CN107771085A - 生物缀合物及其用途 - Google Patents

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格伦·普雷斯特维奇
约翰·埃里克·帕代里
茱莉娅·陈
拉什·劳埃德·巴特利特二世
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Abstract

本文提供了包含聚糖和与其结合的1至约50个肽的生物缀合物，其中所述肽包含胶原结合单元、透明质酸结合单元、ICAM结合单元、VCAM结合单元和/或选择素结合单元。本文还提供了包含该生物缀合物的组合物及其用途。

Description

生物缀合物及其用途
相关申请的交叉引用
本申请根据35 U.S.C. 119(e)要求2015年4月17日提交的美国临时申请序列号62/149,428、2015年10月13日提交的美国临时申请序列号62/241,057、以及2015年10月21日提交的美国临时申请序列号62/244,665的利益，其每个的全部内容都通过引用合并入本文中。
技术领域
本文提供的是包含聚糖和结合至该聚糖的1至约50个肽的生物缀合物（bioconjugate），其中所述肽包含胶原结合单元、透明质酸结合单元、ICAM结合单元、VCAM结合单元、和/或选择素结合单元，本文还提供了包含上述生物缀合物的组合物、及其用途。
背景技术
在组织中，细胞被包含各种大分子的细胞外基质（ECM）包围，所述大分子例如是生物缀合物、胶原、透明质酸、层粘连蛋白、纤连蛋白等。在哺乳动物中，生物缀合物是细胞外基质的主要成分，在此它们与其他生物缀合物、透明质酸、以及纤维基质蛋白质（例如胶原）形成大的复合物。随着哺乳动物年龄增长和在某些疾病状态中，身体的某些部位（例如滑膜关节、玻璃体液、脊椎盘、皮肤等）中的细胞外基质会降解，引起不良的症状，例如各种形式的关节炎、视力丧失等。另外，诸如血管损伤、角膜损伤和皮肤伤口的一些组织损伤导致细胞外基质和/或其组分（包括胶原和透明质酸）的暴露。
以前，生物缀合物通过氧化化学而合成，其切割在聚糖骨架之内的一个或多个糖环从而提供用来缀合肽的醛官能团。
概述
本发明提供了生物缀合物，其包含聚糖和1至50个肽，所述肽包含胶原结合单元、透明质酸结合单元、选择素、ICAM和/或VCAM受体结合单元，其通过-C(O)-NH-NH-C(O)-（即酰肼-羰基）键共价地结合至所述聚糖。本文所述的生物缀合物与本领域已知的生物缀合物在结构上的不同之处在于，所述肽通过酰肼-羰基键而结合至所述聚糖，其中酰肼-羰基的羰基基团是存在于聚糖上的环外羰基基团。在本文公开的生物缀合物中，酰肼-羰基的羰基基团侧接（pendant）在聚糖内的糖环上，例如但不限于D-葡糖醛酸盐或L-艾杜糖醛酸盐。预期的是，本文公开的生物缀合物所显示的有益效果（例如提高的结合亲和力）至少部分是由于聚糖不含有氧化切割的糖环。另一个预期的有益效果是，不含有氧化切割的糖环的生物缀合物的稳定性提高。相应地，在一些实施方案中，所述生物缀合物包括聚糖，该聚糖是非氧化的聚糖和/或其中的肽不通过由切割的糖产生的官能团缀合的聚糖。在一些实施方案中，所述聚糖是化学修饰的聚糖衍生物，例如部分地N-脱硫酸化的聚糖衍生物、部分地O-脱硫酸化的聚糖衍生物、部分地O-羧甲基化的聚糖衍生物、或其任意组合。
在一些实施方案中，所述酰肼-羰基键是在肽上的末端酰肼基团和聚糖上的羰基基团之间。在其他实施方案中，所述酰肼-羰基键是在肽上的末端羰基基团和聚糖上的酰肼基团之间。
在一个实施方案中，本发明涉及一种生物缀合物，其包括聚糖和1至50个肽，其中所述肽包括胶原结合单元和/或透明质酸结合单元并且通过酰肼-羰基键被结合至所述聚糖。
在一个实施方案中，本发明涉及一种生物缀合物，其包括聚糖和包括胶原结合单元的1至50个肽和包括透明质酸结合单元的1至50个肽，并且其中所述肽通过酰肼-羰基键被结合至所述聚糖。
在一个实施方案中，本发明涉及一种生物缀合物，其包括聚糖和1至50个肽，其中所述肽包括选择素、ICAM和/或VCAM结合单元并且通过酰肼-羰基键被结合至所述聚糖。
本发明还提供了含有本文所述的生物缀合物的组合物、以及其应用方法。在一个方面，本发明提供了含有本文所述的生物缀合物的组合物，其中结合至聚糖的肽的数量会变化。例如，所述组合物可以包括生物缀合物，其中结合的肽的数量以平均值计算，例如每个聚糖约5至约20个肽。
本文还提供了一种组合物，其包括一个或多个选自以下的生物缀合物：a）一种生物缀合物，其包括聚糖和至少一个含有透明质酸结合单元的肽；b）一种生物缀合物，其包括聚糖和至少一个含有选择素结合单元的肽；c）一种生物缀合物，其包括聚糖和至少一个含有ICAM结合单元的肽；d）一种生物缀合物，其包括聚糖和至少一个含有VCAM结合单元的肽；e）一种生物缀合物，其包括聚糖和至少一个含有胶原结合单元的肽；及其组合。
在一些实施方案中，特别是在含有具有一种以上类型的结合单元的不同的肽的实施方案（例如，生物缀合物包括具有胶原结合单元的肽和具有透明质酸结合单元的肽）中，可以只有一个通过酰肼-羰基键而被结合至聚糖。
本发明还提供了药物组合物，其包括本文所述的生物缀合物或者含有它的组合物以及一种或多种稀释剂或载体（例如盐水）。
可以通过改变聚糖骨架和/或结合至聚糖的肽，调节本文所述的肽功能化的聚合物的生物功能。例如，可以将本文所述的生物缀合物用于治疗和/或预防疾病，例如与血管损伤和/或炎症相关的疾病。
本文所述的生物缀合物和含有它的组合物可以被用来在有需要的患者中治疗和/预防冠状动脉疾病和/或外周动脉疾病。搭桥移植物被用作冠状动脉疾病（coronaryartery disease，CAD）和外周动脉疾病（peripheral artery disease，PAD）中的动脉阻塞的一种治疗形式。在美国每年大约进行500,000例冠状动脉搭桥移植术（CABG）和超过70,000例外周搭桥移植术。最常见的是，通常从隐静脉收获自体血管移植物。如本文所述的生物缀合物可以被用作具有自体静脉移植物的手术搭桥的患有心血管疾病的患者的静脉移植物保存液。
本文还提供了一种在血管损伤或干预之前、期间、和/或之后在患者中治疗血管的方法，其包括向所述血管施用有效量的本文所述的生物缀合物或含有它的组合物。
本文还提供了一种在有需要的患者中治疗在内腔（例如股腘动脉）之内的狭窄或闭塞的方法，其包括在球囊血管成形术之前、期间和/或之后向所述内腔的内壁施加溶液，其中该溶液含有有效量的本文所述的生物缀合物或含有它的组合物。
本文还提供了一种治疗关节炎的方法，其中所述治疗可以包括减少一种或多种与关节炎相关的症状。本领域已知多种症状与关节炎相关，例如但不限于疼痛、僵硬、压痛、炎症、肿胀、发红、发暖和活动性降低。在多种实施方案中，所述关节炎是骨关节炎或类风湿性关节炎。
本文还提供了一种制备含有聚糖和1至50个肽的生物缀合物的方法，所述方法包括：在偶联反应条件下，任选地在活化剂的存在下，使所述聚糖与足够量的肽接触，其中所述肽包括酰肼基团，从而提供所述生物缀合物，其中所述肽包括胶原结合单元、透明质酸结合单元、ICAM结合单元、VCAM结合单元、和/或选择素结合单元，并且通过在所述肽上的末端酰肼基团和在所述聚糖上的羰基基团之间的酰肼-羰基键而被结合至所述聚糖。在一些实施方案中，所述方法包括使所述聚糖与活化剂接触，以提供具有至少一个活化的羧酸部分的活化的聚糖。在其他实施方案中，所述酰肼-羰基键位于所述肽上的末端羰基基团和所述聚糖上的酰肼基团之间。
附图说明
可以通过附图查看本发明的一些方面。本文包括以下附图：
图1A-1D示出了以下的透明质酸结合亲和力：（1A）生物素标记的硫酸软骨素，不含肽（对照）；（1B）生物缀合物，其中GAH肽通过氧化糖环开环化学和BMPH接头被结合至CS；（1C）生物缀合物，其中GAH肽通过酰肼-羰基键被结合至CS；以及（1D）生物缀合物，其中STM肽通过酰肼-羰基键被结合至CS（参见实施例5）。
图2示出了eDS-SILY（本文所述的生物缀合物）对比oxDS-SILY（利用氧化的聚糖合成的生物缀合物）随着时间的稳定性（参见实施例11）。
详细说明
应该理解的是，本发明不被限制至所述特定的实施方案，因为这些实施方案当然可能发生改变。还应该理解的是，本文所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方案，并且并非旨在进行限制，因为本发明的范围将仅仅被附加的权利要求限制。
定义
除非另有定义，否则本文所用的所有技术的和科学的术语都具有如属于本发明的技术领域的普通技术人员通常理解一样的含义。应当注意的是，如在本文和在权利要求中使用的，单数形式“一个”、“一种”、以及“所述”包括复数指代，除非文中另外明确规定。因此，例如，对“一个肽”的引用，包括多个肽。
如本文所用的，以下术语和缩写具有以下含义。
°C 摄氏度
µg 微克
AVF 动静脉瘘
BMPH N-β-马来酰亚胺丙酸酰肼
CS 硫酸软骨素
cps 厘泊
DS 硫酸皮肤素
DCC N,N'-二环己基碳化化二亚胺
DIC N,N'-二异丙基碳化二亚胺
EDC 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺
BMC N-叔丁基-N-甲基碳化二亚胺
BEC N-叔丁基-N-乙基碳化二亚胺
BDDC 1,3-双(2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-基甲基)碳化二亚胺
HFA 六氟丙酮
CDI 羰二咪唑
HOBt 羟基苯并三唑
PyBOP 苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐
HOAt 1-羟基-7-氮杂苯并三唑
TBTU O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸盐
HOSu N-羟基琥珀酰亚胺
IIDQ 2-异丁氧基-1-异丁氧基羰基-1,2-二氢喹啉
EEDQ 乙基-1,2-二氢-2-乙氧基-l-喹啉羧酸酯
ICAM 细胞间粘附分子
VCAM 血管细胞粘附分子
Hep 肝素
HA 透明质酸
DNA 脱氧核糖核酸
EDTA 乙二胺四乙酸
ELISA 酶联免疫吸附测定
FGF 成纤维细胞生长因子
GAH GAHWQFNALTVR (SEQ ID NO: 58)
HEPES 2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸
HLB 亲水/亲油/平衡
ITC 等温滴定热量计
kDa 千道尔顿
g 克
GAG 糖胺聚糖
MES 2-乙磺酸
mg 毫克
ESRD 晚期肾脏疾病
Da 道尔顿
µM 微摩尔
M 摩尔
K d 解离常数
vWF 冯维勒布兰德因子
MMP 基质金属蛋白酶
N 正常
MW 分子量
CVs 柱体积
min 分钟
TMP 磷酸三甲酯
psi 磅每平方英寸
µL 微升
PF-4 血小板因子4
BSA 牛血清白蛋白
nm 纳米
DG 去离子水
PEGDA 聚乙二醇二丙烯酸酯
mL 毫升
MOPS 3-(N-吗啉代)丙磺酸
mV 毫伏
PBS 磷酸盐缓冲盐水
PIPES 哌嗪-N,N′-双(2-乙磺酸)
SILY RRANAALKAGELYKSILY (SEQ ID NO: 1)
SPR 表面等离子体共振
STM STMMSRSHKTRSHHV (SEQ ID NO: 59)
TAPS 3-[[1,3-二羟基- -2-(羟甲基)丙烷-2-基]氨基]丙烷-1-磺酸
TES 2-[[1,3-二羟基-2-(羟甲基)丙烷-2-基]氨基]乙磺酸
Tris 2-氨基-2-羟甲基丙烷-1,3-二醇
w/w 重量/重量
w/v 重量/体积
如本文使用的，术语“包括”旨在表示组合物和方法包括所述的元素但不排除其他元素。“基本上由……组成”当被用来定义组合物和方法时，应该表示排除对于预期用途的组合来说具有任何实质性作用的其他元素。因此，如本文定义的基本上由该元素组成的组合物，将不会排除不实质性地影响本发明的基础性和新颖性特征的其他材料或步骤。“由……组成”应该表示排除多于微量元素的其他成分和实质性方法步骤。通过这些过渡性术语的每一个进行定义的方面都在本发明的范围之内。
术语“约”当被用在数字指定（例如温度、时间、数量和浓度，包括范围）前面时，表示可以(+)或(−) 10%、5%或1%变化的近似值。
如本文使用的，术语“生物缀合物”、“肽聚糖”和“蛋白聚糖”、以及“合成的蛋白聚糖”被可互换地使用，并且是指包含聚糖和共价地键合至该聚糖的一个或多个肽的合成的缀合物。可以合成地制成所述聚糖部分，或者从动物来源获得。所述肽通过酰肼-羰基键（即-C(O)-NH-NH-C(O)-）共价地结合至所述聚糖。在一些实施方案中，所述酰肼-羰基键位于所述肽上的末端酰肼基团和所述聚糖上的羰基基团之间。在其他实施方案中，所述酰肼-羰基键位于所述肽上的末端羰基基团和所述聚糖上的酰肼基团之间。在一些实施方案中，术语生物缀合物包括肽聚糖。
如本文使用的，术语“聚糖”是指具有大量糖苷键连接的单糖的化合物。在一些实施方案中，所述聚糖是糖胺聚糖（GAG），其包含以交替方式与糖醛酸连接的2-氨基糖，并且包括聚合物，例如肝素、硫酸乙酰肝素、软骨素、角蛋白和皮肤素。相应地，可以在本文描述的实施方案中使用的聚糖的非限制性的实例包括藻酸盐、琼脂糖、葡聚糖、硫酸葡聚糖、软骨素、硫酸软骨素（CS）、皮肤素、硫酸皮肤素（DS）、硫酸乙酰肝素、肝素（Hep）、角蛋白、硫酸角质素、和透明质酸（HA），包括其衍生物。在另一个实施方案中，改变所述聚糖的分子量，以适应生物缀合物的效果（参见例如Radek, K. A., et al., Wound Repair Regen., 2009,17: 118-126；以及Taylor, K. R., et al., J. Biol. Chem., 2005, 280:5300-5306）。在一个实施方案中，通过氧化和碱性消除将聚糖降解（参见例如Fransson, L. A., etal., Eur. J. Biochem., 1980, 106 :59-69）以提供具有较低分子量（例如约10 kDa至约50 kDa）的降解聚糖。在一些实施方案中，所述聚糖是未被修饰的。在一些实施方案中，所述聚糖不含有氧化切割的糖环，并且因此不含有并且不会含有醛官能团。在一些实施方案中，所述聚糖被衍生化。
如本文使用的，术语“衍生的聚糖”旨在包括聚糖的衍生物。例如，衍生的聚糖可以包括一个或多个化学衍生物，例如但不限于部分N-脱硫酸衍生物、部分O-脱硫酸衍生物、和/或部分O-羧甲基化衍生物。例如，如本文使用的，术语“肝素”旨在包括肝素及其衍生物，例如但不限于部分N-和/或部分O-脱硫酸肝素衍生物、部分O-羧甲基化肝素衍生物、或其组合。在一些实施方案中，所述肝素是非氧化的肝素（即不含有氧化切割的糖环）并且不含有醛官能团。
如本文使用的，术语“键合”和“共价地键合”可以被可互换地使用，是指一个或多个电子对由两个原子共享。
在一些实施方案中，肽序列通过间隔物键合至聚糖。如本文使用的，术语“间隔物（spacer）”是指生物缀合物的任选部分，其将结合单元或肽连接至酰肼-羰基键。在本文描述的实施方案的任一个中，所述肽中的任何一个或多个可以具有含有一至约五个氨基酸的间隔物序列。应该理解的是，任何氨基酸（天然的或非天然的）都可以被用在间隔物序列中，只要所述间隔物序列不显著地干扰肽的预期的结合。示例性的间隔物包括但不限于：含有一至五个甘氨酸单元（例如G、GG、GGG、GGGG或GGGGG）、任选地含有半胱氨酸（例如GC、GCG、GSGC或GGC）和/或丝氨酸（例如GSG、SGG或GSGSG）、或一至五个精氨酸单元（例如R、RR、RRR等）的短序列。所述间隔物还可以含有非氨基酸部分，例如聚乙二醇（PEG）、6-氨基己酸、琥珀酸、或其组合，并且具有或不具有额外的氨基酸间隔物。在一些实施方案中，本文所述的肽序列进一步包括GSG-NHNH2部分。通常，GSG-NHNH2部分被结合至C末端或N末端。
在一个实施方案中，本发明的生物缀合物直接或间接地结合至胶原。本文使用的术语“结合”旨在包括分子之间的相互作用，其可以使用例如杂交测定、表面等离子共振、ELISA、竞争性结合测定、等温滴定量热法、噬菌体展示、亲和层析、流变学或免疫组织化学来探测。该术语还旨在包括分子之间的“结合”相互作用。结合可以是“直接的”或“间接的”。“直接的”结合包括分子之间的直接物理接触。分子之间的“间接的”结合包括分子同时与一个或多个分子直接物理接触。该结合可以导致含有相互作用的分子的“复合物”的形成。“复合物”是指通过共价或非共价的键、相互作用或力维持在一起的两个或更多个分子的结合。
如本文使用的，术语“肽”和“肽序列”是指通过肽（或酰胺）键连接的直链或支链氨基酸。在一个实施方案中，所述肽包括约3至约120个氨基酸、或约3至约110个氨基酸、或约3至约100个氨基酸、或约3至约90个氨基酸、或约3至约80个氨基酸、或约3至约70个氨基酸、或约3至约60个氨基酸、或约3至约50个氨基酸、或约3至约40个氨基酸、或约5至约120个氨基酸、或约5至约110个氨基酸、或约5至约100个氨基酸、或约5至约90个氨基酸、或约5至约80个氨基酸、或约5至约70个氨基酸、或约5至约60个氨基酸、或约5至约50个氨基酸、或约5至约40个氨基酸、或约5至约30个氨基酸、或约5至约20个氨基酸、或约5至约10个氨基酸。
在本文描述的各种实施方案中，可以通过含有一个或多个保守的氨基酸取代来修饰所述肽（或结合单元）。如本领域一般技术人员熟知的，通过保守性取代来改变肽的任何非关键的氨基酸应该不会显著地改变该肽的活性，因为取代氨基酸的侧链应该能够形成与已经被取代的氨基酸的侧链相似的键和接触。非保守取代也是可能的，只要它们不显著影响肽的结合活性（即选择素、ICAM和/或VCAM结合亲和力）。
如本文使用的，术语“序列同一性”是指两个胎之间或两个核酸分子之间的氨基酸残基或核苷酸同同一性的水平。当比较序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，那么分子在该位置是相同的。一个肽（或多肽或肽区域）与另一个序列具有一定百分比（例如至少约60%、或至少约65%、或至少约70%、或至少约75%、或至少约80%、或至少约83%、或至少约85%、或至少约90%、或至少约95%或至少约99%）的“序列同一性”是指，当被对齐时，该百分比的碱基（或氨基酸）在两个序列的比较中是相同的。应该注意，对于在本申请中公开的任何序列（“参考序列”），与该参考序列具有至少约60%、或至少约65%、或至少约70%、或至少约75%、或至少约80%、或至少约83%、或至少约85%、或至少约90%、或至少约95%、或至少约98%或至少约99%序列同一性的序列也在本发明的范围之内。同样，本发明还包括与参考序列相比具有氨基酸残基或核苷酸的一个、两个、三个、四个、或五个取代、缺失或添加的序列。在一些实施方案中，在本文具体公开的序列中的任何一个或多个中，可以通过具有来自其每一个的一个、两个、或三个氨基添加、缺失和/或取代来修饰所述序列。
如本文使用的，术语“细胞外基质”是指为周围细胞提供结构和生物化学支持的组织的细胞外部分。
如本文使用的，术语“组合物”是指适于施用至预期患者用于治疗目的的含有至少一种药学活性成分的制剂，包括其任何固体形式。所述组合物可以包含至少一种药学上可接受的组分，以提供该化合物的改进制剂，例如合适的载体。在一些实施方案中，所述组合物配制成膜、凝胶、贴剂、或液体溶液。如本文使用的，术语“局部”是指将组合物非全身地施用至待治疗的组织和/或器官（内部的或在一些情况下外部的）的表面，以获得局部效果。
如本文使用的，术语“药学上可接受的”表示所指出的材料不具有会引起合理谨慎的医师避免给予患者的性质，考虑到使用的量和/或待治疗的疾病或病症以及相应的给药途径。典型的药学上可接受的基本上是无菌的。
如本文使用的，术语“药学上可接受的载体”是指药学上可接受的材料、组合物或载体，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料，其涉及将任何补充物或组合物、或其组分从一个器官或身体的一部分携带或运输至另一个器官或身体的一部分，或将药剂递送到静脉的内表面。
如本文使用的，术语“配制的”或“制剂”是指将不同的化学物质（包括一种或多种药物活性成分）组合以产生剂型的方法。在一些实施方案中，两种或更多种药物活性成分可以共制成单一剂型或组合剂量单位，或分别配制并随后组合成组合剂量单位。持续释放制剂是被设计来在延长的时间内在体内缓慢释放治疗剂的制剂，而立即释放制剂是被设计来在缩短的时间内在体内快速释放治疗剂的制剂。
如本文使用的，术语“递送”是指根据需要在体内运输药物组合物的途径、方法、制剂、技术和系统，以安全地实现其期望的治疗效果。递送途径可以是任何合适的途径，包括但不限于血管内、静脉内、动脉内、肌内、皮肤、皮下、经皮、皮内和表皮内途径。
如本文使用的，术语“溶液”是指本领域公知的溶液剂、混悬剂、乳剂、滴剂、软膏剂、液体洗剂、喷雾剂和脂质体。在一些实施方案中，液体溶液含有水性pH缓冲剂，当加入少量的酸或碱时，其能够抵抗pH的变化。在一些实施方案中，液体溶液含有润滑性增强剂。
如本文使用的，术语“聚合物”、“聚合物基质”或“聚合物试剂”是指生物相容性聚合物材料。本文所述的聚合物材料可以包含：例如糖（例如甘露糖醇）、肽、蛋白质、层粘连蛋白、胶原、透明质酸、离子和非离子水溶性聚合物；丙烯酸聚合物；亲水性聚合物，例如聚环氧乙烷、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物、和聚乙烯醇；纤维素聚合物和纤维素聚合物衍生物，例如羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素、和醚化纤维素；聚（乳酸）、聚（乙醇酸）、乳酸和乙醇酸的共聚物、或其它天然的和合成的聚合物。
在一些实施方案中，聚合物基质是可吸收的，例如胶原、聚乙醇酸、聚乳酸、聚对二氧环己酮、和己内酯。如本文使用的，术语“可吸收的”是指材料被吸收到体内的能力。在其他实施方案中，聚合物是不可吸收的，例如聚丙烯、聚酯或尼龙。
如本文使用的，术语“pH缓冲剂”是指当向其中加入少量酸或碱时抵抗pH变化的水性缓冲溶液。pH缓冲溶液通常包含弱酸及其共轭碱的混合物，反之亦然。例如，pH缓冲溶液可以包含：磷酸盐，例如磷酸钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钠二水合物、磷酸氢二钠、磷酸氢二钠十二水合物、磷酸钾、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾；硼酸和硼酸盐，例如硼酸钠和硼酸钾；柠檬酸和柠檬酸盐，例如柠檬酸钠和柠檬酸二钠；乙酸盐，例如乙酸钠和乙酸钾；碳酸盐，例如碳酸钠和碳酸氢钠等。pH调节剂可以包括例如：酸，例如盐酸、乳酸、柠檬酸、磷酸和乙酸；以及碱性碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠和碳酸氢钠等。在一些实施方案中，pH缓冲剂是磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液（即含有磷酸钠、氯化钠和在一些制剂中含有氯化钾和磷酸钾）。
如本文使用的，术语“治疗”是指在血管损伤或干预之前、期间和/或之后预防、治愈、逆转、减轻、缓解、最小化、抑制、压制和/或停止疾病或病症的一种或多种临床症状。
如本文使用的，术语“同时”是指同时（即联合）施用。 在一个实施方案中，所述施用是共同施用，使得两种或更多种药物活性成分（包括其任何固体形式）同时被一起递送。
如本文使用的，术语“顺序地/依次”是指分开的（即在不同的时间）施用。 在一个实施方案中，所述施用是交错的，使得两种或更多种药物活性成分（包括其任何固体形式）分别在不同的时间被递送。
胶原结合的肽
“胶原结合的肽”是包含具有一个或多个胶原结合单元（或序列）的1至约120个氨基酸的肽。如本文使用的，术语“胶原结合单元”意在指结合至胶原的肽内的氨基酸序列。“胶原结合”表示与胶原的相互作用，其可以包括疏水的、离子的（电荷）、和/或范德华相互作用，使得化合物与胶原有利地结合或相互作用。这种结合（或相互作用）旨在区别于共价键和与普通官能团的非特异性相互作用，使得所述肽与包含所述肽在胶原上结合的官能团的任何物质相互作用。可以使用本领域已知的任何方法来测试和评估肽与胶原的结合。参见例如Li, Y., et al., Current Opinion in Chemical Biology, 2013, 17: 968–975、Helmes, B.A., et al., J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 11683–11685、以及Petsalaki,E., et al., PLoS Comput Biol, 2009, 5(3): e1000335。在一个实施方案中，所述肽或所述肽的胶原结合单元以解离常数（K d ）结合至胶原，所述解离常数（K d ）为少于约1 mM、或少于约900 µM、或少于约800 µM、或少于约700 µM、或少于约600 µM、或少于约500 µM、或少于约400 µM、或少于约300 µM、或少于约200 µM、或少于约100 µM。
所述肽可以与正常或不正常参与胶原原纤维形成的蛋白质的一部分具有氨基酸同源性。在一些实施方案中，这些肽与富含亮氨酸的小生物缀合物、血小板受体序列、或调节胶原原纤维生成的蛋白质的氨基酸序列具有同源性或序列同一性。在各种实施方案中，所述肽包括选自以下的氨基酸序列：RRANAALKAGELYKSILY (SEQ ID NO: 1)、GELYKSILY(SEQ ID NO: 2)、RRANAALKAGELYKCILY (SEQ ID NO: 3)、GELYKCILY (SEQ ID NO: 4)、RLDGNEIKR (SEQ ID NO: 5)、AHEEISTTNEGVM (SEQ ID NO: 6)、NGVFKYRPRYFLYKHAYFYPPLKRFPVQ (SEQ ID NO: 7)、CQDSETRTFY (SEQ ID NO: 8)、TKKTLRT(SEQ ID NO: 9)、GLRSKSKKFRRPDIQYPDATDEDITSHM (SEQ ID NO: 10)、SQNPVQP (SEQ IDNO: 11)、SYIRIADTNIT (SEQ ID NO: 12)、KELNLVYT (SEQ ID NO: 13)、GSIT (SEQ ID NO:14)、GSITTIDVPWNV (SEQ ID NO: 15)、GQLYKSILY (SEQ ID NO: 16)、RRANAALKAGQLYKSILY(SEQ ID NO: 17)，或者与其具有至少约80%序列同一性、或至少约83%序列同一性、或至少约85%序列同一性、或至少约90%序列同一性、或至少约95%序列同一性、或至少约98%序列同一性的序列，只要该序列能够结合至胶原。
在一些实施方案中，所述肽包括与在Chiang, T.M., et al. J. Biol. Chem.,2002, 277: 34896-34901、Huizinga, E.G. et al., Structure, 1997, 5: 1147-1156、Romijn, R.A., et al., J. Biol. Chem., 2003, 278: 15035-15039、以及Chiang, etal., Cardio. & Haemato. Disorders-Drug Targets, 2007, 7: 71-75（其每个都通过引用并入本文中）中描述的血管性血友病因子（vWF）或血小板胶原受体的胶原结合结构域具有至少约80%、或至少约83%、或至少约85%、或至少约90%、或至少约95%、或至少约98%、或至少约100%序列同一性的氨基酸序列。一个非限制性的实例是WREPSFCALS (SEQ ID NO:18)，其来源于vWF。用于筛选肽序列的胶原结合亲和力（或胶原结合结构域/单元）的各种方法在本领域中是常规的。显示具有可用于本文公开的生物缀合物和方法中的胶原结合亲和力（或胶原结合单元）的其他肽序列包括但不限于：βAWHCTTKFPHHYCLYBip (SEQ ID NO:19)、βAHKCPWHLYTTHYCFTBip (SEQ ID NO: 20)、βAHKCPWHLYTHYCFT (SEQ ID NO: 21)等，其中Bip是联苯丙氨酸而βA是β-丙氨酸（参见Abd-Elgaliel, W.R., et al.,Biopolymers, 2013, 100(2), 167–173）、GROGER (SEQ ID NO: 22)、GMOGER (SEQ ID NO:23)、GLOGEN (SEQ ID NO: 24)、GLOGER (SEQ ID NO: 25)、GLKGEN (SEQ ID NO: 26)、GFOGERGVEGPOGPA (SEQ ID NO: 27)等，其中O是4-羟基脯氨酸（参见Raynal, N., et al.,J. Biol. Chem., 2006, 281(7), 3821-3831）、HVWMQAPGGGK (SEQ ID NO: 28)（参见Helms, B.A., et al., J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 11683–11685）、WREPSFCALS(SEQ ID NO: 18) （参见Takagi, J., et al., Biochemistry, 1992, 31, 8530–8534）、WYRGRL (SEQ ID NO: 29)等（参见Rothenfluh D.A., et al., Nat Mater. 2008, 7(3),248-54）、WTCSGDEYTWHC (SEQ ID NO: 30)、WTCVGDHKTWKC (SEQ ID NO: 31)、QWHCTTRFPHHYCLYG (SEQ ID NO: 32)等（参见U.S. 2007/0293656）、STWTWNGSAWTWNEGGK(SEQ ID NO: 33)、STWTWNGTNWTRNDGGK (SEQ ID NO: 34)等（参见WO/2014/059530）、CVWLWEQC (SEQ ID NO: 35)、环状CVWLWENC (SEQ ID NO: 36) 、环状CVWLWEQC (SEQ IDNO: 35)（参见Depraetere H., et al., Blood. 1998, 92, 4207-4211、和Duncan R.,Nat Rev Drug Discov, 2003, 2(5), 347-360）、CMTSPWRC (SEQ ID NO: 37)等（参见Vanhoorelbeke, K., et al., J. Biol. Chem., 2003, 278, 37815-37821）、CPGRVMHGLHLGDDEGPC (SEQ ID NO: 38) （参见Muzzard, J., et al., PLoS one. 4 (e5585) I- 10）、KLWLLPK (SEQ ID NO: 39) （参见Chan, J. M., et al., Proc Natl AcadSci U.S.A., 2010, 107, 2213- 2218）、和CQDSETRTFY (SEQ ID NO: 8)等（参见U.S.2013/0243700）、H-V-F/W-Q/ M-Q-P/A-P/K (Helms, B.A., et al., J. Am. Chem. Soc.,2009, 131(33), 11683-11685)，其每个的全文都通过引用合并入本文中。
显示具有可用于本文公开的生物缀合物和方法中的胶原结合亲和力（或胶原结合单元）的其他肽序列包括但不限于：LSELRLHEN (SEQ ID NO: 40)、LTELHLDNN (SEQ ID NO:41)、LSELRLHNN (SEQ ID NO: 42)、LSELRLHAN (SEQ ID NO: 43)、和LRELHLNNN (SEQ IDNO: 44)（参见Fredrico, S., Angew. Chem. Int. Ed. 2015, 37, 10980–10984）。
在一些实施方案中，所述肽包括选自以下的一个或多个序列：RVMHGLHLGDDE (SEQID NO: 45)、D-氨基酸EDDGLHLGHMVR (SEQ ID NO: 46)、RVMHGLHLGNNQ (SEQ ID NO: 47)、D-氨基酸QNNGLHLGHMVR (SEQ ID NO: 48)、RVMHGLHLGNNQ (SEQ ID NO: 47)、GQLYKSILYGSG-4K2K (SEQ ID NO: 49)（一种4分支肽）、GSGQLYKSILY (SEQ ID NO: 50)、GSGGQLYKSILY (SEQ ID NO: 51)、KQLNLVYT (SEQ ID NO: 52)、KELNVYT (SEQ ID NO:53)、CVWLWQQC (SEQ ID NO: 54)、WREPSFSALS (SEQ ID NO: 55)、GHRPLDKKREEAPSLRPAPPPISGGGYR (SEQ ID NO: 56)、以及GHRPLNKKRQQAPSLRPAPPPISGGGYR(SEQ ID NO: 57)。
类似地，对于胶原结合肽，可以产生源自为胶原选择的噬菌体展示文库的肽。可以通过任何技术（例如SPR、ELISA、ITC、亲和层析、或本领域已知的其它技术）合成肽并评估其与胶原的结合。一个实例可以是生物素修饰的肽序列（例如SILY生物素），其在含有固定化的胶原的微孔板上孵育。可以使用链霉亲和素发色团产生剂量反应结合曲线，以确定肽结合至胶原的能力。
在一个实施方案中，所述肽包括一个或多个胶原结合单元，其结合I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、或XIV型胶原中的任意一个或多个。在一个实施方案中，所述肽以解离常数（K d ）结合至I型胶原，所述解离常数（K d ）为少于约1 mM、或少于约900µM、或少于约800 µM、或少于约700 µM、或少于约600 µM、或少于约500 µM、或少于约400 µM、或少于约300 µM、或少于约200 µM、或少于约100 µM。在一个实施方案中，所述肽以解离常数（K d ）结合至II型胶原，所述解离常数（K d ）为少于约1 mM、或少于约900 µM、或少于约800µM、或少于约700 µM、或少于约600 µM、或少于约500 µM、或少于约400 µM、或少于约300 µM、或少于约200 µM、或少于约100 µM。在一个实施方案中，所述肽以解离常数（K d ）结合至III型胶原，所述解离常数（K d ）为少于约1 mM、或少于约900 µM、或少于约800 µM、或少于约700 µM、或少于约600 µM、或少于约500 µM、或少于约400 µM、或少于约300 µM、或少于约200 µM、或少于约100 µM。在一个实施方案中，所述肽以解离常数（K d ）结合至IV型胶原，所述解离常数（K d ）为少于约1 mM、或少于约900 µM、或少于约800 µM、或少于约700 µM、或少于约600 µM、或少于约500 µM、或少于约400 µM、或少于约300 µM、或少于约200 µM、或少于约100 µM。
透明质酸结合的肽
“透明质酸结合的肽”是包含具有一个或多个胶原结合单元（或序列）的1至约120个氨基酸的肽。如本文使用的，“透明质酸结合单元”意在指结合至透明质酸的肽内的氨基酸序列。“透明质酸结合”表示与透明质酸的相互作用，其可以包括疏水的、离子的（电荷）、和/或范德华相互作用，使得化合物与透明质酸有利地结合或相互作用。这种结合（或相互作用）旨在区别于共价键和与普通官能团的非特异性相互作用，使得所述透明质酸结合的肽与包含所述肽在透明质酸上结合的官能团的任何物质相互作用。参见例如Becerra, S.P., etal. J. Biol. Chem., 2008, 283: 33310-33320。在一个实施方案中，所述肽或所述透明质酸结合的肽以解离常数（K d ）结合至透明质酸，所述解离常数（K d ）为少于约1 mM、或少于约900 µM、或少于约800 µM、或少于约700 µM、或少于约600 µM、或少于约500 µM、或少于约400 µM、或少于约300 µM、或少于约200 µM、或少于约100 µM。
在一些实施方案中，合成的生物缀合物的透明质酸结合单元可以包括衍生自透明质酸介导的运动受体（RHAMM）的氨基酸序列（示例性的序列包括但不限于NP_001136028、NP_001136029、NP_036616和NP_036617）。
在本文所述的各种实施方案中，合成的生物缀合物的透明质酸结合的肽组分可以包括选自以下的氨基酸序列：GAHWQFNALTVR (SEQ ID NO: 58)、STMMSRSHKTRSHHV (SEQ IDNO: 59)、TMTRPHFHKRQLVLS (SEQ ID NO: 60)、STMMSRSHKTRSCHH (SEQ ID NO: 61)、STMMSRSHKTRSHH (SEQ ID NO: 62)、GDRRRRRMWHRQ (SEQ ID NO: 63)、GKHLGGKHRRSR (SEQID NO: 64)、RGTHHAQKRRS (SEQ ID NO: 65)、RRHKSGHIQGSK (SEQ ID NO: 66)、SRMHGRVRGRHE (SEQ ID NO: 67)、RRRAGLTAGRPR (SEQ ID NO: 68)、RYGGHRTSRKWV (SEQID NO: 69)、RSARYGHRRGVG (SEQ ID NO: 70)、GLRGNRRVFARP (SEQ ID NO: 71)、SRGQRGRLGKTR (SEQ ID NO: 72)、DRRGRSSLPKLAGPVEFPDRKIKGRR (SEQ ID NO: 73)、AGPVEFPDRKIKGRR (SEQ ID NO: 74)、RMRRKGRVKHWG (SEQ ID NO: 75)、RGGARGRHKTGR(SEQ ID NO: 76)、TGARQRGLQGGWGPRHLRGKDQPPGR (SEQ ID NO: 77)、RQRRRDLTRVEG (SEQID NO: 78)、STKDHNRGRRNVGPVSRSTLRDPIRR (SEQ ID NO: 79)、RRIGHQVGGRRN (SEQ IDNO: 80)、RLESRAAGQRRA (SEQ ID NO: 81)、GGPRRHLGRRGH (SEQ ID NO: 82)、VSKRGHRRTAHE (SEQ ID NO: 83)、RGTRSGSTR (SEQ ID NO: 84)、RRRKKIQGRSKR (SEQ IDNO: 85)、RKSYGKYQGR (SEQ ID NO: 86)、KNGRYSISR (SEQ ID NO: 87)、RRRCGQKKK (SEQID NO: 88)、KQKIKHVVKLK (SEQ ID NO: 89)、KLKSQLVKRK (SEQ ID NO: 90)、RYPISRPRKR(SEQ ID NO: 91)、KVGKSPPVR (SEQ ID NO: 92)、KGRYSISR (SEQ ID NO: 93)、RRRCGQKK(SEQ ID NO: 94)、KTFGKMKPR (SEQ ID NO: 95)、RIKWSRVSK (SEQ ID NO: 96)和KRTMRPTRR (SEQ ID NO: 97)，或者与其具有至少约80%序列同一性、或至少约83%序列同一性、或至少约85%序列同一性、或至少约90%序列同一性、或至少约95%序列同一性、或至少约98%序列同一性的序列，只要该序列能够结合至透明质酸。
可以被包含作为透明质酸结合的合成的生物缀合物的肽组分的其他肽包括具有Arg-Arg (R-R)部分的肽，例如是选自以下的一个或多个肽：RRASRSRGQVGL (SEQ ID NO:98)、GRGTHHAQKRRS (SEQ ID NO: 99)、QPVRRLGTPVVG (SEQ ID NO: 100)、ARRAEGKTRMLQ(SEQ ID NO: 101)、PKVRGRRHQASG (SEQ ID NO: 102)、SDRHRRRREADG (SEQ ID NO: 103)、NQRVRRVKHPPG (SEQ ID NO: 104)、RERRERHAVARHGPGLERDARNLARR (SEQ ID NO: 105)、TVRPGGKRGGQVGPPAGVLHGRRARS (SEQ ID NO: 106)、NVRSRRGHRMNS (SEQ ID NO: 107)、DRRRGRTRNIGN (SEQ ID NO: 108)、KTAGHGRRWSRN (SEQ ID NO: 109)、AKRGEGRREWPR (SEQID NO: 110)、GGDRRKAHKLQA (SEQ ID NO: 111)、RRGGRKWGSFEG (SEQ ID NO: 112)、和RQRRRDLTRVEG (SEQ ID NO: 78)（参见例如Amemiya et al., Biochem. Biophys. Acta,2005, 1724, 94-99，其通过引用合并入本文中）；或者与其具有至少约80%序列同一性、或至少约83%序列同一性、或至少约85%序列同一性、或至少约90%序列同一性、或至少约95%序列同一性、或至少约98%序列同一性的序列，只要该序列能够结合至透明质酸。在另一个实施方案中，所述肽选自RDGTRYVQKGEYR (SEQ ID NO: 113)、HREARSGKYK (SEQ ID NO:114)、PDKKHKLYGV (SEQ ID NO: 115)、和WDKERSRYDV (SEQ ID NO: 116)（参见例如Yang,B., et al, EMBO Journal, 1994, 13, 286-296, and Goetinck, P.F. et al, J.Cell. Biol, 1987, 105, 2403-2408，其都通过引用合并入本文中）；或者与其具有至少约80%序列同一性、或至少约83%序列同一性、或至少约85%序列同一性、或至少约90%序列同一性、或至少约95%序列同一性、或至少约98%序列同一性的序列，只要该序列能够结合至透明质酸。
也可以通过噬菌体展示，利用对结合至透明质酸的阳性选择，从而选择肽。透明质酸结合的肽可以通过其与透明质酸的相互作用来确定，并且通过用于评估分子相互作用的任何技术（例如表面等离子体共振、ELISA、竞争性结合测定、等温滴定量热法、亲和层析、流变学和 /或免疫组织化学）进行测量。被认为是“透明质酸结合”的肽可以与透明质酸或含透明质酸的组织相互作用，使得相互作用不归因于已知的化学反应性基团。相互作用可能是由于肽中的氨基酸残基造成的疏水和电荷相互作用。可以通过将透明质酸固定在微培养板上并与透明质酸结合的肽孵育，然后通过检测技术（例如使用发色团的生物素-抗生物素蛋白），测量所述相互作用。也可以通过机械影响含有透明质酸的液体、凝胶或与透明质酸结合肽或与含有透明质酸结合肽的合成生物缀合物一起温育的组织来测量相互作用。
为了鉴定肽，可以合成选自噬菌体展示的肽或由蛋白质中的透明质酸结合基序鉴定的肽，并评价其与透明质酸的相互作用。例如，可以在N-末端用生物素修饰合成B-X7-B序列，并在透明质酸涂覆的微孔板上孵育。可以产生剂量反应结合曲线，以确定肽结合至透明质酸的能力。在一个实施方案中，所述肽包括约3至约120个氨基酸、或约3至约110个氨基酸、或约3至约100个氨基酸、或约3至约90个氨基酸、或约3至约80个氨基酸、或约3至约70个氨基酸、或约3至约60个氨基酸、或约3至约50个氨基酸、或约3至约40个氨基酸、或约5至约120个氨基酸、或约5至约100个氨基酸、或约5至约90个氨基酸、或约5至约80个氨基酸、或约5至约70个氨基酸、或约5至约60个氨基酸、或约5至约50个氨基酸、或约5至约40个氨基酸、或约5至约30个氨基酸、或约5至约20个氨基酸、或约5至约10个氨基酸。
ICAM、VCAM和选择素结合的肽
“ICAM、VCAM和选择素结合的肽”是包含具有一个或多个胶原结合单元（或序列）的1至约120个氨基酸的肽。如本文使用的，术语“ICAM、VCAM和/或选择素结合单元”意在指结合至ICAM、VCAM和/或选择素受体的肽内的氨基酸序列。所述结合表示与ICAM、VCAM和/或选择素受体的相互作用，其可以包括疏水的、离子的（电荷）、和/或范德华相互作用，使得化合物与ICAM、VCAM和/或选择素受体有利地结合或相互作用。这种结合（或相互作用）旨在区别于共价键和与普通官能团的非特异性相互作用，使得ICAM、VCAM和/或选择素结合的肽或单元与包含所述肽在ICAM、VCAM和/或选择素受体上结合的官能团的任何物质相互作用。在一个实施方案中，所述肽或结合单元以解离常数（K d ）结合至在ICAM、VCAM和/或选择素受体，所述解离常数（K d ）为少于约1 mM、或少于约900 µM、或少于约800 µM、或少于约700 µM、或少于约600 µM、或少于约500 µM、或少于约400 µM、或少于约300 µM、或少于约200 µM、或少于约100 µM。
有用的肽的实例包括以下肽序列（或单元），其能够结合至选择素：IELLQAR (SEQID NO: 117)、IELLQARGSC (SEQ ID NO: 118)、IDLMQAR (SEQ ID NO: 119)、IDLMQARGSC(SEQ ID NO: 120)、QITWAQLWNMMK (SEQ ID NO: 121)、QITWAQLWNMMKGSC (SEQ ID NO:122)、及其组合。所述选择素可以是S-、P-或E-选择素。用于筛选肽序列的E-选择素结合亲和力（或E-选择素结合单元）的各种方法在本领域中是常规的（参见例如Martens, C. L.et al. J. Biol. Chem. 1995, 270(36), 21129-21136；和Koivunen, E. et al. J.Nucl. Med. 1999, 40, 883-888）。
显示具有可用于本文公开的生物缀合物和方法中的E-选择素结合亲和力（或E-选择素结合单元）的其他肽序列包括但不限于LRRASLGDGDITWDQLWDLMK (SEQ ID NO: 123)、HITWDQLWNVMN (SEQ ID NO: 124)、QITWAQLWNMMK (SEQ ID NO: 121)、YGNSNITWDQLWSIMNRQTT (SEQ ID NO: 125)、WTDTHITWDQLWHFMNMGEQ (SEQ ID NO: 126)、EPWDQITWDQLWIIMNNGDG (SEQ ID NO: 127)、HITWDQLWLMMS (SEQ ID NO: 128)、DLTWEGLWILMT (SEQ ID NO: 129)、RGVWGGLWSMTW (SEQ ID NO: 130)、DYSWHDLWFMMS (SEQID NO: 131)、KKEDWLALWRIMSVPDEN (SEQ ID NO: 132)、RNMSWLELWEHMK (SEQ ID NO:133)、KEQQWRNLWKMMS (SEQ ID NO: 134)、SQVTWNDLWSVMNPEVVN (SEQ ID NO: 135)和RSLSWLQLWDWMK (SEQ ID NO: 136)（参见例如Martens, C. L. et al. J. Biol. Chem.1995, 270(36), 21129-21136）、DITWDQLWDLMK (SEQ ID NO: 137) （参见例如Koivunen,E. et al. J. Nucl. Med. 1999, 40, 883-888）、DITWDELWKIMN (SEQ ID NO: 138)、DYTWFELWDMMQ (SEQ ID NO: 139)、DMTHDLWLTLMS (SEQ ID NO: 140)、EITWDQLWEVMN (SEQID NO: 141)、HVSWEQLWDIMN (SEQ ID NO: 142)、HITWDQLWRIMT (SEQ ID NO: 143)、DISWDDLWIMMN (SEQ ID NO: 144)、QITWDQLWDLMY (SEQ ID NO: 145)、RNMSWLELWEHMK(SEQ ID NO: 133)、AEWTWDQLWHVMNPAESQ (SEQ ID NO: 146)、HRAEWLALWEQMSP (SEQ IDNO: 147)、KKEDWLALWRIMSV (SEQ ID NO: 148)、KRKQWIELWNIMS (SEQ ID NO: 149)、WKLDTLDMIWQD (SEQ ID NO: 150)和HITWDQLWNVMLRRAASLG (SEQ ID NO: 151) （参见例如Simanek, E. E. Chem. Rev. 1998, 98, 833-862）、或其组合，其中每个的全文都通过引用合并入本文中。
用于筛选肽序列的ICAM结合亲和力（或ICAM结合单元）的各种方法在本领域中是常规的（参见例如Martens, C. L. et al. J. Biol. Chem. 1995, 270(36), 21129-21136；和Koivunen, E. et al. J. Nucl. Med. 1999, 40, 883-888）。可以结合ICAM的有用的肽序列的实例包括以下：NAFKILVVITFGEK (SEQ ID NO: 152)、NAFKILVVITFGEKGSC(SEQ ID NO: 153)、ITDGEA (SEQ ID NO: 154)、ITDGEAGSC (SEQ ID NO: 155)、DGEATD(SEQ ID NO: 156)、DGEATDGSC (SEQ ID NO: 157)、及其组合。
显示具有可用于本文公开的生物缀合物和方法中的ICAM结合亲和力（或ICAM结合单元）的其他肽序列包括但不限于：EWCEYLGGYLRYCA (SEQ ID NO: 158)（参见例如Welply,J. K. et al. Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics 1996, 26(3):262-270）、FEGFSFLAFEDFVSSI (SEQ ID NO: 159) （参见例如美国公开号WO2014059384）、NNQKIVNLKEKVAQLEA (SEQ ID NO: 160)、NNQKIVNIKEKVAQIEA (SEQ ID NO: 161)、NNQKLVNIKEKVAQIEA (SEQ ID NO: 162)、YPASYQR (SEQ ID NO: 163)、YQATPLP (SEQ IDNO: 164)、GSLLSAA (SEQ ID NO: 165)、FSPHSRT (SEQ ID NO: 166)、YPFLPTA (SEQ IDNO: 167)和GCKLCAQ (SEQ ID NO: 168)（参见例如美国专利8,926,946）、GGTCGGGGTGAGTTTCGTGGTAGGGATAATTCTGTTTGGGTGGTT (SEQ ID NO: 169)、EWCEYLGGYLRCYA(SEQ ID NO: 170) （参见例如Koivunen, E. et al. J. Nucl. Med. 1999, 40, 883-888）、GRGEFRGRDNSVSVV (SEQ ID NO: 171) （参见例如中国公开号CN1392158）、QTSVSPSKVI (SEQ ID NO: 172)、PSKVILPRGG (SEQ ID NO: 173)、LPRGGSVLVTG (SEQ IDNO: 174)、和QTSVSPSKVILPRGGSVLVTG (SEQ ID NO: 175) （参见例如Tibbetts, S. A. etal. Peptides 21 -2000 1161–1167）、及其组合，其中每个的全文都通过引用合并入本文中。
用于筛选肽序列的VCAM结合亲和力（或VCAM结合单元）的各种方法在本领域中是常规的（参见例如Martens, C. L. et al. J. Biol. Chem. 1995, 270(36), 21129-21136；和Koivunen, E. et al. J. Nucl. Med. 1999, 40, 883-888）。显示具有可用于本文公开的生物缀合物和方法的VCAM结合亲和力（或VCAM结合单元）的其他肽序列包括但不限于YRLAIRLNER (SEQ ID NO: 176)、YRLAIRLNERRENLRIALRY (SEQ ID NO: 177)和RENLRIALRY (SEQ ID NO: 178)、及其组合，其全文通过引用合并入本文中。
在一些实施方案中，本文所述的任何序列可以被修饰，使得任何一个或多个氨基酸（例如1、2、3、4或5个氨基酸）被从中添加、缺失或取代。在一些实施方案中，修饰序列，使得任何一个或多个氨基酸被丙氨酸取代。在一些实施方案中，修饰序列，使得任何一个或多个1-氨基酸被替换为相应的D-氨基酸扫描。在一些实施方案中，修饰序列，使得任何一个或多个缬氨酸被亮氨酸替代、任何一个或多个谷氨酸被谷氨酰胺替代、任何一个或多个天冬氨酸被天冬酰胺替代、和/或任何一个或多个精氨酸被谷氨酰胺取代。
在本文所述的实施方案的任一个中，具有胶原结合单元、透明质酸结合单元、ICAM结合单元、VCAM结合单元、和/或选择素结合单元的肽包含前述段落中所述的任何氨基酸序列，或者与这些氨基酸序列的任一个具有至少约80%、或至少约83%、或至少约85%、或至少约90%、或至少约95%、或至少约98%、或至少约100%同源性的氨基酸序列。在各种实施方案中，可以通过含有一个或多个保守的氨基酸取代来修饰所述合成的生物缀合物。如本领域一般技术人员熟知的，通过保守性取代来改变肽的任何非关键的氨基酸应该不会显著地改变该肽的活性，因为取代氨基酸的侧链应该能够形成与已经被取代的氨基酸的侧链相似的键和接触。
如本领域所熟知的，氨基酸的“保守性取代”或肽的“保守性取代变体”是指这样的氨基酸取代，其维持了：1）肽的二级结构；2）氨基酸的电荷或疏水性；和3）侧链的庞大性或这些特征中的任何一个或多个。说明性地，众所周知的术语“亲水性残基”涉及丝氨酸或苏氨酸。“疏水性残基”是指亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸或丙氨酸等。“带正电的残基”涉及赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、或组氨酸。“带负电的残基”是指天冬氨酸或谷氨酸。具有“庞大的侧链”的残基是指苯丙氨酸、色氨酸、或酪氨酸等。表1中给出了说明性的保守的氨基酸取代的列表。
表1
对于氨基酸 取代为
丙氨酸 D-Ala, Gly, Aib, β-Ala, L-Cys, D-Cys
精氨酸 D-Arg, Lys, D-Lys, Orn, D-Orn
天冬酰胺 D-Asn, Asp, D-Asp, Glu, D-Glu, Gln, D-Gln
天冬氨酸 D-Asp, D-Asn, Asn, Glu, D-Glu, Gln, D-Gln
半胱氨酸 D-Cys, S-Me-Cys, Met, D-Met, Thr, D-Thr, L-Ser, D-Ser
谷氨酰胺 D-Gln, Asn, D-Asn, Glu, D-Glu, Asp, D-Asp
谷氨酸 D-Glu, D-Asp, Asp, Asn, D-Asn, Gln, D-Gln
甘氨酸 Ala, D-Ala, Pro, D-Pro, Aib, β-Ala
异亮氨酸 D-Ile, Val, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met
亮氨酸 Val, D-Val, Met, D-Met, D-Ile, D-Leu, Ile
赖氨酸 D-Lys, Arg, D-Arg, Orn, D-Orn
蛋氨酸 D-Met, S-Me-Cys, Ile, D-Ile, Leu, D-Leu, Val, D-Val
苯丙氨酸 D-Phe, Tyr, D-Tyr, His, D-His, Trp, D-Trp
脯氨酸 D-Pro
丝氨酸 D-Ser, Thr, D-Thr, allo-Thr, L-Cys, D-Cys
苏氨酸 D-Thr, Ser, D-Ser, allo-Thr, Met, D-Met, Val, D-Val
酪氨酸 D-Tyr, Phe, D-Phe, His, D-His, Trp, D-Trp
缬氨酸 D-Val, Leu, D-Leu, Ile, D-Ile, Met, D-Met
在一些实施方案中，修饰肽序列，以用谷氨酰胺取代一个或多个谷氨酸残基和/或用天冬酰胺取代一个或多个天冬氨酸残基。
生物缀合物
本文提供了生物缀合物，其包含聚糖和1至50个肽，所述肽包含胶原结合单元和/或透明质酸结合单元、选择素、ICAM和/或VCAM受体结合单元，其通过-C(O)-NH-NH-C(O)-（即酰肼-羰基）连接共价地结合至所述聚糖。
以前，通过利用氧化化学来切割聚糖骨架内的一个或多个糖环，从而在聚糖上提供醛结合位点，以将肽结合至聚糖（例如硫酸皮肤素）。然后使用醛结合位点缀合肽（例如通过–C(O)-NH-N=C键）。
本文所述的生物缀合物与本领域已知的生物缀合物在结构上的不同之处在于，所述肽通过酰肼-羰基键而结合至所述聚糖，其中酰肼-羰基的羰基基团是存在于聚糖上的环外羰基基团。环外羰基基团可以存在于天然的聚糖上，或者可以修饰聚糖修饰以包含这样的官能团。下文详细描述了这样的方法。预期的是，本文公开的生物缀合物所显示的有益效果（例如提高的结合亲和力）至少部分是由于聚糖不含有氧化切割的糖环。
在一些实施方案中，生物缀合物可以包含聚合物骨架（例如不同于聚糖的生物相容性聚合物），其由任何单体或单体单元的组合组成，只要在其上存在至少一个（在一些情况下1至约50个）适合的官能团，使得如本文所述的肽可以与其共价结合。所述聚合物可以是线性的、分支的、或者可以含有侧链（例如1至50个肽之外）。所述聚合物可以是中性的、阳离子的、阴离子的或两性离子的。在一些实施方案中，所述聚合物是糖聚合物。所述聚合物可以是共聚物，例如包括式A-B-A的嵌段共聚物。提供这样的聚合物的方法是本领域已知的，包括例如活性聚合。在一个实施方案中，所述聚合物是聚（乙二醇）（PEG）。在另一个实施方案中，所述聚合物不是聚乙二醇（PEG）。在一些实施方案中，所述聚合物不是聚糖或纳米颗粒。 在一些实施方案中，所述聚合物是聚糖。
在本文所述的生物缀合物的一些实施方案中，所述聚糖可以是藻酸盐、软骨素、皮肤素、硫酸皮肤素、乙酰肝素、硫酸乙酰肝素、肝素、葡聚糖、硫酸葡聚糖、或透明质酸。在一个实施方案中，所述聚糖是硫酸皮肤素。在一个实施方案中，所述聚糖不是硫酸皮肤素。在另一个实施方案中，所述聚糖是硫酸软骨素。在另一个实施方案中，所述聚糖是肝素。在本文所述的生物缀合物中可以使用各种分子量的肝素，例如从约650-700 Da的单个二糖单元至约50 kDa的聚糖。在一些实施方案中，所述肝素是约10至约20 kDa。在一些实施方案中，所述肝素高达约15、或约16、或约17、或约18、或约19、或约20 kDa。
在一个实施方案中，所述生物缀合物包括具有胶原结合单元的肽，该单元结合至I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、或XIV型胶原中的一个或多个。在一个实施方案中，胶原结合单元在结合至胶原时促进或抑制原纤维生成。在一个实施方案中，胶原结合单元在结合至胶原时不促进或抑制原纤维生成。在一些实施方案中，所述肽结合至I型胶原。在其他实施方案中，所述肽结合至IV型胶原。在一些实施方案中，在本文所述的生物缀合物中可以使用对胶原具有特定结合亲和力的一种或多种肽。例如，合成的生物缀合物可以包含至少一种对I型胶原具有结合亲和力的肽和至少一种对IV型胶原具有结合亲和力的肽。在另一个实施方案中，所述肽具有对I型胶原的结合亲和力。在另一个实施方案中，所述肽具有对IV型胶原的结合亲和力。在一些实施方案中，所述肽具有对II型胶原的结合亲和力。在一些实施方案中，所述肽具有对III型胶原的结合亲和力。在一些实施方案中，所述肽结合至多于一种类型的胶原，其中对每种胶原类型的相对亲和力可以变化。在一个实施方案中，所述胶原结合单元以解离常数（K d ）结合至胶原，所述解离常数（K d ）为少于约1 mM、或少于约900 µM、或少于约800 µM、或少于约700 µM、或少于约600 µM、或少于约500 µM、或少于约400 µM、或少于约300 µM、或少于约200 µM、或少于约100 µM。
进一步地，本文所述的生物缀合物可以包含具有多于一个结合单元的肽，其中所述结合单元可以是相同的或不同的。例如，在一些实施方案中，所述肽包含两个或更多个胶原结合单元，其中所述胶原结合单元是相同的。在另一个实施方案中，所述肽包含两个或更多个胶原结合单元，其中所述胶原结合单元是不同的。
在一些实施方案中，所述生物缀合物包括一个或多个肽，其包括式(I)或(II)的氨基酸序列：
(X)n-YKS-(X)m (I)
(X)n-YKC-(X)m (II)
其中
n为0至50；
m为0至50；
并且每个X独立地选自天然或非天然氨基酸。在一些实施方案中，每个X独立地选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
在一些实施方案中，所述生物缀合物包括一个或多个肽，其包括选自以下的氨基酸序列：YKSILY (SEQ ID NO: 179)、LYKSILY (SEQ ID NO: 180)、ELYKSILY (SEQ ID NO:181)、GELYKSILY (SEQ ID NO: 2)、AGELYKSILY (SEQ ID NO: 182)、KAGELYKSILY (SEQ IDNO: 183)、LKAGELYKSILY (SEQ ID NO: 184)、ALKAGELYKSILY (SEQ ID NO: 185)、AALKAGELYKSILY (SEQ ID NO: 186)、NAALKAGELYKSILY (SEQ ID NO: 187)、ANAALKAGELYKSILY (SEQ ID NO: 188)、RANAALKAGELYKSILY (SEQ ID NO: 189)、RRANAALKAGELYKSILY (SEQ ID NO: 1)、QLYKSILY (SEQ ID NO: 190)、GQLYKSILY (SEQ IDNO: 16)、AGQLYKSILY (SEQ ID NO: 191)、KAGQLYKSILY (SEQ ID NO: 192)、LKAGQLYKSILY(SEQ ID NO: 193)、ALKAGQLYKSILY (SEQ ID NO: 194)、AALKAGQLYKSILY (SEQ ID NO:195)、NAALKAGQLYKSILY (SEQ ID NO: 196)、ANAALKAGQLYKSILY (SEQ ID NO: 197)、RANAALKAGQLYKSILY (SEQ ID NO: 198)、和RRANAALKAGQLYKSILY (SEQ ID NO: 17)，或者与其具有至少约80%序列同一性、或至少约83%序列同一性、或至少约85%序列同一性、或至少约90%序列同一性、或至少约95%序列同一性、或至少约98%序列同一性的序列，只要该序列包括至少一个YKS序列。
在一些实施方案中，所述生物缀合物包括一个或多个肽，其包括选自以下的氨基酸序列：YKCILY (SEQ ID NO: 199)、LYKCILY (SEQ ID NO: 200)、ELYKCILY (SEQ ID NO:201)、GELYKCILY (SEQ ID NO: 4)、AGELYKCILY (SEQ ID NO: 202)、KAGELYKCILY (SEQ IDNO: 203)、LKAGELYKCILY (SEQ ID NO: 204)、ALKAGELYKCILY (SEQ ID NO: 205)、AALKAGELYKCILY (SEQ ID NO: 206)、NAALKAGELYKCILY (SEQ ID NO: 207)、ANAALKAGELYKCILY (SEQ ID NO: 208)、RANAALKAGELYKCILY (SEQ ID NO: 209)、RRANAALKAGELYKCILY (SEQ ID NO: 3)、QLYKCILY (SEQ ID NO: 210), GQLYKCILY (SEQID NO: 211)、AGQLYKCILY (SEQ ID NO: 212)、KAGQLYKCILY (SEQ ID NO: 213)、LKAGQLYKCILY (SEQ ID NO: 214)、ALKAGQLYKCILY (SEQ ID NO: 215)、AALKAGQLYKCILY(SEQ ID NO: 216)、NAALKAGQLYKCILY (SEQ ID NO: 217)、ANAALKAGQLYKCILY (SEQ IDNO: 218)、RANAALKAGQLYKCILY (SEQ ID NO: 219)、和RRANAALKAGQLYKCILY (SEQ ID NO:220)，或者与其具有至少约80%序列同一性、或至少约83%序列同一性、或至少约85%序列同一性、或至少约90%序列同一性、或至少约95%序列同一性、或至少约98%序列同一性的序列，只要该序列包括至少一个YKC序列。
在一些实施方案中，所述生物缀合物包括一个或多个肽，其包括选自以下的氨基酸序列：LYKS (SEQ ID NO: 221)、ELYKS (SEQ ID NO: 222)、GELYKS (SEQ ID NO: 223)、AGELYKS (SEQ ID NO: 224)、KAGELYKS (SEQ ID NO: 225)、LKAGELYKS (SEQ ID NO:226)、ALKAGELYKS (SEQ ID NO: 227)、AALKAGELYKS (SEQ ID NO: 228)、NAALKAGELYKS(SEQ ID NO: 229)、ANAALKAGELYKS (SEQ ID NO: 230)、RANAALKAGELYKS (SEQ ID NO:231)、和RRANAALKAGELYKS (SEQ ID NO: 232)，或者与其具有至少约80%序列同一性、或至少约83%序列同一性、或至少约85%序列同一性、或至少约90%序列同一性、或至少约95%序列同一性、或至少约98%序列同一性的序列，只要该序列包括至少一个YKS序列。
在一些实施方案中，所述生物缀合物包括一个或多个肽，其包括选自以下的氨基酸序列：LYKC (SEQ ID NO: 233)、ELYKC (SEQ ID NO: 234)、GELYKC (SEQ ID NO: 235)、AGELYKC (SEQ ID NO: 236)、KAGELYKC (SEQ ID NO: 237)、LKAGELYKC (SEQ ID NO:238)、ALKAGELYKC (SEQ ID NO: 239)、AALKAGELYKC (SEQ ID NO: 240)、NAALKAGELYKC(SEQ ID NO: 241)、ANAALKAGELYKC (SEQ ID NO: 242)、RANAALKAGELYKC (SEQ ID NO:243)、和RRANAALKAGELYKC (SEQ ID NO: 244)，或者与其具有至少约80%序列同一性、或至少约83%序列同一性、或至少约85%序列同一性、或至少约90%序列同一性、或至少约95%序列同一性、或至少约98%序列同一性的序列，只要该序列包括至少一个YKC序列。
在一些实施方案中，所述生物缀合物包括一个或多个肽，其包括选自以下的氨基酸序列：AYKS (SEQ ID NO: 245)、RAYKS (SEQ ID NO: 246)、LRAYKS (SEQ ID NO: 247)、NLRAYKS (SEQ ID NO: 248)、LNLRAYKS (SEQ ID NO: 249)、RLNLRAYKS (SEQ ID NO:250)、ARLNLRAYKS (SEQ ID NO: 251)、LARLNLRAYKS (SEQ ID NO: 252)、ILARLNLRAYKS(SEQ ID NO: 253)、AILARLNLRAYKS (SEQ ID NO: 254)、EAILARLNLRAYKS (SEQ ID NO:255)、AEAILARLNLRAYKS (SEQ ID NO: 256)、KAEAILARLNLRAYKS (SEQ ID NO: 257)、GKAEAILARLNLRAYKS (SEQ ID NO: 258)、和YGKAEAILARLNLRAYKS (SEQ ID NO: 259)，或者与其具有至少约80%序列同一性、或至少约83%序列同一性、或至少约85%序列同一性、或至少约90%序列同一性、或至少约95%序列同一性、或至少约98%序列同一性的序列，只要该序列包括至少一个YKS序列。
在一些实施方案中，所述生物缀合物包括一个或多个肽，其包括选自以下的氨基酸序列：AYKC (SEQ ID NO: 260)、RAYKC (SEQ ID NO: 261)、LRAYKC (SEQ ID NO: 262)、NLRAYKC (SEQ ID NO: 263)、LNLRAYKC (SEQ ID NO: 264)、RLNLRAYKC (SEQ ID NO:265)、ARLNLRAYKC (SEQ ID NO: 266)、LARLNLRAYKC (SEQ ID NO: 267)、ILARLNLRAYKC(SEQ ID NO: 268)、AILARLNLRAYKC (SEQ ID NO: 269)、EAILARLNLRAYKC (SEQ ID NO:270)、AEAILARLNLRAYKC (SEQ ID NO: 271)、KAEAILARLNLRAYKC (SEQ ID NO: 272)、GKAEAILARLNLRAYKC (SEQ ID NO: 273)、和YGKAEAILARLNLRAYKC (SEQ ID NO: 274)，或者与其具有至少约80%序列同一性、或至少约83%序列同一性、或至少约85%序列同一性、或至少约90%序列同一性、或至少约95%序列同一性、或至少约98%序列同一性的序列，只要该序列包括至少一个YKC序列。
在一些实施方案中，所述生物缀合物包括一个或多个肽，其包括氨基酸序列GAHWQFNALTVR (SEQ ID NO: 58)，或者与其具有至少约80%序列同一性、或至少约83%序列同一性、或至少约85%序列同一性、或至少约90%序列同一性、或至少约95%序列同一性、或至少约98%序列同一性的序列，只要该序列以小于约1 mM的解离常数(K d )结合至透明质酸。
在一些实施方案中，所述生物缀合物包括一个或多个肽，其包括氨基酸序列STMMSRSHKTRSHHV (SEQ ID NO: 59)，或者与其具有至少约80%序列同一性、或至少约83%序列同一性、或至少约85%序列同一性、或至少约90%序列同一性、或至少约95%序列同一性、或至少约98%序列同一性的序列，只要该序列以小于约1 mM的解离常数(K d )结合至透明质酸。
相应地，在一些实施方案中，所述生物缀合物包括一个或多个肽，其包括式(IA)或(IIA)的氨基酸序列：
(X)n-YKS-(X)m-GSG (IA)
(X)n-YKC-(X)m-GSG (IIA)
其中
n为0至50；
m为0至50；
并且每个X独立地选自天然或非天然氨基酸。在一些实施方案中，每个X独立地选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。在一些实施方案中，每个X独立地选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸和酪氨酸。
在一些实施方案中，在式I、II、IA和IIA的任一个中的n为0至约50、或0至约40、或0至约30、或0至约20、或0至约15、或0至约10、或0至约5。在一些实施方案中，n为1至约40、或1至约30、或1至约20、或1至约15、或1至约10、或1至约5。在一些实施方案中，n为0至约50、或0至约40、或0至约30、或0至约20、或0至约15、或0至约10、或0至约5。在一些实施方案中，n为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。
在一些实施方案中，在式I、II、IA和IIA的任一个中的m为0至约50、或0至约40、或0至约30、或0至约20、或0至约15、或0至约10、或0至约5。在一些实施方案中，m为1至约50、或1至约40、或1至约30、或1至约20、或1至约15、或1至约10、或1至约5。在一些实施方案中，m为0至约50、或0至约40、或0至约30、或0至约20、或0至约15、或0至约10、或0至约5。在一些实施方案中，m为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。
在一个实施方案中，所述生物缀合物包括一个或多个肽，其包括多达约40个氨基酸。相应地，在一些实施方案中，在式I、II、IA和IIA的任一个中的n和m的总和是约120、或约110、或约100、或约90、或约80、或约70、或约60、或约50、或约40、或约30、或约25、或约20、或约15、或约10、或约5、或约3、或约2。
在一些实施方案中，所述生物缀合物包括一个或多个肽，其包括选自以下的氨基酸序列：YKSILYGSG (SEQ ID NO: 275)、LYKSILYGSG (SEQ ID NO: 276)、ELYKSILYGSG(SEQ ID NO: 277)、GELYKSILYGSG (SEQ ID NO: 278)、AGELYKSILYGSG (SEQ ID NO:279)、KAGELYKSILYGSG (SEQ ID NO: 280)、LKAGELYKSILYGSG (SEQ ID NO: 281)、ALKAGELYKSILYGSG (SEQ ID NO: 282)、AALKAGELYKSILYGSG (SEQ ID NO: 283)、NAALKAGELYKSILYGSG (SEQ ID NO: 284)、ANAALKAGELYKSILYGSG (SEQ ID NO: 285)、RANAALKAGELYKSILYGSG (SEQ ID NO: 286)、和RRANAALKAGELYKSILYGSG (SEQ ID NO:287)，或者与其具有至少约80%序列同一性、或至少约83%序列同一性、或至少约85%序列同一性、或至少约90%序列同一性、或至少约95%序列同一性、或至少约98%序列同一性的序列，只要该序列包括至少一个YKS序列。
在一些实施方案中，所述生物缀合物包括一个或多个肽，其包括选自以下的氨基酸序列：YKCILYGSG (SEQ ID NO: 288)、LYKCILYGSG (SEQ ID NO: 289)、ELYKCILYGSG(SEQ ID NO: 290)、GELYKCILYGSG (SEQ ID NO: 291)、AGELYKCILYGSG (SEQ ID NO:292)、KAGELYKCILYGSG (SEQ ID NO: 293)、LKAGELYKCILYGSG (SEQ ID NO: 294)、ALKAGELYKCILYGSG (SEQ ID NO: 295)、AALKAGELYKCILYGSG (SEQ ID NO: 296)、NAALKAGELYKCILYGSG (SEQ ID NO: 297)、ANAALKAGELYKCILYGSG (SEQ ID NO: 298)、RANAALKAGELYKCILYGSG (SEQ ID NO: 299)、和RRANAALKAGELYKCILYGSG (SEQ ID NO:300)，或者与其具有至少约80%序列同一性、或至少约83%序列同一性、或至少约85%序列同一性、或至少约90%序列同一性、或至少约95%序列同一性、或至少约98%序列同一性的序列，只要该序列包括至少一个YKC序列。
在一些实施方案中，所述生物缀合物包括一个或多个肽，其包括选自以下的氨基酸序列：YKSGSG (SEQ ID NO: 301)、LYKSGSG (SEQ ID NO: 302)、ELYKSGSG (SEQ ID NO:303)、GELYKSGSG (SEQ ID NO: 304)、AGELYKSGSG (SEQ ID NO: 305)、KAGELYKSGSG (SEQID NO: 306)、LKAGELYKSGSG (SEQ ID NO: 307)、ALKAGELYKSGSG (SEQ ID NO: 308)、AALKAGELYKSGSG (SEQ ID NO: 309)、NAALKAGELYKSGSG (SEQ ID NO: 310)、ANAALKAGELYKSGSG (SEQ ID NO: 311)、RANAALKAGELYKSGSG (SEQ ID NO: 312)、和RRANAALKAGELYKSGSG (SEQ ID NO: 313)，或者与其具有至少约80%序列同一性、或至少约83%序列同一性、或至少约85%序列同一性、或至少约90%序列同一性、或至少约95%序列同一性、或至少约98%序列同一性的序列，只要该序列包括至少一个YKS序列。
在一些实施方案中，所述生物缀合物包括一个或多个肽，其包括选自以下的氨基酸序列：YKCGSG (SEQ ID NO: 314)、LYKCGSG (SEQ ID NO: 315)、ELYKCGSG (SEQ ID NO:316)、GELYKCGSG (SEQ ID NO: 317)、AGELYKCGSG (SEQ ID NO: 318)、KAGELYKCGSG (SEQID NO: 319)、LKAGELYKCGSG (SEQ ID NO: 320)、ALKAGELYKCGSG (SEQ ID NO: 321)、AALKAGELYKCGSG (SEQ ID NO: 322)、NAALKAGELYKCGSG (SEQ ID NO: 323)、ANAALKAGELYKCGSG (SEQ ID NO: 324)、RANAALKAGELYKCGSG (SEQ ID NO: 325)、和RRANAALKAGELYKCGSG (SEQ ID NO: 326)，或者与其具有至少约80%序列同一性、或至少约83%序列同一性、或至少约85%序列同一性、或至少约90%序列同一性、或至少约95%序列同一性、或至少约98%序列同一性的序列，只要该序列包括至少一个YKC序列。
在一些实施方案中，所述生物缀合物包括一个或多个肽，其包括选自以下的氨基酸序列：AYKSGSG (SEQ ID NO: 327)、RAYKSGSG (SEQ ID NO: 328)、LRAYKSGSG (SEQ IDNO: 329)、NLRAYKSGSG (SEQ ID NO: 330)、LNLRAYKSGSG (SEQ ID NO: 331)、RLNLRAYKSGSG (SEQ ID NO: 332)、ARLNLRAYKSGSG (SEQ ID NO: 333)、LARLNLRAYKSGSG(SEQ ID NO: 334)、ILARLNLRAYKSGSG (SEQ ID NO: 335)、AILARLNLRAYKSGSG (SEQ IDNO: 336)、EAILARLNLRAYKSGSG (SEQ ID NO: 337)、AEAILARLNLRAYKSGSG (SEQ ID NO:338)、KAEAILARLNLRAYKSGSG (SEQ ID NO: 339)、GKAEAILARLNLRAYKSGSG (SEQ ID NO:340)、和YGKAEAILARLNLRAYKSGSG (SEQ ID NO: 341)，或者与其具有至少约80%序列同一性、或至少约83%序列同一性、或至少约85%序列同一性、或至少约90%序列同一性、或至少约95%序列同一性、或至少约98%序列同一性的序列，只要该序列包括至少一个YKS序列。
在一些实施方案中，所述生物缀合物包括一个或多个肽，其包括选自以下的氨基酸序列：AYKCGSG (SEQ ID NO: 342)、RAYKCGSG (SEQ ID NO: 343)、LRAYKCGSG (SEQ IDNO: 344)、NLRAYKCGSG (SEQ ID NO: 345)、LNLRAYKCGSG (SEQ ID NO: 346)、RLNLRAYKCGSG (SEQ ID NO: 347)、ARLNLRAYKCGSG (SEQ ID NO: 348)、LARLNLRAYKCGSG(SEQ ID NO: 349)、ILARLNLRAYKCGSG (SEQ ID NO: 350)、AILARLNLRAYKCGSG (SEQ IDNO: 351)、EAILARLNLRAYKCGSG (SEQ ID NO: 352)、AEAILARLNLRAYKCGSG (SEQ ID NO:353)、KAEAILARLNLRAYKCGSG (SEQ ID NO: 354)、GKAEAILARLNLRAYKCGSG (SEQ ID NO:355)、和YGKAEAILARLNLRAYKCGSG (SEQ ID NO: 356)，或者与其具有至少约80%序列同一性、或至少约83%序列同一性、或至少约85%序列同一性、或至少约90%序列同一性、或至少约95%序列同一性、或至少约98%序列同一性的序列，只要该序列包括至少一个YKC序列。
在一些实施方案中，所述生物缀合物包括一个或多个肽，其包括氨基酸序列GAHWQFNALTVRGSG (SEQ ID NO: 357)，或者与其具有至少约80%序列同一性、或至少约83%序列同一性、或至少约85%序列同一性、或至少约90%序列同一性、或至少约95%序列同一性、或至少约98%序列同一性的序列，只要该序列以小于约1 mM的解离常数(K d )结合至透明质酸。
在一些实施方案中，所述生物缀合物包括一个或多个肽，其包括氨基酸序列STMMSRSHKTRSHHVGSG (SEQ ID NO: 358)，或者与其具有至少约80%序列同一性、或至少约83%序列同一性、或至少约85%序列同一性、或至少约90%序列同一性、或至少约95%序列同一性、或至少约98%序列同一性的序列，只要该序列以小于约1 mM的解离常数(K d )结合至透明质酸。
在一些实施方案中，对于透明质酸具有特定结合亲和力的一种或多种肽可用于本文所述的生物缀合物中。进一步地，本文使用的肽可以包含多于一个透明质酸结合单元，其中所述结合单元可以是相同的或不同的。
另外，在一些实施方案中，所述生物缀合物包含一个或多个肽，其包括至少一个透明质酸结合单元和至少一个胶原结合单元。在一个实施方案中，所述生物缀合物包括一个或多个肽，其包括至少一个透明质酸结合单元和至少一个胶原结合单元，其中胶原结合单元结合至I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、或XIV型胶原中的一个或多个。
本发明还涉及含有1至约50个肽的生物缀合物，所述肽包括选择素、ICAM和/或VCAM结合单元。所述肽通过酰肼-羰基键缀合至聚糖（例如糖胺聚糖或GAG，例如硫酸皮肤素），并且生物缀合物还可以包含1至约3个疏水尾部（例如烷基尾部）。
这种生物缀合物可以保护血管的内皮细胞衬里免受损伤、尿毒症、氧化应激和炎症。所述生物缀合物可以形成S/E选择素结合和ICAM结合的抗中性粒细胞/单核细胞腔内衬（即EC-SEAL），其特别可用于保护手术受影响的血管以及导管化血管的内皮细胞衬里。
本文所述的生物缀合物可以包含一种或多种类型的肽，使得生物缀合物能够结合选择素、ICAM和/或VCAM。例如，本文包括包含选择素结合肽和ICAM结合肽的生物缀合物。还包括包含选择素结合肽和VCAM结合肽的生物缀合物、或包含ICAM结合肽和VCAM结合肽的生物缀合物。另外，所述肽可以在单个肽内包含一个或多个选择素、ICAM和/或VCAM结合单元（或序列）。相应地，在一个实施方案中，本文公开的是包含具有选择素结合单元和ICAM结合单元的肽的生物缀合物。还包括包含具有选择素结合单元和VCAM结合单元的肽的生物缀合物。还包括包含ICAM结合单元和VCAM结合单元的生物缀合物缀合物。
在一些实施方案中，所述生物缀合物包括选自以下的一个或多个肽或结合单元：IELLQAR (SEQ ID NO: 117)、IELLQARGSC (SEQ ID NO: 118)、IDLMQAR (SEQ ID NO:119)、IDLMQARGSC (SEQ ID NO: 120)、QITWAQLWNMMK (SEQ ID NO: 121)、和QITWAQLWNMMKGSC (SEQ ID NO: 122)、或其组合。
在其他实施方案中，所述生物缀合物包含一个或多个含有选择素结合单元的肽，例如是选自以下的一个或多个： LRRASLGDGDITWDQLWDLMK (SEQ ID NO: 123)、HITWDQLWNVMN (SEQ ID NO: 124)、QITWAQLWNMMK (SEQ ID NO: 121)、YGNSNITWDQLWSIMNRQTT (SEQ ID NO: 125)、WTDTHITWDQLWHFMNMGEQ (SEQ ID NO: 126)、EPWDQITWDQLWIIMNNGDG (SEQ ID NO: 127)、HITWDQLWLMMS (SEQ ID NO: 128)、DLTWEGLWILMT (SEQ ID NO: 129)、RGVWGGLWSMTW (SEQ ID NO: 130)、DYSWHDLWFMMS (SEQID NO: 131)、KKEDWLALWRIMSVPDEN (SEQ ID NO: 132)、RNMSWLELWEHMK (SEQ ID NO:133)、KEQQWRNLWKMMS (SEQ ID NO: 134)、SQVTWNDLWSVMNPEVVN (SEQ ID NO: 135)、RSLSWLQLWDWMK (SEQ ID NO: 136)、DITWDQLWDLMK (SEQ ID NO: 137) DITWDELWKIMN(SEQ ID NO: 138)、DYTWFELWDMMQ (SEQ ID NO: 139)、DMTHDLWLTLMS (SEQ ID NO: 140)、EITWDQLWEVMN (SEQ ID NO: 141)、HVSWEQLWDIMN (SEQ ID NO: 142)、HITWDQLWRIMT (SEQID NO: 143)、DISWDDLWIMMN (SEQ ID NO: 144)、QITWDQLWDLMY (SEQ ID NO: 145)、RNMSWLELWEHMK (SEQ ID NO: 133)、AEWTWDQLWHVMNPAESQ (SEQ ID NO: 146)、HRAEWLALWEQMSP (SEQ ID NO: 147)、KKEDWLALWRIMSV (SEQ ID NO: 148)、KRKQWIELWNIMS(SEQ ID NO: 149)、WKLDTLDMIWQD (SEQ ID NO: 150)和HITWDQLWNVMLRRAASLG (SEQ IDNO: 151)、或其组合。
在其他实施方案中，所述生物缀合物包含一个或多个含有ICAM结合单元的肽。相应地，在一些实施方案中，所述生物缀合物包含一个或多个选自以下的ICAM结合单元：NAFKILVVITFGEK (SEQ ID NO: 152)、NAFKILVVITFGEKGSC (SEQ ID NO: 153)；ITDGEA(SEQ ID NO: 154)、ITDGEAGSC (SEQ ID NO: 155)、DGEATD (SEQ ID NO: 156)、和DGEATDGSC (SEQ ID NO: 157)、或其组合。显示具有可用于本文公开的生物缀合物和方法的ICAM结合亲和力（或ICAM结合单元）的其他肽序列包括但不限于：EWCEYLGGYLRYCA (SEQID NO: 158)、FEGFSFLAFEDFVSSI (SEQ ID NO: 159)、NNQKIVNLKEKVAQLEA (SEQ ID NO:160)、NNQKIVNIKEKVAQIEA (SEQ ID NO: 161)、NNQKLVNIKEKVAQIEA (SEQ ID NO: 162)、YPASYQR (SEQ ID NO: 163)、YQATPLP (SEQ ID NO: 164)、GSLLSAA (SEQ ID NO: 165)、FSPHSRT (SEQ ID NO: 166)、YPFLPTA (SEQ ID NO: 167)、GCKLCAQ (SEQ ID NO: 168)、GGTCGGGGTGAGTTTCGTGGTAGGGATAATTCTGTTTGGGTGGTT (SEQ ID NO: 169)、EWCEYLGGYLRCYA(SEQ ID NO: 170)、GRGEFRGRDNSVSVV (SEQ ID NO: 171)、QTSVSPSKVI (SEQ ID NO:172)、PSKVILPRGG (SEQ ID NO: 173)、LPRGGSVLVTG (SEQ ID NO: 174)、和QTSVSPSKVILPRGGSVLVTG (SEQ ID NO: 175)、或其组合。
在其他实施方案中，所述生物缀合物包含一个或多个含有VCAM结合单元的肽。在一些实施方案中，所述VCAM结合单元选自YRLAIRLNER (SEQ ID NO: 176)、YRLAIRLNERRENLRIALRY (SEQ ID NO: 177)和RENLRIALRY (SEQ ID NO: 178)、或其组合。
在一个实施方案中，所述生物缀合物包含一个或多个VCAM结合、ICAM结合和/或选择素结合的肽。在一些实施方案中，所述生物缀合物包含一个或多个ICAM结合肽和一个或多个选择素结合肽。在一个实施方案中，所述生物缀合物包含含有一个或多个VCAM结合单元、ICAM结合单元和/或选择素结合单元的肽。在一些实施方案中，所述生物缀合物包含含有一个或多个ICAM结合单元和一个或多个选择素结合单元的肽。
根据生物缀合物的期望性质，键合至聚糖的肽的总数可以变化。在一些实施方案中，存在于生物缀合物中的肽的总数是约1至约50、或约1至约40、或约1至约30、或约1至约25、或约2至约30、或约2至约25、或约3至约25、或约4至约25、或约5至约25、或约5至约30、或约1至约25、或约2至约25、或约11至约14、或约1至约8、或约1至约5、或约1、或约2、或约3、或约4、或约5、或约6、或约7、或约8个肽。在一些实施方案中，所述生物缀合物包括约10至约40个肽。在其他实施方案中，所述生物缀合物包括约5至约30个肽。在一些实施方案中，所述生物缀合物包括少于约20个肽。在一些实施方案中，所述生物缀合物包括少于约18个肽。在各种实施方案中，所述生物缀合物包括约4至约18个肽。在一些实施方案中，所述生物缀合物包括少于约15个肽。在一些实施方案中，所述生物缀合物包括少于约10个肽。在一些实施方案中，所述生物缀合物包括少于约30个肽。在一些实施方案中，所述生物缀合物包括少于约25个肽。在一些实施方案中，所述生物缀合物包括约5至约40、或约10至约40、或约5至约20、或约4至约18、或约10、或约11、或约18、或约20个肽、或约25个肽、或约30个肽、或约40个肽、或约50个肽。
如本文所述的肽进一步包含用于缀合至肽的酰肼部分。酰肼基团可以在任何合适的连接点，例如C-端、N-端或通过氨基酸上的侧链，结合至肽。例如，当肽通过肽的氨基酸的侧链结合至聚糖时，该侧链是谷氨酸或天冬氨酸。可以在结合至肽序列中的氨基酸上存在的羰基（例如C端羰基）的肼（-NHNH2）之间形成酰肼。
在一些实施方案中，酰肼基团通过间隔物键合至肽。所述间隔物可以是任何适当官能化的线性或分支的部分，并且通常具有约4至约100个原子。在一个实施方案中，所述间隔物包含一个或多个、或者1至10、或者1至5、或者1至3个氨基酸。所述氨基酸可以是任何氨基酸，并且在一些情况下是非极性氨基酸，例如丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。在一些实施方案中，所述氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、精氨酸和丝氨酸。在一个实施方案中，所述间隔物选自甘氨酸、甘氨酸-甘氨酸、甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸、精氨酸-精氨酸、精氨酸-甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸和赖氨酸-甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸。所述间隔物还可以包含非氨基酸部分，例如聚乙二醇（PEG）、6-氨基己酸、琥珀酸、或其组合，并具有或不具有额外的氨基酸间隔物。在一些实施方案中，本文所述的肽序列还包含GSG-NHNH2部分。 通常，GSG-NHNH2部分结合至C-或N-末端。
在一些实施方案中，间隔物包含多于一个结合位点（可以是线性的或分支的），使得多于一个的肽序列可以与其结合，从而产生分支的构建体。此外，由于肽可以通过末端或非末端氨基酸部分结合至聚糖，所以当通过非末端氨基酸部分结合至聚糖时，肽将被分支。间隔物上的结合位点可以是相同的或不同的，并且可以是任何合适的结合位点，例如胺或羧酸部分，从而可以将所需的肽序列结合到其上（例如通过酰胺键）。因此，在一些实施方案中，间隔物含有一个或多个赖氨酸、谷氨酸或天冬氨酸残基。这样的构建体可以提供具有式PnL的多于一个胶原和/或透明质酸结合单元的肽，其中P是胶原和/或透明质酸结合单元，L是间隔物，n是2至约10、或2至8、或2至6、或25、或2至4、或2、或3、或4、或5、或6、或7、或8、或9、或10的整数。例如，间隔物L可以是例如KGSG (SEQ ID NO: 359)、KKGSG (SEQ ID NO:360)或KKKGSG (SEQ ID NO: 361)等的氨基酸序列序列，分别提供2、3或4个结合位点。
在一些实施方案中，间隔物或其组合可以被用来产生进一步的分支。例如，间隔物可以包含一个或多个含有能够连接另外的肽或胶原结合单元的侧链的氨基酸。用于包含在这样的间隔物中的示例性氨基酸包括但不限于赖氨酸、谷氨酸、天冬氨酸等。在一些实施方案中，间隔字包含2至6个氨基酸、或3或4个氨基酸。在一些实施方案中，间隔物包含一个或多个式KXX的氨基酸序列，其中每个X独立地是天然或非天然的氨基酸。可以单独或组合使用以制备分支构建体的间隔物的具体实施例包括但不限于KRR、KKK、(K)nGSG、和(KRR)n-KGSG，其中n是0至5、或1、2、3、4、或5。在一个实施方案中，所述间隔物是GSGKRRGSG (SEQ IDNO: 362)。
在下表中显示了结合至肽的这些间隔物的示意图。
示例性的胶原结合构建体包括但不限于(GELYKSILYGSG)2K (SEQ ID NO: 363)、(GELYKSILYGSG)2KGSG (SEQ ID NO: 364)、(GELYKSILYGSG)3KK (SEQ ID NO: 365)、(GELYKSILYGSG)3KKGSG (SEQ ID NO: 366)、(GELYKSILYGSG)4KKK (SEQ ID NO: 367)、(GELYKSILYGSG)4KKKGSG (SEQ ID NO: 368)、(GQLYKSILYGSG)2K (SEQ ID NO: 369)、(GQLYKSILYGSG)2KGSG (SEQ ID NO: 370)、(GQLYKSILYGSG)3KK (SEQ ID NO: 371)、(GQLYKSILYGSG)3KKGSG (SEQ ID NO: 372)、(GQLYKSILYGSG)4K2K (SEQ ID NO: 373)、(GQLYKSILYGSG)4K2KGSG (SEQ ID NO: 374)、(GQLYKSILYGSG)4KKK (SEQ ID NO: 375)、(GQLYKSILYGSG)4KKKGSG (SEQ ID NO: 376)、(GQLYKSILYGSG)4-(KRR)2-K (SEQ ID NO:377)、和(GQLYKSILYGSG)4-(KRR)2-KGSG (SEQ ID NO: 378)。
在一些实施方案中，酰肼基团键合至肽N末端。在一些实施方案中，酰肼基团键合至肽C末端。在一些实施方案中，酰肼基团键合至肽中的氨基酸的侧链，例如谷氨酸和/或天冬氨酸。在一些实施方案中，酰肼基团通过间隔物键合至肽C末端。间隔物可以通过任何合适的键键合至肽。在一些实施方案中，间隔物通过酰胺键键合至肽。
在一个实施方案中，酰肼基团通过间隔物键合至C末端，所述间隔物包含选自甘氨酸、丙氨酸、精氨酸和丝氨酸中的一种或多种氨基酸。在一个实施方案中，所述间隔物选自甘氨酸、甘氨酸-甘氨酸、和甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸。在各种实施方案中，所述肽包含氨基酸间隔物，例如甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸（GSG）、KRRGSG (SEQ ID NO: 384)、或GSGKRRGSG (SEQID NO: 362)。
在本文描述的实施方案的任一个中，每个聚糖的肽的数量是平均的，其中组合物中的某些生物缀合物可能每个聚糖具有更多的肽，并且某些生物缀合物每个聚糖具有更少的肽。相应地，在一些实施方案中，如本文所述的肽的数量是生物缀合物的组合物中的平均数。例如，在一些实施方案中，生物缀合物是这样的组合物，其中每个聚糖的肽的平均数为约5。在其他实施方案中，每个聚糖的肽的平均数为约6、或约7、或约8、或约9、或约10、或约11、或约12、或约13、或约14、或约15、或约16、或约17、或约18、或约19、或约20、或约25、或约30。
在一些实施方案中，根据用聚糖骨架上的肽官能化的二糖单元的百分比，可以将每个聚糖的肽的数量描述为“官能化百分比（％）”。例如，可以通过将单个二糖单元的分子量（或平均分子量）（例如约550-800 Da、或约650-750 Da ）除以聚糖的分子量（例如约25kDa至约70 kDa、或甚至约100 kDa），计算存在于聚糖上的可用的二糖单元的总数。在聚糖不含有常规的“二糖单元”（例如海藻酸）的实施方案中，可以通过将单个糖单元的分子量（或平均分子量）除以聚糖的分子量，并乘以2，计算用于本文所示的计算中的聚糖上存在的可用的二糖单元的总数。
在一些实施方案中，存在于聚糖上的可用的二糖单元的数量为约10至约80、或约10至约70、或约15至约70、或约20至约70、或约30至约70、或约35至约70、或约40至约70、或约10至约75、或约15至约75、或约20至约75、或约30至约75、或约35至约75、或约40至约75、或约10至约50、或约20至约50、或约25至约50、或约10至约35、或约15至约35、或约20至约35、或约10至约30、或约15至约30、或约20至约30、或约15、或约20、或约25、或约30、或约35、或约40、或约45、或约50、或约55、或约60、或约65、或约70。
因此，在一些实施方案中，所述聚糖含有约1至约50、或约5至约30％的官能化、或约25％的官能化，其中由聚糖上被肽官能化的二糖单元的百分比确定官能化的百分比（％）。在一些实施方案中，聚糖的官能化的百分比（％）是约1%至约50%、或约3%至约40%、或约5%至约30%、或约10%至约20%、或约1%、或约2%、或约5%、或约10%、或约15%、或约20%、或约25%、或约30%、或约35%、或约40%、或约45%、或约50%、或约55%、或约60%、或约65%、或约70%、或约75%、或约80%、或约85%、或约90%、或约95%、或约100%。
在一些实施方案中，本文提供了一种组合物，其包含如本文所述的生物缀合物和肽，其中所述肽与生物缀合物紧密相关（例如通过离子键）。 在一些实施方案中，由此可以形成生物缀合物聚集体。预期的是，生物缀合物聚集体（包含生物缀合物和非共价结合的肽）可以包含1％至200％官能化（由聚糖上被肽官能化的二糖单元的百分比确定）。在一些实施方案中，所述生物缀合物的官能化的百分比（％）是约1%至约50%、或约3%至约40%、或约5%至约30%、或约10%至约20%、或约1%、或约2%、或约5%、或约10%、或约15%、或约20%、或约25%、或约30%、或约35%、或约40%、或约45%、或约50%、或约55%、或约60%、或约65%、或约70%、或约75%、或约80%、或约85%、或约90%、或约95%、或约100%。
预期的是，任何聚糖都可用于本文所述的各种实施方案中，包括但不限于藻酸盐、琼脂糖、葡聚糖、硫酸葡聚糖、软骨素、硫酸软骨素（CS）、皮肤素、硫酸皮肤素（DS）、硫酸乙酰肝素 、肝素（Hep）、角蛋白、硫酸角质素和透明质酸（HA）。所述聚糖可以是天然存在的或化学衍生的，例如但不限于部分N-脱硫酸衍生物、部分O-脱硫酸衍生物、和/或部分O-羧甲基化衍生物。
在一些实施方案中，所述聚糖是未经修饰的。在一些实施方案中，所述聚糖不含有氧化裂解的糖环，因此不含有醛官能团。预期的是，本文公开的生物缀合物表现出的有益效果可以至少部分归因于所述聚糖不包含氧化切割的糖环。例如，与本领域已知的透明质酸结合的生物缀合物相比，本文公开的具有透明质酸结合单元的生物缀合物表现出增加的结合亲和力（参见例如实施例5）。
这样的连接可以来源于将肽上的酰肼基团与聚糖上的羰基基团（例如羧酸基团或其活化的衍生物）结合，或替代地将聚糖上的酰肼基团与肽上的羰基基团（例如羧酸基团或其活化的衍生物）结合。在一些实施方案中，酰肼-羰基键位于肽上的的末端酰肼基团和聚糖上的羰基基团之间。
在一个实施方案中，所述聚糖是肝素，其中肝素可以包括肝素衍生物，例如但不限于部分N-和/或部分O-脱硫酸化的肝素衍生物、部分O-羧甲基化的肝素衍生物、或其组合。在一些实施方案中，所述肝素是非氧化的肝素（即不含氧化裂解的糖环）并且不含醛官能团。肝素衍生物和/或提供肝素衍生物（例如部分N-脱硫酸肝素和/或部分O-脱硫酸肝素（即2-O和/或6-O-脱硫酸肝素））的方法，在本领域中是已知的（参见例如Kariya et al., J.Biol. Chem., 2000, 275:25949-5958；Lapierre, et al. Glycobiology, 1996, 6(3):355-366）。还考虑的是，部分O-羧甲基化肝素（或任何聚糖）衍生物，例如可以根据Prestwich等人（US 2012/0142907；US 2010/0330143）制备的，可用于提供本文公开的生物缀合物。
在一些实施方案中，改变聚糖的分子量以调节生物缀合物的作用（参见例如Radek, K. A., et al., Wound Repair Regen., 2009, 17: 118-126；和Taylor, K. R.,et al., J. Biol. Chem., 2005, 280:5300-5306）。在另一个实施方案中，通过氧化和碱性消除将聚糖降解（参见例如Fransson, L. A., et al., Eur. J. Biochem., 1980, 106:59-69）以提供具有较低分子量（例如约10 kDa至约50 kDa）的降解聚糖。
在一个实施方案中，所述聚糖是硫酸皮肤素（DS）。DS的生物功能是广泛的，包括生长因子FGF-2、FGF-7和FGF-10的结合和活化，其促进内皮细胞和角质形成细胞增殖和迁移。在一些实施方案中，硫酸皮肤素的重量范围为约10 kDa至约70 kDa。 在一个实施方案中，硫酸皮肤素的分子量约为46 kDa。在另一个实施方案中，通过氧化和碱性消除将硫酸皮肤素降解（参见例如Fransson, L. A., et al., Eur. J. Biochem., 1980, 106 :59-69）以提供具有较低分子量（例如约10 kDa）的降解的硫酸皮肤素。
在另一个实施方案中，所述聚糖是肝素。肝素的各种分子量可以用于本文所述的生物缀合物中，例如从约650-700 Da的单个二糖单元至约5 0kDa。在一些实施方案中，所述肝素为约10至约20 kDa。在一些实施方案中，所述肝素高达约15、或约16、或约17、或约18、或约19、或约20 kDa。在一些实施方案中，肝素可以在不切割一个或多个糖环的条件下被氧化（参见例如Wang, et al. Biomacromolecules 2013, 14(7):2427-2432）。
在一个实施方案中，所述生物缀合物包括聚糖和约5至约10、或约7个肽，其中所述肽包括GELYKSILY (SEQ ID NO: 2)或GELYKSILYGSG (SEQ ID NO: 278)的至少一个序列，并且通过酰肼-羰基键被结合至所述聚糖。在一些实施方案中，所述酰肼-羰基键位于肽上的末端酰肼基团和聚糖上的羰基基团之间。在一个实施方案中，所述聚糖是肝素。在一些实施方案中，所述肝素不含有氧化裂解的糖环，因此不含醛官能团。
在一个实施方案中，所述生物缀合物包括聚糖和约20个肽，其中所述肽包括GELYKSILY (SEQ ID NO: 2)或GELYKSILYGSG (SEQ ID NO: 278)的至少一个序列，并且通过酰肼-羰基键被结合至所述聚糖。在一些实施方案中，所述酰肼-羰基键位于肽上的末端酰肼基团和聚糖上的羰基基团之间。在一个实施方案中，所述聚糖是硫酸皮肤素。在一些实施方案中，所述硫酸皮肤素不含有氧化裂解的糖环，因此不含醛官能团。
在一个实施方案中，所述生物缀合物包括聚糖和约5至约10、或约7个肽，其中所述肽包括GQLYKSILY (SEQ ID NO: 16)或GQLYKSILYGSG (SEQ ID NO: 387)的至少一个序列，并且通过酰肼-羰基键被结合至所述聚糖。在一些实施方案中，所述酰肼-羰基键位于肽上的末端酰肼基团和聚糖上的羰基基团之间。在一个实施方案中，所述聚糖是肝素。在一些实施方案中，所述肝素不含有氧化裂解的糖环，因此不含醛官能团。
在一个实施方案中，所述生物缀合物包括聚糖和约20个肽，其中所述肽包括GQLYKSILY (SEQ ID NO: 16)或GQLYKSILYGSG (SEQ ID NO: 387)的至少一个序列，并且通过酰肼-羰基键被结合至所述聚糖。在一些实施方案中，所述酰肼-羰基键位于肽上的末端酰肼基团和聚糖上的羰基基团之间。在一个实施方案中，所述聚糖是硫酸皮肤素。在一些实施方案中，所述硫酸皮肤素不含有氧化裂解的糖环，因此不含醛官能团。
在一个实施方案中，所述生物缀合物包括聚糖和约5至约10、或约7个肽，其中所述肽包括RRANAALKAGELYKSILY (SEQ ID NO: 1)或RRANAALKAGELYKSILYGSG (SEQ ID NO:287)的至少一个序列，并且通过酰肼-羰基键被结合至所述聚糖。在一些实施方案中，所述酰肼-羰基键位于肽上的末端酰肼基团和聚糖上的羰基基团之间。在一个实施方案中，所述聚糖是肝素。在一些实施方案中，所述肝素不含有氧化裂解的糖环，因此不含醛官能团。
在一个实施方案中，所述生物缀合物包括聚糖和约20个肽，其中所述肽包括RRANAALKAGELYKSILY (SEQ ID NO: 1)或RRANAALKAGELYKSILYGSG (SEQ ID NO: 287)的至少一个序列，并且通过酰肼-羰基键被结合至所述聚糖。在一些实施方案中，所述酰肼-羰基键位于肽上的末端酰肼基团和聚糖上的羰基基团之间。在一个实施方案中，所述聚糖是硫酸皮肤素。在一些实施方案中，所述硫酸皮肤素不含有氧化裂解的糖环，因此不含醛官能团。
在一个实施方案中，所述生物缀合物不是包含硫酸皮肤素和约1至约50个肽的生物缀合物，所述肽包含RRANAALKAGELYKSILY (SEQ ID NO: 1)、RRANAALKAGELYKSILYGC(SEQ ID NO: 388)或RRANAALKAGELYKSILYGSG (SEQ ID NO: 287)的至少一个序列，其中所述肽通过酰肼-羰基键被结合至所述聚糖。
在一个实施方案中，所述生物缀合物包括聚糖和约5至约10、或约7个肽，其中所述肽包括RRANAALKAGQLYKSILY (SEQ ID NO: 17)或RRANAALKAGQLYKSILYGSG (SEQ ID NO:389)的至少一个序列，并且通过酰肼-羰基键被结合至所述聚糖。在一些实施方案中，所述酰肼-羰基键位于肽上的末端酰肼基团和聚糖上的羰基基团之间。在一个实施方案中，所述聚糖是肝素。在一些实施方案中，所述肝素不含有氧化裂解的糖环，因此不含醛官能团。
在一个实施方案中，所述生物缀合物包括聚糖和约20个肽，其中所述肽包括RRANAALKAGQLYKSILY (SEQ ID NO: 17)或RRANAALKAGQLYKSILYGSG (SEQ ID NO: 389)的至少一个序列，并且通过酰肼-羰基键被结合至所述聚糖。在一些实施方案中，所述酰肼-羰基键位于肽上的末端酰肼基团和聚糖上的羰基基团之间。在一个实施方案中，所述聚糖是硫酸皮肤素。在一些实施方案中，所述硫酸皮肤素不含有氧化裂解的糖环，因此不含醛官能团。
在一个实施方案中，所述生物缀合物包括聚糖和约1至约5、或约1至2个肽，其中所述肽包括(GQLYKSILY)4-(KRR)2-K (SEQ ID NO: 390)、(GQLYKSILYGSG)4-(KRR)2-KGSG(SEQ ID NO: 378)或(GQLYKSILY)4-(KRR)2-KGSG (SEQ ID NO: 391)，并且通过酰肼-羰基键被结合至所述聚糖。在一些实施方案中，所述酰肼-羰基键位于肽上的末端酰肼基团和聚糖上的羰基基团之间。在一个实施方案中，所述聚糖是肝素。在一些实施方案中，所述肝素不含有氧化裂解的糖环，因此不含醛官能团。
在一个实施方案中，所述生物缀合物包括聚糖和约5至约10个肽，其中所述肽包括GAHWQFNALTVR (SEQ ID NO: 58)或GAHWQFNALTVRGSG (SEQ ID NO: 357)的至少一个序列，并且通过酰肼-羰基键被结合至所述聚糖。在一些实施方案中，所述酰肼-羰基键位于肽上的末端酰肼基团和聚糖上的羰基基团之间。在一个实施方案中，所述聚糖是硫酸软骨素。在一些实施方案中，所述硫酸软骨素不含有氧化裂解的糖环，因此不含醛官能团。
在一个实施方案中，所述生物缀合物包括聚糖和约5至约10个肽，其中所述肽包括STMMSRSHKTRSHHV (SEQ ID NO: 59)或STMMSRSHKTRSHHVGSG (SEQ ID NO: 358)的至少一个序列，并且通过酰肼-羰基键被结合至所述聚糖。在一些实施方案中，所述酰肼-羰基键位于肽上的末端酰肼基团和聚糖上的羰基基团之间。在一个实施方案中，所述聚糖是硫酸软骨素。在一些实施方案中，所述硫酸软骨素不含有氧化裂解的糖环，因此不含醛官能团。
在一个实施方案中，所述生物缀合物包括聚糖和约1至约20个肽，其中所述肽包括GAHWQFNALTVR (SEQ ID NO: 58)或GAHWQFNALTVRGSG (SEQ ID NO: 357)的至少一个序列、以及WYRGRL (SEQ ID NO: 29)或WYRGRLGSG (SEQ ID NO: 392)的至少一个序列，并且通过酰肼-羰基键被结合至所述聚糖。在一个实施方案中，所述聚糖是硫酸软骨素。在一些实施方案中，所述硫酸软骨素不含有氧化裂解的糖环，因此不含醛官能团。
在一个实施方案中，所述生物缀合物包括聚糖和约1至约20个肽，其中所述肽包括GAHWQFNALTVR (SEQ ID NO: 58)或GAHWQFNALTVRGSG (SEQ ID NO: 357)的至少一个序列、以及RRANAALKAGELYKSILY (SEQ ID NO: 1)或RRANAALKAGELYKSILYGSG (SEQ ID NO: 287)的至少一个序列，并且通过酰肼-羰基键被结合至所述聚糖。在一个实施方案中，所述聚糖是硫酸软骨素。在一些实施方案中，所述硫酸软骨素不含有氧化裂解的糖环，因此不含醛官能团。
在一个实施方案中，所述生物缀合物包括聚糖和约5至约15个肽，其中所述肽包括IELLQAR (SEQ ID NO: 117)或IELLQARGSG (SEQ ID NO: 393)的至少一个序列，并且通过酰肼-羰基键被结合至所述聚糖。在一些实施方案中，所述酰肼-羰基键位于肽上的末端酰肼基团和聚糖上的羰基基团之间。在一个实施方案中，所述聚糖是硫酸皮肤素。在一些实施方案中，所述硫酸皮肤素不含有氧化裂解的糖环，因此不含醛官能团。
在一个实施方案中，所述生物缀合物包括聚糖和约5至约15个肽，其中所述肽包括IDLMQAR (SEQ ID NO: 119)或IDLMQARGSG (SEQ ID NO: 394)的至少一个序列，并且通过酰肼-羰基键被结合至所述聚糖。在一些实施方案中，所述酰肼-羰基键位于肽上的末端酰肼基团和聚糖上的羰基基团之间。在一个实施方案中，所述聚糖是硫酸皮肤素。在一些实施方案中，所述硫酸皮肤素不含有氧化裂解的糖环，因此不含醛官能团。
在一个实施方案中，所述生物缀合物包括聚糖和约5至约15个肽，其中所述肽包括ITDGEA (SEQ ID NO: 154)和/或ITDGEAGSG (SEQ ID NO: 395)的至少一个序列，并且通过酰肼-羰基键被结合至所述聚糖。在一些实施方案中，所述酰肼-羰基键位于肽上的末端酰肼基团和聚糖上的羰基基团之间。在一个实施方案中，所述聚糖是硫酸皮肤素。在一些实施方案中，所述硫酸皮肤素不含有氧化裂解的糖环，因此不含醛官能团。
在一个实施方案中，所述生物缀合物包括聚糖和约5至约15个肽，其中所述肽包括DGEATD (SEQ ID NO: 156)和/或DGEATDGSG (SEQ ID NO: 396)的至少一个序列，并且通过酰肼-羰基键被结合至所述聚糖。在一些实施方案中，所述酰肼-羰基键位于肽上的末端酰肼基团和聚糖上的羰基基团之间。在一个实施方案中，所述聚糖是硫酸皮肤素。在一些实施方案中，所述硫酸皮肤素不含有氧化裂解的糖环，因此不含醛官能团。
在一个实施方案中，所述生物缀合物包括聚糖和约5至约15个肽，其中所述肽包括DGEATD (SEQ ID NO: 156)、DGEATDGSG (SEQ ID NO: 396)、ITDGEA (SEQ ID NO: 154)和/或ITDGEAGSG (SEQ ID NO: 395)的至少一个序列、和IELLQAR (SEQ ID NO: 117)、IELLQARGSG (SEQ ID NO: 393)、IDLMQAR (SEQ ID NO: 119)、和/或IDLMQARGSG (SEQ IDNO: 394) 的至少一个序列，并且通过酰肼-羰基键被结合至所述聚糖。在一些实施方案中，所述酰肼-羰基键位于肽上的末端酰肼基团和聚糖上的羰基基团之间。在一个实施方案中，所述聚糖是硫酸皮肤素。在一些实施方案中，所述硫酸皮肤素不含有氧化裂解的糖环，因此不含醛官能团。
生物缀合物的合成
本文使用的肽可以从商业来源购买或者使用本领域公知的方法（例如化学和/或生物技术方法）部分或完全合成。在一些实施方案中，根据本领域公知的固相肽合成方案合成肽。在另一个实施方案中，根据熟知的Fmoc方案在固体支持物上合成肽，按照本领域技术人员已知的方法，用三氟乙酸从支持物上切下并通过色谱法纯化。在其他实施方案中，利用本领域技术人员熟知的生物技术方法合成肽。在一个实施方案中，通过本领域技术人员已知的重组DNA技术，将编码所需肽的氨基酸序列信息的DNA序列连接进表达质粒（例如结合用于肽的亲和纯化的亲和标签的质粒），将质粒转染进宿主生物体中进行表达，然后从宿主生物体或生长培养基中分离肽，例如通过亲和纯化。重组DNA技术方法被描述于Sambrook etal., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 3rd Edition, Cold SpringHarbor Laboratory Press, (2001)（其通过引用合并入本文中），并且对于本领域技术人员来说是熟知的。
如方案1所示，本文所述的肽可以通过羧酸部分共价结合至聚糖（例如肝素）1A以提供如本文所公开的生物缀合物1B。如在肽偶联反应中通常那样，可以使用活化剂来促进反应。合适的偶联剂（或活化剂）是本领域已知的，包括例如碳化二亚胺（例如N,N'-二环己基碳化二亚胺（DCC）、N,N'-二环戊基碳化二亚胺、N,N'-二异丙基碳化二亚胺（DIC）、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺（EDC）、N-叔丁基-N-甲基碳化二亚胺（BMC）、N-叔丁基-N-乙基碳化二亚胺（BEC）、1,3-双(2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-基甲基)碳化二亚胺（BDDC）等）、酸酐（例如对称的、混合的、或环状的酸酐）、活性酯（例如苯基活化的酯衍生物、对异羟肟酸活化酯、六氟丙酮（HFA）等）、酰基唑（使用CDI的酰基咪唑、酰基苯并三唑等）、酰基叠氮化物、酰基卤化物、磷盐（HOBt、PyBOP、HOAt等）、铵盐/脲盐（例如四甲基铵盐、双吡咯烷基铵盐、双哌啶铵盐、咪唑脲盐、嘧啶脲盐、衍生自 N,N,N’-三甲基-N’-苯基脲的脲盐、基于吗啉代的铵/脲偶联剂、锑酸盐脲盐等）、有机磷试剂（例如膦酸和磷酸衍生物）、有机硫试剂（例如磺酸衍生物）、三嗪偶联剂（例如2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪、4-（4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基）-4-甲基吗啉鎓氯化物、4-（4,6 - 二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基）-4-甲基吗啉鎓四氟硼酸盐等）、吡啶鎓偶联剂（例如Mukaiyama试剂、四氟硼酸吡啶鎓偶联剂等）、聚合物支撑的试剂（例如聚合物结合的碳化二亚胺、聚合物结合的TBTU、聚合物结合的2,4,6-三氯-1,3,5-三嗪、 聚合物结合的HOBt、聚合物结合的HOSu、聚合物结合的IIDQ、聚合物结合的EEDQ等），等等（参见例如El-Faham, et al. Chem. Rev., 2011, 111(11):6557–6602；Han, et al. Tetrahedron, 2004, 60:2447-2467）。
在一个实施方案中，肽偶联反应通过活化的聚糖中间体进行，其通过将聚糖的羧酸部分与偶联剂（例如碳化二亚胺试剂，例如但不限于N,N'-二环己基碳化二亚胺（DCC）、N,N'-二异丙基碳化二亚胺（DIC）、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺（EDC）等）反应，以形成O-酰基异脲中间体。这种碳化二亚胺化学在本领域中是公知的，并且合适的偶联剂可以从商业来源购买。将O-酰基异脲中间体与所需的肽接触产生生物缀合物。在肽之前或存在肽的情况下，可以将聚糖与活化剂接触。在一些实施方案中，在N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）或其衍生物的存在下进行反应。在一些实施方案中，肽序列可以包含反应性部分（例如酰肼官能团）以帮助与聚糖或其O-酰基异脲中间体进行偶联反应。在一些实施方案中，肽序列包括一个或多个氨基酸残基，其作为结合单元与末端氨基酸（例如终止甘氨酸）或反应性部分（即酰肼官能团）之间的间隔物。例如，可以加入丝氨酸-甘氨酸（SG）、甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸（GSG）或甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸（GSGSG）间隔物以提供聚糖的连接点。另外，在肽中的一个或多个氨基酸含有反应性官能团（例如羧酸侧链）的某些情况下，可以使用标准的保护基团化学来保护一个或多个侧链以促进偶联反应。另外，也可以单独使用非氨基酸间隔物、或与氨基酸间隔物（例如氨基己酸）组合使用。
方案1.生物缀合物的合成
在一些实施方案中，生物缀合物衍生自修饰的聚糖衍生物（例如肝素）（方案2）。 适用于本文所述生物缀合物的各种聚糖衍生物是本领域已知的，例如部分N-脱硫酸肝素和部分O-脱硫酸肝素（即2-O和/或6-O-脱硫酸肝素，参见例如Kariya et al., J. Biol. Chem.,2000, 275:25949-5958；Lapierre, et al. Glycobiology, 1996, 6(3):355-366）。在以下方案2中示出了示例性的方法。如方案2中所示，聚糖（例如肝素）1A可以与合适的脱硫剂反应，以提供一个或多个脱硫聚糖衍生物2A，所述脱硫剂例如是碱（例如NaOH）或甲硅烷基化剂（例如 N,O -双（三甲基甲硅烷基）乙酰胺（BTSA）、N-甲基-N-（三甲基甲硅烷基）三氟乙酰胺（MTSTFA）等）。如本领域技术人员显而易见的，可以根据所使用的试剂和反应条件，调整聚糖衍生物2A，使得可以获得脱硫的聚糖衍生物2A的部分、完全或混合物。 然后，在典型的肽偶联反应条件下，如上文方案1所述，任选地在偶联剂的存在下，使脱硫酸化的聚糖衍生物2A与肽反应，以提供生物缀合物2B。另外，如方案2所示，可以将具有至少一个羟基基团的聚糖衍生物（例如6-O-脱硫酸化肝素）转化成O-羧甲基化聚糖衍生物（例如6-O-羧甲基化肝素） 2C（参见例如Prestwich等在US 2012/0142907和US 2010/0330143中）。 在典型的肽偶联反应条件下，任选地如上文针对方案1所述在偶联剂的存在下，2C与肽的反应，可以提供生物缀合物2D和/或2E。
方案2.生物缀合物的替代的合成
与方案1和2相比，方案3显示了本领域已知的生物缀合物的合成。如方案1中所示，使用高碘酸盐试剂（例如高碘酸钠）将聚糖（例如硫酸软骨素“CS”）氧化，以在聚糖上提供醛官能团（例如“ox-CS”）以将肽共价键合至聚糖。然后通过使氧化聚糖的醛官能团（例如“ox-CS”）与N-[β-马来酰亚胺丙酸]酰肼（BMPH）反应，以形成聚糖中间体（例如“BMPH-CS”），并使聚糖中间体与含有至少一个游离巯基（即-SH基团）的肽进一步反应以产生合成的肽聚糖，使肽共价结合至聚糖（例如硫酸软骨素“CS”）。
方案3.CS-BMPH-肽 n 的合成
4. 使用方法
4.1 使用胶原结合的生物缀合物的方法
在一个实施方案中，描述了抑制血小板的活化的方法，所述方法包括提供用于接触胶原的胶原结合的合成生物缀合物的步骤，其中胶原结合的合成生物缀合物结合至胶原，并且其中血小板的活化被抑制。在另一个实施方案中，描述了一种抑制血小板粘附至胶原的方法，所述方法包括提供用于接触胶原的胶原结合的合成生物缀合物的步骤，其中胶原结合的合成生物缀合物结合至胶原，并且其中血小板至胶原的粘附被抑制。以下讨论了使用胶原结合的生物缀合物的其他方法。
a. 冠状动脉疾病（CAD）和外周动脉疾病（PAD）
本公开的一个实例提供了用于改善手术性搭桥手术的成功率和/或减少失败的方法和相关的组合物。搭桥移植物被用作冠状动脉疾病（CAD）和外周动脉疾病（PAD）中的动脉阻塞的一种治疗形式。在美国每年大约进行500,000例冠状动脉搭桥移植术（CABG）和超过70,000例外周搭桥移植术。最常见的是，通常从隐静脉收获自体血管移植物。
尽管使盛行使用自体静脉移植物进行手术性搭桥来恢复血流，但在CAD和PAD中都有大量的静脉移植失败（VGF）。仅在外周，5年内静脉移植失败率就达到50％的失败率。由于技术因素和急性血栓形成，5％至10％的静脉移植物在植入后不久即失败，另外20％至30％的病例可能出现中期失败（3至24个月），并可能导致昂贵的监测、再次介入程序和截肢。在布里格姆妇女医院的二十年经验中，CLI患者（n = 1219）的12个月的静脉移植失败发生率为29％。静脉移植失败的后果通常对患者来说是严重的，包括复发性缺血症状、使手术衰弱和肢体丧失。迄今为止，药物治疗和技术创新对减少静脉移植失败的影响甚微。
预期的是，无论是由静脉移植物采集、保存介质、制备搭桥的过度操作还是由局部缺血和再灌注损伤引起的静脉移植导管的脆性内皮层的损伤，都导致植入之后在血管壁之内的血小板介导的炎症反应。这种内皮损伤和ECM-血小板活化级联可以通过急性炎症和血栓形成早期的VGF，或通过新生内膜增生形成延迟的VGF。因此，限制静脉移植物内皮下基质在植入后暴露至循环的血小板，可以帮助减少急性血管壁炎症，改善再上皮化并限制可能导致血管闭塞和VGF的过度新生内膜增生。如本文所述的生物缀合物可以被用作具有自体静脉移植物的手术搭桥的患有心血管疾病的患者的静脉移植物保存液。如本文所述的生物缀合物和包含其的组合物可以被用来在有需要的患者中治疗和/或预防的冠状动脉疾病和/或外周动脉疾病。
因此，根据本公开的一个实例，提供了一种制备血管移植物（例如静脉移植物）的方法，该方法将血管的区段的内壁与含有本发明的合成的生物共轭物的溶液相接触。实现所述接触的一种方法是将该区段浸泡在所述溶液中。这种接触的条件可以变化，但是可以根据合成的生物缀合物的浓度和血管的特性，容易地确定所述条件，使得合适的量的合成生物缀合物结合到内壁。 用这种方法制备的血管移植物也在本公开的范围内。
一旦制备了移植物，就可以将其植入至有此需要的患者。可以容易地由医疗专业人员进行外科搭桥手术。一旦植入，则结合至移植物内壁的合成的生物缀合物可以帮助减少急性血管壁炎症，改善移植物的再上皮化并限制移植物的过度新生内膜增生，从而减少移植失败。
在一个实施方案中，当已经如上所述使用合成的生物缀合物处理移植物时，在搭桥手术过程期间或之后，可以将合成生物缀合物的溶液注射进移植物的内腔中，使得合成的生物缀合物将结合移植物的内壁。在一个方面，在血流恢复或开始通过移植物之前完成注射。在另一个方面，在血流恢复或开始之后不久（例如在10分钟内、在5分钟内、或在1分钟内）完成注射。
在一些实施方案中，所述方法有效地抑制血管的负向重塑。冠状动脉疾病，也被称为缺血性或冠状性心脏病，发生在冠状动脉（向心肌提供血液的动脉）之内的一部分光滑的弹性衬里发生动脉粥样硬化时，有效地限制血液流向心脏。外周动脉疾病，也被称为动脉粥样硬化或动脉硬化，是在循环系统的动脉中发生的一种疾病。负性重塑包括血管对刺激的生理或病理反应，导致血管直径和管腔直径的减小。这种刺激可以通过例如血流改变或血管成形术过程来提供。在一些实施方案中，本文所述的生物缀合物和包含其的组合物的注射，与没有注射的血管的直径相比，导致血管直径增加约10%、20%、30%、40%、60%、70%、80%、95%、或以上的任一种。可以例如通过血管造影将负性重塑量化为在病变部位（或疾病部位）的直径狭窄百分比。确定重塑程度的另一种方法涉及使用血管内超声（IVUS）测量病变内外部弹性薄层区域。IVUS是一种可以对外部弹性薄层以及血管腔进行成像的技术。在一些实施方案中，负向重构与血管介入手术相关，例如血管成形术、支架术或经皮腔内斑块旋切术。因此，可以在血管介入手术之前、期间和/或之后注射如本文所述的生物缀合物和包含其的组合物。在一些实施方案中，提供了一种在有需要的患者中治疗股腘动脉之内的狭窄、或闭塞的方法，所述方法包括在球囊血管成形术之前、期间和/或之后将溶液施加至腔的内壁，其中所述溶液包含有效量的如本文所述的生物缀合物或包含其的组合物。
因此，本发明提供了一种在有需要的个体中抑制血管（例如动脉）中的负性重塑的方法，所述方法包括将有效量的本文所述的生物缀合物或包含其的组合物注射进血管壁或血管壁周围的组织中。在一些实施方案中，所述生物缀合物或组合物被注射在潜在的或实际的负性重塑部位处或其附近（例如离该部位不超过约2、1或0.5cm）。在一些实施方案中，将纳米颗粒组合物远离潜在的或实际的负性重塑部位注射（例如离该部位至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10 cm中的任何一个）。在一些实施方案中，所述注射是通过带有针头的导管。在一些实施方案中，所述部位是冠状动脉或外周动脉。在一些实施方案中，所述动脉选自由肾动脉、脑动脉、肺动脉和腿部动脉。在一些实施方案中，所述动脉是球囊受伤的动脉。进一步的实例包括但不限于腹主动脉、胫前动脉、主动脉弓、弓形动脉、腋动脉、肱动脉、颈动脉、腹腔动脉、旋腓动脉、肝总动脉、髂总动脉、深股动脉（deep femoral artery）、掌深动脉弓、指背动脉、跖背动脉、颈外动脉、髂外动脉、面动脉、股动脉、肠系膜下动脉、髂内动脉、肠动脉、膝下外侧动脉、膝上外侧动脉、掌指动脉、腓动脉、腘动脉、胫后动脉、股深动脉（profunda femoris artery）、肺动脉、桡动脉、肾动脉、脾动脉、锁骨下动脉、掌浅动脉弓、肠系膜上动脉、尺侧上副动脉、和/或尺动脉。在一些实施方案中，所述动脉是冠脉血管的一部分。
在一个实施方案中，上述方法中使用的生物缀合物包含肝素和约5至约10、或约7个肽，其中所述肽包含RRANAALKAGELYKSILY (SEQ ID NO: 1)或RRANAALKAGELYKSILYGSG(SEQ ID NO: 287)的至少一个序列，并且通过酰肼-羰基键结合至所述肝素。
b. 血管治疗
本文所述的生物缀合物和组合物可以被用来在血管损伤或介入之前、期间和/或之后治疗患者中的血管。所述血管介入可以包括但不限于有和没有支架的血管成形术、移植血管、经皮腔内斑块旋切术和血管通路功能障碍、或其他外科手术。
在本文所述的各种实施方案中，可以将生物缀合物或其组合物施用至需要治疗的患者，以抑制血小板活化，该活化例如参与血栓形成、血小板结合至裸露内皮的暴露的胶原、剥脱内皮产生的炎症、内膜增生或血管痉挛。
在各种实施方案中，所述生物缀合物可以例如静脉内施用或施用进肌肉。其它合适的胃肠外施用途径包括血管内、静脉内、动脉内、肌内、皮肤、皮下、经皮、皮内、和表皮内递送。用于肠胃外施用的合适的手段包括针（包括微针）注射器、输注技术、和基于导管的递送。基于导管的递送可以包括将生物缀合物作为球囊上的涂层、通过多孔球囊、或作为支架上的涂层而递送。在另一个实施方案中，所述生物缀合物可以全身递送（即不直接递送至目标血管，而是通过肠胃外施用递送）。
这些生物缀合物通过物理的肽-胶原相互作用局部地结合至暴露的胶原。当结合至胶原时，所述生物缀合物具有许多功能，包括1）作为血小板附着/活化的屏障，2）通过抑制MMP通路保护胶原免于降解，和3）隔离生长因子FGF-2、FGF-7、和FGF-10，从而促进内皮和上皮细胞的增殖和迁移。
所述生物缀合物可以竞争胶原上的血小板结合位点并防止血小板结合和活化。所述生物缀合物的聚糖骨架可以带负电荷并结合水分子，在胶原表面形成亲水屏障，防止血小板和蛋白质的粘附。通过掩盖暴露的胶原，而不是抑制正常的血小板功能，所述生物缀合物可以提供局部治疗，解决级联中炎症和内膜增生的初始步骤。
在一个实施方案中，本发明提供了一种新的方法来解决接受血液透析的患者中的血管通路功能障碍的未满足需求。在一个实施方案中，所述方法需要产生设计自如本文所述的生物缀合物的官腔血管涂层。例如，在动静脉瘘（AVF）中，新内膜增生大多发生在AVF的静脉部分。虽然内膜增生的初始机制在动脉和静脉中是相似的，但是产生的病变存在差异。在外周血管疾病的情况下，静脉内膜增生倾向于成为比动脉内膜增生更具侵袭性的病变，并且对血管成形术的反应较差。公开的生物缀合物预防动脉损伤中的血小板结合和内膜增生的能力被认为有助于其降低或预防新内膜增生的能力。
因此，在一些实施方案中，本发明提供了一种用于改善需要血液透析的患者中的动静脉瘘（AVF）的成熟的方法、或者用于改善开放性、扩大静脉的内径、减少狭窄、减少新生内膜增生、减少血液动力学应激、减少内皮或平滑肌细胞损伤、减少血管通路功能障碍、或减少AVF处的凝血或炎症的方法。在一些实施方案中，所述方法需要将溶液施加至AVF的腔的内壁；以及恢复或启动AVF中的血流，其中所述溶液是本发明的生物缀合物、或者所述溶液包含有效量的本发明的生物缀合物。
本发明公开了一种局部治疗，其使用合成的聚合物腔涂层，其特异性地结合至暴露的胶原，其中所述涂层可以阻止血小板粘附到血管壁，从而抑制血栓形成和内膜增生中的引发事件。另外，所述涂层可以促进血管壁的快速内皮再生，导致更快的愈合。可以预期，在生成过程中将所公开的生物共轭物施用至天然AV瘘管将导致瘘管的狭窄显著减少和直径更大。
在一些实施方案中，对于在血液流动开始之前新产生的AVF，在血流开始之前少于约10分钟施用溶液。在一些实施方案中，在血液流动开始之前少于约20、15、10、9、8、7、6、5、4、3或2分钟、或60、45、30、20、10或5秒钟施用溶液。在一些实施方案中，在血液流动开始之前至少1分钟或至少2、3、4、5分钟施用溶液。在一些实施方案中，在血液流动恢复之后至少1分钟或至少2、3、4、5分钟施用溶液。在一些实施方案中，开始血液流动，然后停止以允许输送溶液。在一些实施方案中，在创建吻合术之前、在创建吻合术期间、或之后将溶液施用至血管。在一些实施方案中，在创建吻合术之前、在创建吻合术期间、以及之后将溶液施用至血管。
在一些实施方案中，将溶液冲洗通过AVF，例如使用针、导管或其他药物递送装置。在一个实施方案中，所述方法还需要在使用溶液冲洗AVF之后关闭AVF。在一些实施方案中，除了如上所述的溶液的施用之外，或者可替代地，将溶液注入通过夹紧已建立的AVF的近侧和静脉和动脉而产生的封闭的管腔中。
在一个实施方案中，在静脉扩张或摩擦AVF的静脉部分之后约5分钟之内（或者10、9、8、7、6、4、3或2分钟之内）施加溶液，其用于扩大静脉的内径。将溶液施用至静脉内部的机械扩张或摩擦的表面，可以减少摩擦过程中表面上生物缀合物的损失。
进一步设想，所公开的组合物和方法可以用于在患者中建立血管通路，该方法可能需要将本发明的溶液施用至血管通路中的血管的壁；并恢复或启动血管通路中的血液流动。 在一些实施方案中，所述壁是血管的内壁，但也可以是任何血管的外壁。
在一些实施方案中，所述血管通路是动静脉瘘（AVF）、动静脉移植物（AVG）、或用于肠外营养、化疗或血浆置换的持久的血管通路。预期的是，所述溶液减少暴露至血小板的壁。在一些实施方案中，所述壁包括由于损伤或外科手术而暴露至血流的细胞或组织。结果表明，所述溶液的应用在血管通路（例如AVF和AVG）中改善了开放性、改善了存活率、改善了血流、扩大了血管内径、或者减少了狭窄。
在一些实施方案中，本发明提供了一种用于改善需要血液透析的患者中的动静脉瘘（AVF）的成熟的方法、或者用于改善开放性、扩大静脉的内径、减少狭窄、减少新生内膜增生、减少血液动力学应激、减少内皮或平滑肌细胞损伤、减少血管通路功能障碍、或减少AVF处的凝血或炎症的方法。在一些实施方案中，所述方法需要将溶液施加至AVF的腔的内壁；以及恢复或启动AVF中的血流，其中所述溶液包含有效量的本发明的生物缀合物。
预期的是，所述生物缀合物可以经皮或静脉内施用至患者的血管的内部。经皮或静脉内递送允许治疗患者手术后瘘生成。所述生物缀合物可以被递送用于治疗血管、维持血管、或防止瘘管失败。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括进行一个或多个维护应用，例如球囊辅助的成熟、球囊血管成形术、经皮腔内斑块旋切术、或脱色程序。但是，在一些实施方案中，在血液透析时的预防性输送，特别是在特别高的流速损伤内皮的过程之后，以及移植物或瘘中的注射被认为有利于维持和预防狭窄。
在一个实施方案中，上述方法中使用的生物缀合物包含肝素和约5至约10、或约7个肽，其中所述肽包含RRANAALKAGELYKSILY (SEQ ID NO: 1)或RRANAALKAGELYKSILYGSG(SEQ ID NO: 287)的至少一个序列，并且通过酰肼-羰基键被结合至所述肝素。在一些实施方案中，所述肝素是普通肝素（unfractionated heparin，UFH）或低分子量肝素（LMWH）。
在一个实施方案中，上述方法中使用的生物缀合物包含肝素和约5至约20％用肽进行的官能化，其中所述肽包含RRANAALKAGELYKSILY (SEQ ID NO: 1)或RRANAALKAGELYKSILYGSG (SEQ ID NO: 287)的至少一个序列，并且通过酰肼-羰基键被结合至所述肝素。
c. 血管介入
可以在施用胶原结合的合成生物缀合物之前、期间或之后，通过任何常规的程序，进行血管介入（例如经皮冠状动脉介入）。考虑与本发明的方法结合使用的血管介入手术的实例包括支架术、经皮腔内斑块旋切术、和血管成形术，例如球囊血管成形术。血管介入手术可以涉及暂时闭塞血管（例如球囊血管成形术），或者可以不涉及暂时闭塞血管（例如非球囊血管成形术手术、不涉及球囊血管成形术的支架手术等）。示例性的递送模式可以包括导管、肠胃外施用、球囊上的涂层、通过多孔球囊、涂覆的支架、及其任何组合或在血管介入手术期间的递送药物的任何其他已知的方法。
在另一个说明性的实施方案中，在血管介入手术期间，具有保守的氨基酸取代的这些生物缀合物中的任一种可以抑制血小板结合至裸露的内皮的暴露的胶原、血小板活化、血栓形成、剥脱内皮导致的炎症、内膜增生、和/或血管痉挛，或者可以刺激内皮细胞增殖或者可以在裸露的血管中结合至胶原。在另一个说明性的实施方案中，在血管介入手术期间，本段中描述的具有保守的氨基酸取代的任何生物缀合物可以抑制血小板结合至裸露的内皮的暴露的胶原、血小板活化、内膜增生、和/或血管痉挛，或者可以在裸露的血管中结合至胶原。
在本文所述的各种实施方案中，可以将胶原结合的合成生物缀合物施用至患者（例如需要治疗以抑制血小板活化的患者，该活化例如参与血栓形成、血小板结合至裸露内皮的暴露胶原、血栓形成、剥脱内皮产生的炎症、内膜增生、或血管痉挛）。在各种实施方案中，胶原结合的合成生物缀合物可以例如静脉内施用或施用进肌肉。用于肠胃外施用的合适的途径包括血管内、静脉内、动脉内、肌内、皮肤、皮下、经皮、真皮内、和表皮内递送。用于肠胃外施用的合适手段包括针（包括微针）注射器、输注技术和基于导管的递送。在说明性实施方案中，提供了用于与胶原结合的合成生物缀合物一起用于肠胃外施用或基于导管的递送的药物制剂，其包含：a）药物活性量的胶原结合的合成生物缀合物；b）药学上可接受的pH缓冲剂，以提供在约pH 4.5至约pH 9范围内的pH；c）浓度范围为约0至约300毫摩尔的离子强度调节剂；和d）浓度范围为总配方重量的约0.25％至约10％的水溶性粘度调节剂、或任何单独的组分a）、b）、c）或d）或a）、b）、c） 、和d）的任何组合。
在本文所述的任何实施方案中，可以以任何合适的方式将胶原结合的合成生物缀合物血管内施用进患者（例如进入动脉或静脉）。在本文所述的各种实施方案中，可以在血管介入之前、期间、或之后，将胶原结合的合成生物缀合物施用进患者的血管中。在各种实施方案中，例如经皮冠状动脉介入（PCI）的血管介入可以包括例如支架术、经皮腔内斑块旋切术、移植术、和血管成形术，例如球囊血管成形术。说明性地，血管介入可以涉及暂时闭塞动脉（例如冠状动脉）或静脉（例如球囊血管成形术），或者可以不涉及暂时闭塞动脉或静脉（例如非球囊血管成形术手术、不涉及球囊血管成形术的支架手术等）。示例性的递送模式可以包括导管、肠胃外施用、球囊上的涂层、通过多孔球囊、涂覆的支架、及其任何组合或在血管介入手术期间的递送药物的任何其他已知的方法。在一个说明性的实施方案中，目标血管可以包括冠状动脉，例如向患者的心脏组织提供血液的任何血管，包括天然的冠状动脉以及已经移植进患者的血管，例如在早期的冠状动脉搭桥手术中移植的。在本文所述的任何实施方案中，待施用胶原结合的合成生物缀合物的目标血管和要在其上进行血管介入手术的目标血管可以包含阻塞，例如狭窄或导致通过血管的血流减少的一些其它形式的完整或部分阻塞。因此，可以通过导管（例如扩张导管、线上血管成形术球囊导管、输注导管、快速交换或单轨导管、或本领域已知的任何其他导管装置）递送胶原结合的合成生物缀合物，所述导管被经皮插入患者体内，并穿过患者的血管到目标血管。本领域已知各种基于导管的装置，包括在美国专利第7,300,454号中描述的那些装置，该专利在此引入作为参考。在使用导管的本文所述的各种实施方案中，用于递送胶原结合的合成生物缀合物的导管，可以是与通过其来进行血管介入的导管相同的导管，或者可以是不同的导管（例如通过相同或不同的皮肤切口经皮插入患者体内的不同导管、和/或通过相同或不同的途径穿过患者的血管至目标血管的不同导管）。在另一个实施方案中，胶原结合的合成生物缀合物可以直接注射进目标血管。在另一个实施方案中，胶原结合的合成生物缀合物可以全身递送（即不直接递送至目标血管，而是通过肠胃外施用递送而不需要基于导管的递送）。
在血管含有阻塞物（例如狭窄）的情况下，可以通过将胶原结合的合成生物缀合物直接递送至阻塞部位处或远离阻塞处或两者的目标血管来进行施用。在另一个实施方案中，可以将胶原结合的合成生物缀合物递送至阻塞附近的一个或多个位点。说明性地，当递送胶原结合的合成生物缀合物时，导管尖端可以保持静止，或者可以在递送胶原结合的合成生物缀合物的同时移动导管尖端（例如以从最初远离阻塞的位置、至或者穿过阻塞、或至靠近阻塞的位置的方向）。
如上所述，在一个实施方案中，可以在血管介入（例如经皮冠状动脉介入）之前的一个时间，将胶原结合的合成生物缀合物直接施用至患者的血管。例如，可以就在血管介入之前（例如在血管介入之前约1小时内，例如约30分钟内、约15分钟内、和/或约5分钟内），进行胶原结合的合成生物缀合物的递送。任选地，可以在全部或部分血管介入手术期间和/或在该手术完成之后，继续将胶原结合的合成生物缀合物直接递送至目标血管，或者可以在开始血管介入手术之前，停止将胶原结合的合成生物缀合物直接递送至目标血管，并且随后不重新开始。在本文所述的任何实施方案中，胶原结合的合成生物缀合物的递送可以是连续的，或者可以通过单次或多次施用来进行。在将胶原结合的合成生物缀合物施用至目标血管之前、期间和/或之后，可以施用相同的胶原结合的合成生物缀合物或一种或多种不同的胶原结合的合成生物缀合物。
在一个实施方案中，上述方法中使用的生物缀合物包含肝素和约5至约10、或约7个肽，其中所述肽包含RRANAALKAGELYKSILY (SEQ ID NO: 1)或RRANAALKAGELYKSILYGSG(SEQ ID NO: 287)的至少一个序列，并且通过酰肼-羰基键结合至所述肝素。
d. 内皮功能障碍
在一个实施方案中，本发明提供了用于治疗患有与内皮功能障碍相关的疾病的患者的组合物和方法。 在一些实施方案中，所述组合物包括本发明的合成的胶原结合的生物缀合物。
本文发现，胶原结合的生物缀合物可以减少急性和慢性疾病中内皮功能障碍或损伤的炎症影响。预期这样的生物缀合物抑制或减少血小板结合至功能失调的内皮，从而减少血小板介导的炎症。炎症可以通过血小板过程来激活，例如血小板-血小板结合、血小板-白细胞结合、促进白细胞渗出、或者简单地从血小板释放局部和区域性细胞因子。
进一步地，本文发现，胶原结合的生物缀合物减少了暴露的内皮细胞中的促炎细胞因子分泌和E-选择素和P-选择素的表达。再者，即使在血小板衍生的生长因子（PDGF）的存在下，这些生物缀合物也可以增加内皮细胞增殖和迁移、减弱IL-6分泌和血管损伤标志物的产生。预期的是，由胶原结合的生物缀合物的施用引起的这些作用中的一些或全部有助于减少功能失调的内皮处的炎症。
在一些实施方案中，还提供了一种用于预防或减轻患有内皮功能障碍的血管部位的炎症的方法。所述方法需要向所述部位施用包含本发明的合成的胶原结合的生物缀合物的药物组合物。
术语“内皮功能障碍”也被称为“内皮细胞（EC）功能障碍”、“功能失调的内皮”或“功能失调的内皮细胞”。可以通过在内皮细胞的细胞表面上揭露或暴露ICAM和VCAM受体或选择素受体，确定内皮功能障碍。P-选择素和E-选择素是暴露的选择素受体实例，其由于损伤和炎症而在细胞表面瞬时表达，并在功能失调的内皮中长期表达。
在一些实施方案中，内皮功能障碍的特征是渗透的内皮衬里或损伤的内皮细胞。在一些实施方案中，内皮功能障碍的特征在于糖萼的损失。在一些实施方案中，内皮功能障碍的特征在于在内皮细胞的表面上表达并暴露于循环的选择素蛋白。在一些实施方案中，该部位发炎。
在一个方面，血管部位不被物理手段裸露并且不从血管介入手术中恢复。血管介入手术的非限制性实例包括经皮冠状动脉介入（PCI）。
“功能失调的内皮细胞”或“内皮细胞（EC）功能障碍”意指在内皮细胞的细胞表面上揭露或暴露ICAM和VCAM受体以及选择素受体。P-选择素和E-选择素是暴露的选择素受体实例，其由于损伤和炎症而在细胞表面瞬时表达，并在功能失调的内皮中长期表达。具有慢性功能失调的内皮细胞的疾病状态的一个实例是糖尿病。
内皮细胞的功能障碍在广泛的疾病的发病机制中起重要作用，因为内皮细胞参与维持功能性毛细血管。
例如，内皮直接涉及外周血管疾病、中风、心脏病、糖尿病、胰岛素抵抗、慢性肾衰竭、肿瘤生长、转移、静脉血栓形成、和严重的病毒感染性疾病（Rajendran et al., Int. J. Biol. Sci., 9:1057-1069, 2013）。
如本文使用的，“与内皮功能障碍相关的疾病”是指至少部分由内皮功能障碍引起或诱导内皮功能障碍的人类疾病或病症。相应地，治疗与内皮功能障碍相关的疾病是指治疗疾病、恢复功能失调的内皮、或者预防或改善由功能失调的内皮引起的病症或症状，例如炎症、内膜增生和血栓形成。
本发明人已经证明，胶原结合的生物缀合物可以有效地递送至人类患者的任何器官。因此，胶原结合的生物缀合物可以被用来治疗在任何器官中发生并与以下任何疾病或病症相关的内皮功能障碍。
血管疾病。可以用胶原结合的生物缀合物适当治疗的血管疾病包括但不限于动脉粥样硬化疾病（外周动脉疾病、冠状动脉疾病、中风、颈动脉疾病、肾动脉狭窄）、静脉血栓形成疾病（深静脉或浅静脉血栓形成）、和医源性大血管损伤（血管成形术、设置支架的血管成形术、经皮腔内斑块旋切术、血栓切除术、创建透析通路、用于搭桥的静脉采集、脑或主动脉瘤的治疗）。
肾脏疾病。可以用胶原结合的生物缀合物适当治疗的肾脏疾病包括但不限于急性肾小管坏死、糖尿病慢性肾衰竭、狼疮肾炎、肾纤维化、和急性肾小球肾炎。
肺部疾病。可以用胶原结合的生物缀合物适当治疗的肺部疾病包括但不限于特发性肺纤维化（IPF）、慢性阻塞性肺病、哮喘、和肺气肿。
血液疾病。可以用胶原结合的生物缀合物适当治疗的血液疾病包括但不限于血栓性血小板减少性紫癜（TTP）、弥散性血管内凝血（DIC）、和溶血性尿毒症综合征（HUS）。
此外，还可以使用本发明的胶原结合的生物缀合物治疗皮肤疾病（例如系统性硬化）、风湿病（包括血管炎病症（狼疮）、类风湿性关节炎和其他炎性关节炎（痛风））、胃肠疾病（包括炎性肠病、肝炎、和肝纤维化）、肿瘤生长、肿瘤转移、感染性疾病（包括病毒性和细菌性败血症）、神经系统疾病（包括多发性硬化症、痴呆、和肌萎缩侧索硬化）、眼科疾病（包括黄斑变性、青光眼、和葡萄膜炎）、内分泌疾病（例如糖尿病）、以及复合区域疼痛综合征（CRPS）。
考虑的是，可以根据待治疗的疾病和受影响的功能失调内皮的位置，针对肽同一性、连接至聚糖的肽的数量、以及GAG骨架特性，对生物缀合物进行调整以优化治疗。因此，可以设计许多分子设计参数来优化目标效果。
在一个实施方案中，所述生物缀合物包含具有附着的胶原结合的肽的硫酸皮肤素（DS）。 DS可能是有用的，因为它能够促进上皮细胞迁移和增殖。
考虑的是，本文提供的生物缀合物的其他变体也能够抑制功能失调的内皮的炎症。 在一个实施方案中，所述生物缀合物包括胶原结合的肽，例如被称为“SILY”的RRANAALKAGELYKSILY (SEQ ID NO: 1)。
e. 组织粘连
本发明的方法可用于与组织粘连有关的各种应用，例如心脏、腹部或骨盆粘连。考虑的是，本发明的方法可用于治疗和/或预防这些持续的缺陷或复发性损伤。
在一些实施方案中，本发明提供了一种在有需要的患者中治疗和/或预防腹部或盆腔粘连的方法，其包括将药物组合物施用于器官的非自然暴露的组织上。在一个实施方案中，所述组合物包含生物缀合物，所述生物缀合物包含聚糖，所述聚糖具有约1至约80个胶原结合肽键合至该聚糖。“暴露的组织”可以指暴露于在正常健康条件下看到的新环境的组织或表面、或者在正常健康的条件下不暴露于不同器官的细胞或组织但是由于疾病、或损伤、或在医疗程序期间而暴露的组织（即“非自然暴露的组织”）。
粘连是纤维疤痕组织的异常地结合通常不连接的组织和/或器官的带。在对各种类型的损伤或组织紊乱的响应中会发生粘连，例如手术、创伤、感染、化学疗法、放射、异物、或癌症。
腹部和盆腔粘连是腹部外科手术常见的并发症。腹部粘连会导致严重的临床问题和/或疼痛。例如，腹部粘连相关的临床问题可以包括小肠梗阻、继发性女性不孕症、异位妊娠、慢性腹部和盆腔疼痛、以及困难和危险的再次手术（Diamond, M. P., Freeman, M. L.Eur. Soc. Human. Repro. Embryo. 2001; 7(6): 567-576）。腹部粘连可能通过束缚不正常连接的组织和/或器官并引起神经牵引而引起疼痛。如果肠发生梗阻然后膨胀，则会导致疼痛。相应地，腹部粘连可能导致肠道紊乱和肠梗阻或阻塞。在极端的情况下，腹部粘连可能在肠段周围形成纤维条带，其收缩血流并导致组织死亡。
导致上述临床问题和/或疼痛的腹部和盆腔粘连的标准治疗是手术干预。然而，手术干预带有额外的腹部粘连和进一步的并发症的风险。因此，腹部粘连的替代治疗和/或预防选择将有益于治疗和/或预防有需要的患者的腹部粘连。
在一个方面，腹部组织或器官的创伤导致腹部组织和/或器官之间的纤维组织带形成。考虑的是，本文所述的方法可用于治疗和/或预防所述腹部粘连。
考虑的是，本文提供的合成的生物缀合物将提供保护性水合层以使疼痛最小化、保护腹部组织和/或器官胶原免于降解、并促进上皮迁移和上皮增殖。
在一些实施方案中，本发明提供了一种在有需要的患者中治疗和/或预防腹部粘连的方法，其包括在腹部器官的暴露的组织上施用药物组合物。在一个实施方案中，所述组合物包含生物缀合物，所述生物缀合物包含聚糖，所述聚糖具有约1至约80个胶原结合肽键合至该聚糖。
在一些实施方案中，本发明提供了一种在有需要的患者中治疗和/或预防腱-腱鞘粘连的方法，其包括将本文所述的生物缀合物或组合物施用至非自然暴露的腱和/或腱鞘。
在一些实施方案中，本发明提供了一种在有需要的患者中治疗和/或预防心脏粘连的方法，其包括将本文所述的生物缀合物或组合物施用至非自然暴露的心脏组织。
在一些方面，所述组织由于手术、创伤、感染、化疗、放射、异物、或癌症而被暴露。在一个方面，所述组织被手术地暴露。
在一些方面，所述组合物作为喷雾剂而被施用。在一些方面，所述组织是腹膜组织。
还预期本发明的组合物和方法可用于减少或防止矫形粘连，例如在手或手指手术期间。
在一些实施方案中，所述方法可以进一步包括本领域已知的减少或防止粘连的其它方法，例如使用围绕组织的网。
本文提供的生物缀合物可以被用来通过向患者施用靶向腹部组织和/或器官的细胞外基质组分的合成生物缀合物来治疗和/或预防有此需要的患者的腹部粘连。预期的是，可以针对肽同一性、连接至糖胺聚糖（GAG）骨架的肽的数目、和GAG骨架特性，来定制本文提供的合成生物缀合物，以促进腹部组织血管形成。因此，可以设计许多分子设计参数来优化目标效果。
本文提供的生物缀合物可以用作手术中的辅助物以防止或减少组织粘附。在手术过程中，合成的生物缀合物可以被递送至可能是粘附性的组织或器官。预期这样的施用将有助于预防和/或减少术后粘连。在一个实施方案中，本发明提供了一种减少或防止手术后粘连的方法，其中所述方法包括将本文提供的合成生物缀合物递送至手术部位。在另一个实施方案中，本文提供的生物缀合物可用于腹腔手术（例如腹腔镜腹部手术）中。在另一个实施方案中，本文提供的生物缀合物可以通过腹腔镜而被递送至可能是粘附性的组织或器官。考虑的是，使用合成生物缀合物DS-SILY的处理，将通过结合至损伤区域、提供保护性的保湿层以使疼痛最小化、保护腹部组织和/或器官胶原免于降解、以及促进上皮迁移和上皮细胞增殖，从而治疗和/或防止腹部粘连。进一步考虑的是，DS-SILY将持续存在于受伤部位，因此不需要每天多次治疗。
在一个实施方案中，肽聚糖包含连接有胶原结合的肽的硫酸皮肤素（DS）。由于其促进上皮细胞迁移和增殖的能力，DS可用于腹部粘连应用。
预期的是，本文提供的生物缀合物的其它变体也能够通过结合至I型胶原来抑制血小板活化。在一个实施方案中，所提供的合成生物缀合物将通过使肽聚糖的聚糖部分通过胶原结合的肽（例如被称为“SILY”的RRANAALKAGELYKSILY (SEQ ID NO: 1)）系栓到损伤部位来治疗和/或预防腹部粘连。
在另一个实施方案中，所述生物缀合物包含缀合至聚糖的胶原结合的肽（例如SILY），所述聚糖包含肝素（Hep-SILY）、硫酸皮肤素（DS-SILY）、或葡聚糖（Dex-SILY）。
可以在开放式手术期间或者通过腹腔镜或者通过允许进入手术部位的任何器械而施用本发明的组合物。
f. 胃食管损伤
在一个实施方案中，本发明提供了一种新的方法来解决治疗或预防患者中的胃食管损伤的未满足的需求。一般而言，所述新方法需要将包含本发明的合成胶原结合的生物缀合物的药物组合物应用于受损的胃食管组织或细胞上。
组合物的这种应用可以产生合成的胶原结合的生物缀合物的涂层。合成的胶原结合生物缀合物可以通过物理的肽-胶原相互作用结合至暴露于食管组织的胶原。当结合至胶原时，所述生物缀合物具有许多功能，包括1）作为血小板附着/活化的屏障、2）通过抑制MMP通路保护胶原免于降解、和3）隔离生长因子FGF-2、FGF-7、和FGF-10，从而促进内皮细胞和上皮细胞的增殖和迁移，导致组织修复和恢复。
在一个实施方案中，胶原结合的生物缀合物包括共价连接有胶原结合的肽的多糖骨架。所述合成的生物缀合物可以竞争胶原上的血小板结合位点并防止血小板结合和活化。所述生物缀合物的聚糖骨架可以带负电荷并结合水分子，在胶原表面形成亲水屏障，防止血小板和蛋白质的粘附。通过掩盖暴露的胶原，而不是抑制正常的血小板功能，所述生物缀合物可以提供局部治疗，解决级联中炎症和内膜增生的初始步骤。
考虑的是，这种新方法对于治疗胃食管损伤是有用的，其包括但不限于由GERD或医源性干预引起的。进一步考虑的是，以下类别的患者可以从这种方法中受益：
——需要食管胃十二指肠镜（EGD）消融的GERD相关的食管损伤
——需要EGD扩张的食道狭窄
——需要EGD治疗的消化性溃疡病（PUD）。
可以将药物组合物局部应用至受损的胃食管组织的一个或多个病变。考虑到组织的有限的可进入性，预期使用输送装置是有益的。例如，可以在食管胃十二指肠镜（EGD）手术期间或使用食管胃镜十二指肠镜，递送所述组合物。
帕利夫明（Palifermin）是一种可用于口腔粘膜炎治疗的角质形成细胞生长因子。本发明的生物缀合物结合至胶原，并且也结合至内源或外源生长因子（例如帕利夫明）。因此，这样的制剂提供了帕利夫明的靶向递送。在一些实施方案中，本发明提供了一种递送帕利夫明的方法。在一些实施方案中，所述方法包括将包含生物缀合物和帕利夫明的组合物施用至有此需要的患者。在其他实施方案中，本发明提供了一种用于治疗患者的口腔粘膜炎的方法，其中所述方法包括将包含生物缀合物和帕利夫明的组合物施用至有此需要的患者。
考虑的是，可以针对肽特性、连接至聚糖的肽的数目、和GAG骨架特性来定制溶液中提供的生物缀合物，以促进损伤的胃食管组织的恢复。因此，可以设计许多分子设计参数来优化目标效果。
在一个实施方案中，所述生物缀合物包含连接有胶原结合的肽的硫酸皮肤素（DS）。由于其促进上皮细胞迁移和增殖的能力，DS是有用的。
预期的是，本文提供的生物缀合物的其它变体也能够通过结合至I型胶原来抑制血小板活化。在一个实施方案中，所述生物缀合物包括胶原结合的肽，例如被称为“SILY”的RRANAALKAGELYKSILY (SEQ ID NO: 1)。在另一个实施方案中，所述生物缀合物包含缀合至聚糖的胶原结合的肽（例如SILY），所述聚糖包含肝素（Hep-SILY）、硫酸皮肤素（DS-SILY）、或葡聚糖（Dex-SILY）。
在又一个实施方案中，所述生物缀合物包含肝素和1至5个分支的胶原结合的肽，例如(GQLYKSILY)4-(KRR)2-KGSG (SEQ ID NO: 391)。
g. 伤口愈合
本文所述的方法和组合物可以被用来治疗组织完整性受损的任何状况，包括慢性伤口和急性伤口、结缔组织中的伤口、以及肌肉、骨骼和神经组织中的伤口。如本文使用的，“伤口”包括手术切口、烧伤、酸碱烧伤、冷灼伤（冻伤）、晒伤、溃疡、压疮、割伤、擦伤、撕裂伤、由躯体创伤造成的伤口、由先天性疾病造成的伤口、由牙周病或接着的牙科手术造成的伤口、以及与癌组织或肿瘤有关的伤口。如本文所述，伤口可以包括急性伤口或慢性伤口。
急性伤口是由完整皮肤的外部损伤引起的，包括手术伤口、咬伤、烧伤、割伤、撕裂、擦伤等。慢性伤口包括例如由损害真皮或上皮组织完整性的内源性机制造成的伤口，例如腿部溃疡、足部溃疡、和压疮。在本文所述的任何实施方案中，用于促进伤口愈合或减少瘢痕形成的组合物可以在任何时间被使用来治疗慢性或急性伤口。例如，可以在手术之前、手术期间、或手术之后治疗与手术切口相关的急性伤口，以促进伤口愈合和/或减少患者中的疤痕形成。在多个示例性方面，可以以一个剂量或多个剂量将如本文所述的组合物施用至患者，以促进伤口愈合和/或减少瘢痕形成。
如本文使用的，“减少疤痕形成”包括疤痕的极限拉伸强度的增加和/或可见的瘢痕长度的减少。如本文使用的，瘢痕形成的减少还包括完全抑制瘢痕形成或完全消除患者中可见的疤痕。
如本文使用的，“促进伤口愈合”是指引起慢性或急性伤口的部分或完全愈合，或减轻由急性或慢性伤口引起的任何症状。这样的症状包括疼痛、出血、组织坏死、组织溃疡、疤痕形成、以及已知由急性或慢性伤口引起的任何其他症状。
在本文描述的任何实施方案中，提供了一种促进伤口愈合的方法。所述方法包括向患者施用胶原结合的合成生物缀合物的步骤，其中所述胶原结合的合成生物缀合物促进患者中的伤口愈合。在本文所述的任何各种实施方案中，所述胶原结合的合成生物缀合物可以是异常的胶原结合的合成生物缀合物或纤维源性胶原结合的合成生物缀合物，其与通常调节胶原原纤维生成的生物缀合物的氨基酸序列的一部分具有氨基酸同源性。
在本文描述的任何实施方案中，提供了一种减少疤痕形成的方法。所述方法包括向患者施用胶原结合的合成生物缀合物的步骤，其中所述胶原结合的合成生物缀合物减少患者中的瘢痕形成。在本文所述的任何各种实施方案中，所述胶原结合的合成生物缀合物可以是异常的胶原结合的合成生物缀合物或纤维源性胶原结合的合成生物缀合物，其与通常调节胶原原纤维生成的生物缀合物的氨基酸序列的一部分具有氨基酸同源性。
在本文所述的任何实施方案中，用于促进伤口愈合和/或减少瘢痕形成的组合物可以被浸渍进适于将组合物递送至伤口的任何材料中，所述材料包括棉花、纸、无纺布、机织物和针织物、单丝、薄膜、凝胶、海绵等。例如，可以使用棉花、纸、无纺布、机织物、针织物、薄膜和海绵形式的手术缝合线（单丝、加捻纱或针织纱）、吸收垫、透皮贴剂、绷带、烧伤敷料和包装。
使用选择素、ICAM/ VCAM结合的生物缀合物的方法
本文所述的生物缀合物可以被用来抑制血小板结合至内皮、抑制血液中的其他细胞结合至暴露的上皮、抑制血小板活化、抑制血栓形成、抑制剥脱内皮导致的炎症、抑制内膜增生、和/或抑制血管痉挛。本文所述的生物缀合物也可以刺激内皮细胞增殖并可以结合至血管的表面。在这些实施方案的任何一个中，这些上述效果可以在血管介入手术期间发生，例如基于导管的手术。在这些实施方案的任何一个中，可以使用包含具有至少一个ICAM、VCAM和/或选择素结合单元的肽的任何上述生物缀合物。
在一个实施方案中，本发明提供了用于治疗患有与内皮功能障碍相关的疾病的患者的组合物和方法。本发明还涉及抑制以下中的一个或多个：血小板结合至内皮、血小板活化、血栓形成、剥脱内皮导致的炎症、内膜增生、和/或血管痉挛、或其刺激内皮细胞增殖或结合至裸露的血管的有效性，包括向有需要的患者施用有效量的本文提供的组合物。
如本文所提供的ICAM、VCAM和/或选择素结合的生物缀合物可以减少急性和慢性疾病中的内皮功能障碍或损伤的炎症影响。预期这样的缀合物抑制或降低血小板结合至功能失调的内皮，从而减少血小板介导的炎症。炎症可以通过血小板过程来激活，例如血小板结合、血小板-白细胞结合、促进白细胞渗出、或者简单地从血小板释放局部和区域性细胞因子。
在一些实施方案中，还提供了一种预防或减轻在患有内皮功能障碍的血管部位的炎症的方法。所述方法需要向所述部位施用包含本公开的ICAM、VCAM和/或选择素结合的生物缀合物的药物组合物。
如本文所述，ICAM、VCAM和/或选择素结合的生物缀合物靶向暴露于血流的内皮选择素和ICAM/VCAM和/或选择素受体，其中它们可以保持结合足够的时间量以防止血小板结合至裸露的内皮细胞，因此防止血小板活化、血栓形成、剥脱内皮导致的炎症、内膜增生、和血管痉挛。 因此，这些生物缀合物可以通过抑制功能失调的内皮细胞中的选择素或ICAMs/VCAM的产生来抑制炎症反应。
术语“内皮功能障碍”也被称为“内皮细胞（EC）功能障碍”、“功能失调的内皮”或“功能失调的内皮细胞”。可以通过在内皮细胞的细胞表面上揭露或暴露ICAM和VCAM受体或选择素受体，确定内皮功能障碍。P-选择素和E-选择素是暴露的选择素受体实例，其由于损伤和炎症而在细胞表面瞬时表达，并在功能失调的内皮中长期表达。
在一些实施方案中，内皮功能障碍的特征是渗透的内皮衬里或损伤的内皮细胞。在一些实施方案中，内皮功能障碍的特征在于糖萼的损失。在一些实施方案中，内皮功能障碍的特征在于在内皮细胞的表面上表达并暴露于循环的选择素蛋白。在一些实施方案中，该部位发炎。
如本文使用的，“与内皮功能障碍相关的疾病”是指至少部分由内皮功能障碍引起或诱导内皮功能障碍的人类疾病或病症。相应地，治疗与内皮功能障碍相关的疾病是指治疗疾病、恢复功能失调的内皮、或者预防或改善由功能失调的内皮引起的病症或症状，例如炎症、内膜增生和血栓形成。
如所公开的，在一些实施方案中，生物缀合物可以抑制功能失调的内皮细胞来治疗、抑制或减轻炎性疾病。如Ley, “The role of selectins in inflammation anddisease”, Vol. 9, Elsevier Science, (2003)所证实的，功能失调的内皮细胞与炎症和其他炎性疾病有关。其它炎性疾病和自身免疫性疾病的实例包括动脉粥样硬化、冠状动脉疾病、糖尿病、高血压、高胆固醇血症、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、青光眼、尿毒症、败血症、和器官衰竭。
通过抑制选择素受体的产生和掩蔽VCAM/ICAM受体，生物缀合物可以被用来治疗患有这些短暂或慢性疾病的患者。在以下文献中支持与抑制或减弱这些疾病有关的选择素抑制的证据：Ridings et al., “A dual-binding antibody to E- and L-selectinattenuates sepsis-induced lung injury”, Vol. 152, American Journal ofRespiratory and Critical Care Medicine, (1995)、Weyrich et al., “In VivoNeutralization of P-Selectin Protects Feline Heart and Endothelium inMyocardial Ischemia and Reperfusion Injury”, Vol. 91, The American Societyfor Clinical Investigation, (1993)，其每个都通过引用合并入本文中。本领域已知，一些癌症也与炎症和慢性炎症相关，因此生物缀合物可以被用来治疗、抑制或减弱肿瘤细胞生长。
在说明性的实施方案中，本公开的ICAM、VCAM和/或选择素结合的生物缀合物可用于血管介入手术，包括例如防止以下的组合中的任何一个：血小板结合至裸露的内皮、血小板活化、血栓形成、剥脱内皮引起的炎症、内膜增生、和血管痉挛。本文所述的生物缀合物还可以通过抑制功能失调的内皮细胞中的选择素或ICAM/VCAM的产生来抑制炎症反应。
在一个实施方案中，如上所述的方法中使用的生物缀合物包含聚糖和约5至约15个肽，其中所述肽包含DGEATD (SEQ ID NO: 156)、DGEATDGSG (SEQ ID NO: 396)、ITDGEA(SEQ ID NO: 154)和/或ITDGEAGSG (SEQ ID NO: 395)的至少一个序列、以及IELLQAR(SEQ ID NO: 117)、IELLQARGSG (SEQ ID NO: 393)、IDLMQAR (SEQ ID NO: 119) 和/或IDLMQARGSG (SEQ ID NO: 394) 的至少一个序列，并且通过酰肼-羰基键被结合至聚糖。在一个实施方案中，所述聚糖是硫酸皮肤素。
使用透明质酸结合的生物缀合物的方法
a. 软骨替代
在本文所述的一个实施方案中，提供了用于生物材料软骨替代组合物的添加剂。所述添加剂包含透明质酸结合的合成生物缀合物以添加到现有的生物材料软骨替代材料中。先前描述的透明质酸结合的合成生物缀合物的实施方式可应用于本文所述的添加剂。
如本文使用的，短语“现有的生物材料软骨替代材料”是指可用于替换体内受损、缺陷、或缺失软骨的生物相容性组合物。现有的各种类型的生物材料软骨替代组合物在本领域中是公知的并且是可以预期的。例如，现有的生物材料软骨或骨替代组合物包括DeNovo® NT天然组织移植物（Zimmer）、MaioRegenTM (JRI Limited)、或由Biomet生产的冷冻保存的骨关节组织的集合。
在一个实施方案中，提供了一种制备生物材料或骨软骨替代物的方法。该方法包括将合成的生物缀合物与现有的生物材料或骨软骨替代材料进行组合的步骤。先前描述的透明质酸结合的合成生物缀合物的实施方式适用于本文所述的方法。
在一个实施方案中，提供了一种治疗患者中的关节炎的方法。该方法包括向患者施用透明质酸结合的合成生物缀合物的步骤，其中所述合成的生物缀合物减少与关节炎相关的一种或多种症状。先前描述的透明质酸结合的合成生物缀合物的实施方式适用于本文所述的方法。
在各种实施方案中，在治疗关节炎的方法中使用的合成生物缀合物减少了与关节炎有关的一种或多种症状。本领域已知与关节炎有关的各种症状，包括但不限于疼痛、僵硬、压痛、炎症、肿胀、发红、发暖和活动性降低。关节炎的症状可能存在于关节、肌腱或身体的其他部位。 如本文使用的，“减少”是指预防或完全或部分减轻关节炎的症状。
在各种实施方案中，所述关节炎是骨关节炎或类风湿性关节炎。骨关节炎和类风湿性关节炎的发病机理和临床症状在本领域中是众所周知的。在该方法的一个实施方案中，合成生物缀合物在施用后充当润滑剂或防止软骨损失。在另一个实施方案中，合成的生物缀合物防止患者的骨骼的关节。例如，合成生物缀合物抑制在患有软骨减少或受损的患者中的骨关节上的骨。
在一个实施方案中，提供了一种减少或防止患者中的ECM组分的降解的方法。例如，提供了一种减少或防止患者的软骨中的ECM组分的降解的方法。该方法包括向患者施用透明质酸结合的合成生物缀合物。先前描述的透明质酸结合的合成生物缀合物的实施方式适用于本文所述的方法。在一个实施方案中，合成生物缀合物对基质金属蛋白酶（例如聚集蛋白聚糖酶）具有抗性。
在另一个实施方案中，提供了一种减少或防止患者中透明质酸降解的方法。该方法包括向患者施用透明质酸结合的合成生物缀合物。先前描述的透明质酸结合的合成生物缀合物的实施方式适用于本文所述的方法。
在另一个实施方案中，提供了一种减少或防止胶原降解的方法。该方法包括在胶原的存在下将透明质酸结合的合成生物缀合物与透明质酸接触，以及减少或防止胶原降解的步骤。先前描述的透明质酸结合的合成生物缀合物的实施方式适用于本文所述的方法。
在另一个实施方案中，提供了一种减少或防止硫酸软骨素降解的方法。该方法包括在胶原的存在下将透明质酸结合的合成生物缀合物与透明质酸接触，以及降低或防止硫酸软骨素降解的步骤。先前描述的透明质酸结合的合成生物缀合物的实施方式适用于本文所述的方法。
“减少ECM组分降解”，例如透明质酸、胶原、或硫酸软骨素降解，是指完全或部分分别降低透明质酸、胶原蛋白、或硫酸软骨素的降解。
在一个实施方案中，在患者中“减少透明质酸降解”是指降低透明质酸降解速率。在一个实施方案中，“减少胶原降解”是指降低胶原降解速度。 在一个实施方案中，“减少硫酸软骨素”降解是指降低硫酸软骨素降解的速度。
在本文描述的一个实施例中，提供了一种用于校正或修改患者中的组织缺陷的方法。 该方法包括向将透明质酸和透明质酸结合的合成生物缀合物施用进所述组织缺陷，其中所述缺陷被校正或修改。先前描述的透明质酸结合的合成生物缀合物的实施方式适用于本文所述的方法。 在一个实施方案中，所述组织缺陷是美容缺陷（cosmetic defect）。
在一个实施方案中，上述方法中使用的生物缀合物包含硫酸软骨素和约5至约10个肽，其中所述肽包括GAHWQFNALTVR (SEQ ID NO: 58)或GAHWQFNALTVRGSG (SEQ ID NO:357)的至少一个序列，并且通过酰肼-羰基键被结合至所述硫酸软骨素。
其他
a. 角膜伤口
本发明的方法可用于与角膜伤口愈合有关的各种应用。在一个实施方案中，需要治疗的角膜伤口状况是对角膜的创伤性损伤的结果(Chiapella, A. P., Rosenthal, A. R.British Journal of Ophthalmology, 1985; 69: 865-870)。在另一个实施方案中，需要治疗的伤口状况是由眼科手术引起，例如Epi-Lasik诱导角膜损伤(Tuft, S.J., et al.Br J Ophthalmol. 1993; 77: 243-247)。在某些情况下，由于缺乏或不完全愈合，可能会出现持续缺陷或复发性损伤(Kenyon, K. R. Cornea and Refractive Atlas ofClinical Wisdom. Eds. S.A. Melki and M. A. Fava. SLACK, Inc.: New Jersey, US,2011; pp. 39)。预期本发明的方法可用于治疗这些持久性缺陷或复发性损伤。
在一个方面，对角膜上皮的损伤导致角膜屏障功能的破坏，并且预期本文所述的方法可用于治疗所述损伤。
本文提供的生物缀合物可以被用来促进有需要的患者的角膜伤口愈合，其向患者施用靶向涉及角膜伤口愈合的特异性细胞外基质组分的生物缀合物。预期可以针对肽特性、连接至聚糖的肽的数目、和聚糖特性来定制本文提供的生物缀合物，以促进角膜伤口愈合。因此，可以设计许多分子设计参数来优化目标效果。
预期使用包含硫酸皮肤素和胶原蛋白结合的肽（例如RRANAALKAGELYKSILY (SEQID NO: 1)，称为“SILY”）的生物缀合物进行的治疗增强角膜伤口愈合，其结合至损伤区域、提供保护性水合层以使疼痛最小化、保护角膜胶原免于降解、和/或促进上皮迁移和/或上皮增殖。进一步考虑，生物缀合物将持续存在于受伤部位，因此不需要每天多次治疗。
b. 润滑素模拟
本文所述的合成生物缀合物可用于取代、复原、或补充具有胶原和透明质酸的组织，例如软骨、滑液和玻璃体液。特别地，同时具有胶原结合的肽和透明质酸结合的肽的肽聚糖可以被具体地用作润滑素模拟物并且可用于下述方法和用途中。
软骨退化。关节软骨上润滑良好的表面导致滑膜关节的最佳功能。然而，如在骨关节炎中发生的那样，润滑减少导致软骨退化和纤维性颤动，这又导致关节功能障碍和疼痛。润滑减少也会导致其他形式的关节炎（包括类风湿性关节炎）中的关节功能障碍和疼痛。
本文提供的合成生物缀合物可以被用来模拟润滑素的一些功能，润滑素是由衬于动物关节的内表面的组织分泌的粘液性糖蛋白。因此，合成的生物缀合物有可能增强关节软骨表面的润滑作用，从而减少磨损引起的软骨侵蚀。合成的生物缀合物还具有保护大分子（例如透明质酸和II型胶原）免于酶诱导的降解的潜力。
相应地，提供了一种在患者中治疗和/或预防软骨退化的方法，其包括向有需要的患者施用包含本文所述的细胞外基质结合的合成生物缀合物的药物组合物。在一个实施方案中，通过将包含细胞外基质结合的合成生物缀合物的药物组合物注射进滑液腔中来治疗患者。
还考虑的是，所述合成的生物缀合物可以被用来治疗和/或预防关节软骨疾病，其通过保护关节软骨基质免受创伤和细胞因子诱导的酶促降解。
玻璃体液变性。玻璃体液是填充眼后腔的粘弹性凝胶状物质。玻璃体置换术已被用于替代功能失调的玻璃体液，例如在发生玻璃体混浊或物理崩溃和液化的情况下，以及在视网膜手术期间作为临时性或永久性玻璃体置换。合适的玻璃体替代物应该是透明的、生物相容的，并具有接近天然玻璃体的密度和折射率。
相应地，提供了一种在患者中治疗和/或预防玻璃体液变性的方法，其包括向有需要的患者施用包含本文所述的细胞外基质结合的合成生物缀合物的药物组合物。
髓核变性。髓核是存在于椎间盘中的凝胶状物质，并且用于在压缩负荷下在每个椎间盘内的所有方向上分配液压，并且由软骨细胞样细胞、胶原原纤维、和通过透明质链聚集的生物缀合物聚集蛋白聚糖组成。髓核退化导致椎间盘在椎体之间均匀而有效地传递载荷的能力降低，并导致椎间盘的环形区域（称为纤维环）的损伤。环内的裂隙或泪液可以转化为疝或破裂的椎间盘，导致椎间盘区域的神经受到撞击，最后导致腰部或腿部疼痛。
还进行了只取代髓核的尝试。预期髓核的替换可阻止退化的核的初始脱水并使椎间盘返回至完全水合状态，从而推迟或阻止退化过程（包括相关的疼痛），并且恢复机械功能至椎体节段。
预期本文所述的合成生物缀合物将结合并保护纤维环。相应地，提供了一种在患者中治疗和/或预防纤维环变性的方法，其包括向有需要的患者施用包含本文所述的细胞外基质结合的合成生物缀合物的药物组合物。还提供了一种在患者中治疗和/或预防髓核变性的方法，其包括向有需要的患者施用包含本文所述的细胞外基质结合的合成生物缀合物的药物组合物。
在一个实施方案中，上述方法中使用的生物缀合物包含硫酸软骨素和约1至约20个肽，其中所述肽包含GAHWQFNALTVR (SEQ ID NO: 58)或GAHWQFNALTVRGSG (SEQ ID NO:357)的至少一个序列、以及WYRGRL (SEQ ID NO: 29)或WYRGRLGSG (SEQ ID NO: 392) 的至少一个序列。
在一个实施方案中，上述方法中使用的生物缀合物包含硫酸软骨素和约1至约20个肽，其中所述肽包含GAHWQFNALTVR (SEQ ID NO: 58)或GAHWQFNALTVRGSG (SEQ ID NO:357)的至少一个序列、以及RRANAALKAGELYKSILY (SEQ ID NO: 1)或RRANAALKAGELYKSILYGSG (SEQ ID NO: 287)的至少一个序列。
组合物
在一个实施方案中，该生物缀合物以组合物形式施用。本公开提供了包含生物缀合物和药学上可接受的载体的组合物。药学上可接受的载体是本领域普通技术人员已知的，包括水或盐水。如本领域已知的，组分以及它们的相对量由预期用途和递送方法确定。可以选择组合物中使用的稀释剂或载体，使得它们不降低生物缀合物的期望效果。合适的组合物的实例包括水溶液，例如在等渗盐水、5％葡萄糖中的溶液。也可以使用其他熟知的药学上可接受的液体载体，例如醇、乙二醇、酯和酰胺。在某些实施方案中，组合物还包含一种或多种赋形剂，例如但不限于离子强度调节剂、溶解度增强剂、糖(如甘露糖醇或山梨醇)、pH缓冲剂、表面活性剂、稳定聚合物、防腐剂和/或共溶剂。
在某些实施方案中，该组合物是水溶液。因为配制的容易性，以及能够通过滴注溶液来容易地施用这些组合物，所以水性溶液适合用于组合物制剂。在某些实施方案中，该组合物是混悬液、粘稠或半粘稠凝胶、或其他类型的固体或半固体组合物。在一些实施方案中，该组合物为本领域中众所周知的泡沫、软膏、液体洗涤剂、凝胶剂、喷雾剂和脂质体的形式。或者，局部施用是通过选自泵-导管系统、连续或选择性释放装置或粘附屏障(adhesionbarrier)的装置将所提供的生物缀合物输注至治疗部位。在某些实施方案中，该组合物是直接施用于或接触静脉或动脉的内壁的溶液。在一些实施方案中，该组合物包含聚合物基质。在其他实施方案中，该组合物是可吸收的。在某些实施方案中，该组合物包含pH缓冲剂。在一些实施方案中，该组合物含有润滑性增强剂(lubricity enhancing agent)。
在某些实施方案中，聚合物基质或聚合物材料被用作该组合物的药学上可接受的载体。本文所述的聚合物材料可包含天然或非天然聚合物，例如糖、肽、蛋白质、层粘连蛋白、胶原蛋白、透明质酸、离子和非离子水溶性聚合物；丙烯酸聚合物；亲水性聚合物，如聚环氧乙烷、聚氧乙烯-氧丙烯共聚物和聚乙烯醇；纤维素聚合物和纤维素聚合物衍生物，如羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素和醚化纤维素；聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、乳酸和乙醇酸的共聚物，或天然和合成的其它聚合试剂。在某些实施方案中，本文提供的组合物被配制成膜、凝胶、泡沫或其它剂型。
合适的离子强度调节剂包括，例如，甘油、丙二醇、甘露醇、葡萄糖、右旋糖、山梨糖醇、氯化钠、氯化钾和其它电解质。
在某些实施方案中，该生物缀合物的溶解度可能需要增强。在这种情况下，通过使用合适的制剂技术可以提高溶解度，例如掺入增溶剂成分，如甘露醇、乙醇、甘油、聚乙二醇、丙二醇、泊洛沙姆和本领域已知的其它物质。
在某些实施方案中，该组合物含有润滑性增强剂。如本文所用的，润滑性增强剂是指能够改变药学上可接受的载体的粘度的一种或多种药学上可接受的聚合物材料。合适的聚合物材料包括但不限于：离子型和非离子型水溶性聚合物；透明质酸及其盐、硫酸软骨素及其盐、葡聚糖、明胶、壳聚糖、胶凝糖(gellans)、其他生物缀合物或多糖或其任何组合；纤维素聚合物和纤维素聚合物衍生物，如羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素和醚化纤维素；胶原蛋白和改性胶原蛋白；半乳甘露聚糖，例如瓜尔豆胶、刺槐豆胶和他拉胶，以及衍生自上述天然树胶的多糖以及含有甘露糖和/或半乳糖部分作为主要结构组分的类似天然或合成树胶(例如羟丙基瓜尔胶)；胶，如黄蓍胶和黄原胶；结冷胶；海藻酸和海藻酸钠；壳聚糖；乙烯聚合物；亲水性聚合物，如聚环氧乙烷、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物和聚乙烯醇；羧基乙烯基聚合物或交联的丙烯酸聚合物，例如“卡波姆”家族聚合物(如能够以CarbopolTM商标商购获得的羧基聚亚烷基)；和各种其他粘性或粘弹性物质。在一个实施方案中，润滑性增强剂选自透明质酸、皮肤素、软骨素、肝素、乙酰肝素、角蛋白、葡聚糖、壳聚糖、藻酸盐、琼脂糖、明胶、羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素和醚化纤维素、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚维酮、卡波姆941、卡波姆940、卡波姆971P、卡波姆974P或其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，润滑性增强剂与生物缀合物同时施用。或者，在一个实施方案中，将润滑性增强剂与生物缀合物按顺序施用。在一个实施方案中，润滑性增强剂是硫酸软骨素。在一个实施方案中，润滑增强剂是透明质酸。该润滑性增强剂可以改变组合物的粘度。
关于上述润滑性增强剂的结构、化学性质和物理性质的进一步细节参见例如US5,409,904、US 4,861,760(结冷胶)、US 4,255,415、US 4,271,143(羧基乙烯基聚合物)、WO94/10976(聚乙烯醇 )、WO 99/51273(黄原胶)和WO 99/06023(半乳甘露聚糖)。提出使用非酸性润滑性增强剂，如中性或碱性试剂，以有助于实现制剂的所需pH。
在一些实施方案中，生物缀合物可与以下物质组合：矿物质、氨基酸、糖、肽、蛋白质、维生素(诸如抗坏血酸)或层粘连蛋白、胶原蛋白、纤连蛋白、透明质酸、纤维蛋白、弹性蛋白或聚集蛋白聚糖或生长因子(如表皮生长因子、血小板衍生的生长因子、转化生长因子β或成纤维细胞生长因子)、以及糖皮质激素(如地塞米松)或粘弹性改变剂(如离子型和非离子型水溶性聚合物；丙烯酸聚合物；亲水性聚合物(如聚环氧乙烷、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物和聚乙烯醇)；纤维素聚合物和纤维素聚合物衍生物(如羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素和醚化纤维素)；聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、乳酸和乙醇酸的共聚物、或天然和合成的其它聚合物)。
合用于本发明组合物的pH缓冲剂包括例如乙酸盐、硼酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐和磷酸盐缓冲剂，以及盐酸、氢氧化钠、氧化镁、磷酸二氢钾、碳酸氢盐、氨、碳酸、盐酸、柠檬酸钠、柠檬酸、乙酸、磷酸氢二钠、硼砂、硼酸、氢氧化钠、二乙基巴比妥酸和蛋白质以及各种生物缓冲液，例如TAPS、Bicine、Tris、Tricine、HEPES、TES、MOPS、PIPES、二甲胂酸盐或MES。在某些实施方案中，将合适的缓冲体系(例如磷酸钠、乙酸钠、柠檬酸钠、硼酸钠或硼酸)加入组合物中以防止储存条件下的pH漂移。在一些实施方案中，缓冲液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液(即，含有磷酸钠、氯化钠，以及在一些制剂中含有氯化钾和磷酸钾)。具体浓度将根据使用的试剂而变化。在某些实施方案中，加入pH缓冲体系(例如磷酸钠、乙酸钠、柠檬酸钠、硼酸钠或硼酸)以将pH保持在约pH 4至约pH 8、或约pH 5至约pH 8、或约pH 6至约pH 8、或约pH 7至约pH 8。在一些实施方案中，选择缓冲剂以将pH保持在约pH 4至约pH 8的范围内。在一些实施方案中，pH从约pH5到约pH8。在一些实施方案中，缓冲液是盐水缓冲液。在某些实施方案中，所述pH为约pH 4至约pH 8、或约pH 3至约pH 8、或约pH 4至约pH 7。在一些实施方案中，所述组合物为膜、凝胶、贴剂或液体溶液形式，其包含聚合物基质、pH缓冲剂、润滑性增强剂和生物缀合物，其中所述组合物任选地含有防腐剂；并且其中所述组合物的pH在约pH4至约pH8的范围内。
在组合物中使用表面活性剂来递送更高浓度的生物缀合物。表面活性剂起到增溶抑制剂和稳定胶体分散体的作用，所述胶体分散体例如是胶束溶液、微乳液、乳液和混悬液。合适的表面活性剂包含聚山梨酸酯、泊洛沙姆、聚氧乙烯40硬脂酸酯、聚氧乙烯蓖麻油、泰洛沙泊、曲通和失水山梨糖醇单月桂酸酯。在一个实施方案中，表面活性剂的亲水/亲油/平衡值(HLB)在12.4至13.2范围内，并且可用于眼用(例如TritonX114和泰洛沙泊)。
在某些实施方案中，将稳定聚合物(即缓和剂)加入到组合物中。稳定聚合物应该是离子/带电的聚合物，更具体地说是在其表面上携带负电荷的聚合物，其可以表现出(-)10-50 mV的ζ-电位以获得物理稳定性并且能够在水中形成分散体(即水溶性)。在一个实施方案中，稳定聚合物包含来自交联聚丙烯酸酯家族的聚电解质或多种聚电解质(如果多于一种的话)，例如卡波姆和Pemulen®，特别是卡波姆974p(聚丙烯酸)，其范围为约0.1％至约0.5％ w/w。
在一个实施方案中，该组合物包含增加生物缀合物对血管的细胞外基质的渗透性的试剂。优选地，该增加渗透性的试剂选自苯扎氯铵、皂苷、脂肪酸、聚氧乙烯脂肪醚、脂肪酸烷基酯、吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮、丙酮酸、焦谷氨酸或其混合物。
该生物缀合物可以被消毒以去除不需要的污染物，包括但不限于内毒素和传染物。可以使用不会不利地影响生物缀合物的结构和生物趋向性质(biotropic property)的灭菌技术。在某些实施方案中，可以使用常规灭菌技术来消毒和/或灭菌生物缀合物，包括环氧丙烷或环氧乙烷处理、无菌过滤、气体等离子体灭菌、γ辐射、电子束和/或过酸(如过乙酸)灭菌。在一个实施方案中，该生物缀合物可以经受一个或多个灭菌过程。或者，可以将生物缀合物包裹在包括塑料包装或箔包装的任何类型的容器中，并且可以进一步灭菌。
在一些实施方案中，将防腐剂加入到组合物中以防止使用期间的微生物污染。加入到组合物中的合适的防腐剂包括苯扎氯铵、苯甲酸、对羟基苯甲酸烷基酯、苯甲酸烷基酯、氯丁醇、氯甲酚、十六烷醇、脂肪醇(如十六烷醇)、汞的有机金属化合物(如乙酸盐、硝酸苯汞或硼酸苯汞)、双咪唑烷基脲、己二酸二异丙酯、二甲基聚硅氧烷、EDTA盐、维生素E及其混合物。在某些实施方案中，防腐剂选自苯扎氯铵、氯丁醇、二甲基十二烷基苄基溴化铵、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯乙醇、依地酸二钠、山梨酸或聚季铵盐-1。在某些实施方案中，该组合物包含防腐剂。在一些实施方案中，防腐剂的用量为约0.001％至约1.0％w/v。在某些实施方案中，该组合物不含防腐剂并被称为“无防腐剂的”。在一些实施方案中，单位剂量组合物是无菌的、但无防腐剂的。
在一些实施方案中，生物缀合物和其他药剂的单独或顺序施用是有利于递送组合物的。在某些实施方案中，生物缀合物和其它药剂可以以不同的给药频率或间隔给药。例如，生物缀合物可以每天给药，而其他药剂可以给药频率低些。另外，如本领域技术人员所显而易见的，可以使用相同的施用途径或不同的施用途径施用生物缀合物和其它药剂。
可以使用任何有效的施用生物缀合物的方案。例如，生物缀合物可以作为单一剂量施用或作为多剂量每日方案施用。此外，例如一至五天每周的交错疗法可以用作每日治疗的替代方案。
在各种实施方案中，生物缀合物可以局部施用，例如通过膜、凝胶、贴剂或液体溶液施用。在一些实施方案中，组合物以在缓冲的无菌水溶液形式提供。在某些实施方案中，溶液具有约1至约100厘泊(cps)、或约1至约200cps、或约1至约300cps、或约1至约400cps的粘度。在一些实施方案中，溶液具有约1至约100cps的粘度。在某些实施方案中，溶液具有约1至约200cps的粘度。在某些实施方案中，溶液具有约1至约300cps的粘度。在某些实施方案中，溶液具有约1至约400cps的粘度。在某些实施方案中，溶液呈可注射液体溶液的形式。在其它实施方案中，组合物被配制成粘性液体(即几百至几千cps的粘度)、凝胶或软膏。在这些实施方案中，生物缀合物分散或溶解在合适的药学上可接受的载体中。
与用于基于导管的递送的生物缀合物一起使用的示例性组合物可以包含：a)如本文所述的合成生物缀合物；b)药学上可接受的载体；c)聚合物基质； d)pH缓冲剂，以提供约pH 4至约pH 8范围内的pH；和e)浓度范围为总配方重量的约0.25％至约10％的水溶性润滑性增强剂，或任何单独的组分a)、b)、c)、d)或e)，或a)、 b)、c)、d)或e)的任何组合。
示例性制剂可以包含：a)如本文所述的生物缀合物；b)药学上可接受的载体；c)聚合物基质;；和d)pH缓冲剂以提供约pH4至约pH8范围内的pH，其中所述溶液对于液体溶液具有约3至约30cps的粘度。
本公开所考虑的示例性组合物还可以用于通过注射施用，包括水性或油性混悬液或乳剂(其具有芝麻油、玉米油、棉籽油或花生油)，还包括酏剂(其具有甘露醇、右旋糖)或无菌水溶液以及类似的药物载体。盐水中的水溶液也常规用于注射，但是在本文中不太优选。也可以使用乙醇、甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等(及其合适的混合物)、环糊精衍生物和植物油。例如，通过使用诸如卵磷脂的包衣，通过在分散液的情况下维持所需的粒径和通过使用表面活性剂，来维持适当的流动性。可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来预防微生物的作用。
无菌可注射溶液通过如下方法制备：将所需量的组分加入具有上述各种其他成分(按需要)的适当溶剂中，然后过滤除菌。通常，通过将各种灭菌的活性成分加入含有基础分散介质和所需的上述其它成分的无菌载体中来制备分散液。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其由先前无菌过滤的溶液产生活性成分加任何另外的所需成分的粉末。
在制备包含本文所述的生物缀合物的药物组合物时，活性成分通常通过赋形剂或载体稀释和/或包封在可为胶囊、小袋、纸或其他容器形式的载体内。当赋形剂用作稀释剂时，其可以是固体、半固体或液体材料(如上)，其充当活性成分的媒介物、载体或介质。因此，所述组合物可以是膜、凝胶、贴剂、散剂、锭剂、小药囊、扁囊剂、酏剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂、气雾剂(固体形式或在液体介质中)、包含例如高达10wt％的活性化合物的软膏剂、软明胶膜和硬明胶膜、凝胶、贴剂、无菌注射溶液和无菌包装粉末的形式。
合适赋形剂的一些实例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、无菌水、糖浆和甲基纤维素。所述制剂可另外包含：润滑剂，如滑石粉、硬脂酸镁和矿物油；润湿剂；乳化剂和悬浮剂；防腐剂，如羟基苯甲酸甲酯和羟基苯甲酸丙酯；甜味剂；和调味剂。
用于药物递送的膜在本领域中是公知的，并且包括无毒、无刺激性聚合物，不含可浸出的杂质，如多糖(例如纤维素、麦芽糖糊精等)。在一些实施方案中，聚合物是亲水性的。在其他实施方案中，聚合物是疏水性的。该膜粘附在其所施用的组织上，并且在约一周的时间内被缓慢地吸收到体内。本文所述的薄膜剂型中使用的聚合物是可吸收的，并且显示出如本领域中所公知的足够的剥离强度、剪切强度和拉伸强度。在一些实施方案中，膜是可注射的。在某些实施方案中，在手术介入之前、之中或之后将膜施用至患者。
这里使用的凝胶是指可以具有从软和弱到硬和韧的性质的固态胶状物质。如本领域所熟知的，凝胶是通过流体在其整个体积内膨胀的非流体胶体网络或聚合物网络。水凝胶是一种凝胶，其包含亲水性聚合物链网络，有时以胶体凝胶的形式存在，其中水是分散介质。水凝胶是高吸收性的并且可以含有大量的水，例如大于90％的水。在一些实施方案中，本文所述的凝胶包含天然或合成的聚合物网络。在一些实施方案中，凝胶包含亲水性聚合物基质。在其他实施方案中，凝胶包含疏水性聚合物基质。在一些实施方案中，凝胶具有与天然组织非常相似的柔韧程度。在某些实施方案中，凝胶是生物相容的和可吸收的。在某些实施方案中，在外科手术之前、之中或之后将凝胶施用至患者。
本文使用的液体溶液是指本领域公知的溶液剂、混悬剂、乳剂、滴剂、软膏剂、液体洗剂、喷雾剂、脂质体。在一些实施方案中，所述液体溶液含有水性pH缓冲剂，当添加少量酸或碱时所述水性pH缓冲剂抵抗pH的变化。在某些实施方案中，在手术介入之前、之中或之后将液体溶液施用至患者。
示例性制剂可以包含：a)如本文所述的一种或多种生物缀合物；b)药学上可接受的载体；和c)作为基质网络的亲水性聚合物，其中所述组合物配制成粘性液体(即几百至几千厘泊的粘度)、凝胶或软膏。在这些实施方案中，生物缀合物分散或溶解在合适的药学上可接受的载体中。
在某些实施方案中，生物缀合物或包含其的组合物在配制之前、期间或之后被冻干。因此，本文还提供了包含生物缀合物的冻干组合物或包含含有如本文所述生物缀合物的组合物的冻干组合物。
剂量
生物缀合物的合适剂量可以通过标准方法确定，例如通过在实验室动物模型或临床试验中建立剂量-反应曲线来确定，并且可以根据患者状况、被治疗的疾病状态、施用途径和组织分布以及共同使用其他治疗方法的可能性而显著变化。给予患者的有效量基于体表面积、患者体重或质量、以及医师对患者状况的评估。在各种示例性实施例中，剂量在约0.01μg至约10g的范围内。例如，对于全身性递送，剂量可以是约10g、或约5g、或约1g。在其它示例性实施方案中，有效剂量范围为每剂约100μg至约10 g，或每剂约100μg至约1 g，或每剂约100μg至约500mg，约0.01μg至约100 mg剂量，或每剂约100μg至约50mg，或每剂约500μg至约10mg，或每剂约1mg至10mg，或每剂约1至约100mg， 或每剂约1mg至500mg，或每剂约1mg至200mg，或每剂约10mg至100mg，或每剂约10mg至75mg，或每剂约10mg至50mg，或每剂约10mg，或每剂约20mg，或每剂约30mg，或每剂约40mg，或每剂约50mg，或每剂约60mg，或每剂约70mg毫克，或每剂约80毫克，或每剂约90毫克，或每剂约100毫克。在本文所述的各种实施方案的任一个中，有效剂量范围为每剂约0.01μg至约1000mg，每剂1μg至约100mg，约100μg至约1.0mg，约50μg至约600μg，约50μg至约700μg，约100μg至约200μg，约100μg至约600μg，约100μg至约500μg，约200μg至约600μg，或约100μg至约50mg，或每剂约500μg至约10mg，或每剂约1mg至约10mg。
在一些实施方案中，组合物以多剂量形式包装。因此需要防腐剂来防止使用过程中的微生物污染。在某些实施方案中，可以将如上所述的合适的防腐剂加入到组合物中。在一些实施方案中，组合物含有防腐剂。在某些实施方案中，防腐剂的用量为约0.001％至约1.0％w/v。在一些实施方案中，单位剂量组合物是无菌的、但无防腐剂的。
实施例
实施例1. EDC功能化方案(Hep-SILY)
材料
用合适浓度的离液剂(如丁醇、乙醇、氯化胍、高氯酸锂、乙酸锂、氯化镁、苯酚、丙醇、十二烷基硫酸钠、硫脲或脲(例如约5M至约10M的脲))来制备合适的反应缓冲液(例如2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)。用1N HCl将最终的pH调节至约4.5至约6的pH。
将肽(例如，RRANAALKAGELYKSILYGSG-NHNH2 (SEQ ID NO: 397) (MW = 2253 Da，结构如下所示))溶解于反应缓冲液中至3mg/mL。肽溶液通常在偶联反应之前新鲜制备。
将生物素化的肽(例如生物素RRANAALKAGELYKSILYGSG-NHNH2 (SEQ ID NO: 398)(MW = 2479 Da))溶解于反应缓冲液中至3mg/mL。所得的标记的肽溶液通常在偶联反应之前新鲜制备。
将聚糖(例如，肝素(MWavg = 16 kDa))溶解于反应缓冲液中至20mg/mL，并储存于-20℃或在偶联反应之前新鲜制备。
将EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺)在加入到聚糖中之前立即溶解于反应缓冲液中至75mg/mL。
缀合-含肝素的生物缀合物(100mg)
通过向肝素中加入50摩尔过量的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)(59.3mg或0.79mL的75mg/mL水溶液)以活化肝素。原料在室温下反应约5分钟。然后将标记的肽以1:1摩尔比(肝素：标记的肽)(15.3mg或5.1mL的3mg/mL在反应缓冲液中溶液)加入到活化的肝素中。然后将反应混合物在室温下振荡约5分钟。在振荡的同时，以1:7摩尔比(Hep：肽)(97.3mg或32.4mL的3mg/mL在反应缓冲液中溶液)加入肽。然后使各组分在室温下在振荡下反应约2小时。在指定的时间之后，通过在室温下用0.5M NaOH(大约4.5mL)将pH提高至8达约30分钟并且振荡来淬灭反应。
所得到的Hep-SILY生物缀合物通过渗滤器(Spectrum-MidiKros mPES 10K中空管过滤器)纯化，使用5个柱体积(CV)的反应缓冲液(约250mL)制备，随后用10个CV的具有TPM的水(约500mL)在约15psi下以35mL /分钟的流速洗脱。然后将滞留物(即最终产物)在-80℃冷冻。任选地，将产品冻干至干燥。
实施例2. 血小板因子-4(PF4)测定的血小板抑制
以下方法用于评估本文公开的生物缀合物对血小板抑制的作用。用纤维状胶原包被微孔板，然后用1％牛奶封闭。将生物缀合物在1X PBS中以1mg/mL开始稀释，并以10X浓缩因素用1X PBS稀释，并将50μL溶液加入胶原包被的孔中。处理液在室温下孵育15分钟。然后通过除去处理溶液并用1X PBS冲洗三次而用未结合的处理液冲洗孔。
通过静脉穿刺采集健康志愿者的全血。丢弃前5mL血液，然后将大约15mL采集到柠檬酸盐玻璃真空采血管(BD Bioscience)中。将血液在25℃下以200g在玻璃管中离心20分钟。离心血液的顶层(富含血小板的血浆)被用于血小板实验。
在室温下，将富含血小板的血浆(50μL/孔)加入微孔板中1小时。温育1小时后，从每个孔中取出45mL富含血小板的血浆，并加入到含有5mL ETP(107mM EDTA、12mM茶碱和2.8mM 前列腺素E1)的微量离心管中以抑制进一步的血小板活化。将这些试管在4℃以2000g离心30分钟以使血小板沉淀。收集上清液用于ELISA研究以测试血小板活化标志物的存在。利用夹心ELISA来检测每种蛋白质。两个夹心ELISA的组分均购自R＆D Systems，并遵循所提供的方案。有必要在1X PBS中的1％BSA中稀释血小板血清，以使值落入试验的线性范围内。通过血小板因子4(PF-4)的释放测量血小板活化。
实施例3. 原纤维形成试验
以下方法用于评估本文公开的生物缀合物对原纤维形成的影响。通过将2mg/mL在HCl中的胶原蛋白在2X TES缓冲液(60mM TES、60mM Na2HPO4、300mM NaCl)中稀释至1mg/mL并且保持在冰上来制备胶原溶液。将含有生物缀合物的测试样品溶解在1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液中至终浓度为0.6mg/mL，并保持在冰上。将测试样品以1：1(体积:体积)的比率加入到胶原中，使得最终的胶原浓度为0.5mg/mL。然后通过涡旋彻底混合胶原测试溶液。
通过监测在37℃孵育期间胶原蛋白测试溶液的浊度(313nm处的吸光度)来测量原纤维形成。将样品以100μL/孔移液到96孔板中。将酶标仪保持在37℃，每分钟监测一次浊度，直至60分钟。
实施例4. 胶原结合平板(Collagen-Binding Plate)试验
以下方法用于评估本文公开的生物缀合物对胶原的结合亲和力。采用类似的试验来评估其他靶标(例如透明质酸、ICAM、VCAM、选择蛋白)的结合亲和力。
生物缀合物变体的胶原结合通过平板试验进行比较，其中胶原涂覆在96孔板上。在室温下，将胶原蛋白在0.02N乙酸中以50μg/ mL涂布在高结合平板上1小时。未结合的胶原蛋白用1X PBS pH7.4冲洗。然后将平板在室温下在1X PBS溶液中的1％牛奶中封闭1小时。
将含有生物素化的肽的生物缀合物变体溶解在1X PBS pH7.4中的1％牛奶中至终浓度为1mg/mL。从这个溶液中进行10X系列稀释。然后将分子在封闭的胶原包被的平板上温育，并在室温下温育15分钟。然后用含1％BSA和0.2％吐温20的1X PBS冲洗平板3次。
通过链霉亲和素-HRP检测结合的分子，其在含1％BSA和0.2％吐温20的1X PBS中以1：500稀释，并在室温下以200μL/孔温育20分钟。用含0.2％吐温20的1X PBS将链霉亲和素溶液从板上漂洗3次。然后将TMB底物溶液在室温下以100μL/孔加入各孔15分钟，并用100μL硫酸溶液(0.16M)终止显色。然后在450nm测量孔中的吸光度，并以吸光度对浓度作图而以剂量-响应形式绘制结合亲和力曲线。
实施例5. 透明质酸结合生物缀合物的比较
该实施例显示，当与如US 2014/0301983中所述的透明质酸结合生物缀合物相比时，包含具有如本文所述的透明质酸结合单元的肽的生物缀合物表现出对透明质酸的出人意料的增强的结合亲和力。
生物缀合物
使用硫酸软骨素和GAH肽(即，GAHWQFNALTVRGSG-NHNH2(SEQ ID NO：399))和STM肽(即STMMSRSHKTRSHHVGSG-NHNH2 (SEQ ID NO: 400))根据上述实施例1制备本文所述的具有酰肼-羰基键的结合了透明质酸的生物缀合物。还使用硫酸软骨素和标记的GAH肽(即，生物素GAHWQFNALTVRGSG-NHNH2(SEQ ID NO：401))和标记的STM肽(即，生物素STMMSRSHKTRSHHVGSG-NHNH2(SEQ ID NO：402))根据上述实施例1制备了具有酰肼-羰基键的结合了透明质酸的生物缀合物的生物素化形式。
使用氧化的硫酸软骨素和具有GGGC间隔物的GAH肽(即，GAHWQFNALTVRGGGC(SEQID NO：402))通过如US2014/0301983(通过引用整体并入本文)中所述的BMPH接头制备了结合透明质酸的生物缀合物。使用生物素化的硫酸软骨素作为对照(图1A)。
合并试验(Incorporation Assay)
为了评估聚集蛋白聚糖模拟物与透明质酸的结合，按照制造商的方案(ESI BIO)合成了HyStem水凝胶。简言之，使Glycosil(硫醇改性的透明质酸)、Extralink-lite(聚乙二醇二丙烯酸酯，PEGDA)和脱气去离子水(DG)达到室温。在使用注射器和针头的无菌条件下，将1.0mL DG水加入到Glycosil小瓶中，并在水平振荡器上振荡40分钟。同样，将0.5mL的DG水加入到Extralink-Lite小瓶中。然后将Extralink-lite和Glycosil以1:4的体积比(0.25mLExtralink-Lite与1.0mL Glycosil)混合。将50μl的混合物从Eppendorf移液到0.5mL的管帽中，使溶液胶凝2小时。然后将这些水凝胶与500μl聚集蛋白聚糖模拟物溶液一起在24孔板中孵育3小时，并在水平振荡器上振荡。随后，通过在1X磷酸盐缓冲盐水(1X PBS)中孵育过夜来洗涤凝胶，接着使用链霉亲和素DyLight荧光探针(Lifetechnologies)染色。链霉亲和素DyLight在1X PBS中以1：200的体积比稀释，并加入到凝胶中孵育1小时，并在水平振荡器上振荡。非特异性结合的荧光探针通过将凝胶在1X PBS中孵育20分钟并在水平振荡器上振荡(重复两次)来洗去。然后使用光谱共焦显微镜(Nikon，A1 +)对凝胶成像。
图1显示，具有通过酰肼-羰基键与CS结合的GAH肽的生物缀合物(图1C)和具有通过酰肼-羰基键与CS结合的STM肽的生物缀合物(图1D)，与具有通过氧化糖开环化学和BMPH接头结合CS的GAH肽的生物缀合物相比(图1B)，显示出更大的透明质酸结合亲和力。
实施例6. 在不改变护理标准的情况下将生物缀合物递送至血管瘘
该实施例证明，本文公开的生物缀合物可以用作管腔血管覆盖层(luminal vascularcoating)以防止天然AVF中的内膜增生。在猪的股动脉和静脉中产生瘘，用本文公开的生物缀合物治疗，或用盐水作为对照。预期生物缀合物将被有效地递送至血管瘘(fistulavessels)而不改变护理标准，并且将导致比未经处理的瘘明显更少的狭窄和扩大的血管直径。
通过这个实施例可以测试三种递送方法：(1)紧接在血流之前递送，(2)在血流之前故意剥脱瘘之后递送，以及(3)在血流恢复之后(例如5分钟后)递送至形成的瘘。
方法1被认为是主要的递送方法，方法2和方法3可以单独使用，或者在方法1不足以导致生物缀合物覆盖血管腔的情况下，方法2和方法3与方法1一起使用。在方法2中，通过用镊子的手柄摩擦静脉来进行血管的故意剥脱，类似于在AVF创建期间临床应用扩张器。可以检查方法3以确定紧接在瘘产生之后的静脉中的高血流是否导致无法通过初始递送治疗剂解决的内皮细胞层的损伤。在方法3中，血流恢复到瘘，然后夹住近端静脉和动脉停止。然后用生物缀合物冲洗瘘并恢复血流。
在所有情况下，在新形成的吻合中移除单个缝线，并使用具有平滑球头的喂食针将生物缀合物冲洗通过瘘。生物缀合物(例如约5mL)冲洗通过瘘。在生物缀合物递送后(例如约2小时)处死动物。去除瘘，用盐水冲洗，并用10％福尔马林固定(例如约10分钟)。
细胞用鬼笔环肽染色。当生物缀合物具有生物素标签时，使用荧光标记的链霉亲和素标记检测生物缀合物。将静脉与动脉分开，并将两种血管打开，使得可以使用共聚焦显微镜检查它们的腔表面。
预期所有三种方法的生物缀合物递送都会有效。通过测试未暴露于生物缀合物的动脉来说明非特异性结合，即没有明显的染色。在CT扫描过程中，通过向动物注射造影剂以使血管可视化从而确定狭窄程度，并通过图像测量血管的直径。
实施例7. Hep-SILY用于治疗股腘动脉内的狭窄或闭塞
以下是设计用于评估和比较球囊血管成形术加管腔内Hep-SILY对平原老式球囊血管成形术(POBA)加生理盐水(对照)治疗股腘动脉(femoropopliteal artery)内狭窄或闭塞的安全性和有效性的临床试验。根据实施例1制备每肝素约6-8个SILY肽的Hep-SILY。
本试验提出了一个多中心、双臂(2-arm)、平行、盲法、随机比较气囊血管成形术加管腔内Hep-SILY和球囊血管成形术单独治疗原发性股腘动脉的重新或再狭窄病变的安全性和有效性。大约66名受试者表现出跛行或缺血性休息疼痛并且在患者流出动脉到脚的股腘动脉中具有血管造影显著病变，这些患者在此项研究中将被随机分配和治疗。
关键的入选标准将是40岁以上并愿意提供同意书。主要排除标准为妊娠、预期寿命少于5年、筛查3个月内有出血性卒中史、心肌梗死史、筛查2周内溶栓或心绞痛、以及已知的肝素禁忌证。
受试者将接受基线血管造影，以确认股腘动脉中的血管造影显著损伤。血管造影确认并通过导丝成功穿越病变后，受试者将以2：1比率随机给予POBA加SBCV治疗(组1，N =44)与POBA治疗加生理盐水(对照)(组2，N =22)。组1将接受球囊血管成形术及至多10 ml的Hep-SILY冲洗，而组2将接受球囊血管成形术和至多10 ml的盐水冲洗。
研究的总时间约为10个月(从首个受试者首次访问到最后一个受试者最后一次访问)，包括4个月的招募时间。参与个体研究的时间大约是初始手术后的24周，筛查将在研究前一个月进行。
在出院前以及在4、8、12、18和24周的随访中收集各种数据。主要目的是有效性，它是对分析段(整段损伤段加上5mm近端和远端边缘)治疗后24周时的晚期管腔丢失(LLL)测定来确定的，由独立的、不知情的血管造影核心实验室来评估。LLL被定义为紧接在首次手术后的最小管腔直径(MLD)与随访时的MLD之间的差异。
使用24周随访血管造影图来比较术后血管造影图来测量LLL(对于慢性肾功能不全的受试者，使用双相多普勒超声来测量LLL)。
次要目的是安全性，其以治疗紧急不良事件(AE)的发生率、临床实验室评估、生命体征和体检结果来衡量。具体的安全事件包括全因死亡、无截肢(踝关节以上)生存率(AFS)和靶血管重塑(TVR)。
实施例8：Hep-SILY用于治疗或预防新生内膜增生或外周动脉疾病(PAD)
在递送了如本文所述的生物缀合物(例如实施例1的Hep-SILY)的兔血管成形术模型中评估新生内膜增生。该研究中使用了多只(例如六只)兔子。每只动物接受了球囊血管成形术介导的右侧和左侧髂动脉损伤。将动物分成测试组(肝素-SIYY)或载体对照组(1×PBS)。在每个组中两个髂动脉均受伤，并在球囊损伤后立即用测试物品或对照物处理。
在损伤之后的给定时间(例如28天)之后，对动物实施安乐死，并对动脉节段进行组织学评估。典型地，选择来自每个血管的具有最严重新生内膜反应的几个(例如三个)组织切片用于形态测量。使用数字形态测量法(IPLab软件，Rockville，MD)由Movat染色载玻片测量外弹性层(EEL)、内弹性层(IEL)和内腔的横截面积。新生内膜厚度为在最小和最大位置的从IEL到内腔的距离，然后取平均值。横截面积用于计算以下内容：
•中间区域= EEL区域 - IEL区域
•新生内膜面积= IEL面积 - 内腔面积
•中膜-内膜面积= EEL面积 - 内腔面积
•％狭窄= [1-(内腔面积/ IEL面积)] * 100
变量的均值使用方差分析(ANOVA)进行比较。p值小于0.05通常被认为是统计学显著的。
预期如本文所述的生物缀合物(例如实施例1的Hep-SILY)将有效抑制新生内膜增生，因此可用于治疗或预防外周动脉疾病(PAD)。
实施例9：生物缀合物/肽聚集体形成
如实施例1所述合成Hep-SILY，在纯化过程中进行下列改变。在用5 CV的反应缓冲液纯化之前，将反应物稀释到水中，使离液剂(例如脲)浓度降低到约3M。随后，将反应物纯化到16CV的水中。
通过尺寸排阻色谱法评价所得产物，证明高分子量物质的形成，表明聚集体形成。将Hep-SILY复合物的性能与不含离子相互作用的SILY肽的参考Hep-SILY进行比较。与不含聚集体的Hep-SILY相比，含有Hep-SILY的聚集体以更高的亲和力(更低的EC50值)结合胶原蛋白。
实施例10. 用生物缀合物处理的静脉移植物
下面的方法可用于确认，使用如本文所述的生物缀合物处理过的静脉移植物在移植物用于搭桥手术中时可导致减少的静脉移植失败。该实施例还将测试制备静脉移植物的条件。
A. 优化生物缀合物的浓度
在开始动物模型研究之前，将对切除的兔血管组织的动脉进行离体研究以优化药物浓度和浸泡持续时间。来自离体结合研究的信息将被用来界定浸泡时间、药物浓度和制剂缓冲液以产生静脉移植物保存溶液。
首先，生物缀合物与静脉的结合将被量化以检查生物缀合物浓度和浸泡时间的影响。从一只兔子切下的静脉将被切成大约1平方厘米的片段并放置在24孔板中。将测试缓冲盐水中不同浓度的生物缀合物和不同处理时间。组织碎片将在含有洗涤剂的提取介质中均质化并离心以沉淀碎片。通过bicinchoninic acid assay(BCA)试剂测定上清液的蛋白质含量，通过ELISA或ECL(MSD(Meso Scale Discovery)公司的电化学发光技术)测定药物含量。
另外，为了确定血管壁的何种损伤程度可增强结合力，还将进行第二组实验，在第二组实验中使用橡胶淀帚轻轻地将血管刮净，再将其切割成碎片。此过程将模拟外科医生在植入前从静脉除去瓣膜的过程。
除了如本文所述的生物缀合物的定量之外，将进行免疫组织化学(IHC)以确认药物物质结合静脉的管腔。根据上述实验选择两个条件(浓度和浸泡时间)进行测试。从兔子切除颈静脉，并用生物缀合物溶液冲洗和浸泡。然后将静脉用缓冲盐水冲洗3次。组织将被切成3段。一段将固定在中性缓冲福尔马林(NBF)中，第二段将在最佳切割温度(OCT)下冷冻保存，第三段将被速冻。将来自低温恒温器或福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样品的组织切片用H＆E染色并使用已经制备对药物特异性的抗体进行免疫染色。尽管生物缀合物将与血管上的任何暴露的胶原蛋白结合，但该实施例期望看到药物覆盖血管的内表面。
此外，IHC程序将使用人尸体静脉进行，以确保该程序可转移至人体组织。从死亡24小时内的尸体中获得静脉组织。
B. 在静脉搭桥动物手术中评估生物缀合物溶液
静脉移植物模型将在雄性新西兰白兔中进行。静脉搭桥移植物将采用吻合套管(anastomotic cuff)技术构建。收集外颈静脉，并放入肝素化盐水溶液中或静脉移植物保存液中(合适的时间及合适浓度的生物缀合物)。在储存期后，将静脉末端穿过由4F血管导管鞘形成的聚氨酯套管，然后在套管的外侧翻转并用缝合线固定。然后将颈动脉管腔暴露，动脉切口为1-2 cm。套住并翻转的静脉末端将被插入颈动脉管腔，动脉将用缝合线固定在套管周围。一旦恢复血流，动脉的插入段将被完全分开以允许静脉移植物的完全延伸。通过观察移植物内的脉动血流来确认移植物通畅。
将使用一共20只动物。对于其中十只动物，在移植到颈动脉之前，静脉浸于肝素化的生理盐水中，对于另十只动物，静脉浸于静脉移植物保存溶液中。动物将存活28天。选择肝素盐水作为对照组，因为它常用于临床。
在第28天，诱发麻醉并确认血管的通畅性。将给予静脉内的肝素丸剂，并将动物处死。静脉移植物将通过10％中性缓冲福尔马林(NBF)从升主动脉原位灌注固定。然后切除静脉移植物并浸入NBF中固定，然后进行石蜡包埋切片和形态测定。将对静脉移植物沿其长度方向上的至少三个不同部分进行分析，避开紧邻异物套管的组织。
将石蜡包埋的6μm切片用Movat五色染色剂着色并用Aperio显微镜成像。将绘出管腔的边界、内弹性膜(IEL)和外弹性膜(EEL)，并计算每个边界内的面积。新生内膜面积将计算为IEL面积-管腔面积。
每组有10个静脉移植物，每个移植物内至少要检查3个区域。每个移植物中的三个测量值将被平均以给出每个移植物的平均新生内膜面积值。10个样本量使得产生用于检测新内膜增生减少25％的足够概率(sufficient power)(0.8，α= 0.05)，其中测量值中标准偏差为20％。这一目标的成功标准包括用生物缀合物治疗的静脉移植物中新生内膜增生减少25％。
C. 液体稳定性研究
生物缀合化合物的设计和合成正在开发中，并且具有完善的控制。将完成一个稳定性程序，以确定在室温和在4℃时以液体形式储存的生物缀合物的稳定性。生物缀合物溶液先前以冻干形式储存，并在使用前复原。发现这种溶液在3个月内稳定(迄今为止测试过的时间)。因此，将开始在4℃和在室温时以液体形式储存的生物缀合物的正式稳定性方案。在这种情况下，液体制剂将是生物缀合物用于临床递送的方便形式。
D. 大鼠的毒性研究
将进行剂量范围发现研究。首先，大鼠将在四个剂量水平下接受单次IV注射以确定两天后的急性毒性。附加组(satellite group)将按相似的剂量给药，并在一定的时间间隔取血样，以确定药代动力学参数。接下来，将在非GLP环境中在大鼠中进行为期7天的重复剂量研究，不设置恢复期。这项研究的结果将被用来选择最高的耐受剂量水平。最后，使用最高耐受剂量水平进行28天的长期重复剂量研究，并设置28天恢复期。
本研究的目的包括死亡率、临床观察、给药前体重和死亡时体重、给药前摄食量和死亡时摄食量、血样的毒代动力学观察和临床病理学。标准组织病理学将在标准器官上进行。
预计没有观察到毒性。预计在发现任何毒性作用之前将达到溶解度极限。
实施例11. oxDS-SILY与eDS-SILY的稳定性比较
进行稳定性研究，以比较通过氧化化学(即，开环；oxDS-SILY)合成的或根据上述实施例1使用硫酸皮肤素代替肝素(即，非开环；eDS-SILY)合成的DS-SILY的稳定性。
简言之，按以下步骤制备oxDS-SILY。将硫酸皮肤素(DS)溶解在pH 5.5的0.1M磷酸钠缓冲液中，制成浓度为20 mg/mL的溶液。官能度由高碘酸盐的浓度控制。根据下表，将高碘酸盐溶解在pH 5.5的0.1M磷酸钠缓冲液中而制备不同浓度的高碘酸盐溶液。
目标物 (SILY/DS) 高碘酸盐浓度 (mg/mL)
20 2.3
将DS溶液与高碘酸盐溶液以1：1(V：V)的比率在室温下混合2小时以提供氧化的DS，其使用Biogel P6柱和磷酸盐缓冲盐水进行纯化。将具有结合了末端GSG-NHNH2的SILY肽(即，RRANAALKAGELYKSILYGSG-NHNH2(SEQ ID NO：397))溶解于水中以提供1 mg/mL的浓度，如果需要的话，使用超声助溶。将SILY肽在室温下缓慢加入到氧化的DS中，并搅拌约2小时(避光)。反应混合物的pH维持在6以上。任选地，可以将1摩尔类似官能化的SILY生物素(生物素标记的肽)与1摩尔的DS反应，然后可以加入未标记的SILY肽达到(摩尔当量-1) 预期的醛数量。DS-SILY20也是通过向1摩尔的DS中加入20摩尔的未标记的SILY来制备的。产物用水纯化以提供所需的DS-SILY。
合成样品并冷冻储存长达8周。在0、4周和8周时测量HPLC-SEC。对峰面积进行比较，峰面积减少表明降解。
结果表明，eDS-SILY在8周测试期间保持稳定，而在此期间oxDS-SILY降解。oxDS-SILY的主峰和高分子量相关峰(实心柱和阴影柱)分别在8周内下降，而eDS-SILY值保持相对恒定并且不随时间减少(图2)。
实施例12. 用于治疗胃食管损伤的临床试验方案
该实施例提出了一个临床试验来测试选自本文所述的生物缀合物在治疗胃食管损伤中的能力，例如Hep-SILY、其它包含上述支化肽的含肝素的生物缀合物、或DS-SILY。所测试的试剂将是制备成溶液或凝胶的生物缀合物。胃食管损伤在患者和医疗系统中发病率很高且治疗成本大。保持食道通畅消耗了大量的资源。
目标疾病是任何胃食管损伤，无论是GERD自发损伤还是干预导致的医源性损伤。这是一项通过食管胃十二指肠镜(EGD)局部给予生物缀合物治疗胃食管损伤的随机、多中心、安全性和有效性的研究。
该临床试验的目标包括：1)评估在EGD介入时给予的EGD递送的生物缀合物治疗的整体安全性概况；2)确定EGD递送的生物缀合物在降低胃食管损伤中的再狭窄率方面的有效性。
将有五十(50)名患者参与试验，其中25名将接受生物缀合物(EGD递送)，另25名接受载体(EGD递送)。
关键入选标准包括：(a)需要EGD消融的GERD相关食管损伤，(b)需要EGD扩张的食管狭窄，以及(c)需要EGD治疗的消化性溃疡疾病(PUD)。关键排除标准包括H/O严重过敏性疾病。
随访日程安排为一周、六周和十二周。安全性评估包括：(1)确定不良事件(AE)和严重不良事件(SAE)；(2)体检/生命体征：特别注意局部发现；(3)包括生物缀合物抗体的实验室(基线，第1周 、第12周和第24周)。EGD递送可以在6周和12周时重复。
为了测定食道的通畅性，将在治疗前和研究结束时进行定量的钡剂吞咽。
该试验的主要目标是复发性狭窄的比率降低，次要目标是经口饮食的进展时间，复发性狭窄的时间以及改善的PUD评分或症状。预计试验将在所有这些目标上取得成功。

Claims (86)

1.一种生物缀合物，其包含聚糖和至少一个肽，其中所述肽包含胶原结合单元、透明质酸结合单元、ICAM结合单元、VCAM结合单元和/或选择素结合单元，并通过酰肼-羰基键与聚糖结合。
2.根据权利要求1所述的生物缀合物，其中所述聚糖选自藻酸盐、软骨素、硫酸软骨素、皮肤素、硫酸皮肤素、乙酰肝素、硫酸乙酰肝素、肝素、葡聚糖、硫酸葡聚糖和透明质酸或它们的衍生物。
3.根据权利要求1所述的生物缀合物，其中所述肽包含胶原结合单元。
4.根据权利要求3所述的生物缀合物，其中所述肽的胶原结合单元以低于约1 mM的解离常数(K d )结合至胶原。
5.根据权利要求1所述的生物缀合物，其中所述肽包含透明质酸结合单元。
6.根据权利要求5所述的生物缀合物，其中所述肽的透明质酸结合单元以低于约1 mM的解离常数(K d )结合至透明质酸。
7.根据权利要求1所述的生物缀合物，其中所述生物缀合物包含具有至少一个胶原结合单元的肽和具有至少一个透明质酸结合单元的肽，和/或至少一个具有胶原结合单元和透明质酸结合单元的肽。
8.根据权利要求1所述的生物缀合物，其中所述生物缀合物包含至少一个具有ICAM结合单元的肽和至少一个具有选择素结合单元的肽。
9.根据前述任一项权利要求所述的生物缀合物，其中所述肽包含至多约120个氨基酸、或至多约100个氨基酸、或至多约50个氨基酸、或至多约40个氨基酸。
10.根据前述任一项权利要求所述的生物缀合物，其中所述肽包含至多约25个氨基酸。
11.根据前述任一项权利要求所述的生物缀合物，其中所述生物缀合物包含1至约25个肽、或约5至约25个肽、或约11至约14个肽。
12.根据前述任一项权利要求所述的生物缀合物，其中所述生物缀合物包含1至约10个肽、或约7-8个肽。
13.根据前述任一项权利要求所述的生物缀合物，其中所述聚糖包含约1％至约75％的官能化，其中所述官能化百分比(％)由所述聚糖上被肽官能化的二糖单元的百分比确定。
14.根据前述任一项权利要求所述的生物缀合物，其中所述聚糖包含约5％至约30％的官能化，或约10％至约40％的官能化。
15.根据前述任一项权利要求所述的生物缀合物，其中所述聚糖包含约25％的官能化，或约30％的官能化。
16.根据前述任一项权利要求所述的生物缀合物，其中所述聚糖不含氧化裂解的糖单元。
17.根据前述任一项权利要求所述的生物缀合物，其中所述聚糖是衍生的聚糖。
18.根据权利要求17所述的生物缀合物，其中所述衍生的聚糖是部分N-脱硫酸衍生物、部分O-脱硫酸衍生物、部分O-羧甲基化衍生物或它们的任何组合。
19.根据权利要求1所述的生物缀合物，其中所述肽包含的氨基酸序列选自：YKSILY(SEQ ID NO: 179)、LYKSILY (SEQ ID NO: 180)、ELYKSILY (SEQ ID NO: 181)、GELYKSILY(SEQ ID NO: 2)、AGELYKSILY (SEQ ID NO: 182)、KAGELYKSILY (SEQ ID NO: 183)、LKAGELYKSILY (SEQ ID NO: 184)、ALKAGELYKSILY (SEQ ID NO: 185)、AALKAGELYKSILY(SEQ ID NO: 186)、NAALKAGELYKSILY (SEQ ID NO: 187)、ANAALKAGELYKSILY (SEQ IDNO: 188)、RANAALKAGELYKSILY (SEQ ID NO: 189)、RRANAALKAGELYKSILY (SEQ ID NO:1)、QLYKSILY (SEQ ID NO: 190)、GQLYKSILY (SEQ ID NO: 16)、AGQLYKSILY (SEQ ID NO:191)、KAGQLYKSILY (SEQ ID NO: 192)、LKAGQLYKSILY (SEQ ID NO: 193)、ALKAGQLYKSILY(SEQ ID NO: 194)、AALKAGQLYKSILY (SEQ ID NO: 195)、NAALKAGQLYKSILY (SEQ ID NO:196)、ANAALKAGQLYKSILY (SEQ ID NO: 197)、RANAALKAGQLYKSILY (SEQ ID NO: 198)以及RRANAALKAGQLYKSILY (SEQ ID NO: 17)，或包含与上述序列具有至少约80%序列同一性并且包含至少一个YKS序列的序列。
20.根据权利要求1所述的生物缀合物，其中所述肽包含的氨基酸序列选自：YKCILY(SEQ ID NO: 199)、LYKCILY (SEQ ID NO: 200)、ELYKCILY (SEQ ID NO: 201)、GELYKCILY(SEQ ID NO: 4)、AGELYKCILY (SEQ ID NO: 202)、KAGELYKCILY (SEQ ID NO: 203)、LKAGELYKCILY (SEQ ID NO: 204)、ALKAGELYKCILY (SEQ ID NO: 205)、AALKAGELYKCILY(SEQ ID NO: 206)、NAALKAGELYKCILY (SEQ ID NO: 207)、ANAALKAGELYKCILY (SEQ IDNO: 208)、RANAALKAGELYKCILY (SEQ ID NO: 209)、RRANAALKAGELYKCILY (SEQ ID NO:3)、QLYKCILY (SEQ ID NO: 210)、GQLYKCILY (SEQ ID NO: 211)、AGQLYKCILY (SEQ IDNO: 212)、KAGQLYKCILY (SEQ ID NO: 213)、LKAGQLYKCILY (SEQ ID NO: 214)、ALKAGQLYKCILY (SEQ ID NO: 215)、AALKAGQLYKCILY (SEQ ID NO: 216)、NAALKAGQLYKCILY (SEQ ID NO: 217)、ANAALKAGQLYKCILY (SEQ ID NO: 218)、RANAALKAGQLYKCILY (SEQ ID NO: 219)以及RRANAALKAGQLYKCILY (SEQ ID NO: 220)，或包含与上述序列具有至少约80%序列同一性并且包含至少一个YKS序列的序列。
21.根据权利要求1所述的生物缀合物，其中所述肽包含氨基酸序列GAHWQFNALTVR(SEQ ID NO: 58)或与该序列具有至少约80%序列同一性并且能够结合至透明质酸的序列。
22.根据权利要求1所述的生物缀合物，其中所述肽包含氨基酸序列STMMSRSHKTRSHHV(SEQ ID NO: 59) 或与该序列具有至少约80%序列同一性并且能够结合至透明质酸的序列。
23.根据权利要求1所述的生物缀合物，其中所述肽包含GAHWQFNALTVR (SEQ ID NO:58) 或GAHWQFNALTVRGSG (SEQ ID NO: 357)或与前述序列具有至少约80%序列同一性并且能够结合至透明质酸的序列中的至少一个序列，以及WYRGRL (SEQ ID NO: 29)或WYRGRLGSG (SEQ ID NO: 392) 或与前述序列具有至少约80%序列同一性并且能够结合至胶原的序列中的至少一个序列。
24.根据权利要求1所述的生物缀合物，其中所述肽包含GAHWQFNALTVR (SEQ ID NO:58)或GAHWQFNALTVRGSG (SEQ ID NO: 357) 或与前述序列具有至少约80%序列同一性并且能够结合至透明质酸的序列中的至少一个序列，以及RRANAALKAGELYKSILY (SEQ ID NO:1)或RRANAALKAGELYKSILYGSG (SEQ ID NO: 287) 或与前述序列具有至少约80%序列同一性并且能够结合至胶原的序列中的至少一个序列。
25.根据权利要求1所述的生物缀合物，其中所述肽包含的氨基酸序列选自：i)IELLQAR (SEQ ID NO: 117)、IELLQARGSC (SEQ ID NO: 118)、IDLMQAR (SEQ ID NO:119)、IDLMQARGSC (SEQ ID NO: 120)、QITWAQLWNMMK (SEQ ID NO: 121)、QITWAQLWNMMKGSC (SEQ ID NO: 122)、NAFKILVVITFGEK (SEQ ID NO: 152)、NAFKILVVITFGEKGSC (SEQ ID NO: 153)、ITDGEA (SEQ ID NO: 154)、ITDGEAGSC (SEQ IDNO: 155)、DGEATD (SEQ ID NO: 156)、或DGEATDGSC (SEQ ID NO: 157)、或与前述序列具有至少约80%序列同一性并且能够结合至选择素、ICAM和/或VCAM的序列。
26.根据前述任一项权利要求所述的生物缀合物，其中所述酰肼基团任选地经由间隔物键合至所述肽的C末端。
27.根据前述任一项权利要求所述的生物缀合物，其中所述酰肼基团任选地经由间隔物键合至所述肽的N末端。
28.根据前述任一项权利要求所述的生物缀合物，其中所述酰肼基团经由间隔物键合至所述C末端，上述间隔物包含一个或多个选自甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、赖氨酸和丝氨酸的氨基酸。
29.根据权利要求27所述的生物缀合物，其中所述间隔物选自甘氨酸、甘氨酸-甘氨酸、丝氨酸-甘氨酸、赖氨酸-精氨酸、精氨酸-精氨酸和甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸。
30.一种组合物，其包含前述任一项权利要求所述的生物缀合物，其中每个聚糖的平均肽数目少于约30个。
31.一种组合物，其包含权利要求1-29的任一项所述的生物缀合物，其中每个聚糖的平均肽数目为约5个至约30个。
32.一种组合物，其包含权利要求1-29的任一项所述的生物缀合物，其中每个聚糖的平均肽数目为约7个。
33.一种组合物，其包含权利要求1-29的任一项所述的生物缀合物或权利要求30-32的任一项所述的组合物，以及包含胶原结合单元、透明质酸结合单元、ICAM结合单元、VCAM结合单元和/或选择素结合单元的额外的肽，其中所述肽非共价地结合至所述生物缀合物，并且其中所述组合物包含基于聚糖中的二糖单元的数目的1%至约200%的肽。
34.根据权利要求33所述的组合物，其中所述额外的肽与所述生物缀合物离子键合。
35.一种在血管损伤或介入之前、期间和/或之后治疗患者的血管的方法，所述方法包括将有效量的权利要求1-29中任一项所述的生物缀合物或者权利要求30-34中任一项所述的组合物施用至所述血管。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述生物缀合物经肠胃外施用给患者。
37.根据权利要求36所述的方法，其中肠胃外施用是通过选自血管内、静脉内、动脉内、肌内、皮肤、皮下、经皮、真皮内和表皮内的途径施用。
38.根据权利要求36或37所述的方法，其中所述生物缀合物使用针或用于输注的装置经肠胃外施用。
39.根据权利要求35-38中任一项所述的方法，其中所述生物缀合物通过导管、作为球囊上的涂层、通过多孔球囊或作为支架上的涂层施用于患者。
40.根据权利要求35所述的方法，其中所述介入选自血管成形术、经皮腔内斑块旋切术、支架术或其他外科手术。
41.根据权利要求35所述的方法，其中所述生物缀合物结合患者的裸露血管。
42.根据权利要求35所述的方法，其中所述生物缀合物抑制血小板活化。
43.根据权利要求41-42中任一项所述的方法，其中所述生物缀合物抑制血小板与所述裸露血管的结合。
44.根据权利要求41-43中任一项所述的方法，其中所述生物缀合物抑制内膜增生。
45.根据权利要求41-44中任一项所述的方法，其中所述生物缀合物抑制血栓形成。
46.根据权利要求41-45中任一项所述的方法，其中所述生物缀合物抑制血管痉挛。
47.根据权利要求41-46中任一项所述的方法，其中所述生物缀合物刺激内皮细胞增殖。
48.根据权利要求40-47中任一项所述的方法，其中所述生物缀合物结合裸露血管上的暴露胶原。
49.一种用于在患者中建立血管通路的方法，所述方法包括：
将溶液应用于在血管通路中的血管壁；和
恢复或启动血管通路中的血流，
其中所述溶液包含有效量的权利要求1-29中任一项所述的生物缀合物或权利要求30-34中任一项所述的组合物。
50.一种改善需要血液透析的患者中动静脉瘘(AVF)的成熟的方法，所述方法包括：
将溶液应用于AVF的内腔的内壁；和
恢复或启动AVF中的血流，
其中所述溶液包含有效量的权利要求1-29中任一项所述的生物缀合物或权利要求30-34中任一项所述的组合物。
51.一种在有需要的患者中治疗和/或预防组织粘连的方法，所述方法包括在器官的暴露的组织上施用药物组合物，其中所述药物组合物包含权利要求1-29中任一项所述的生物缀合物或权利要求30-34中的任一项所述的组合物。
52.一种在有需要的患者中治疗和/或预防腹部或盆腔粘连的方法，包括在腹部或盆腔器官的暴露组织上施用药物组合物，其中所述药物组合物包含权利要求1-29中任一项所述的生物缀合物或权利要求30-34中任一项所述的组合物。
53.一种治疗患有与内皮功能障碍相关的疾病的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1-29中任一项所述的生物缀合物或权利要求30-34中任一项所述的组合物。
54.根据权利要求53所述的方法，其中与内皮功能障碍有关的疾病选自动脉粥样硬化、冠状动脉疾病、糖尿病、高血压、高胆固醇血症、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、青光眼、尿毒症、败血症和器官衰竭。
55.一种用于预防或减轻患者血管部位炎症的方法，其中所述部位(a)包含渗透的内皮内衬或受损的内皮细胞，并且(b)不从血管介入手术中恢复，所述方法包括向患者施用权利要求1-29中任一项所述的生物缀合物或权利要求30-34中任一项所述的组合物。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述血管介入手术包括经皮冠状动脉介入(PCI)手术。
57.根据权利要求53所述的方法，其中所述疾病选自血管疾病、肾脏疾病、肺部疾病、皮肤疾病、风湿病、胃肠疾病、肿瘤、血液病、传染病、神经疾病、眼科疾病和内分泌疾病。
58.根据权利要求53所述的方法，其中所述疾病选自类风湿性关节炎、糖尿病、尿毒症、细菌或病毒感染、动脉粥样硬化、皮炎、肾小球肾炎、急性肺损伤、纤维化、缺血性急性肾衰竭和吸烟诱发的血管损伤。
59.一种促进有需要的患者的角膜伤口愈合的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的权利要求1-29中任一项所述的生物缀合物或权利要求30-34中任一项所述的组合物。
60.一种在患有胃食管损伤的患者中维持食道开放、减少再狭窄、改善伤口愈合、减少复发性狭窄、加速进展至经口饮食或改善消化性溃疡疾病(PUD)症状的方法，所述方法包括将药物组合物局部施用于患者的受损的胃食管组织，其中所述药物组合物包含有效量的权利要求1-29中任一项所述的生物缀合物或权利要求30-34中任一项所述的组合物。
61.一种用于治疗患者的胃食管损伤的方法，所述方法包括将药物组合物局部施用于胃食管组织的损伤处，其中所述药物组合物包含有效量的权利要求1-29中任一项的生物缀合物或权利要求30-34中任一项的组合物。
62.一种治疗患者关节炎的方法，所述方法包括给患者施用有效量的权利要求1-29中任一项所述的生物缀合物或权利要求30-34中任一项所述的组合物。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述关节炎选自骨关节炎和类风湿性关节炎。
64.一种减少瘢痕形成的方法，所述方法包括向有需要的个体施用有效量的权利要求1-29中任一项所述的生物缀合物或权利要求30-34中任一项所述的组合物。
65.一种促进伤口愈合的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的权利要求1-29中任一项所述的生物缀合物或权利要求30-34中任一项所述的组合物。
66.一种治疗已经经历血管介入的患者的狭窄的方法，所述方法包括向患者施用权利要求1-29中任一项所述的生物缀合物或权利要求30-34中任一项所述的组合物。
67.一种治疗和/或预防患者中富含透明质酸组织的降解的方法，所述方法包括向有需要的患者施用权利要求1-29中任一项所述的生物缀合物或权利要求30-34中任一项所述的组合物。
68.一种治疗和/或预防患者软骨退化的方法，所述方法包括向有需要的患者施用权利要求1-29中任一项所述的生物缀合物或权利要求30-34中任一项所述的组合物。
69.一种治疗和/或预防患者软骨退化的方法，所述方法包括将根据权利要求1-29中任一项所述的生物缀合物或根据权利要求30-34中任一项所述的组合物注射到有需要的患者的滑液腔中。
70.一种治疗和/或预防患者中玻璃体液变性的方法，所述方法包括向有需要的患者施用权利要求1-29中任一项所述的生物缀合物或权利要求30-34中任一项所述的组合物。
71.一种治疗和/或预防患者的髓核变性的方法，所述方法包括向有需要的患者施用权利要求1-29中任一项所述的生物缀合物或权利要求30-34中任一项所述的组合物。
72.一种治疗有需要的患者的股腘动脉内的狭窄或闭塞的方法，所述方法包括在球囊血管成形术之前、期间和/或之后将溶液施加到腔的内壁，其中所述溶液包含有效量的权利要求1-29中任一项所述的生物缀合物或权利要求30-34中任一项所述的组合物。
73.一种治疗或预防患者的冠状动脉疾病和/或外周动脉疾病的方法，所述方法包括向有此需要的患者施用权利要求1-29中任一项所述的生物缀合物或权利要求30-34中任一项所述的组合物。
74.一种制备用于搭桥手术的血管移植物的方法，所述方法包括使血管段的内壁与包含有效量的权利要求1-29中任一项所述的生物缀合物或权利要求30-34中任一项所述的组合物的溶液接触。
75.根据权利要求74所述的方法，其中所述血管是静脉。
76.根据权利要求74所述的方法，其中所述接触在允许所述生物缀合物结合到所述内壁的条件下进行。
77.一种包含血管段的血管移植物，所述血管段包含结合有效量的根据权利要求1-29中任一项所述的生物缀合物或根据权利要求30-34中任一项所述的组合物的内壁。
78.一种用于在经历搭桥移植手术的患者中预防或减少移植失败的方法，所述方法包括将移植物植入患者的循环系统中，其中所述移植物包含结合至有效量的权利要求1-29中任一项所述的生物缀合物或根据权利要求30-34中任一项所述的组合物的内壁。
79.一种用于在经历搭桥移植手术的患者中预防或减少移植失败的方法，所述方法包括将移植物植入到患者的循环系统中，并且在移植之前、之中或之后将溶液注射到移植物内部，所述溶液包含有效量的权利要求1-29中任一项所述的生物缀合物或权利要求30-34中任一项所述的组合物。
80.一种制备包含聚糖和1至50个肽的生物缀合物的方法，所述方法包括在任选地存在活化剂的情况下，在偶联反应条件下，使聚糖与足够量的肽接触以提供所述生物缀合物，其中所述肽包含酰肼基团，其中所述肽包含胶原结合单元、透明质酸结合单元、ICAM结合单元、VCAM结合单元和/或选择素结合单元，并且所述肽通过肽上的末端酰肼基团与聚糖上的羰基之间的酰肼-羰基键而与聚糖结合。
81.根据权利要求80所述的方法，其中所述生物缀合物包含YKS或YKC中的至少一个序列。
82.根据权利要求80所述的方法，其中所述活化剂是碳化二亚胺试剂。
83.根据权利要求80所述的方法，其中所述活化剂选自由N,N'-二环己基碳化二亚胺、N,N'-二异丙基碳化二亚胺和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺。
84.根据权利要求80所述的方法，其中所述酰肼基团任选经由间隔物与所述肽的C-末端结合。
85.根据权利要求84所述的方法，其中所述间隔物包含一个或多个选自甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、赖氨酸和丝氨酸的氨基酸。
86.根据权利要求84或85所述的方法，其中所述间隔物选自甘氨酸、甘氨酸-甘氨酸、丝氨酸-甘氨酸、精氨酸-精氨酸、赖氨酸-精氨酸、赖氨酸-精氨酸-精氨酸和甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸。
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