JP7015775B2 - 遺伝子修復作用を呈するポリフェノール誘導体 - Google Patents
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Description
この発明は遺伝子修復作用を呈するポリフェノール誘導体に関するものである。
細胞は老化に伴って遺伝子の損傷の発生頻度が増加する。細胞には遺伝子修復の機能が備わっているものの、加齢や老化により遺伝子の損傷が増加するため、遺伝子の修復が追いつかずに損傷が蓄積する。
その過程で細胞構築の蛋白質の合成が減少する。細胞内の蛋白質が多くの生命維持のために消耗すると細胞自体が次第に損傷を受け、死滅し、変異して機能が低下する。また、体の各器官において、多くの細胞がそのような状態に達すると、器官自体の能力を弱め、そして、次第に病気の症状となって現れるようになる。一方、遺伝子修復の働きには、数種類が認められている。たとえば、DNAポリメラーゼとリガーゼの組み合わせによる修復機能がある。また、活性酸素による塩基の障害に対してはOGG1、つまり、8ヒドロキシル-2-デオキシグアノシンの修復酵素である8-オキソグアニンDNAグリコシラーゼである。
DNAポリメラーゼを介したSOS修復機能も存在し、いろいろな障害に対する修復機能が存在している。これらの遺伝子修復機能を活性化することは加齢や化学物質による遺伝子の障害を修復し、疾患を遺伝子から回復させることから好ましい。この遺伝子修復機能を活性化する研究が行われている。
遺伝子修復機能に関する発明としては、たとえば、標的DNAのインビボ除去による遺伝子修復があるものの、細胞レベルでの治療であり生体には応用が限られる(例えば、特許文献1参照。)。また、DNAの標的改変の発明ではベクターによる遺伝子の調整が記載されている(例えば、特許文献2参照。)。
既存の物質による遺伝子修復作用は軽度であり、産業上への利用が限定されるという課題があり、また、化学合成された物質では安全性に問題があり、利用が限られている。
そこで、副作用が弱く優れた遺伝子修復作用を呈する天然物が望まれている。
上記の目的を達成するために、請求項1に記載の発明は下記の式(1)で示される遺伝子修復作用を呈するポリフェノール誘導体に関するものである。
この発明は、以上のように構成されているため、次のような効果を奏する。
請求項1に記載のポリフェノール誘導体は遺伝子修復作用に優れている。
以下、この発明を具体化した実施形態について詳細に説明する。
遺伝子修復作用を呈するポリフェノール誘導体とは、下記の式(1)で示される構造からなるものである。
前記の式(1)のように遺伝子修復作用を呈するポリフェノール誘導体はグリセリンの1分子、カルボン酸を2分子有するピリジンの3分子、パラ-ジヒドロキシベンゼンの3分子から構成されている。これらの分子及びその結合はすべて自然界に存在する天然型であり、また、各分子の間の結合は自然界に認められるエステル結合またはエーテル結合で結合されている。
このポリフェノール誘導体はグリセリン、ヒドロキシベンゼンを含むポリフェノール類及びピリジンを原料として化学合成により得ることができる。しかし、この場合、化学的合成では原料の損失が多く、製造コストが高くなるため、産業への利用は限定される。
一方、化学合成された純度の高いポリフェノール誘導体は分析の標準品や微量な試供品を得るために用いられる。
このポリフェノール誘導体の構造を解析することは有効成分の特定ができる点から好ましい。また、製品や製剤に利用して販売する際の有効成分の含有量の指標として利用できることから好ましい。
このポリフェノール誘導体の構造解析として化学合成された高純度(純度99.1%)の標準品を用いて重水素化クロロホルム中の600MHzのH-NMRにより解析した場合、ピークの位置は3.25、3.77、3.83、6.45、6.62、6.70、6.95、7.02、7.10、7.11、7.25、7.26、7.27、7.28、7.38、7.45及び7.48ppmに認められる。
また、このポリフェノール誘導体の構造解析として重水素化クロロホルム中の500MHzのC-NMRにより解析した場合、ピークの位置は41.2、41.5、41.7、99.8、108.3、114.9、117.1、119.0、121.4、123.6、125.1、129.1、129.2、129.5、129.7、130.6、130.7、131.0、131.3、131.4、131.8、133.3、135.6、135.7、135.8、136.0、138.3、145.6、147.4、147.9、148.4、150.3、154.0、171.5、172.3及び172.4ppmに認められる。
さらに、このポリフェノール誘導体は高速液体クロマトグラフィーなどでも解析され、それぞれの解析データを集約してその構造が同定されることは好ましい。この化学式はC42H29N3O15であり、分子量は815.69である。
つまり、炭素42個、水素29個、窒素3個及び酸素15個から構成されている。また、この構成成分であるポリフェノール誘導体は天然に存在している化合物である。
もともと、このポリフェノールとは動植物や微生物に広く分布する水溶性のフェノール性化合物であり、特に、水酸基を2つ有するポリフェノールである。このポリフェノールは自然界に存在する天然物であり、その安全性は高い。このポリフェノールの水酸基は抗酸化作用を有し、還元作用を呈する。ポリフェノールが活性化された状態は細胞膜が安定に維持される状態に関係している。
このポリフェノール誘導体では1分子のポリフェノールのうち、1つは1分子のピリジン環に結合した2個のカルボン酸とエステル結合をしている。このピリジン環は弱塩基性を示すことから、電気的にプラス、つまり、陽性の状態にある。一方、ポリフェノールの水酸基は弱酸性を示すことから中和されて全体として中性を呈する。
この誘導体が細胞膜に取り込まれた場合、細胞膜の電位をプラスとマイナスで調整するという働きがあり、神経細胞、心筋細胞、筋肉細胞や皮膚細胞における細胞膜の安定化と活性化に寄与する。さらに、この誘導体は両媒性であり、細胞膜の構造を維持する働きがある。
このポリフェノール誘導体は電気的な活性と両媒性の性質の結果として皮膚や腸管からの吸収率が高くなる。特に、経皮吸収においてはポリフェノール単体に比して3倍程度の吸収が増加する。
さらに、このポリフェノール誘導体は皮膚の保湿剤としてエモリエント作用があり、皮脂の代替として角質細胞表面にうるおいをもたらす。皮膚の皮脂は洗顔などにより消失しやすいことからこのポリフェノール誘導体により水分が保護されることは皮膚に対して好ましい状態である。
ポリフェノール誘導体は細胞膜にポリフェノールを介して細胞外と細胞内を貫通するにより、細胞膜を安定化する。また、細胞膜に存在している受容体を活性化する。さらに、細胞膜の流動性を高めて細胞膜の機能を高める。このポリフェノール誘導体は細胞内に移動して核膜も安定化する。核膜の安定化作用により遺伝子が防御されることは好ましい。活性酸素などによる遺伝子の障害を核膜の段階でこのポリフェノール誘導体が消去する。
さらに、ポリフェノールのカルボン酸部分は弱酸性に荷電していることから、耐酸性が強く、経口摂取された場合に、胃酸に対して抵抗性を示し、吸収率が高まることは、好ましい。
また、弱酸性であるため、皮膚に塗布した場合、皮膚に対して刺激性がないことは好ましい。
このポリフェノール誘導体は核膜に浸透して遺伝子修復酵素を活性化する。標的となる遺伝子修復酵素はDNAポリメラーゼ及び8-オキソグアニンDNAグリコシラーゼまたは8-ヒドロキシルデオキシグアニンDNAグリコシターゼ(いずれもOGG1と略す)である。
DNAポリメラーゼによる遺伝子の修復はSOS修復といわれ、塩基の変化や付加体に働き、DNA鎖の切断と複製を行う工程からなる。このDNAポリメラーゼによる修復は1日に1万回以上行われているため、この誘導体を継続して利用することは好ましい。
OGG1による遺伝子修復は8OHdGのような塩基の酸化体の排除と正常な塩基の組み込みを行う工程である。このポリフェノール誘導体はこれらの遺伝子修復酵素の働きを行うこと及び遺伝子を酸化物質や活性酸素から防御する働きにより遺伝子修復作用を呈する。遺伝子修復酵素作用には酵素活性の活性化と酵素のmRNA転写レベルでの活性化の両方による。
このポリフェノール誘導体による遺伝子修復作用は核内に遺伝子が存在するすべての細胞に働き、遺伝子を修復する。
また、活性酸素、フリーラジカル、紫外線、化学物質、医薬品の副作用、金属、加齢などすべての物質による遺伝子の障害に対応して遺伝子を修復させる。
また、このポリフェノール誘導体は脂溶性と水溶性の両方の性質を呈することから動物の細胞膜及び植物や酵母の細胞壁を通過し、細胞内に吸収されやすい。また、水溶性溶媒と油溶性溶媒の両方に溶解することから幅広い溶媒を利用することができる点は好ましい。
さらに、皮膚の角質細胞膜も通過しやすく、角質層のバリア機能を維持することは皮膚の健康や美容の点から好ましい。また、このポリフェノール誘導体は細胞膜を通過し、皮膚細胞内で遺伝子修復を活性化して細胞の再生や機能を促進することから好ましい。
植物に対してはこのポリフェノール誘導体が植物の細胞壁と細胞膜を通過して植物細胞内に入り、遺伝子修復を促進し、花の開花や結実、葉の成長を促進して植物の寿命を延長することは好ましい。すなわち、植物活性化剤としての働きがある。
また、このポリフェノール誘導体は粉末にした場合水溶性溶媒と反応して水素ガスを発生し、活性酸素を消去する。水素ガスの発生量は1,6ppmの飽和濃度であり、溶解した1分から2時間程度発生する。水素ガスはヒドロキシラジカルを消去する働きがあり、優れた活性酸素消去作用が確認されている。
このポリフェノール誘導体は遺伝子の修復に働く他、細胞増殖、セラミド、コラーゲンやエラスチン産生を促進することにより皮膚細胞機能を促進することは好ましい。
神経細胞においても細胞内の遺伝子修復を活性化する。神経細胞は認知症、アルツハイマー症などで活性酸素やアミロイドβたんぱく質による遺伝子の障害を受けやすく、遺伝子は修復されにくいという弱点がある。そのため、このポリフェノール誘導体による遺伝子修復は神経の働きを回復させ、かつ、神経疾患の防御と回復の目的で好ましい。
また、ミエリン鞘を保護して神経終末からの神経伝達物質の放出を促進して神経伝達を高めることは好ましい。さらに、発生する水素ガスは低分子で血液脳関門を通過して障害された脳細胞を修復する。
運動神経細胞の神経末端からのアセチルコリンの放出を高めることにより筋肉の収縮を高めて神経と筋肉の活動性を増すことは好ましい。
また、このポリフェノール誘導体は皮膚細胞の遺伝子修復作用を呈し、かつ、コラーゲンやエラスチン合成酵素の遺伝子を活性化してこれらの産生を高めることは好ましい。化粧料としての利用が高まることから好ましい。
このポリフェノール誘導体は心筋梗塞においては冠状動脈の梗塞や虚血状態でも心筋細胞の遺伝子修復作用により心臓の活動を活性化して強心作用を発揮することは好ましい。また、同時に発生する水素ガスは心筋における虚血再灌流による活性酸素の障害を改善する。
特に、梗塞部位の血管においてはこのポリフェノール誘導体は血管新生を促進し、血流の改善し、血圧を低下させる。
また、このポリフェノール誘導体はアスリートの運動、一般人の運動時、また、筋肉を増強したい場合、筋肉細胞に対して脂肪の輸送を促進する。これは遺伝子レベルでのエネルギー産生を活性化する経路を介することから好ましい。また、筋肉の活動時にこの誘導体から発生する水素ガスが運動時の活性酸素を消去し、活性酸素による筋肉細胞の遺伝子障害を減少させることから好ましい。
このポリフェノール誘導体は生体内では腎臓や肝臓のエステラーゼにより分解され、尿中に排泄される。分解されて構成成分である安全性の高いポリフェノール、グリセリンなどに分解される。したがって、このポリフェノール誘導体は体内に蓄積されることはなく、分解も生体内酵素で行われ、分解物も天然物であることから安全性が高い。
さらに、ポリフェノール部分には植物の生育を促進する植物活性化作用があることからこのポリフェノール誘導体にも植物の生育を促進できる点は産業上の利用の点から好ましい。
また、植物が細菌やウイルスに感染した場合、遺伝子が障害を受ける場合がある。このような遺伝子の障害に対して遺伝子修復を活性化することは好ましい。
このポリフェノール誘導体は天然にも存在しており、微生物の一種であるスタフィロコッカス類やコケモモなどの植物に広く存在している。スタフィロコッカスは皮膚表皮の常在菌としても知られており、特に、スタフィロコッカス エピデルミジスは皮膚の善玉菌として皮膚の健康に寄与していることから好ましい。
このポリフェノール誘導体を精製により上記の植物から抽出することは可能である。ただし、精製には大量の原料を必要とし、有機溶媒などを利用することから産業上への利用は制限される。
このポリフェノール誘導体はスフィンゴモナスとコケモモを発酵させて製造させることは好ましい。発酵法としてはスフィンゴモナスとコレモモにより発酵させて得る。用いる菌体は皮膚の常在菌であるため、安全性が高い。
この製造方法は原料に食経験があり、ポリフェノール誘導体の産生量も多いことから好ましい。
得られたポリフェノール誘導体を医薬品素材として利用する場合、目的とするポリフェノール誘導体を精製することは、目的とするポリフェノール誘導体の純度が高まり、不純物を除去できる点から好ましい。
医薬品としては注射剤または経口剤または塗布剤などの非経口剤として利用され、医薬部外品としては錠剤、カプセル剤、ドリンク剤、石鹸、塗布剤、ゲル剤、歯磨き粉等に配合されて利用される。
経口剤としては錠剤、カプセル剤、散剤、シロップ剤、ドリンク剤等が挙げられる。前記の錠剤及びカプセル剤に混和される場合には、結合剤、賦形剤、膨化剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤等とともに用いることができる。前記の錠剤はシェラックまたは砂糖などで被覆することもできる。
また、前記のカプセル剤の場合には、上記の材料にさらに油脂等の液体担体を含有させることができる。前記のシロップ剤及びドリンク剤の場合には、甘味剤、防腐剤、色素香味剤等を添加することができる。
非経口剤としては、軟膏剤、クリーム剤、水剤等の外用剤の他に、注射剤が挙げられる。外用剤の基材としては、ワセリン、パラフィン、油脂類、ラノリン、マクロゴールド等が用いられ、通常の方法によって軟膏剤やクリーム剤等とすることができる。
注射剤には、液剤があり、その他、凍結乾燥剤がある。これは使用時、注射用蒸留水や生理食塩液等に無菌的に溶解して用いられる。
食品製剤としては遺伝子修復作用を呈するため、筋肉細胞の修復に働くエナジードリンクや強壮性食品に利用される。神経活動を促進することから神経細胞の遺伝子の障害を介した神経のリハビリ用食品や学習時の食事などに利用される。また、美容食品にも利用される。保健機能食品として栄養機能食品や特定保健用食品に利用することは好ましい。
得られた食品製剤をイヌやネコなどのペットや家畜動物に利用する場合、筋肉の遺伝子の障害の回復、老化の抑制と運動能力の向上を目的とした飼料やペット用サプリメントとして利用される。
化粧料として常法に従って界面活性化剤、溶剤、増粘剤、賦形剤等とともに用いることができる。例えば、クリーム、毛髪用ジェル、洗顔剤、美容液、化粧水等の形態とすることができる。
化粧料の形態は任意であり、溶液状、クリーム状、ペースト状、ゲル状、ジェル状、固形状または粉末状として用いることができる。この誘導体は水溶性と油溶性の両方の溶媒に溶解することから幅広い化粧料に利用できる。すなわち、水溶液とオイルに溶解することができる。
ここで製造された化粧料は皮膚の障害された遺伝子の修復、セラミド、コラーゲンやエラスチンなどの増加及び皮膚の健康維持の目的で利用される。
また、このポリフェノール誘導体は遺伝子が障害された歯肉細胞の機能の維持を目的とした歯磨き剤、洗口液や歯磨きペーストなどに利用できる。
また、植物に対しては遺伝子の障害を回復させることにより葉の結実と収穫量の増加を目的とした植物活性化剤として利用することができる。
この植物活性化剤は高級で希少な蘭、胡蝶蘭やマツバランなどの花の栽培促進の目的で利用でき、葉や野菜、穀類の栽培を安定化させる。植物工場における野菜や葉の栽培にも利用でき、栽培効率を上げることができる。
次に、コケモモと大豆を原料としてスタフィロコッカス エピデルミジスにより発酵させた後、三菱化学製のダイヤイオンHP20によって精製する工程からなる遺伝子修復作用を呈するポリフェノール誘導体の製造方法について説明する。
ここでいうポリフェノール誘導体とは前記の式(1)で示されるポリフェノールの1分子、カルボン酸を有するピリジン及びグリセリンから構成されている。これらの結合はすべて天然型であり、物質の間はエステル結合及びエーテル結合を介して結合している。
このポリフェノール誘導体のポリフェノール、カルボン酸を有するピリジン及びグリセリンは天然に存在し、食経験も豊富であり、安全性が認められていることから好ましい。
この誘導体は皮膚、神経、骨、筋肉、肝臓や腎臓などにも働き、障害された遺伝子を修復させることにより、組織及び身体機能を回復させる。
この製造方法とはコケモモと大豆を皮膚の常在菌であるスタフィロコッカス エピデルミジスにより発酵する工程からなる。コレモモの代わりとしてポリフェノールを含む植物や藻類などを用いることもできる。
原料となる物質はコケモモ、大豆及びスタフィロコッカス エピデルミジスである。
ここでいうコケモモとは学名Vaccinium vitisのツツジ科スノキ属の植物であり、その果実は食用とされる。日本、アジア、欧米で栽培または自生している。このコケモモにはポリフェノールが豊富であり、目的とするポリフェノール誘導体の原材料として好ましい。使用する部位としては果実や葉が利用されるが、食経験も豊富である果実は安全性の点から好ましい。
また、使用する大豆は日本産、欧米産または中国産のいずれでも良いが、品質が安定している日本産の大豆は好ましい。
コケモモの実は日本、アメリカ、アジア、その他の国で採取されたいずれのものでも良いが、品質が高く、価格の点から、日本産は品質が良いことから好ましい。
コレモモと大豆は乾燥され、粉末化されることが好ましく、発酵の前にオートクレーブ滅菌されることは発酵をスムーズに行うることから好ましい。
3マイクロメーター以下の粒子サイズの粉末が発酵の工程を実施しやすくすることから好ましい。
発酵に用いる菌はスタフィロコッカス エピデルミジスであり、ヒトの皮膚常在菌である。この菌はヒトの皮膚に常在しており、皮膚を保護していると同時に、アクネ菌などの毒性の高い菌の増殖を抑制している。この菌はグラム陽性菌であり、非病原菌である。
また、スタフィロコッカス エピデルミジスは食用としても利用される。特に、化粧品としては健常なヒトの皮膚より採取した菌が活性化強いとから好ましい。
前記の発酵に関するそれぞれの添加量はコケモモ及び大豆の乾燥粉末1重量に対し、スタフィロコッカス エピデルミジスは0.001~0.03重量が好ましい。納豆菌は発酵される前に、前培養することは、発酵の初発時間を短縮し、発酵時間が短縮されることから好ましい。
前記の発酵は清浄な培養用タンクで実施され、滅菌された水道水により前記の材料を混合することは好ましい。
また、この発酵は38~40℃に加温され、2日間から14日間発酵される。目的とするポリフェノール誘導体をHPLCやTLCにより定量することならびに菌体の増殖性を確認することにより、発酵の工程管理を実施することは産生量が調整されることから好ましい。
前記の発酵は清浄な培養用タンクで実施され、滅菌された水道水により前記の材料を混合することは好ましい。
この発酵の工程によって生成されるポリフェノール誘導体が形成される。
前記の発酵物は含水エタノールで抽出されることは、生成物を効率良く回収し、菌を滅菌でき、次の工程が実施しやすいことから、好ましい。また、得られた発酵物を超音波処理することは、生成物が分離しやすいことから、好ましい。また、凍結乾燥などにより、濃縮することは、以下の工程が短時間に実施できることから好ましい。なお、精製工程は組み合せを行い、また、繰り返すことにより純度が高くなる。
前記の還元反応物から、目的とするポリフェノール誘導体を分離し、精製することは純度の高い物質として摂取量を減少させることができる点から好ましい。この精製の方法としては三菱化学製のダイヤイオンHP20によって精製する。また、この精製は繰り返すことにより純度が増すことから、精製を繰り返して実施することは好ましい。
三菱化学製のダイヤイオンHP20によって精製され、分取されることにより高純度の目的とするポリフェノール誘導体が得られる。分離用担体または樹脂としては、表面が後述のようにコーティングされた、多孔性の多糖類、酸化珪素化合物、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリプロピレン、スチレン-ビニルベンゼン共重合体等が用いられる。0.1~300μmの粒度を有するものが好ましく、粒度が細かい程、精度の高い分離が行なわれるが、分離時間が長い欠点がある。
さらに、逆相担体または樹脂として表面が疎水性化合物でコーティングされたものは、疎水性の高い物質の分離に利用されることは好ましい。陽イオン物質でコーティングされたものは陰イオン性に荷電した物質の分離に適している。また、陰イオン物質でコーティングされたものは陽イオン性に荷電した物質の分離に適している。特異的な抗体をコーティングした場合には、特異的な物質のみを分離するアフィニティ担体または樹脂として利用される。
アフィニティ担体または樹脂は、抗原抗体反応を利用して抗原の特異的な調製に利用される。分配性担体または樹脂は、シリカゲル(メルク社製)等のように、物質と分離用溶媒の間の分配係数に差異がある場合、それらの物質の単離に利用される。
これらのうち、製造コストを低減することができる点から、吸着性担体または樹脂、分配性担体または樹脂、分子篩用担体または樹脂及びイオン交換担体または樹脂が好ましい。さらに、分離用溶媒に対して分配係数の差異が大きい点から、逆相担体または樹脂及び分配性担体または樹脂はより好ましい。
分離用溶媒として有機溶媒を用いる場合には、有機溶媒に耐性を有する担体または樹脂が用いられる。また、医薬品製造または食品製造に利用される担体または樹脂は好ましい。
これらの点から吸着性担体としてダイヤイオン(三菱化学(株)社製)及びXAD-2またはXAD-4(ロームアンドハース社製)、分子篩用担体としてセファデックスLH-20(アマシャムファルマシア社製)、分配用担体としてシリカゲル、イオン交換担体としてIRA-410(ロームアンドハース社製)、逆相担体としてDM1020T(富士シリシア社製)がより好ましい。
これらのうち、ダイヤイオンHP-20は天然物から有機酸、ペプチドやポリフェノールを精製できる点から好ましい。また、セファデックスLH-20及びDM1020Tはさらに好ましい。
得られた抽出物は、分離前に分離用担体または樹脂を膨潤化させるための溶媒に溶解される。その量は、分離効率の点から抽出物の重量に対して2~40倍量が好ましく、4~20倍量がより好ましい。分離の温度としては物質の安定性の点から10~30℃が好ましく、12~25℃がより好ましい。
分離用溶媒には、水、または、水を含有する低級アルコール、親水性溶媒、親油性溶媒が用いられる。低級アルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールが用いられるが、食用として利用されているエタノールが好ましい。また、水溶性の溶媒に加えて油溶性の溶媒である植物油、魚油、ラードなどの動物性油脂に溶解できる。
セファデックスLH-20を用いる場合、分離用溶媒には低級アルコールが好ましい。シリカゲルを用いる場合、分離用溶媒にはクロロホルム、メタノール、酢酸またはそれらの混合液が好ましい。
ダイヤイオンHP-20を用いる場合、分離用溶媒はメタノール、エタノール等の低級アルコールまたは低級アルコールと水の混合液が好ましい。
ポリフェノール誘導体を含む画分を採取して乾燥または真空乾燥により溶媒を除去し、目的とするポリフェノール誘導体を粉末または濃縮液として得ることは溶媒による影響を除外できることから好ましい。
また、最終抽出を食用油や化粧料に用いる油脂で実施することは、得られるポリフェノール誘導体が安定に維持されることから好ましい。例えば、大豆油、米ぬか油、グレープシード油、オリーブ油、ホホバ油で抽出することは好ましい。
また、このポリフェノール誘導体を粉末化することは防腐の目的から好ましい。
以下、前記実施形態を実施例及び試験例を用いて具体的に説明する。なお、これらは一例であり、原料や検体の違いに応じて常識の範囲内で条件を変更させることが可能である。
群馬県で栽培されたコケモモをけんこう村より購入して用いた。すなわち、新鮮なコケモモ2kgを水道水で水洗後、粉砕機(株式会社奈良機械製作所製のスーパー自由ミル)にて粉砕し、コケモモの乾燥粉末粉砕物を1.0kg得た。
これを清浄な発酵タンク(滅菌された発酵用丸形40リットルタンク、遠藤科学製)に入れ、滅菌された水道水5kgを添加し、攪拌した。
これとは別に北海道産大豆を購入し、洗浄後粉砕して大豆1.0kgを得た。さらに、健常なヒト(60歳、男性)の顔面皮膚より採取したスタフィロコッカス エピデルミジスを培養して発酵タンクに添加した。なお、スタフィロコッカス エピデルミジスは事前に選択培地にて100%純粋なコロニーとして得られたものを用いた。大腸菌などの他の菌やウイルスについても検査したが、他の菌やウイルスの混入は認められなかった。
前記の前培養したスタフィロコッカス エピデルミジスの発酵準備液とコケモモと大豆の乾燥粉末は攪拌され、36~39℃の温度範囲で加温し、発酵させた。
発酵過程では通気によりバブリングと攪拌を行いつつ、発酵液のサンプリングを行い、5日間発酵させた。発酵終了後、発酵タンクより発酵物を取り出し、煮沸滅菌した。この発酵物を濾過布により濾過して、発酵液3.9kgを得た。
この発酵液をオートクレーブ(121℃、10分間)により加温することにより、発酵を停止させた。これを濾過し、濾過液を目的とするポリフェノール誘導体とした。これを検体1とした。
さらに、この検体1を三菱化学製のダイヤイオンHP-20を用いて精製した。つまり、前述の検体1のポリフェノール誘導体の200gに5%エタノール含有精製水の4Lを添加し、ダイヤイオン(HP20型、三菱化学製)500gを5%エタノール液に懸濁して充填したガラス製カラム(遠藤科学製)に供した。
これに5Lの5%エタノール液を添加して清浄し、さらに、30%エタノール液を1L添加して洗浄した。また、60%エタノール液を1L添加して目的とするポリフェノール誘導体を溶出させ、この溶出液を濃縮して精製した。この精製操作を3回繰り返した。3度の精製操作により精製されたポリフェノール誘導体を減圧蒸留により、エタノール部分を除去し、水溶液とした。これを真空乾燥させ、ポリフェノール誘導体の精製物94gを得てこれを検体2とした。ポリフェノール誘導体の純度は99.1%であり、収率は約6.9%であった。これは天然物から製造するには十分な収量であり、この製造方法が優れた製法であることが確認された。
以下に、ポリフェノール誘導体の構造解析に関する試験方法及び結果について説明する。
(試験例1)
(試験例1)
上記のように得られた検体2を重水素化ジメチルスルホキシド(シグマアルドリッチ製)に溶解し、高速液体クロマトグラフィ(HPLC、島津製作所)で分析した。
さらに、これを核磁気共鳴装置(600MHz、NMR、ブルカー製)で解析した結果、この精製物の重水素化ジメチルスルホキシド中のH-NMR測定の結果、ピークの位置は3.25、3.77、3.83、6.45、6.62、6.70、6.95、7.02、7.10、7.11、7.25、7.26、7.27、7.28、7.38、7.45及び7.48ppmに認められた。
また、このポリフェノール誘導体の構造解析として重水素化ジメチルスルホキシド中の600MHzのC-NMRにより解析した場合、ピークの位置は41.2、41.5、41.7、99.8、108.3、114.9、117.1、119.0、121.4、123.6、125.1、129.1、129.2、129.5、129.7、130.6、130.7、131.0、131.3、131.4、131.8、133.3、135.6、135.7、135.8、136.0、138.3、145.6、147.4、147.9、148.4、150.3、154.0、171.5、172.3及び172.4
に認められた。
に認められた。
また、精製物である検体2のHPLCによる分析ではメインピークは1本となり、不純物は0.6%未満であった。なお、検体1中の目的とするポリフェノール誘導体の純度は61.7%であった。
上記の解析結果から化学的に合成した標準品と同一構造を呈することが判明した。検体2から目的とするポリフェノール誘導体であると確認できた。つまり、グリセリンの1分子、カルボン酸を2分子有するピリジンの3分子、パラ-ジヒドロキシベンゼンの3分子から構成されていた。各分子の間の結合はエステル結合またはエーテル結合で結合されていた。また、検体2を粉末化した場合、水溶液に溶解した結果、水素ガスの発生がガスクロマトグラフィー(島津製作所製)により確認された。この場合の水素ガスの発生量は1.6ppmであった。
以下にヒト皮膚表皮細胞を用いた皮膚作用試験について述べる。なお、この試験方法は生化学的に成分の効果を検証できる再現性のある常法である。
(試験例2)
(試験例2)
クラボウより購入したヒト由来表皮細胞(表皮由来、エピーダーセル)を用いた。培養液として5%牛胎児血清含有MEM培地(Sigma製)を用いて培養した1000個の細胞を35mm培養シャーレ(FALCON製)に播種し、5%炭酸ガス下、37℃で培養した。ここに紫外線照射装置(クオークテクノロジー製)により280nmの紫外線を1時間照射した。ここに、前記の検体1、検体2及び陽性対照としてEGF(フナコシ製、表皮成長因子)をいずれも0.1mg/mlの最終濃度で添加した。これを48時間培養して試験した。
培養液を採取後、表皮細胞の生存率をトリパンブルー法により計数した。その後、表皮細胞の懸濁液を調製した。ここからmRNAを核酸抽出キット(フナコシ製)により抽出した。常法に従い、RT-PCR法によりDNAポリメラーゼ及び8-オキソグアニンDNAグリコシラーゼ(OGG1と略す)のmRNAを定量した。同時に、細胞懸濁液中の8-OHdG量をキット(日本老化制御研究所製)にて定量した。8-OHdGに特異的なモノクローナル抗体を使用したELISAキットである。なお、シャーレは5枚を用いてその平均値を算出した。溶媒を添加した溶媒対照群と比較した。
その結果、検体1の0.1mg/mlの添加によりヒト由来表皮細胞数は溶媒対照群に比して平均値として177%に増加した。また、検体2では225%に増加した。一方、EGFでは169%となった。この結果、検体1及び検体2の方がEGFよりも優れた細胞増殖作用を呈した。また、検体1とEGFを同時に添加した場合、細胞数は366%となり、検体1とEGFの相乗的な作用が確認された。
上記の細胞中のDNAポリメラーゼのmRNA発現量(コピー数)は溶媒対照群では14コピー、検体1処理群では189コピー、検体2処理群では566コピ-、EGF処理群では102コピーであった。また、DNAポリメラーゼのmRNA発現量は検体1及び検体2で著しく、EGFより優っていた。これは検体1及び検体2による遺伝子修復酵素の遺伝子レベルでの増加作用を示していた。なお、検体1及び検体2を添加した培養液では添加後1時間に1.6ppmの水素ガスの発生が確認された。
上記の細胞中のOGG1のmRNA発現量(コピー数)は溶媒対照群では20コピー、検体1処理群では233コピー、検体2処理群では884コピ-、EGF処理群では221コピーであった。
OGG1のmRNA発現量は検体1及び検体2で高く、EGFより優っていた。これは検体1及び検体2が遺伝子修復酵素の誘導作用を有することを示していた。
上記の細胞中の8OHdG量は溶媒対照群では633ng、検体1処理群では108ng、検体2処理群では37ng、EGF処理群では552ngであった。
8OHdGは遺伝子が活性酸素により修飾された変異した状態であり、遺伝子の障害をあらわしている。検体1及び検体2でこの値が低く、EGFの働きより優っていた。これは検体1及び検体2による遺伝子修復作用を示していた。
一方、安全性試験の一環として人工皮膚であるEpiSkin(SkinEthic社製)を用いた皮膚刺激性実験では、検体1及び検体2の添加により細胞毒性はなく、刺激性が認められず、安全性が確認された。なお、この方法は細胞を用いる皮膚刺激性試験評価法として動物を使用しない方法として確立されている。
本発明で得られるポリフェノール誘導体は遺伝子修復作用を呈し、皮膚細胞や神経細胞などの細胞機能を増進させる。これにより国民のQOLを改善し、健康な労働人口を増加させ、かつ、医療費を削減できる。
本発明で得られるポリフェノール誘導体は遺伝子修復作用を呈し、これにより皮膚の細胞を増加させ、化粧料としてシワやタルミなどの皮膚トラブルに悩む方の皮膚の改善に貢献して化粧品業界の発展に寄与する。
本発明で得られるポリフェノール誘導体は発酵法により製造されることから機能性を有する食品として利用でき、食品産業や発酵業界の発展に寄与する。
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