 포함한다.
또다른 구체예에서, 공작된 콜라겐 매트릭스는 히알루론산을 포함하고, 그리고 공작된 콜라겐 매트릭스 안에 히알루론산은 이 매트릭스의 약 2 내지 약 60 건중량 (wt)%, 이 매트릭스의 약 2 내지 약 50 건중량 %, 이 매트릭스의 약 5 내지 약 50 건중량 %, 이 매트릭스의 약 10 내지 약 50 건중량 %, 이 매트릭스의 약 10 내지 약 20 건중량 %, 이 매트릭스의 약 10 내지 약 30 건중량, 이 매트릭스의 약 10 내지 약 25 건중량 %, 이 매트릭스의 약 15 내지 약 30 건중량 %, 또는 이 매트릭스의 약 15 내지 약 45 건중량 %를 포함한다. 또다른 구체예에서, 공작된 콜라겐 매트릭스 안에 히알루론산은 이 매트릭스의 약 2 건중량 %, 약 5 건중량 %, 약 10 건중량 %, 약 15 건중량 %, 약 20 건중량 %, 약 25 건중량 %, 약 30 건중량 %, 약 35 건중량 %, 약 40 건중량 %, 약 45 건중량 %, 또는 약 50 건중량 %을 포함한다.
한 구체예에서, 공작된 콜라겐 매트릭스는 히알루론산과 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸을 포함한다. 공작된 콜라겐 매트릭스에서 히알루론산과 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸은 이 매트릭스의 약 10 내지 약 60 건중량 (wt)%, 이 매트릭스의 약 20 내지 약 60 건중량 %, 이 매트릭스의 약 30 내지 약 60 건중량 %, 이 매트릭스의 약 40 내지 약 60 건중량 %, 이 매트릭스의 약 10 내지 약 50 건중량 %, 이 매트릭스의 약 20 내지 약 50 건중량 %, 이 매트릭스의 약 25 내지 약 50 건중량 %, 이 매트릭스의 약 30 내지 약 50 건중량 %, 또는 이 매트릭스의 약 25 내지 약 40 건중량 %를 포함한다. 또다른 구체예에서, 공작된 콜라겐 매트릭스에서 히알루론산과 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸은 이 매트릭스의 약 10 건중량 %, 약 15 건중량 %, 약 20 건중량 %, 약 25 건중량 %, 약 30 건중량 %, 약 35 건중량 %, 약 40 건중량 %, 약 50 건중량 %, 약 55 건중량 %, 약 60 건중량 %, 또는 약 70 건중량 %을 포함한다.
하나의 설명적 측면에서, 공작된 콜라겐 매트릭스는 멸균될 수 있다. 본 명세서에서 이용된 것과 같이 "멸균" 또는 "멸균되다" 또는 "멸균된"은 엔도톡신, 핵산 오염물질, 그리고 감염성 물질들을 포함하나 이에 한정되지 않는 원치 않는 오염물질을 제거함으로써 이 매트릭스를 소독한다는 것을 의미한다.
다양한 설명적 구체예들에서, 공작된 콜라겐 매트릭스는 산성 pH에서 글루타알데히드 태닝, 포름알데히드 태닝, 산화 프로필렌 또는 산화 에틸렌 처리, 기체 플라즈마 멸균, 감마 방사선 (가령, 1-4 Mrads 감마 조사 또는 1-2.5 Mrads의 감마 조사), 전자 빔, 및/또는 페르산, 이를 테면 퍼아세트산으로 멸균을 포함하나 이에 한정되지 않는 통상적인 멸균 기술을 이용하여 살균 및/또는 멸균될 수 있다. 이 메트릭스의 구조 및 그리고 바이오트로픽 성질들에 부정적 영형을 주지 않는 멸균 기술이 이용될 수 있다. 한 구체예에서, 공작된 콜라겐 매트릭스는 하나 또는 그 이상의 멸균 공정을 거칠 수 있다. 설명적 구체예에서, 용액내 콜라겐은 중합에 앞서, 살균 또는 멸균될 수 있다. 공작된 콜라겐 매트릭스는 플라스틱 랩 또는 포일 랩을 포함하는 임의의 유형의 용기에서 포장될 수 있고, 그리고 추가 멸균될 수 있다.
이들 임의의 구체예들에서, 공작된 콜라겐 매트릭스는 세포의 외생성 집단을 더 포함할 수 있다. 세포의 추가된 집단은 하나 또는 그 이상의 세포 집단을 포함할 수 있다. 다양한 구체예들에서, 이 세포 집단은 내포 세포, 중배엽 유도된 세포, 중피 세포, 활막세포, 신경 세포, 교 세포, 골아세포, 섬유아세포, 연골세포, 심줄세포, 평활근 세포, 골근육 세포, 심근육 세포, 다중-전위 선조 세포 (가령, 골 골수 선조 세포를 포함한 줄기세포), 그리고 골원성 세포로 구성된 군으로부터 선택된 비-케라틴화된 또는 케라틴화된 상피 세포 또는 세포 집단을 포함한다. 일부 구체예들에서, 세포 집단은 연골세포와 줄기세포로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예들에서, 줄기세포는 골아세포, 골원성 세포, 그리고 간엽성 줄기세포로 구성된 군으로부터 선택된다. 다양한 구체예들에서, 공작된 콜라겐 매트릭스는 하나 또는 그 이상의 세포 유형의 조합으로 접종된다.
다양한 측면에서, 본 발명의 공작된 콜라겐 매트릭스 또는 공작된 이식편 구조체는 미네랄, 아미노산, 슈가, 펩티드, 단백질, 비타민(이를 테면 아스코르브산)을 포함하는 영양제, 또는 라미닌, 피브로넥틴, 히알루론산, 피브린, 엘라스틴, 또는 어그리칸, 또는 성장 인자 이를 테면 상피 성장 인자, 혈소판-유도된 성장 인자, 형질변형 성장 인자, 또는 섬유아세포 성장 인자, 그리고 글루코코르티코이드 이를 테면 덱사메타손 또는 점탄성 변경 물질들, 이를 테면 이온성 그리고 비-이온성 물 가용성 고분자; 아크릴산 고분자; 친수성 고분자 이를 테면 폴리옥시드 에틸렌, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 코폴리머, 그리고 폴리비닐알코올; 셀룰로오즈 고분자 그리고 셀룰로오즈 폴리머 유도체들 이를 테면 하이드록시프로필 셀룰로오즈, 하이드록시에틸 셀룰로오즈, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오즈, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오즈 프탈레이트, 메틸 셀룰로오즈, 카르복시메틸 셀룰로오즈, 그리고 에테르화된 셀룰로오즈; 폴리(락트산), 폴리(글리콜산), 락트산 및 글리콜산의 코폴리머, 또는 천연 및 합성의 다른 폴리머 물질과 복합될 수 있다. 다른 설명적 구체예들에서, 가교 물질, 이를 테면 카르보디이미드, 알데히드, 리실-산화효소, N-하이드록시숙시니미드 에스테르, 이미도에스테르, 하이드라지드, 그리고 말레이미드, 뿐만 아니라 게니핀을 포함하는 천연 가교 물질, 그리고 이와 유사한 것이 세포의 추가에 앞서, 세포 추가와 동시에, 또는 세포 추가 후에 첨가될 수 있다.
상기에서 논의된 바와 같이, 한 구체예에 따라, 세포는 콜라겐의 중합 이후 또는 콜라겐 중합 동안 공작된 콜라겐 매트릭스 또는 공작된 이식편 구조체에 추가될 수 있다. 이 세포를 포함하는 공작된 콜라겐 매트릭스는 공작된 이식편 구조체로 이용하기 위하여 숙주에 피하로 주사되거나 또는 이식될 수 있다. 또다른 구체예에서, 공작된 콜라겐 매트릭스 상에 또는 내부에 있는 세포는 예정된 시간 동안 시험관애서 배양되어 세포 수를 증가시키거나 또는 환자에게 이식 또는 주사에 앞서 원하는 재구성(remodeling)을 유도할 수 있다.
본 명세서에서 기술된 한 구체예에서, 연골세포 또는 줄기세포의 시험관 배양을 위한 조성물이 제공된다(가령, 환자에게 후속 이식 또는 주사 없이 세포의 시험관 배양용). 시험관 배양을 위한 조성물은 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸을 포함한다. 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸의 기존 설명된 구체예들은 본 명세서에서 기술된 시험관 배양용 조성물에 적용된다.
다양한 측면에서, 본 발명의 시험관 배양용 조성물은 미네랄, 아미노산, 슈가, 펩티드, 단백질, 비타민(이를 테면 아스코르브산)을 포함하는 영양제, 또는 라미닌, 피브로넥틴, 히알루론산, 피브린, 엘라스틴, 또는 어그리칸, 또는 성장 인자 이를 테면 상피 성장 인자, 혈소판-유도된 성장 인자, 형질변형 성장 인자, 또는 섬유아세포 성장 인자, 그리고 글루코코르티코이드 이를 테면 덱사메타손과 복합될 수 있다.
일부 구체예들에서, 시험관 배양을 위한 조성물은 골아세포, 골원성 세포, 그리고 간엽성 줄기세포로 구성된 군으로부터 선택된 줄기 세포를 포함한다. 다양한 구체예들에서, 시험관 배양용 조성물은 하나 또는 그 이상의 세포 유형과 조합되어 접종될 수 있다.
하나의 설명적 측면에서, 시험관 배양용 조성물은 멸균될 수 있다. 본 명세서에서 이용된 것과 같이 "멸균" 또는 "멸균되다" 또는 "멸균된"은 엔도톡신, 핵산 오염물질, 그리고 감염성 물질들을 포함하나 이에 한정되지 않는 원치 않는 오염물질을 제거함으로써 이 매트릭스를 소독한다는 것을 의미한다. 선행 단락에서 제공된 멸균 과정, 방법 및 구체예들은 본 명세서에서 기술된 시험관 배양용 조성물에 또한 적용될 수 있다. 시험관 배양조성물은 환자에게 이식 또는 주사되는 세포 집단을 확장시키는데 이용될 수 있다.
본 명세서에서 기술된 한 구체예에서, 생물재료 연골 대체 조성물용 첨가제가 제공된다. 첨가제는 기존의 생물재료 연골 대체 재료에 추가하기 위한 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸을 포함한다. 기존에 기술된 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸의 구체예들은 본 명세서에서 기술된 첨가제에 적용될 수 있다.
본 명세서에서 이용된 것과 같이, 구절 "기존의 생물재료 연골 대체 재료"는 신체에서 손상된, 결함성, 또는 유실(missing) 연골의 대체로 이용될 수 있는 생물학적으로 필적되는 조성물을 의미한다. 기존의 생물재료 연골 대체 조성물의 다양한 유형이 당업계에 공지되어 있고, 그리고 고려된다. 예를 들면, 기존의 생물재료 연골 또는 골 대체 조성물은 DeNovo® NT 천연 조직 이식편 (Zimmer), MaioRegen™ (JRI Limited), 또는 Biomet에서 생산된 냉동보존된 골관절 조직 집합을 포함한다.
한 구체예에서, 생물재료 또는 골 연골 대체를 준비하는 방법이 제공된다. 이 방법은 이 합성 펩티도글리칸과 기존의 생물재료 또는 골 연골 대체 재료를 복합시키는 단계를 포함한다. 기존의 설명된 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸의 구체예들은 본 명세서에서 기술된 방법에 적용된다.
한 구체예에서, 환자의 관절염을 치료하는 방법이 제공된다. 이 방법은 이 환자에게 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸를 투여하는 단계를 포함하는데, 이때 이 합성 펩티도글리칸은 관절염과 연합된 하나 또는 그 이상의 증상을 감소시킨다. 기존에 설명된 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸의 구체예들이 본 명세서에서 기술된 이 방법에 적용된다.
다양한 구체예들에서, 관절염을 치료하는 방법에 이용된 이 합성 펩티도글리칸은 관절염과 연합된 하나 또는 그 이상의 증상을 감소시킨다. 관절염과 연관된 다양한 증상들이 당업계에 공지되어 있는데, 통증, 강성, 말랑해짐, 염증, 부기, 붉어짐(redness), 온기(warmth), 그리고 감소된 유동성을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 관절염의 증상들은 관절, 힘줄, 또는 신체의 다른 부분들에 존재할 수 있다. 본 명세서에서 이용된 것과 같이, "감소된다"는 관절염의 증상을 막거나 또는 완벽하게 또는 부분적으로 경감시킨다는 것을 의미한다.
다양한 구체예들에서, 관절염은 골관절염 또는 류마티즘성 관절염이다. 골관절염 및 류마티즘성 관절염의 병리 및 임상 증후들은 당업계에 공지되어 있다. 이 방법의 한 구체예에서, 이 합성 펩티도글리칸은 투여 후 윤활제로 작용하거나 또는 연골 상실을 막는다. 또다른 구체예에서, 이 합성 펩티도글리칸는 환자에서 골 관절을 막는다. 예를 들면, 이 합성 펩티도글리칸은 감소된 또는 손상된 연골을 가진 환자에서 골 관절상에 골을 억제한다.
한 구체예에서, 환자에게서 ECM 성분들의 퇴화를 감소 또는 방지하는 방법이 제공된다. 예를 들면, 환자의 연골에서 ECM 성분들의 퇴화를 감소 또는 방지하는 방법이 제공된다. 이 방법은 이 환자에게 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸을 투여하는 것을 포함한다. 기존의 설명된 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸의 구체예들이 본 명세서에서 기술된 이 방법에 적용된다. 한 구체예에서, 이 합성 펩티도글리칸은 매트릭스 메탈로 프로테아제, 가령, 어그리카나제에 저항성이다.
또다른 구체예에서, 환자에게서 히알루론산 퇴화를 감소 또는 예방하는 방법이 제공된다. 이 방법은 이 환자에게 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸을 투여하는 것을 포함한다. 기존의 설명된 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸의 구체예들이 본 명세서에서 기술된 이 방법에 적용된다.
또다른 구체예에서, 콜라겐 퇴화를 감소 또는 예방하는 방법이 제공된다. 이 방법은 콜라겐 존재하에서 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸에 히알루론산을 접촉시키고, 그리고 콜라겐 퇴화를 감소 또는 예방하는 단계를 포함한다. 기존의 설명된 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸의 구체예들이 본 명세서에서 기술된 이 방법에 적용된다.
또다른 구체예에서, 콘드로이틴 술페이트 퇴화를 감소 또는 예방하는 방법이 제공된다. 이 방법은 콜라겐 존재하에서 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸에 히알루론산을 접촉시키고, 그리고 콘드로이틴 술페이트 퇴화를 감소 또는 예방하는 단계를 포함한다. 기존의 설명된 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸의 구체예들이 본 명세서에서 기술된 이 방법에 적용된다.
ECM 성분 퇴화, 가령, 히알루론산, 콜라겐, 또는 콘드로이틴 술페이트 퇴화을 "감소시키는"이란 히알루론산, 콜라겐, 또는 콘드로이틴 술페이트의 퇴화를 각각 완벽하게 또는 부분적으로 감소시킨다는 의미다.
한 구체예에서, 환자에게서 히알루론산 퇴화의 감소는 히알루론산 퇴화 속도의 감소를 의미한다. 예를 들면, 본 출원의 실시예 부분에서 설명된 도 8은 히알루론산 그리고 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸의 혼합물안에 히알루론산 퇴화 속도는 이 합성 펩티도글리칸을 추가할 때 유의미적으로 감소된다는 것을 보여준다.
한 구체예에서, 콜라겐 퇴화의 감소는 콜라겐 퇴화 속도의 감소를 의미한다. 예를 들면, 본 출원의 실시예 부분에서 설명된 도 10에서 히알루론산 그리고 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸 존재하에 콜라겐 퇴화 속도는 이 합성 펩티도글리칸을 추가할 때 유의미적으로 감소된다는 것을 보여준다.
한 구체예에서, 콘드로이틴 술페이트 퇴화의 감소는 콘드로이틴 술페이트 퇴화의 속도 감소를 의미한다. 예를 들면, 본 출원의 실시예 부분에서 설명된 도 10에서 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸 존재하에 콘드로이틴 술페이트 퇴화 속도는 이 합성 펩티도글리칸을 추가할 때 유의미적으로 감소된다는 것을 보여준다.
본 명세서에서 기술된 한 구체예에서, 환자에서 조직 결함을 교정 또는 변형시키는 방법이 제공된다. 이 방법은 조직 결함으로 히알루론산 그리고 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸을 투여하는 것을 포함하는데, 이때 결함 교정 또는 변형된다. 기존의 설명된 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸의 구체예들이 본 명세서에서 기술된 이 방법에 적용된다. 한 구체예에서, 이 조직 결함은 미용적 결함이다.
다음의 구체예들은 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸이 환자에게 투여되는, 본 명세서에서 기술된 방법에 적용된다. 다양한 구체예들에서, 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸은 주사되거나 또는 이식된다(가령, 연골 복구 조성물 또는 장치에 통합된다). 본 명세서에서 기술된 일부 구체예들에서, 주사는 관절내 주사이다. 본 명세서에서 기술된 또다른 구체예에서, 주사는 환자의 관절 캡슐내로 주사된다. 기타 구체예들에서, 피부 충전물의 경우에서와 같이 주사는 피하 주사이다. 주사용으로 적합한 수단은 바늘(미세바늘 포함) 주사기 또는 주입 장치를 포합한다.
설명을 위한 구체예에서, 환자에게 투여하기 위한 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸과 함께 이용되는 약학 제제는 다음을 포함한다: a) 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸의 제약학적 활성 양; b) 약 pH 4.5 내지 약 pH 9 범위의 pH를 제공하기 위하여 제약학적 수용가능한 pH 완충 물질; c) 약 0 내지 약 300 millimolar 농도 범위에서 이온성 강도 변형 물질; 그리고 d) 총 제제 중량 또는 임의의 개별 성분 a), b), c), 또는 d) 또는 a), b), c) 그리고 d)의 임의의 조합의 약 0.25% 내지 약 10% 농도 범위에서 물 가용성 점성 변형 물질.
본 명세서에서 기술된 다양한 구체예들에서, pH 완충 물질은 당업계에 공지되어 있는 물질이며, 예를 들면, 아세트산염, 붕산염, 탄산염, 구연산염, 그리고 인산 완충염, 뿐만 아니라 염산, 수산화 나트륨, 산화 마그네슘, 인산일칼륨, 중탄산염, 암노니아, 카르본 산, 염화수소 산, 구연산 나트륨, 구연산, 아세트 산, 인간수소이나트륨, 붕사(borax), 붕산, 수산화나트륨, 디에틸 바르비투르산, 그리고 단백질, 뿐만 아니라 다양한 생물학적 완충액, 예를 들면, TAPS, Bicine, Tris, Tricine, HEPES, TES, MOPS, PIPES, 카코딜레이트(cacodylate), 또는 MES를 포함한다.
본 명세서에서 기술된 다양한 구체예들에서, 이온성 강도 변형 물질은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들면, 글리세린, 프로필렌 글리콜, 만니톨, 포도당, 덱스트로즈, 솔비톨, 염화나트륨, 염화칼륨 및 기타 전해질을 포함한다.
유용한 점성 조정 물질은 이온성 그리고 비-이온성 물 가용성 고분자; 가교된 아크릴산 고분자 이를 테면 고분자의 "카르보머(carbomer)" 패밀리, 가령, Carbopol® 상표로 시판되는 카르복시폴리알킬렌; 친수성 고분자 이를 테면 폴리옥시드 에틸렌, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 코폴리머, 그리고 폴리비닐알코올; 셀룰로오즈 고분자 그리고 셀룰로오즈 폴리머 유도체들 이를 테면 하이드록시프로필 셀룰로오즈, 하이드록시에틸 셀룰로오즈, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오즈, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오즈 프탈레이트, 메틸 셀룰로오즈, 카르복시메틸 셀룰로오즈, 그리고 에테르화된 셀룰로오즈; 검(gums) 이를 테면 트라가탄 및 산탄검; 알긴산 나트륨; 젤라틴, 히알루론산 그리고 이의 염, 치토산, 겔란 또는 이의 임의의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 전형적으로, 비-산성 점성 강화 물질, 이를 테면 중성 또는 염기성 물질은 제제의 원하는 pH를 용이하게 획득하기 위하여 이용된다.
본 명세서에서 기술된 다양한 구체예들에서, 주사용 제제는 멸균 비-수성 용액 또는 적합한 비이클 이를 테면 멸균, 발열물질-없는 물과 함께 이용되는 건조된 형태(가령, 동결건조된)로 제형화될 수 있다. 예를 들면, 동결건조와 같은 멸균 조건 하에서 주사용 제제의 준비는 당업계에 공지되어 있는 표준 약학 기술에 의해 용이하게 실현될 수 있다. 한 구체예에서, 히알루론산을 함유하는 용액의 점성은 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸의 추가에 의해 증가된다.
본 명세서에서 기술된 다양한 구체예들에서, 주사를 통하여 투여하기 위한 제제의 준비에 이용된 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸의 용해도는 적합한 제형화 기술, 이를 테면 용해도-강화 조성물 이를 테면 만니톨, 에탄올, 글리세린, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 폴옥사머 및 당업계에 공지되어 있는 기타 물질의 통합에 의해 증가될 수 있다.
본 명세서에서 기술된 다양한 구체예들에서, 주사를 통하여 투여되는 제제는 즉각 및/또는 변형된 방출을 위하여 제형화될 수 있다. 변형된 방출 제제는 지연된, 지속된, 펄스, 제어된, 표적화된 그리고 예정된 방출 제형을 포함한다. 따라서, 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸은 고형, 반-고형, 또는 활성 화합물의 변형된 방출을 제공하는 이식된 데포우(depot)로서 투여용 요변성(thixotropic) 액체로 제형화될 수 있다. 이러한 제형의 설명을 위한 실시예는 약물-피복된 스텐트 및 코폴리머(dl-락트산, 글리콜)산 (PGLA) 미소구를 포함한다. 또다른 구체예에서, 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸 또는 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸을 포함하는 조성물은 적합한 경우 연속적으로 투여될 수 있다.
본 명세서에서 기술된 임의의 구체예들에서, 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸은 단독으로 투여되거나 또는 적합한 약학 운반체 또는 희석제와 함께 투여될 수 있다. 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸 제형에 이용되는 희석제 또는 운반체 성분들은 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸의 바람직한 효과를 감소시키지 않도록 선택될 수 있다. 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸 제형은 임의의 적합한 형태일 수 있다. 적합한 약형(dosage forms)의 예로는 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸의 수성 용액, 예를 들면, 등장성 염수, 5% 포도당 또는 기타 공지의 약학적으로 수용가능한 액체 운반체 이를 테면 알코올, 글리콜, 에스테르 그리고 아미드 안에 용액을 포함한다.
히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸의 적합한 투약량(dosages)은 표준 방법들, 예를 들면 실험실 동물 모델 또는 임상 시험에서 용량-반응 곡선을 확립함으로써 결정될 수 있다. 본 명세서에서 기술된 다양한 구체예들에서, 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸의 투약은 환자의 상태, 치료될 질병의 상태, 투여 경로 및 조직 분포, 다른 치료 과정과의 공동이용 가능성에 따라 유의미적으로 다변할 수 있다. 설명하자면, 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸의 적합한 투약량(단일 다량(bolus) 투여 또는 오랜 시간을 두고)은 약 1 ng/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 100 ng/kg 내지 약 1 mg/kg, 약 1 μg/kg 내지 약 500 μg/kg, 또는 약 100 μg/kg 내지 약 400 μg/kg을 포함한다. 이들 각 구체예에서, 용량/kg은 환자 체격 또는 체중 kg 당 용량을 의미한다. 다른 설명적 측면들에서, 유효량은 용량당 약 0.01 μg 내지 약 1000 mg, 약 1 μg 내지 약 100 mg, 또는 약 100 μg 내지 약 50 mg, 또는 약 500μg 내지 약 10 mg, 또는 약 1 mg 내지 10 mg, 또는 약 1 내지 약 100 mg, 또는 약 1 mg 내지 5000 mg, 또는 약 1 mg 내지 3000 mg, 또는 약 100 mg 내지 3000 mg, 또는 약 1000 mg 내지 3000 mg 범위일 수 있다. 한 구체예에서, 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸의 적합한 투약량은 약 0.01 uM 내지 약 100 uM, 약 0.05 내지 약 100 uM, 약 0.1 uM 내지 약 100 uM, 약 0.1 uM 내지 약 50 uM, 약 0.1 uM 내지 약 20 uM, 약 0.1 uM 내지 약 10 uM, 약 0.5 uM 내지 약 10 uM, 약 0.5 uM 내지 약 50 uM, 그리고 약 0.5 uM 내지 약 100 uM의 농도 범위를 포함한다. 또다른 구체예에서, 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸의 적합한 투약량은 약 0.01 uM, 0.1 uM, 0.2 uM, 0.5 uM, 1 uM, 2 uM, 5 uM, 10 uM, 20 uM, 50 uM, 그리고 100 uM의 농도를 포함한다.
히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸은 부형제에서 제형화될 수 있다. 본 명세서에서 기술된 임의의 구체예들에서, 부형제는 약 0.4 mg/ml 내지 약 6 mg/ml 농도 범위를 가질 수 있다. 다양한 구체예들에서, 부형제의 농도는 약 0.5 mg/ml 내지 약 10 mg/ml, 약 0.1 mg/ml 내지 약 6 mg/ml, 약 0.5 mg/ml 내지 약 3 mg/ml, 약 1 mg/ml 내지 약 3 mg/ml, 약 0.01 mg/ml 내지 약 10 mg/ml, 그리고 약 2 mg/ml 내지 약 4 mg/ml 범위를 가질 수 있다.
히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸이 연골 복구 조성물 또는 장치 (가령, 이식용 겔)의 일부로 이식되는 구체예들에서, 상기에서 설명된 임의의 적합한 제형이 이용될 수 있다.
히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸을 투여하기 위한 임의의 효과적인 섭생이 이용될 수 있다. 예를 들면, 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸은 단일 투약으로 또는 다중투약 일일 섭생으로 투여될 수 있다. 더우기, 시차화된(staggered) 섭생, 예를 들면, 주당 1 내지 5일을 일일 치료에 대체방법으로 이용될 수 있다.
본 명세서에서 기술된 다양한 구체예들에서, 이 환자는 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸의 다중 주사로 치료된다. 한 구체예에서, 이 환자에게 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸를 다중 횟수(가령 약 2 내지 최대 약 50회), 예를 들면, 1272 시간 간격 또는 4872 시간 간격으로 주사한다. 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸의 추가 주사는 최초 주사 이후 일일 간격 또는 월간격으로 환자에게 투여될 수 있다.
본 명세서에서 기술된 임의의 구체예에 있어서, 이 펩티드 일부, 글리칸 일부, 또는 이 모두와 상이한 2개 또는 그 이상 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸의 조합이 단일 히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸을 대신하여 이용될 수 있음을 인지할 것이다.
전술한 구체예에서, 화합물, 조성물 그리고 방법의 특정 측면은 대안 목록, 이를 테면, 설명하자면, 하나 또는 그 이상의 G 및 P의 선택에서 제시된다는 것을 또한 인지해야 한다. 따라서, 본 발명의 다양한 대체 구체예들은 언급된 목록의 개별 구성요소들 뿐만 아니라, 이들 목록의 다양한 하위집단을 포함한다는 것으로 이해해야 한다. 이들 각 조합은 목록에서 설명되는 것으로 이해된다.
다음의 설명을 위한 실시예들에서, 용어 "어그리칸 모방체(mimetic)" 그리고 "모방체"은 용어 "히알루론산-결합 합성 펩티도글리칸"과 동의어로 이용된다.
실시예 1
펩티드 합성
모든 펩티드는 Symphony 펩티드 합성기(Protein Technologies, Tucson, AZ)를 이용하여, Knorr 수지 상에서 FMOC 프로토콜에 따라, 합성되었다. 정제안된(crude) 펩티드는 수지로부터 TFA에 의해 방출되며, 그리고 AKTAexplorer (GE Healthcare, Piscataway, NJ) 상에서 Grace-Vydac 218TP C-18 역상 컬럼 그리고 물/아세토니트릴 0.1%TFA의 구배를 이용하여 역상 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 단실-변형된 펩티드는 수지로부터 방출에 앞서, 단실-Gly (Sigma)로 추가적인 커플링 단계를 추가함으로써 준비되었다. 펩티드 구조는 질량 분석에 의해 확인되었다. 다음의 펩티드는 상기에서 설명된 것과 같이 준비되었다: GAHWQFNALTVRGGGC, KQKIKHVVKLKGC, 그리고 KLKSQLVKRKGC.
실시예 2
콘드로이틴 술페이트 기능화 및 합성 펩티도글리칸 형성
어그리칸 모방체 (가령, GAH) 창조를 위한 반응 개요는 도 1에서 볼 수 있다. 콘드로이틴 술페이트 (CS) (Sigma, St. Louis, MO)의 기능화는 CS를 산화시키기 위하여 과요오드산 나트륨(Thermo Scientific, Waltham, MA)을 이용하여 실행되었다. 반응 지속기간 및 과요오드산 나트륨 농도를 변화시킴으로써, 산화 반응에 의해 생성된 알데히드 기들의 수가 조절되었고, 그 값은 표 2에 나타낸다. 표 2는 CS 쇄 당 원하는 수의 알데히드를 얻는데 요구되는 과요오드산 나트륨농도 및 반응 지속기간을 상세히 나타낸다. 도 1에 나타낸 개요와 같이 진행되는 화학적 반응을 통하여, CS 쇄 마다에 부착되는 BMPH의 수는 생산된 알데히드의 수와 부착된 히알루론산 (HA) 결합 펩티드의 수와 동일한 것으로 추정된다. 반응 지속기간 및 과요오드산 나트륨의 농도에 근거하여, CS 쇄 당 펩티드의 수(평균)는 표 2에 나타낸다.
과요오드산 나트륨농도 (mM)
 반응 지속기간 (hr)
 # 알데히드/ CS 쇄
10
 24
 3
20
 24
 7.2
30
 24
 8.5
20
 48
 9
30
 48
 10.5
CS의 농도는 모든 산화 반응 동안 20 mg/mL에서 일정하게 유지되었다. CS 및 과요오드산 나트륨의 측정된 양은 명시된 시간 동안 0.1 M 아세테이트 나트륨 완충액 (pH 5.5)에서 반응되고, 그리고 빛으로부터 보호된다. KTA Purifier FPLC (GE Healthcare, Piscataway, NJ)를 이용하여 폴리아크릴아미드 비드 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)로 채워진 Bio-Scale Mini Bio-겔 컬럼에서 겔 여과 크로마토그래피를 실행하여 과요오드산 나트륨을 제거함으로써 반응이 종료된다. 탈염 과정에 이용되는 운영(running) 완충액은 1x 인산염 완충된 염수(PBS, pH 7.4, Invitrogen, Carlsbad, CA)이다.
N-[β-말레이미도프로피오닌산]하이드라지드,트리플로오르아세트산 염 (BMPH, Pierce, Rockford, IL)은 1x PBS에서 탈염되고, 산화된 CS와 50M 과량으로 반응된다. BMPH의 하이드라지드 말단은 새로 만들어진 알데히드를 통하여 기능화된 CS에 공유적으로 부착되도록 반응되어, Schiff 염기 중간생성물이 형성된다. 시아노보로하이드리드 나트륨(5 M, Pierce)이 이 반응물에 추가되어, Schiff 염기 중간생성물 이민을 좀더 안정적인 아민으로 환원되었다. 과량의 BMPH는 탈이온수에서 FPLC 탈염에 의해 용액으로부터 제거되었다. KTA Purifier FPLC 상에서 흡수도 탐지 능력으로 인하여, 과량의 BMPH 양이 측정되었다. 작은 크기의 그리고 낮은 분자량의 BMPH (297.19 g/mol)는 훨씬 나중 시점에서 별도로 컬럼으로부터 이를 용리시켰다. 다수의 단일 밴드 및 때때로 이중 밴드의 존재와 함께, BMPH는 215 nm 파장(단일 밴드의 특징) 과 254 nm 파장(이중 밴드의 특징) 모두에서 강력한 흡수 스펙트럼을 만들었다. 따라서, 215 nm 흡수도 스펙트럼의 통합된 영역에 대해 공지의 BMPH를 상호연관시키는 표준 곡선이 만들어졌다, 도 2. 이 표준 곡선과 함께, 과량의 BMPH 양이 측정되었다. 고유 반응 물질로부터 과량의 BMPH 양을 공제함으로써 반응에서 소모된 BMPH의 양을 측정하게 된다. 소비된 양을 이용하여 산화된 CS에 결합된 BMPH의 수가 산출되었다. 수집된 CS-BMPH 산물은 냉동시키고, 동결건조시키고, -80℃에 보관되었다.
HA 결합 펩티드 서열는 Mummert에 의해 확인되었다. 확인된 서열에 약간의 변형으로 본 연구에 이용된 특이적 HA 결합 서열, GAHWQFNALTVRGGGC (GAH로 표시됨)이 만들어졌다. 이 펩티드는 Genscript (Piscataway, NJ)에 의해 만들어졌고, 여기로부터 구입하였다. 시스테인 아미노산은 BMPH의 말레이미드 기에 티오에테르 결합 형성을 통하여 커플링이 되도록 포함되었다. 기능화된 CS에 결합된 BMPH의 수는 부착된 GAH 펩티드의 수와 동일할 것이라는 가정이 참작되어, 이 반응은 1:1 비율로 일어난다. 쇄당 결합된 BMPH의 수에 대해 과량의 1 몰에서 GAH 펩티드는 디메틸 술폭시드(DMSO, Sigma)에 용해되고, 그리고 15분 간격으로 용적의 1/4이 CS-BMPH 용액으로 추가되었다. GAH 펩티드의 최종 추가 후, 이 반응은 2시간 동안 진행되었다. 이 시간 동안 과량의 GAH 펩티드는 미립자를 형성한다. GAH 기능화된 CS를 획득하기 위하여 이 용액을 정제하기에 앞서, 용액은 Acrodisc 0.8 μm 구멍 직경 필터(Pall, Port Washington, NY)를 통하여 통과시켜 과량의 펩티드 미립자를 제거하였다. 그 다음 용액은 탈이온화된 물과 함께 KTA Purifier FPLC를 통과시켜 GAH-CS 화합물을 정제하였다. 그 다음 수집된 화합물은 -80℃에서 냉동시키고, 동결건조시켜 원하는 어그리칸-모방체를 만들었다. 실험 협약에 의해, 어그리칸 모방체는 (부착된 펩티드의 수) (펩티드 서열의 첫 3문자) - (기능화된 GAG 약어)로 명명되는데, 가령 어그리칸 모방체의 경우, 콘드로이틴 술페이트 GAG 골격으로 기능화된 3 GAH HA 결합 펩티드의 경우, 3GAH-CS로 명명된다.
실시예 3
합성 펩티도글리칸이 히알루론산에 결합
고정된 히알루론산에 합성 펩티도글리칸 결합
4 mg/mL 농도의 히알루론산 (HA, Streptococcus equi, Sigma)을 96-웰 플레이트(Costar, blk/clr, Corning, Corning, New York)에 4℃에서 하룻밤 동안 고정시켰다. 바이오틴 라벨된 GAH 펩티드는 CS쇄당 1개 바이오틴-GAH 농도로 기능화된 CS에 BMPH를 통하여 결합되었다. 라벨안된 GAH 펩티드는 CS의 남아있는 반응안된 알데히드에 결합되었다. 표준 바이오틴-스트렙타아비딘 탐지 방법을 이용하여 고정된 HA에 어그리칸 모방체 결합 정도를 측정하였다. HA 표면의 차단은 1x PBS 용액에서 1% 소의 혈청 알부민 (BSA, Sera Care Life Sciences, Milford, MA)으로 1 시간동안 실시되었다. 1x PBS로 세척한 후, 바이오틴-라벨된 어그리칸 모방체는 30분 동안 웰에서 항온처리되고, 그 다음 1x PBS로 세척되었다. 스트렙타아비딘-양고추냉이 과산화효소 (R&D Systems, Minneapolis, MN) 용액이 각 웰에 추가되었고, 20분 동안 반응되도록 두었다. 반응이 완료되고, 세척된 후, 크로모겐 용액이 추가되었고(Substrate Reagent Pack, R&D Systems), 15분 동안 발달되었다. 15 분에, 황산 (Sigma)을 각 웰에 직접 추가하여 반응을 종료시켰다. 웰 플레이트는 M5 SpectraMax Plate Reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)에서 450 및 540 nm 파장에서 판독되었다. 생성된 2개의 흡수도 판독을 공제함으로써, 결합된 바이오틴-라벨된 어그리칸-모방체로 인한 흡수도가 측정되었다.
어그리칸 모방체당 1개의 GAH 펩티드가 바이오틴-라벨된 GAH 펩티드에 의해 대체되었고, 현재-라벨된 어그리칸 모방체는 고정된 HA와 함께 항온처리되었다. 상업적으로 이용가능한 바이오틴 탐지 산물(스트렙타아비딘 및 HRP를 통하여)은 고정된 HA에 모방체 결합 정도를 설명하였다(도 3 참고). 1 μM 농도에서 출발하여, 어그리칸 모방체는 고정된 HA에 용량 의존적으로 증가되었는데, 이것은 이 모방체가 HA에 결합되었음을 보여주는 것이다. 그러나, 이 모방체의 결합 친화력의 측정은 고정된 HA의 양의 불확실성으로 인하여 실시되지 않았다.
히알루론산에 유량계 유도된 합성 펩티도글리칸 결합
좀더 생리학적으로 관련된 상황에서 HA에 결합하는 어그리칸-모방체의 능력을 테스트하기 위하여, HA 용액을 만들었다. HA에 결합하는 어그리칸-모방체의 능력은 이 모방체에 의한 HA 가교를 나타내는 용액의 저장 모듈의 개선에 의해 유추되었다. HA에 결합하는 어그리칸 모방체의 능력을 테스트하기 위하여 1x PBS pH 7.4에서 다중 처리가 일어났다: 2.5 wt% HA 대조군, CS:HA의 25:1 몰 비율에서 HA+CS, 25:1의 HA+3GAH-CS, 25:1의 HA+7.2GAH-CS, 25:1의 HA+10.5GAH-CS.
AR-G2 유량계 (TA Instruments, New Castle, DE), 주파수(0.1 - 100 Hz, 2.512 Pa) 그리고 스트레스 (0.1 - 100 Pa, 1.0 Hz) 스윕은 각 용액의 저장 모듈을 측정하기 위하여 실행되었다.
유동학은 제공된 힘에 반응하여 물질의 유동을 연구하는데, 점탄성 재료를 측정할 때 흔히 이용된다. 구체적으로, 유량계는 적용된 힘에 대한 물질의 피이드백에 근거하여 저장 모듈 및 상실 모듈을 측정한다. 저장 모듈은 물질에 의해 탄성적으로 흡수되는 에너지의 양의 측정이며, 상실 모듈은 열을 통하여 잃은 에너지의 양을 나타낸다. 큰 저장 모듈은 좀더 딱딱한 탄성 구조를 가진 겔-유사 물질을 나타내고, 반면, 작은 저장 모듈 및 큰 상실 모듈은 제공된 하중(load)를 탄성적으로 유지시키지 못하는 점성 재료를 나타낸다. 고분자량 HA (~1.5MDa)는 HA 쇄 얽힘에 의해 형성된 허위-겔로 인하여 제공된 하중의 일부를 탄성적으로 유지시키는 매우 점성이 큰 재료다. 만들어진 어그리칸 모방체는 다중 HA 결합 펩티드를 보유하여 HA에 적합한 모방체 결합으로 간주되면, HA 쇄 가교(crosslinker) 유형으로 작용할 수 있다. 고분자량의 HA를 가진 용액에서, 어그리칸 모방체는 용액의 견고성을 증가시킬 수 있고, 더 큰 저장 모듈을 만들 것이라고 가정된다. 더 큰 저장 모듈은 혼합물 내에 어그리칸 모방체와 HA 쇄들 사이에 강력한 결합 친화력를 증명하는 강력한 HA 가교를 나타낸다. 기능화된 CS 쇄당 부착된 GAH 펩티드 수 (평균 3, 7.2, 또는 10.5)를 차등시킨, 어그리칸 모방체의 다양한 형태가 테스트되었다.
도 4에 나타낸 실험 결과는 CS의 추가로 HA 용액의 저장 모듈을 유의미적으로 (α=0.05) 낮아졌음을 보여주었다. CS와 연합된 조밀한 음전하의 추가는 HA 얽힘 정도를 용이하게 하고, 제공된 에너지를 보관하는 허위-겔을 제거함으로써, HA 쇄들의 확산을 도왔다. 가설을 확인하기 위하여, CS 당 GAH 펩티드의 수를 3에서 10.5로 증가시켰을 때, 혼합물의 저장 모듈은 마찬가지로 증가되었다. 이러한 증가는 어그리칸 모방체 당 GAH 펩티드의 수를 더 많이 가지게 하는 두 가지 유익산 속성에 기여될 수 있다. 첫째, CS 당 더 많은 GAH 펩티드가 부착되면, 모방체의 친화력(avidity)은 더 높아지게 되고, 이는 HA 분자에 더 강력하게 모방체가 결합되도록 한다. 둘째, CS에 더 많은 GAH 펩티드가 부착될수록, 모방체가 HA 분자 사이에 가교로 작용할 가능성이 더 커진다. 이들 두 효과는 모두 더욱 겔-과 유사한 혼합물에 기여하여, 더 큰 측정된 저장 모듈을 만든다. 모방체와 HA 사이에 더 약한 결합은 허위-겔을 복원시킬 수 없을 것이며, 유량계로부터 제공된 에너지를 비축할 수 없을 것이다. 저장 모듈에서의 증가는 도 3에 나타낸 것과 같이 고정된 HA에 강력한 모방체 결합을 확인시킨다. 특히 CS 쇄당 10.5개 GAH 펩티드는 저장 모듈이 HA 대조군과 유사한 평균 저장 모듈에 도달한 HA+CS 대조군 보다 유의미적으로 더 높았다(α=0.05).
실시예 4
합성 펩티도글리칸 압축 연구
콜라겐 겔 형성 및 탁도
고유한 연골 세포밖 매트릭스를 모방하기 위하여, 콜라겐을 이용하여 천연 골격 내에 HA 및 어그리칸-모방체 응집체(aggregates)를 포획하였다. 콜라겐 유형 II (CII)은 2가지 상이한 시판 재료로부터 얻었다(Affymetrix, Santa Clara, CA 및 Sigma). 연골 ECM 성분들의 혼합물은 고유한 성분 분해에 따라 pH 7.6 TES 완충액 (60 mM TES, 20 mM Na2HPO4, 0.56 M NaCl, Sigma의 화학물질)에서 준비되었고, 이때 CII는 70 건중량%을 포함하고, HA 및 어그리칸 모방체/CS 대조군의 보합은 이 혼합물의 나머지 30 건중량%를 형성한다. 겔에서 CII의 최종 농도는 2 mg/mL이었다. 시료는 CII 대조군, CII+HA+CS 대조군, 그리고 CII+HA+어그리칸 모방체 (10.5GAH-CS)으로 구성된다. 때이른 원섬유형성(fibrollogenesis) 및 겔 형성을 막기 위하여, 이 용액은 산성 pH에서 얼음 위에 유지시킨다. 성분들의 용액 혼합물은 원섬유형성이 개시되도록 37℃ 및 생리적 pH에 위치시킨 384 웰 플레이트(Greinier blk/clr, Monroe, NC)에 위치시켰고, 겔 형성을 측정하기 위하여 M5 SpectraMax에서 313nm에서 감시하였다. 다양한 처리로 포함된 경우, CII는 겔을 형성할 수 없었다 (Supplementary Information 참고). 따라서, 콜라겐 유형 I (CI, 고농도 쥐 꼬리 콜라겐 유형 1, BD Biosciences, Bedford, MA)이 겔 형성에 이용되었다. CI의 경우 동일한 처리 및 절차가 이용되었지만, 단 성분의 양은 CI 4 mg/mL의 최종 농도로 변이시켰다. CI는 다음 모든 실험에 이용되었다.
연골 모사의 형성을 측정하기 위하여 CI로 탁도가 실행되었고, 그 결과는 도 5에 나타낸다. 설명된 것과 같이, HA+10.5GAH-CS의 추가는 콜라겐 섬유들의 원섬유형성에 영향을 주지 않았다. 모든 처리는 유사한 곡선을 따랐고, 대략 동일한 시점에 유사한 흡수도 절정에 도달되었다. HA+10.5GAH-CS 처리는 때이른 CI 미소섬유 형성 때문이 아니라, 1x PBS 용액에서 자가-응집체를 형성하는 어그리칸 모방체의 경향으로 인하여, 더 높은 초기 흡수도를 가졌다. 10.5GAH-CS의 응집은 초기 HA 유량계 테스트에서 인지되었지만, 응집은 어그리칸 모방체가 HA에 결합하는 능력을 방해하지 않았다.
콜라겐 겔 성질 테스트
콜라겐-기본 겔 압축 테스트 및 주파수 스윕은 20-mm 평행 플레이트 배열(TA Instruments)을 이용하여 AR-G2 유량계에서 실행되었다. 375 μL 겔 혼합물을 얼음위에서 준비하였고, 유량계 베이스 플레이트로 피펫팅하였다. 배열은 1 mm의 갭 거리로 낮추었고, 용액은 37℃으 가열되었다. 습도 트랩을 이용하여 겔 탈수를 방지하였고, 혼합물은 2시간에 걸쳐 겔형성이 되도록 하였다. 이 두 시간은 탁도 데이터로부터 겔형성 데이터까지 나타낸 시간으로 결정되었다. 2시간 후, 겔은 테스트에 따라서 압축되거나 요동된다(oscillated). 압축 테스트는 초당 1% (10 μm)의 공학 긴장 속도에서 실행되었다. 배열 머리에서 갭 거리 및 표준력(normal force)이 측정되었다. 주파수 스윕은 0.1에서 1 Hz로 주파수의 10 증가 대수 기반 동안 만들어진 겔의 저장 모듈을 측정하였다.
동시 표준역과 치환이 측정되었고, 처리에 대한 공학 스트레스 및 긴장이 산출되었다. 도 6에서 나타낸 것과 같이, 어그리칸 모방체의 함유는 겔 복합물의 압축 강도를 유의미적으로 (α=0.05) 증가시켰다. 콜라겐+HA+AGG 모방체의 절정의 공학 스트레스는 공학 긴장 of 9%의 공학 긴장에서 7.5 kPa에 도달되었고, 반면 콜라겐+HA+CS 대조군은 4%에서 절정의 4.8 kPa에 도달되었고, 그리고 콜라겐 대조군은 15% 긴장에서 절정의 4.2 kPa에 도달되었다.
CI+HA+10.5 겔의 압축 강도의 증가에는 두 요인이 기여하였는데, 첫 번째는 물을 끌어당기는 모방체의 능력이며, 둘째 요인은 어그리칸 모방체의 HA 가교 능력이다. 고유한 연골에서, HA 및 CS에 의해 제공되는 포획된 음전하의 우세는 물을 끌어당기고, 연골로부터 물의 확산을 지체시킨다. 압축력이 연골에 제공될 때, 물은 활액 캡슐로 확산되어 나갈 수 없다. 이러한 압축불가능한 물을 보유함으로써, 구조의 압축 강도는 증가된다. 유사하게 테스트된 겔 복합체에서, 겔 안에 CS와 연합된 음전하의 함유는 동일한 인력(attraction)을 제공한다. 도 6에서 볼 수 있는 것과 같이, CS 및 10.5GAH-CS 처리는 증가된 압축 강도를 가진다. CS 처리는 CI 복합체 내에서 고정되지 않고(HA에 결합되지 않음) 그리고 따라서, 작은 압축 변형 후, CS 및 이것이 끌어당긴 물은 복합체로부터 주변 유체로 확산된다. 복합체로부터 CS 및 물의 확산은 복합체의 압축 강도를 감소시키고, 이는 콜라겐 골격 대조군의 것과 닮은 겔의 압축 프로파일이 생성되는 원인이 된다. 대조적으로, 10.5GAH-CS는 짜여진(interwoven) HA에 결합된다. 따라서, 모방체가 HA에 결합을 정복하기 위하여 더 높은 압축 스트레스가 요구되며, 복합체로부터 CS 및 끌어당겨진 물의 확산 원인이 된다.
둘째로, HA 가교(crosslinker)로써 작용하는 어그리칸 모방체의 능력은 HA 및 모방체의 포획 정도를 더 높이는 결과를 낳는다. 효과적으로, HA 가교 성질은 고유한 어그리칸/HA 응집체와 유사한, 콜라겐 복합체내에서 큰 응집체를 만든다. 어그리칸 모방체과 고유한 어그리칸 사이의 주요 차이는 분자의 크기다. 어그리칸 단독의 단백질 골격은 ~220 kDa에 달하지만, 전체적으로 어그리칸 모방체는 겨우 대략 30 kDa에 달한다. 다라서, HA에 결합된 100개 이상의 어그리칸 분자와 함께, 고유한 응집체 복합물은 어그리칸 모방체가 생산하는 것보다 훨씬 더 큰 응집체를 만든다. 그러나, 어그리칸 모방체는 HA 쇄들 사이에 가교(crosslinker)로 작용함으로써, 어그리칸 모방체는 고유한 응집체의 주요 특징들, 방대함, 음-전하를 띈 구조를 또한 나타낼 수 있는 이의 자체의 응집체 형태를 만들 수 있다. 어그리칸 모방체가 HA 가교(crosslinker)로의 역할은 상기에서 설명된 CI 겔에서 유동 테스트를 통하여 전단 부하(shear load)를 제공하여 추가 조사되었다. 이들 실험 결과는 도 7에서 볼 수 있다.
10.5GAH-CS의 함유는 형성된 겔의 저장 모듈을 유의미적으로 (α=0.05) 증가시켰다. HA에 모방체의 결합에 의해 생성된 네트워크는 CI 매트릭스의 기존 견고함을 보충시켰고, 이에 의해 전단 부하에 의해 제공된 에너지의 탄성 흡수를 증가시켰다. 이 연구는 10.5GAH-CS의 가교 능력 및 대체 응집체 형성의 창조를 증명하기 때문에 중요하다.
실시예 5
히알루론산 퇴화의 합성 펩티도글리칸 보호
HA 용액의 역학 점성 값은 AR-G2를 이용하여 측정되었다. 고분자량 HA 용액은 긴 쇄 길이로 인하여 방대한 쇄 얽힘으로 인하여 큰 점성을 가진다. 히알루노니다제 (유형 II, Sheep Testes, Sigma)는 HA 쇄를 절단하여 얽힘이 적은 더 짧은 쇄를 만든다. 더 짧은 HA 쇄들은 측정가능한 더 낮은 점성을 보유할 것이다. HA 용액은 100 units/mL 히알루노니다제와 함께 항온처리되었다. 역학 점성은 최초로 그리고 2 및 4-시간 시점에서 일정한 각 진동수(angular frequency)와 진동(oscillatory) 스트레스와 함께 타임 스윕을 이용하여 측정되었다. 시료 (0.5 wt% HA)는 HA, HA+CS, 그리고 HA+10.5GAH-CS로 구성된다. 처리 값은 HA 몰 비율에 75:1 처리에서 추가되었다. 각 측정에 대한 퇴화율은 측정된 점성에서 최초 점성의 차이를 최초 점성으로 나누어 산출되었다.
Pratta et al. 및 Little et al의 작업에서 연골 성분 퇴화를 예방하는데 있어서 어그리칸의 중요성을 보여주었다. 골관절염에서 연골 매트릭스의 파괴는 어그리칸 프로테오글리칸의 절단으로 시작된다. 프로테오글리칸의 GAG-풍부한 영역의 제거는 남아있는 성분들, CII 및 HA를 분해 효소들에게 노출시킨다. 퇴화를 방지하는데 어그리칸의 중요성의 인식과 함께, HA 퇴화를 예방하는데 어그리칸-모방체의 능력을 측정하는 연구가 실행되었다.
HA 용액의 점성은 HA 쇄들의 크기에 의존적이다. 얽힘(entanglement)으로 인하여, 더 큰 HA 쇄들은 더 높은 점성을 만들 것이다. 히알루노니다제에 노출되는 경우, HA 쇄들은 더 작은 단위로 절단된다. 따라서, HA의 크기 및 HA 얽힘의 양이 감소된다. 이러한 감소는 측정된 점성에서 유사한 감소를 촉발한다. 히알루노니다제 존재하에서 HA 용액 점성의 변화율은 HA가 겪는 퇴화의 양에 주요 정보를 제공할 것이다. 도 8은 HA 대조군의 퇴화 비율 대(versus) 연합된 처리를 나타낸다. 나타낸 것과 같이, AGG 모방체, GAH는 HA의 퇴화 속도를 유의미적으로 감소시키는데, 이는 ECM 성분들의 보호에서 고유한 AGG와 유사하게 행동한다는 것을 나타낸다.
히알루노니다제 없는(TES 완충액은 히알루노니다제 용적을 대체한다) 각 처리의 점성을 처음 측정하였고, 퇴화 산출 비율의 기선으로 삼았다. 0 hr 시점은 히알루노니다제의 추가, 용액의 혼합, 유량계로 피펫팅, 그리고 기계의 평형 작업 시작과 관련된다. 따라서, 0 hr 시점은 히알루노니다제를 추가한 후 대략 2분에 일어난다. 고 농도의 히알루노니다제(25 units/mL)를 이용하여 최악의 가능한 전개를 모방하였다. 추가적으로, HA 분자는 콜라겐 네트워크로 단단하게 짜여지기 보다는 용액에 분산되었다. 도 8에서 볼 수 있는 것과 같이, HA 대조군과 HA+CS 처리는 모두 0 hr 시점에서 HA 용액의 거의 완전환 퇴화를 가졌다. 대조적으로, 10.5GAH-CS의 추가는 HA 퇴화 양을 유의미적으로(α=0.05) 감소시켰다. 사실, 0.5GAH-CS의 존재는 기선 값 이상으로 점성을 증가시켰다. 히알루노니다제의 추가는 과량의 HA중 일부를 절단하는 것으로 본다. 이것은 10.5GAH-CS가 남아있는 고유의 쇄들을 더 잘 가교시키게 함으로써, 더 큰 점성을 가진 더 조밀한 겔을 만들게 된다.
2 hr 시점에서, HA 대조군 및 HA+CS는 90% 이상 퇴화율로 완벽하게 분해되지만, 10.5GAH-CS를 가진 HA 용액은 유의미적으로 (α=0.05) 더 낮은 퇴화비율을 가졌다. 끝으로, 4 hr 시점에서, 모든 처리는 분해되었고, 이들의 퇴화 비율은 모두 90% 이상이었다. 3가지 시점 가운데, 10.5GAH-CS는 HA 퇴화를 완벽하게 차단하지는 못하였지만, HA 대조군 및 HA+CS의 퇴화와 비교하였을 때 퇴화 속도를 급진적으로 감소시켰다. 감소된 속도는 10.5GAH-CS가 HA 쇄들의 퇴화를 방지한다는 것을 설명한다. 이러한 방지는 HA 쇄에서 히알루노니다제 절단점의 경쟁적 저해를 통하여 이루어진 것으로 본다. 모방체가 HA 쇄에 비-공유 결합과 함께 HA 쇄들의 점진적 퇴화 속도는 이러한 믿음을 실증하는 것으로 보인다. 추가적으로, 10.5GAH-CS 용액의 퇴화 속도는 인위적으로 높아진 것으로 보인다. HA 용액 안에 모방체의 항온처리시에, HA+10.5GAH-CS 응집체가 형성되었다. 그러나, 이들 응집체는 용액 용적을 통하여 균일하게 분산되지 않았다. 따라서, 이 용액은 측적이 이루어지기 앞서 다른 시료들과 유사하게 혼합되었다. 용액의 혼합은 응집체를 분리시키고, 10.5GAH-CS를 몰아내고, 히알루노니다제 절단 점에 노출된다. 4 hr 시점 이후에도, 필경 완전한 퇴화가 발생될 때, HA+10.5GAH-CS의 실질적인 응집이 여전히 발생되었다. 연골의 ECM과 유사한 조밀한 매트릭스에서, 10.5GAH-CS는 퇴화 속도를 감소시킬 뿐만 아니라, HA 퇴화를 억제시킬 수 없을 것이라는 것이 가능하다.
실시예 6
동결주사 전자 현미경(CryoScanning Electron Microscopy (SEM))
탁도 측정의 경우에 설명된 것과 같이, ECM-기반 구조체는 37℃에서 하룻밤 동안 SEM 플레이트상에서 형성되었다. SEM 플레이트는 홀더에 고정되었고, 액체 질소 슬러시로 집어넣었다. Gatan Alto 2500 프레-챔버(pre-chamber)로 이동될 때 시료에서 진공을 빼내었다. 이 쳄버내에서, -170℃로 냉각되었고, 냉각된 메스를 이용하여 시료상에 프리 브레이크(free break) 표면을 만들었다. 이 시료는 15분 동안 -85℃에서 승화되도록 한 후, 120초간 백금으로 증착-코팅(sputter-coating)되었다. 증착-코팅 후, 시료를 현미경으로 이동시키고, -130℃에서 영상을 촬영하였다.
도 9에 나타낸 것과 같이, 대표 영상은 10,000x 확대에서 얻었다. 패널 A는 CI 대조군을 보여주는데, 그리고 주요 미소섬유 사이에 방대한 가교와 상대적으로 작은 구멍 크기를 특징으로 한다. 구멍 크기. 패널 B는 CI+HA+CS를 보여주는데, 방대한 가교를 보유하지만, 큰 HA 쇄들의 존재로 인하여 더 큰 구멍 크기를 가진다. 패널 C는 CI+HA+10.5GAH-CS를 보여주며, 매우 큰 구멍 크기에 추가로, 눈에 띄는 더 작은 수준의 가교를 설명한다. AGG 모방체는 HA에 결합할 수 있어, CI 가교를 방해하는 상대적으로 큰, 부담스런 복합체를 만들 수 있다.
대표 영상에서 정성(qualified)할 수 있듯이, HA+CS 추가는 콜라겐 미소섬유 직경 변화에 효과를 주지 않았지만, HA+CS 시료는 더 큰 대표적인 빈 공간(void space)을 가졌다. 대조군 집단들과 비교하여, HA와 AGG 모방체의 추가는 작은 미소섬유 직경의 제한된 숫자로 인하여, 콜라겐 미소섬유 직경의 변화가 더 작아지게 되었고, 시료의 빈 공간이 전체적으로 증가되었다. HA 분자에 AGG 모방체의 결합으로 콜라겐 골격 안에 포획된 응집 복합체를 만들었으며, 공간 방해로 인하여 더 큰 미소섬유 사이에 더 작은 미소검유의 형성이 배제되었다.
실시예 7
콜라겐 보호
콜라겐 단독, 콜라겐+HA+CS, 또는 콜라겐+HA+10.5GAH-CS를 포함하는 ECM-기반 구조체는 이미 설명된 것과 같이 8-웰 쳄버 슬라이드에서 만들어졌다. 최종 시료 용적은 0.8 mg의 콜라겐 유형 I을 포함하는 200 μL이었다. 제조업자의 지시에서 설명된 프로토콜에 따라 0.133 mg/mL의 농도에서 매트릭스 메탈로프로테아제-I (MMP-I, R&D Systems, Minneapolis, MN)가 활성화되었다. 간단하게 설명하자면, 제조업자의 완충액 (50 mM Tris, 10 mM CaCl2, 150 mM NaCl, 0.05% Brij-35, pH 7.5)에 이미 용해된 MMP-1은 효소를 활성화시키기 위하여, 2시간 동안 37℃에서 동량의 25 mM APMA (Sigma)와 복합되었다. 활성화될 때, MMP-1 용액은 물에 2배 희석시키고, 시료에 100 μL 상청액으로 추가되었다. 시료는 부드럽게 교반시키면서 37℃에서 항온처리되었다. 최초 효소 용액을 추가한 후 25시간 뒤. 상청액을 제거하고, 새로운 효소 배치(batch)로 대체되었다. 효소와 총 50 hr의 항온처리 후, 남아있는 겔은 챔버 슬라이드로부터 제거하고, 탈이온수로 세척하여 임의의 효소 용액 또는 퇴화 산물을 제거하였고, 그리고 12 M HCl에 재용해시켰다. 시료는 최종 농도 6 M HCl에 도달하도록 물에서 희석시키고, 그리고 110℃에서 하룻밤 동안 가수분해되었다. 가수분해 이후, 하이드록시프롤린 (hyp)의 양은 Reddy, et al. (Clin Biochem, 1996, 29: 225-9)에 의해 개발된 프로토콜에 따라 분석되었다. 간략하게 설명하자면, 가수분해된 시료는 실온에서 25분 동안 Cholramine T 용액 (0.56 M)과 함께 항온처리되고, 그 다음 Elrich 시약을 추가하고, 후속적으로 65℃에서 20분간 클로로포어(chlorophore) 발달시켰다. 클로로포어 발달 후, 시료는 550nm 파장에서 분광광도계에서 판독되었다. 흡수도 판독값은 공지 농도의 콜라겐으로부터 얻은 것과 비교하여 각 시료에 남아있는 콜라겐의 양을 측정하였다.
각 모사 시료는 0.8 mg의 CI로 구축되었고, 퇴화 후, 남아있는 CI 양은 Reddy et al에 의해 개발된 프로토콜에 의해 측정되었고. 그리고 CI 표준 세트에 의해 CI 양으로 전환되었다. 퇴화 비율은 남아있는 CI를 최초 CI로부터 빼고, 최초 CI로 나누고, 그리고 100을 곱하여 결정되었다. 3가지 처리의 퇴화 비율은 도 10에 나타낸다. 모든 처리는 서로 유의미적으로 상이하였다(p<0.05). 구체적으로, AGG 모방체 시료 (CI+HA+10.5GAH-CS = 41.0%)의 퇴화 비율은 다른 두 처리(CI=64.5% 그리고 CI+HA+CS=74.7%)보다 유의미적으로 적었다(p<0.05). AGG 모방체의 존재는 CI 퇴화를 유의미적으로 감소시켰다. AGG 모방체의 존재는 분해 효소의 절단 부위에 방해로 작용할 수 있다. 콜라겐 골격 안에 단단하게 포획된 HA를 가진 큰 응집체를 만듦으로써, AGG 모방체는 콜라겐의 기부 공간을 차지할 수 있고, 퇴화 위치에 효소의 접근을 방지할 수 있다.
실시예 8
연골 매트릭스를 통한 펩티도글리칸의 확산
연골 외식편은 3월령된 소의 무릎 관절의 부하 관련 부위로부터 획득하였다. 고유한 어그리칸은 수확된 연골 외식편으로부터 제거되었으며, 유형 II 콜라겐 및 잔류 GAG로 주로 구성된 매트릭스를 남겨두었다. 이는 37℃에서 3시간 동안 HBSS에서 0.5% (w/v) 트립신으로 외식편을 처리함으로써 이루어졌다(도 13). 트립신 처리 이후, 외식편은 HBSS에서 3회 세척되었고, 잔류 트립신을 비활성화시키기 위하여 20% FBS와 함께 항온처리되었다. 펩티도글리칸은 10 μM 농도로 증류수에 용해되었고, 실온에서 한 시간 동안 매 10분마다 표면 상에 10 μL의 용액을 위치시킴으로써 연골 외식편의 관절 표면을 통하여 확산되었다(도 14). 정상 연골 및 어그리칸 고갈된 연골은 각각 양성 및 음성 대조군으로써, 1X PBS로 처리되었다. 확산 이후, 외식편은 1X PBS로 3회 세척되었으며, 추가 테스트를 할 때까지 -20℃에 보관되었다. 펩티도글리칸의 확산은 조직의 정중시상 단편을 스트렙타아비딘-양고추냉이 과산화효소 착색(stain)으로 착색시킴으로써 확인되었다. 스트렙타아비딘 착색은 바이오틴 라벨된 분자에 결합하고, 갈색으로 표시된다(도 15 및 16).
실시예 9
벌크(Bulk) 압축 테스트
0.01-50 N (TA Instruments) 범위에서 표준력(normal forces)을 탐지할 수 있는 힘 변환기와 함께, AR G2 유량계에서 대체-조절된 제한되지 않은 압축이 실행되었다. 외식편은 소수성 프린트된 슬라이드(Tekdon)의 하부에 접착되었고, 1X PBS 수조(bath)에서 커버되었다. 20mm 직경의 스테인레스 강 플레이트 배열 머리는 최초 접촉이 일어날 때 까지 낮춰졌다. 외식편 높이는 디지털 측미기(micrometer)(Duratool)를 이용하여 측정되었다. 0-30% 명목상(nominal) 긴장으로부터 압축 부하(5% 간격)는 5 sec의 램프 지속 기간(가령 1.0 %/sec의 긴장 속도)과 30sec의 홀딩 시간이 관련된 단계적 부하를 통하여 외식편에 제공되었다. 압축 강성 값은 선형 피트 모델에 근거하여, 각 긴장 값에 대해 평형 스트레스 값의 기울기를 이용하여 획득되었고, 각 유지 영역동안 산출되었다. 벌크 압축용으로 테스트된 골격은 다음을 포함하였다: 1) 정상 연골, 2) 어그리칸 고갈된 연골 (AD), 그리고 3) AD+mAGC (도 17). HA 결합 펩티도글리칸 (mAGC)의 추가는 콜라겐 유형 II 결합 펩티도글리칸 (mAG(II)C)과 비교하였을 때 연골 외식편의 강성을 더 높은 정도로 유의미적으로 복귀시켰다.
실시예 10
동물 모델
Sprague-Dawley 쥐(250~300g)가 수술에 이용되었다. 슬개골 힘줄, 전 후 십자 인대 그리고 중앙, 측면 부행(collateral) 인대가 절단되었다. 중앙 및 측면 반월판(meniscuses)은 전부 수술적으로 치료되었다(menisectomized). 무릎 관절 캡슐(capsule)은 흡수되는 봉합사로 복구되었고, 피부는 4-0 단사 나일론으로 봉합하였다. 4주차에서 시작하여, 10 μl의 1 μm mAGC는 매주 투여되었다.
염증의 정도는 수술 후(도 19) 4, 6, 8주에 펩티도글리칸과 함께 또는 펩티도글리칸 없이 처리된 Sprague-Dawley 쥐에서 MMP-13 프로브로 나타내었다(도 18). Sprague-Dawley 쥐의 무릎 관절의 X-선 영상에서 유도 후 6주와 8주차 손상된 무릎(도 20, 각각 패널 A 및 D), 펩티도글리칸 처리된 손상된 무릎(도 20, 각각 패널 B 및 E), 그리고 골관절염 유도 수술후 정상 무릎 (도 20, 패널 C)를 보여준다. Sprague-Dawley 쥐의 MicroCT는 OA 유도 수술 후 6주 및 8주에 새로운 연골의 재-성장을 나타내었다. OA 유도후 6주와 8주차에 손상된 무릎(도 21, 각각 패널 A 및 D), 펩티도글리칸 처리이후 손상된 무릎(도 21, 각각 패널 B 및 E), 그리고 정상 무릎 (도 21, 패널 C)을 나타낸다.
실시예 11
시약
펩티드 GAHWQFNALTVRGGGC (GAH)는 Genscript (Piscataway, NJ)로부터 구입되었다. N-[-말레이미도프로피오닌산] 하이드라지드, 트리플로오르아세트산 염 (BMPH)은 Pierce (Rockford, IL)로부터 구입되었다. 쥐 꼬리 유형 I 콜라겐은 BD Biosciences (Bedford, MA)로부터 구입되었다. 인간 재조합 인터루킨-1β은 Peprotech (Rocky Hill, NJ)로부터 구입되었다. 모든 기타 공급물은 다른 언급이 없는 한, VWR (West Chester, PA) 또는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)로부터 구입되었다.
실시예 12
콜라겐 골격 합성
콜라겐 골격은 pH 7.6에서 TES 완충액 (60 mM TES, 20 mM Na2PO4, 0.56 M NaCl)에서 준비되었다. 기계적 테스트 및 시험관내 염증 모델 연구를 위한 골격 조성물은 이들의 각 단락에서 설명되어 있다. 모든 용액은 37℃에서 미소섬유형성이 개시될 때까지 얼음위에서 유지되었다. 정렬된 콜라겐 골격은 1시간 동안 37℃에서 9.4 Tesla 자석(Chemagnetics CMX400)의 등중심에 콜라겐 용액을 위치시킴으로써 생성되었지만, 정렬안된 겔은 자석 노출 없이 유사하게 준비되었다. 콜라겐 용액을 내포하는 슬라이드는 자장과 나란하게 배치되어, 슬라이드의 하부에 수직 방향으로 콜라겐 섬유들이 지향된다. 그 다음 겔은 기화를 방지하기 위하여 습도-조절된 챔버에서 37℃, 24시간 동안 유지되었다.
실시예 13
유동(Rheological) 기계적 테스트
전단(Shear) 및 압축 테스트는 20 mm 직경 스테인레스 강 평행 플레이트 배열 머리를 이용하여 스트레스-조절된 AR G2 유량계 (TA Instruments)에서 실행되었다. 콜라겐 골격은 20 mm 직경 소수성 프린트된 슬라이드 (Tekdon)에서 준비되었다. 전단 테스트의 경우, 배열 머리는 950 μm의 갭 높이에서 접촉이 될 때까지 낮춰졌다. 예비 주파수 및 스트레스 스윕은 선형 및 스트레스-독립적 저장 모듈 범위를 결정하기 위하여 실행되었다. 그 다음 주파수 스윕은 0.1 내지 2 Hz의 주파수 범위에 걸쳐 0.2Pa의 진동 스트레스로 모든 겔에서 실행되었다. 압축 테스트의 경우, 배열 머리는 1000 μm의 갭 높이에서 접촉이 될 때까지 낮춰졌다. 0-30% 명목상(nominal) 긴장으로부터 압축 부하(5% 간격)는 5 sec의 램프 지속 기간(가령 1.0 %/sec의 긴장 속도)과 30sec의 홀딩 시간이 관련된 단계적 부하를 통하여 외식편에 제공되었다. 압축 강성 값은 선형 피트 모델에 근거하여, 각 긴장 값에 대해 평형 스트레스 값의 기울기를 이용하여 획득되었고, 각 유지 영역동안 산출되었다. 기계적 테스트용 콜라겐 골격 조성물은 다음과 같다: 1) 정렬안된 콜라겐, 2) 정렬된 콜라겐, 3) 정렬안된 콜라겐+mAGC 그리고 4) 정렬된 콜라겐+mAGC.
벌크(Bulk) 기계적 분석: 어그리칸 모방체, mAGC는 섬유 배열과 무관하게 골격의 벌크 기계적 성질들을 강화시켰다(도 22). 전단(shear) 테스트의 경우, 정렬안된 그리고 정렬된 콜라겐 겔들의 경우, 0.5 Hz에서 저장 모듈값은 각각 104.1±3.6 Pa 그리고 49.9±5.4 Pa이었다. mAGC를 콜라겐 골격에 추가하면 정렬안된 그리고 정렬된 겔의 저장 모듈이 각각 113.9±4.6 Pa 그리고 76.6±3.6 Pa로 상당히 증가됨을 보여주었다(p<0.001). 정렬안된 겔들은 정렬된 겔과 비교하였을 때 더 높은 저장 모듈을 보여주었다 (p<0.0001). 압축 테스트의 경우, 정렬된 골격의 압축 강성(2478±250 Pa)은 정렬안된 골격 (3564±315 Pa)보다 더 낮았다(p<0.001). mAGC를 이들 골격계에 추가하면 정렬된 그리고 정렬안된 골격의 압축 강성이 각각 4626±385 Pa 그리고 5747±306 Pa로 증가되었다(p<0.0001).
실시예 14
시험관 염증 모델
연골세포에 접종된 콜라겐 골격은 IL-1β로 자극되고, 퇴화 산물에 대해 평가되었다.
연골세포 단리: 주요 연골세포는 도살장에서 도축 24시간 이내에 3월령의 소의 무릎 관절로부터 수거되었다(Dutch Valley Veal). 150-200 μm 두께의 연골 박편은 측면 대퇴골 관절구로부터 깍아내었고, 무혈청 DMEM/F-12 배지(50 μg/mL 아스코르브산 2-인산염, 100 μg/mL 피루베이트 나트륨, 0.1% 소의 혈청 알부민, 100 units/mL 페니실린, 100μg/mL 스트렙토마이신 및 25 mM HEPES)에서 3회 세척되고, 그 다음 6시간 동안 37℃에서 3% 태아 소의 혈청(FBS) 그리고 0.2% 콜라게나제-P (Roche Pharmaceuticals)에 의해 절단되었다. 방출된 연골세포는 70 μm 세포 스트레이너(strainer)를 통하여 여과되었고, 10% FBS가 보충된 상기 열거된 배지에서 각 5분씩 1000rpm에서 3회 원심분리되었다. 이 세포 펠렛은 10% FBS 보충된 배지에서 재현탁되었고, 합류될 때까지 5% CO2 가습 배양기에서 37℃에서 10cm 배양접시에서 10,000 세포/mL로 도말되었다.
골격 구성: 합류에 도달될 때, 세포는 트립신처리되고 그리고 콜라겐 골격내에서 10,000개 세포/mL로 포획되었고(표 3) 그리고 처리전 3일 동안 평형이 되도록 두었다.
Figure 112013117217243-pct00016
염증 모델: 구조체는 5% FBS 및 항생제(100 units/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신)이 보충된 화학적으로-특정된 배지에서 20 ng/mL IL-1β과 함께 또는 없이 항온처리되었다. 배양 배지는 2일마다 교체되었다. 제거된 배지 추출물은 추가 테스트가 있을 때까지 - 80℃에서 보관되었다.
퇴화 분석: GAG 퇴화는 디메틸메틸렌 블루(DMMB) 염료 분석을 이용하여 세포 배양 배지에 방출된 CS를 측정하여 모니터되었고 그리고 콘드로이틴-6-술페이트 표준 곡선으로 산출되었다. 유사하게, 세포 배양 배지에서 유형 I 콜라겐 퇴화는 제조업자가 특정한 프로토콜 (Bio-Color)을 이용하여, Sircol 콜라겐 분석에 의해 모니터되었다. GAG 및 콜라겐 퇴화는 8일간 배양 기간동안 누적 방출로써 기록되었다.
단백질분해성 퇴화 분석: 세포 배양 배지로 방출된 CS 및 콜라겐의 양은 mAGC를 함유한 골격인 경우 유의미적으로 감소되었다(도 11, 12, 23 그리고 24) (pCS<0.001 그리고 p콜라겐<0.02, 각각). 정렬된 콜라겐 겔은 정렬안된 콜라겐 섬유들과 비교하여 배지 안으로 통계학적으로 더 많은 CS 및 콜라겐 방출을 보였다 (p<0.001).
본 명세서에서 기술된 것과 같이, 히알루론-결합 합성 펩티도글리칸은 단백질분해성 절단으로부터 골격내 HA 및 하부 콜라겐 섬유들을 보호할 수 있다. 히알루론-결합 합성 펩티도글리칸의 합성은 CS의 연골보호성 장점을 이용하였다. CS는 매트릭스 메탈로프로테아제 생산을 하향-조절하는 것으로 나타났다. 본 명세서에서 설명된 우리의 합성 펩티도글리칸 기획은 CS 쇄들이 HA에 부착되도록 허용하여, 이들 두 분자 모두의 퇴화를 방지한다. 단백질분해성 효소가 풍부한 환경에 이 합성 펩티도글리칸을 배치함으로써, ECM 성분들의 과도한 상실을 방지하는 능력이 설명되었다.
실시예 15
실시간 PCR
다음의 세포 배양 연구에서, 구조체는 1주 미만 동안 4℃에서 RNAlater 용액 (Ambion)에 보관되었다. 총 mRNA는 제조업자의 프로토콜에 따라 Nucleospin RNA II (Clontech)을 이용하여 추출되었다. 모든 시료로부터 추출된 mRNA는 Nanodrop 2000 분광 측정기(Thermo Scientific)를 이용하여 정량화되었고, High Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit (Applied Biosystems)를 이용하여 cDNA로 역전사되었다. 실시간 PCR은 다음의 프라이머와 함께 Taqman Gene 발현 분석 (Applied Biosystems)으로 실시되었다: GAPDH (Bt03210913_g1), 어그리칸 (Bt03212186_m1) 그리고 콜라겐 유형 II (Bt03251861_m1). 관심 대상의 두 유전자와 내생성 유전자에 대해 20 μL 반응물당 60 ng의 cDNA 주형이 준비되었다. 실시간 PCR 분석은 Taqman PCR Master Mix 및 7500 실시간 PCR System (Applied Biosystems)을 이용하여 실행되었다. 보고된 데이터는 GAPDH 유전자 발현에 대해 표준화되었다.
mRNA 발현 분석: 콜라겐 배열, 어그리칸 모방체의 존재 그리고 IL-1β로 자극은 어그리칸 (p배열 <0.001, p펩티도글리칸 <0.02 그리고 pIL-1β<0.001) 및 콜라겐 유형 II 발현 (p배열 <0.01, p펩티도글리칸 <0.001 그리고 pIL-1β<0.015)에 유의미적으로 영향을 주었다. mAGC의 존재는 골격으로부터 과도한 CS 상실을 제한시켰고, 이는 더 낮은 어그리칸 발현을 야기하였다 (p<0.02) (도 25). mAGC의 존재는 또한 콜라겐 퇴화를 제한시켰다. 그러나, 콜라겐 유형 II 발현은 퇴화 동안 상실된 콜라겐 정도에 의존적이었다(도 25). 정렬안된 골격에서, 콜라겐 유형 II 발현의 수준은 mAGC 없이 준비된 골격에서 더 높았고, 반면, 정렬된 콜라겐 골격에서, 콜라겐 유형 II의 수준은 mAGC로 준비된 골격에서 더 높았다.(p<0.05).
실시예 16
통계학적 분석
각 실험은 2회 반복되었고, 각 데이터 세트는 최소한 n=3이다. 기계적 테스트 데이터에 대한 통계학적 유의성은 인자로써 펩티드의 배열 및 추가와 함께 이원(two-way) ANOVA 분석되었다. 세포 배양 데이터는 인자로써, 펩티도글리칸의 배열 및 추가, 그리고 IL-1β로 처리와 함께 3원(three-way) ANOVA로 분석되었다. post-hoc Tukey 쌍 비교(α= 0.05)는 각 시스템에서 어그리칸 모방체와 함께, 그리고 없이 준비된 골격을 직접 비교하는데 이용되었다.
SEQUENCE LISTING <110> PURDUE RESEARCH FOUNDATION <120> HYALURONIC ACID-BINDING SYNTHETIC PEPTIDOGLYCANS, PREPARATION, AND METHODS OF USE <130> 3220-227676 <140> <141> <150> PCT/US2012/039404 <151> 2012-05-24 <150> 61/550,621 <151> 2011-10-24 <150> 61/489,602 <151> 2011-05-24 <160> 59 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Any basic amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(8) <223> Any non-acidic amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Any non-acidic amino acid or absent <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Any basic amino acid <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 1 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 2 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 2 Gly Ala 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Claims (24)

  1. 콘드로이틴 술페이트에 접합된 합성 펩티드를 포함하는 합성 펩티도글리칸으로서, 이때 합성 펩티드는 아미노산 서열 GAHWQFNALTVRGG의 아미노산 1-12 (GAHWQFNALTVR)을 포함하는 히알루론산-결합 서열을 포함하는, 합성 펩티도글리칸.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 청구항 1에 있어서, 이 합성 펩티도글리칸은 어그리카나제에 저항성인, 합성 펩티도글리칸.
  6. 청구항 1에 있어서, 이 합성 펩티도글리칸의 펩티드 성분은 이 펩티드의 C-말단에 부착된 글리신-시스테인을 보유하는, 합성 펩티도글리칸.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 펩티드는 2 내지 20개 탄소 원자를 포함하는 링커에 의해 콘드로이틴 술페이트에 결합되는, 합성 펩티도글리칸.
  8. 청구항 1, 5 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드는 아미노산을 포함하는 링커에 의해 콘드로이틴 술페이트에 결합되는, 합성 펩티도글리칸.
  9. 청구항 1, 5 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드는 20 내지 500 달톤의 분자량을 가지는 링커에 의해 콘드로이틴 술페이트에 결합되는, 합성 펩티도글리칸.
  10. 청구항 1, 5 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 콘드로이틴 술페이트에 접합되는 합성 펩티드의 수는 3 내지 11인, 합성 펩티도글리칸.
  11. 중합된 콜라겐, 히알루론산, 그리고 청구항 1, 5 내지 7 중 어느 한 항의 합성 펩티도글리칸을 포함하는 공작된 콜라겐 매트릭스.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 매트릭스는 세포의 외생성 집단을 더 포함하는, 공작된 콜라겐 매트릭스.
  13. 청구항 1에 있어서, 상기 합성 펩티도글리칸은 매트릭스 메탈로 프로테아제에 저항성인 합성 펩티도글리칸.
  14. 청구항 11에 있어서, 상기 합성 펩티도글리칸은 매트릭스 메탈로 프로테아제에 저항성인, 공작된 콜라겐 매트릭스.
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