JP6876217B2 - 抗炎症作用を呈するペプチドグリカン誘導体 - Google Patents

Description

この発明は抗炎症作用を呈するペプチドグリカン誘導体に関するものである。

炎症は全身または局所で発生する生体反応であり、痛み、かゆみ、発赤などの症状を呈する。ウイルスや細菌感染、異物の侵入や擦傷により生体が刺激された場合に、炎症反応が生じる。

炎症時には、炎症性サイトカイン、炎症物質や炎症酵素などの生体物質が産生され、炎症反応を発症させる。炎症は生活において障害になることが多く、たとえば、ウイルス感染による発熱や頭痛などがある。皮膚では接触性アレルギーやアトピーも炎症反応を呈し、肌の健康を損ねる。

そのため、抗炎症作用を呈する物質が開発されている。合成ステロイド剤は炎症を抑制するものの副作用として日和見感染が認められる。また、ＮＡＩＤｓと言われる非ステロイド性抗炎症剤にも副作用があり、腸管異常や嘔吐などが認められる。そこで副作用のない天然物由来の抗炎症作用を発揮する物質が探索されている。

天然の抗炎症剤に関する発明としてはアミジン及びアルカンポリオールを含む組成物に関する発明があるものの、より具体的に抗炎症作用を発揮する物質が特定されていない。（例えば、特許文献１参照。）

また、ペプチドによる抗炎症作用に関する発明として有用ポリペプチドの発明があるものの、その作用が不明瞭であり、かつ、有用物質の特定に至っていない。（例えば、特許文献２参照。）

このように、抗炎症作用を発揮し、副作用の少ない天然物は望まれているものの、有用な成分や物質に関する発明はない。

そのため、天然物由来でかつ、抗炎症作用を呈する物質や誘導体が望まれている。

特許第４２１７７４０号 特願２０１０−００４２９５

前記したように既存の天然物による抗炎症作用は軽度であり、産業上への利用が限定されるという課題があり、また、化学合成された物質では安全性に問題があり、利用が限られている。

そのため、副作用が弱く優れた抗炎症作用を呈する物質が望まれている。

上記の目的を達成するために、請求項１に記載の発明は下記の式（１）に示される抗炎症作用を呈するペプチドグリカン誘導体に関するものである。

この発明は、以上のように構成されているため、次のような効果を奏する。

請求項１に記載の誘導体によれば、優れた抗炎症作用を発揮することができる。

以下、この発明を具体化した実施形態について詳細に説明する。

まず、下記の式（１）に示される抗炎症作用を呈するペプチドグリカン誘導体は炭素元素２７個、水素元素３９個、酸素元素１３個、窒素元素５個及びイオウ元素１個から構成されている。

すなわち、Ｃ２７Ｈ３９Ｏ１３Ｎ５Ｓ１の化学式である。Ｌ−システインとＬ−アルギニンからなるジペプチドと１分子のフェノキシ基及び２分子のＤ−リボースから構成されている。

この誘導体のフェニル基部分はリボースの水酸基とエステル結合している。また、リボースはエーテル結合している。この誘導体のフェニル基部分は炎症により誘導されるＣＯＸ−２（シクロオキシゲナーゼ タイプ２）の活性を抑制することにより炎症性プロスタグランジンたとえば、プロスタグランジンＥ２を減少させる。このプロスタグランジンＥ２の減少はＣＯＸ−２の拮抗型阻害による働きである。一方、ＣＯＸ−１には影響を及ぼさないという選択性がある。

この誘導体のペプチドとリボースから構成される環状部分は炎症性サイトカインの産生を抑制する。炎症性サイトカインとしてはＴＮＦアルファがあり、この誘導体はＴＮＦアルファの産生を抑制する。この抑制はこの誘導体がＴＮＦアルファのｍＲＮＡの発現を抑制することにより生じる。

この誘導体は炎症性プロスタグランジン及び炎症性サイトカインを抑制することにより抗炎症作用を発揮する。その他にも、ブラジキニンの産生を抑制し、炎症性プロテアーゼの産生を抑制する働きをこの誘導体は有している。

この構成成分であるリボースはＤ型であり、天然型である。リボースは核酸の構成成分であるものの、その生理作用は多岐にわたっている。このリボースは発酵食品や化粧料としても利用され、その安全性は確認されている。

ペプチドを構成しているシステイン及びアルギニンは天然型のＬ型である。これらのアミノ酸の安全性も確認されている。システインはＳＨ基を有し、還元状態を呈する。また、アルギニンは一酸化窒素の供給源であり、一酸化窒素は血管内皮に作用して血流を増加させ、弛緩作用を発揮する。

また、このペプチドグリカン誘導体をフェニル基、システイン、アルギニンとリボースを原料として有機化学的に合成することができる。この有機合成された誘導体は標準物質として解析や分析に利用される。しかし、製造にはコストがかかり、また、有機溶媒を使用することから、化粧品や食品分野には利用しにくいという安全性上の欠点がある。

このペプチドグリカン誘導体の構造についてはこの誘導体の重水素化ジメチルスルホキシド中の６００ＭＨｚのＨ−ＮＭＲ（１Ｈ−ＮＭＲ）解析（ブルカー製）により、ピークの位置は０．９２、１．７３、１．８４、２．７６、３．１４、３．２３、３．３５、３．３６、３．４３、３．４４、３．４９、３．６５、３．６７、３．８３、３．８８、３．９４、４．８２、４．９２、５．０３、５．０９、７．１１及び７．３３ｐｐｍに認められる。

また、この誘導体の重水素化ジメチルスルホキシド中のＣ−ＮＭＲ（１３Ｃ−ＮＭＲ）解析ではピークの位置は２４．２、２５．１、２５．４、４５．７、５０．２、６２．８、６３．１、６８．２、７２．０、７２．１、７５．６、７５．７、７８．７、７８．８、８０．３、８１．６、８１．９、９５．７、１０３．２、１１８．９、１３２．１、１３２．５、１６０．７、１７３．１及び１７３．８ｐｐｍに認められる。

このペプチドグリカン誘導体は天然由来であることから、吸収性と安全性が高い。特に、安全性の面から、このペプチドグリカン誘導体は体内酵素、特に、ペプチダーゼやエステラーゼなどにより分解される。仮に、この誘導体を大量に摂取した場合でも、生体内に過剰量は分解されることから安全性が高い。

このペプチドグリカン誘導体は抗炎症作用を発揮する。特に、皮膚の炎症を抑える働きが強い。その理由は胃における胃酸による分解である。つまり、胃酸の強酸性によって分解される。したがって、経口摂取する場合には、耐酸性の製剤化または腸溶性カプセルに充填されるなど胃酸に対する対策が必要である。

さらに、この誘導体は粉末にした場合、水溶液と反応する際に、水素ガスを発生する。発生する水素ガスは活性酸素を除去する働きがあるため、紫外線や酸化物質によって発生した活性酸素を除去して生体を安定に維持できることから好ましい。また、水素ガスはヒドロキシルラジカルを消去し、還元作用を呈し、かつ、抗酸化作用を発揮することから好ましい。

さらに、システインはケラチンを増加させる原料であり、このペプチドグリカン誘導体にはケラチン増加作用を有する。このペプチドグリカン誘導体はケラチン合成酵素を活性化してケラチン量を増加させる。このケラチンの増加作用は皮膚や毛髪を強固にすることから好ましい。

このペプチドグリカン誘導体の抽出方法または製造方法としては発酵法、酵素反応法や化学合成法などがある。

このペプチドグリカン誘導体の抽出方法としてツバメの巣や大豆などの豆類から抽出することができる。この抽出方法ではプロテアーゼやリパーゼなどの消化酵素を利用することは抽出効率が高められることから好ましい。

特に、ツバメの巣にはもともとペプチドグリカンが豊富であることから原料として好ましい。また、酵素反応法の場合、ペプチドグリカンを含有する植物から抽出することができる。または、発酵により微生物に生合成させることができる。

ツバメの巣を発酵させることはこのペプチドグリカン誘導体の製造方法として有用である。発酵させる場合には、大豆とともに納豆菌により発酵させる発酵技術は日本では知識が豊富であり、食用としての実績も多く、かつ、安全性も高いことから好ましい。

さらに、高純度の誘導体を得る目的で精製されることは好ましい。精製の方法としては、分離用の樹脂などの精製操作を利用することは好ましい。

例えば、分離用担体または樹脂により分離され、分取されることは好ましい。分離用担体または樹脂としては、表面が後述のようにコーティングされた、多孔性のペプチドグリカン、酸化珪素化合物、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリプロピレン、スチレン−ビニルベンゼン共重合体等が用いられる。０．１〜３００μｍの粒度を有するものが好ましく、粒度が細かい程、精度の高い分離が行なわれるが、分離時間が長い欠点がある。

例えば、逆相担体または樹脂として表面が疎水性化合物でコーティングされたものは、疎水性の高い物質の分離に利用される。陽イオン物質でコーティングされたものは陰イオン性に荷電した物質の分離に適している。また、陰イオン物質でコーティングされたものは陽イオン性に荷電した物質の分離に適している。特異的な抗体をコーティングした場合には、特異的な物質のみを分離するアフィニティ担体または樹脂として利用される。

アフィニティ担体または樹脂は、抗原抗体反応を利用して抗原の特異的な調製に利用される。分配性担体または樹脂は、シリカゲル（メルク社製）等のように、物質と分離用溶媒の間の分配係数に差異がある場合、それらの物質の単離に利用される。

これらのうち、製造コストを低減することができる点から、吸着性担体または樹脂、分配性担体または樹脂、分子篩用担体または樹脂及びイオン交換担体または樹脂が好ましい。さらに、分離用溶媒に対して分配係数の差異が大きい点から、逆相担体または樹脂及び分配性担体または樹脂はより好ましい。

分離用溶媒として有機溶媒を用いる場合には、有機溶媒に耐性を有する担体または樹脂が用いられる。また、医薬品製造または食品製造に利用される担体または樹脂は好ましい。これらの点から吸着性担体としてダイヤイオン（三菱化学（株）社製、ＨＰ−２０及びＨＰ−２１）及びＸＡＤ−２またはＸＡＤ−４（ロームアンドハース社製）、分子篩用担体としてセファデックスＬＨ−２０（アマシャムファルマシア社製）、分配用担体としてシリカゲル、イオン交換担体としてＩＲＡ−４１０（ロームアンドハース社製）、逆相担体としてＤＭ１０２０Ｔ（富士シリシア社製）がより好ましい。

これらのうち、ダイヤイオンＨＰ−２０、セファデックスＬＨ−２０及びＤＭ１０２０Ｔはさらに好ましい。

得られた抽出物は、分離前に分離用担体または樹脂を膨潤化させるための溶媒に溶解される。その量は、分離効率の点から抽出物の重量に対して１〜４０倍量が好ましく、４〜２０倍量がより好ましい。分離の温度としては物質の安定性の点から４〜３０℃が好ましく、１０〜２５℃がより好ましい。

分離用溶媒には、水、または、水を含有する低級アルコール、親水性溶媒、親油性溶媒が用いられる。低級アルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールが用いられるが、食用として利用されているエタノールが好ましい。

セファデックスＬＨ−２０を用いる場合、分離用溶媒には低級アルコールが好ましい。シリカゲルを用いる場合、分離用溶媒にはクロロホルム、メタノール、酢酸またはこれらの混合液が好ましい。

ダイヤイオンＨＰ−２０及びＤＭ１０２０Ｔを用いる場合、分離用溶媒はメタノール、エタノール等の低級アルコールまたは低級アルコールと水の混合液が好ましい。

また、活性を含む画分を採取して乾燥または真空乾燥により溶媒を除去し、粉末または濃縮液として得ることは溶媒による影響を除外できることから、好ましい。

このペプチドグリカン誘導体は優れた抗炎症作用を発揮し、特に、皮膚に対して外的刺激に対する炎症を防御できる点から好ましい。たとえば、細菌感染による炎症、ニキビ菌による炎症やアトピー性の炎症に対して作用する。さらに、皮膚のケラチンも生合成し、美肌作用、抗炎症作用や皮膚再生作用を呈する。ケラチン産生を必要とするまつ毛増殖剤、育毛剤、毛髪用化粧料としても利用できる。

ペプチドグリカン誘導体に油脂を添加することは、得られる活性部分が油の中で安定に維持することから好ましい。例えば、大豆油、米ぬか油、グレープシード油、オリーブ油、ホホバ油で抽出することは好ましい。この誘導体は水溶性と油溶性の両方の溶媒に溶解する。この両親媒性の性質はこの誘導体の化粧料、食品や日用品への利用範囲を広げることから好ましい。

医薬品として注射剤または経口剤または塗布剤などの非経口剤として利用され、医薬部外品としては、錠剤、カプセル剤、ドリンク剤、石鹸、塗布剤、ゲル剤、歯磨き粉等に配合されて利用される。

経口剤としては錠剤、カプセル剤、散剤、シロップ剤、ドリンク剤等が挙げられる。前記の錠剤及びカプセル剤に混和される場合には、結合剤、賦形剤、膨化剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤等とともに用いることができる。前記の錠剤は、シェラックまたは砂糖で被覆することもできる。

また、前記のカプセル剤の場合には、上記の材料にさらに油脂等の液体担体を含有させることができる。前記のシロップ剤及びドリンク剤の場合には、甘味剤、防腐剤、色素香味剤等を添加することができる。

非経口剤としては、軟膏剤、クリーム剤、水剤等の外用剤の他に、注射剤が挙げられる。外用剤の基材としては、ワセリン、パラフィン、油脂類、ラノリン、マクロゴールド等が用いられ、通常の方法によって軟膏剤やクリーム剤等とすることができる。

注射剤には、液剤があり、その他、凍結乾燥剤がある。これは使用時、注射用蒸留水や生理食塩液等に無菌的に溶解して用いられる。

食品製剤として抗炎症作用を目的とした美容食品、美容と抗炎症作用を目的とした食品、ケラチン増加による皮膚保護のための化粧料などに利用される。また、保健機能食品として栄養機能食品や特定保健用食品に利用することは好ましい。

得られた食品製剤をイヌやネコなどのペットや家畜動物に利用する場合、皮膚や組織の健康を維持する目的として、飼料やペット用サプリメントとして利用される。

化粧料として常法に従って界面活性化剤、溶剤、増粘剤、賦形剤等とともに用いることができる。例えば、クリーム、毛髪用ジェル、洗顔剤、美容液、化粧水等の形態とすることができ、抗炎症及びケラチンの産生を促進する化粧料となる。化粧料の形態は任意であり、溶液状、クリーム状、ペースト状、ゲル状、ジェル状、固形状または粉末状として用いることができる。この誘導体は水溶性と油溶性の両方の溶媒に溶解する。この両親媒性の性質はこの誘導体の利用を広げることから好ましい。

また、抗炎症作用を利用した植物活性化剤としても利用される。すなわち、植物はウイルスや細菌などの外敵に対して局所で炎症反応を起こして生育が抑制される。そこで、この誘導体が植物の炎症を抑制することにより植物の生育を活性化し、開花、結実、収穫量の増加をもたらすことは好ましい。

以下に、ツバメの巣を発酵する製造工程によりこの誘導体の製造ついて説明する。ツバメの巣を大豆と納豆菌により発酵させた発酵液に分岐シクロデキストリンを添加してプロテアーゼ処理を行う工程からなる。

原料となる物質はツバメの巣、大豆、納豆菌、分岐シクロデキストリン及びプロテアーゼである。

ツバメの巣とは食用にも用いられるツバメの巣であり、たとえば、アナツバメ類の巣である。アナツバメはアマツバメ目アマツバメ科で東南アジア沿岸に生息するツバメである。ツバメの巣はツバメの唾液が固められたものと考えられているが、その成分の一部は海藻である。栄養成分としてはタンパク質、糖質、脂質などであり、一般的な食品原料として特に、中国料理や中華料理として利用される。

利用するツバメの巣は日本でも手に入る食用のものは安全性が高いことから好ましい。産地としてはインドネシア、タイ、フィリピン、マレーシアなどの東南アジアが好ましく、それを日本に輸入して日本で洗浄、消毒されたものは衛生面からより好ましい。

原料となる大豆は、日本産、中国産、アメリカ産、ロシア産などいずれの産地の大豆でも利用できるが、トレーサビリティーが確実であり、生産者が明確である日本産が好ましい。

このうち、有機栽培や無農薬で栽培された大豆は有害な農薬や金属を含有しないことから、さらに好ましい。

これらの原料は使用に際して株式会社奈良機械製作所製の自由ミル、スーパー自由ミル、サンプルミル、ゴブリン、スーパークリーンミル、マイクロス、減圧乾燥機として東洋理工製の小型減圧乾燥機、株式会社マツイ製の小型減圧伝熱式乾燥機ＤＰＴＨ−４０、エーキューエム九州テクノス株式会社製のクリーンドライＶＤ−７、ＶＤ−２０、中山技術研究所製ＤＭ−６などの粉砕機で乾燥され、粉砕される。これにより発酵の工程が効率的に進行されやすい。

用いる納豆菌は学名バチルス サブチリスであり、納豆の製造に利用される有用な微生物である。納豆素本舗の粉末の納豆菌は品質が良好で発酵に適していることから好ましい。

分岐シクロデキストリンは環状ブドウ糖の一つであり、ブドウ糖が環状に結合し、食品や化粧料に利用されることから好ましい。この分岐シクロデキストリンは内腔に疎水性部分を有することから疎水性の高い物質を吸着しやすい。塩水港精糖社製の分岐シクロデキストリンは品質が高いことから好ましい。

用いるプロテアーゼとしては天野エンザイム社製の食品加工用プロテアーゼであるプロテアーゼＡ「アマノ」ＳＤ、プロテアーゼＭ「アマノ」ＳＤまたはプロテアーゼＰ「アマノ」３ＳＤの品質が安定し、使用実績が豊富なことから好ましい。

ツバメの巣は粉砕機により粉砕され、清浄な水を添加して懸濁される。ツバメの巣１００ｇに対して清浄な容器の中で精製水などの水と１リットル〜１０リットルとともに攪拌される。

ツバメの巣と大豆粉砕物は煮沸滅菌され、発酵タンクに添加される。滅菌することにより雑菌の混入が防御され、納豆菌による発酵が進行する。

発酵は静置法または撹拌法のいずれでも良いが、発酵を短時間で実施できる点から撹拌法が好ましい。発酵は３９〜４４℃で２４時間から７２時間行われることが好ましい。温度が低く、時間が短い場合には発酵が進まず、温度が高く、時間が長い場合には目的とするペプチドグリカン誘導体が分解されてしまうおそれがある。

この発酵液はろ紙、珪藻土や濾過布などにより濾過されることは以下の工程を容易に行えることから好ましい。

このろ液に分岐シクロデキストリンが添加される。分岐シクロデキストリンは環状ブドウ糖の一つであり、ブドウ糖が環状に結合し、食品や化粧料に利用されることから好ましい。この分岐シクロデキストリンは内腔に疎水性部分を有することから疎水性の高い物質を吸着しやすい。塩水港精糖社製の分岐シクロデキストリンは品質が高いことから好ましい。

添加される分岐シクロデキストリンはツバメの巣１００ｇに対して分岐シクロデキストリンの１００ｇから３００ｇが好ましい。この分岐シクロデキストリンによりリボースとペプチドが結合する。

この分岐シクロデキストリンとの懸濁液は攪拌されることが好ましい。

この懸濁液にプロテアーゼが添加される。添加されるプロテアーゼは上記の発酵液１００ｇに対して０．００１ｇから０．３ｇが好ましい。このプロテアーゼは精製水に懸濁して添加されることは反応が進むことから好ましい。

この懸濁液は反応を促進するために加温され、攪拌されることは好ましい。加温としては３７〜４４℃が好ましい。また、攪拌は１分間当り１０〜３０回が好ましい。時間は１時間から６時間が好ましい。

このプロテアーゼ反応液は濾過される。濾紙やメンブランフィルターを用いることにより効率良くろ過される。ろ過してろ液を得ることにより反応していない成分や原料を排除できることから好ましい。

得られた反応物は煮沸滅菌され、プロテアーゼを失活させることは好ましい。

さらに、得られた反応物は、凍結乾燥することにより粉末化され、用いられる。

前記の反応物から、目的とするペプチドグリカン誘導体を分離し、精製することは純度の高い物質として摂取量を減少させることができる点から好ましい。この精製の方法としては、分離用の樹脂などの精製操作を利用することが好ましい。なお、純度を高めるために精製工程を繰り返して実施することは好ましい。

例えば、分離用担体または樹脂により分離され、分取されることにより目的とするペプチドグリカン誘導体が得られる。分離用担体または樹脂としては、表面が後述のようにコーティングされた、多孔性のペプチドグリカン、酸化珪素化合物、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリプロピレン、スチレン−ビニルベンゼン共重合体等が用いられる。０．１〜３００μｍの粒度を有するものが好ましく、粒度が細かい程、精度の高い分離が行なわれるが、分離時間が長い欠点がある。

例えば、逆相担体または樹脂として表面が疎水性化合物でコーティングされたものは、疎水性の高い物質の分離に利用される。陽イオン物質でコーティングされたものは陰イオン性に荷電した物質の分離に適している。また、陰イオン物質でコーティングされたものは陽イオン性に荷電した物質の分離に適している。特異的な抗体をコーティングした場合には、特異的な物質のみを分離するアフィニティ担体または樹脂として利用される。

アフィニティ担体または樹脂は、抗原抗体反応を利用して抗原の特異的な調製に利用される。分配性担体または樹脂は、シリカゲル（メルク社製）等のように、物質と分離用溶媒の間の分配係数に差異がある場合、それらの物質の単離に利用される。

これらのうち、製造コストを低減することができる点から、吸着性担体または樹脂、分配性担体または樹脂、分子篩用担体または樹脂及びイオン交換担体または樹脂が好ましい。さらに、分離用溶媒に対して分配係数の差異が大きい点から、逆相担体または樹脂及び分配性担体または樹脂はより好ましい。

分離用溶媒として有機溶媒を用いる場合には、有機溶媒に耐性を有する担体または樹脂が用いられる。また、医薬品製造または食品製造に利用される担体または樹脂は好ましい。

これらの点から吸着性担体としてダイヤイオン（三菱化学（株）社製、ＨＰ−２０及びＨＰ−２１）及びＸＡＤ−２またはＸＡＤ−４（ロームアンドハース社製）、分子篩用担体としてセファデックスＬＨ−２０（アマシャムファルマシア社製）、分配用担体としてシリカゲル、イオン交換担体としてＩＲＡ−４１０（ロームアンドハース社製）、逆相担体としてＤＭ１０２０Ｔ（富士シリシア社製）がより好ましい。

これらのうち、ダイヤイオンＨＰ−２０、セファデックスＬＨ−２０及びＤＭ１０２０Ｔはさらに好ましい。

得られた抽出物は、分離前に分離用担体または樹脂を膨潤化させるための溶媒に溶解される。その量は、分離効率の点から抽出物の重量に対して１〜３２倍量が好ましく、５〜１９倍量がより好ましい。分離の温度としては物質の安定性の点から４〜３０℃が好ましく、１０〜２６℃がより好ましい。

分離用溶媒には、水、または、水を含有する低級アルコール、親水性溶媒、親油性溶媒が用いられる。低級アルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールが用いられるが、食用として利用されているエタノールが好ましい。

セファデックスＬＨ−２０を用いる場合、分離用溶媒には低級アルコールが好ましい。シリカゲルを用いる場合、分離用溶媒にはクロロホルム、メタノール、酢酸またはそれらの混合液が好ましい。

ダイヤイオンＨＰ−２０及びＤＭ１０２０Ｔを用いる場合、分離用溶媒はメタノール、エタノール等の低級アルコールまたは低級アルコールと水の混合液が好ましい。

ペプチドグリカン誘導体を含む画分を採取して乾燥または真空乾燥により溶媒を除去し、目的とするペプチドグリカン誘導体を粉末または濃縮液として得ることは溶媒による影響を除外できることから、好ましい。

また、このペプチドグリカン誘導体を粉末化することは防腐の目的から好ましい。

以下、前記実施形態を実施例及び試験例を用いて具体的に説明する。なお、これらは一例であり、素材、原料や検体の違いに応じて常識の範囲内で条件を変更させることが可能である。

日本橋古樹軒よりインドネシア産のツバメ（アナツバメ由来）の巣１ｋｇを購入した。これを水洗後、粉砕機（株式会社奈良機械製作所製のスーパー自由ミル）により粉砕して粉砕物約１ｋｇを得た。

また、千葉県産の大豆を大豆工房より購入し、粉砕機により粉砕して粉砕物約１ｋｇを得た。

このツバメの巣の懸濁物８００ｇと大豆粉砕物８００ｇを清浄なステンレス製の寸胴に移し、５リットルの精製水を添加して懸濁した。

これを９５〜９７℃で１時間煮沸して滅菌した。これらを１００ｋｇ容量の横河電機社製の撹拌式発酵タンク（ＦＰ２１１）に移し、滅菌した精製水１０リットルを添加した。

これに納豆菌本舗である有限会社高橋祐蔵研究所製造の粉末納豆菌１０ｇを購入した。この納豆菌を滅菌水１００ｇに懸濁し、これに粉末大豆粉を添加し、３７℃で１時間加温して前培養した。

この納豆菌液を前記の撹拌式発酵タンクに添加して４０〜４２℃で４８時間発酵させた。発酵の状態は大豆の粉末の分解性及び溶解したタンパク質の定量（ビューレット法）によりモニタリングした。

発酵後、得られた発酵液の上清を濾過布により粗濾過してろ液を得た。

このろ液１０リットルを清浄なタンクに移してこれに塩水港精糖社製の分岐シクロデキストリン（イソエリート）５０ｇを添加して十分に攪拌した。

さらに、天野エンザイム製のプロテアーゼＭ「アマノ」ＳＤの５ｇを添加し、３７℃に加温して攪拌した。

攪拌は攪拌装置を用いて室温で１０時間実施した。この反応液を短時間、煮沸滅菌し、酵素を失活させた。得られた反応液を東洋濾紙の濾紙（Ｎｏ．２）により吸引ろ過してろ液を得た。

この溶液を凍結乾燥機（タイテック社製のフリーズトラップＶＡ−１４０Ｓ）により凍結乾燥させて目的とする粉末２５ｇを得た。これを検体１とした。

得られた検体１の粉末２０ｇを精製水１００ｍＬに懸濁して７％エタノールで膨潤させたダイヤイオンＨＰ−２０（三菱化学製）５００ｇに供した。７％エタノール７００ｍＬで洗浄後、２０％エタノールでさらに洗浄した。

これに、６０％エタノール５００ｍＬを添加し、目的とするペプチドグリカン誘導体を分画した。得られた分画を減圧乾燥器により乾燥した。この精製操作を４回実施して最終精製物として粉末１０ｇを得た。この粉末を検体２とした。

以下に、ペプチドグリカン誘導体の構造解析に関する試験方法及び結果について説明する。
（試験例１）

上記のように得られた検体２を精製水に溶解し、濾過後、質量分析器付き高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ、島津製作所）で分析した。

さらに、重水素化ジメチルスルホキシド中、核磁気共鳴装置（ＮＭＲ、ブルカー製）で解析した。構造解析の結果、検体２及び検体１からフェニル基、リボース、システイン及びアルギニンが結合した誘導体が検出された。

その結合はフェニル基、システイン及びアルギニンは１分子ずつの結合であり、リボースは２分子であった。また、システインとアルギニンはＬ型であった。

６００ＭＨｚのＨ−ＮＨＲ分析結果では、０．９２、１．７３、１．８４、２．７６、３．１４、３．２３、３．３５、３．３６、３．４３、３．４４、３．４９、３．６５、３．６７、３．８３、３．８８、３．９４、４．８２、４．９２、５．０３、５．０９、７．１１及び７．３３ｐｐｍにピークが認められた。

さらに、Ｃ−ＮＭＲ分析結果では、２４．２、２５．１、２５．４、４５．７、５０．２、６２．８、６３．１、６８．２、７２．０、７２．１、７５．６、７５．７、７８．７、７８．８、８０．３、８１．６、８１．９、９５．７、１０３．２、１１８．９、１３２．１、１３２．５、１６０．７、１７３．１及び１７３．８ｐｐｍにピークが認められた。

以下に、Ｃ−ＮＭＲの解析結果のチャートを示した。（横軸単位はｐｐｍ、縦軸単位はピーク強度を示す。）

上記の分析値は有機化学合成されたペプチドグリカン誘導体のピークと同一であり、目的とするペプチドグリカン誘導体として同定された。検体２に含まれるこの誘導体は９９．１％、つまり、純度９９．１％であり、一方、検体１の純度は８０．３％であった。

また、得られた誘導体の粉末０．１ｇを精製水１０ｍＬに溶解した場合、水素ガスの発生が認められた。ガスクロマトグラフィー（島津製作所製）で定量した結果、１．６ｐｐｍの水素ガス濃度を呈した。

以下に、ヒト由来白血球を用いた抗炎症作用の確認試験について述べる。
（試験例２）

健常な人間５例（男性２例及び女性３例、年齢２５〜６１歳）より採取したヘパリン加血液をインフォームドコンセプト下で医師の元、無菌的に採取した。採取した血液からフィコールを用いた遠心分離法により白血球を採取した。この白血球をＲＰＭＩ−１６４０培地（和光純薬製）に懸濁して３７℃、５％炭酸ガス下、炭酸ガス培養器（ＭＧ−７０Ｃ、タイテック製）内で培養した。この細胞を９６孔マイクロプレート（ファルコン製）に播種し、ここにＬＰＳ（リポポリサッカライド、和光純薬製）の溶液を添加した。この最終濃度は０．１ｍｇ／ｍＬとした。

ここに試験物質として検体２及び対照物質としてＮＳＡＩＤｓのロキソフェンナトリウム（ロキソニン、第一三共製）をいずれも生理食塩液に懸濁し、希釈して最終濃度で０．１ｍｇ／ｍＬになるように添加した。なお、溶媒対照として生理食塩液を用いた。これを３７℃で３日間培養して生細胞数を顕微鏡下で計数した。さらに、上清を採取して含有されるＴＮＦアルファ量（フナコシ製、ＩＤＥＬＩＳＡ ＥＬＩＳＡキット）及びプロスタグランジンＥ２量をＥＬＩＳＡ法（コスモ・バイオ株式会社）により比色的に定量した。

その結果、溶媒対照の細胞数を１００％として検体２の添加による比率を求めた結果、検体２の添加により１３３％に増加した。一方、ロキソフェンナトリウムでは１１１％となり検体２の方が白血球の保護に優れていた。

ＴＮＦアルファ量は溶媒対照を１００％として検体２の添加による比率を求めた結果、検体２の添加により２６％に減少した。一方、ロキソフェンナトリウムでは４４％となり、検体２の方がＴＮＦアルファ量の抑制作用に優れていた。

プロスタグランジンＥ２量は溶媒対照を１００％として検体２の添加による比率を求めた結果、検体２の添加により２３％に減少した。一方、ロキソフェンナトリウムでは４０％となり、検体２の方がプロスタグランジンＥ２量の抑制作用に優れていた。また、この誘導体はヒト由来白血球に対して障害を与えなかったという結果から安全性は高いと考えられた。

以下に、ヒト由来皮膚細胞を用いたケラチン産生の確認試験について述べる。
（試験例３）

コスモ・バイオ株式会社より購入したヒト皮膚由来の初代表皮培養細胞を用いた。細胞を専用の培養液に懸濁し、前培養して細胞を増殖させた。３７℃、５％炭酸ガス下、炭酸ガス培養器内で培養した。その後、増殖期にある細胞をトリプシン含有培地にて剥離して実験に供した。生細胞数をトリパンブルー色素排除法により顕微鏡下で計数した。細胞数を１ｍＬあたり１０００個に調整して５ｍＬずつ培養シャーレに播種してさらに、３７℃、５％炭酸ガス下で培養した。これを紫外線照射装置（ロックタイト、出力８８ＭＨ）により紫外線を照射して細胞にダメージを与えた。照射はシャーレの蓋を外して１時間実施した。

この紫外線照射により皮膚細胞が障害を受け、この障害に対する回復を試験した。なお、この方法は皮膚に対する試験物質の評価に実施される方法である。

ここに試験物質として検体２及び対照物質としてヒトＥＧＦ（フナコシ製）をいずれも生理食塩液に懸濁し、希釈して最終濃度で０．１ｍｇ／ｍＬになるように添加した。なお、溶媒対照として生理食塩液を用いた。これを３７℃で３日間培養して生細胞数を顕微鏡下で計数した。さらに、細胞を精製水に分散して超音波破砕機により細胞分散液を得た。この細胞分散液中に含まれるケラチン量をＥＬＩＳＡ法（コスモ・バイオ株式会社）により定量した。

その結果、溶媒対照の細胞数を１００％として検体２の添加による比率を求めた結果、検体２の添加により２４４％に増加した。一方、ＥＧＦでは１７７％となり。検体２の方が皮膚細胞の増殖作用に優れていた。ケラチン量については溶媒対照の値を１００％として検体２の添加により３８１％に増加した。一方、ＥＧＦでは２４０％となり、検体２の方がケラチン産生作用に優れていた。また、溶媒中の水素ガス濃度は１．６ｐｐｍであった。また、この誘導体はヒト由来皮膚細胞に対して障害を与えず、細胞数を回復させたという結果から、安全性は高いと考えられた。

本発明で得られるペプチドグリカン誘導体は抗炎症作用を呈し、かつ、副作用が少ないことから、治療や予防に利用され、国民のＱＯＬを改善できる。

本発明で得られるペプチドグリカン誘導体は化粧料としても皮膚改善に利用され、化粧品業界の発展に寄与する。

Claims (1)

1. 下記の式（１）に示される抗炎症作用を呈するペプチドグリカン誘導体。