TW201718019A - 生物結合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明提供包含聚醣及與其結合之1至約50個肽的生物結合物，其中該(等)肽包含膠原蛋白結合單元、玻尿酸結合單元、ICAM結合單元、VCAM結合單元及/或選擇素結合單元；含有其的組合物；及其用途。

Description

生物結合物及其用途 相關申請案之交叉參考
本申請案根據35 U.S.C.119(e)主張2015年4月17日申請的美國臨時申請案第62/149,428號、2015年10月13日申請的美國臨時申請案第62/241,057號及2015年10月21日申請的美國臨時申請案第62/244,665號的權益，其中每一者的內容以全文引用的方式併入本文中。
本文提供包含聚醣及與其結合之1至約50個肽的生物結合物，其中該等肽包含膠原蛋白結合單元、玻尿酸結合單元、ICAM結合單元、VCAM結合單元及/或選擇素結合單元；含有其的組合物；及其用途。
在組織中，細胞係被含有各種大分子，諸如生物結合物、膠原蛋白、玻尿酸、層黏連蛋白、纖維結合蛋白等的胞外基質(extracellular matrix；ECM)所包圍。在哺乳動物中，生物結合物為胞外基質之主要組分，其在胞外基質中會與其他生物結合物、玻尿酸及纖維基質蛋白(諸如膠原蛋白)形成大的複合物。隨著哺乳動物衰老及在一些疾病病況下，身體某些區域中(例如，在滑膜關節、玻璃體、脊椎盤、皮膚等中)之胞外基質可能降解，導致不想要的症狀，諸如各種形式之關節炎、視力喪失及其類似症狀。另外，一些組織損傷，諸如血管損傷、角膜損傷及真皮傷口會導致胞外基質及/或其組分(包 括膠原蛋白及玻尿酸)暴露。
先前，生物結合物係經由氧化化學合成，此會使聚醣主鏈內之一或多個醣環裂解，以便提供用於與肽結合之醛官能基。
本發明提供包含聚醣及1至50個肽之生物結合物，肽係包含經由-C(O)-NH-NH-C(O)-(亦即醯肼-羰基)鍵與其共價結合之膠原蛋白結合單元、玻尿酸結合單元、選擇素、ICAM及/或VCAM受體結合單元。本文所描述之生物結合物在結構上不同於此項技術中已知之生物結合物，不同之處在於肽係經由醯肼-羰基鍵與聚醣結合，其中醯肼-羰基之羰基為存在於聚醣上之環外羰基。在本文所揭示之生物結合物中，醯肼-羰基之羰基側接於聚醣內之醣環上，諸如(但不限於)D-葡萄糖醛酸鹽或L-艾杜糖醛酸鹽。預期由如本文所揭示之生物結合物展現之有益效果(諸如結合親和力增加)係至少部分由於不含有以氧化方式裂解的醣環之聚醣。另一有益效果是不含以氧化方式裂解之醣環的生物結合物之穩定性會提高。因此，在某些實施例中，生物結合物包含非經氧化聚醣之聚醣，及/或其中肽係非藉由因裂解醣所產生的官能基結合之聚醣。在某些實施例中，聚醣為經化學修飾之聚醣衍生物，諸如部分N-脫硫酸化聚醣衍生物、部分O-脫硫酸化聚醣衍生物、部分O-羧甲基化聚醣衍生物或其任何組合。
在某些實施例中，醯肼-羰基鍵位於肽上的末端醯肼基與聚醣上的羰基之間。在其他實施例中，醯肼-羰基鍵位於肽上的末端羰基與聚醣上的醯肼基之間。
在一個實施例中，本發明係關於一種包含聚醣及1至50個肽之生物結合物，其中肽包含膠原蛋白結合單元及/或玻尿酸結合單元，且經由醯肼-羰基鍵與聚醣結合。
在其他實施例中，本發明係關於一種包含聚醣及約1至約50個肽 之生物結合物，其中肽包含選擇素、ICAM及/或VCAM之結合單元，且經由醯肼-羰基鍵與聚醣結合。
亦提供包含本文所描述之生物結合物之組合物，及其使用方法。在一個態樣中，提供包含如本文所描述之生物結合物之組合物，其中與聚醣結合之肽的數量變化。舉例而言，組合物可包含如此生物結合物，其中與其結合之肽的數量經計算為平均值，諸如每聚醣約5至約20個肽。
本文亦提供一種包含選自由以下組成之群的一或多種生物結合物之組合物：a)包含聚醣及至少一個包含玻尿酸結合單元的肽之生物結合物；b)包含聚醣及至少一個包含選擇素結合單元的肽之生物結合物；c)包含聚醣及至少一個包含ICAM結合單元的肽之生物結合物；d)包含聚醣及至少一個包含VCAM結合單元的肽之生物結合物；及e)包含聚醣及至少一個包含膠原蛋白結合單元的肽之生物結合物。
亦提供醫藥組合物，其包含本文所描述之生物結合物或含有其等之組合物及一或多種稀釋劑或載劑(諸如鹽水)。
本文所描述之肽官能化聚合物之生物功能可藉由改變聚醣主鏈及/或與其連接之肽加以調節。舉例而言，本文所描述之生物結合物可用於治療及/或預防疾病，諸如與血管損傷及/或炎症相關之疾病。
如本文所描述之生物結合物及包含其等的組合物可用於治療及/或預防有其需要之患者之冠狀動脈疾病及/或外周動脈疾病。繞道移植係用作為冠狀動脈疾病(CAD)及外周動脈疾病(PAD)中動脈阻塞之一種治療形式。在美國，每年進行大約500,000個冠狀動脈繞道移植(CABG)程序及超過70,000個外周繞道移植程序。最常見地，通常係自隱靜脈收集自體血管移植物。如本文所描述之生物結合物可用作為以自體靜脈移植物進行繞道手術期間之患有心血管疾病患者的靜脈移植物保存液。
本文亦提供一種在血管損傷或介入之前、期間及/或之後，治療患者之血管的方法，其包含向血管施用有效量之如本文所描述之生物結合物或包含其的組合物。
本文亦提供一種治療有其需要之患者之內腔(例如，股膕動脈)內的狹窄或閉塞之方法，其包含在球囊血管成形術之前、期間及/或之後，向內腔之內壁施用溶液，其中該溶液包含有效量之如本文所描述之生物結合物或包含其的組合物。
亦提供一種治療關節炎之方法，其中治療可包括減輕與關節炎相關之一或多種症狀。此項技術中已知與關節炎相關之各種症狀包括(但不限於)疼痛、僵硬、壓痛、炎症、腫脹、發紅、發熱及行動性降低。在各種實施例中，關節炎為骨關節炎或類風濕性關節炎。
本文亦提供一種製造包含聚醣及1至50個肽之生物結合物的方法，該方法包含使聚醣與足夠量之肽(其中肽包含醯肼基)視情況在活化劑存在下於偶合反應條件下接觸以提供生物結合物，其中肽包含膠原蛋白結合單元、玻尿酸結合單元、ICAM結合單元、VCAM結合單元及/或選擇素結合單元且經由位於肽上的末端醯肼基與聚醣上的羰基之間的醯肼-羰基鍵與聚醣結合。在某些實施例中，該方法包含使聚醣與活化劑接觸，以提供具有至少一個活化羧酸部分之活化聚醣。在其他實施例中，醯肼-羰基鍵位於肽上的末端羰基與聚醣上的醯肼基之間。
本發明之某些態樣可藉由附圖查看。包括以下：
圖1(圖A-D)展示(A)不含肽的生物素標記硫酸軟骨素、(B)具有經由氧化醣開環化學及BMPH連接子與CS結合之GAH肽的生物結合物、(C)具有經由醯肼-羰基鍵與CS結合之GAH肽的生物結合物及(D)具有經由醯肼-羰基鍵與CS結合之STM肽的生物結合物之玻尿酸結合親和 力(參見實例5)。
圖2展示eDS-SILY(如本文所描述之生物結合物)與oxDS-SILY(利用氧化聚醣所合成之生物結合物)隨時間推移之穩定性(參見實例11)。
應理解，本發明不限於所描述之特定實施例，因此其當然可變化。亦應理解，本文所用之術語僅出於描述特定實施例之目的而並不意欲為限制性的，因為本發明之範疇將僅由所附申請專利範圍限制。
1. 定義
除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語具有與本發明所屬領域之一般技術者通常所理解相同之含義。必須注意，除非上下文另外明確說明，否則如本文及所附申請專利範圍所用之單數形式「一(a/an)」及「該」包括複數指示物。因此，例如提及「肽」包括複數個肽。
如本文所用，以下術語及縮寫具有以下含義。
如本文所用，術語「包含(comprising/comprises)」欲意謂包括所述要素之組合物及方法，但不排除其他要素。當用於定義組合物及方法時，「基本上由……組成」應意謂不包括除用於所述目的之組合之任何必需顯著性以外的其他要素。因此，基本上由如本文所定義之要素組成的組合物不排除非實質上影響所主張之基本及新穎特徵之其他材料或步驟。「由……組成」應意謂排除其他成分及實質性方法步驟之微量以上的要素。由此等過渡術語中之每一者定義之實施例在本發明之範疇內。
當在例如溫度、時間、量及濃度之數字名稱(包括範圍)之前使用時，術語「約」係指可能有(+)或(-)10%、5%或1%之變化的近似值。
如本文所用，術語「生物結合物」、「肽聚醣」及「蛋白聚醣」及「合成蛋白聚醣」可互換使用，且係指包含聚醣及與其共價鍵結之一或多種肽的合成結合物。聚醣部分可以合成方式製得或來源於動物來源。肽經由醯肼-羰基鍵(亦即，-C(O)-NH-NH-C(O)-)共價結合於聚醣。在某些實施例中，醯肼-羰基鍵位於肽上的末端醯肼基與聚醣上的羰基之間。在其他實施例中，醯肼-羰基鍵位於肽上的末端羰基與聚醣上的醯肼基之間。在一些實施例中，術語生物結合物包括肽聚醣。
如本文所用，術語「聚醣」係指具有大量醣苷連接之單醣之化合物。在某些實施例中，聚醣為葡萄糖胺聚醣(GAG)，其包含以交替方式與糖醛酸連接之2-胺基糖，且包括諸如肝素、硫酸乙醯肝素、軟骨素、角蛋白及皮膚素之聚合物。因此，可在本文所描述之實施例中 使用的聚醣之非限制性實例包括海藻酸鹽、瓊脂糖、葡聚醣、硫酸葡聚醣、軟骨素、硫酸軟骨素(CS)、皮膚素、硫酸皮膚素(DS)、硫酸乙醯肝素、肝素(Hep)、角蛋白、硫酸角質素及玻尿酸(HA)，包括其衍生物。在另一實施例中，聚醣之分子量是變化的以調整生物結合物之效果(參見例如，Radek,K.A.等人，Wound Repair Regen.,2009,17：118-126；及Taylor,K.R.等人，J.Biol.Chem.,2005,280：5300-5306)。在一個實施例中，聚醣係藉由氧化及鹼性消除作用加以降解(參見例如，Fransson,L.A.等人，Eur.J.Biochem.,1980,106：59-69)，以得到具有低分子量(例如，約10kDa至約50kDa)之降解聚醣。在一些實施例中，聚醣未經修飾。在某些實施例中，聚醣不含有以氧化方式裂解之醣環，及因此不會且尚未含有醛官能基。在某些實施例中，聚醣為衍生的。
如本文所用，術語「衍生聚醣」意欲包括聚醣衍生物。舉例而言，衍生聚醣可包括一或多種化學衍生物，諸如(但不限於)部分N-脫硫酸化衍生物、部分O-脫硫酸化衍生物及/或部分O-羧甲基化衍生物。舉例而言，如本文所用，術語「肝素」意欲包括肝素及其衍生物，諸如(但不限於)部分N-及/或部分O-脫硫酸化肝素衍生物、部分O-羧甲基化肝素衍生物或其組合。在某些實施例中，肝素為非氧化肝素(亦即，不含以氧化方式裂解之醣環)且不含醛官能基。
如本文所用，術語「鍵結」及「共價鍵結」可互換使用且係指兩個原子共用一或多對電子。
在某些實施例中，肽序列經由間隔基鍵結至聚醣。如本文所用，術語「間隔基」意欲指使結合單元或肽連接至醯肼-羰基鍵之生物結合物之視情況存在之部分。在本文所描述之任一實施例中，肽中之任何一或多者可具有包含一至約五個胺基酸之間隔基序列。預期任何天然或非天然胺基酸可用於間隔基序列中，其限制條件為間隔基序 列不會顯著干擾預期的肽結合。例示性間隔基包括(但不限於)包含一至五個甘胺酸單元(例如，G、GG、GGG、GGGG或GGGGG)，視情況包含半胱胺酸(例如，GC、GCG、GSGC或GGC)及/或絲胺酸(例如，GSG、SGG或GSGSG)，或一至五個精胺酸單元(例如，R、RR、RRR等)的短序列。間隔基亦可包含非胺基酸部分，諸如聚乙二醇(PEG)、6-胺基己酸、丁二酸或其組合，具有或不具有額外胺基酸間隔基。在某些實施例中，本文所描述之肽序列進一步包含GSG-NHNH2部分。通常，GSG-NHNH2部分與C端或N端結合。
在一個實施例中，本發明之生物結合物係直接或間接結合於膠原蛋白。如本文所用之術語「結合(binding/bind)」意謂包括可使用例如雜交分析、表面電漿子共振、ELISA、競爭結合分析、等溫滴定量熱法、噬菌體呈現、親和層析、流變學或免疫組織化學偵測之分子間相互作用。該等術語亦意謂包括分子間「結合」相互作用。結合可為「直接」或「間接」的。「直接」結合包含分子間直接物理接觸。分子間「間接」結合包含與一或多個分子同時具有直接物理接觸的分子。此結合可導致包含相互作用分子之「複合物」形成。「複合物」係指藉由共價或非共價鍵結、相互作用或力量結合在一起的兩個或兩個以上分子之結合。
如本文所用，術語「肽」及「肽序列」意欲指由肽(或醯胺)鍵連接之胺基酸之直鏈或分支鏈。在一個實施例中，肽包含約3至約120個胺基酸，或約3至約110個胺基酸，或約3至約100個胺基酸，或約3至約90個胺基酸，或約3至約80個胺基酸，或約3至約70個胺基酸，或約3至約60個胺基酸，或約3至約50個胺基酸，或約3至約40個胺基酸，或約5至約120個胺基酸，或約5至約100個胺基酸，或約5至約90個胺基酸，或約5至約80個胺基酸，或約5至約70個胺基酸，或約5至約60個胺基酸，或約5至約50個胺基酸，或約5至約40個胺基酸，或約5至 約30個胺基酸，或約5至約20個胺基酸，或約5至約10個胺基酸。
在本文所描述之各種實施例中，肽(或結合單元)可藉由包括一或多個保守胺基酸取代而經修飾。如熟習此項技術者所熟知，藉由保守取代改變肽之任何非關鍵胺基酸不應顯著改變彼肽之活性，因為置換胺基酸之側鏈應能夠形成類似於已經置換之胺基酸之側鏈的鍵及觸點。非保守取代亦為可能的，其限制條件為其不會實質上影響肽之結合活性(亦即，選擇素、ICAM及/或VCAM結合親和力)。
如本文所用，術語「序列一致性」係指兩個肽之間或兩個核酸分子之間的胺基酸殘基或核苷酸之一致性程度。當比較序列中之位置由同一鹼基或胺基酸佔據時，則在彼位置處之分子為相同的。肽(或多肽或肽區域)與另一序列具有一定百分比(例如，至少約60%，或至少約65%，或至少約70%，或至少約75%，或至少約80%，或至少約83%，或至少約85%，或至少約90%，或至少約95%，或至少約98%或至少約99%)之「序列一致性」意謂當比對時在比較兩個序列中鹼基(或胺基酸)之百分比相同。應指出，對於本申請案中所揭示之任何序列(「參考序列」)，與參考序列具有至少約60%，或至少約65%，或至少約70%，或至少約75%，或至少約80%，或至少約83%，或至少約85%，或至少約90%，或至少約95%，或至少約98%或至少約99%序列一致性之序列亦在本發明內。同樣，本發明亦包括與參考序列相比具有胺基酸殘基或核苷酸之一個、兩個、三個、四個或五個取代、缺失或添加的序列。在某些實施例中，在本文所指定之序列中之任何一或多者中，序列可藉由於其中每一者具有一個、兩個或三個胺基添加、缺失及/或取代而經修飾。
如本文所用，術語「胞外基質」係指可提供給周圍細胞結構及生物化學支持之組織之胞外部分。
如本文所用，術語「組合物」係指出於治療目的適於向預期患 者投與之含有至少一種醫藥活性成分(包括其任何固體形式)的製劑。組合物可包括至少一種醫藥學上可接受之組分以提供改良之化合物調配物，該組分諸如適合載劑。在某些實施例中，組合物以膜、凝膠、貼片或液體溶液形式調配。如本文所用，術語「局部」係指出於局部效果，以非全身性方式將組合物投與給待治療之組織及/或器官(內部，或在一些情況下外部)之表面。
如本文所用，術語「醫藥學上可接受」係指考慮到使用量及/或待治療之疾病或病狀及各別投與途徑，所指材料不具有會使相當謹慎醫師避免向患者投與之特性。典型的醫藥學上可接受之材料基本上為無菌的。
如本文所用，術語「醫藥學上可接受之載劑」係指醫藥學上可接受之材料、組合物或媒劑，諸如液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、溶劑或囊封材料，其參與自身體之一個器官或部分攜帶或輸送任何補充劑或組合物或其組分至身體之另一器官或部分或遞送藥劑至靜脈內表面。
如本文所用，術語「調配(formulated/formulation)」係指使不同化學物質(包括一或多種醫藥活性成分)組合產生劑型之過程。在某些實施例中，兩種或兩種以上醫藥活性成分可共調配成單一劑型或組合劑量單位，或分別調配且隨後組合成組合劑量單位。持續釋放調配物為被設計成在延長時間段內在體內緩慢釋放治療劑之調配物，而立即釋放調配物為被設計成在縮短時間段內在體內快速釋放治療劑之調配物。
如本文所用，術語「遞送」係指按需要用於在體內輸送醫藥組合物以安全地達成其所需治療效果之途徑、方法、調配物、技術及系統。遞送途徑可為任何適合途徑，包括(但不限於)血管內、靜脈內、動脈內、肌肉內、皮膚、皮下、經皮、皮內及表皮內途徑。
如本文所用，術語「溶液」係指此項技術中熟知之溶液、懸浮液、乳液、滴劑、軟膏、液體洗滌液、噴霧劑及脂質體。在一些實施例中，液體溶液含有在添加少量酸或鹼時可抵抗pH變化之水性pH緩衝劑。在某些實施例中，液體溶液含有潤滑性增強劑。
如本文所用，術語「聚合物」、「聚合物基質」或「聚合劑」係指生物相容性聚合材料。本文所描述之聚合材料可包含例如糖(諸如甘露糖醇)、肽、蛋白質、層黏連蛋白、膠原蛋白、玻尿酸、離子及非離子水溶性聚合物；丙烯酸聚合物；親水性聚合物，諸如聚氧化乙烯、聚氧化乙烯-聚氧化丙烯共聚物及聚乙烯醇；纖維素聚合物及纖維素聚合物衍生物，諸如羥丙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯、甲基纖維素、羧甲基纖維素及醚化纖維素；聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、乳酸與乙醇酸共聚物或其他天然及合成之聚合劑。
在某些實施例中，聚合基質為可吸收的，諸如膠原蛋白、聚乙醇酸、聚乳酸、聚二氧六環酮及己內酯。如本文所用，術語「可吸收」係指材料能夠被吸收至體內。在其他實施例中，聚合物為不可吸收的，諸如聚丙烯、聚酯或耐綸。
如本文所用，術語「pH緩衝劑」係指在向其中添加少量酸或鹼時可抵抗pH變化之水性緩衝劑溶液。pH緩衝溶液通常包含弱酸與其結合鹼之混合物，或反之亦然。舉例而言，pH緩衝溶液可包含磷酸鹽，諸如磷酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鈉二水合物、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鈉十二水合物、磷酸鉀、磷酸二氫鉀及磷酸氫二鉀；硼酸及硼酸鹽，諸如硼酸鈉及硼酸鉀；檸檬酸及檸檬酸鹽，諸如檸檬酸鈉及檸檬酸二鈉；乙酸鹽，諸如乙酸鈉及乙酸鉀；碳酸鹽，諸如碳酸鈉及碳酸氫鈉等。pH調節劑可包括例如酸，諸如鹽酸、乳酸、檸檬酸、磷酸及乙酸；及鹼性鹼，諸如氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉及碳酸氫 鈉等。在一些實施例中，pH緩衝劑為磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)溶液(亦即，含有磷酸鈉、氯化鈉且在一些調配物中氯化鉀及磷酸鉀)。
如本文所用，術語「治療」係指在血管損傷或介入之前、期間及/或之後，預防、治癒、逆轉、減弱、緩解、最小化、抑制、遏制及/或停止疾病或病症之一或多種臨床症狀。
如本文所用，術語「並行」係指同時(亦即，以結合形式)投與。在一個實施例中，投與為共投與，以使得兩種或兩種以上醫藥活性成分(包括其任何固體形式)一起一次性遞送。
如本文所用，術語「依次」係指單獨(亦即，在不同時間)投與。在一個實施例中，係錯開投與，以使得兩種或兩種以上醫藥活性成分(包括其任何固體形式)分別在不同時間遞送。
膠原蛋白結合肽
「膠原蛋白結合肽」為包含1至約120個具有一或多個膠原蛋白結合單元(或序列)之胺基酸的肽。如本文所用，術語「膠原蛋白結合單元」意欲指在結合於膠原蛋白之肽內之胺基酸序列。「膠原蛋白結合」係指與膠原蛋白之相互作用，可包括疏水性、離子(電荷)及/或凡得瓦爾力相互作用(Van der Waals interaction)，使得化合物與膠原蛋白有利地結合或相互作用。此結合(或相互作用)意欲區別於與常見官能基之共價鍵結及非特異性相互作用，使得肽與含有與肽在膠原蛋白上結合之彼官能基的任何物質相互作用。可使用此項技術中已知之任何方法測試且評估肽與膠原蛋白之結合。參見例如，Li,Y.等人，Current Opinion in Chemical Biology,2013,17：968-975；Helmes,B.A.等人，J.Am.Chem.Soc.2009,131,11683-11685；及Petsalaki,E.等人，PLoS Comput Biol,2009,5(3)：e1000335。在一個實施例中，肽或肽之膠原蛋白結合單元以小於約1mM，或小於約900μM，或小於約800μM，或小於約700μM，或小於約600μM，或小於約500μM，或小於 約400μM，或小於約300μM，或小於約200μM，或小於約100μM之解離常數(K d )結合於膠原蛋白。
肽與正常或不正常參與膠原蛋白原纖維形成之蛋白質的一部分可具有胺基酸同源性。在一些實施例中，此等肽與小的富含白胺酸之生物結合物之胺基酸序列、血小板受體序列或調節膠原蛋白原纖維形成之蛋白質具有同源性或序列一致性。在各種實施例中，肽包含選自以下之胺基酸序列：RRANAALKAGELYKSILY(SEQ ID NO：1)、GELYKSILY(SEQ ID NO：2)、RRANAALKAGELYKCILY(SEQ ID NO：3)、GELYKCILY(SEQ ID NO：4)、RLDGNEIKR(SEQ ID NO：5)、AHEEISTTNEGVM(SEQ ID NO：6)、NGVFKYRPRYFLYKHAYFYPPLKRFPVQ(SEQ ID NO：7)、CQDSETRTFY(SEQ ID NO：8)、TKKTLRT(SEQ ID NO：9)、GLRSKSKKFRRPDIQYPDATDEDITSHM(SEQ ID NO：10)、SQNPVQP(SEQ ID NO：11)、SYIRIADTNIT(SEQ ID NO：12)、KELNLVYT(SEQ ID NO：13)、GSIT(SEQ ID NO：14)、GSITTIDVPWNV(SEQ ID NO：15)、GQLYKSILY(SEQ ID NO：16)、RRANAALKAGQLYKSILY(SEQ ID NO：17)；或與其具有至少約80%序列一致性，或至少約83%序列一致性，或至少約85%序列一致性，或至少約90%序列一致性，或至少約95%序列一致性，或至少約98%序列一致性之序列，其限制條件為該序列能夠與膠原蛋白結合。
在某些實施例中，肽包含與馮威里氏因子(vWF)或血小板膠原蛋白受體之膠原蛋白結合域具有至少約80%，或至少約83%，或至少約85%，或至少約90%，或至少約95%，或至少約98%，或至少約100%序列一致性之胺基酸序列，如描述於Chiang,T.M.等人，J.Biol.Chem.,2002,277：34896-34901；Huizinga,E.G.等人，Structure,1997,5：1147-1156；Romiin,R.A.等人，J.Biol.Chem.,2003,278：15035- 15039；及Chiang等人，Cardio.& Haemato.Disorders-Drug Targets,2007,7：71-75中，每一者以引用的方式併入本文中。非限制性實例為WREPSFCALS(SEQ ID NO：18)，來源於vWF。
用於針對膠原蛋白結合親和力(或膠原蛋白結合域/單元)篩選肽序列之各種方法為此項技術中常規的。可在本文所揭示之生物結合物及方法中使用之展示具有膠原蛋白結合親和力(或膠原蛋白結合單元)之其他肽序列包括(但不限於)βAWHCTTKFPHHYCLYBip(SEQ ID NO：19)、βAHKCPWHLYTTHYCFTBip(SEQ ID NO：20)、βAHKCPWHLYTHYCFT(SEQ ID NO：21)等，其中Bip為聯苯丙胺酸且βA為β-丙胺酸(參見，Abd-Elgaliel,W.R.等人，Biopolymers,2013,100(2),167-173)；GROGER(SEQ ID NO：22)、GMOGER(SEQ ID NO：23)、GLOGEN(SEQ ID NO：24)、GLOGER(SEQ ID NO：25)、GLKGEN(SEQ ID NO：26)、GFOGERGVEGPOGPA(SEQ ID NO：27)等，其中O為4-羥脯胺酸(參見，Raynal,N.等人，J.Biol.Chem.,2006,281(7),3821-3831)；HVWMQAPGGGK(SEQ ID NO：28)(參見，Helms,B.A.等人，J.Am.Chem.Soc.2009,131,11683-11685)、WREPSFCALS(SEQ ID NO：18)(參見，Takagi,J.等人，Biochemistry,1992,31,8530-8534)、WYRGRL(SEQ ID NO：29)等(參見，Rothenfluh D.A.等人，Nat Mater.2008,7(3),248-54)；WTCSGDEYTWHC(SEQ ID NO：30)、WTCVGDHKTWKC(SEQ ID NO：31)、QWHCTTRFPHHYCLYG(SEQ ID NO：32)等(參見，U.S.2007/0293656)；STWTWNGSAWTWNEGGK(SEQ ID NO：33)、STWTWNGTNWTRNDGGK(SEQ ID NO：34)等(參見，WO/2014/059530)；CVWLWEQC(SEQ ID NO：35)環狀CVWLWENC(SEQ ID NO：36)、環狀CVWLWEQC(SEQ ID NO：35)(參見，Depraetere H.等人，Blood.1998,92,4207-4211及Duncan R.,Nat Rev Drug Discov,2003,2(5),347-360)；CMTSPWRC(SEQ ID NO：37)等(參見，Vanhoorelbeke,K.等人，J.Biol.Chem.,2003,278,37815-37821)；CPGRVMHGLHLGDDEGPC(SEQ ID NO：38)(參見，Muzzard,J.等人，PLoS one.4(e 5585)I-10)；KLWLLPK(SEQ ID NO：39)(參見，Chan,J.M.等人，Proc Natl Acad Sci U.S.A.,2010,107,2213-2218)；及CQDSETRTFY(SEQ ID NO：8)等(參見，U.S.2013/0243700)；H-V-F/W-Q/M-Q-P/A-P/K(Helms,B.A.等人，J.Am.Chem.Soc.,2009,131(33),11683-11685)，其中每一者以全文引用的方式併入本文中。
可用於本文所揭示之生物結合物及方法中之展示具有膠原蛋白結合親和力(或膠原蛋白結合單元)之額外肽序列包括(但不限於)LSELRLHEN(SEQ ID NO：40)、LTELHLDNN(SEQ ID NO：41)、LSELRLHNN(SEQ ID NO：42)、LSELRLHAN(SEQ ID NO：43)及LRELHLNNN(SEQ ID NO：44)(參見，Fredrico,S.,Angew.Chem.Int.Ed.2015,37,10980-10984)。
在某些實施例中，肽包括選自由以下組成之群的一或多個序列：RVMHGLHLGDDE(SEQ ID NO：45)、D-胺基酸EDDGLHLGHMVR(SEQ ID NO：46)、RVMHGLHLGNNQ(SEQ ID NO：47)、D-胺基酸QNNGLHLGHMVR(SEQ ID NO：48)、RVMHGLHLGNNQ(SEQ ID NO：47)、GQLYKSILYGSG-4K2K(SEQ ID NO：49)(4-分支鏈肽)、GSGQLYKSILY(SEQ ID NO：50)、GSGGQLYKSILY(SEQ ID NO：51)、KQLNLVYT(SEQ ID NO：52)、KELNVYT(SEQ ID NO：53)、CVWLWQQC(SEQ ID NO：54)、WREPSFSALS(SEQ ID NO：55)、GHRPLDKKREEAPSLRPAPPPISGGGYR(SEQ ID NO：56)及GHRPLNKKRQQAPSLRPAPPPISGGGYR(SEQ ID NO：57)。
類似地，對於膠原蛋白結合肽，可產生來源於選擇膠原蛋白之噬菌體呈現庫的肽。可藉由任何技術，諸如SPR、ELISA、ITC、親和層析或此項技術中已知之其他技術來合成且評估肽與膠原蛋白之結合。實例可為在含有固定膠原蛋白之微量培養盤上培育之經生物素修飾之肽序列(例如，SILY生物素)。可使用抗生蛋白鏈菌素-發色團產生劑量反應結合曲線來確定肽與膠原蛋白結合之能力。
在一個實施例中，肽包含一或多個膠原蛋白結合單元，其結合I型、II型、III型、IV型、V型、VI型、VII型、VIII型、IX型、X型、XI型、XII型、XIII型或XIV型膠原蛋白中之任何一或多者。在一個實施例中，肽以小於約1mM，或小於約900μM，或小於約800μM，或小於約700μM，或小於約600μM，或小於約500μM，或小於約400μM，或小於約300μM，或小於約200μM，或小於約100μM之解離常數(K d )結合於I型膠原蛋白。在一個實施例中，肽以小於約1mM，或小於約900μM，或小於約800μM，或小於約700μM，或小於約600μM，或小於約500μM，或小於約400μM，或小於約300μM，或小於約200μM，或小於約100μM之解離常數(K d )結合於II型膠原蛋白。在一個實施例中，肽以小於約1mM，或小於約900μM，或小於約800μM，或小於約700μM，或小於約600μM，或小於約500μM，或小於約400μM，或小於約300μM，或小於約200μM，或小於約100μM之解離常數(K d )結合於III型膠原蛋白。在一個實施例中，肽以小於約1mM，或小於約900μM，或小於約800μM，或小於約700μM，或小於約600μM，或小於約500μM，或小於約400μM，或小於約300μM，或小於約200μM，或小於約100μM之解離常數(K d )結合於IV型膠原蛋白。
玻尿酸結合肽
「玻尿酸結合肽」為包含1至約120個具有一或多個膠原蛋白結 合單元(或序列)之胺基酸的肽。如本文所用，「玻尿酸結合單元」意欲指在結合於玻尿酸之肽內之胺基酸序列。「玻尿酸結合」係指與玻尿酸之相互作用，可包括疏水性、離子(電荷)及/或凡得瓦爾力相互作用，以使得化合物與玻尿酸有利地結合或相互作用。此結合(或相互作用)意欲區別於與常見官能基之共價鍵結及非特異性相互作用，以使得玻尿酸結合肽與含有與肽在玻尿酸上結合之官能基的任何物質相互作用。參見例如，Becerra,S.P.等人，J.Biol.Chem.,2008,283：33310-33320在一個實施例中，肽或玻尿酸結合單元以小於約1mM，或小於約900μM，或小於約800μM，或小於約700μM，或小於約600μM，或小於約500μM，或小於約400μM，或小於約300μM，或小於約200μM，或小於約100μM之解離常數(K d )結合於玻尿酸。
在某些實施例中，合成生物結合物之玻尿酸結合單元可包含來源於玻尿酸介導之運動受體(RHAMM)的胺基酸序列(例示性序列包括(但不限於)NP_001136028、NP_001136029、NP_036616及NP_036617)。
在本文所描述之各種實施例中，合成生物結合物之玻尿酸結合肽組分可包含選自以下之胺基酸序列：GAHWQFNALTVR(SEQ ID NO：58)、STMMSRSHKTRSHHV(SEQ ID NO：59)、TMTRPHFHKRQLVLS(SEQ ID NO：60)、STMMSRSHKTRSCHH(SEQ ID NO：61)、STMMSRSHKTRSHH(SEQ ID NO：62)、GDRRRRRMWHRQ(SEQ ID NO：63)、GKHLGGKHRRSR(SEQ ID NO：64)、RGTHHAQKRRS(SEQ ID NO：65)、RRHKSGHIQGSK(SEQ ID NO：66)、SRMHGRVRGRHE(SEQ ID NO：67)、RRRAGLTAGRPR(SEQ ID NO：68)、RYGGHRTSRKWV(SEQ ID NO：69)、RSARYGHRRGVG(SEQ ID NO：70)、GLRGNRRVFARP(SEQ ID NO：71)、SRGQRGRLGKTR(SEQ ID NO：72)、DRRGRSSLPKLAGPVEFPDRKIKGRR(SEQ ID NO：73)、 AGPVEFPDRKIKGRR(SEQ ID NO：74)、RMRRKGRVKHWG(SEQ ID NO：75)、RGGARGRHKTGR(SEQ ID NO：76)、TGARQRGLQGGWGPRHLRGKDQPPGR(SEQ ID NO：77)、RQRRRDLTRVEG(SEQ ID NO：78)、STKDHNRGRRNVGPVSRSTLRDPIRR(SEQ ID NO：79)、RRIGHQVGGRRN(SEQ ID NO：80)、RLESRAAGQRRA(SEQ ID NO：81)、GGPRRHLGRRGH(SEQ ID NO：82)、VSKRGHRRTAHE(SEQ ID NO：83)、RGTRSGSTR(SEQ ID NO：84)、RRRKKIQGRSKR(SEQ ID NO：85)、RKSYGKYQGR(SEQ ID NO：86)、KNGRYSISR(SEQ ID NO：87)、RRRCGQKKK(SEQ ID NO：88)、KQKIKHVVKLK(SEQ ID NO：89)、KLKSQLVKRK(SEQ ID NO：90)、RYPISRPRKR(SEQ ID NO：91)、KVGKSPPVR(SEQ ID NO：92)、KGRYSISR(SEQ ID NO：93)、RRRCGQKK(SEQ ID NO：94)、KTFGKMKPR(SEQ ID NO：95)、RIKWSRVSK(SEQ ID NO：96)及KRTMRPTRR(SEQ ID NO：97)；或與其具有至少約80%序列一致性，或至少約83%序列一致性，或至少約85%序列一致性，或至少約90%序列一致性，或至少約95%序列一致性，或至少約98%序列一致性之序列，其限制條件為該序列能夠與玻尿酸結合。
可作為玻尿酸結合合成生物結合物之肽組分而包括之額外肽包括具有Arg-Arg(R-R)基元之肽，諸如選自以下之一或多個肽：RRASRSRGQVGL(SEQ ID NO：98)、GRGTHHAQKRRS(SEQ ID NO：99)、QPVRRLGTPVVG(SEQ ID NO：100)、ARRAEGKTRMLQ(SEQ ID NO：101)、PKVRGRRHQASG(SEQ ID NO：102)、SDRHRRRREADG(SEQ ID NO：103)、NQRVRRVKHPPG(SEQ ID NO：104)、RERRERHAVARHGPGLERDARNLARR(SEQ ID NO：105)、TVRPGGKRGGQVGPPAGVLHGRRARS(SEQ ID NO：106)、 NVRSRRGHRMNS(SEQ ID NO：107)、DRRRGRTRNIGN(SEQ ID NO：108)、KTAGHGRRWSRN(SEQ ID NO：109)、AKRGEGRREWPR(SEQ ID NO：110)、GGDRRKAHKLQA(SEQ ID NO：111)、RRGGRKWGSFEG(SEQ ID NO：112)及RQRRRDLTRVEG(SEQ ID NO：78)(參見例如，Amemiya等人，Biochem.Biophys.Acta,2005,1724,94-99，以引用的方式併入本文中)；或與其具有至少約80%序列一致性，或至少約83%序列一致性，或至少約85%序列一致性，或至少約90%序列一致性，或至少約95%序列一致性，或至少約98%序列一致性之序列，其限制條件為該序列能夠與玻尿酸結合。在另一實施例中，肽選自以下：RDGTRYVQKGEYR(SEQ ID NO：113)、HREARSGKYK(SEQ ID NO：114)、PDKKHKLYGV(SEQ ID NO：115)及WDKERSRYDV(SEQ ID NO：116)(參見例如，Yang,B.等人，EMBO Journal,1994,13,286-296及Goetinck,P.F.等人，J.Cell.Biol,1987,105,2403-2408，兩者以引用的方式併入本文中)；或與其具有至少約80%序列一致性，或至少約83%序列一致性，或至少約85%序列一致性，或至少約90%序列一致性，或至少約95%序列一致性，或至少約98%序列一致性之序列，其限制條件為該序列能夠與玻尿酸結合。
亦可利用針對與玻尿酸結合之陽性選擇藉由噬菌體呈現選擇肽。玻尿酸結合肽可藉由其與玻尿酸之相互作用來確定，且藉由用於評估分子相互作用之任何技術(諸如表面電漿子共振、ELISA、競爭結合分析、等溫滴定量熱法、親和層析、流變學及/或免疫組織化學)量測。被視為「玻尿酸結合」之肽可與玻尿酸或含玻尿酸組織相互作用，因此相互作用並非歸因於已知化學反應性基團。相互作用可歸因於由肽中之胺基酸殘基產生的疏水性及電荷相互作用。相互作用可藉由使玻尿酸固定於微量培養盤上且與玻尿酸結合肽一起培育，隨後藉 由諸如使用發色團之生物素-抗生物素蛋白的偵測技術來量測。相互作用亦可藉由對已與玻尿酸結合肽或含有玻尿酸結合肽之合成生物結合物一起培育之含有玻尿酸的流體、凝膠或組織之機械影響來量測。
為識別肽，可合成選自噬菌體呈現之肽或自蛋白質中之玻尿酸結合基元識別之肽，且評估其與玻尿酸之相互作用。舉例而言，B-X7-B序列可藉由在N端之生物素修飾來合成且在經玻尿酸塗佈之微量培養盤上培育。可產生劑量反應結合曲線以確定肽與玻尿酸結合之能力。在一個實施例中，肽包含約3至約120個胺基酸，或約3至約110個胺基酸，或約3至約100個胺基酸，或約3至約90個胺基酸，或約3至約80個胺基酸，或約3至約70個胺基酸，或約3至約60個胺基酸，或約3至約50個胺基酸，或約3至約40個胺基酸，或約5至約120個胺基酸，或約5至約100個胺基酸，或約5至約90個胺基酸，或約5至約80個胺基酸，或約5至約70個胺基酸，或約5至約60個胺基酸，或約5至約50個胺基酸，或約5至約40個胺基酸，或約5至約30個胺基酸，或約5至約20個胺基酸，或約5至約10個胺基酸。
ICAM、VCAM及選擇素結合肽
「ICAM、VCAM及/或選擇素結合肽」為包含1至約120個具有一或多個膠原蛋白結合單元(或序列)之胺基酸的肽。如本文所用，術語「ICAM、VCAM及/或選擇素結合單元」意欲指在結合於ICAM、VCAM及/或選擇素受體中之一或多者之肽內之胺基酸序列。該結合係指與ICAM、VCAM及/或選擇素受體之相互作用，可包括疏水性、離子(電荷)及/或凡得瓦爾力相互作用，使得化合物與ICAM、VCAM及/或選擇素受體有利地結合或相互作用。此結合(或相互作用)意欲區別於與常見官能基之共價鍵結及非特異性相互作用，使得ICAM、VCAM及/或選擇素結合肽或單元與含有與肽在ICAM、VCAM及/或選擇素受體上結合之彼官能基的任何物質相互作用。在一個實施例中， 肽或結合單元以小於約1mM，或小於約900μM，或小於約800μM，或小於約700μM，或小於約600μM，或小於約500μM，或小於約400μM，或小於約300μM，或小於約200μM，或小於約100μM之解離常數(K d )結合於ICAM、VCAM及/或選擇素受體。
適用之肽之實例包括以下可與選擇素結合之肽序列(或單元)：IELLQAR(SEQ ID NO：117)、IELLQARGSC(SEQ ID NO：118)、IDLMQAR(SEQ ID NO：119)、IDLMQARGSC(SEQ ID NO：120)、QITWAQLWNMMK(SEQ ID NO：121)、QITWAQLWNMMKGSC(SEQ ID NO：122)及其組合。選擇素可為S選擇素、P選擇素或E選擇素。用於針對E選擇素結合親和力(或E選擇素結合單元)篩選肽序列之各種方法為此項技術中常規的(參見例如，Martens,C.L.等人J.Biol.Chem.1995,270(36),21129-21136；及Koivunen,E.等人J.Nucl.Med.1999,40,883-888)。
可用於本文所揭示之生物結合物及方法中之展示具有E選擇素結合親和力(或E選擇素結合單元)之其他肽序列包括(但不限於)LRRASLGDGDITWDQLWDLMK(SEQ ID NO：123)、HITWDQLWNVMN(SEQ ID NO：124)、QITWAQLWNMMK(SEQ ID NO：121)、YGNSNITWDQLWSIMNRQTT(SEQ ID NO：125)、WTDTHITWDQLWHFMNMGEQ(SEQ ID NO：126)、EPWDQITWDQLWIIMNNGDG(SEQ ID NO：127)、HITWDQLWLMMS(SEQ ID NO：128)、DLTWEGLWILMT(SEQ ID NO：129)、RGVWGGLWSMTW(SEQ ID NO：130)、DYSWHDLWFMMS(SEQ ID NO：131)、KKEDWLALWRIMSVPDEN(SEQ ID NO：132)、RNMSWLELWEHMK(SEQ ID NO：133)、KEQQWRNLWKMMS(SEQ ID NO：134)、SQVTWNDLWSVMNPEVVN(SEQ ID NO：135)及 RSLSWLQLWDWMK(SEQ ID NO：136)(參見例如，Martens,C.L.等人J.Biol.Chem.1995,270(36),21129-21136)、DITWDQLWDLMK(SEQ ID NO：137)(參見例如，Koivunen,E.等人J.Nucl.Med.1999,40,883-888)、DITWDELWKIMN(SEQ ID NO：138)、DYTWFELWDMMQ(SEQ ID NO：139)、DMTHDLWLTLMS(SEQ ID NO：140)、EITWDQLWEVMN(SEQ ID NO：141)、HVSWEQLWDIMN(SEQ ID NO：142)、HITWDQLWRIMT(SEQ ID NO：143)、DISWDDLWIMMN(SEQ ID NO：144)、QITWDQLWDLMY(SEQ ID NO：145)、RNMSWLELWEHMK(SEQ ID NO：133)、AEWTWDQLWHVMNPAESQ(SEQ ID NO：146)、HRAEWLALWEQMSP(SEQ ID NO：147)、KKEDWLALWRIMSV(SEQ ID NO：148)、KRKQWIELWNIMS(SEQ ID NO：149)、WKLDTLDMIWQD(SEQ ID NO：150)及HITWDQLWNVMLRRAASLG(SEQ ID NO：151)(參見例如，Simanek,E.E.Chem.Rev.1998,98,833-862)或其組合，其中每一者以全文引用的方式併入本文中。
用於針對ICAM結合親和力(或ICAM結合單元)篩選肽序列之各種方法為此項技術中常規的(參見例如，Martens,C.L.等人J.Biol.Chem.1995,270(36),21129-21136；及Koivunen,E.等人J.Nucl.Med.1999,40,883-888)。適用之可結合ICAM之肽序列之實例包括以下：NAFKILVVITFGEK(SEQ ID NO：152)、NAFKILVVITFGEKGSC(SEQ ID NO：153)、ITDGEA(SEQ ID NO：154)、ITDGEAGSC(SEQ ID NO：155)、DGEATD(SEQ ID NO：156)、DGEATDGSC(SEQ ID NO：157)及其組合。
可用於本文所揭示之生物結合物及方法中之展示具有ICAM結合親和力(或ICAM結合單元)之其他肽序列包括(但不限於) EWCEYLGGYLRYCA(SEQ ID NO：158)(參見例如，Welply,J.K.等人Proteins：Structure,Function,and Bioinformatics 1996,26(3)：262-270)、FEGFSFLAFEDFVSSI(SEQ ID NO：159)(參見例如，美國公開案第WO2014059384號)、NNQKIVNLKEKVAQLEA(SEQ ID NO：160)、NNQKIVNIKEKVAQIEA(SEQ ID NO：161)、NNQKLVNIKEKVAQIEA(SEQ ID NO：162)、YPASYQR(SEQ ID NO：163)、YQATPLP(SEQ ID NO：164)、GSLLSAA(SEQ ID NO：165)、FSPHSRT(SEQ ID NO：166)、YPFLPTA(SEQ ID NO：167)及GCKLCAQ(SEQ ID NO：168)(參見例如，美國專利8,926,946)、GGTCGGGGTGAGTTTCGTGGTAGGGATAATTCTGTTTGGGTGGTT(SEQ ID NO：169)、EWCEYLGGYLRCYA(SEQ ID NO：170)(參見例如，Koivunen,E.等人J.Nucl.Med.1999,40,883-888)、GRGEFRGRDNSVSVV(SEQ ID NO：171)(參見例如，中國公開案第CN1392158號)、QTSVSPSKVI(SEQ ID NO：172)、PSKVILPRGG(SEQ ID NO：173)、LPRGGSVLVTG(SEQ ID NO：174)及QTSVSPSKVILPRGGSVLVTG(SEQ ID NO：175)(參見例如，Tibbetts,S.A.等人Peptides 21-20001161-1167)及其組合，其中每一者以全文引用的方式併入本文中。
用於針對VCAM結合親和力(或VCAM結合單元)篩選肽序列之各種方法為此項技術中常規的(參見例如，Martens,C.L.等人J.Biol.Chem.1995,270(36),21129-21136；及Koivunen,E.等人J.Nucl.Med.1999,40,883-888)。可在本文所揭示之生物結合物及方法中使用之展示具有VCAM結合親和力(或VCAM結合單元)之其他肽序列包括(但不限於)YRLAIRLNER(SEQ ID NO：176)、YRLAIRLNERRENLRIALRY(SEQ ID NO：177)及RENLRIALRY(SEQ ID NO：178)(參見例如，歐洲公開案第EP1802352號)及其組合，其以全文引用的方式併入本文 中。
在某些實施例中，本文所描述之任何序列可經修飾，使得任何一或多個胺基酸(例如，1、2、3、4或5個胺基酸)自其添加、缺失或取代。在一些實施例中，序列經修飾使得任何一或多個胺基酸經丙胺酸置換。在一些實施例中，序列經修飾使得任何一或多個1-胺基酸經相應d-胺基酸掃描置換。在一些實施例中，序列經修飾使得任何一或多個纈胺酸經白胺酸置換，任何一或多個麩胺酸經麩醯胺酸置換，任何一或多個天冬胺酸經天冬醯胺置換，及/或任何一或多個精胺酸經麩醯胺酸置換。
在本文所描述之任一實施例中，具有膠原蛋白結合單元、玻尿酸結合單元、ICAM結合單元、VCAM結合單元及/或選擇素結合單元之肽包含在前述段落中描述之任何胺基酸序列，或與任何此等胺基酸序列具有至少約80%，或至少約83%，或至少約85%，或至少約90%，或至少約95%，或至少約98%，或至少約100%同源性之胺基酸序列。在各種實施例中，本文所描述之合成生物結合物之肽組分可藉由包括一或多個保守胺基酸取代而經修飾。如熟習此項技術者所熟知，藉由保守取代改變肽之任何非關鍵胺基酸不應顯著改變彼肽之活性，因為置換胺基酸之側鏈應能夠形成類似於已經置換之胺基酸之側鏈的鍵及觸點。
如此項技術中所熟知，胺基酸之「保守取代」或肽之「保守取代變異體」係指一種胺基酸取代，其維持：1)肽之二級結構；2)胺基酸之電荷或疏水性；及3)側鏈之膨鬆度或此等特徵中之任何一或多者。說明性地，熟知術語「親水性殘基」係關於絲胺酸或蘇胺酸。「疏水性殘基」係指白胺酸、異白胺酸、苯丙胺酸、纈胺酸或丙胺酸或其類似物。「帶正電殘基」係關於離胺酸、精胺酸、鳥胺酸或組胺酸。「帶負電殘基」係指天冬胺酸或麩胺酸。具有「龐大側鏈」之殘 基係指苯丙胺酸、色胺酸或酪胺酸或其類似物。在表1中給出說明性保守胺基酸取代之清單。
在一些實施例中，肽序列經修飾以使一或多個麩胺酸殘基經麩醯胺酸置換及/或一或多個天冬胺酸殘基經天冬醯胺置換。
2. 生物結合物
本文提供包含聚醣及1至50個肽之生物結合物，肽包含經由-C(O)-NH-NH-C(O)-(亦即醯肼-羰基)鍵與其共價結合之膠原蛋白結合單元及/或玻尿酸結合單元、選擇素、ICAM及/或VCAM受體結合單元。
先前，藉由利用氧化化學使聚醣主鏈內之一或多個醣環裂解以便提供在聚醣上之醛結合位點，使肽結合於聚醣(諸如硫酸皮膚素)。隨後使用醛結合位點結合肽(例如，經由-C(O)-NH-N=C鍵)。
本文所描述之生物結合物在結構上不同於此項技術中已知之生物結合物，不同之處在於肽經由醯肼-羰基鍵與聚醣結合，其中醯肼- 羰基之羰基為存在於聚醣上之環外羰基。環外羰基可存在於天然聚醣上，或者聚醣可經修飾以包括此類官能基。該等方法進一步詳述於下文中。預期由如本文所揭示之生物結合物展現之有益效果(諸如結合親和力增加)係至少部分由於不含以氧化方式裂解的醣環之聚醣。
在某些實施例中，生物結合物可包含由任何單一或組合之單體單元組成的聚合物主鏈(例如，不同於聚醣之生物相容性聚合物)，其限制條件為至少一個且在一些情況下1至約50個適合官能基存在於其上，使得如本文所描述之肽可與其共價結合。聚合物可為直鏈、分支鏈的，或可含有側鏈(例如，不同於1至50個肽)。聚合物可為中性、陽離子、陰離子或兩性離子的。在某些實施例中，聚合物為含糖聚合物。聚合物可為共聚物，包括例如式A-B-A嵌段共聚物。提供此類聚合物之方法為此項技術中已知，且包括例如活性聚合。在一個實施例中，聚合物為聚(乙二醇)(PEG)。在另一實施例中，聚合物不為聚(乙二醇)(PEG)。在某些實施例中，聚合物不為聚醣或奈米粒子。在某些實施例中，聚合物為聚醣。
在本文所描述之生物結合物之某些實施例中，聚醣可為海藻酸鹽、軟骨素、皮膚素、硫酸皮膚素、乙醯肝素、硫酸乙醯肝素、肝素、葡聚醣、硫酸葡聚醣或玻尿酸。在一個實施例中，聚醣為硫酸皮膚素。在一個實施例中，聚醣不為硫酸皮膚素。在另一實施例中，聚醣為硫酸軟骨素。在另一實施例中，聚醣為肝素。可在本文所描述之生物結合物中使用肝素之各種分子量，諸如約650-700Da之單一雙醣單元至約50kDa聚醣。在一些實施例中，肝素為約10kDa至約20kDa。在一些實施例中，肝素為高達約15kDa，或約16kDa，或約17kDa，或約18kDa，或約19kDa，或約20kDa。
在一個實施例中，生物結合物包含具有結合於I型、II型、III型、IV型、V型、VI型、VII型、VIII型、IX型、X型、XI型、XII 型、XIII型或XIV型膠原蛋白中之一或多者之膠原蛋白結合單元的肽。在一個實施例中，膠原蛋白結合單元在與膠原蛋白結合之後，促進或抑制原纖維形成。在一個實施例中，膠原蛋白結合單元在與膠原蛋白結合之後，不會促進或抑制原纖維形成。在一些實施例中，肽結合於I型膠原蛋白。在其他實施例中，肽結合於IV型膠原蛋白。在某些實施例中，可在本文所描述之生物結合物中使用一或多個對膠原蛋白具有指定結合親和力之肽。舉例而言，合成生物結合物可包含至少一個對I型膠原蛋白具有結合親和力之肽及至少一個對IV型膠原蛋白具有結合親和力之肽。在另一實施例中，肽對I型膠原蛋白具有結合親和力。在另一實施例中，肽對IV型膠原蛋白具有結合親和力。在某些實施例中，肽對II型膠原蛋白具有結合親和力。在某些實施例中，肽對III型膠原蛋白具有結合親和力。在某些實施例中，肽結合於一種以上類型之膠原蛋白，其中對各膠原蛋白類型之相對親和力可不同。在一個實施例中，膠原蛋白結合單元以小於約1mM，或小於約900μM，或小於約800μM，或小於約700μM，或小於約600μM，或小於約500μM，或小於約400μM，或小於約300μM，或小於約200μM，或小於約100μM之解離常數(K d )結合於膠原蛋白。
此外，本文所描述之生物結合物可包含具有一個以上結合單元之肽，其中結合單元可相同或不同。舉例而言，在某些實施例中，肽包含兩個或兩個以上膠原蛋白結合單元，其中膠原蛋白結合單元相同。在另一實施例中，肽包含兩個或兩個以上膠原蛋白結合單元，其中膠原蛋白結合單元不同。
在某些實施例中，生物結合物包含一或多個包含式(I)或(II)之胺基酸序列的肽：(X)n-YKS-(X)m (I)
(X)n-YKC-(X)m (II)
其中n為0至50；m為0至50；且各X獨立地選自天然或非天然胺基酸。在某些實施例中，各X獨立地選自由以下組成之群：丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸及纈胺酸。
在某些實施例中，生物結合物包含一或多個包含選自由以下組成之群的胺基酸序列之肽：YKSILY(SEQ ID NO：179)、LYKSILY(SEQ ID NO：180)、ELYKSILY(SEQ ID NO：181)、GELYKSILY(SEQ ID NO：2)、AGELYKSILY(SEQ ID NO：182)、KAGELYKSILY(SEQ ID NO：183)、LKAGELYKSILY(SEQ ID NO：184)、ALKAGELYKSILY(SEQ ID NO：185)、AALKAGELYKSILY(SEQ ID NO：186)、NAALKAGELYKSILY(SEQ ID NO：187)、ANAALKAGELYKSILY(SEQ ID NO：188)、RANAALKAGELYKSILY(SEQ ID NO：189)、RRANAALKAGELYKSILY(SEQ ID NO：1)、QLYKSILY(SEQ ID NO：190)、GQLYKSILY(SEQ ID NO：16)、AGQLYKSILY(SEQ ID NO：191)、KAGQLYKSILY(SEQ ID NO：192)、LKAGQLYKSILY(SEQ ID NO：193)、ALKAGQLYKSILY(SEQ ID NO：194)、AALKAGQLYKSILY(SEQ ID NO：195)、NAALKAGQLYKSILY(SEQ ID NO：196)、ANAALKAGQLYKSILY(SEQ ID NO：197)、RANAALKAGQLYKSILY(SEQ ID NO：198)及RRANAALKAGQLYKSILY(SEQ ID NO：17)；或與其具有至少約80%序列一致性，或至少約83%序列一致性，或至少約85%序列一致性，或至少約90%序列一致性，或至少約95%序列一致性，或至少約98% 序列一致性之序列，其限制條件為該序列包含至少一個YKS序列。
在某些實施例中，生物結合物包含一或多個包含選自由以下組成之群的胺基酸序列之肽：YKCILY(SEQ ID NO：199)、LYKCILY(SEQ ID NO：200)、ELYKCILY(SEQ ID NO：201)、GELYKCILY(SEQ ID NO：4)、AGELYKCILY(SEQ ID NO：202)、KAGELYKCILY(SEQ ID NO：203)、LKAGELYKCILY(SEQ ID NO：204)、ALKAGELYKCILY(SEQ ID NO：205)、AALKAGELYKCILY(SEQ ID NO：206)、NAALKAGELYKCILY(SEQ ID NO：207)、ANAALKAGELYKCILY(SEQ ID NO：208)、RANAALKAGELYKCILY(SEQ ID NO：209)、RRANAALKAGELYKCILY(SEQ ID NO：3)、QLYKCILY(SEQ ID NO：210)、GQLYKCILY(SEQ ID NO：211)、AGQLYKCILY(SEQ ID NO：212)、KAGQLYKCILY(SEQ ID NO：213)、LKAGQLYKCILY(SEQ ID NO：214)、ALKAGQLYKCILY(SEQ ID NO：215)、AALKAGQLYKCILY(SEQ ID NO：216)、NAALKAGQLYKCILY(SEQ ID NO：217)、ANAALKAGQLYKCILY(SEQ ID NO：218)、RANAALKAGQLYKCILY(SEQ ID NO：219)及RRANAALKAGQLYKCILY(SEQ ID NO：220)；或與其具有至少約80%序列一致性，或至少約83%序列一致性，或至少約85%序列一致性，或至少約90%序列一致性，或至少約95%序列一致性，或至少約98%序列一致性之序列，其限制條件為該序列包含至少一個YKC序列。
在某些實施例中，生物結合物包含一或多個包含選自由以下組成之群的胺基酸序列之肽：LYKS(SEQ ID NO：221)、ELYKS(SEQ ID NO：222)、GELYKS(SEQ ID NO：223)、AGELYKS(SEQ ID NO：224)、KAGELYKS(SEQ ID NO：225)、LKAGELYKS(SEQ ID NO：226)、ALKAGELYKS(SEQ ID NO：227)、AALKAGELYKS(SEQ ID NO：228)、NAALKAGELYKS(SEQ ID NO：229)、ANAALKAGELYKS(SEQ ID NO：230)、RANAALKAGELYKS(SEQ ID NO：231)及RRANAALKAGELYKS(SEQ ID NO：232)；或與其具有至少約80%序列一致性，或至少約83%序列一致性，或至少約85%序列一致性，或至少約90%序列一致性，或至少約95%序列一致性，或至少約98%序列一致性之序列，其限制條件為該序列包含至少一個YKS序列。
在某些實施例中，生物結合物包含一或多個包含選自由以下組成之群的胺基酸序列之肽：LYKC(SEQ ID NO：233)、ELYKC(SEQ ID NO：234)、GELYKC(SEQ ID NO：235)、AGELYKC(SEQ ID NO：236)、KAGELYKC(SEQ ID NO：237)、LKAGELYKC(SEQ ID NO：238)、ALKAGELYKC(SEQ ID NO：239)、AALKAGELYKC(SEQ ID NO：240)、NAALKAGELYKC(SEQ ID NO：241)、ANAALKAGELYKC(SEQ ID NO：242)、RANAALKAGELYKC(SEQ ID NO：243)及RRANAALKAGELYKC(SEQ ID NO：244)；或與其具有至少約80%序列一致性，或至少約83%序列一致性，或至少約85%序列一致性，或至少約90%序列一致性，或至少約95%序列一致性，或至少約98%序列一致性之序列，其限制條件為該序列包含至少一個YKC序列。
在某些實施例中，生物結合物包含一或多個包含選自由以下組成之群的胺基酸序列之肽：AYKS(SEQ ID NO：245)、RAYKS(SEQ ID NO：246)、LRAYKS(SEQ ID NO：247)、NLRAYKS(SEQ ID NO：248)、LNLRAYKS(SEQ ID NO：249)、RLNLRAYKS(SEQ ID NO：250)、ARLNLRAYKS(SEQ ID NO：251)、LARLNLRAYKS(SEQ ID NO：252)、ILARLNLRAYKS(SEQ ID NO：253)、AILARLNLRAYKS(SEQ ID NO：254)、EAILARLNLRAYKS(SEQ ID NO：255)、AEAILARLNLRAYKS(SEQ ID NO：256)、KAEAILARLNLRAYKS (SEQ ID NO：257)、GKAEAILARLNLRAYKS(SEQ ID NO：258)及YGKAEAILARLNLRAYKS(SEQ ID NO：259)；或與其具有至少約80%序列一致性，或至少約83%序列一致性，或至少約85%序列一致性，或至少約90%序列一致性，或至少約95%序列一致性，或至少約98%序列一致性之序列，其限制條件為該序列包含至少一個YKS序列。
在某些實施例中，生物結合物包含一或多個包含選自由以下組成之群的胺基酸序列之肽：AYKC(SEQ ID NO：260)、RAYKC(SEQ ID NO：261)、LRAYKC(SEQ ID NO：262)、NLRAYKC(SEQ ID NO：263)、LNLRAYKC(SEQ ID NO：264)、RLNLRAYKC(SEQ ID NO：265)、ARLNLRAYKC(SEQ ID NO：266)、LARLNLRAYKC(SEQ ID NO：267)、ILARLNLRAYKC(SEQ ID NO：268)、AILARLNLRAYKC(SEQ ID NO：269)、EAILARLNLRAYKC(SEQ ID NO：270)、AEAILARLNLRAYKC(SEQ ID NO：271)、KAEAILARLNLRAYKC(SEQ ID NO：272)、GKAEAILARLNLRAYKC(SEQ ID NO：273)及YGKAEAILARLNLRAYKC(SEQ ID NO：274)；或與其具有至少約80%序列一致性，或至少約83%序列一致性，或至少約85%序列一致性，或至少約90%序列一致性，或至少約95%序列一致性，或至少約98%序列一致性之序列，其限制條件為該序列包含至少一個YKC序列。
在某些實施例中，生物結合物包含一或多個包含以下胺基酸序列之肽：GAHWQFNALTVR(SEQ ID NO：58)；或與其具有至少約80%序列一致性，或至少約83%序列一致性，或至少約85%序列一致性，或至少約90%序列一致性，或至少約95%序列一致性，或至少約98%序列一致性之序列，其限制條件為該序列以小於約1mM之解離常數(K d )結合於玻尿酸。
在某些實施例中，生物結合物包含一或多個包含以下胺基酸序列之肽：STMMSRSHKTRSHHV(SEQ ID NO：59)；或與其具有至少約80%序列一致性，或至少約83%序列一致性，或至少約85%序列一致性，或至少約90%序列一致性，或至少約95%序列一致性，或至少約98%序列一致性之序列，其限制條件為該序列以小於約1mM之解離常數(K d )結合於玻尿酸。
因此，在一些實施例中，生物結合物包含一或多個包含式(IA)或(IIA)之胺基酸序列的肽：(X)n-YKS-(X)m-GSG (IA)
(X)n-YKC-(X)m-GSG (IIA)
其中n為0至50；m為0至50；且各X獨立地選自天然或非天然胺基酸。在一些實施例中，各X獨立地選自由以下組成之群：丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸及纈胺酸。在一些實施例中，各X獨立地選自由以下組成之群：丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺、麩胺酸、甘胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸及酪胺酸。
在一些實施例中，在式I、II、IA及IIA任一者中n為0至約50，或0至約40，或0至約30，或0至約20，或0至約15，或0至約10，或0至約5。在一些實施例中，n為1至約40，或1至約30，或1至約20，或1至約15，或1至約10，或1至約5。在一些實施例中，n為0至約50，或0至約40，或0至約30，或0至約20，0至約15，或0至約10，或0至約5。在一些實施例中，n為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19或20。
在一些實施例中，在式I、II、IA及IIA任一者中m為0至約50，或0至約40，或0至約30，或0至約20，或0至約15，或0至約10，或0至約5。在一些實施例中，m為1至約50，或1至約40，或1至約30，或1至約20，或1至約15，或1至約10，或1至約5。在一些實施例中，m為0至約50，或0至約40，或0至約30，或0至約20，0至約15，或0至約10，或0至約5。在一些實施例中，m為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。
在一個實施例中，生物結合物包含一或多個包含至多約40個胺基酸之肽。因此，在某些實施例中，在式I、II、IA及IIA任一者中n與m之總和為約120，或約110，或約100，或約90，或約80，或約70，或約60，或約50，或約40，或約30，或約25，或約20，或約15，或約10，或約5，或約3，或約2。
在某些實施例中，生物結合物包含一或多個包含選自由以下組成之群的胺基酸序列之肽：YKSILYGSG(SEQ ID NO：275)、LYKSILYGSG(SEQ ID NO：276)、ELYKSILYGSG(SEQ ID NO：277)、GELYKSILYGSG(SEQ ID NO：278)、AGELYKSILYGSG(SEQ ID NO：279)、KAGELYKSILYGSG(SEQ ID NO：280)、LKAGELYKSILYGSG(SEQ ID NO：281)、ALKAGELYKSILYGSG(SEQ ID NO：282)、AALKAGELYKSILYGSG(SEQ ID NO：283)、NAALKAGELYKSILYGSG(SEQ ID NO：284)、ANAALKAGELYKSILYGSG(SEQ ID NO：285)、RANAALKAGELYKSILYGSG(SEQ ID NO：286)及RRANAALKAGELYKSILYGSG(SEQ ID NO：287)；或與其具有至少約80%序列一致性，或至少約83%序列一致性，或至少約85%序列一致性，或至少約90%序列一致性，或至少約95%序列一致性，或至少 約98%序列一致性之序列，其限制條件為該序列包含至少一個YKS序列。
在某些實施例中，生物結合物包含一或多個包含選自由以下組成之群的胺基酸序列之肽：YKCILYGSG(SEQ ID NO：288)、LYKCILYGSG(SEQ ID NO：289)、ELYKCILYGSG(SEQ ID NO：290)、GELYKCILYGSG(SEQ ID NO：291)、AGELYKCILYGSG(SEQ ID NO：292)、KAGELYKCILYGSG(SEQ ID NO：293)、LKAGELYKCILYGSG(SEQ ID NO：294)、ALKAGELYKCILYGSG(SEQ ID NO：295)、AALKAGELYKCILYGSG(SEQ ID NO：296)、NAALKAGELYKCILYGSG(SEQ ID NO：297)、ANAALKAGELYKCILYGSG(SEQ ID NO：298)、RANAALKAGELYKCILYGSG(SEQ ID NO：299)及RRANAALKAGELYKCILYGSG(SEQ ID NO：300)；或與其具有至少約80%序列一致性，或至少約83%序列一致性，或至少約85%序列一致性，或至少約90%序列一致性，或至少約95%序列一致性，或至少約98%序列一致性之序列，其限制條件為該序列包含至少一個YKC序列。
在某些實施例中，生物結合物包含一或多個包含選自由以下組成之群的胺基酸序列之肽：YKSGSG(SEQ ID NO：301)、LYKSGSG(SEQ ID NO：302)、ELYKSGSG(SEQ ID NO：303)、GELYKSGSG(SEQ ID NO：304)、AGELYKSGSG(SEQ ID NO：305)、KAGELYKSGSG(SEQ ID NO：306)、LKAGELYKSGSG(SEQ ID NO：307)、ALKAGELYKSGSG(SEQ ID NO：308)、AALKAGELYKSGSG(SEQ ID NO：309)、NAALKAGELYKSGSG(SEQ ID NO：310)、ANAALKAGELYKSGSG(SEQ ID NO：311)、RANAALKAGELYKSGSG(SEQ ID NO：312)及 RRANAALKAGELYKSGSG(SEQ ID NO：313)；或與其具有至少約80%序列一致性，或至少約83%序列一致性，或至少約85%序列一致性，或至少約90%序列一致性，或至少約95%序列一致性，或至少約98%序列一致性之序列，其限制條件為該序列包含至少一個YKS序列。
在某些實施例中，生物結合物包含一或多個包含選自由以下組成之群的胺基酸序列之肽：YKCGSG(SEQ ID NO：314)、LYKCGSG(SEQ ID NO：315)、ELYKCGSG(SEQ ID NO：316)、GELYKCGSG(SEQ ID NO：317)、AGELYKCGSG(SEQ ID NO：318)、KAGELYKCGSG(SEQ ID NO：319)、LKAGELYKCGSG(SEQ ID NO：320)、ALKAGELYKCGSG(SEQ ID NO：321)、AALKAGELYKCGSG(SEQ ID NO：322)、NAALKAGELYKCGSG(SEQ ID NO：323)、ANAALKAGELYKCGSG(SEQ ID NO：324)、RANAALKAGELYKCGSG(SEQ ID NO：325)及RRANAALKAGELYKCGSG(SEQ ID NO：326)；或與其具有至少約80%序列一致性，或至少約83%序列一致性，或至少約85%序列一致性，或至少約90%序列一致性，或至少約95%序列一致性，或至少約98%序列一致性之序列，其限制條件為該序列包含至少一個YKC序列。
在某些實施例中，生物結合物包含一或多個包含選自由以下組成之群的胺基酸序列之肽：AYKSGSG(SEQ ID NO：327)、RAYKSGSG(SEQ ID NO：328)、LRAYKSGSG(SEQ ID NO：329)、NLRAYKSGSG(SEQ ID NO：330)、LNLRAYKSGSG(SEQ ID NO：331)、RLNLRAYKSGSG(SEQ ID NO：332)、ARLNLRAYKSGSG(SEQ ID NO：333)、LARLNLRAYKSGSG(SEQ ID NO：334)、ILARLNLRAYKSGSG(SEQ ID NO：335)、AILARLNLRAYKSGSG (SEQ ID NO：336)、EAILARLNLRAYKSGSG(SEQ ID NO：337)、AEAILARLNLRAYKSGSG(SEQ ID NO：338)、KAEAILARLNLRAYKSGSG(SEQ ID NO：339)、GKAEAILARLNLRAYKSGSG(SEQ ID NO：340)及YGKAEAILARLNLRAYKSGSG(SEQ ID NO：341)；或與其具有至少約80%序列一致性，或至少約83%序列一致性，或至少約85%序列一致性，或至少約90%序列一致性，或至少約95%序列一致性，或至少約98%序列一致性之序列，其限制條件為該序列包含至少一個YKS序列。
在某些實施例中，生物結合物包含一或多個包含選自由以下組成之群的胺基酸序列之肽：AYKCGSG(SEQ ID NO：342)、RAYKCGSG(SEQ ID NO：343)、LRAYKCGSG(SEQ ID NO：344)、NLRAYKCGSG(SEQ ID NO：345)、LNLRAYKCGSG(SEQ ID NO：346)、RLNLRAYKCGSG(SEQ ID NO：347)、ARLNLRAYKCGSG(SEQ ID NO：348)、LARLNLRAYKCGSG(SEQ ID NO：349)、ILARLNLRAYKCGSG(SEQ ID NO：350)、AILARLNLRAYKCGSG(SEQ ID NO：351)、EAILARLNLRAYKCGSG(SEQ ID NO：352)、AEAILARLNLRAYKCGSG(SEQ ID NO：353)、KAEAILARLNLRAYKCGSG(SEQ ID NO：354)、GKAEAILARLNLRAYKCGSG(SEQ ID NO：355)及YGKAEAILARLNLRAYKCGSG(SEQ ID NO：356)；或與其具有至少約80%序列一致性，或至少約83%序列一致性，或至少約85%序列一致性，或至少約90%序列一致性，或至少約95%序列一致性，或至少約98%序列一致性之序列，其限制條件為該序列包含至少一個YKC序列。
在某些實施例中，生物結合物包含一或多個包含以下胺基酸序 列之肽：GAHWQFNALTVRGSG(SEQ ID NO：357)；或與其具有至少約80%序列一致性，或至少約83%序列一致性，或至少約85%序列一致性，或至少約90%序列一致性，或至少約95%序列一致性，或至少約98%序列一致性之序列，其限制條件為該序列以小於約1mM之解離常數(K d )結合於玻尿酸。
在某些實施例中，生物結合物包含一或多個包含以下胺基酸序列之肽：STMMSRSHKTRSHHVGSG(SEQ ID NO：358)；或與其具有至少約80%序列一致性，或至少約83%序列一致性，或至少約85%序列一致性，或至少約90%序列一致性，或至少約95%序列一致性，或至少約98%序列一致性之序列，其限制條件為該序列以小於約1mM之解離常數(K d )結合於玻尿酸。
在某些實施例中，可在本文所描述之生物結合物中使用一或多個對玻尿酸具有指定結合親和力之肽。此外，如本文所用之肽可包含一個以上玻尿酸結合單元，其中結合單元可相同或不同。
另外，在某些實施例中，生物結合物包含一或多個包含至少一個玻尿酸結合單元及至少一個膠原蛋白結合單元之肽。在一個實施例中，生物結合物包含一或多個包含至少一個玻尿酸結合單元及至少一個膠原蛋白結合單元之肽，其中膠原蛋白結合單元結合於I型、II型、III型、IV型、V型、VI型、VII型、VIII型、IX型、X型、XI型、XII型、XIII型或XIV型膠原蛋白中之一或多者。
本發明亦關於包含1至約50個肽之生物結合物，肽包含選擇素、ICAM及/或VCAM結合單元。肽經由醯肼-羰基鍵結合於聚醣(例如，葡萄糖胺聚醣或GAG)，諸如硫酸皮膚素，且生物結合物亦可包括一至約三個疏水尾(例如，烷基尾)。
此類生物結合物可保護血管之內皮細胞內層免於損傷、尿毒症、氧化壓力及炎症。生物結合物可形成S/E選擇素結合及ICAM結合 抗中性白血球/單核細胞管腔內層(亦即，EC-SEAL)，該等尤其適用於保護以手術方式受影響之血管以及插管血管之內皮細胞內層。
本文所描述之生物結合物可包含一或多種類型之肽，以使得生物結合物能夠與選擇素、ICAM及/或VCAM結合。舉例而言，本文包括包含選擇素結合肽及ICAM結合肽之生物結合物。亦包括包含選擇素結合肽及VCAM結合肽之生物結合物，或包含ICAM結合肽及VCAM結合肽之生物結合物。另外，肽可在單一肽內包含一或多個選擇素、ICAM及/或VCAM結合單元(或序列)。因此，在一個實施例中，本文揭示一種包含具有選擇素結合單元及ICAM結合單元之肽的生物結合物。亦包括包含具有選擇素結合單元及VCAM結合單元之肽的生物結合物。亦包括為包含ICAM結合單元及VCAM結合單元之結合物的生物結合物。
在某些實施例中，生物結合物包含一或多個肽或選自由以下組成之群的結合單元：IELLQAR(SEQ ID NO：117)、IELLQARGSC(SEQ ID NO：118)、IDLMQAR(SEQ ID NO：119)、IDLMQARGSC(SEQ ID NO：120)、QITWAQLWNMMK(SEQ ID NO：121)及QITWAQLWNMMKGSC(SEQ ID NO：122)或其組合。
在其他實施例中，生物結合物包含一或多個包含選擇素結合單元之肽，選擇素結合單元諸如選自由以下組成之群的一或多者：LRRASLGDGDITWDQLWDLMK(SEQ ID NO：123)、HITWDQLWNVMN(SEQ ID NO：124)、QITWAQLWNMMK(SEQ ID NO：121)、YGNSNITWDQLWSIMNRQTT(SEQ ID NO：125)、WTDTHITWDQLWHFMNMGEQ(SEQ ID NO：126)、EPWDQITWDQLWIIMNNGDG(SEQ ID NO：127)、HITWDQLWLMMS(SEQ ID NO：128)、DLTWEGLWILMT(SEQ ID NO：129)、RGVWGGLWSMTW(SEQ ID NO：130)、 DYSWHDLWFMMS(SEQ ID NO：131)、KKEDWLALWRIMSVPDEN(SEQ ID NO：132)、RNMSWLELWEHMK(SEQ ID NO：133)、KEQQWRNLWKMMS(SEQ ID NO：134)、SQVTWNDLWSVMNPEVVN(SEQ ID NO：135)、RSLSWLQLWDWMK(SEQ ID NO：136)、DITWDQLWDLMK(SEQ ID NO：137)、DITWDELWKIMN(SEQ ID NO：138)、DYTWFELWDMMQ(SEQ ID NO：139)、DMTHDLWLTLMS(SEQ ID NO：140)、EITWDQLWEVMN(SEQ ID NO：141)、HVSWEQLWDIMN(SEQ ID NO：142)、HITWDQLWRIMT(SEQ ID NO：143)、DISWDDLWIMMN(SEQ ID NO：144)、QITWDQLWDLMY(SEQ ID NO：145)、RNMSWLELWEHMK(SEQ ID NO：133)、AEWTWDQLWHVMNPAESQ(SEQ ID NO：146)、HRAEWLALWEQMSP(SEQ ID NO：147)、KKEDWLALWRIMSV(SEQ ID NO：148)、KRKQWIELWNIMS(SEQ ID NO：149)、WKLDTLDMIWQD(SEQ ID NO：150)及HITWDQLWNVMLRRAASLG(SEQ ID NO：151)或其組合。
在其他實施例中，生物結合物包含一或多個包含ICAM結合單元之肽。因此，在某些實施例中，生物結合物包含一或多個選自由以下組成之群的ICAM結合單元：NAFKILVVITFGEK(SEQ ID NO：152)、NAFKILVVITFGEKGSC(SEQ ID NO：153)、ITDGEA(SEQ ID NO：154)、ITDGEAGSC(SEQ ID NO：155)、DGEATD(SEQ ID NO：156)及DGEATDGSC(SEQ ID NO：157)或其組合。可在本文所揭示之生物結合物及方法中使用之展示具有ICAM結合親和力(或ICAM結合單元)之其他肽序列包括(但不限於)EWCEYLGGYLRYCA(SEQ ID NO：158)、FEGFSFLAFEDFVSSI(SEQ ID NO：159)、NNQKIVNLKEKVAQLEA(SEQ ID NO：160)、 NNQKIVNIKEKVAQIEA(SEQ ID NO：161)、NNQKLVNIKEKVAQIEA(SEQ ID NO：162)、YPASYQR(SEQ ID NO：163)、YQATPLP(SEQ ID NO：164)、GSLLSAA(SEQ ID NO：165)、FSPHSRT(SEQ ID NO：166)、YPFLPTA(SEQ ID NO：167)、GCKLCAQ(SEQ ID NO：168)、GGTCGGGGTGAGTTTCGTGGTAGGGATAATTCTGTTTGGGTGGTT(SEQ ID NO：169)、EWCEYLGGYLRCYA(SEQ ID NO：170)、GRGEFRGRDNSVSVV(SEQ ID NO：171)、QTSVSPSKVI(SEQ ID NO：172)、PSKVILPRGG(SEQ ID NO：173)、LPRGGSVLVTG(SEQ ID NO：174)及QTSVSPSKVILPRGGSVLVTG(SEQ ID NO：175)或其組合。
在其他實施例中，生物結合物包含一或多個包含VCAM結合單元之肽。在某些實施例中，VCAM結合單元選自由以下組成之群：YRLAIRLNER(SEQ ID NO：176)、YRLAIRLNERRENLRIALRY(SEQ ID NO：177)及RENLRIALRY(SEQ ID NO：178)或其組合。
在一個實施例中，生物結合物包含一或多個VCAM結合肽、ICAM結合肽及/或選擇素結合肽。在某些實施例中，生物結合物包含一或多個ICAM結合肽及一或多個選擇素結合肽。在一個實施例中，生物結合物包含有包含一或多個VCAM結合單元、ICAM結合單元及/或選擇素結合單元之肽。在某些實施例中，生物結合物包含有包含一或多個ICAM結合單元及一或多個選擇素結合單元之肽。
視所需之生物結合物特性而定，鍵結至聚醣之肽的總數可變化。在某些實施例中，存在於生物結合物中的肽之總數為約1至約50，或約1至約40，或約1至約30，或約1至約25，或約2至約30，或約2至約25，或約3至約25，或約4至約25，或約5至約25，或約5至約30，或約1至約25，或約2至約25，或約11至約14，或約1至約8，或約1至約5，或約1，或約2，或約3，或約4，或約5，或約6，或約7，或 約8個肽。在一些實施例中，生物結合物包含約10至約40個肽。在其他實施例中，生物結合物包含約5至約30個肽。在某些實施例中，生物結合物包含小於約20個肽。在某些實施例中，生物結合物包含小於約18個肽。在各種實施例中，生物結合物包含約4至約18個肽。在某些實施例中，生物結合物包含小於約15個肽。在某些實施例中，生物結合物包含小於約10個肽。在某些實施例中，生物結合物包含小於約30個肽。在某些實施例中，生物結合物包含約25個肽。在某些實施例中，生物結合物包含約5至約40，或約10至約40，或約5至約20，或約4至約18，或約10，或約11，或約18，或約20個肽，或約25個肽，或約30個肽，或約40個肽，或約50個肽。
如本文所描述之肽進一步包含用於結合於肽之醯肼部分。醯肼基可在任何適合之連接點(諸如C端、N端)或經由胺基酸上之側鏈結合於肽。舉例而言，當肽經由肽之胺基酸之側鏈結合於聚醣時，該側鏈為麩胺酸或天冬胺酸。可在與存在於肽序列中的胺基酸上之羰基(例如，C端羰基)結合之肼(-NHNH2)之間形成醯肼。
在某些實施例中，醯肼基經由間隔基鍵結至肽。間隔基可為任何適當官能化之直鏈或分支鏈部分，且通常具有約4至約100個原子。在一個實施例中，間隔基包含一或多個，或1至10，或1至5，或1至3個胺基酸。胺基酸可為任何胺基酸，且在一些情況下為非極性胺基酸，諸如丙胺酸、半胱胺酸、甘胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、色胺酸、酪胺酸及纈胺酸。在某些實施例中，胺基酸選自由以下組成之群：甘胺酸、丙胺酸、精胺酸及絲胺酸。在一個實施例中，間隔基選自由以下組成之群：甘胺酸、甘胺酸-甘胺酸、甘胺酸-絲胺酸-甘胺酸、精胺酸-精胺酸、精胺酸-甘胺酸-絲胺酸-甘胺酸及離胺酸-甘胺酸-絲胺酸-甘胺酸。間隔基亦可包含非胺基酸部分，諸如聚乙二醇(PEG)、6-胺基己酸、丁二酸或其組合， 具有或不具有額外胺基酸間隔基。在某些實施例中，本文所描述之肽序列進一步包含GSG-NHNH2部分。通常，GSG-NHNH2部分與C端或N端結合。
在某些實施例中，間隔基包含一個以上結合位點(可為直鏈或分支鏈的)，使得一個以上肽序列可與其結合，因此產生分支鏈構築體。另外，由於肽可經由末端或非末端胺基酸部分結合於聚醣，肽在經由非末端胺基酸部分結合於聚醣時為分支鏈的。間隔基上之結合位點可相同或不同，且可為任何適合之結合位點，諸如胺或羧酸部分，使得所需肽序列可與其結合(例如，經由醯胺鍵)。因此，在某些實施例中，間隔基含有一或多個離胺酸、麩胺酸或天冬胺酸殘基。此類構築體可提供具有一個以上式PnL之膠原蛋白及/或玻尿酸結合單元的肽，其中P為膠原蛋白及/或玻尿酸結合單元，L為間隔基，且n為2至約10，或2至8，或2至6，或2至5，或2至4，或2，或3，或4，或5，或6，或7，或8，或9，或10之整數。舉例而言，間隔基L可為諸如KGSG(SEQ ID NO：359)、KKGSG(SEQ ID NO：360)或KKKGSG(SEQ ID NO：361)等之胺基酸序列，分別提供2、3或4個結合位點。
在某些實施例中，間隔基或其組合可用於產生進一步分支。舉例而言，間隔基可包含含有能夠連接額外肽或膠原蛋白結合單元之側鏈的一或多個胺基酸。包括在此類間隔基中之例示性胺基酸包括(但不限於)離胺酸、麩胺酸、天冬胺酸等。在某些實施例中，間隔基包含2至6個胺基酸，或3或4個胺基酸。在某些實施例中，間隔基包含一或多個式KXX之胺基酸序列，其中各X獨立地為天然或非天然胺基酸。可單獨或以組合形式用於製造分支鏈構築體之間隔基之特定實例包括(但不限於)KRR、KKK、(K)nGSG及(KRR)n-KGSG，其中n為0至5，或1、2、3、4或5。在一個實施例中間隔基為GSGKRRGSG(SEQ ID NO：362)。
此等結合於肽之間隔基之示意圖展示於下表中。
例示性膠原蛋白結合構築體包括(但不限於)(GELYKSILYGSG)2K(SEQ ID NO：363)、(GELYKSILYGSG)2KGSG(SEQ ID NO：364)、(GELYKSILYGSG)3KK(SEQ ID NO：365)、 (GELYKSILYGSG)3KKGSG(SEQ ID NO：366)、(GELYKSILYGSG)4KKK(SEQ ID NO：367)、(GELYKSILYGSG)4KKKGSG(SEQ ID NO：368)、(GQLYKSILYGSG)2K(SEQ ID NO：369)、(GQLYKSILYGSG)2KGSG(SEQ ID NO：370)、(GQLYKSILYGSG)3KK(SEQ ID NO：371)、(GQLYKSILYGSG)3KKGSG(SEQ ID NO：372)、(GQLYKSILYGSG)4K2K(SEQ ID NO：373)、(GQLYKSILYGSG)4K2KGSG(SEQ ID NO：374)、(GQLYKSILYGSG)4KKK(SEQ ID NO：375)、(GQLYKSILYGSG)4KKKGSG(SEQ ID NO：376)、(GQLYKSILYGSG)4-(KRR)2-K(SEQ ID NO：377)、(GQLYKSILYGSG)4-(KRR)2-KGSG(SEQ ID NO：378)、TLTYTWSGSG)2-KGSG(SEQ ID NO：379)、(TLTYTWSGSG)4K2K(SEQ ID NO：380)、(TLTYTWSGSG)4KKKGSG(SEQ ID NO：381)、(TLTYTWSGSG)2-KRRGSG(SEQ ID NO：382)及(TLTYTWSGSG)4-(KRR)2-KGSG(SEQ ID NO：383)。
在某些實施例中，醯肼基鍵結至肽N端。在某些實施例中，醯肼基鍵結至肽C端。在某些實施例中，醯肼基鍵結至肽中胺基酸(諸如麩胺酸及/或天冬胺酸)之側鏈。在某些實施例中，醯肼基經由間隔基鍵結至肽C端。間隔基可經由任何適合鍵與肽結合。在一些實施例中，間隔基經由醯胺鍵與肽結合。
在一個實施例中，醯肼基經由包含選自由甘胺酸、丙胺酸、精胺酸及絲胺酸組成之群的一或多個胺基酸之間隔基鍵結至C端。在一個實施例中，間隔基選自由以下組成之群：甘胺酸、甘胺酸-甘胺酸及甘胺酸-絲胺酸-甘胺酸。在各種實施例中，肽包含胺基酸間隔基，諸如甘胺酸-絲胺酸-甘胺酸(GSG)、KRRGSG(SEQ ID NO：384)或GSGKRRGSG(SEQ ID NO：362)。包含此類間隔基之例示性序列包括 TLTYTWSGSG(SEQ ID NO：385)及TLTYTWSGSGKRRGSG(SEQ ID NO：386)。
在本文所描述之任一實施例中，每聚醣之肽數量為平均值，其中組合物中之某些生物結合物可具有每聚醣更多肽且某些生物結合物具有每聚醣更少肽。因此，在某些實施例中，如本文所描述之肽的數量為在生物結合物之組合物中的平均值。舉例而言，在某些實施例中，生物結合物為每聚醣之肽平均數量為約5之組合物。在其他實施例中，每聚醣之肽平均數量為約6，或約7，或約8，或約9，或約10，或約11，或約12，或約13，或約14，或約15，或約16，或約17，或約18，或約19，或約20，或約25，或約30。
在某些實施例中，每聚醣之肽數量可描述為以聚醣主鏈上經肽官能化之雙醣單元的百分比計之「官能化百分比(%)」。舉例而言，存在於聚醣上的可用雙醣單元之總數可藉由單一雙醣單元之分子量(或平均分子量)(例如，約550-800Da，或約650-750Da)除以聚醣之分子量(例如，約25kDa至約70kDa，或甚至約100kDa)來計算。在聚醣不含習知「雙醣單元」(例如，褐藻酸)之實施例中，在本文所提出的計算中使用之存在於聚醣上的可用雙醣單元之總數可藉由單一醣單元之分子量(或平均分子量)除以聚醣之分子量且乘以2來計算。
在一些實施例中，存在於聚醣上的可用雙醣單元之數量為約10至約80，或約10至約70，或約15至約70，或約20至約70，或約30至約70，或約35至約70，或約40至約70，或約10至約75，或約15至約75，或約20至約75，或約30至約75，或約35至約75，或約40至約75，或約10至約50，或約20至約50，或約25至約50，或約10至約35，或約15至約35，或約20至約35，或約10至約30，或約15至約30，或約20至約30，或約15，或約20，或約25，或約30，或約35，或約40，或約45，或約50，或約55，或約60，或約65，或約70。
因此，在某些實施例中，聚醣包含約1至約50，或約5至約30%官能化，或約25%官能化，其中官能化百分比(%)係藉由聚醣上經肽官能化之雙醣單元的百分比確定。在一些實施例中，聚醣之官能化百分比(%)為約1%至約50%，或約3%至約40%，或約5%至約30%，或約10%至約20%，或約1%，或約2%，或約5%，或約10%，或約15%，或約20%，或約25%，或約30%，或約35%，或約40%，或約45%，或約50%，或約55%，或約60%，或約65%，或約70%，或約75%，或約80%，或約85%，或約90%，或約95%，或約100%。
在某些實施例中，提供一種包含如本文所描述之生物結合物及肽的組合物，其中肽與生物結合物緊密結合(例如，經由離子鍵結)。在某些實施例中，可由此形成生物結合物聚集體。預期生物結合物聚集體(包含生物結合物及非共價結合肽)可包含1%至200%官能化(藉由聚醣上經肽官能化之雙醣單元的百分比確定)。在一些實施例中，生物結合物之官能化百分比(%)為約1%至約50%，或約3%至約40%，或約5%至約30%，或約10%至約20%，或約1%，或約2%，或約5%，或約10%，或約15%，或約20%，或約25%，或約30%，或約35%，或約40%，或約45%，或約50%，或約55%，或約60%，或約65%，或約70%，或約75%，或約80%，或約85%，或約90%，或約95%，或約100%。
預期可在本文所描述之各種實施例中使用任何聚醣，包括(但不限於)海藻酸鹽、瓊脂糖、葡聚醣、硫酸葡聚醣、軟骨素、硫酸軟骨素(CS)、皮膚素、硫酸皮膚素(DS)、硫酸乙醯肝素、肝素(Hep)、角蛋白、硫酸角質素及玻尿酸(HA)。聚醣可為天然存在或化學衍生的，諸如(但不限於)部分N-脫硫酸化衍生物、部分O-脫硫酸化衍生物及/或部分O-羧甲基化衍生物。
在一些實施例中，聚醣未經修飾。在某些實施例中，聚醣不含 以氧化方式裂解之醣環且因此不含醛官能基。預期由如本文所揭示之生物結合物所展現之有益效果可至少部分地歸因於不含以氧化方式裂解醣環之聚醣。舉例而言，具有玻尿酸結合單元之如本文所揭示之生物結合物與此項技術中已知之玻尿酸結合生物結合物相比展現增加之結合親和力(參見例如，實例5)。
此鍵聯可由使肽上之醯肼基與聚醣上之羰基(例如，羧酸基或其活化衍生物)，或者聚醣上之醯肼基與肽上之羰基(例如，羧酸基或其活化衍生物)偶合而產生。在某些實施例中，醯肼-羰基鍵位於肽上的末端醯肼基與聚醣上的羰基之間。
在一個實施例中，聚醣為肝素，其中肝素可包括肝素衍生物，諸如(但不限於)部分N-及/或部分O-脫硫酸化肝素衍生物、部分O-羧甲基化肝素衍生物或其組合。在某些實施例中，肝素為非氧化肝素(亦即，不含以氧化方式裂解之醣環)且不含醛官能基。肝素衍生物及/或提供肝素衍生物，諸如部分N-脫硫酸化肝素及/或部分O-脫硫酸化肝素(亦即，2-O及/或6-O-脫硫酸化肝素)之方法為此項技術中已知(參見例如，Kariya等人，J.Biol.Chem.,2000,275：25949-5958；Lapierre等人，Glycobiology,1996,6(3)：355-366)。亦預期部分O-羧甲基化肝素(或任何聚醣)衍生物，諸如可根據Prestwich等人(US 2012/0142907；US 2010/0330143)製備之彼等肝素衍生物可用於提供本文所揭示之生物結合物。
在某些實施例中，聚醣之分子量是變化的以調整生物結合物之效果(參見例如，Radek,K.A.等人，Wound Repair Regen.,2009,17：118-126；及Taylor,K.R.等人，J.Biol.Chem.,2005,280：5300-5306)。在另一實施例中，聚醣藉由氧化及鹼性消除來降解(參見例如，Fransson,L.A.等人，Eur.J.Biochem.,1980,106：59-69)，得到具有低分子量(例如，約10kDa至約50kDa)之降解聚醣。
在一個實施例中，聚醣為硫酸皮膚素(DS)。DS之生物功能為廣泛的，且包括使生長因子FGF-2、FGF-7及FGF-10結合及活化，促進內皮細胞及角質細胞增殖及遷移。在一些實施例中，硫酸皮膚素之重量範圍為約10kDa至約70kDa。在一個實施例中，硫酸皮膚素之分子量為約46kDa。在另一實施例中，硫酸皮膚素藉由氧化及鹼性消除來降解(參見例如，Fransson,L.A.等人，Eur.J.Biochem.,1980,106：59-69)，得到具有低分子量(例如，約10kDa)之降解硫酸皮膚素。
在另一實施例中，聚醣為肝素。可在本文所描述之生物結合物中使用肝素之各種分子量，諸如約650-700Da至約50kDa之單一雙醣單元。在一些實施例中，肝素為約10kDa至約20kDa。在一些實施例中，肝素為高達約15kDa，或約16kDa，或約17kDa，或約18kDa，或約19kDa，或約20kDa。在某些實施例中，肝素可在不裂解一或多個醣環之條件下氧化(參見例如，Wang等人，Biomacromolccules 2013,14(7)：2427-2432)。
在一個實施例中，生物結合物包含聚醣及約5至約10或約7個肽，其中肽包含GELYKSILY(SEQ ID NO：2)或GELYKSILYGSG(SEQ ID NO：278)之至少一個序列，且經由醯肼-羰基鍵與聚醣結合。在某些實施例中，醯肼-羰基鍵位於肽上的末端醯肼基與聚醣上的羰基之間。在一個實施例中，聚醣為肝素。在某些實施例中，肝素不含以氧化方式裂解之醣環且因此不含醛官能基。
在一個實施例中，生物結合物包含聚醣及約20個肽，其中肽包含GELYKSILY(SEQ ID NO：2)或GELYKSILYGSG(SEQ ID NO：278)之至少一個序列，且經由醯肼-羰基鍵與聚醣結合。在某些實施例中，醯肼-羰基鍵位於肽上的末端醯肼基與聚醣上的羰基之間。在一個實施例中，聚醣為硫酸皮膚素。在某些實施例中，硫酸皮膚素不含以氧化方式裂解之醣環且因此不含醛官能基。
在一個實施例中，生物結合物包含聚醣及約5至約10或約7個肽，其中肽包含GQLYKSILY(SEQ ID NO：16)或GQLYKSILYGSG(SEQ ID NO：387)之至少一個序列，且經由醯肼-羰基鍵與聚醣結合。在某些實施例中，醯肼-羰基鍵位於肽上的末端醯肼基與聚醣上的羰基之間。在一個實施例中，聚醣為肝素。在某些實施例中，肝素不含以氧化方式裂解之醣環且因此不含醛官能基。
在一個實施例中，生物結合物包含聚醣及約20個肽，其中肽包含GQLYKSILY(SEQ ID NO：16)或GQLYKSILYGSG(SEQ ID NO：387)之至少一個序列，且經由醯肼-羰基鍵與聚醣結合。在某些實施例中，醯肼-羰基鍵位於肽上的末端醯肼基與聚醣上的羰基之間。在一個實施例中，聚醣為硫酸皮膚素。在某些實施例中，硫酸皮膚素不含以氧化方式裂解之醣環且因此不含醛官能基。
在一個實施例中，生物結合物包含聚醣及約5至約10或約7個肽，其中肽包含RRANAALKAGELYKSILY(SEQ ID NO：1)或RRANAALKAGELYKSILYGSG(SEQ ID NO：287)之至少一個序列，且經由醯肼-羰基鍵與聚醣結合。在某些實施例中，醯肼-羰基鍵位於肽上的末端醯肼基與聚醣上的羰基之間。在一個實施例中，聚醣為肝素。在某些實施例中，肝素不含以氧化方式裂解之醣環且因此不含醛官能基。
在一個實施例中，生物結合物包含聚醣及約20個肽，其中肽包含RRANAALKAGELYKSILY(SEQ ID NO：1)或RRANAALKAGELYKSILYGSG(SEQ ID NO：287)之至少一個序列，且經由醯肼-羰基鍵與聚醣結合。在某些實施例中，醯肼-羰基鍵位於肽上的末端醯肼基與聚醣上的羰基之間。在一個實施例中，聚醣為硫酸皮膚素。在某些實施例中，硫酸皮膚素不含以氧化方式裂解之醣環且因此不含醛官能基。
在一個實施例中，生物結合物不為包含硫酸皮膚素及約1至約50個肽之生物結合物，肽包含RRANAALKAGELYKSILY(SEQ ID NO：1)、RRANAALKAGELYKSILYGC(SEQ ID NO：388)或RRANAALKAGELYKSILYGSG(SEQ ID NO：287)之至少一個序列，其中肽經由醯肼-羰基鍵與聚醣結合。
在一個實施例中，生物結合物包含聚醣及約5至約10或約7個肽，其中肽包含RRANAALKAGQLYKSILY(SEQ ID NO：17)或RRANAALKAGQLYKSILYGSG(SEQ ID NO：389)之至少一個序列，且經由醯肼-羰基鍵與聚醣結合。在某些實施例中，醯肼-羰基鍵位於肽上的末端醯肼基與聚醣上的羰基之間。在一個實施例中，聚醣為肝素。在某些實施例中，肝素不含以氧化方式裂解之醣環且因此不含醛官能基。
在一個實施例中，生物結合物包含聚醣及約20個肽，其中肽包含RRANAALKAGQLYKSILY(SEQ ID NO：17)或RRANAALKAGQLYKSILYGSG(SEQ ID NO：389)之至少一個序列，且經由醯肼-羰基鍵與聚醣結合。在某些實施例中，醯肼-羰基鍵位於肽上的末端醯肼基與聚醣上的羰基之間。在一個實施例中，聚醣為硫酸皮膚素。在某些實施例中，硫酸皮膚素不含以氧化方式裂解之醣環且因此不含醛官能基。
在一個實施例中，生物結合物包含聚醣及約1至約5或約1至2個肽，其中肽包含(GQLYKSILY)4-(KRR)2-K(SEQ ID NO：390)、(GQLYKSILYGSG)4-(KRR)2-KGSG(SEQ ID NO：378)或(GQLYKSILY)4-(KRR)2-KGSG(SEQ ID NO：391)，且經由醯肼-羰基鍵與聚醣結合。在某些實施例中，醯肼-羰基鍵位於肽上的末端醯肼基與聚醣上的羰基之間。在一個實施例中，聚醣為肝素。在某些實施例中，肝素不含以氧化方式裂解之醣環且因此不含醛官能基。
在一個實施例中，生物結合物包含聚醣及約5至約10個肽，其中肽包含GAHWQFNALTVR(SEQ ID NO：58)或GAHWQFNALTVRGSG(SEQ ID NO：357)之至少一個序列，且經由醯肼-羰基鍵與聚醣結合。在某些實施例中，醯肼-羰基鍵位於肽上的末端醯肼基與聚醣上的羰基之間。在一個實施例中，聚醣為硫酸軟骨素。在某些實施例中，硫酸軟骨素不含以氧化方式裂解之醣環且因此不含醛官能基。
在一個實施例中，生物結合物包含聚醣及約5至約10個肽，其中肽包含STMMSRSHKTRSHHV(SEQ ID NO：59)或STMMSRSHKTRSHHVGSG(SEQ ID NO：358)之至少一個序列，且經由醯肼-羰基鍵與聚醣結合。在某些實施例中，醯肼-羰基鍵位於肽上的末端醯肼基與聚醣上的羰基之間。在一個實施例中，聚醣為硫酸軟骨素。在某些實施例中，硫酸軟骨素不含以氧化方式裂解之醣環且因此不含醛官能基。
在一個實施例中，生物結合物包含聚醣及約5至約15個肽，其中肽包含IELLQAR(SEQ ID NO：117)或IELLQARGSG(SEQ ID NO：393)之至少一個序列，且經由醯肼-羰基鍵與聚醣結合。在某些實施例中，醯肼-羰基鍵位於肽上的末端醯肼基與聚醣上的羰基之間。在一個實施例中，聚醣為硫酸皮膚素。在某些實施例中，硫酸皮膚素不含以氧化方式裂解之醣環且因此不含醛官能基。
在一個實施例中，生物結合物包含聚醣及約5至約15個肽，其中肽包含IDLMQAR(SEQ ID NO：119)或IDLMQARGSG(SEQ ID NO：394)之至少一個序列，且經由醯肼-羰基鍵與聚醣結合。在某些實施例中，醯肼-羰基鍵位於肽上的末端醯肼基與聚醣上的羰基之間。在一個實施例中，聚醣為硫酸皮膚素。在某些實施例中，硫酸皮膚素不含以氧化方式裂解之醣環且因此不含醛官能基。
在一個實施例中，生物結合物包含聚醣及約5至約15個肽，其中 肽包含ITDGEA(SEQ ID NO：154)及/或ITDGEAGSG(SEQ ID NO：395)之至少一個序列，且經由醯肼-羰基鍵與聚醣結合。在某些實施例中，醯肼-羰基鍵位於肽上的末端醯肼基與聚醣上的羰基之間。在一個實施例中，聚醣為硫酸皮膚素。在某些實施例中，硫酸皮膚素不含以氧化方式裂解之醣環且因此不含醛官能基。
在一個實施例中，生物結合物包含聚醣及約5至約15個肽，其中肽包含DGEATD(SEQ ID NO：156)及/或DGEATDGSG(SEQ ID NO：396)之至少一個序列，且經由醯肼-羰基鍵與聚醣結合。在某些實施例中，醯肼-羰基鍵位於肽上的末端醯肼基與聚醣上的羰基之間。在一個實施例中，聚醣為硫酸皮膚素。在某些實施例中，硫酸皮膚素不含以氧化方式裂解之醣環且因此不含醛官能基。
在一個實施例中，生物結合物包含聚醣及約5至約15個肽，其中肽包含DGEATD(SEQ ID NO：156)、DGEATDGSG(SEQ ID NO：396)、ITDGEA(SEQ ID NO：154)及/或ITDGEAGSG(SEQ ID NO：395)之至少一個序列，及IELLQAR(SEQ ID NO：117)、IELLQARGSG(SEQ ID NO：393)、IDLMQAR(SEQ ID NO：119)及/或IDLMQARGSG(SEQ ID NO：394)之至少一個序列，且經由醯肼-羰基鍵與聚醣結合。在某些實施例中，醯肼-羰基鍵位於肽上的末端醯肼基與聚醣上的羰基之間。在一個實施例中，聚醣為硫酸皮膚素。在某些實施例中，硫酸皮膚素不含以氧化方式裂解之醣環且因此不含醛官能基。
3. 生物結合物之合成
如本文所用之肽可購自商業來源，或部分或完全使用此項技術中熟知之方法(例如，化學及/或生物技術方法)合成。在某些實施例中，肽係根據此項技術中熟知之固相肽合成方案合成。在另一實施例中，肽係在固體載體上根據熟知Fmoc方案合成，用三氟乙酸自載體裂解且根據熟習此項技術者已知之方法藉由層析純化。在其他實施例 中，肽係利用熟習此項技術者熟知之生物技術方法合成。在一個實施例中，藉由熟習此項技術者已知之重組DNA技術使編碼所需肽之胺基酸序列資訊之DNA序列接合至表現質體(例如，併入親和力標籤用於肽之親和力純化的質體)中，使質體轉染至用於表現之宿主生物體中，且隨後例如藉由親和力純化自宿主生物體或生長培養基分離肽。重組DNA技術方法描述於以引用的方式併入本文中之Sambrook等人，「Molecular Cloning：A Laboratory Manual」，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,(2001)中，且為熟習此項技術者所熟知。
如流程1中所展示，如本文所描述之肽可經由羧酸部分共價結合於聚醣(例如，肝素)1A，提供如本文所揭示之生物結合物1B。如在肽偶合反應中為典型的，可使用活化劑促進反應。適合偶合劑(或活化劑)為此項技術中已知，且包括例如碳化二亞胺(例如，N,N'-二環己基碳化二亞胺(DCC)、N,N'-二環戊基碳化二亞胺、N,N'-二異丙基碳化二亞胺(DIC)、1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳化二亞胺(EDC)、N-第三丁基-N-甲基碳化二亞胺(BMC)、N-第三丁基-N-乙基碳化二亞胺(BEC)、1,3-雙(2,2-二甲基-1,3-二氧戊環-4-基甲基)碳化二亞胺(BDDC)等)；酸酐(例如，對稱、混合或環狀酸酐)；活化酯(例如，苯基活化酯衍生物、對異羥肟酸活化酯、六氟丙酮(HFA)等)；醯基唑(使用CDI之醯基咪唑、醯基苯并三唑等)；醯基疊氮化物；酸性鹵化物；鏻鹽(HOBt、PyBOP、HOAt等)；銨/鹽(例如，四甲基銨鹽、雙吡咯啶基銨鹽、雙哌啶基銨鹽、咪唑鎓鹽、嘧啶鎓鹽、來源於N,N,N'-三甲基-N'-苯基脲之鹽、基於N-嗎啉基之銨/偶合試劑、銻酸鹽等)；有機磷試劑(例如，次膦酸及磷酸衍生物)；有機硫試劑(例如，磺酸衍生物)；三嗪偶合試劑(例如，2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪、氯化4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4甲基嗎啉鎓、四氟硼酸4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4甲基嗎啉鎓等)；吡啶鎓偶合試劑 (例如，向山試劑(Mukaiyama's reagent)、四氟硼酸吡啶鎓偶合試劑等)；聚合物負載試劑(例如，聚合物結合碳化二亞胺、聚合物結合TBTU、聚合物結合2,4,6-三氯-1,3,5-三嗪、聚合物結合HOBt、聚合物結合HOSu、聚合物結合IIDQ、聚合物結合EEDQ等)；及其類似物(參見例如，El-Faham等人，Chem.Rev.,2011,111(11)：6557-6602；Han等人，Tetrahedron,2004,60：2447-2467)。
在一個實施例中，藉由使聚醣之羧酸部分與偶合劑(例如碳化二亞胺試劑，諸如(但不限於)N,N'-二環己基碳化二亞胺(DCC)、N,N'-二異丙基碳化二亞胺(DIC)、1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳化二亞胺(EDC)等)反應形成O-醯基異脲中間物，經由活化之聚醣中間物進行肽偶合反應。此碳化二亞胺化學試劑為此項技術中所熟知，且可自商業來源購得適合偶合試劑。使O-醯基異脲中間物與所需肽接觸，產生生物結合物。可在肽之前或在肽存在下使聚醣與活化劑接觸。在一些實施例中，反應係在N-羥基丁二醯亞胺(NHS)或其衍生物存在下進行。在某些實施例中，肽序列可包含反應性部分(例如，醯肼官能基)來輔助與聚醣或其O-醯基異脲中間物之偶合反應。在一些實施例中，肽序列包括充當結合單元與末端胺基酸(例如，終端甘胺酸)或反應性部分(亦即，醯肼官能基)之間的間隔基之一或多個胺基酸殘基。舉例而言，可添加絲胺酸-甘胺酸(SG)、甘胺酸-絲胺酸-甘胺酸(GSG)或甘胺酸-絲胺酸-甘胺酸-絲胺酸-甘胺酸(GSGSG)間隔基以為聚醣提供連接點。另外，在肽中之一或多個胺基酸含有反應性官能基(例如，羧酸側鏈)之某些情況下，可使用標準保護基化學方法保護一或多個側鏈，促進偶合反應。另外，非胺基酸間隔基亦可單獨或與胺基酸間隔基(例如，胺基己酸)組合使用。
流程1. 生物結合物之合成
在某些實施例中，生物結合物來源於經修飾之聚醣衍生物(例如，肝素)(流程2)。適用於本文所描述之生物結合物的各種聚醣衍生物為此項技術中已知，諸如部分N-脫硫酸化肝素及部分O-脫硫酸化肝素(亦即，2-O及/或6-O-脫硫酸化肝素，參見例如Kariya等人，J.Biol.Chem.,2000,275：25949-5958；Lapierre等人，Glycobiology,1996,6(3)：355-366)。例示性方法展示於以下流程2中。如流程2中所展示，可使聚醣(例如，肝素)1A與適合之脫硫劑(諸如鹼(例如，NaOH))或矽烷化試劑(例如，N,O-雙(三甲基矽烷基)乙醯胺(BTSA)、N-甲基-N-(三甲基矽烷基)三氟乙醯胺(MTSTFA)等)反應，提供一或多種脫硫酸化聚醣衍生物2A。如熟習此項技術者顯而易知，聚醣衍生物2A可視所用之試劑及反應條件而調整，使得可獲得部分、完整的脫硫酸化聚醣衍生物2A或其混合物。隨後可使脫硫酸化聚醣衍生物2A與肽視情況在如上文對於流程1所描述之偶合劑存在下在典型的肽偶合反應條件下反應，提供生物結合物2B。另外，如流程2中所展示，可將具有至少一個羥基之聚醣衍生物(例如，6-O-脫硫酸化肝素)轉化為O-羧甲基化聚醣衍生物(例如，6-O-羧甲基化肝素)2C(參見例如，Prestwich等人在US 2012/0142907及US 2010/0330143中)。使2C與肽視情況在如上文對於流程1所描述之偶合劑存在下在典型的肽偶合反應條件下反應可提供生物結合物2D及/或2E。
流程2. 生物結合物之替代合成
相比於流程1及2，流程3展示此項技術中已知之生物結合物的合成。如流程1中所展示，使用高碘酸鹽試劑(諸如高碘酸鈉)氧化聚醣(例如，硫酸軟骨素「CS」)，在聚醣上提供醛官能基(例如，「ox-CS」)用於使肽與聚醣共價鍵結。隨後藉由使氧化聚醣之醛官能基(例如，「ox-CS」)與N-[β-順丁烯二醯亞胺基丙酸]醯肼(BMPH)反應形成 聚醣中間物(例如，「BMPH-CS」)，且進一步使聚醣中間物與含有至少一個游離硫醇基(亦即，-SH基團)之肽反應產生合成肽聚醣，使肽共價鍵結至聚醣(例如，硫酸軟骨素「CS」)。
4. 使用方法
4.1 膠原蛋白結合生物結合物之使用方法
在一個實施例中，描述一種抑制血小板活化之方法，該方法包含以下步驟：提供膠原蛋白結合合成生物結合物用於接觸膠原蛋白，其中膠原蛋白結合合成生物結合物與膠原蛋白結合，且其中血小板之活化得到抑制。在另一實施例中，描述一種抑制血小板黏附於膠原蛋白之方法，該方法包含以下步驟：提供膠原蛋白結合合成生物結合物用於接觸膠原蛋白，其中膠原蛋白結合合成生物結合物與膠原蛋白結合，且其中血小板與膠原蛋白之黏附得到抑制。下文論述膠原蛋白結合生物結合物之其他使用方法。
a. 冠狀動脈疾病(CAD)及外周動脈疾病(PAD)
本發明之一個實施例提供用於提高繞道手術程序之成功率及/或減少失敗之方法及相關組合物。繞道移植係作為冠狀動脈疾病(CAD)及外周動脈疾病(PAD)中動脈阻塞之一種治療形式。在美國，每年進行大約500,000個冠狀動脈繞道移植(CABG)程序及超過70,000個外周繞道移植程序。最常見地，通常係自隱靜脈收集自體血管移植物。
儘管盛行以自體靜脈移植繞道手術恢復血流，在CAD及PAD中仍存在大量靜脈移植失敗(VGF)。在單獨外周中，靜脈移植失敗率在5年內達到50%失敗水準。而在移植之後不久，因技術因素及急性血栓症導致5%至10%靜脈移植失敗，中期失敗(3至24個月)可能發生在另一20%至30%情況下，且可導致昂貴的監控、再介入程序及切除術。在布萊根婦女醫院(Brigham and Women's Hospital)之二十年經驗期間，靜脈移植失敗在CLI患者(n=1219)中之年發病率為29%。靜脈移植失敗之結果對於患者而言通常為嚴重的，包括復發性缺血症狀、手術致衰弱及肢體損失。迄今為止，藥物療法及技術創新對減少靜脈移植失敗幾乎無影響。
預期對靜脈移植導管之脆弱內皮層的損傷，無論是否由靜脈移植收集、保存培養基、在繞道製備中過度操縱或缺血及再灌注損傷引起，導致在移植之後，血管壁內的血小板介導之炎症反應。此類內皮損傷及ECM-血小板活化級聯可經由急性炎症及血栓症導致早期VGF，或經由新生血管內膜增生導致延遲VGF。因此，在移植之後，限制靜脈移植內皮下基質暴露於循環血小板可幫助減少急性血管壁炎症，改善再上皮形成且限制可導致血管閉塞及VGF之過度新生血管內膜增生。如本文所描述之生物結合物可用作患有心血管疾病之進行自體靜脈移植繞道手術之患者的靜脈移植物保存液。如本文所描述之生物結合物及包含其的組合物可用於治療及/或預防有其需要之患者之 冠狀動脈疾病及/或外周動脈疾病。
因此，根據本發明之一個實施例提供一種藉由使血管片段的內壁與含有本發明之合成生物結合物的溶液接觸來製備血管移植物(例如，靜脈移植物)之方法。實施接觸之一種方法為使該片段浸泡於該溶液中。此接觸之條件可不同但可容易視合成生物結合物之濃度及血管之特徵而確定，使得有適合量之合成生物結合物與內壁結合。藉由此類方法製備之血管移植物亦在本發明之範疇內。
在製備移植物之後，可將其植入至有其需要之患者。繞道手術程序可容易藉由醫療專業人員進行。在植入後，與授予物之內壁結合之合成生物結合物可幫助減少急性血管壁炎症，改善移植物之再上皮形成且限制移植物之過度新生血管內膜增生，導致移植失敗減少。
在一個實施例中，當已用如上文所描述之合成生物結合物處理移植物時，在繞道程序期間或之後，可將合成生物結合物之溶液注射至移植物內腔中以使得合成生物結合物與移植物之內壁結合。在一個態樣中，注射係在血流經由移植物恢復或開始之前進行。在另一態樣中，注射係在血流恢復或開始之後不久(例如，在10分鐘內，在5分鐘內，或在1分鐘內)進行。
在一些實施例中，該方法有效抑制血管之負性重塑。冠狀動脈疾病，亦稱為缺血性心臟病或冠心病，在冠狀動脈(向心肌供應血液之動脈)內之光滑彈性內層的一部分產生動脈粥樣硬化時發生，有效地限制血液流向心臟。周邊動脈疾病，亦稱為動脈粥樣硬化或動脈硬化，為發生在循環系統之動脈中的病症。負性重塑包括血管對刺激之生理或病理反應，導致血管直徑及內腔直徑減小。此類刺激可藉由例如改變血流或血管成形術程序來提供。在一些實施例中，本文所描述之生物結合物及包含其的組合物之注射使得血管直徑與無注射之血管直徑相比增加了約10%、20%、30%、40%、60%、70%、80%、95% 或95%以上中之任一者。負性重塑可例如以血管攝影方式定量為在病變位點(或疾病位點)處之直徑狹窄百分比。測定重塑程度之另一方法涉及使用血管內超音波(IVUS)量測病變內外彈性膜面積。IVUS為可使外彈性膜以及血管內腔成像之技術。在一些實施例中，負性重塑與諸如血管成形術、支架術或粥樣斑塊切除術之血管介入程序相關。如本文所描述之生物結合物及包含其的組合物可因此在血管介入程序之前、期間及/或之後注射。在某些實施例中，提供一種治療有其需要之患者之股膕動脈內的狹窄或閉塞之方法，其包含在球囊血管成形術之前、期間及/或之後，向內腔之內壁施用溶液，其中該溶液包含有效量之如本文所描述之生物結合物或包含其的組合物。
本發明因此提供一種抑制有其需要之個體中的血管(例如，動脈)中之負性重塑的方法，其包含向血管壁或血管壁周圍組織中注射有效量之如本文所描述之生物結合物或包含其的組合物。在一些實施例中，生物結合物或組合物係在有潛在或實際負性重塑之位點或與其相鄰之處(諸如與該位點相距不超過約2cm、1cm或0.5cm)注射。在一些實施例中，在遠離具有潛在或實際負性重塑之位點處(例如與該位點相距至少約1cm、2cm、3cm、4cm、5cm、6cm、7cm、8cm、9cm或10cm中之任一者)注射奈米粒子組合物。在一些實施例中，注射係經由含針導管進行。在一些實施例中，位點為冠狀動脈或外周動脈。在一些實施例中，動脈選自由以下組成之群：腎動脈、腦動脈、肺動脈及腿部動脈。在一些實施例中，動脈為球囊損傷動脈。其他實例包括(但不限於)腹主動脈、脛前動脈、主動脈弓、弓狀動脈、腋動脈、肱動脈、頸動脈、腹腔動脈、旋腓骨動脈、肝總動脈、髂總動脈、股深動脈、掌深動脈弓、指背動脈、蹠背動脈、頸外動脈、髂外動脈、面動脈、股動脈、腸系膜下動脈、髂內動脈、腸動脈、膝下外側動脈、膝上外側動脈、指掌側動脈、腓動脈、膕動脈、脛後動脈、 股深動脈、肺動脈、橈動脈、腎動脈、脾動脈、鎖骨下動脈、掌淺動脈弓、腸系膜上動脈、尺側上副動脈及/或尺動脈。在某些實施例中，動脈為冠狀脈管之一部分。
在一個實施例中，在上文所描述之方法中使用的生物結合物包含肝素及約5至約10或約7個肽，其中肽包含RRANAALKAGELYKSILY(SEQ ID NO：1)或RRANAALKAGELYKSILYGSG(SEQ ID NO：287)之至少一個序列，且經由醯肼-羰基鍵與肝素結合。
b. 血管治療
本文所描述之生物結合物及組合物可用於在血管損傷或介入之前、期間及/或之後，治療患者之血管。血管介入可包括(但不限於)在具有及不具有支架、移植血管、粥樣斑塊切除術及血管通路功能障礙下之血管成形術，或其他手術程序。
在本文所描述之各種實施例中，可向需要治療之患者投與生物結合物或其組合物以抑制血小板活化，諸如參與血栓症、血小板結合於所暴露之剝露內皮的膠原蛋白、由剝露內皮產生之炎症、內膜增生或血管痙攣之血小板活化。
在各種實施例中，生物結合物可例如經靜脈內投與或投與至肌肉中。其他適於非經腸投與之途徑包括血管內、靜脈內、動脈內、肌肉內、皮膚、皮下、經皮、皮內及表皮內遞送。適於非經腸投與之方式包括針(包括微針)注射器、輸液技術及基於導管之遞送。基於導管之遞送可包括以球囊上塗層形式經由多孔球囊或以支架上塗層形式遞送生物結合物。在另一實施例中，生物結合物可全身性地遞送(亦即，不直接遞送至靶血管，但藉由非經腸投與遞送)。
此等生物結合物經由物理肽-膠原蛋白相互作用局部結合於所暴露之膠原蛋白。在結合於膠原蛋白時，生物結合物具有多種功能，包括1)充當血小板連接/活化之障壁；2)藉由抑制MMP通路保護膠原蛋 白免於降解；及3)使生長因子FGF-2、FGF-7及FGF-10隔離，因此促進內皮及上皮細胞增殖及遷移。
生物結合物可為膠原蛋白上之血小板結合位點競爭，且防止血小板結合及活化。生物結合物之聚醣主鏈可帶負電且結合水分子，在膠原蛋白表面上產生親水性障壁，防止血小板與蛋白質黏附。藉由遮蔽所暴露之膠原蛋白而非抑制正常血小板功能，生物結合物可提供解決炎症及內膜增生之級聯初始步驟的局部治療。
在一個實施例中，本發明提供一種解決接受血液透析之患者中的血管通路功能障礙之未滿足需求的新方法。在一個實施例中，該方法需要產生由如本文所描述之生物結合物設計之管腔血管塗層。在動靜脈瘻管(AVF)中，例如新生血管內膜增生主要發生在AVF之靜脈部分中。雖然內膜增生之初始機制在動脈及靜脈中類似，但所得病變存在差異。靜脈新生血管內膜增生與在外周血管疾病環境中之動脈內膜增生相比往往為更具侵襲性病變，且對血管成形術具有較不良反應。預期所揭示之生物結合物防止在動脈損傷中之血小板結合及內膜增生的能力促使其能夠減少或防止新生血管內膜增生。
因此，在一些實施例中，本發明提供一種改善需要血液透析之患者中的動靜脈瘻管(AVF)之成熟，或者提高通暢、擴大靜脈內徑、減少狹窄、減少新生血管內膜增生、減少血液動力學應力、減少內皮或平滑肌細胞損傷、減少血管通路功能障礙或減少AVF處的凝血或炎症之方法。在一些實施例中，該方法需要向AVF之內腔之內壁施用溶液；及恢復或引發AVF中之血流，其中該溶液為本發明之生物結合物，或該溶液包含有效量之本發明生物結合物。
揭示一種使用特異性結合於所暴露之膠原蛋白之合成聚合物管腔塗層的局部治療，其中該塗層可阻斷血小板黏附於血管壁且因此抑制血栓症及內膜增生之引發事件。另外，塗層可促進血管壁快速再內 皮化，導致更快癒合。預期在產生期間向天然AV瘻管施用所揭示之生物結合物將導致具有顯著較少狹窄及較大直徑之瘻管。
在一些實施例中，對於在引發血流之前的最新產生之AVF，在引發血流之前少於約10分鐘施用溶液。在一些實施例中，在引發血流之前少於約20、15、10、9、8、7、6、5、4、3或2分鐘，或60、45、30、20、10或5秒施用溶液。在一些實施例中，在引發血流之前至少1分鐘或至少2、3、4、5分鐘施用溶液。在一些實施例中，在恢復血流之後至少1分鐘或至少2、3、4、5分鐘施用溶液。在一些實施例中，引發血流，隨後停止以允許遞送溶液。在一些實施例中，在產生吻合術之前、在產生吻合術期間或之後，向血管施用溶液。在一些實施例中，在產生吻合術之前、在產生吻合術期間或之後，向血管施用溶液。
在一些實施例中，例如用針、導管或其他藥物遞送裝置使溶液沖洗通過AVF。在一個實施例中，該方法進一步需要在用溶液沖洗AVF之後，關閉AVF。在一些實施例中，除施用如上文所描述之溶液之外，或者將溶液注射至由夾緊所建立的AVF之近端及靜脈與動脈而產生之封閉內腔中。
在一個實施例中，在靜脈擴張或AVF之靜脈部分摩擦(用於擴大靜脈內徑)之後約5分鐘內(或者在10、9、8、7、6、4、3或2分鐘內)施用溶液。向靜脈內之機械擴張或摩擦表面施用溶液可減少在摩擦期間於表面上之生物結合物的減損。
進一步預期所揭示之組合物及方法可用於在患者中建立血管通路，該方法可能需要向血管通路中的血管之壁施用本發明溶液；及恢復或引發血管通路中之血流。在一些實施例中，壁為血管之內壁，但其亦可為任何血管之外壁。
在一些實施例中，血管通路為動靜脈瘻管(AVF)、動靜脈移植物 (AVG)或用於非經腸營養、化學療法或血漿去除法之持久血管通路。預期溶液減少壁暴露於血小板。在一些實施例中，壁包含因損傷或手術程序而暴露於血流之細胞或組織。展示溶液之施用提高通暢，提高存活率，改善血流，擴大血管內徑，或減少血管通路(諸如AVF及AVG)中之狹窄。
在一個實施例中，本發明提供一種改善需要血液透析之患者中的動靜脈瘻管(AVE)之成熟，或者提高通暢、擴大靜脈內徑、減少狹窄、減少新生血管內膜增生、減少血液動力學應力、減少內皮或平滑肌細胞損傷、減少血管通路功能障礙或減少AVF處的凝血或炎症之方法。在一些實施例中，該方法需要向AVF之內腔之內壁施用溶液；及恢復或引發AVF中之血流，其中該溶液包含有效量之本發明生物結合物。
預期可向患者之血管內部經皮或經靜脈內投與生物結合物。經皮或靜脈內遞送允許治療患者之術後瘻管產生。可遞送生物結合物用於治療血管，維護血管，或防止瘻管失敗。
在一些實施例中，該等方法進一步包括進行一或多個維護應用，諸如球囊輔助成熟、球囊血管成形術、粥樣斑塊切除術或除凝塊程序。另外，在一些實施例中，在血液透析時，尤其在當尤其高流動速率損害內皮時之程序之後，進行預防劑遞送，且預期在移植物或瘻管中之注射有益於維護及預防狹窄。
在一個實施例中，在上文所描述之方法中使用的生物結合物包含肝素及約5至約10或約7個肽，其中肽包含RRANAALKAGELYKSILY(SEQ ID NO：1)或RRANAALKAGELYKSILYGSG(SEQ ID NO：287)之至少一個序列，且經由醯肼-羰基鍵與肝素結合。在某些實施例中，肝素為未分化肝素(UFH)或低分子量肝素(LMWH)。
在一個實施例中，在上文所描述之方法中使用的生物結合物包含 肝素及約5至約20%官能化肽，其中肽包含RRANAALKAGELYKSILY(SEQ ID NO：1)或RRANAALKAGELYKSILYGSG(SEQ ID NO：287)之至少一個序列，且經由醯肼-羰基鍵與肝素結合。
c. 血管介入
血管介入，諸如經皮冠狀動脈介入術可藉由任何習知程序在投與膠原蛋白結合合成生物結合物之前、期間或之後進行。預期與本發明方法結合使用之血管介入程序之實例包括支架術、粥樣斑塊切除術及血管成形術(諸如球囊血管成形術)。血管介入程序可為涉及暫時閉塞血管之程序(例如，球囊血管成形術)，或其可為不涉及暫時閉塞血管之程序(例如，非球囊血管成形術程序、不涉及球囊血管成形術之支架術程序等)。說明性遞送模式可包括導管、非經腸投與、球囊上塗層、經由多孔球囊、經塗佈支架及其任何組合，或在血管介入程序期間遞送藥物之任何其他已知方法。
在另一說明性實施例中，在血管介入程序期間，具有保守胺基酸取代之此等生物結合物中之任一者可抑制血小板結合於所暴露之剝露內皮的膠原蛋白、血小板活化、血栓症、由剝露內皮產生之炎症、內膜增生及/或血管痙攣，或可刺激內皮細胞增殖或可結合於剝露血管中之膠原蛋白。在另一說明性實施例中，在血管介入程序期間，此段中描述的具有保守胺基酸取代之生物結合物中之任一者可抑制血小板結合於所暴露之剝露內皮的膠原蛋白、血小板活化、內膜增生及/或血管痙攣，或可結合於剝露血管中之膠原蛋白。
在本文所描述之各種實施例中，可向患者(例如需要治療以抑制血小板活化，諸如參與血栓症、血小板結合於所暴露之剝露內皮的膠原蛋白、血栓症、由剝露內皮產生之炎症、內膜增生或血管痙攣之血小板活化的患者)投與膠原蛋白結合合成生物結合物。在各種實施例中，膠原蛋白結合合成生物結合物可例如經靜脈內投與或投與至肌肉 中。適於非經腸投與之途徑包括血管內、靜脈內、動脈內、肌肉內、皮膚、皮下、經皮、皮內及表皮內遞送。適於非經腸投與之方式包括針(包括微針)注射器、輸液技術及基於導管之遞送。在說明性實施例中，提供與膠原蛋白結合合成生物結合物一起用於非經腸投與或基於導管之遞送的醫藥調配物，其包含：a)醫藥活性量之膠原蛋白結合合成生物結合物；b)醫藥學上可接受之pH緩衝劑，提供在約pH 4.5至約pH 9範圍內之pH；c)離子強度調節劑，其濃度範圍為約0至約300毫莫耳；及d)水溶性黏度調節劑，其濃度範圍為約0.25%至約10%總式量，或任何個別組分a)、b)、c)或d)，或a)、b)、c)及d)之任何組合。
在本文所描述之任一實施例中，膠原蛋白結合合成生物結合物可以任何適合方法經血管內投與至患者中(例如，至動脈或靜脈中)。在本文所描述之各種實施例中，膠原蛋白結合合成生物結合物可在血管介入之前、期間或之後，投與至患者血管中。在各種實施例中，血管介入，諸如經皮冠狀動脈介入術(PCI)可包括例如支架術、粥樣斑塊切除術、移植及血管成形術(諸如球囊血管成形術)。說明性地，血管介入可為涉及暫時閉塞動脈，諸如冠狀動脈或靜脈之介入(例如，球囊血管成形術)，或其可為不涉及暫時閉塞動脈或靜脈之介入(例如，非球囊血管成形術程序、不涉及球囊血管成形術之支架術程序等)。說明性遞送模式可包括導管、非經腸投與、球囊上塗層、經由多孔球囊、經塗佈支架及其任何組合，或在血管介入程序期間遞送藥物之任何其他已知方法。在一個說明性實施例中，靶血管可包括冠狀動脈，例如向患者之心臟組織供應血液之任何血管，包括天然冠狀動脈以及例如已在早期冠狀動脈繞道程序中移植至患者體內之動脈。在本文所描述之任一實施例中，向其中投與膠原蛋白結合合成生物結合物及在其上進行血管介入程序之靶血管可含有阻塞，諸如狹窄或造成通過血管之血流量減少的一些其他形式之完全或部分阻塞。因此，膠 原蛋白結合合成生物結合物可經由導管(例如，擴張導管、跨線血管成形術球囊導管、輸液導管、快速交換或單軌導管或此項技術中已知之任何其他導管裝置)遞送至血管，導管經皮插入患者體內且穿過患者之血管到達靶血管。各種基於導管之裝置為此項技術中已知，包括以引用的方式併入本文中之美國專利第7,300,454號中所描述之裝置。在本文所描述之使用導管之各種實施例中，用於遞送膠原蛋白結合合成生物結合物之導管可為經由其進行血管介入之相同導管，或其可為不同導管(例如，經由相同或不同皮膚切口經皮插入患者體內及/或經由相同或不同途徑穿過患者之血管到達靶血管之不同導管)。在另一實施例中，膠原蛋白結合合成生物結合物可直接注射至靶血管中。在另一實施例中，膠原蛋白結合合成生物結合物可全身性地遞送(亦即，不直接遞送至靶血管，但藉由非經腸投與遞送，無需基於導管之遞送)。
在血管含有阻塞(例如，狹窄)之情況下，可藉由將膠原蛋白結合合成生物結合物直接遞送至在阻塞位點或阻塞遠端或兩者處之靶血管進行投與。在另一實施例中，膠原蛋白結合合成生物結合物可遞送至阻塞近端之一或多個位點。說明性地，導管頂端可在遞送膠原蛋白結合合成生物結合物時維持靜止，或導管頂端可在遞送膠原蛋白結合合成生物結合物時移動(例如，沿近端方向自最初阻塞遠端之位置移至或通過阻塞，或移至阻塞近端之位置)。
如上文所指，在一個實施例中，膠原蛋白結合合成生物結合物可在血管介入(例如，經皮冠狀動脈介入術)之前的時間直接投與至患者血管中。舉例而言，可僅在血管介入之前(例如在血管介入之前約1小時內，諸如在約30分鐘內、在約15分鐘內及/或在約5分鐘內)進行膠原蛋白結合合成生物結合物之遞送。視情況，可在全部或部分血管介入程序期間及/或在完成此類程序之後，繼續使膠原蛋白結合合成 生物結合物直接遞送至靶血管，或可在開始血管介入程序之前停止使膠原蛋白結合合成生物結合物直接遞送至靶血管，且隨後不重新開始。在本文所描述之任一實施例中，膠原蛋白結合合成生物結合物之遞送可為連續性的，或其可經由單次或多次投與實現。在向靶血管投與膠原蛋白結合合成生物結合物之前、期間及/或之後，可投與相同的膠原蛋白結合合成生物結合物或一或多種不同的膠原蛋白結合合成生物結合物。
在一個實施例中，在上文所描述之方法中使用的生物結合物包含肝素及約5至約10或約7個肽，其中肽包含RRANAALKAGELYKSILY(SEQ ID NO：1)或RRANAALKAGELYKSILYGSG(SEQ ID NO：287)之至少一個序列，且經由醯肼-羰基鍵與肝素結合。
d. 內皮功能障礙
在一個實施例中，本發明提供用於治療罹患與內皮功能障礙相關之疾病的患者之組合物及方法。在一些實施例中，組合物包括本發明之合成膠原蛋白結合生物結合物。
本文發現膠原蛋白結合生物結合物可減少急性及慢性疾病中內皮功能障礙或損傷之炎症影響。預期此類生物結合物抑制或減少血小板結合於功能障礙內皮且因此減少血小板介導之炎症。炎症可經由諸如血小板-血小板結合、血小板-白血球結合、促進白血球滲出之血小板過程或僅自局部及區域細胞因子之血小板釋放來活化。
此外，發現膠原蛋白結合生物結合物可減少促炎性細胞因子分泌及E選擇素及P選擇素在所暴露之內皮細胞中的表現。此外，此等生物結合物可增加內皮細胞增殖及遷移，使IL-6分泌及血管損傷標記物之產生衰減，甚至在血小板衍生之生長因子(PDGF)存在下。預期藉由投與膠原蛋白結合生物結合物引起之此等效果中的一些或全部促使功能障礙內皮之炎症減少。
在一些實施例中，亦提供一種預防或減少罹患內皮功能障礙之血管位點處的炎症之方法。該方法需要向該位點投與包括本發明之合成膠原蛋白結合生物結合物的醫藥組合物。
術語「內皮功能障礙」亦稱為「內皮細胞(EC)功能障礙」、「功能障礙內皮」或「功能障礙內皮細胞」。內皮功能障礙可藉由內皮細胞之細胞表面上的ICAM及VCAM受體或選擇素受體之揭露或暴露來確定。P選擇素及E選擇素為因損傷及炎症而會在細胞表面上暫時表現及在功能障礙內皮中長期表現之所暴露的選擇素受體之實例。
在一些實施例中，內皮功能障礙之特徵在於內皮內層滲透或內皮細胞受損。在一些實施例中，內皮功能障礙之特徵在於醣外被減損。在一些實施例中，內皮功能障礙之特徵在於內皮細胞表面上所表現且暴露於循環之選擇素蛋白。在一些實施例中，該位點罹患炎症。
在一個態樣中，血管位點非因物理方式剝露且未由於血管介入程序而痊癒。血管介入程序之非限制性實例包括經皮冠狀動脈介入術(PCI)。
「功能障礙內皮細胞」或「內皮細胞(EC)功能障礙」意謂內皮細胞之細胞表面上的ICAM及VCAM受體以及選擇素受體之揭露或暴露。P選擇素及E選擇素為因損傷及炎症而在細胞表面上暫時表現及在功能障礙內皮中長期表現之所暴露的選擇素受體之實例。具有慢性功能障礙內皮細胞之疾病病況之實例為糖尿病。
內皮功能障礙在廣泛範圍之疾病之發病機制中起重要作用，因為內皮細胞參與維護功能性毛細管。
舉例而言，內皮直接參與外周血管疾病、中風、心臟病、糖尿病、胰島素抗性、慢性腎衰竭、腫瘤生長、癌轉移、靜脈血栓症及嚴重的病毒性傳染病(Rajendran等人，Int.J.Biol.Sci.,9：1057-1069,2013)。
如本文所用之「與內皮功能障礙相關之疾病」係指至少部分由內皮功能障礙引起或誘導內皮功能障礙之人類疾病或病狀。因此，治療與內皮功能障礙相關之疾病係指治療疾病，恢復功能障礙內皮，或預防或改善由功能障礙內皮產生之病狀或症狀，諸如炎症、內膜增生及血栓症。
本發明人已證明膠原蛋白結合生物結合物可有效地遞送至人類患者之任何器官。因此，膠原蛋白結合生物結合物可用於治療在任一器官發生及與以下疾病或病狀中之任一者相關的內皮功能障礙。
血管疾病.可用膠原蛋白結合生物結合物適當治療之血管疾病包括(但不限於)動脈粥樣硬化疾病(外周動脈疾病、冠狀動脈疾病、中風、頸動脈疾病、腎動脈狹窄)、靜脈血栓性疾病(深或淺靜脈血栓症)及醫原性大血管損傷(血管成形術、具有支架置入之血管成形術、粥樣斑塊切除術、血栓切除術、透析通路創建、繞道用靜脈收集、腦或主動脈瘤治療)。
腎病.可用膠原蛋白結合生物結合物適當治療之腎病包括(但不限於)急性腎小管壞死、糖尿病慢性腎衰竭、狼瘡性腎炎、腎纖維化及急性絲球體腎炎。
肺病.可用膠原蛋白結合生物結合物適當治療之肺病包括(但不限於)特發性肺纖維化(IPF)、慢性阻塞性肺病、哮喘及肺氣腫。
血液病.可用膠原蛋白結合生物結合物適當治療之血液病包括(但不限於)血栓性血小板減少性紫癜症(TTP)、散播性血管內凝血(DIC)及溶血性尿毒症症候群(HUS)。
另外，皮膚病，諸如全身性硬化症；風濕病，包括血管炎性病症(狼瘡)、類風濕性關節炎及其他發炎性關節炎(痛風)；胃腸道疾病，包括發炎性腸道疾病；肝炎及肝纖維化；腫瘤生長、腫瘤轉移；傳染病，包括病毒及細菌性敗血症；神經疾病，包括多發性硬化症、 癡呆症及肌肉萎縮性側索硬化；眼科疾病，包括黃斑變性、青光眼及葡萄膜炎；內分泌疾病，諸如糖尿病；及複雜區域疼痛症候群(CRPS)亦可用本發明之膠原蛋白結合生物結合物治療。
預期生物結合物可相對於肽一致性、連接至聚醣之肽的數量及GAG主鏈一致性進行調整，用於視待治療疾病及受影響的功能障礙內皮之位置而定之優化治療。因此，多個分子設計參數可經改造用於優化目標效果。
在一個實施例中，生物結合物包含具有連接之膠原蛋白結合肽的硫酸皮膚素(DS)。DS可能因為其能夠促進上皮細胞遷移及增殖而為有用的。
預期本文所提供之生物結合物之其他變異體亦能夠抑制功能障礙內皮之炎症。在一個實施例中，生物結合物包括膠原蛋白結合肽，諸如RRANAALKAGELYKSILY(SEQ ID NO：1)，稱為「SILY」。
e. 組織黏附
本發明之方法適用於與組織黏附，諸如心臟、腹部或骨盆黏附相關之多種應用。預期本發明之方法適用於治療及/或預防此等持續性缺陷或復發性損傷。
在某些實施例中，本發明提供一種治療及/或預防有其需要之患者之腹部或骨盆黏附的方法，其包含在器官之非自然暴露組織上施用醫藥組合物。在一個實施例中，該組合物包含生物結合物，生物結合物包含聚醣，具有鍵結至聚醣之約1至約80個膠原蛋白結合肽。「暴露組織」可指暴露於在正常健康條件下可見之新環境的組織或表面，或非暴露於在正常健康條件下不同器官之細胞或組織但因疾病或損傷或在醫療程序期間暴露之組織(亦即，非自然暴露組織)。
黏附為非正常地結合不正常連接之組織及/或器官之一群纖維疤痕組織。黏附發展回應於各種類型之損傷或組織干擾，例如手術、創 傷、感染、化學療法、輻射、異物或癌症。
腹部及骨盆黏附為腹部手術程序之常見併發症。腹部黏附可造成嚴重臨床問題及/或疼痛。舉例而言，腹部黏附相關臨床問題可包括小腸梗阻、繼發性不孕症、異位妊娠、慢性腹部及骨盆疼痛及困難且危險的二次手術(Diamond,M.P.,Freeman,M.L.Eur.Soc.Human.Repro.Embryo.2001；7(6)：567-576)。腹部黏附可藉由繫栓不正常連接之組織及/或器官及引起神經牽引而造成疼痛。若腸道變得梗阻，則腹脹將引起疼痛。因此，腹部黏附可引起腸道干擾及腸梗阻或阻塞。在極端情況下，腹部黏附可在腸道區段周圍形成纖維帶，收縮血流且導致組織死亡。
引起上述臨床問題及/或疼痛之腹部及骨盆黏附之標準治療為手術介入。然而，手術介入帶有額外腹部黏附及進一步併發症之風險。因此，腹部黏附之替代治療及/或預防選項將有益於治療及/或預防有其需要之患者之腹部黏附。
在一個態樣中，腹部組織或器官之創傷導致腹部組織及/或器官之間形成纖維組織帶。預期本文所描述之方法適用於治療及/或預防該腹部黏附。
預期本文所提供之合成生物結合物可提供保護性水合層，以使疼痛降至最低，保護腹部組織及/或器官膠原蛋白免於降解，且促進上皮遷移及上皮增殖。
在某些實施例中，本發明提供一種治療及/或預防有其需要之患者之腹部黏附的方法，其包含在腹部器官之暴露組織上施用醫藥組合物。在一個實施例中，該組合物包含生物結合物，生物結合物包含聚醣，具有鍵結至聚醣之約1至約80個膠原蛋白結合肽。
在某些實施例中，本發明提供一種治療及/或預防有其需要之患者之肌腱-肌腱鞘黏附的方法，其包含向非自然暴露之肌腱及/或肌腱 鞘施用如本文所描述之生物結合物或組合物。
在某些實施例中，本發明提供一種治療及/或預防有其需要之患者之心臟黏附的方法，其包含向非自然暴露之心臟組織施用如本文所描述之生物結合物或組合物。
在一些態樣中，組織因手術、創傷、感染、化學療法、輻射、異物或癌症而暴露。在一個態樣中，組織以手術方式暴露。
在一些態樣中，組合物以噴霧劑形式施用。在一些態樣中，組織為腹膜組織。
亦預期本發明之組合物及方法適用於減少或預防矯形外科黏附，諸如在手或手指手術期間。
在一些實施例中，該等方法可進一步包括此項技術中已知之減少或預防黏附之其他方法，諸如在組織周圍使用網格。
本文所提供之生物結合物可用於藉由向有其需要之患者投與靶向腹部組織及/或器官之胞外基質組分的合成生物結合物來治療及/或防止患者之腹部黏附。預期本文所提供之合成生物結合物可相對於肽一致性、連接至葡萄糖胺聚醣(GAG)主鏈之肽的數量及GAG主鏈一致性進行調整，促進腹部組織血管形成。因此，多個分子設計參數可經改造用於優化目標效果。
本文所提供之生物結合物可在手術中用作佐劑以防止或減少組織黏附。在手術期間，合成生物結合物可遞送至可能有黏附體生成(adhesiogenic)之組織或器官。預期此類投與可幫助預防及/或減少術後黏附。在一個實施例中，本發明提供一種減少或預防術後黏附之方法，其中該方法包含向手術位點遞送本文所提供之合成生物結合物。在另一實施例中，本文所提供之生物結合物可在諸如腹腔鏡腹部手術之腹部程序中有用。在另一實施例中，本文所提供之生物結合物可經由腹腔鏡遞送至可能有黏附體生成之組織或器官。預期用合成生物結 合物DS-SILY治療藉由結合於損傷區域，以提供保護性水合層，使疼痛降至最低，保護腹部組織及/或器官膠原蛋白免於降解且促進上皮遷移及上皮增殖來治療及/或預防腹部黏附。進一步預期DS-SILY會在受傷區域中存留以便不需要每天多次治療。
在一個實施例中，肽聚醣包含具有連接之膠原蛋白結合肽的硫酸皮膚素(DS)。DS可能因為其能夠促進上皮細胞遷移及增殖而適用於腹部黏附應用。
預期本文所提供之生物結合物之其他變異體亦能夠經由結合於I型膠原蛋白來抑制血小板活化。在一個實施例中，所提供之合成生物結合物將藉由使得肽聚醣之聚醣部分經由膠原蛋白結合肽(例如RRANAALKAGELYKSILY(SEQ ID NO：1)，稱為「SILY」)繫栓至損傷位點來治療及/或預防腹部黏附。
在另一實施例中，生物結合物包含結合至包含肝素(Hep-SILY)、硫酸皮膚素(DS-SILY)或葡聚醣(Dex-SILY)之聚醣之膠原蛋白結合肽(例如，SILY)。
本發明之組合物可在開放手術期間投與，或經由腹腔鏡或允許進入手術位點之任何儀器投與。
f. 胃食道損傷
在一個實施例中，本發明提供一種解決治療或預防患者之胃食道損傷之未滿足需求的新方法。一般而言，該新方法需要在受傷胃食道組織或細胞上施用包括本發明之合成膠原蛋白結合生物結合物的醫藥組合物。
此組合物施用可產生合成膠原蛋白結合生物結合物之塗層。合成膠原蛋白結合生物結合物可經由物理肽-膠原蛋白相互作用結合於在食道組織上暴露之膠原蛋白。在結合於膠原蛋白時，生物結合物具有多種功能，包括1)充當血小板連接/活化之障壁；2)藉由抑制MMP 通路保護膠原蛋白免於降解；及3)使生長因子FGF-2、FGF-7及FGF-10隔離，因此促進內皮及上皮細胞增殖及遷移，導致組織修復及恢復。
在一個實施例中，膠原蛋白結合生物結合物包括具有共價連接之膠原蛋白結合肽的多醣主鏈。合成生物結合物可為膠原蛋白上之血小板結合位點競爭，且防止血小板結合及活化。聚醣主鏈可帶負電且結合水分子，在膠原蛋白表面上產生親水性障壁，防止血小板與蛋白質黏附。藉由遮蔽所暴露之膠原蛋白而非抑制正常血小板功能，生物結合物可提供解決炎症及內膜增生之級聯初始步驟的局部治療。
預期此新方法適用於治療胃食道損傷，包括(但不限於)由GERD或醫原性介入引起之胃食道損傷。進一步預期以下類別之患者可受益於此方法：
- 需要食道胃十二指腸鏡檢查(EGD)消融之GERD相關食道病變
- 需要EGD擴張之食道狹窄
- 需要EGD處理之消化性潰瘍病(PUD)。
醫藥組合物可局部施用於受傷胃食道組織之一或多個病變。考慮到組織之有限可接近性，預期遞送裝置之使用為有益的。舉例而言，組合物可在食道胃十二指腸鏡檢查(EGD)程序期間或使用食道胃十二指腸鏡遞送。
帕利夫明(Palifermin)為適用於口腔黏膜炎治療之角質細胞生長因子。本發明之生物結合物結合於膠原蛋白且亦結合於內源性或外源性生長因子(諸如帕利夫明)。因此，此類調配物提供帕利夫明之靶向遞送。在一些實施例中，本發明提供一種遞送帕利夫明之方法。在某些實施例中，該方法包含向有其需要之患者施用包含生物結合物及帕利夫明之組合物。在其他實施例中，本發明提供一種治療患者之口腔黏膜炎的方法，其中該方法包含向有其需要之患者施用包含生物結合 物及帕利夫明之組合物。
預期所提供之生物結合物溶液可相對於肽一致性、連接至聚醣之肽的數量及GAG主鏈一致性進行調整，促進受傷胃食道組織恢復。因此，多個分子設計參數可經改造用於優化目標效果。
在一個實施例中，生物結合物包含具有連接之膠原蛋白結合肽的硫酸皮膚素(DS)。DS可能因為其能夠促進上皮細胞遷移及增殖而為有用的。
預期本文所提供之生物結合物之其他變異體亦能夠經由結合於I型膠原蛋白來抑制血小板活化。在一個實施例中，生物結合物包括膠原蛋白結合肽，諸如RRANAALKAGELYKSILY(SEQ ID NO：1)，稱為「SILY」。在另一實施例中，生物結合物包含結合至諸如肝素(Hep-SILY)、硫酸皮膚素(DS-SILY)或葡聚醣(Dex-SILY)之聚醣之膠原蛋白結合肽(SILY)。
在又一實施例中，生物結合物包含肝素及1至5個分支鏈膠原蛋白結合肽，諸如(GQLYKSILY)4-(KRR)2-KGSG(SEQ ID NO：391)。
g. 傷口癒合
本文所描述之方法及組合物可用於治療組織之完整性受損之任何病狀，包括慢性傷口及急性傷口，結締組織傷口，及肌肉、骨骼及神經組織之傷口。如本文所用之「傷口」包括手術切口、燒傷、酸及鹼燒傷、冷燒(凍傷)、曬傷、潰瘍、壓瘡、割傷、擦傷、裂傷、由物理創傷造成之傷口、由先天性病症造成之傷口、由牙周病或牙科手術後造成之傷口及與癌組織或腫瘤相關之傷口。如本文所描述，傷口可包括急性或慢性傷口。
急性傷口係由對完整皮膚之外部損傷造成，且包括手術傷口、咬傷、燒傷、割傷、裂傷、擦傷等。慢性傷口包括例如由損害真皮或上皮組織之完整性的內源性機製造成之彼等傷口，例如腿部潰瘍、 足潰瘍及壓瘡。在本文所描述之任一實施例中，可在任何時間使用促進傷口癒合或減少疤痕形成之組合物來治療慢性或急性傷口。舉例而言，與手術切口相關之急性傷口可在手術之前、在手術期間或在手術之後處理，以在患者中促進傷口癒合及/或減少疤痕形成。在各種說明性態樣中，如本文所描述之組合物可視需要以一劑或多劑投與患者以促進傷口癒合及/或減少疤痕形成。
如本文所用，「減少疤痕形成」包括增加疤痕之最終拉伸強度及/或減小可見疤痕長度。如本文所用，疤痕形成減少亦包括在患者中完全抑制疤痕形成或完全消除可見疤痕。
如本文所用，「促進傷口癒合」意謂使慢性或急性傷口部分或完全癒合，或減少由急性或慢性傷口引起之任一症狀。此類症狀包括疼痛、出血、組織壞死、組織潰爛、疤痕形成及已知由急性或慢性傷口造成之任何其他症狀。
在本文所描述之任一實施例中，提供一種促進傷口癒合之方法。該方法包含向患者投與膠原蛋白結合合成生物結合物之步驟，其中膠原蛋白結合合成生物結合物促進患者之傷口癒合。在本文所描述之各種實施例中之任一者中，膠原蛋白結合合成生物結合物可為異常膠原蛋白結合合成生物結合物或原纖維形成性膠原蛋白結合合成生物結合物，與正常調節膠原蛋白原纖維形成之生物結合物之胺基酸序列的一部分具有胺基酸同源性。
在本文所描述之任一實施例中，提供一種減少疤痕形成之方法。該方法包含向患者投與膠原蛋白結合合成生物結合物之步驟，其中膠原蛋白結合合成生物結合物減少患者之疤痕形成。在本文所描述之各種實施例中之任一者中，膠原蛋白結合合成生物結合物可為異常膠原蛋白結合合成生物結合物或原纖維形成性膠原蛋白結合合成生物結合物，與正常調節膠原蛋白原纖維形成之生物結合物之胺基酸序列 的一部分具有胺基酸同源性。
在本文所描述之任一實施例中，可使促進傷口癒合及/或減少疤痕形成之組合物浸漬至適於遞送組合物至傷口之任何材料中，包括棉花、紙、非編織品、編織品及針織品、單絲、膜、凝膠、海綿等。舉例而言，可使用呈棉花、紙、非編織品、編織品、針織品、膜及海綿形式之手術縫合線(單絲、撚紗或針織紗)、吸收墊、經皮貼片、繃帶、燒傷敷料及包裝。
4.2 選擇素、ICAM/VCAM之結合生物結合物之使用方法
本文所描述之生物結合物可用於抑制血小板結合於內皮，抑制血液中其他細胞結合於所暴露之上皮，抑制血小板活化，抑制血栓症，抑制由剝露內皮產生之炎症，抑制內膜增生及/或抑制血管痙攣。本文所描述之生物結合物亦可刺激內皮細胞增殖，且可結合於血管表面。在此等實施例中之任一者中，此等前述效果可在血管介入程序(諸如基於導管之程序)期間發生。在此等實施例中之任一者中，可使用上文所描述之包含具有至少一個ICAM、VCAM及/或選擇素結合單元之肽的生物結合物中之任一者。
在一個實施例中，本發明提供用於治療罹患與內皮功能障礙相關之疾病的患者之組合物及方法。本發明亦關於對以下一或多者之抑制：血小板結合於內皮、血小板活化、血栓症、由剝露內皮產生之炎症、內膜增生及/或血管痙攣；或其在刺激內皮細胞增殖或結合於剝露血管中之有效性，包含向有其需要之患者投與有效量之本文所提供之組合物。
如本文所提供之ICAM、VCAM及/或選擇素結合生物結合物可減少急性及慢性疾病中內皮功能障礙或損傷之炎症影響。預期此類結合物抑制或減少血小板結合於功能障礙內皮且因此減少血小板介導之炎症。炎症可經由諸如血小板-血小板結合、血小板-白血球結合、促進 白血球滲出之血小板過程或僅自局部及區域細胞因子之血小板釋放來活化。
在一些實施例中，亦提供一種預防或減少罹患內皮功能障礙之血管位點處的炎症之方法。該方法需要向該位點投與包括本發明之ICAM、VCAM及/或選擇素結合生物結合物的醫藥組合物。
如本文所描述，ICAM、VCAM及/或選擇素結合生物結合物靶向內皮選擇素及暴露於血流之ICAM/VCAM及/或選擇素受體，其中其可以足夠時間保持結合以防止血小板結合於剝露內皮，且因此防止血小板活化、血栓症、由剝露內皮產生之炎症、內膜增生及血管痙攣。因此，此等生物結合物可藉由抑制在功能障礙內皮細胞中產生選擇素或ICAM/VCAM來抑制炎症反應。
術語「內皮功能障礙」亦稱為「內皮細胞(EC)功能障礙」、「功能障礙內皮」或「功能障礙內皮細胞」。內皮功能障礙可藉由內皮細胞之細胞表面上的ICAM及VCAM受體或選擇素受體之揭露或暴露來確定。P選擇素及E選擇素為因損傷及炎症而在細胞表面上暫時表現及在功能障礙內皮中長期表現之所暴露的選擇素受體之實例。
在一些實施例中，內皮功能障礙之特徵在於內皮內層滲透或內皮細胞受損。在一些實施例中，內皮功能障礙之特徵在於醣外被(glycocalyx)的減損。在一些實施例中，內皮功能障礙之特徵在於內皮細胞表面上所表現且暴露於循環之選擇素蛋白。在一些實施例中，該位點罹患炎症。
如本文所用之「與內皮功能障礙相關之疾病」係指至少部分由內皮功能障礙引起或誘導內皮功能障礙之人類疾病或病狀。因此，治療與內皮功能障礙相關之疾病係指治療疾病，恢復功能障礙內皮，或預防或改善由功能障礙內皮產生之病狀或症狀，諸如炎症、內膜增生及血栓症。
如所揭示，在一些實施例中，生物結合物可抑制功能障礙內皮細胞以治療、抑制或減弱發炎疾病。功能障礙內皮細胞與炎症及其他發炎疾病相關，如Ley,「The role of selectins in inflammation and disease」，第9卷，Elsevier Science,(2003)所證明。其他發炎疾病及自體免疫疾病之實例包括動脈粥樣硬化、冠狀動脈疾病、糖尿病、高血壓、高膽固醇血症、類風濕性關節炎、全身性紅斑性狼瘡症、青光眼、尿毒症、敗血症及器官衰竭。
藉由抑制選擇素受體產生及遮蔽VCAM/ICAM受體，生物結合物可用於治療罹患此等暫時或慢性疾病之患者。與抑制或減弱此等疾病相關之選擇素抑制之證據係由以下各者支持：Ridings等人，「A dual-binding antibody to E-and L-selectin attenuates sepsis-induced lung injury」，第152卷，American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine,(1995)；Weyrich等人，「In Vivo Neutralization of P-Selectin Protects Feline Heart and Endothelium in Myocardial Ischemia and Reperfusion Injury」，第91卷，The American Society for Clinical Investigation,(1993)，其中每一者以引用的方式併入本文中。此項技術中已知一些癌症亦與炎症及慢性炎症相關，且因此生物結合物可用於治療、抑制或減弱贅生性細胞生長。
在說明性實施例中，本發明之ICAM、VCAM及/或選擇素結合生物結合物可在血管介入程序中使用，包括例如用於防止血小板結合於剝露內皮、血小板活化、血栓症、由剝露內皮產生之炎症、內膜增生及血管痙攣之任一者或組合。本文所描述之生物結合物亦可藉由抑制在功能障礙內皮細胞中產生選擇素或ICAM/VCAM來抑制炎症反應。
在一個實施例中，如在上文所描述之方法中使用之生物結合物包含聚醣及約5至約15個肽，其中肽包含DGEATD(SEQ ID NO：156)、DGEATDGSG(SEQ ID NO：396)、ITDGEA(SEQ ID NO：154)及 /或ITDGEAGSG(SEQ ID NO：395)之至少一個序列，及IELLQAR(SEQ ID NO：117)、IELLQARGSG(SEQ ID NO：393)、IDLMQAR(SEQ ID NO：119)及/或IDLMQARGSG(SEQ ID NO：394)之至少一個序列，且經由醯肼-羰基鍵與聚醣結合。在一個實施例中，聚醣為硫酸皮膚素。
4.3 玻尿酸結合生物結合物之使用方法
a. 軟骨置換
在本文所描述之一個實施例中，提供用於生物材料軟骨置換組合物之添加劑。該添加劑包含用於添加至現有生物材料軟骨置換材料之玻尿酸結合合成生物結合物。玻尿酸結合合成生物結合物之先前所描述之實施例適用於本文所描述之添加劑。
如本文所用，片語「現有生物材料軟骨置換材料」意謂可用於在體內置換受損、有缺陷或缺失之軟骨的生物相容組合物。各種類型之現有生物材料軟骨置換組合物為此項技術中熟知且為預期的。舉例而言，現有生物材料軟骨或骨骼置換組合物包括DeNovo® NT天然組織移植物(Zimmer)、MaioRegenTM(JRI Limited)，或由Biomet製得的冷凍保存骨關節組織之集合。
在一個實施例中，提供一種製備生物材料或骨軟骨置換物之方法。該方法包含使合成生物結合物與現有生物材料或骨軟骨置換材料組合之步驟。玻尿酸結合合成生物結合物之先前所描述之實施例適用於本文所描述之方法。
在一個實施例中，提供一種治療患者之關節炎的方法。該方法包含向患者投與玻尿酸結合合成生物結合物之步驟，其中合成生物結合物減少與關節炎相關之一或多種症狀。玻尿酸結合合成生物結合物之先前所描述之實施例適用於本文所描述之方法。
在各種實施例中，在治療關節炎之方法中使用之合成生物結合 物減少與關節炎相關之一或多種症狀。此項技術中已知與關節炎相關之各種症狀包括(但不限於)疼痛、僵硬、壓痛、炎症、腫脹、發紅、發熱及行動性降低。關節炎之症狀可存在於關節、肌腱或身體之其他部分中。如本文所用，「減少」意謂預防或完全或部分緩解關節炎症狀。
在各種實施例中，關節炎為骨關節炎或類風濕性關節炎。骨關節炎及類風濕性關節炎之發病機制及臨床症狀為此項技術中熟知。在此方法之一個實施例中，合成生物結合物在投與後充當潤滑劑或防止軟骨減損。在另一實施例中，合成生物結合物防止患者之骨接合。舉例而言，合成生物結合物抑制軟骨減少或受損之患者之骨接合骨。
在一個實施例中，提供一種減少或防止患者體內ECM組分降解之方法。舉例而言，提供一種減少或防止患者軟骨中之ECM組分降解之方法。該方法包含向患者投與玻尿酸結合合成生物結合物。玻尿酸結合合成生物結合物之先前所描述之實施例適用於本文所描述之方法。在一個實施例中，合成生物結合物對基質金屬蛋白酶(例如，聚集蛋白聚醣酶)具有抗性。
在另一實施例中，提供一種減少或防止患者體內玻尿酸降解之方法。該方法包含向患者投與玻尿酸結合合成生物結合物。玻尿酸結合合成生物結合物之先前所描述之實施例適用於本文所描述之方法。
在另一實施例中，提供一種減少或防止膠原蛋白降解之方法。該方法包含以下步驟：使玻尿酸結合合成生物結合物與玻尿酸在膠原蛋白存在下接觸；及減少或防止膠原蛋白降解。玻尿酸結合合成生物結合物之先前所描述之實施例適用於本文所描述之方法。
在另一實施例中，提供一種減少或防止硫酸軟骨素降解之方法。該方法包含以下步驟：使玻尿酸結合合成生物結合物與玻尿酸在膠原蛋白存在下接觸；及減少或防止硫酸軟骨素降解。玻尿酸結合合 成生物結合物之先前所描述之實施例適用於本文所描述之方法。
「減少ECM組分降解」，例如玻尿酸、膠原蛋白或硫酸軟骨素降解意謂分別完全或部分減少玻尿酸、膠原蛋白或硫酸軟骨素之降解。
在一個實施例中，在患者體內「減少玻尿酸降解」意謂降低玻尿酸降解速率。在一個實施例中，「減少膠原蛋白降解」意謂降低膠原蛋白降解速率。在一個實施例中，「減少硫酸軟骨素」降解意謂降低硫酸軟骨素降解速率。
在本文所描述之一個實施例中，提供一種校正或修改患者體內組織缺陷之方法。該方法包含向缺陷經校正或修改之組織缺陷投與玻尿酸及玻尿酸結合合成生物結合物。玻尿酸結合合成生物結合物之先前所描述之實施例適用於本文所描述之方法。在一個實施例中，組織缺陷為外觀缺陷。
在一個實施例中，在上文所描述之方法中使用之生物結合物包含硫酸軟骨素及約5至約10個肽，其中肽包含GAHWQFNALTVR(SEQ ID NO：58)或GAHWQFNALTVRGSG(SEQ ID NO：357)之至少一個序列，且經由醯肼-羰基鍵與硫酸軟骨素結合。
4.4 其他
a. 角膜傷口
本發明之方法適用於與角膜傷口癒合相關之多種應用。在一個實施例中，需要治療之角膜傷口病狀係由於創傷性角膜損傷。(Chiapella,A.P.,Rosenthal,A.R.British Journal of Ophthalmology,1985；69：865-870)。在另一實施例中，需要治療之傷口病狀係由諸如Epi-Lasik誘導角膜損傷之眼科程序造成(Tuft,S.J.等人，Br J Ophthalmol.1993；77：243-247)。在一些情況下，可能由於沒有癒合或不完全癒合而發生持續性缺陷或復發性損傷(Kenyon,K.R.Cornea and Refractive Atlas of Clinical Wisdom.S.A.Melki及M.A.Fava編. SLACK,Inc.：New Jersey,US,2011；第39頁)。預期本發明之方法適用於治療此等持續性缺陷或復發性損傷。
在一個態樣中，角膜上皮損傷導致角膜障壁功能破壞，且預期本文所描述之方法適用於治療該損傷。
本文所提供之生物結合物可用於藉由向有其需要之患者投與靶向牽涉於角膜傷口癒合中之特定胞外基質組分之生物結合物來促進患者之角膜傷口癒合。預期本文所提供之生物結合物可相對於肽一致性、連接至聚醣之肽的數量及聚醣一致性進行調整以促進角膜傷口癒合。因此，多個分子設計參數可經改造用於優化目標效果。
預期用包含硫酸皮膚素及膠原蛋白結合肽(例如RRANAALKAGELYKSILY(SEQ ID NO：1)，稱為「SILY」)之生物結合物治療藉由結合於損傷區域、提供保護性水合層，以使疼痛降至最低、保護角膜膠原蛋白免於降解及/或促進上皮遷移及/或上皮增殖來增強角膜傷口癒合。進一步預期生物結合物會在受傷區域中存留以便不需要每天多次治療。
b. 潤滑素(Lubricin)模擬物
本文所描述之合成生物結合物可適用於置換、復原或補充具有膠原蛋白及玻尿酸之組織，諸如軟骨、滑液及玻璃體。特定言之，具有膠原蛋白結合肽及玻尿酸結合肽之肽聚醣可尤其適用作潤滑素模擬物及用於下文所描述之方法及用途中。
軟骨變性.關節軟骨上之良好潤滑表面導致滑膜關節之最佳功能。然而，由於發生在骨關節炎中，潤滑減少導致軟骨降解及原纖維化，繼而造成關節功能障礙及疼痛。潤滑減少亦導致其他形式之關節炎，包括類風濕性關節炎之關節功能障礙及疼痛。
本文所提供之合成生物結合物可用於模擬潤滑素之一些功能，潤滑素為由動物關節之內表面內層組織分泌之黏液性醣蛋白。因此， 合成生物結合物有可能增強關節軟骨表面之潤滑，籍此減少磨損誘導之軟骨侵蝕。合成生物結合物亦有可能保護大分子，如玻尿酸及II型膠原蛋白免於酶誘導之降解。
因此，提供一種治療及/或預防患者之軟骨變性的方法，其包含向有其需要之患者投與包含本文所描述之胞外基質結合合成生物結合物的醫藥組合物。在一個實施例中，藉由向滑膜腔中注射包含胞外基質結合合成生物結合物之醫藥組合物來治療患者。
亦預期合成生物結合物可用於藉由保護關節軟骨基質免於創傷性及細胞因子誘導之酶降解來治療及/或預防關節軟骨疾病。
玻璃體變性. 玻璃體為填充眼睛後腔之黏彈性凝膠狀物質。已使用玻璃體置換物來置換功能障礙玻璃體，例如在已發生玻璃體渾濁或物理破裂及液化之情況下，且在視網膜手術期間用作暫時或永久玻璃體置換物。適合之玻璃體置換物應為透明、生物相容的，且具有接近於天然玻璃體之密度及折射率。
因此，提供一種治療及/或預防患者之玻璃體變性的方法，其包含向有其需要之患者投與包含本文所描述之胞外基質結合合成生物結合物的醫藥組合物。
髓核變性. 髓核為存在於脊椎盤中之凝膠狀物質，且用於在各盤內在壓縮負荷下沿所有方向分配液壓，且由軟骨細胞樣細胞、膠原纖維及經由玻尿酸鏈聚集之生物結合物聚集蛋白聚醣組成。髓核變性導致盤在椎體之間均勻且有效傳輸負荷之能力降低，且導致盤之環形區域(稱為纖維環)損壞。環中之裂隙或裂縫可轉變為突出或破裂之盤，導致對盤區中之神經的衝擊及最終下背或腿部疼痛。
亦嘗試僅置換髓核。預期髓核之置換遏制變性核之初始脫水且使盤返回至完全水合狀態，使得變性過程(包括相關疼痛)被推遲或防止且使機械功能恢復至椎段。
預期本文所描述之合成生物結合物會結合且保護纖維環。因此，提供一種治療及/或預防患者之纖維環變性的方法，其包含向有其需要之患者投與包含本文所描述之胞外基質結合合成生物結合物的醫藥組合物。亦提供一種治療及/或預防患者之髓核變性的方法，其包含向有其需要之患者投與包含本文所描述之胞外基質結合合成生物結合物的醫藥組合物。
在一個實施例中，在上文所描述之方法中使用之生物結合物包含硫酸軟骨素及約1至約20個肽，其中肽包含GAHWQFNALTVR(SEQ ID NO：58)或GAHWQFNALTVRGSG(SEQ ID NO：357)之至少一個序列，及WYRGRL(SEQ ID NO：29)或WYRGRLGSG(SEQ ID NO：392)之至少一個序列。
在一個實施例中，在上文所描述之方法中使用之生物結合物包含硫酸軟骨素及約1至約20個肽，其中肽包含GAHWQFNALTVR(SEQ ID NO：58)或GAHWQFNALTVRGSG(SEQ ID NO：357)之至少一個序列，及RRANAALKAGELYKSILY(SEQ ID NO：1)或RRANAALKAGELYKSILYGSG(SEQ ID NO：287)之至少一個序列。
5. 組合物
在一個實施例中，生物結合物以組合物形式投與。本發明提供包含生物結合物及醫藥學上可接受之載劑的組合物。可使用一般熟習此項技術者已知之醫藥學上可接受之載劑，包括水或鹽水。如此項技術中已知，組分以及其相對量係藉由預期用途及遞送方法確定。用於組合物中之稀釋劑或載劑可經選擇使得其不削弱所要之生物結合物效果。適合組合物之實例包括水溶液，例如等滲鹽水(5%葡萄糖)溶液。可使用其他熟知之醫藥學上可接受之液體載劑，諸如醇、二醇、酯及醯胺。在某些實施例中，組合物進一步包含一或多種賦形劑，諸如(但不限於)離子強度調節劑、溶解度增強劑、糖(諸如甘露糖醇或山梨 糖醇)、PH緩衝劑、界面活性劑、穩定聚合物、防腐劑及/或共溶劑。
在某些實施例中，組合物為水溶液。水溶液適用於組合物調配物中，此係基於容易調配以及能夠容易藉助於灌輸溶液投與此類組合物。在某些實施例中，組合物為懸浮液、黏性或半黏性凝膠或其他類型之固體或半固體組合物。在一些實施例中，組合物呈此項技術中非常熟知之泡沫、軟膏、液體洗滌液、凝膠、噴霧劑及脂質體形式。或者，局部投與為經由選自泵-導管系統、連續或選擇性釋放裝置或黏附障壁之裝置向治療位點輸注所提供之生物結合物。在某些實施例中，組合物為直接施用於或接觸靜脈或動脈之內壁的溶液。在一些實施例中，組合物包含聚合物基質。在其他實施例中，組合物為可吸收的。在某些實施例中，組合物包含pH緩衝劑。在一些實施例中，組合物含有潤滑性增強劑。
在某些實施例中，聚合物基質或聚合材料用作用於組合物之醫藥學上可接受之載劑或載體。本文所描述之聚合材料可包含天然或非天然聚合物，例如糖、肽、蛋白質、層黏連蛋白、膠原蛋白、玻尿酸、離子及非離子水溶性聚合物；丙烯酸聚合物；親水性聚合物，諸如聚氧化乙烯、聚氧化乙烯-聚氧化丙烯共聚物及聚乙烯醇；纖維素聚合物及纖維素聚合物衍生物，諸如羥丙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯、甲基纖維素、羧甲基纖維素及醚化纖維素；聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、乳酸與乙醇酸共聚物或其他天然及合成之聚合劑。在某些實施例中，本文所提供之組合物被調配為膜、凝膠、泡沫或/及其他劑型。
適合之離子強度調節劑包括例如甘油、丙二醇、甘露糖醇、葡萄糖、右旋糖、山梨糖醇、氯化鈉、氯化鉀及其他電解質。
在某些實施例中，生物結合物之溶解度可能需要增強。在該等情況下，溶解度可藉由使用適當調配技術增加，諸如併入溶解度增強 組合物，諸如甘露糖醇、乙醇、甘油、聚乙二醇、丙二醇、泊洛沙姆(poloxomer)及此項技術中已知之其他物質。
在某些實施例中，組合物含有潤滑性增強劑。如本文所用，潤滑性增強劑係指能夠調節醫藥學上可接受之載劑的黏度之一或多種醫藥學上可接受之聚合材料。適合聚合材料包括(但不限於)：離子及非離子水溶性聚合物；玻尿酸及其鹽、硫酸軟骨素及其鹽、聚葡萄糖、明膠、聚葡萄胺糖、膠凝糖、其他生物結合物或多醣或其任何組合；纖維素聚合物及纖維素聚合物衍生物，諸如羥丙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯、甲基纖維素、羧甲基纖維素及醚化纖維素；膠原蛋白及經修飾之膠原蛋白；半乳甘露聚醣，諸如瓜爾豆膠、刺槐豆膠及刺雲豆膠，以及來源於前述天然樹膠及含有甘露糖及/或半乳糖部分作為主要結構組分之類似的天然或合成樹膠(例如，羥丙基瓜爾膠)之多醣；樹膠，諸如黃蓍膠及三仙膠；膠凝糖膠；海藻酸鹽及海藻酸鈉；聚葡萄胺糖；乙烯基聚合物；親水性聚合物，諸如聚氧化乙烯、聚氧化乙烯-聚氧化丙烯共聚物及聚乙烯醇；羧乙烯基聚合物或交聯丙烯酸聚合物，諸如「卡波姆(carbomer)」家族聚合物，例如可以CarbopolTM商標市售獲得之羧基聚伸烷基；及各種其他黏性或黏彈性物質。在一個實施例中，潤滑性增強劑選自由以下組成之群：玻尿酸、皮膚素、軟骨素、肝素、乙醯肝素、角蛋白、葡聚醣、殼聚醣、海藻酸鹽、瓊脂糖、明膠、羥丙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯、甲基纖維素、羧甲基纖維素及醚化纖維素、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚維酮、卡波姆941、卡波姆940、卡波姆971P、卡波姆974P或其醫藥學上可接受之鹽。在一個實施例中，潤滑性增強劑與生物結合物並行施用。或者，在一個實施例中，潤滑性增強劑與生物結合物依次施用。在一個實施例中，潤滑性增強劑為硫酸軟骨素。 在一個實施例中，潤滑性增強劑為玻尿酸。潤滑性增強劑可改變組合物之黏度。
關於上述潤滑性增強劑之結構、化學特性及物理特性之其他細節，參見例如U.S.5,409,904、U.S.4,861,760(膠凝糖膠)、U.S.4,255,415、U.S.4,271,143(羧乙烯基聚合物)、WO 94/10976(聚乙烯醇)、WO 99/51273(三仙膠)及WO 99/06023(半乳甘露聚醣)。通常，使用非酸性潤滑性增強劑，諸如中性或鹼性試劑，以便促進實現所要之調配物pH。
在一些實施例中，生物結合物可與以下各者組合：礦物質、胺基酸、糖、肽、蛋白質、維生素(諸如抗壞血酸)；或層黏連蛋白、膠原蛋白、纖維結合蛋白、玻尿酸、纖維蛋白、彈性蛋白或聚集蛋白聚醣；或生長因子，諸如表皮生長因子、血小板衍生之生長因子、轉型生長因子β或纖維母細胞生長因子；及糖皮質激素，諸如地塞米松(dexamethasone)或黏彈性改變劑，諸如離子及非離子水溶性聚合物；丙烯酸聚合物；親水性聚合物，諸如聚氧化乙烯、聚氧化乙烯-聚氧化丙烯共聚物及聚乙烯醇；纖維素聚合物及纖維素聚合物衍生物，諸如羥丙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯、甲基纖維素、羧甲基纖維素及醚化纖維素；聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、乳酸與乙醇酸共聚物或其他天然及合成之聚合劑。
適用於本文組合物之pH緩衝劑包括例如乙酸鹽、硼酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽及磷酸鹽緩衝劑；以及鹽酸、氫氧化鈉、氧化鎂、磷酸一鉀、碳酸氫鹽、氨、碳酸、鹽酸、檸檬酸鈉、檸檬酸、乙酸、磷酸氫二鈉、硼砂、硼酸、氫氧化鈉、二乙基巴比妥酸及蛋白質；以及各種生物緩衝劑，例如TAPS、Bicine、Tris、Tricine、HEPES、TES、MOPS、PIPES、二甲胂酸鹽或MES。在某些實施例中，添加適當緩 衝系統(例如，磷酸鈉、乙酸鈉、檸檬酸鈉、硼酸鈉或硼酸)至組合物以防止pH在儲存條件下變動。在一些實施例中，緩衝劑為磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)溶液(亦即，含有磷酸鈉、氯化鈉且在一些調配物中氯化鉀及磷酸鉀)。特定濃度將視所用試劑而不同。在某些實施例中，添加pH緩衝系統(例如，磷酸鈉、乙酸鈉、檸檬酸鈉、硼酸鈉或硼酸)以維持在約pH 4至約pH 8，或約pH 5至約pH 8，或約pH 6至約pH 8，或約pH 7至約pH 8之範圍內的pH。在一些實施例中，選擇緩衝劑以維持在約pH 4至約pH 8範圍內之pH。在一些實施例中，pH為約pH 5至約pH 8。在一些實施例中，緩衝劑為鹽水緩衝劑。在某些實施例中，pH為約pH 4及約pH 8，或約pH 3至約pH 8，或約pH 4至約pH 7。在一些實施例中，組合物呈膜、凝膠、貼片或包含聚合基質、pH緩衝劑、潤滑性增強劑及生物結合物之液體溶液形式，其中組合物視情況含有防腐劑；且其中該組合物之pH在約pH 4至約pH 8範圍內。
在組合物中使用界面活性劑來遞送較高濃度之生物結合物。界面活性劑之功能為溶解抑制劑且穩定膠體分散液，諸如膠束溶液、微乳液、乳液及懸浮液。適合界面活性劑包含c聚山梨醇酯、泊洛沙姆(poloxamer)、多醣基40硬脂酸酯、聚氧乙烯蓖麻油、泰洛沙泊(tyloxapol)、曲拉通(triton)及脫水山梨糖醇單月桂酸酯。在一個實施例中，界面活性劑具有在12.4至13.2範圍內之親水/親油/平衡(HLB)，且可接受用於眼科用途，諸如TritonX114及泰洛沙泊。
在某些實施例中，向組合物添加穩定聚合物，亦即緩和劑。穩定聚合物應為離子/帶電實例，更特定言之可展現物理穩定性之(-)10-50mV ξ電位且能夠在水中製得分散液(亦即水溶性)之表面帶負電聚合物。在一個實施例中，穩定聚合物包含範圍為約0.1%至約0.5%w/w之來自交聯聚丙烯酸酯家族之一種或一種以上聚電解質，諸如卡波姆及Pemulen®，特定言之卡波姆974p(聚丙烯酸)。
在一個實施例中，組合物包含增加生物結合物滲透至血管之胞外基質之試劑。較佳地，增加滲透性之試劑選自氯化苯甲烴銨、皂苷、脂肪酸、聚氧化乙烯脂肪醚、脂肪酸烷基酯、吡咯啶酮、聚乙烯吡咯啶酮、丙酮酸、焦麩胺酸或其混合物。
生物結合物可經滅菌以移除非所需摻雜物，包括(但不限於)內毒素及傳染劑。可使用並未不利地影響生物結合物之結構及生體特性之滅菌技術。在某些實施例中，生物結合物可使用習知滅菌技術來殺菌及/或滅菌，包括環氧丙烷或環氧乙烷處理、無菌過濾、氣體電漿滅菌、γ輻射、電子束及/或用過酸(諸如過氧乙酸)滅菌。在一個實施例中，生物結合物可經受一或多個滅菌過程。或者，生物結合物可被包裹在任何類型之包括塑膠包裹物或箔包裹物之容器中，且可進一步滅菌。
在一些實施例中，添加防腐劑至組合物以防止在使用期間微生物污染。添加至組合物之適合防腐劑包含氯化苯甲烴銨、苯甲酸、對羥基苯甲酸烷基酯、苯甲酸烷基酯、氯丁醇、氯甲酚、鯨蠟醇、脂肪醇(諸如十六醇)、汞之有機金屬化合物(諸如乙酸鹽、硝酸苯汞或硼酸鹽)、重氮利定脲、己二酸二異丙酯、二甲基聚矽氧烷、EDTA鹽、維生素E及其混合物。在某些實施例中，防腐劑選自氯化苯甲烴銨、氯丁醇、苄十二烷基溴化銨(benzododecinium bromide)、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、苯乙醇、依地酸二鈉、山梨酸或聚四級銨鹽-1(polyquarternium-1)。在某些實施例中，組合物包含防腐劑。在一些實施例中，防腐劑以約0.001%至約1.0%w/v之含量使用。在某些實施例中，組合物不含防腐劑且稱為「無防腐劑的」。在一些實施例中，單位劑量組合物為無菌但無防腐劑的。
在一些實施例中，生物結合物及其他試劑之單獨或依次投與為促進組合物遞送所必需。在某些實施例中，生物結合物及另一種試劑 可以不同給藥頻率或時間間隔投與。舉例而言，生物結合物可每日投與，而另一種試劑可較不頻繁投與。另外，如熟習此項技術者將顯而易知，生物結合物及另一種試劑可使用相同投與途徑或不同投與途徑投與。
可使用用於投與生物結合物之任何有效方案。舉例而言，生物結合物可以單次劑量或多次劑量每日方案投與。此外，例如每週一至五天之錯開方案可用作每日治療之替代方案。
在各種實施例中，生物結合物可局部投與，諸如藉由膜、凝膠、貼片或液體溶液。在一些實施例中，所提供之組合物呈緩衝無菌水溶液形式。在某些實施例中，溶液之黏度為約1至約100厘泊(cp)，或約1至約200cp，或約1至約300cp，或約1至約400cp。在一些實施例中，溶液之黏度為約1至約100cp。在某些實施例中，溶液之黏度為約1至約200cp。在某些實施例中，溶液之黏度為約1至約300cp。在某些實施例中，溶液之黏度為約1至約400cp。在某些實施例中，溶液呈可注射液體溶液形式。在其他實施例中，組合物被調配為黏性液體(亦即黏度為幾百至幾千cp)、凝膠或軟膏。在此等實施例中，使生物結合物分散或溶解於適當的醫藥學上可接受之載劑中。
與生物結合物一起用於基於導管之遞送之例示性組合物可包含：a)如本文所描述之合成生物結合物；b)醫藥學上可接受之載劑；c)聚合物基質；d)pH緩衝劑，提供在約pH 4至約pH 8範圍內之pH；及e)水溶性潤滑性增強劑，濃度範圍為約0.25%至約10%總式量，或任何個別組分a)、b)、c)、d)或e)，或a)、b)、c)、d)或e)之任何組合。
例示性調配物可包含：a)如本文所描述之生物結合物；b)醫藥學上可接受之載劑；c)聚合物基質；及d)pH緩衝劑，提供在約pH 4至約pH 8範圍內之pH，其中就液體溶液而言該溶液之黏度為約3至約30 cp。
本發明預期亦可用於藉由注射投與之例示性組合物包括水性或油性懸浮液，或乳液與芝麻油、玉米油、棉籽油或花生油，以及酏劑、甘露糖醇、右旋糖或無菌水溶液，及類似的醫藥媒劑。鹽水溶液亦習知地用於注射，但在本發明背景非首選。亦可使用乙醇、甘油、丙二醇、液體聚乙二醇及其類似物(及其適合混合物)、環糊精衍生物及植物油。可例如藉由使用包衣(諸如卵磷脂)、藉由維持所需粒徑(在分散液之情況下)及藉由使用界面活性劑來維持適當流動性。微生物作用之預防可藉由各種抗菌劑及抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞及其類似物來實現。
藉由在具有如上文列舉之各種其他成分的適當溶劑中併入所需量之組分，視需要隨後過濾滅菌來製備無菌可注射溶液。一般而言，藉由將各種滅菌活性成分併入含有基本分散介質及上文列舉之彼等成分之所需其他成分的無菌媒劑中來製備分散液。在用於製備無菌可注射溶液之無菌粉末情況下，較佳製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥技術，該等技術會由其先前無菌過濾溶液產生活性成分與任何額外所需成分之粉末。
在製造包括本文所描述之生物結合物的醫藥組合物中，活性成分通常藉由賦形劑或載劑稀釋及/或密封於可呈膠囊、藥囊、紙或其他容器形式之此類載劑內。當使用賦形劑作為稀釋劑時，其可為固體、半固體或液體材料(如上所述)，其充當活性成分之媒劑、載劑或介質。因此，組合物可呈以下形式：膜、凝膠、貼片、粉末、口含錠、藥囊、扁囊劑、酏劑、懸浮液、乳液、溶液、糖漿、氣溶膠(呈固體狀或呈液體介質形式)、含有例如高達10重量%活性化合物之軟膏、軟及硬的明膠膜、凝膠、貼片、無菌可注射溶液及無菌封裝粉末。
適合賦形劑之一些實例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、澱粉、阿拉伯膠、磷酸鈣、海藻酸鹽、黃蓍膠、明膠、矽酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯啶酮、纖維素、無菌水、糖漿及甲基纖維素。調配物可另外包括：潤滑劑，諸如滑石、硬脂酸鎂及礦物油；濕潤劑；乳化劑及懸浮劑；防腐劑，諸如羥基苯甲酸甲酯及羥基苯甲酸丙酯；甜味劑；及調味劑。
用於藥物遞送之膜為此項技術中熟知且包含無可瀝濾雜質之無毒無刺激聚合物，諸如多醣(例如，纖維素、麥芽糊精等)。在一些實施例中，聚合物為親水性的。在其他實施例中，聚合物為疏水性的。膜黏附至其所施用之組織，且歷經約一週時段緩慢吸收至體內。在本文所描述之薄膜劑型中使用之聚合物為可吸收的，且展現如此項技術中熟知之足夠的剝離、剪切及拉伸強度。在一些實施例中，膜為可注射的。在某些實施例中，在手術介入之前、期間或之後，向患者投與膜。
凝膠在本文中用於指可具有在軟而弱至硬而堅韌範圍內的特性之固體膠狀材料。如此項技術中所熟知，凝膠為由流體貫穿其整個體積膨脹之非流體膠體網路或聚合物網路。水凝膠為一種類型之凝膠，其包含親水性，有時發現為膠體凝膠(其中水為分散介質)之聚合物鏈之網路。水凝膠為高吸收性的，且可含有高度之水，諸如大於90%水。在一些實施例中，本文所描述之凝膠包含天然或合成聚合物網路。在一些實施例中，凝膠包含親水性聚合物基質。在其他實施例中，凝膠包含疏水性聚合物基質。在一些實施例中，凝膠具有非常類似於天然組織之柔性程度。在某些實施例中，凝膠為生物相容且可吸收的。在某些實施例中，在手術介入之前、期間或之後，向患者投與凝膠。
如本文所用之液體溶液係指此項技術中熟知之溶液、懸浮液、 乳液、滴劑、軟膏、液體洗滌液、噴霧劑、脂質體。在一些實施例中，液體溶液含有在添加少量酸或鹼時抵抗pH變化之水性pH緩衝劑。在某些實施例中，在手術介入之前、期間或之後，向患者投與液體溶液。
例示性調配物可包含：a)一或多種如本文所描述之生物結合物；b)醫藥學上可接受之載劑；及c)親水性聚合物作為基質網路，其中該等組合物被調配為黏性液體(亦即，黏度為幾百至幾千cp)、凝膠或軟膏。在此等實施例中，使生物結合物分散或溶解於適當的醫藥學上可接受之載劑中。
在某些實施例中，生物結合物或包含其的組合物係在調配之前、期間或之後凍乾。因此，本文亦提供一種包含如本文所描述之生物結合物或包含其的組合物之凍乾組合物。
6. 給藥
生物結合物之適合劑量可藉由標準方法，例如藉由在實驗室動物模型或臨床試驗中建立劑量反應曲線來確定，且可視患者條件、待治療之疾病病況、投與途徑及組織分佈及共使用其他治療處理之可能性而顯著變化。待向患者投與之有效量係基於體表面積、患者重量或質量及醫師對患者條件之評估。在各種例示性實施例中，劑量在約0.01μg至約10g範圍內。舉例而言，對於全身遞送，劑量可為約10g，或約5g，或約1g。在其他說明性實施例中，有效劑量在以下範圍內：每劑約100μg至約10g，或每劑約100μg至約1g，或每劑約100μg至約500mg，每劑約0.01μg至約100mg，或每劑約100μg至約50mg，或每劑約500μg至約10mg，或每劑約1mg至10mg，或每劑約1至約100mg，或每劑約1mg至500mg，或每劑約1mg至200mg，或每劑約10mg至100mg，或每劑約10mg至75mg，或每劑約10mg至50mg，或每劑約10mg，或每劑約20mg，或每劑約30mg，或每劑約 40mg，或每劑約50mg，或每劑約60mg，或每劑約70mg，或每劑約80mg，或每劑約90mg，或每劑約100mg。在本文所描述之各種實施例中之任一者中，有效劑量在以下範圍內：每劑約0.01μg至約1000mg，每劑1μg至約100mg，約100μg至約1.0mg，約50μg至約600μg，約50μg至約700μg，約100μg至約200μg，約100μg至約600μg，約100μg至約500μg，約200μg至約600μg，或每劑約100μg至約50mg，或每劑約500μg至約10mg或每劑約1mg至約10mg。
在一些實施例中，組合物以多劑量形式封裝。因此，需要防腐劑來防止在使用期間微生物污染。在某些實施例中，可添加如上文所描述之適合防腐劑至組合物。在一些實施例中，組合物含有防腐劑。在某些實施例中，防腐劑以約0.001%至約1.0%w/v之含量使用。在一些實施例中，單位劑量組合物為無菌但無防腐劑的。
實例 實例1. EDC官能化方案(Hep-SILY)
材料
用適當濃度之離液劑，諸如丁醇、乙醇、氯化鈲、過氯酸鋰、乙酸鋰、氯化鎂、苯酚、丙醇、十二烷基硫酸鈉、硫脲或脲(例如，約5M至約10M脲)製備適合之反應緩衝劑(例如，2-(N-(N-嗎啉基))乙磺酸(MES))。用1N HCl將最終pH調節至約4.5至約6之pH。
使肽(例如，RRANAALKAGELYKSILYGSG-NHNH2(SEQ ID NO：397)(MW=2253Da，結構展示於下文中))溶解於反應緩衝劑中，達到3mg/mL。通常在偶合反應之前新鮮製備肽溶液。
使生物素標記肽(例如，生物素RRANAALKAGELYKSILYGSG-NHNH2(SEQ ID NO：398)(MW=2479Da))溶解於反應緩衝劑中，達到3mg/mL。通常在偶合反應之前，新鮮製備所得經標記之肽溶液。
使聚醣(例如，肝素(MW平均=16kDa))溶解於反應緩衝劑中，達到20mg/mL，且在偶合反應之前，儲存在-20℃下或新鮮製備。
使EDC(1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳化二亞胺)在反應緩衝劑中溶解，達到75mg/mL，隨後立即添加至聚醣。
結合-含肝素生物結合物(100mg)
藉由添加50莫耳過量的1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳化二亞胺(EDC)(59.3mg或0.79mL，以75mg/mL溶解於水中)至肝素中，使肝素活化。使起始材料在室溫下反應約5分鐘。隨後以1：1莫耳比(肝素：經標記之肽)添加經標記之肽至經活化之肝素中(15.3mg或5.1mL，3mg/mL於反應緩衝劑中)。隨後使反應混合物在室溫下震盪約5分鐘。在震盪的同時，以1：7莫耳比(Hep：肽)添加肽(97.3mg或32.4mL，3mg/mL於反應緩衝劑中)。隨後使組分在震盪的同時在室溫下反應約2小時。在所分配的時間之後，藉由在震盪的同時在室溫下用0.5M NaOH(大約4.5mL)使pH升高至8持續約30分鐘，使反應淬滅。
使用5管柱體積(CV)之反應緩衝劑(大約250mL)，隨後10CV水(大約500mL)在大約15psi下在TMP下以35mL/min流動速率經由滲濾器(Spectrum-MidiKros mPES 10K中空管過濾器)純化所得Hep-SILY生物結合物。隨後使保留物(亦即，最終產物)冷凍在-80℃下。視情況，使產物凍乾至乾燥。
實例2. 如藉由血小板因子4(PF4)所量測之血小板抑制
使用以下方法評估本文所揭示之生物結合物對血小板抑制之影響。用纖維狀膠原蛋白塗佈微量培養盤，且隨後用1%牛奶阻斷。生物結合物在1×PBS中以1mg/mL起始稀釋且使用10倍濃度因子用 1×PBS稀釋，且添加50μL溶液至經膠原蛋白塗佈之孔中。使處理物在室溫下培育15分鐘。隨後藉由移除處理溶液及用1×PBS沖洗三次來沖洗各孔之未結合處理物。
藉由靜脈穿刺自健康志願者收集人全血。丟棄前5mL血液，且隨後將大約15mL收集至檸檬酸化玻璃採血管(BD Bioscience)中。使血液在玻璃管中在200g下在25℃下離心20分鐘。使用離心血液之頂層，即富含血小板血漿，進行血小板實驗。
在室溫下添加富含血小板血漿(50微升/孔)至微量培養盤中持續1小時。在1小時培育之後，自各孔移出45mL富含血小板血漿且添加至含有5mL ETP(107mM EDTA、12mM茶鹼及2.8mM前列腺素E1)之微量離心機管中以抑制進一步血小板活化。使此等管在4℃下在2000g下旋轉30分鐘以集結血小板。收集上清液用於ELISA研究來測試血小板活化標記物之存在。使用夾心ELISA以便偵測各蛋白質。用於兩種夾心ELISA之組分係購自R&D Systems，且遵循所提供之方案。有必要在含1%BSA之1×PBS中稀釋血小板血清，以使值落在分析之線性範圍內。經由血小板因子4(PF-4)之釋放來量測血小板活化。
實例3. 原纖維形成分析
使用以下方法評估本文所揭示之生物結合物對原纖維形成之影響。藉由將2mg/mL膠原蛋白/HCl在2×TES緩衝劑(60mM TES、60mM Na2HPO4、300mM NaCl)中稀釋至1mg/mL且保持在冰上來製備膠原蛋白溶液。使含有生物結合物之測試樣品在1×磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)溶液中溶解達到0.6mg/mL最終濃度，且亦保持在冰上。以1：1比率(體積：體積)添加測試樣品至膠原蛋白中，使得最終膠原蛋白濃度為0.5mg/mL。隨後藉由渦旋使膠原蛋白測試溶液充分混合。
藉由監測在37℃下培育期間膠原蛋白測試溶液之濁度(在313nm 下之吸收度)來量測原纖維形成。以100微升/孔將樣品用移液管移至96孔培養盤。使微量培養盤讀取器保持在37℃下，且長達60分鐘每隔一分鐘監測濁度。
實例4. 膠原蛋白結合培養盤分析
使用以下方法評估本文所揭示之生物結合物對膠原蛋白之結合親和力。使用類似分析評估其他標靶(例如，玻尿酸、ICAM、VCAM、選擇素)之結合親和力。
藉由培養盤分析比較生物結合物變異體之膠原蛋白結合，其中在96孔培養盤上塗佈膠原蛋白。在高結合培養盤上在室溫下以50μg/mL(在0.02N乙酸中)塗佈膠原蛋白持續1小時。用1×PBS pH 7.4沖洗未結合膠原蛋白。隨後使培養盤在1%牛奶/1×PBS溶液中在室溫下阻斷1小時。
使含有生物素標記肽之生物結合物變異體在1%牛奶/1×PBS pH 7.4中溶解達到1mg/mL最終濃度。由此溶液進行10倍連續稀釋。隨後在經阻斷之膠原蛋白塗佈培養盤上培育分子且在室溫下培育15分鐘。隨後用1×PBS/1%BSA及0.2%Tween20沖洗培養盤3次。
藉由抗生蛋白鏈菌素-HRP偵測結合分子，抗生蛋白鏈菌素-HRP在具有1%BSA及0.2%Tween20之1×PBS中以1：500稀釋且在室溫下以200微升/孔培育20分鐘。用具有0.2%Tween20之1×PBS自培養盤沖洗抗生蛋白鏈菌素溶液3次。隨後在室溫下以100微升/孔添加TMB基質溶液至各孔中持續15分鐘，且用100μL硫酸溶液(0.16M)停止顏色演變。隨後在450nm下量測孔中之吸收度，且藉由吸收度與濃度在劑量-反應中標繪結合親和力。
實例5. 玻尿酸結合生物結合物之比較
此實例展示如本文所描述之包含具有玻尿酸結合單元之肽的生物結合物與如U.S.2014/0301983中所描述之玻尿酸結合生物結合物相 比，展現玻尿酸結合親和力出乎意料地增強。
生物結合物
如本文所描述之具有醯肼-羰基鍵之玻尿酸結合生物結合物係根據上述實例1使用硫酸軟骨素及GAH肽(亦即，GAHWQFNALTVRGSG-NHNH2(SEQ ID NO：399))及STM肽(亦即，STMMSRSHKTRSHHVGSG-NHNH2(SEQ ID NO：400))製備。具有醯肼-羰基鍵之玻尿酸結合生物結合物之生物素標記型式亦根據上述實例1使用硫酸軟骨素及經標記之GAH肽(亦即，生物素GAHWQFNALTVRGSG-NHNH2(SEQ ID NO：401))及經標記之STM肽(亦即，生物素STMMSRSHKTRSHHVGSG-NHNH2(SEQ ID NO：402))製備。
玻尿酸結合生物結合物使用氧化硫酸軟骨素及經由BMPH連接子與GGGC間隔基一起之GAH肽(亦即，GAHWQFNALTVRGGGC(SEQ ID NO：403))，如U.S.2014/0301983(其以全文引用的方式併入本文中)中所描述。使用生物素標記硫酸軟骨素作為對照(圖1A)。
併入分析
為評估聚集蛋白聚醣模擬物與玻尿酸之結合，按照製造商之方案(ESI BIO)合成HyStem水凝膠。簡言之，使Glycosil(經硫醇修飾之玻尿酸)、Extralink-lite(聚乙二醇二丙烯酸酯，PEGDA)及脫氣之去離子水(DG)達到室溫。在使用注射器及針之無菌條件下，在水平震盪器上震盪下添加1.0mL DG水至Glycosil小瓶中持續40分鐘。類似地，添加0.5mL DG水至Extralink-Lite小瓶中。隨後以1：4體積比(0.25mL Extralink-Lite/1.0mL Glycosil)混合Extralink-lite與Glycosil。將50μl混合物用移液管移至來自Eppendorf之0.5mL管帽，且使溶液膠化2小時。隨後使此等水凝膠與500μl聚集蛋白聚醣模擬物溶液在24孔培養盤中在水平震盪器上震盪下一起培育3小時。隨後，藉由在1×磷酸鹽 緩衝鹽水(1×PBS)中培育隔夜來洗滌凝膠，隨後使用抗生蛋白鏈菌素DyLight螢光探針(Lifetechnologies)染色。抗生蛋白鏈菌素DyLight在1×PBS中以1：200體積比稀釋且在水平震盪器上震盪下添加至凝膠中持續1小時。藉由在1×PBS中在水平震盪器上震盪下培育凝膠20分鐘(重複兩次)來洗掉非特異性結合之螢光探針。隨後使用光譜共焦顯微鏡(Nikon,A1+)使凝膠成像。
圖1展示具有經由醯肼-羰基鍵與CS結合之GAH肽的生物結合物(圖1C)及具有經由醯肼-羰基鍵與CS結合之STM肽的生物結合物(圖1D)與具有經由氧化醣開環化學及BMPH連接子與CS結合之GAH肽的生物結合物(圖1B)相比展現更大的玻尿酸結合親和力。
實例6. 遞送生物結合物至瘻管血管而不改變護理標準
此實例展現本文所揭示之生物結合物可用作管腔血管塗層來防止天然AVF中之內膜增生。瘻管在豬之股動脈及靜脈中產生，用本文所揭示之生物結合物或用鹽水作為對照來治療。預期生物結合物將被有效地遞送至瘻管血管而不改變護理標準，且將導致狹窄與未治療瘻管相比顯著較少及血管直徑擴大。
可經由此實例測試三種遞送方法：(1)在血流之前立即遞送；(2)在血流之前有意剝露瘻管之後遞送；及(3)在恢復血流之後(例如，在5分鐘之後)向所形成之瘻管遞送。
方法1被視為主要遞送方法，且方法2及3可單獨使用，或在方法1無法充分導致生物結合物覆蓋血管內腔之情況下方法1除外。在方法2中，藉由用鉗子之手柄摩擦靜脈，類似於在AVF產生期間臨床擴張器應用來進行血管之有意剝露。檢查方法3可用以判定緊隨瘻管產生之靜脈中高血流量是否導致將無法由治療劑之初始遞送解決之內皮細胞層損傷。在方法3中，血流恢復至瘻管，且隨後藉由夾緊近端靜脈及動脈停止。隨後用生物結合物沖洗瘻管且恢復血流。
在所有情況下，在最新創建之吻合術中移除單一縫合線，且使用具有光滑球尖之饋送針使生物結合物沖洗通過瘻管。使生物結合物(例如，大約5mL)沖洗通過瘻管。在生物結合物遞送之後(例如，約2小時)處死動物。移出瘻管，在鹽水中沖洗且用10%福馬林固定(例如，約10分鐘)。
使用毒傘素(phalloidin)染色細胞。當生物結合物具有生物素標籤時，使用經螢光標記之抗生蛋白鏈菌素標記物偵測生物結合物。使靜脈與動脈分離，且打開兩個血管，使得其管腔表面可使用共焦顯微鏡檢查。
預期生物結合物之遞送在所有三種方法中為有效的。藉由測試未暴露於生物結合物，亦即無明顯染色之動脈來計算非特異性結合。藉由在CT掃描期間向動物體內注射造影染料，使得血管可視化且經由影像量測血管直徑來確定狹窄程度。
實例7. 用於治療股膕動脈內之狹窄或閉塞之Hep-SILY
以下為經設計以評估及比較球囊血管成形術加針對普通球囊血管成形術(POBA)之邊緣內Hep-SILY加鹽水(對照)對治療股膕動脈內之狹窄或閉塞之安全性及功效的臨床測試。根據實例1製備具有每肝素大約6-8個SILY肽之Hep-SILY。
此測試提出對球囊血管成形術加單獨的針對球囊血管成形術之邊緣內Hep-SILY在天然股膕動脈中之重生或再狹窄病變中之安全性及功效的多中心2組平行盲化隨機比較。對大約66個呈現跛行或缺血性靜息痛及股膕動脈造影顯著病變(患者動脈流出至腳)之個體隨機分組且處理以用於此研究。
關鍵納入標準為年齡超過40且願意提供同意。關鍵排除標準為妊娠；預期壽命少於5年、在3個月篩選內出血性中風病史；在2週篩選內心肌梗塞、血栓溶解或絞痛症病史；及已知之肝素禁忌症。
個體將接受基線血管造影以確認股膕動脈中之造影顯著病變。在血管造影確認及藉由導引線成功穿過病變之後，個體係以2：1隨機分組用於POBA加SBCV治療(第1組，N=44)與POBA治療加鹽水(對照)(第2組，N=22)。第1組接受球囊血管成形術及多達10ml Hep-SILY沖洗，而第2組接受球囊血管成形術及多達10ml鹽水沖洗。
該研究之總持續時間為大約10個月(自第一個個體第一次訪視至最後一個個體最後一次訪視)，包括4個月登記時段。個人研究參與為在初始程序之後大約24週，且篩選訪視將長達在研究程序之前一個月。
在排放前以及第4週、第8週、第12週、第18週及第24週隨訪時收集各種資料。主要端點為如藉由在治療之後24週在分析段(損傷段之整個長度加5-mm近端及遠端邊緣)中之晚期內腔丟失(LLL)所量測之功效，如藉由獨立盲化血管造影核心實驗室評估。LLL定義為主要程序後不久之最小內腔直徑(MLD)與在隨訪時之MLD之間的差值。
使用與程序後血管造影相比之24週隨訪血管造影量測LLL(對於患有慢性腎功能不全之個體，使用雙工多普勒超音波(duplex Doppler ultrasound)測量LLL)。
次要端點為如藉由治療引發之不良事件(AE)發生率、臨床實驗室評估、生命體征及身體檢查結果所量測之安全性。要量測之特定安全事件包括各種原因之死亡、無切除術(腳踝以上)存活率(AFS)及靶血管之血管再形成(TVR)。
實例8：用於治療或預防新生血管內膜增生或外周動脈疾病(PAD)之Hep-SILY
在遞送如本文所描述之生物結合物(例如，實例1之Hep-SILY)之兔血管成形術模型中評估新生血管內膜增生。多隻(例如，六隻)兔參加該研究。各動物接受球囊血管成形術介導之對右側及左側髂動脈之 損傷。動物分為測試組(肝素-SILY)或媒劑對照(1×PBS)。在各組中，兩個髂動脈均受傷且緊隨球囊損傷用測試物品或對照治療。
在損傷之後在給定時間(例如，28天)後，使動物安樂死且在組織學上評估動脈段。通常選擇各血管之具有最嚴重的新生血管內膜反應之幾個(例如，三個)組織學切片用於形態測定。用數位形態測定(IPLab software,Rockville,MD)自Movat染色載片量測外彈性膜(EEL)、內彈性膜(IEL)及內腔之截面積。新生血管內膜厚度被量測為在最小及最大位點處IEL至內腔之距離且隨後進行平均。使用截面積計算以下各者：
‧內側面積=EEL面積-IEL面積
‧新生血管內膜面積=IEL面積-內腔面積
‧內側內膜面積=EEL面積-內腔面積
‧狹窄%=[1-(內腔面積/IEL面積)]* 100
使用變異數分析(ANOVA)比較變數之平均值。小於0.05之p值通常被視為統計顯著。
預期如本文所描述之生物結合物(例如，實例1之Hep-SILY)在抑制新生血管內膜增生中為有效的，且因此可用於治療或預防外周動脈疾病(PAD)。
實例9：生物結合物/肽聚集體形成
如實例1中所描述藉由以下修飾在純化程序期間合成Hep-SILY。在5CV之反應緩衝劑中純化之前，在水中稀釋反應物，使得離液劑(例如，脲)濃度降低至大約3M。隨後，在16CV水中純化反應物。
藉由尺寸排阻層析評估所得產物，展現高分子量物質形成，指示聚集體形成。將Hep-SILY複合物之效能與不含以離子方式相互作用之SILY肽的參考Hep-SILY進行比較。含有聚集體之Hep-SILY與不含聚集體之Hep-SILY相比以較高親和力(較低EC50值)結合膠原蛋白。
實例10. 用生物結合物處理之靜脈移植物
以下方法可用於確認，經以如本文所描述之生物結合物處理之靜脈移植物在該等移植物用於繞道手術時會導致靜脈移植失敗減少。該實例亦測試用於製備靜脈移植物之條件。
A. 優化生物結合物之濃度
切下的兔血管組織進行離體動脈研究，以便在開始動物模型研究前優化原料藥濃度及浸泡持續時間。得自離體結合研究之資訊將用於界定浸泡時間、原料藥濃度及調配緩衝劑，以產生靜脈移植物保存液。
首先，定量與靜脈結合之生物結合物，以檢查生物結合物濃度及浸泡時間之效果。自一隻兔切下的靜脈被切成大約1cm2段且置於24孔培養盤中。測試生物結合物在緩衝鹽水中之濃度的變化及治療時間之變化。組織片段在含有清潔劑之提取介質中均質化且離心以集結碎片。藉由雙金雞納酸分析(BCA)試劑分析上清液之蛋白質及藉由ELISA或ECL(MSD,Meso Scale Discovery電化學發光技術)分析上清液之原料藥。
另外，為確定廣泛血管壁損傷如何可增強結合，包括第二組實驗，其中血管用橡膠刮棒輕輕地刮下，隨後將血管切成片段。此程序係模擬醫師自靜脈移出閥隨後移植之過程。
除了定量如本文所描述之生物結合物之外，亦進行免疫組織化學(IHC)以確認原料藥結合於靜脈之內腔。基於以上測試用實驗選擇兩個條件(濃度及浸泡時間)。自兔切下頸靜脈且用生物結合物溶液沖洗及浸泡。靜脈隨後在3次更換之緩衝鹽水中沖洗。組織被切成3段。一段被固定於中性緩衝福馬林(NBF)中，第二段被冷凍保存於最佳切割溫度(OCT)下且第三段被快速冷凍。來自低溫恆溫器或福馬林固定之石蠟包埋(FFPE)標本之組織切片用H&E染色，且使用對已製備之原 料藥具有特異性之抗體進行免疫染色。雖然生物結合物會結合於血管上之任何所暴露之膠原蛋白，此實例預期可見塗佈血管之內表面的原料藥。
此外，使用人屍靜脈進行IHC程序，以確保將程序轉移至人類組織。在死亡之24小時內自屍體獲得靜脈組織。
B. 在靜脈繞道動物程序中評估生物結合物溶液
在雄性紐西蘭白兔中進行靜脈移植模型。用吻合封套技術構築靜脈繞道移植。收集頸外靜脈且在適當時間及生物結合物濃度下置於肝素化鹽水或靜脈移植物保存液之溶液中。在儲存時段之後，使靜脈端通過由4F血管導引鞘塑造之聚胺基甲酸酯封套且隨後外翻過封套外部並用縫合線固定。頸動脈內腔隨後以1-2cm動脈切口暴露。經圍封及逆轉之靜脈端被插入頸動脈內腔中且用縫合線在封套周圍固定動脈。在恢復流動後，動脈之插入段被完全分割以允許充分靜脈移植延伸。藉由移植物內脈動流之可視化來確認移植通暢。
使用總計20隻動物。十隻動物之靜脈在移植至頸動脈中之前浸泡於肝素化鹽水中，且十隻動物之靜脈浸泡於靜脈移植物保存液中。動物存活28天。選擇肝素化鹽水作為對照組，因為其通常用於臨床設置中。
在第28天，誘導麻醉且確認血管之通暢。給與靜脈內肝素推注，且處死動物。靜脈移植物經歷用10%中性緩衝福馬林(NBF)自上升主動脈原位灌注固定。隨後切下靜脈移植物且浸沒固定於NBF中，隨後石蠟包埋用於剖切及形態測定。沿靜脈移植物之長度分析靜脈移植物之至少三個不同切片，避免緊鄰異物封套之組織。
石蠟包埋之6μm切片用Movat之五鉻染劑染色且用Aperio顯微鏡成像。概述內腔、內彈性膜(IEL)及外彈性膜(EEL)之周長，且計算各周界內之面積。新生血管內膜面積被計算為IEL面積-內腔面積。
在各組中有10個靜脈移植物，且在各移植物內檢查三個面積之最小者。對各移植物內的三個量測值進行平均，得到每個移植物之平均新生血管內膜面積值。10個之樣品尺寸導致足夠能力(0.8,α=0.05)用於偵測新生血管內膜增生之25%減少，量測值具有20%標準差。此目標之成功標準包括在用生物結合物處理之靜脈移植物中新生血管內膜增生減少25%。
C.液體穩定性研究.
生物結合物化合物之設計及合成係處於用公認對照研發之過程中。完成穩定性程序以確定在室溫及4℃下儲存為液體之生物結合物之穩定性。生物結合物溶液先前已以凍乾形式儲存，且在使用之前復原。發現此類溶液穩定持續3個月(迄今為止所測試之時間)。因此，啟動在4℃及室溫下儲存為液體之生物結合物之正式穩定性方案。液體調配物為用於在此設置下臨床遞送之適宜的生物結合物形式。
D. 在大鼠中之毒性研究
進行劑量範圍發現研究。首先，給與大鼠單次IV注射四個劑量水準以在兩天之後確定急性毒性。隨體組將被類似地給藥且以時間間隔取用血液樣品以確定藥物動力學參數。隨後，在非GLP設置中在大鼠中在無恢復期之情況下進行7天重複劑量研究。此研究之結果將用於選擇最高可耐受劑量水準。最後，在28天恢復期之情況下使用最高可耐受劑量水準進行長期28天重複劑量研究。
該研究之端點包括死亡、臨床觀測、在給藥前及在屍體剖檢時之體重、在給藥前及在屍體剖檢時之食物消耗、來自血液收集及臨床病理學之毒物動態學觀測。在標準器官上進行標準組織病理學。
預期無毒性被觀測到。預期在發現任何毒性作用之前達到溶解度極限。
實例11. oxDS-SILY與eDS-SILY之穩定性比較
進行穩定性研究以比較藉由氧化化學所合成之DS-SILY(亦即，開環；oxDS-SILY)或根據上述實例1使用硫酸皮膚素替代肝素所合成之DS-SILY(亦即，非開環，eDS-SILY)的穩定性。
簡言之，如下製備oxDS-SILY。使硫酸皮膚素(DS)溶解於pH為5.5之0.1M磷酸鈉緩衝劑中，製造濃度為20mg/mL之溶液。藉由高碘酸鹽之濃度來控制官能化之程度。根據下表，藉由使高碘酸鹽溶解於pH為5.5之0.1M磷酸鈉緩衝劑中來製備各種濃度之高碘酸鹽溶液。
使DS溶液與高碘酸鹽溶液以1：1比率(V：V)在室溫下混合兩小時，提供氧化DS，使用Biogel P6管柱用磷酸鹽緩衝鹽水將其純化。使具有與其結合之末端GSG-NHNH2的SILY肽(亦即，RRANAALKAGELYKSILYGSG-NHNH2(SEQ ID NO：397))溶解於水中，提供1mg/mL濃度，視需要使用音波處理。在室溫下緩慢地添加SILY肽至氧化DS中且攪拌約2小時，保護其免於光。使反應混合物之pH維持高於6。視情況，可使1莫耳類似官能化SILY生物素(生物素標記肽)與1莫耳DS反應，且隨後使未標記SILY肽(莫耳當量-1)增加至所預期之醛數量。亦藉由添加20莫耳未標記SILY至1莫耳DS中來製備DS-SILY20。用水純化產物，提供所要之DS-SILY。
合成樣品且冷凍儲存長達8週。在時間0、第4週及第8週量測HPLC-SEC。比較峰面積，其中峰面積減小係指降解。
結果顯示eDS-SILY在8週測試期內仍穩定，而oxDS-SILY在該時段內會降解。在oxDS-SILY之情況下，主峰及高分子量相關峰(分別為實心條形圖及陰影條形圖)在8週內會下降，而eDS-SILY值則保持相對恆定且並未隨時間推移減小(圖2)。
實例12. 用於治療胃食道損傷之臨床試驗方案
此實例係提出臨床試驗計畫，以測試選自本文所描述之生物結合物，諸如Hep-SILY、包括如上文所論述之分支鏈肽的其他含肝素生物結合物或DS-SILY的生物結合物在治療胃食道損傷中之能力。本文試劑為以溶液或膠凝形式製備之生物結合物。胃食道損傷構成顯著發病率及患者及醫療系統之成本。維持食道通暢消耗重要資源。
疾病標靶為GERD自發性或介入醫原性任何胃食道損傷。此為局部生物結合物之隨機多中心安全性及有效性研究，其係經由食道胃十二指腸鏡檢查(EGD)投藥以治療胃食道損傷。
此試驗之目標包括1)評估在EGD介入時給與的經EGD遞送之生物結合物治療之總體安全概況；及2)確定經EGD遞送之生物結合物在降低胃食道損傷中之再狹窄率中的有效性。
五十(50)個患者參加該試驗，其中25個接受生物結合物(經EGD遞送)且25個接受媒劑(經EGD遞送)。
關鍵納入標準包括(a)需要EGD消融之GERD相關食道病變；(b)需要EGD擴張之食道狹窄；及(c)需要EGD處理之消化性潰瘍病(PUD)。關鍵排除標準包括H/O嚴重過敏性疾病。
訪視時程為一週、六週及12週。安全性評估包括(1)不良事件(AE)及嚴重AE(SAE)之確定；(2)身體檢查/生命特徵：特別關注局部發現；及(3)包括生物結合物抗體之實驗室(基線、第1週、第12週及第24週)。可在第6週及第12週重複EGD遞送。
為量測食道之通暢性，在治療前及研究末端進行定量鋇餐造影。
此試驗之主要端點為復發性狹窄率降低，且次要端點為推進經口飲食之時間、達到復發性狹窄之時間及PUD評分或症狀改善。預期該試驗在所有此等端點上會取得成功。
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<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(50)
<223> 任何胺基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(50)
<223> /註記=「此區可包含1至50個胺基酸，其中一些位置可能不存在」
<220>
<221> MOD_RES
<222> (54)..(103)
<223> 任何胺基酸
<220>
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(106)
<223> /註記=「參見所申請之說明書中對取代物及較佳實施例之詳細描述」
<400> 408
<210> 409
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<212> PRT
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<220>
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<220>
<221> MOD_RES
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<223> 任何胺基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MOD_RES
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<223> 任何胺基酸
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<221> MISC_FEATURE
<222> (54)..(103)
<223> /註記=「此區可包含1至50個胺基酸，其中一些位置可能不存在」
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(106)
<223> /註記=「參見所申請之說明書中對取代物及較佳實施例之詳細描述」
<400> 409
<210> 410
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註記=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 410

Claims (84)

  1. 一種包含聚醣及至少一個肽之生物結合物，其中該(等)肽包含膠原蛋白結合單元、玻尿酸結合單元、ICAM結合單元、VCAM結合單元及/或選擇素結合單元，且係經由醯肼-羰基鍵與該聚醣結合。
  2. 如請求項1之生物結合物，其中該聚醣選自由以下組成之群：海藻酸鹽、軟骨素、硫酸軟骨素、皮膚素、硫酸皮膚素、乙醯肝素、硫酸乙醯肝素、肝素、葡聚醣、硫酸葡聚醣及玻尿酸或其衍生物。
  3. 如請求項1之生物結合物，其中該(等)肽包含膠原蛋白結合單元。
  4. 如請求項3之生物結合物，其中該(等)肽之該膠原蛋白結合單元以小於約1mM之解離常數(K d )結合於膠原蛋白。
  5. 如請求項1之生物結合物，其中該(等)肽包含玻尿酸結合單元。
  6. 如請求項5之生物結合物，其中該(等)肽之該玻尿酸結合單元以小於約1mM之解離常數(K d )結合於玻尿酸。
  7. 如請求項1之生物結合物，其中該生物結合物包含有包含至少一個膠原蛋白結合單元之肽及包含至少一個玻尿酸結合單元之肽，及/或至少一個包含膠原蛋白結合單元及玻尿酸結合單元兩者之肽。
  8. 如請求項1之生物結合物，其中該生物結合物包含至少一個包含ICAM結合單元之肽及至少一個包含選擇素結合單元之肽。
  9. 如前述請求項中任一項之生物結合物，其中該(等)肽包含至多約120個胺基酸，或至多約100個胺基酸，或至多約50個胺基酸，或至多約40個胺基酸。
  10. 如前述請求項中任一項之生物結合物，其中該(等)肽包含至多約25個胺基酸。
  11. 如前述請求項中任一項之生物結合物，其包含1至約25個肽，或約5至約25個肽，或約11至約14個肽。
  12. 如前述請求項中任一項之生物結合物，其包含1至約10個肽，或約7-8個肽。
  13. 如前述請求項中任一項之生物結合物，其中該聚醣包含約1至約75百分比(%)官能化，其中該官能化百分比(%)係藉由該聚醣上經肽官能化之雙醣單元的百分比確定。
  14. 如前述請求項中任一項之生物結合物，其中該聚醣包含約5至約30百分比(%)官能化，或約10至約40百分比(%)官能化。
  15. 如前述請求項中任一項之生物結合物，其中該聚醣包含約25百分比(%)官能化，或約30百分比(%)官能化。
  16. 如前述請求項中任一項之生物結合物，其中該聚醣不含經氧化方式裂解之醣單元。
  17. 如前述請求項中任一項之生物結合物，其中該聚醣為經衍生聚醣。
  18. 如請求項17之生物結合物，其中該經衍生聚醣為部分N-脫硫酸化衍生物、部分O-脫硫酸化衍生物、部分O-羧甲基化衍生物或其任何組合。
  19. 如請求項1之生物結合物，其中該(等)肽包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：YKSILY(SEQ ID NO：179)、LYKSILY(SEQ ID NO：180)、ELYKSILY(SEQ ID NO：181)、GELYKSILY(SEQ ID NO：2)、AGELYKSILY(SEQ ID NO：182)、KAGELYKSILY(SEQ ID NO：183)、LKAGELYKSILY(SEQ ID NO：184)、ALKAGELYKSILY(SEQ ID NO：185)、AALKAGELYKSILY(SEQ ID NO：186)、NAALKAGELYKSILY(SEQ ID NO：187)、ANAALKAGELYKSILY(SEQ ID NO：188)、RANAALKAGELYKSILY(SEQ ID NO：189)、RRANAALKAGELYKSILY(SEQ ID NO：1)、QLYKSILY(SEQ ID NO：190)、GQLYKSILY(SEQ ID NO：16)、AGQLYKSILY(SEQ ID NO：191)、KAGQLYKSILY(SEQ ID NO：192)、LKAGQLYKSILY(SEQ ID NO：193)、ALKAGQLYKSILY(SEQ ID NO：194)、AALKAGQLYKSILY(SEQ ID NO：195)、NAALKAGQLYKSILY(SEQ ID NO：196)、ANAALKAGQLYKSILY(SEQ ID NO：197)、RANAALKAGQLYKSILY(SEQ ID NO：198)及RRANAALKAGQLYKSILY(SEQ ID NO：17)，或與其具有至少約80%序列一致性之序列，其限制條件為該序列包含至少一個YKS序列。
  20. 如請求項1之生物結合物，其中該(等)肽包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：YKCILY(SEQ ID NO：199)、LYKCILY(SEQ ID NO：200)、ELYKCILY(SEQ ID NO：201)、GELYKCILY(SEQ ID NO：4)、AGELYKCILY(SEQ ID NO：202)、KAGELYKCILY(SEQ ID NO：203)、LKAGELYKCILY(SEQ ID NO：204)、ALKAGELYKCILY(SEQ ID NO：205)、AALKAGELYKCILY(SEQ ID NO：206)、NAALKAGELYKCILY(SEQ ID NO：207)、ANAALKAGELYKCILY(SEQ ID NO：208)、RANAALKAGELYKCILY(SEQ ID NO：209)、RRANAALKAGELYKCILY(SEQ ID NO：3)、QLYKCILY(SEQ ID NO：210)、GQLYKCILY(SEQ ID NO：211)、AGQLYKCILY(SEQ ID NO：212)、KAGQLYKCILY(SEQ ID NO：213)、 LKAGQLYKCILY(SEQ ID NO：214)、ALKAGQLYKCILY(SEQ ID NO：215)、AALKAGQLYKCILY(SEQ ID NO：216)、NAALKAGQLYKCILY(SEQ ID NO：217)、ANAALKAGQLYKCILY(SEQ ID NO：218)、RANAALKAGQLYKCILY(SEQ ID NO：219)及RRANAALKAGQLYKCILY(SEQ ID NO：220)，或與其具有至少約80%序列一致性之序列，其限制條件為該序列包含至少一個YKS序列。
  21. 如請求項1之生物結合物，其中該(等)肽包含胺基酸序列GAHWQFNALTVR(SEQ ID NO：58)或與其具有至少約80%序列一致性之序列，其限制條件為該序列能夠結合於玻尿酸。
  22. 如請求項1之生物結合物，其中該(等)肽包含胺基酸序列STMMSRSHKTRSHHV(SEQ ID NO：59)或與其具有至少約80%序列一致性之序列，其限制條件為該序列能夠結合於玻尿酸。
  23. 如請求項1之生物結合物，其中該(等)肽包含選自以下之胺基酸序列：i)IELLQAR(SEQ ID NO：117)、IELLQARGSC(SEQ ID NO：118)、IDLMQAR(SEQ ID NO：119)、IDLMQARGSC(SEQ ID NO：120)、QITWAQLWNMMK(SEQ ID NO：121)、QITWAQLWNMMKGSC(SEQ ID NO：122)、NAFKILVVITFGEK(SEQ ID NO：152)、NAFKILVVITFGEKGSC(SEQ ID NO：153)、ITDGEA(SEQ ID NO：154)、ITDGEAGSC(SEQ ID NO：155)、DGEATD(SEQ ID NO：156)或DGEATDGSC(SEQ ID NO：157)，或與其具有至少約80%序列一致性之序列，其限制條件為該序列能夠結合於選擇素、ICAM及/或VCAM。
  24. 如前述請求項中任一項之生物結合物，其中該醯肼基視情況經由間隔基鍵結至該(等)肽C端。
  25. 如前述請求項中任一項之生物結合物，其中該醯肼基視情況經由間隔基鍵結至該(等)肽N端。
  26. 如前述請求項中任一項之生物結合物，其中該醯肼基經由包含選自由以下組成之群的一或多個胺基酸的間隔基鍵結至該C端：甘胺酸、丙胺酸、精胺酸、離胺酸及絲胺酸。
  27. 如請求項25之生物結合物，其中該間隔基選自由以下組成之群：甘胺酸、甘胺酸-甘胺酸、絲胺酸-甘胺酸、離胺酸-精胺酸、精胺酸-精胺酸，及甘胺酸-絲胺酸-甘胺酸。
  28. 一種包含如前述請求項中任一項之生物結合物的組合物，其中每聚醣之肽的平均數量小於約30。
  29. 一種包含如請求項1至27中任一項之生物結合物的組合物，其中每聚醣之肽的平均數量為約5至約30。
  30. 一種包含如請求項1至27中任一項之生物結合物的組合物，其中每聚醣之肽的平均數量為約7。
  31. 一種組合物，其包含如請求項1至27中任一項之生物結合物或如請求項28至30中任一項之組合物及包含膠原蛋白結合單元、玻尿酸結合單元、ICAM結合單元、VCAM結合單元及/或選擇素結合單元之肽，其中該肽係以非共價方式結合於該生物結合物，且另外，其中該組合物包含以該聚醣中雙醣單元之數量計1%至約200%肽。
  32. 如請求項31之組合物，其中該肽係以離子方式結合於該生物結合物。
  33. 一種在血管損傷或介入之前、期間及/或之後治療患者之血管的方法，其包含向該血管施用有效量之如請求項1至27中任一項之生物結合物或如請求項28至32中任一項之組合物。
  34. 如請求項33之方法，其中該生物結合物係非經腸方式投與該患 者。
  35. 如請求項34之方法，其中該非經腸方式投與係經由選自由以下組成之群的途徑：血管內、靜脈內、動脈內、肌肉內、皮膚、皮下、經皮、皮內及表皮內。
  36. 如請求項34或35之方法，其中該生物結合物係使用輸液用針或裝置以非經腸方式投與。
  37. 如請求項33至36中任一項之方法，其中該生物結合物係用導管以球囊上塗層形式經由多孔球囊或以支架上塗層形式投與該患者。
  38. 如請求項33之方法，其中該介入選自由以下組成之群：血管成形術、粥樣斑塊切除術、支架術或其他手術程序。
  39. 如請求項33之方法，其中該生物結合物結合於該患者體內之剝露血管。
  40. 如請求項33之方法，其中該生物結合物抑制血小板活化。
  41. 如請求項39至40中任一項之方法，其中該生物結合物抑制血小板結合於該剝露血管。
  42. 如請求項39至41中任一項之方法，其中該生物結合物抑制內膜增生。
  43. 如請求項39至42中任一項之方法，其中該生物結合物抑制血栓症。
  44. 如請求項39至43中任一項之方法，其中該生物結合物抑制血管痙攣。
  45. 如請求項39至44中任一項之方法，其中該生物結合物刺激內皮細胞增殖。
  46. 如請求項38至45中任一項之方法，其中該生物結合物結合於該剝露血管上所暴露之膠原蛋白。
  47. 一種在患者體內建立血管通路之方法，其包含：向血管通路中之血管壁施用溶液；及恢復或引發該血管通路中之血流，其中該溶液包含有效量之如請求項1至27中任一項之生物結合物或如請求項28至32中任一項之組合物。
  48. 一種改善需要血液透析之患者體內動靜脈瘻管(arteriovenous fistula；AVF)之成熟的方法，其包含：向AVF之內腔之內壁施用溶液；及恢復或引發該AVF中之血流，其中該溶液包含有效量之如請求項1至27中任一項之生物結合物或如請求項28至32中任一項之組合物。
  49. 一種治療及/或預防有其需要之患者體內的組織黏附之方法，其包含在器官之所暴露的組織上施用醫藥組合物，其中該醫藥組合物包含如請求項1至27中任一項之生物結合物或如請求項28至32中任一項之組合物。
  50. 一種治療及/或預防有其需要之患者體內的腹部或骨盆黏附之方法，其包含在腹部或骨盆器官之所暴露的組織上施用醫藥組合物，其中該醫藥組合物包含如請求項1至27中任一項之生物結合物或如請求項28至32中任一項之組合物。
  51. 一種治療罹患與內皮功能障礙相關疾病的患者之方法，該方法包含向該患者投與包含如請求項1至27中任一項之生物結合物或如請求項32至36中任一項之組合物的醫藥組合物。
  52. 如請求項51之方法，其中該與內皮功能障礙相關之疾病選自由以下組成之群：動脈粥樣硬化、冠狀動脈疾病、糖尿病、高血壓、高膽固醇血症、類風濕性關節炎、全身性紅斑性狼瘡症、青光眼、尿毒症、敗血症及器官衰竭。
  53. 一種預防或減少在患者體內血管位點處的炎症之方法，其中該位點(a)包含滲透內皮內層或受損內皮細胞及(b)未由於血管介入程序而痊癒，該方法包含向該患者投與如請求項1至27中任一項之生物結合物或如請求項28至32中任一項之組合物。
  54. 如請求項53之方法，其中該血管介入程序包含經皮冠狀動脈介入術(percutaneous coronary intervention；PCI)程序。
  55. 如請求項49之方法，其中該疾病選自由以下組成之群：血管疾病、腎病、肺病、皮膚病、風濕病、胃腸道疾病、腫瘤、血液病、傳染病、神經疾病、眼科疾病及內分泌疾病。
  56. 如請求項49之方法，其中該疾病選自由以下組成之群：類風濕性關節炎、糖尿病、尿毒症、細菌或病毒感染、動脈粥樣硬化、皮炎、絲球體腎炎、急性肺損傷、纖維化、缺血性急性腎衰竭及抽菸誘導之血管損傷。
  57. 一種促進有其需要之患者體內的角膜傷口癒合之方法，該方法包含向該患者投與有效量之如請求項1至27中任一項之生物結合物或如請求項28至32中任一項之組合物。
  58. 一種在罹患胃食道損傷之患者中維持食道通暢、減少再狹窄、改善傷口癒合、減少復發性狹窄、加速推進經口飲食或改善消化性潰瘍病(peptic ulcer disease；PUD)症狀之方法，其包含向該患者之受傷胃食道組織局部施用醫藥組合物，其中該醫藥組合物包含有效量之如請求項1至27中任一項之生物結合物或如請求項28至32中任一項之組合物。
  59. 一種治療患者之胃食道損傷的方法，其包含向胃食道組織上之病變局部施用醫藥組合物，其中該醫藥組合物包含有效量之如請求項1至27中任一項之生物結合物或如請求項28至32中任一項之組合物。
  60. 一種治療患者之關節炎的方法，該方法包含向該患者投與有效量之如請求項1至27中任一項之生物結合物或如請求項28至32中任一項之組合物。
  61. 如請求項60之方法，其中該關節炎選自由以下組成之群：骨關節炎及類風濕性關節炎。
  62. 一種減少疤痕形成之方法，其包含向有其需要之個體投與有效量之如請求項1至27中任一項之生物結合物或如請求項28至32中任一項之組合物。
  63. 一種促進傷口癒合之方法，其包含向有其需要之患者投與有效量之如請求項1至27中任一項之生物結合物或如請求項28至32中任一項之組合物。
  64. 一種治療已進行血管介入之患者體內的狹窄之方法，其包含向患者投與如請求項1至27中任一項之生物結合物或如請求項28至32中任一項之組合物。
  65. 一種治療及/或預防患者體內富含玻尿酸之組織變性之方法，其包含向有其需要之患者投與如請求項1至27中任一項之生物結合物或如請求項28至32中任一項之組合物。
  66. 一種治療及/或預防患者之軟骨變性的方法，其包含向有其需要之患者投與如請求項1至27中任一項之生物結合物或如請求項28至32中任一項之組合物。
  67. 一種治療及/或預防患者之軟骨變性的方法，其包含向有其需要之患者的滑膜腔中注射如請求項1至27中任一項之生物結合物或如請求項28至32中任一項之組合物。
  68. 一種治療及/或預防患者之玻璃體變性的方法，其包含向有其需要之患者投與如請求項1至27中任一項之生物結合物或如請求項28至32中任一項之組合物。
  69. 一種治療及/或預防患者之髓核變性的方法，其包含向有其需要之患者投與如請求項1至27中任一項之生物結合物或如請求項28至32中任一項之組合物。
  70. 一種治療有其需要之患者之股動脈內的狹窄或閉塞之方法，其包含在球囊血管成形術之前、期間及/或之後，向內腔之內壁施用溶液，其中該溶液包含有效量之如請求項1至27中任一項之生物結合物或如請求項28至32中任一項之組合物。
  71. 一種治療或預防患者之冠狀動脈疾病及/或外周動脈疾病的方法，其包含向有其需要之患者投與如請求項1至27中任一項之生物結合物或如請求項28至32中任一項之組合物。
  72. 一種製備用於繞道手術之血管移植物的方法，其包含使血管片段的內壁與包含有效量之如請求項1至27中任一項之生物結合物或如請求項28至32中任一項之組合物的溶液接觸。
  73. 如請求項72之方法，其中該血管為靜脈。
  74. 如請求項72之方法，其中該接觸係在允許該生物結合物結合於該內壁之條件下進行。
  75. 一種包含血管片段之血管移植物，該血管片段包含結合於有效量之如請求項1至27中任一項之生物結合物或如請求項28至32中任一項之組合物的內壁。
  76. 一種預防或減少進行繞道移植程序之患者移植失敗的方法，其包含向該患者之循環系統中植入移植物，其中該移植物包含結合於有效量之如請求項1至27中任一項之生物結合物或如請求項28至32中任一項之組合物的內壁。
  77. 一種預防或減少進行繞道移植程序之患者移植失敗的方法，其包含向該患者之循環系統中植入移植物，及在該移植之前、期間或之後，向該移植物之內部中注射包含有效量之如請求項1至 27中任一項之生物結合物或如請求項28至32中任一項之組合物的溶液。
  78. 一種製造包含聚醣及1至50個肽之生物結合物的方法，該方法包含使該聚醣與足夠量之肽(其中該肽包含醯肼基)視情況在活化劑存在下在偶合反應條件下接觸以提供該生物結合物，其中該(等)肽包含膠原蛋白結合單元、玻尿酸結合單元、ICAM結合單元、VCAM結合單元及/或選擇素結合單元且經由位於該等肽上的末端醯肼基與該聚醣上的羰基之間的醯肼-羰基鍵與該聚醣結合。
  79. 如請求項78之方法，其中該生物結合物包含YKS或YKC之至少一個序列。
  80. 如請求項78之方法，其中該活化劑為碳化二亞胺試劑。
  81. 如請求項78之方法，其中該活化劑選自由以下組成之群：N,N'-二環己基碳化二亞胺、N,N'-二異丙基碳化二亞胺及1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳化二亞胺。
  82. 如請求項78之方法，其中該醯肼基視情況經由間隔基鍵結至該(等)肽C端。
  83. 如請求項82之方法，其中該間隔基包含選自由以下組成之群的一或多個胺基酸：甘胺酸、丙胺酸、精胺酸、離胺酸及絲胺酸。
  84. 如請求項82或83之方法，其中該間隔基選自由以下組成之群：甘胺酸、甘胺酸-甘胺酸、絲胺酸-甘胺酸、精胺酸-精胺酸、離胺酸-精胺酸、離胺酸-精胺酸-精胺酸及甘胺酸-絲胺酸-甘胺酸。
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