JP7079920B2 - 血管内皮細胞増殖作用を呈するヒドロキシピラン誘導体及びヒト口腔細胞の培養工程からなるその製造方法 - Google Patents

Description

この発明は血管内皮細胞増殖作用を呈するヒドロキシピラン誘導体及びヒト口腔細胞の培養工程からなるその製造方法に関するものである。

血管内皮細胞は血管の内側に一層に存在し、血液の滑らかな流れを調整する。また、血液が凝固しないように抗凝血作用を呈する。さらに、血管の収縮と弛緩に関与し、血圧調整作用を示す。

血管内皮細胞が障害されることにより、血液が凝固し、血栓が形成される。また、血管平滑筋細胞とともに粥状動脈硬化症の発症にかかわる。血管内皮細胞の障害は血圧の調節、免疫機能、動脈硬化、脂質代謝、腎臓疾患、肝臓疾患や皮膚の健康状態にかかわる重篤な障害である。また、血管内皮細胞増殖因子としてはＶＥＧＦが知られている。

そのため、血管内皮細胞の障害を引き起こさないように、また、障害を改善させるための方策が研究され。開発されている。たとえば、血管内皮細胞増殖因子の産生促進剤の発明があり、レピディウム メイエニイ ワルプ由来成分からなる血管内皮細胞の増殖促進が報告されている。（例えば、特許文献１参照。）ＶＥＧＦには癌による血管新生の促進という副作用があり、この発明はこの因子による安全性を欠いている。

また、血管内皮細胞増殖剤についてＶＥＧＦ関連の発明として血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）産生促進剤の製造方法、毛乳頭細胞賦活剤の製造方法及び毛髪化粧料の製造方法がある。（例えば、特許文献２参照。）

さらに、血管内皮細胞増殖因子産生促進剤に関する発明があり、タコノキ属植物抽出物を有効成分が認められる。（例えば、特許文献３参照。）しかし、ここでは詳細な物質に関する発明ではなく、あくまでも、ＶＥＧＦ産生を介した血管内皮細胞の増殖であり、この働きには限界がある。

このように、血管内皮細胞増殖作用を発揮し、副作用の少ない天然物は望まれているものの、有用な物質に関する発明はない。

特願２０１５－０９７５７２ 特願２０１４－２５８４０９ 特願２００２－２０５０７１

上記したように既存の天然物による血管内皮細胞増殖作用は軽度であり、産業上への利用が限定されるという課題があり、また、化学合成された物質では安全性に問題があり、利用が限られている。

そのため、副作用が弱く優れた血管内皮細胞増殖作用を呈する物質およびその製造方法が望まれている。

上記の目的を達成するために、請求項１に記載の発明は下記の式（１）に示される血管内皮細胞増殖作用を呈するヒドロキシピラン誘導体に関するものである。

さらに、上記の目的を達成するために、請求項２に記載の発明は請求項１に記載の式（１）に示される血管内皮細胞増殖作用を呈するヒドロキシピラン誘導体の製造方法に関するものであり、ヒト口腔細胞の培養工程を含むものである。

この発明は、以上のように構成されているため、次のような効果を奏する。

請求項１に記載のヒドロキシピラン誘導体によれば、優れた血管内皮細胞増殖作用を発揮することができる。

請求項２に記載のヒドロキシピラン誘導体の製造方法によれば、ヒドロキシピラン誘導体を効率良く製造することができる。

以下、この発明を具体化した実施形態について詳細に説明する。

まず、下記の式（１）に示される血管内皮細胞増殖作用を呈するヒドロキシピラン誘導体は炭素元素２８個、水素元素２７個、窒素元素１個及び酸素元素９個から構成されている。

すなわち、Ｃ２８Ｈ２７Ｎ１Ｏ９の化学式である。構成成分はヒドロキシピラン、ジヒドロキシベンゼン及びロイシンである。

このヒドロキシピラン誘導体は式（１）に示されるようにヒドロキシピラン１分子にエチレン側鎖、ジヒドロキシベンゼン及びロイシンから構成されている。ヒドロキシピランはジヒドロキシベンゼンと結合し、このジヒドロキシベンゼンは水酸基を介してジヒドロキシベンゼンを伴ったエチレン性カルボン酸と結合している。さらに、ジヒドロキシベンゼンの水酸基はＬーロイシンのカルボン酸と結合している。

構造的には中央に位置するベンゼン環及びロイシンの疎水性部分は疎水性を呈し、一方、ヒドロキシピラン、アミノ基及び水酸基は水溶性を呈する。この構造からこの誘導体は親水性と疎水性を兼ね合わせている。つまり、水溶性状態と脂溶性状態の性質を併せ持っている。この誘導体は疎水性の官能基により細胞膜の親油性部分を通過しやすい。また、核膜部分も通過して血管内皮細胞増殖に直接作用し、かつ、ミトコンドリアのＡＴＰ産生を増加させることにより、血管内皮細胞増殖作用を呈する。

すなわち、この誘導体はＶＥＧＦ（血管内皮細胞増殖因子）やＶＥＧＦ受容体を介さずに、直接、血管内皮細胞を増殖させる。この増殖性はＶＥＧＦが欠乏した状態やＶＥＧＦの増加による血管新生や癌の成長という副作用を生じない。

この誘導体による血管内皮細胞増殖のメカニズムは核内ＳＴＡＴ１の転写因子の結合性と反応性を高めること、ならびにミトコンドリアでＡＴＰ産生を促進させることである。さらに、ミトコンドリアではミトコンドリア膜に結合して膜を安定化させる。前述したようにＶＥＧＦの働きには関与しない。

しかし、ＶＥＧＦと共存することによって血管内皮細胞の増殖性は相乗的に効果を発揮する。すなわち、ＶＥＧＦとこの誘導体は作用部位が異なるために、ＶＥＧＦの効果は消去せず、また、抑制されることもなく、相乗的に増殖作用を発揮する。

この誘導体はヒドロキシピラン、ロイシン、ジヒドロキシベンゼンなどの既存物質がエステル結合したものであることから安全性が高い。

このヒドロキシピラン誘導体をヒドロキシピラン、ロイシン、ジヒドロキシベンゼンを原料として有機化学的に合成することができる。この有機合成された誘導体は標準物質として解析や分析に利用される。しかし、化学的な製造にはコストがかかり、かつ、有害な有機溶媒と重金属を使用することから、産業には利用しにくいという安全性上の欠点がある。

このヒドロキシピラン誘導体の構造についてはこの誘導体の重水素化クロロホルム中の６００ＭＨｚのＨ－ＮＭＲ（１Ｈ－ＮＭＲ）解析（ブルカー製）により、ピークの位置は１．１３、１．８７、１．９７、２．１９、３．０２、３．１２、３．１４、３．２７、３．３９、３．８０、３．９７、４．４１、５．１０、５．１２、７．５０、８．２４、９．６６及び１３．９８ｐｐｍに認められる。

また、この誘導体の重水素化クロロホルム中のＣ－ＮＭＲ（１３Ｃ－ＮＭＲ）解析ではピークの位置は１７．４、２９．４、３５．３、３７．４、５３．２、５５．４、６５．８、６７．１、７２．６、７４．３、８７．０、９０．６、９７．０、１０９．８、１１３．６、１１３．７、１１７．５、１２１．７、１２１．９、１３１．２、１４２．８、１４３．８、１５８．７、１６５．２、１７０．０、１７１．９、１９０．７及び１９３．４ｐｐｍに認められる。

このヒドロキシピラン誘導体は天然由来であることから安全性が高く、また、細胞内や核内への移行性に優れている。しかし、仮に、この誘導体を大量に摂取した場合でも、生体内で過剰量は分解されることから安全性が高い。

さらに、この誘導体は粉末にして水溶液と反応する際に水素ガスを発生する。発生する水素ガスは活性酸素を除去する働きがあるため、紫外線や酸化物質によって発生した活性酸素を除去して生体を安定に維持できることから好ましい。また、水素ガスはヒドロキシルラジカルを消去し、還元作用を呈し、かつ、抗酸化作用を発揮することから好ましい。

また、この誘導体は血管内皮細胞に働き、増殖させる。また、血管内皮細胞のミトコンドリアに働き、ＡＴＰを産生させる。このＡＴＰ産生増加の働きはミトコンドリア膜の安定化作用に起因している。ミトコンドリア膜はＡＴＰ産生の際に発生する呼吸によって障害を受けてＡＴＰ産生の能力が低下する。ここには活性酸素が関与しているがこの誘導体は発生する活性酸素を除去する働きがある。

この誘導体は末梢血管の血管内皮細胞を増殖させ、ＡＴＰを産生させることにより、末梢循環を改善させる。末梢循環の改善により、皮膚、心臓、神経、肝臓、腎臓、消化器の働きを維持し、健康的にする。たとえば、皮膚の末梢血管の増強と血流の改善により、皮膚細胞を増加させてシワを改善する。また、メラニンの排泄を促進させてシミやクスミを改善する。

さらに、心臓においては冠血管を増強して心臓に良い働きをもちらす。さらに、神経においては脳血管障害に対して改善作用を発揮する。

このヒドロキシピラン誘導体の抽出方法または製造方法としては発酵法、酵素反応法や化学合成法などがある。たとえば、このヒドロキシピラン誘導体の製造方法としてはオクラ芽、コメヌカ、大豆などから抽出することができる。また、種々の植物や植物カルスからも抽出することができる。また、この抽出方法ではプロテアーゼやリパーゼなどの消化酵素を利用することは抽出効率が高められることから好ましい。

特に、オクラと米糠を納豆菌及び紅麹菌で発酵させる発酵法、または、ヒト口腔細胞または皮膚表皮細胞を培養して培養液を得る製造方法はこの誘導体の効率的な製造工程である。

特に、オクラ芽と米糠を納豆菌及び紅麹菌で発酵させて得られる発酵液を培地としてヒト口腔細胞を培養してその培養液を得るという製造方法はこのヒドロキシピラン誘導体の製造方法の一つであり、効率的な製造方法である。これらの発酵技術及び培養技術は日本では経験と知識が豊富であり、かつ、安全性も高いことから好ましい。ヒトの口腔細胞にはエステル結合酵素やエステル変換酵素が含有されていることからヒト口腔細胞を用いる方法は特異的である。

さらに、高純度の誘導体を得る目的で精製されることは好ましい。精製の方法としては、分離用の樹脂を用いて分離用溶媒で抽出する精製操作を利用することは好ましい。

例えば、分離用担体または樹脂により分離され、分取されることは好ましい。分離用担体または樹脂としては、表面が後述のようにコーティングされた、多孔性のヒドロキシピラン、酸化珪素化合物、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリプロピレン、スチレン－ビニルベンゼン共重合体等が用いられる。０．１～３００μｍの粒度を有するものが好ましく、粒度が細かい程、精度の高い分離が行なわれるが、分離時間が長い欠点がある。

例えば、逆相担体または樹脂として表面が疎水性化合物でコーティングされたものは、疎水性の高い物質の分離に利用される。陽イオン物質でコーティングされたものは陰イオン性に荷電した物質の分離に適している。また、陰イオン物質でコーティングされたものは陽イオン性に荷電した物質の分離に適している。特異的な抗体をコーティングした場合には、特異的な物質のみを分離するアフィニティ担体または樹脂として利用される。

アフィニティ担体または樹脂は、抗原抗体反応を利用して抗原の特異的な調製に利用される。分配性担体または樹脂は、シリカゲル（メルク社製）等のように、物質と分離用溶媒の間の分配係数に差異がある場合、それらの物質の単離に利用される。

これらのうち、製造コストを低減することができる点から、吸着性担体または樹脂、分配性担体または樹脂、分子篩用担体または樹脂及びイオン交換担体または樹脂が好ましい。さらに、分離用溶媒に対して分配係数の差異が大きい点から、逆相担体または樹脂及び分配性担体または樹脂はより好ましい。

分離用溶媒として有機溶媒を用いる場合には、有機溶媒に耐性を有する担体または樹脂が用いられる。また、医薬品製造または食品製造に利用される担体または樹脂は好ましい。これらの点から吸着性担体としてダイヤイオン（三菱化学（株）社製、ＨＰ－２０及びＨＰ－２１）及びＸＡＤ－２またはＸＡＤ－４（ロームアンドハース社製）、分子篩用担体としてセファデックスＬＨ－２０（アマシャムファルマシア社製）、分配用担体としてシリカゲル、イオン交換担体としてＩＲＡ－４１０（ロームアンドハース社製）、逆相担体としてＤＭ１０２０Ｔ（富士シリシア社製）がより好ましい。

このうち、ダイヤイオンＨＰ－２０、セファデックスＬＨ－２０及びＤＭ１０２０Ｔは分離効率が高く、使用実績も多いことから、さらに好ましい。

得られた抽出物は、分離前に分離用担体または樹脂を膨潤化させるための溶媒に溶解される。その量は、分離効率の点から抽出物の重量に対して１～４０倍量が好ましく、４～２０倍量がより好ましい。分離の温度としては物質の安定性の点から４～３０℃が好ましく、１０～２３℃がより好ましい。

分離用溶媒には、水、または、水を含有する低級アルコール、親水性溶媒、親油性溶媒が用いられる。低級アルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールが用いられるが、食用として利用されているエタノールが好ましい。

セファデックスＬＨ－２０を用いる場合、分離用溶媒には低級アルコールが好ましい。シリカゲルを用いる場合、分離用溶媒にはクロロホルム、メタノール、酢酸またはこれらの混合液が好ましい。

ダイヤイオンＨＰ－２０及びＤＭ１０２０Ｔを用いる場合、分離用溶媒はメタノール、エタノール等の低級アルコールまたは低級アルコールと水の混合液が好ましい。また、活性を含む画分を採取して乾燥または真空乾燥により溶媒を除去し、粉末または濃縮液として得ることは溶媒による影響を除外できることから、好ましい。

このヒドロキシピラン誘導体は優れた血管内皮細胞増殖作用を発揮して皮膚の末梢血管に働き、メラニン排泄や皮膚の血流を改善させる化粧料に用いられることは好ましい。つまり、化粧料、シャンプー、まつ毛増殖剤、育毛剤、毛髪用化粧料として利用できる。さらに、ＶＥＧＦとの相乗作用によって血流を改善して皮膚のターンオーバーを増加させる化粧料として利用できる。

医薬品として注射剤または経口剤または塗布剤などの非経口剤として利用され、医薬部外品としては、錠剤、カプセル剤、ドリンク剤、石鹸、塗布剤、ゲル剤、歯磨き粉等に配合されて利用される。

経口剤としては錠剤、カプセル剤、散剤、シロップ剤、ドリンク剤等が挙げられる。上記の錠剤及びカプセル剤に混和される場合には、結合剤、賦形剤、膨化剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤等とともに用いることができる。上記の錠剤は、シェラックまたは砂糖で被覆することもできる。

また、上記のシロップ剤及びドリンク剤の場合には、甘味剤、防腐剤、色素香味剤等を添加することができる。

非経口剤としては、軟膏剤、クリーム剤、水剤等の外用剤の他に、注射剤が挙げられる。外用剤の基材としては、ワセリン、パラフィン、油脂類、ラノリン、マクロゴールド等が用いられ、通常の方法によって軟膏剤やクリーム剤等とすることができる。

注射剤には、液剤があり、その他、凍結乾燥剤がある。これは使用時、注射用蒸留水や生理食塩液等に無菌的に溶解して用いられる。

食品製剤として血管内皮細胞増殖作用を目的とした食品、血管内皮細胞増殖作用を目的とした健康食品、さらには、皮膚保護のための食品などに利用される。また、保健機能食品として栄養機能食品や特定保健用食品に利用することは好ましい。

得られた食品製剤をイヌやネコなどのペットや家畜動物に利用する場合、皮膚の血流や血管を強化することにより、栄養素の有効利用を目的として飼料やペット用サプリメントとして利用される。

化粧料として常法に従って界面活性化剤、溶剤、増粘剤、賦形剤等とともに用いることができる。例えば、クリーム、毛髪用ジェル、洗顔剤、美容液、化粧水等の形態とすることができ、血管内皮細胞増殖作用を呈する化粧料となる。化粧料の形態は任意であり、溶液状、クリーム状、ペースト状、ゲル状、ジェル状、固形状または粉末状として用いることができる。この誘導体は水溶性と油溶性の両方の溶媒に溶解する。この両親媒性の性質はこの誘導体の利用を広げることから好ましい。

また、この誘導体は血管内皮細胞増殖作用を利用した植物活性化剤としても利用される。この誘導体は植物の栄養素の循環を改善させ、生育を活性化し、開花、結実、収穫量の増加をもたらすことは好ましい。たとえば、この誘導体にＨＢ－１０１（株式会社フローラ製）の植物活力剤とともに植物の成長を促進する働きが増強され、維持され、安定化されることから好ましい。

以下に、式（１）に示される血管内皮細胞増殖作用を呈するヒドロキシピラン誘導体の製造方法で、ヒト口腔細胞の培養工程を含む方法について説明する。具体的には、オクラ芽と米糠を納豆菌及び紅麹菌で発酵させて得られる発酵液を培地としてヒト口腔細胞を培養してその培養液を得るという製造工程からなる。この製造工程は以下のように、オクラ芽と米糠を納豆菌及び紅麹菌で発酵させて得られる製造工程とこの発酵液を培地としてヒト口腔細胞を培養するという２つの製造工程からなる。

用いる原料はオクラ芽と米糠を納豆菌及び紅麹菌並びにヒト口腔細胞である。

オクラ芽はアオイ科トロロアオイ属で学名Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ Ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｓであるオクラの種子から発芽させた新芽である。オクラには豊富な栄養素、特に、ムコ多糖、ムコ多糖タンパク質、ムチンなどの粘性のある物質を含有している。オクラの芽には、ムコ多糖の他に細胞の成長を促進する栄養素が含有されている。これらの栄養素はヒト口腔細胞を増殖させるために好ましい。ここで用いるオクラの芽は日本産、アジア産、アメリカ産などのいずれでも用いられるが、日本産のオクラの芽は品質が安定し、農薬の汚染も少ないことから好ましい。特に、株式会社サラダコスモ製のオクラの芽は無農薬栽培され、安全性と品質が高いことから好ましい。

オクラの芽は乾燥され、粉末化されることが好ましく、発酵の前にオートクレーブ滅菌されることは発酵をスムーズに行うることから好ましい。３マイクロメーター以下の粒子サイズの粉末が発酵の工程を実施しやすくすることから好ましい。

また、原料となる米糠は国産、アジア産、アメリカ産などいずれの産地でも良いが無農薬
の米より採取される日本産のものが好ましい。特に、マルカワみそ株式会社製の無農薬で有機ＪＡＳ認定の米糠は品質が高いことから好ましい。

これらの原料は使用に際して株式会社奈良機械製作所製の自由ミル、スーパー自由ミル、サンプルミル、ゴブリン、スーパークリーンミル、マイクロス、減圧乾燥機として東洋理工製の小型減圧乾燥機、株式会社マツイ製の小型減圧伝熱式乾燥機ＤＰＴＨ－４０、エーキューエム九州テクノス株式会社製のクリーンドライＶＤ－７、ＶＤ－２０、中山技術研究所製ＤＭ－６などの粉砕機で乾燥され、粉砕される。これにより発酵の工程が効率的に進行されやすい。

用いる納豆菌は学名Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓで日本では納豆の製造や食品加工に汎用され、食経験が豊富で有用な食用菌である。沖縄や鹿児島などの日本産、中国や台湾の東南アジア原産の菌種が用いられる。このうち、納豆素本舗製の納豆菌は高い発酵性を呈することから好ましい。

上記の発酵に関するそれぞれの添加量は、オクラの芽１重量に対して米糠は０．３～５重量、納豆菌は０．００４～０．０５重量が好ましい。納豆菌は発酵される前に、前培養することは、発酵の初発時間を短縮し、発酵時間が短縮されることから好ましい。

上記の発酵は清浄な培養用タンクで実施され、滅菌された水道水により上記の材料を混合することは好ましい。まず、オクラの芽と米糠は納豆菌により発酵が行われる。発酵は３７～４２℃で２４時間から９６時間行われることが好ましい。温度が低く、時間が短い場合には発酵が進まず、温度が高く、時間が長い場合には腐敗するおそれがある。発酵物はろ過されてろ液が以下の工程に供される。

発酵の条件は上記の発酵法に準ずる。納豆菌の発酵によりポリフェノール、タンパク質が分解されて低分子化される。

この発酵したろ液は紅麹菌により発酵される。用いる紅麹菌は、学名Ｍｏｎａｓｃａｃｅａｅで、食経験が豊富で有用な食用菌である。沖縄や鹿児島などの日本産、中国や台湾の東南アジア原産の菌種が用いられる。このうち、紅麹本舗製の紅麹菌は高い発酵性を呈することから好ましい。

発酵に関するそれぞれの添加量は上記の納豆菌の発酵液１重量に対して紅麹菌は０．００１～０．０３重量が好ましい。紅麹菌は発酵される前に、前培養することは、発酵の初発時間を短縮し、発酵時間が短縮されることから好ましい。

また、この発酵は、３５～４８℃に加温され、発酵は４日間から１４日間行われる。

発酵後、９０℃程度の加温により納豆菌と紅麹菌が死滅し、発酵が停止される。この発酵液は濾過され、ろ液はヒト口腔細胞の培養用培地として利用される。そのため、オートクレーブ滅菌される。これをヒト口腔細胞用培地とする。

この発酵液を培地としてヒト口腔細胞が培養される。ヒトの口腔細胞にはエステル結合酵素やエステル変換酵素が含有されていることからヒト口腔細胞を用いる方法は優れている。つまり、ヒト口腔細胞は倫理的な同意の基にウイルスや細菌に感染していないことを確認した成人ヒトの口腔内より採取される。すなわち、滅菌された綿棒に上記のヒト口腔細胞用培地を浸潤させた後、口腔を摩擦させることにより口腔組織が採取される。摩擦は非侵襲的に実施され、検体採取者に肉体的負荷がかからないように実施する。この検体採取は医療的な行為ではない。

この摩擦された口腔組織は上記のヒト口腔細胞用培地に含有した１%コラゲナーゼ液により細胞が分散される。つまり、ヒト口腔組織を１５ｍＬ容の滅菌試験管（ＦＡＬＣＯＮ製など）に入れ、ヒト口腔細胞用培地に含有した１%コラゲナーゼ液を１０ｍＬを添加し、３７℃で５分間加温し、撹拌される。加温後、４℃に冷却され、分散された細胞を細胞分離装置（ＦＡＬＣＯＮ製のセルストレーナーなど）により回収する。細胞に上記のヒト口腔細胞用培地を添加して細胞を洗浄し、細胞数を１ｍＬあたり１０００個として３５ｍｍ径培養用シャーレ（ＦＡＬＣＯＮ製など）に播種され、５％炭酸ガス下、３７℃で培養される。

培養は炭酸ガス培養器（たとえば、ヤマト科学製のＢＮＡ６００など）内で実施される。細胞の状態を顕微鏡で観察しつつ、５日～１０日の間培養される。コンフルエントになる前に培養を停止させ、培養液を滅菌ピペット（ＦＡＬＣＯＮ製など）により採取し、滅菌遠沈管（ＦＡＬＣＯＮ製など）に移す。これを１５００ｒｐｍにて５分間、遠心分離し、残存する細胞を遠沈させ、上清部分を採取する。この上清部分を１００℃、５分間煮沸滅菌して冷却後、メンブレンフィルターにより精密濾過し、清浄な容器に移して目的とするヒドロキシピラン誘導体を含有する溶液とする。

上記の反応物から、目的とするヒドロキシピラン誘導体を上記に記載した精製方法により分離し、精製することは純度の高い物質として摂取量を減少させることができる点から好ましい。特に、ダイヤイオンＨＰ－２０を用いたカラムクロマトにより精製する工程は純度が高まり、回収率が高いことから好ましい。なお、この精製工程を３回～５回程度繰り返すことによって純度の高い精製品が得られる。

ヒドロキシピラン誘導体を含む画分を採取して乾燥または真空乾燥により溶媒を除去し、目的とするヒドロキシピラン誘導体を粉末または濃縮液として得ることは溶媒による影響を除外できることから、好ましい。

また、このヒドロキシピラン誘導体を粉末化することは防腐及び安定性の目的から好ましい。

以下、上記実施形態を実施例及び試験例を用いて具体的に説明する。なお、これらは一例であり、素材、原料や検体の違いに応じて常識の範囲内で条件を変更させることが可能である。

株式会社サラダコスモより購入したオクラの芽を用いた。これを粉砕機（株式会社奈良機械製作所製のスーパー自由ミル）にて粉砕し、オクラの芽の乾燥粉末粉砕物を１ｋｇ得た。

また、マルカワみそ株式会社より購入した無農薬の米糠を用いた。粉砕機により粉砕して約１ｋｇを発酵に利用した。

オクラの芽の粉砕物１ｋｇ及び米糠の粉砕物１ｋｇを清浄な発酵タンク（滅菌された発酵用丸形４０リットルタンク）に入れて滅菌された水道水１０ｋｇを添加し、攪拌した。これを煮沸滅菌して滅菌状態を維持させつつ、冷却した。

これとは別に、納豆素本舗より購入した納豆菌の１０ｇを小型発酵タンクに供し、滅菌した大豆粉末とともに前培養させた培養液を用意した。

上記の前培養した納豆菌の溶液を上記のオクラの芽と米糠粉末を入れた発酵タンクに添加し、攪拌後、３９～４２℃の温度範囲で加温し、発酵させた。

発酵過程では、通気によりバブリングと攪拌を行いつつ、発酵液のサンプリングを行った。発酵の状態は溶出したタンパク質の定量（ビューレット法）によりモニタリングした。

発酵終了後、得られた発酵液の上清を濾過布により粗濾過してろ液を得た。

この発酵ろ液５ｋｇを清浄な発酵タンクに入れ、ここに紅麹本舗製の紅麹菌１０ｇを前培養した紅麹菌を添加して、発酵させた。３８～４２℃の温度範囲に加温し、発酵を約７日間実施した。

発酵後、９０℃設定の加温により納豆菌と紅麹菌を死滅させて発酵を停止された。この発酵液を東洋濾紙の濾紙（Ｎｏ．２）により吸引ろ過し、ろ液をオートクレーブ滅菌し、これをヒト口腔細胞用培地とした。

ヒト口腔細胞は倫理的な同意の基にウイルスや細菌に感染していないことを確認した成人（日本人男性、６０歳）の口腔内より採取した。滅菌された綿棒に上記のヒト口腔細胞用培地を浸潤させた後、口腔を摩擦した。この摩擦は検体採取者に肉体的負荷がかからないように実施した。なお、上記の男性以外にも、１０名の男性（日本人、２２歳～７２歳）及び８名の女性（日本人、２３歳～８０歳）の口腔細胞でも同様に実施し、同様な結果を得た。

摩擦して得られた口腔組織を１５ｍＬ容の滅菌試験管（ＦＡＬＣＯＮ製）に入れ、上記のヒト口腔細胞用培地に含有した１%コラゲナーゼ液１０ｍＬを添加し、３７℃で５分間加温し、撹拌した。

加温後、４℃に冷却し、分散された細胞を細胞分離装置（ＦＡＬＣＯＮ製のセルストレーナー）によりろ液として細胞を回収した。この細胞に上記のヒト口腔細胞用培地を添加して細胞を洗浄し、細胞数を１ｍＬあたり１０００個とした。この１ｍＬを３５ｍｍ径培養用シャーレ（ＦＡＬＣＯＮ製など）に播種した、炭酸ガス培養液（ヤマト科学製のＢＮＡ６００）内で５％炭酸ガス下、３７℃で培養した。顕微鏡で観察し、コンフルエントになる前に培養を停止した。

この培養液を滅菌ピペット（ＦＡＬＣＯＮ製）により採取し、滅菌遠沈管（ＦＡＬＣＯＮ製）に移した。これを１５００ｒｐｍにて５分間、遠心分離して残存する細胞を遠沈させて上清部分を採取した。

この上清部分を１００℃、５分間煮沸滅菌して冷却後、メンブレンフィルターにより精密濾過し、清浄な容器に移して目的とするヒドロキシピラン誘導体を含有する溶液とした。これを検体１とした。培養としてシャーレは５０枚程度利用し、これらを合わせて検体１の溶液を４１ｇ採取した。

得られた検体１の３０ｇを精製水１００ｍＬに懸濁して３％エタノールで膨潤させたダイヤイオンＨＰ－２０（三菱化学製）５００ｇ入りガラスカラム（３ｃｍ径×長さ９０ｃｍ）に供した。３％エタノール１８００ｍＬで洗浄後、１５％エタノール１０００ｍＬで、さらに洗浄した。

これに５０％エタノール７００ｍＬを添加して分画を分離した。５０ｍＬずつ分画して目的とするヒドロキシピラン誘導体はＨＰＬＣ法により検出し、ヒドロキシピラン誘導体の分画を採取した。この精製操作を５回実施して最終精製物とした。この液体をエバポレーターにより減圧蒸留してエタノールを蒸発させ、精製されたヒドロキシピラン誘導体の溶液とした。これを検体２とした。

以下に、ヒドロキシピラン誘導体の構造解析に関する試験方法及び結果について説明する。
（試験例１）

上記のように得られた検体１及び検体２を精製水に希釈し、濾過後、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ、島津製作所）で分析した。

さらに、上記検体１及び検体２を重水素化クロロホルム中、６００ＭＨｚの核磁気共鳴装置（ＮＭＲ、ブルカー製）で解析した。構造解析の結果、検体２及び検体１からヒドロキシピランの１分子、ロイシンの１分子、エチレン基の２分子、ジヒドロキシベンゼンの２分子が結合した目的とする誘導体が検出された。

６００ＭＨｚのＨ－ＮＨＲ分析結果では、１．１３、１．８７、１．９７、２．１９、３．０２、３．１２、３．１４、３．２７、３．３９、３．８０、３．９７、４．４１、５．１０、５．１２、７．５０、８．２４、９．６６及び１３．９８ｐｐｍにピークが認められた。

さらに、Ｃ－ＮＭＲ分析結果では、１７．４、２９．４、３５．３、３７．４、５３．２、５５．４、６５．８、６７．１、７２．６、７４．３、８７．０、９０．６、９７．０、１０９．８、１１３．６、１１３．７、１１７．５、１２１．７、１２１．９、１３１．２、１４２．８、１４３．８、１５８．７、１６５．２、１７０．０、１７１．９、１９０．７及び１９３．４ｐｐｍにピークが認められた。

以下に、Ｃ－ＮＭＲの解析結果のチャートを示した。（横軸単位はｐｐｍ、縦軸単位はピーク強度を示す。）

上記の分析値は有機化学合成されたヒドロキシピラン誘導体のピークと同一であり、目的とするヒドロキシピラン誘導体として同定された。検体２に含まれるこの誘導体は９８．２％、つまり、純度９８．２％であった。

なお、検体１中のこの誘導体の純度は７８．２％であった。

以下に、ヒト由来血管内皮細胞の増殖性及びＡＴＰ産生に関する確認試験について述べる。
（試験例２）

ヒト由来血管内皮細胞（成人由来、皮膚微小血管タイプ、Ｄ１００１７）をタカラバイオより購入して用いた。この血管内皮細胞は成人皮膚由来であり、皮膚の血管を評価するために適している。このヒト由来血管内皮細胞を専用の培養液（タカラバイオ製）にて５％炭酸ガス下、３７℃で培養した。増殖の認められた細胞をトリプシンＥＤＴＡ液で剥離し、培養液に分散して２０００個の細胞を３５ｍｍ径シャーレ（ファルコン組織培養ディッシュ３００１、ファルコン製）に培養液１ｍＬとともに播種した。

これをさらに１日間培養して細胞をシャーレに付着させた。ここに、実施例で採取された検体１、検体２及びＶＥＧＦを最終濃度１０ｍｇ／ｍＬ（１％濃度）となるように添加した。対照としたＶＥＧＦはヒト細胞で発現させた高活性の組換え体ＶＥＧＦ（ヒューマンザイム製）であり、フナコシより購入して用いた。

さらに、検体２とＶＥＧＦを同時に添加する相乗的な作用を調べる群も設定した。なお、溶媒対照として培養液のみを添加する群を設けた。実験は５枚のシャーレで実施し、平均値を求めて溶媒対照との比率にて結果を表記した。

検体処理２日後に、生きた細胞数をトリプシンとＥＤＴＡ液にて剥離し、培養液に分散してトリパンブルー色素法により顕微鏡下、血球計数盤を用いて計数した。また、細胞を低張処理により破壊した。この細胞分散液に含有されるＡＴＰ量を化学発光によるＡＴＰ定量キット（カイマン製）にて定量した。なお、通常の培養液にはＶＥＧＦが含有されていないことをＨＰＬＣ法（島津製作所製）により定量した。ＶＥＧＦの測定条件はＳｈｉｍｐａｃｋＳＣＲを用い、移動相として０．１％酢酸含有２０％アセトニトリルを用いてカラム温度３７℃で２９０ｎｍの波長で測定した。標準物質として上記のＶＥＧＦを用いた。

この実験の結果、溶媒対照に比して検体１による内皮細胞数は１８２％、検体２では２４１％、ＶＥＧＦでは１７３％となった。さらに、検体２とＶＥＧＦの同時添加では、溶媒対照に比して５６９％になった。この結果から、検体１と検体２はＶＥＧＦよりも優れた内皮細胞の増殖作用を示すと考えられた。さらに、検体２はＶＥＧＦと相乗作用を示した。

また、ＡＴＰ含量については、溶媒対照に比して検体１では１３４％、検体２では２０２％、ＶＥＧＦでは１１４％となった。さらに、検体２とＶＥＧＦの同時添加では、溶媒対照に比して４３３％になった。この結果から、検体１と検体２はＡＴＰ産生についてＶＥＧＦよりも優れた増加作用を示すと考えられた。

なお、活性型であるリン酸化ＳＴＡＴの半定量をＰｈｏｓｐｈ－ＳＴＡＴＣｅｌｌ－Ｂａｓｅｄ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄシステム、フナコシより購入）を用いて内皮細胞を９６孔マイクロプレート（ファルコン製）に播種して定量した結果、溶媒対照に比して検体１の添加により１５４％、検体２の添加により２３２％、ＶＥＧＦの添加により１１１％となった。この結果、検体１及び検体２はＳＴＡＴ１を含むＳＴＡＴを増加させると結論された。一方、ＶＥＧＦによるＳＴＡＴの増加作用は軽度であり、検体１及び検体２が優れていた。

以下に、ヒト由来皮膚表皮細胞の増殖性及びＡＴＰ産生に関する確認試験について述べる。
（試験例３）

ヒト由来皮膚表皮細胞（成人由来、表皮ケラチノサイト、ＫＧＭ－Ｇｏｌｄ）をロンザジャパン株式会社より購入して用いた。この細胞は成人皮膚由来であり、表皮細胞の増殖を評価するために適している。このヒト由来皮膚表皮細胞を専用の無血清培養液（ロンザジャパン製）にて５％炭酸ガス下、３７℃で培養した。増殖の認められた細胞をトリプシンＥＤＴＡ液（和光純薬製）で剥離し、培養液に分散して５０００個の細胞を３５ｍｍ径シャーレ（ファルコン組織培養ディッシュ３００１、ファルコン製）に培養液１ｍＬとともに播種した。

これをさらに２日間培養して細胞をシャーレに付着させた。ここに、実施例で採取された検体１、検体２及び陽性対照としたＥＧＦを最終濃度１０ｍｇ／ｍＬ（１％濃度）となるように添加した。対照としたＥＧＦはオリエンタル酵母製のヒト組み換え体ＥＧＦ（製品コード４７０６１０００）を購入して用いた。

さらに、検体２とＥＧＦを同時に添加する群も設定した。なお、溶媒対照として無血清培養液のみを添加する群を設けた。実験は５枚のシャーレで実施し、平均値を求めて溶媒対照との比率にて結果を表記した。

検体処理２日後に、トリプシンとＥＤＴＡ液にて剥離し、培養液に分散してトリパンブルー色素法により顕微鏡下、生きた細胞数を血球計数盤を用いて計数した。また、細胞を低張処理により破壊した。この細胞分散液に含有されるＡＴＰ量を化学発光によるＡＴＰ定量キット（カイマン製）にて定量した。なお、用いた無血清培養液にはＥＧＦが含有されていないことを確認した。

この実験の結果、溶媒対照に比して検体１による皮膚表皮細胞数は１６３％、検体２では２３１％、ＥＧＦでは１５５％となった。さらに、検体２とＥＧＦの同時添加では、溶媒対照に比して４９１％になった。この結果から、検体１と検体２はＥＧＦよりも優れた内皮細胞の増殖作用を示すと考えられた。さらに、検体２はＥＧＦと相乗作用を示した。

また、ＡＴＰ含量については、溶媒対照に比して検体１では１４１％、検体２では１９１％、ＥＧＦでは１０９％となった。さらに、検体２とＥＧＦの同時添加では、溶媒対照に比して２６６％になった。この結果から、検体１と検体２はＡＴＰ産生についてＥＧＦよりも優れた増加作用を示すと考えられた。

さらに、細胞を精製水に分散して超音波破砕機により細胞分散液を得た。この細胞分散液中に含まれるケラチン量をＥＬＩＳＡ法（コスモ・バイオ株式会社）により定量した。その結果、ケラチン量は溶媒対照の値を１００％として検体１では１３８％、検体２では１９２％、ＥＧＦでは１２８％となった。ケラチンは皮膚組織にとって有用成分であり、皮膚を保護することから、検体１及び検体２はＥＧＦよりも優れた皮膚保護作用を示した。

本発明で得られるヒドロキシピラン誘導体は血管内皮細胞増殖作用を呈し、かつ、副作用が少ないことから動脈硬化、心筋梗塞や脳血管障害などの血管障害の治療や予防に利用され、国民のＱＯＬを改善できる。

本発明で得られるヒドロキシピラン誘導体は化粧料としても皮膚改善に利用され、化粧品業界の発展に寄与する。

Claims (2)

1. 下記の式（１）に示される血管内皮細胞増殖作用を呈するヒドロキシピラン誘導体。
   

   
2. オクラ芽と米糠を納豆菌及び紅麹菌で発酵させて得られる発酵液を培地としてヒト口腔細胞を培養してその培養液を得るという製造工程からなる請求項１に記載の式（１）に示される血管内皮細胞増殖作用を呈するヒドロキシピラン誘導体の製造方法。