JP2024506265A - 分子系超構造及びその利用方法 - Google Patents

Abstract

本明細書では、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）分子に共有結合するフェチュインＡベース分子（ＡＨＳＧ）を含むバイオコンジュゲートが提供される。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２０２１年１月２６日に出願された米国仮出願第６３／１４１，９７７号及び２０２１年５月２１日に出願された米国仮出願第６３／１９１，８３９号の優先権の利益を主張するものであり、両方の出願は、あらゆる目的でその全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。

本明細書に記載の主題は、一般に、硫酸化ＧＡＧの主鎖に結合したホリスタチンなどの成長因子を含む分子系超構造に関する。

老化は、体の全ての臓器及び組織に影響を与える。例えば、免疫系が感染症やがんから守る能力を失い、適切な創傷治癒をサポートすることもできなくなる。同時に、自然免疫系によって媒介される炎症反応が増幅され、高齢者は自己免疫疾患や「炎症」と定義される炎症性疾患にかかりやすくなる。最も関連した変化は、ナイーブＴ細胞の減少と、それに伴う記憶細胞の増加、ＴＣＲレパートリーの漸進的な減少、及びｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖の減少によって特徴付けられる適応免疫系で観察される。

加齢による筋肉量及びその再生能力の減少（サルコペニア）により、日常生活活動を営むのに必要な筋力及び運動能力が低下する。サルコペニアは、筋線維の喪失と機能低下に影響する神経支配、幹細胞機能（衛星細胞）、及び筋恒常性の内分泌調節の変化によって明らかになる。人間は、３０歳を超えると年間約０．５～１％の筋肉量を失い、６５歳を超えると筋肉量の減少速度が劇的に加速化する。

通常、衛星細胞と、損傷後の筋肉の修復を促進する、筋結合組織線維芽細胞ならびに浸潤性マクロファージ及び好中球との相互作用における機能不全は、おそらく老化した生物の筋再生の低下に影響すると考えられる。したがって、加齢による筋肉減少に対処する再生アプローチは、免疫系と筋幹細胞コンパートメントの両方をターゲットにする必要がある。

再生医療は、正常的な個体発生及び組織発達の反復説に基づいている。補充療法としての特定の生細胞集団の送達、または原位置（ｉｎ－ｓｉｔｕ）形態形成をサポートし影響を与える化学的手がかりの送達が利用される。生理学的経路の解明及び一般に「成長因子」と名付けられた組換えモルフォゲンの作製に、多くの関心が集まり、数多くの臨床試験が行われてきた。これらの多くの試験の結果は、有効性の欠如や製品コストの上昇によって阻まれ、残念なものとなっている。歴史的に組織再生に使用されてきた周知の成長因子としては、アンジオポエチン（Ａｎｇ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、形質転換成長因子（ＴＦＧ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）が挙げられる。

因子の注入による単純な送達では、特定の細胞集団を標的にすることができず、一時的な弱い生物学的反応が生じる可能性がある。成長因子の超生理学的濃度の影響は予測が難しく、投与直後、急速に分解されるかあるいは組織成分に非特異的に結合するため、注入方式は、所望の効果を生み出すほどの十分な局所濃度が提供されない。

この問題に対処するために、マトリックス中またはマトリックス上への成長因子の化学的固定化と、成長因子の物理的カプセル化という２つの戦略が追求されている。

化学的な観点から見ると、非共有結合による組み込みは、静電荷による成長因子の吸収に基づいている。ヘパリン、フィブロネクチン、ゼラチン、低分子オリゴペプチドなどのタンパク質を化学的または物理的にコーティングすることで、成長因子やモルフォゲンを固定化するための特定の生物学的部位を提供することが可能である。フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、エラスチンもしくはヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸などのグリコサミノグリカンを含む生体高分子ゲル、または様々な合成ヒドロゲルは、成長因子を固定化するための細胞外マトリックス模倣材料として使用可能である。

成長因子の共有結合による組み込みは、より長時間の放出も可能にする。因子は、共重合または化学的もしくは物理的処理によって組み込むことが可能な官能基を介してポリマーに結合し得る。例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）は、スターポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）を介してアミノシランガラスに共有結合し、ＴＧＦ－β１は、ポリ（エチレングリコール）ＰＥＧヒドロゲルに共有結合した。ただし、この方法は、結合部位が予測できないことと、生物活性官能基の損傷により固定化中に成長因子の生物活性が損なわれるという限界がある。

シルク、ケラチン、コラーゲン、ゼラチン、フィブリノーゲン、エラスチン、キトサン、ヒアルロン酸、デンプン、カラギーナン、セルロース、アルギン酸塩などの天然素材も薬物担体として広く注目されている。これらのほとんどは水溶性なので、成長因子の生物活性に対して比較的無害な穏やかな製造条件を可能にする。

ポリ（α－ヒドロキシ酸）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（無水物）、ポリ（アミノ酸）、デキストリン、ポリ（グリコシド）（ＰＧＡ）、ポリ（Ｌ－ラクチド）（ＰＬＡ）及びそれらの共重合体（ＰＬＧ酸）、エラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ）、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）を含む多数の合成ポリマーが、成長因子のカプセル化に使用されている。

担体からの因子放出速度は、因子拡散またはマトリックス分解のいずれかを制御することによって調整可能である。しかしながら、天然ポリマーを送達ビヒクルとして使用する場合の潜在的な問題は、分解速度の制御が難しい一方、合成主鎖が、結合した成長因子のタンパク質分解に対する保護を提供できないことである。さらに、担体ポリマーの断片が毒性を引き起こす可能性もある。結合した成長因子は、システインプロテアーゼによる酵素分解を受けやすい。さらに、加水分解酵素によって放出された担体断片が、対象内で特定された特定の循環抗体によるＩＩ型免疫反応を発生させることが明らかになった。調整可能なマトリックス分解及びその後の拡散による送達システムは、成長因子／モルフォゲン送達に好適である。より優れた送達システムとして、いわゆる「リリースオンデマンド」は、操作された基質の切断を引き起こす、ｐＨ、温度、酵素、または薬物によって引き起こされる局所環境シグナルに応答した。しかしながら、これらの複合体は、依然として吸着した成長因子のプロテアーゼを保護できず、加水分解酵素による分解後、得られた複合体が分散されるか、またはすぐ細胞に組み込まれ、成長因子と受容体との相互作用の機会を得ることなく分解されてしまった。

最後に、成長因子による治療は、不安定である可能性があるが、単一のペプチドまたはペプチドの限られた組み合わせを用いることで、不安定な受容体活性化による予測できない結果が発生するか、または特定の補因子もしくは担体タンパク質の欠如による効果喪失をもたらす可能性がある。したがって、標的送達及び成長因子の長期的及び／または持続的放出を可能にする送達ビヒクルを提供することが求められる。

この問題に対処するためには、幹細胞由来のｉｎ ｖｉｔｒｏ操作された特定の細胞集団から得られる組成物を使用し、全ての因子が、元の細胞の発生段階に特異的な安定した割合で存在するようにする。

いくつかの実施形態において、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）分子のカルボキシル末端と、シスタチン１ドメインのＮ末端で結合するフェチュインＡ分子（ＡＨＳＧ）をコアに含む分子系超構造が記載される。この構造にはさらに、ヘパリン結合ドメイン（ＨＢＤ）でＧＡＧ伸長部分に静電的に結合するホリスタチン、またはＨＢＤを有する他の成長因子で構成され得る。

いくつかの実施形態において、精製された個別成分を使用する合成工程により、分子系超構造を作製する方法が記載される。いくつかの実施形態において、自己組織化法によって当該構造を作製する方法は、部分分化した幹細胞の細胞培養物、細胞に曝露された液体培地、及び一組の架橋試薬を含み、培養中の細胞は、非リン酸化単鎖フェチュインＡ、及びＨＢＤを有する成長因子として少なくともホリスタチンを産生するように特異的に誘導される。

いくつかの実施形態において、骨筋萎縮及び加齢に関連する炎症を含む様々な非特異的炎症状態の免疫調節に対処するための、本明細書で作製される分子系超構造の使用が記載される。

本発明の上記の概要及び以下の詳細な説明は、添付の図面とあわせて閲読されることにより、より良好に理解され得る。本発明は、図面に示された実施形態そのものに限定されるものではないことに留意されたい。

分子系超構造を例示的に示す。

本明細書に記載の全ての参考文献及び刊行物は、あらゆる目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。

他に定義しない限り、本明細書中で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈上、明らかに別段に解される場合を除き、複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「ペプチド」への言及には、複数のペプチドが含まれる。

「約」という用語は、数値の前に使用される場合、温度、時間、量、及び濃度など、範囲を含めて、（＋）もしくは（－）１０％、５％、または１％変動し得る近似値を示す。

特定の実施形態において、本明細書では、硫酸化ＧＡＧと、１つ以上の単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片とを含む合成バイオコンジュゲートであって、１つ以上の単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片は、硫酸化ＧＡＧに共有結合する。

本明細書で使用される場合、「バイオコンジュゲート」という用語は、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）と、それに共有結合する１つ以上のＡＨＳＧ分子またはそのＡＨＳＧ断片（天然または合成）とを含む合成コンジュゲートを指す。ＧＡＧ部分は、合成により作製することができ、または動物源に由来することもできる。いくつかの実施形態において、ＡＨＳＧ分子もしくはその断片は、ＡＨＳＧ分子またはＡＨＳＧ断片上の末端アミノ基（例えば、Ｎ末端またはアミノ酸側鎖）とＧＡＧ上のカルボキシル基との間を介して、またはＡＨＳＧ分子またはＡＨＳＧ断片（例えば、Ｃ末端またはアミノ酸側鎖）上のカルボキシル基とＧＡＧ上の好適な窒素原子または酸素原子との間を介して、ＧＡＧに共有結合し得る。いくつかの実施形態において、バイオコンジュゲートという用語は、ペプチドグリカンを含む。

本明細書で使用される場合、「ＧＡＧ」という用語は、グリコシド結合した多数の単糖を有する化合物を指し、「グリコサミノグリカン」または「グリカン」とも呼ばれ得る。特定の実施形態において、ＧＡＧは、ウロン酸と交互に結合した２－アミノ糖を含み、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン、ケラチン、及びデルマタンなどのポリマーを含む。したがって、本明細書に記載の実施形態で使用できるＧＡＧの非限定的な例としては、アルギン酸塩、アガロース、デキストラン、デキストラン硫酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）、デルマタン、デルマタン硫酸（ＤＳ）、ヘパラン硫酸、ヘパリン（Ｈｅｐ）、ケラチン、ケラタン硫酸、及びヒアルロン酸（ＨＡ）、ならびにそれらの誘導体が挙げられる。特定の実施形態において、ＧＡＧの分子量は、合成バイオコンジュゲートの効果を調整するために変更される（例えば、Ｒａｄｅｋ，Ｋ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｗｏｕｎｄ Ｒｅｐａｉｒ Ｒｅｇｅｎ．，２００９，１７：１１８－１２６及びＴａｙｌｏｒ，Ｋ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００５，２８０：５３００－５３０６を参照すること、これらは、あらゆる目的のためにその全体が参照により明示的に組み込まれる）。一実施形態において、ＧＡＧは、酸化及びアルカリ脱離によって分解され（例えば、Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｌ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８０，１０６：５９－６９を参照すること、これは、あらゆる目的のためにその全体が参照により明示的に組み込まれる）、より分子量の低い、分解されたＧＡＧが得られる（例えば、約１０ｋＤａ～約５０ｋＤａ）。いくつかの実施形態において、ＧＡＧは修飾されない。特定の実施形態において、ＧＡＧは化学修飾される。

特定の実施形態において、硫酸化ＧＡＧは、ヘパラン硫酸（ＨＳ）、ヘパリン（ＨＥＰ）、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）、デルマタン硫酸（ＤＳ）、ケラタン硫酸（ＫＳ）、またはそれらの誘導体である。特定の実施形態において、硫酸化ＧＡＧは、化学的に修飾されたＧＡＧである。本明細書で使用される場合、「化学的に修飾されたＧＡＧ」という用語は、ＧＡＧ（またはグリコサミノグリカン）の誘導体を含むことを意図する。例えば、化学的に修飾されたＧＡＧは、部分的にＮ－硫酸化された誘導体、部分的にＯ－硫酸化された誘導体、及び／または部分的にＯ－カルボキシメチル化された誘導体、またはそれらの組み合わせなどの１つ以上の化学的誘導体化を含み得るが、これらに限定されない。特定の実施形態において、ＧＡＧは、非酸化されたものである（すなわち、酸化的に切断された糖環を含まない）。特定の実施形態において、硫酸化ＧＡＧは、化学的に硫酸化されたＧＡＧである。

一実施形態において、ＧＡＧはヘパリンであり、ヘパリンは、硫酸化されたヘパリン誘導体、部分的にＮ－及び／または部分的にＯ－脱硫酸化されたヘパリン誘導体、部分的にＯ－カルボキシメチル化されたヘパリン誘導体、またはそれらの組み合わせなどのヘパリン誘導体を含み得るが、これらに限定されない。特定の実施形態において、ヘパリンは、非酸化されたヘパリンであり（すなわち、酸化的に切断された糖環を含まない）、アルデヒド官能基を含まない。ヘパリン誘導体、及び／または部分的にＮ－脱硫酸化されたヘパリン及び／または部分的にＯ－脱硫酸化されたヘパリン（すなわち、２－Ｏ及び／または６－Ｏ－脱硫酸化されたヘパリン）などのヘパリン誘導体を提供する方法は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｋａｒｉｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０００，２７５：２５９４９－５９５８、Ｌａｐｉｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９６，６（３）：３５５－３６６を参照すること、これらは、あらゆる目的のためにその全体が参照により明示的に組み込まれる）。また、部分的にＯ－カルボキシメチル化されたヘパリン（または任意のＧＡＧ）誘導体、例えば、Ｐｒｅｓｔｗｉｃｈ， ｅｔ ａｌ．（ＵＳ２０１２／０１４２９０７及びＵＳ２０１０／０３３０１４３、これらは、あらゆる目的のためにその全体が参照により明示的に組み込まれる）に従って調製され得るものを使用し、本明細書に開示されるバイオコンジュゲートを提供し得ることも企図される。

一実施形態において、ＧＡＧはデルマタン硫酸（ＤＳ）である。ＤＳの生物学的機能は広範囲にわたっており、内皮細胞やケラチノサイトの増殖及び移動を促進する成長因子ＦＧＦ－２、ＦＧＦ－７、及びＦＧＦ－１０の結合及び活性化を含む。いくつかの実施形態において、デルマタン硫酸の重量範囲は、約１０ｋＤａ～約７０ｋＤａである。一実施形態において、デルマタン硫酸の分子量は、約４６ｋＤａである。別の実施形態において、デルマタン硫酸は、酸化及びアルカリ脱離によって分解され（例えば、Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｌ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８０，１０６：５９－６９を参照すること、これは、あらゆる目的のためにその全体が参照により明示的に組み込まれる）、分子量の低い、分解されたデルマタン硫酸が得られる（例えば、約１０ｋＤａ）。

約６５０～７００Ｄａの単一二糖単位から約５０ｋＤａなど様々な分子量のＧＡＧが、本明細書に記載の合成バイオコンジュゲートに使用され得る。いくつかの実施形態において、ヘパリンは、約１０～約２０ｋＤａである。いくつかの実施形態において、ヘパリンは、最大約１５、または約１６、または約１７、または約１８、または約１９、または約２０ｋＤａである。特定の実施形態において、ヘパリンは、１つ以上の糖環を切断しない条件下で酸化され得る（例えば、Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１３，１４（７）：２４２７－２４３２を参照すること、これは、あらゆる目的のためにその全体が参照により明示的に組み込まれる）。

特定の実施形態において、合成バイオコンジュゲートは、Ｎ末端で硫酸化ＧＡＧに共有結合する１つ以上の単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片を含む。特定の実施形態において、ＡＨＳＧ分子もしくはその断片は、アミド結合を介してＮ末端で硫酸化ＧＡＧに共有結合する。

特定の実施形態において、ＡＨＳＧ分子またはＡＨＳＧ断片は、リンカーを介して硫酸化ＧＡＧに結合する。本明細書で使用される場合、「リンカー」という用語は、ＡＨＳＧ分子またはＡＨＳＧ断片をＧＡＧに連結するバイオコンジュゲートの任意の部分を指すことが意図される。このような実施形態において、リンカーは、１～１００個の直鎖原子を含み、切断可能または切断不可能であり得る。特定の実施形態において、リンカーは、切断不可能なリンカーである。特定の実施形態において、リンカーは、ペプチドリンカー（例えば、１～１０または１～５アミノ酸）を含む。リンカー配列がＡＨＳＧ分子またはＡＨＳＧ断片の意図的な結合を著しく妨げない限り、天然または非天然の任意のアミノ酸は、リンカー配列に使用され得ることが企図される。リンカーは、ＡＨＳＧ分子またはＡＨＳＧ断片の任意の好適なアミノ酸（側鎖、Ｃ末端またはＮ末端を含む）に結合することができる。特定の実施形態において、ＡＨＳＧ分子またはＡＨＳＧ断片は、リンカーを介して硫酸化ＧＡＧの主鎖に共有結合する。

本明細書に記載される様々な実施形態において、ＡＨＳＧ分子またはＡＨＳＧ断片は、１つ以上の保存的アミノ酸置換を含めることによって修飾され得る。当業者には周知であるように、保存的置換によりペプチドの任意の非重要アミノ酸を変更することは、置換するアミノ酸の側鎖が、置換されたアミノ酸の側鎖と同様の結合及び接触を形成することができるはずであるので、ペプチドの活性を有意に変更することはないはずである。ＡＨＳＧ分子またはＡＨＳＧ断片の結合活性に実質的に影響を及ぼさない限り、非保存的置換も可能である。

特定の実施形態において、１つ以上の単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片は、フェチュインＡに対して少なくとも約８０％の配列同一性を有する。本明細書で使用される場合、「配列同一性」という用語は、２つのペプチドまたはタンパク質間のアミノ酸残基またはヌクレオチド同一性のレベルを指す。比較される配列内の位置が同じアミノ酸によって占められている場合、分子はその位置で同一である。ペプチド（またはポリペプチドもしくはペプチド領域）が、別の配列とある特定のパーセンテージ（例えば、少なくとも約６０％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％）の「配列同一性」を有するとは、整列された場合、２つの配列を比較すると、そのパーセンテージのアミノ酸が同じであることを意味する。本明細書に開示される任意の配列（「参照配列」）の場合、参照配列に対して、少なくとも約６０％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列も本開示の範囲内であることに留意されたい。同様に、本開示は、参照配列と比較して、アミノ酸残基の１、２、３、４、または５個の置換、欠失、または付加を有する配列も含む。特定の実施形態において、本明細書で特定される任意の１つ以上の配列の場合、配列は、それからそれぞれ１、２、３、または最大５、または最大１０、または最大２０個のアミノ酸の付加、欠失、及び／または置換により修飾され得る。

特定の実施形態において、単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片は、フェチュインＡのＴＧＦβ結合配列を含む。特定の実施形態において、単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片は、フェチュインＡのＴＧＦβ結合配列に対して、少なくとも８０％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。

特定の実施形態において、単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片は、配列番号１～４または配列番号１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片は、配列番号１を含む。特定の実施形態において、単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片は、配列番号２を含む。特定の実施形態において、単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片は、配列番号３を含む。特定の実施形態において、単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片は、配列番号４を含む。特定の実施形態において、単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片は、配列番号１１を含む。

特定の実施形態において、単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片は、配列番号１～４または配列番号１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号１２の断片を含む配列番号１～４または配列番号１１のいずれか１つの断片である。特定の実施形態において、単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片は、配列番号１を含むか、または配列番号１２の断片を含む配列番号１の断片を含む。特定の実施形態において、単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片は、配列番号２を含むか、または配列番号１２の断片を含む配列番号２の断片を含む。特定の実施形態において、単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片は、配列番号３を含むか、または配列番号１２の断片を含む配列番号３の断片を含む。特定の実施形態において、単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片は、配列番号４を含むか、または配列番号１２の断片を含む配列番号４の断片を含む。特定の実施形態において、単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片は、配列番号１１を含むか、または配列番号１２の断片を含む配列番号１１の断片を含む。

特定の実施形態において、単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片は、配列番号１２のアミノ酸配列または配列番号１２に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片は、配列番号１２に対して、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。

特定の実施形態において、単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片は、約３～約１２０個のアミノ酸、または約３～約１１０個のアミノ酸、または約３～約１００個のアミノ酸、または約３～約９０個のアミノ酸、または約３～約８０個のアミノ酸、または約３～約７０個のアミノ酸、または約３～約６０個のアミノ酸、または約３～約５０個のアミノ酸、または約３～約４０個のアミノ酸、または約５～約１２０個のアミノ酸、または約５～約１００個のアミノ酸、または約５～約９０個のアミノ酸、または約５～約８０個のアミノ酸、または約５～約７０個のアミノ酸、または約５～約６０個のアミノ酸、または約５～約５０個のアミノ酸、または約５～約４０個のアミノ酸、または約５～約３０個のアミノ酸、または約５～約２０個のアミノ酸、または約５～約１０個のアミノ酸を含む。

特定の実施形態において、ＧＡＧ当たりの単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくはその断片の数は、ＧＡＧ主鎖上のＡＨＳＧ分子もしくはその断片で官能化されている二糖単位のパーセントに基づく「パーセント（％）官能化」として記載され得る。例えば、ＧＡＧ上に存在する利用可能な二糖単位の総数は、単一の二糖単位（例えば、約５５０～８００Ｄａ、または約６５０～７５０Ｄａ）の分子量（または平均分子量）をＧＡＧの分子量（例えば、約２５ｋＤａ～最大約７０ｋＤａ、またはさらには約１００ｋＤａ）で割ることで算出され得る。ＧＡＧが従来の「二糖単位」（例えば、アルギン酸）を含まない実施形態において、本明細書に提示される算出に用いられるＧＡＧ上に存在する利用可能な二糖単位の総数は、単一の糖単位の分子量（または平均分子量）をＧＡＧの分子量で割り、２を掛けることで算出し得る。

したがって、特定の実施形態において、ＧＡＧは、ＡＨＳＧ分子もしくはその断片による約１％～約５０％または約５％～約３０％官能化、またはＡＨＳＧ分子もしくはその断片による約１０％～約３０％官能化、またはＡＨＳＧ分子もしくはその断片による約２０％官能化が進行し、ＡＨＳＧ分子もしくはその断片によるパーセント（％）官能化は、ＡＨＳＧ分子もしくはその断片で官能化されたＧＡＧ上の二糖単位のパーセントによって決定される。いくつかの実施形態において、ＡＨＳＧ分子もしくはその断片によるＧＡＧのパーセント（％）官能化は、約１％～約７５％、１％～約５０％、または約３％～約４０％、または約５％～約３０％、または約１０％～約３０％、または約５％、または約１０％、または約１５％、または約２０％、または約２５％、または約３０％、または約３５％、または約４０％、または約４５％、または約５０％である。特定の実施形態において、硫酸化ＧＡＧは、約１％～約７５パーセント（％）官能化が進行し、パーセント（％）官能化は、単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片で官能化された硫酸化ＧＡＧの二糖単位のパーセントによって決定される。

特定の実施形態において、合成バイオコンジュゲートは、１～約２０個、または１～約１５個、または１～約１２個、または１～約１０個、または１～約９個、または１～約８個、または１～約７個、または１～約６個、または１～５個、または１～４個、または１～３個、または１～２個の単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片を含む。特定の実施形態において、合成バイオコンジュゲートは、１～５個の単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片を含む。

特定の実施形態において、ＡＨＳＧ分子もしくはその断片の数は、組成物中で変化する。本明細書に記載される実施形態のいずれかにおいて、硫酸化ＧＡＧ当たりのＡＨＳＧ分子もしくはその断片の数は平均値であり、組成物中の特定のバイオコンジュゲートは、硫酸化ＧＡＧ当たり、より多いＡＨＳＧ分子もしくはその断片を有し得、特定の合成バイオコンジュゲートは、硫酸化ＧＡＧ当たり、より少ないＡＨＳＧ分子もしくはその断片を有し得る。したがって、特定の実施形態において、本明細書に記載のＡＨＳＧ分子もしくはその断片の数は、合成バイオコンジュゲートの組成物において平均である。例えば、特定の実施形態において、合成バイオコンジュゲートは、ＧＡＧ当たりのＡＨＳＧ分子もしくはその断片の平均個数が約５個である組成物である。他の実施形態において、硫酸化ＧＡＧ当たりの単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片の平均個数は、１～約２０個、または１～約１５個、または１～約１２個、または１～約１０個、または１～約９個、または１～約８個、または１～約７個、または１～約６個、または１～５個、または１～４個、または１～３個、または１～２個である。

特定の実施形態において、合成バイオコンジュゲートは、１個の単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片を含む。

特定の実施形態において、合成バイオコンジュゲートは、単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片と、１つ以上の硫酸化ＧＡＧとを含み、１つ以上の硫酸化ＧＡＧが、単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片に共有結合する。

一実施形態において、本開示の合成バイオコンジュゲートは、ホリスタチンに直接的または間接的に結合する。本明細書で使用される場合、「結合」または「結合する」という用語は、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ、表面プラズモン共鳴、ＥＬＩＳＡ、競合的結合アッセイ、等温滴定熱量測定、ファージディスプレイ、親和性クロマトグラフィー、レオロジー、または免疫組織化学を用いて検出され得る分子間の相互作用を含むことを意味する。その用語は、分子間の「結合」性相互作用を含むことも意味する。結合は「直接」的または「間接」的であり得る。「直接」結合は、分子間の直接的な物理的接触を含む。分子間の「間接」結合は、１つ以上の分子と直接的な物理的接触を同時に有する分子を含む。この結合により、相互作用する分子を含む「複合体」が形成され得る。「複合体」とは、共有結合または非共有結合、相互作用または力により共に保持された２つ以上の分子の結合を指す。したがって、本明細書に開示される合成バイオコンジュゲートを含む組成物、またはそれを含む組成物であって、さらにホリスタチンを含む当該組成物を提供する。特定の実施形態において、ホリスタチンは、合成バイオコンジュゲートの１～５倍過剰に存在する。特定の実施形態において、ホリスタチンは、合成バイオコンジュゲートに対し、５倍過剰、または４倍過剰、または３倍過剰、または２倍過剰、または１：１の比率で存在する。

特定の実施形態において、ホリスタチンは、ＧＡＧの二糖単位当たり１：１のホリスタチン比率で存在する。特定の実施形態において、ホリスタチンは、ＧＡＧの二糖単位当たり１：２のホリスタチン比率で存在する。特定の実施形態において、ホリスタチンは、ＧＡＧの二糖単位当たり最大１：２のホリスタチン比率で存在する。特定の実施形態において、合成バイオコンジュゲートを含む組成物は、ＧＡＧの二糖単位当たり２：１～１：２、または１：１～１：２の平均比率でホリスタチンを含む。

特定の実施形態において、本明細書に開示される分子系超構造は、ａ）ＨＢドメインを有する１つ以上の成長因子の結合、ｂ）システインプロテアーゼに対する成長因子の保護、ｃ）抗炎症効果、ｄ）ＴＧＦｂ隔離、及びｅ）ミネラル隔離を提供する。超構造は、シスタチンドメイン１のアミノ末端での共有エステル結合によって天然ＡＨＳＧ分子とカルボキシル末端で官能化された硫酸化ＧＡＧ主鎖を有する。

この構築物はさらに成長因子と結合する。図１に示されたように、例示的なＧＡＧはヘパリンであり、例示的な成長因子はホリスタチンであるが、他のＧＡＧまたは成長因子が結合されてもよい。分子系超構造は、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）分子のカルボキシル末端とシスタチン１ドメインのＮ末端で結合するフェチュインＡ分子（ＡＨＳＧ）をコアに含み得る。この構造にはさらに、ヘパリン結合ドメイン（ＨＢＤ）でＧＡＧ伸長部分に静電的に結合するホリスタチン、またはＨＢＤを有する他の成長因子で構成され得る。

カルボジイミドカップリング化学は、分子を様々な基質に共有結合的にグラフトするための最も一般的なアプローチの１つである。これらのカップリング試薬のうち、バイオコンジュゲーションを目的とした一般的な架橋分子は、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）である。ＥＤＣは、カルボン酸基とアミノ基との間のコンジュゲーション反応を媒介して、生理学的ｐＨの水性環境で安定した分子間アミド結合形成を提供する。

組成物
一実施形態において、バイオコンジュゲートは、組成物中に投与される。本開示は、バイオコンジュゲートと、局所投与または全身投与などの投与のための薬学的に許容される担体とを含む組成物を提供する。特定の実施形態において、組成物は、筋肉内注射または関節内注射などの局所投与用に製剤化されるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、組成物は、筋肉内投与または静脈内投与などの全身投与または注入用に製剤化されるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、投与方式はバイオコンジュゲートの大きさに依存し、例えば、全身投与にはより短い主鎖が使用され得る。

水または生理食塩水を含めて当業者に知られている薬学的に許容される担体を使用し得る。当該技術分野で知られているように、成分及びそれらの相対量は、意図された用途及び送達方法によって決定される。組成物に使用される希釈剤または担体は、バイオコンジュゲートの所望の効果を弱めないように選択することができる。適切な組成物の例としては、水溶液、例えば等張食塩水中５％のグルコース溶液が挙げられる。アルコール、グリコール、エステル、及びアミドなどの他のよく知られた薬学的に許容される液体担体を使用してもよい。特定の実施形態において、組成物は、イオン強度修飾剤、溶解促進剤、マンニトールまたはソルビトールなどの糖、ｐＨ緩衝剤、界面活性剤、安定化ポリマー、防腐剤、及び／または共溶媒などの１つ以上の賦形剤をさらに含むが、これらに限定されない。

特定の実施形態において、組成物は水溶液である。水溶液は、製剤化の容易さ、及び溶液を注入してそのような組成物を容易に投与する能力に応じた組成物製剤の使用に適している。特定の実施形態において、組成物は、懸濁液、粘性もしくは半粘性ゲル、または他の種類の固体もしくは半固体組成物である。いくつかの実施形態において、組成物は、当該技術分野で非常によく知られている泡、軟膏、液体洗浄剤、ゲル、スプレー、及びリポソームの形態である。あるいは、局所投与は、ポンプ－カテーテルシステム、連続放出または選択的放出デバイス、または癒着バリアから選択されるデバイスを介して、提供されるバイオコンジュゲートを治療部位に注入することである。特定の実施形態において、組成物は、静脈または動脈の内壁に直接適用または接触する溶液である。いくつかの実施形態において、組成物はポリマーマトリックスを含む。他の実施形態において、組成物は吸収性である。特定の実施形態において、組成物は、ｐＨ緩衝剤を含む。いくつかの実施形態において、組成物は潤滑性向上剤を含有する。

特定の実施形態において、ポリマーマトリックスまたはポリマー材料は、組成物の薬学的に許容される担体または支持体として使用される。本明細書に記載されるポリマー材料は、例えば、糖、ペプチド、タンパク質、ラミニン、コラーゲン、ヒアルロン酸、イオン性及び非イオン性の水溶性ポリマーなどの天然または非天然のポリマー；アクリル酸ポリマー；ポリエチレンオキシド、ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレン共重合体、ポリビニルアルコール等の親水性ポリマー；ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、エーテル化セルロース等のセルロース系ポリマー及びセルロース系ポリマー誘導体；ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、乳酸とグリコール酸の共重合体、または他の天然及び合成ポリマー剤を含み得る。特定の実施形態において、本明細書で提供される組成物は、フィルム、ゲル、泡、またはその他の剤形として製剤化される。

好適なイオン強度修飾剤としては、例えば、グリセリン、プロピレングリコール、マンニトール、グルコース、デキストロース、ソルビトール、塩化ナトリウム、塩化カリウム、及び他の電解質が挙げられる。

特定の実施形態において、バイオコンジュゲートの溶解度を高める必要がある場合がある。そのような場合、溶解度は、適切な製剤化技術、例えば、マンニトール、エタノール、グリセリン、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ポロキサマー、及び当該技術分野で知られている他のものなどの溶解度増強組成物を組み込むことにより高めることが可能である。

特定の実施形態において、組成物は潤滑性向上剤を含有する。本明細書で使用される場合、潤滑性向上剤は、薬学的に許容される担体の粘度を改変することができる１つ以上の薬学的に許容されるポリマー材料を指す。適切なポリマー材料としては、イオン性及び非イオン性の水溶性ポリマー；ヒアルロン酸及びその塩、コンドロイチン硫酸及びその塩、デキストラン、ゼラチン、キトサン、ジェラン、他のバイオコンジュゲートもしくは多糖類、またはそれらの任意の組み合わせ；ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、エーテル化セルロース等のセルロース系ポリマー及びセルロース系ポリマー誘導体；コラーゲン及び修飾コラーゲン；グアーガム、ローカストビーンガム、及びタラガムなどのガラクトマンナン、ならびにマンノース及び／またはガラクトース部分を主要な構造成分（例えば、ヒドロキシプロピルグアー）として含む前述の天然ガム及び同様の天然または合成ガムに由来する多糖類；トラガカントガム、キサンタンガムなどのガム類；ジェランガム；アルギン酸塩及びアルギン酸ナトリウム；キトサン；ビニルポリマー；ポリエチレンオキシド、ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレン共重合体、ポリビニルアルコール等の親水性ポリマー；「カルボマー」ポリマーの一群（例えばＣａｒｂｏｐｏｌ（商標）で市販されているカルボキシポリアルキレン）などのカルボキシビニルポリマーまたは架橋されたアクリル酸ポリマー；及びその他の様々な粘性または粘弾性物質が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、潤滑性向上剤は、ヒアルロン酸、デルマタン、コンドロイチン、ヘパリン、ヘパラン、ケラチン、デキストラン、キトサン、アルギン酸塩、アガロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、及びエーテル化セルロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリジノン、ポビドン、カルボマー９４１、カルボマー９４０、カルボマー９７１Ｐ、カルボマー９７４Ｐ、またはそれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される。一実施形態において、潤滑性向上剤は、バイオコンジュゲートと同時に適用される。あるいは、一実施形態において、潤滑性向上剤は、バイオコンジュゲートに対して順次適用される。一実施形態において、潤滑性向上剤は、コンドロイチン硫酸である。一実施形態において、潤滑性向上剤は、ヒアルロン酸である。潤滑性向上剤は、組成物の粘度を変化させることが可能である。

いくつかの実施形態において、バイオコンジュゲートは、ミネラル、アミノ酸、糖、ペプチド、タンパク質、ビタミン（アスコルビン酸など）、またはラミニン、コラーゲン、フィブロネクチン、ヒアルロン酸、フィブリン、エラスチン、またはアグリカン、または上皮成長因子、血小板由来成長因子、形質転換成長因子ベータもしくは線維芽細胞成長因子などの成長因子、及びデキサメタゾンのようなグルココルチコイド、またはイオン性及び非イオン性の水溶性ポリマーなどの粘弾性変更剤；アクリル酸ポリマー；ポリエチレンオキシド、ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレン共重合体、ポリビニルアルコール等の親水性ポリマー；ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、エーテル化セルロース等のセルロース系ポリマー及びセルロース系ポリマー誘導体；ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、乳酸とグリコール酸の共重合体、または他の天然及び合成ポリマー剤両方と組み合わせて使用され得る。

本明細書の組成物に使用するのに好適なｐＨ緩衝剤としては、例えば、酢酸塩、ホウ酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、及びリン酸塩の緩衝液、ならびに塩酸、水酸化ナトリウム、酸化マグネシウム、リン酸一カリウム、重炭酸塩、アンモニア、炭酸、塩酸、クエン酸ナトリウム、クエン酸、酢酸、リン酸水素二ナトリウム、ホウ砂、ホウ酸、水酸化ナトリウム、ジエチルバルビツール酸、タンパク質、ならびに様々な生物学的緩衝液（例えば、ＴＡＰＳ、Ｂｉｃｉｎｅ、トリス、トリシン、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、カコジル酸塩、またはＭＥＳ）が挙げられる。特定の実施形態において、貯蔵条件下でのｐＨドリフトを防ぐために、適切な緩衝液系（例えば、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、またはホウ酸）が組成物に添加される。いくつかの実施形態において、緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液（すなわち、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、及びいくつかの製剤では塩化カリウム及びリン酸カリウムを含む）である。特定の濃度は、使用する薬剤に応じて変わる。特定の実施形態において、ｐＨ緩衝液系（例えば、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、またはホウ酸）を添加して、ｐＨを、約ｐＨ４～約ｐＨ８、または約ｐＨ５～約ｐＨ８、または約ｐＨ６～約ｐＨ８、または約ｐＨ７～約ｐＨ８の範囲内に維持する。いくつかの実施形態において、緩衝液は、ｐＨを、約ｐＨ４～約ｐＨ８の範囲内に維持するように選択される。いくつかの実施形態において、ｐＨは約ｐＨ５～約ｐＨ８である。いくつかの実施形態において、緩衝液は、生理食塩水緩衝液である。特定の実施形態において、ｐＨは、約ｐＨ４～約ｐＨ８、または約ｐＨ３～約ｐＨ８、または約ｐＨ４～約ｐＨ７である。いくつかの実施形態において、組成物は、ポリマーマトリックス、ｐＨ緩衝剤、潤滑性向上剤、及びバイオコンジュゲートを含む、フィルム、ゲル、パッチ、または溶液の形態であり、当該組成物は、任意選択で防腐剤を含み、当該組成物のｐＨは、約ｐＨ４～約ｐＨ８の範囲内である。

バイオコンジュゲートは、エンドトキシン及び感染因子を含めるが、これらに限定されない望ましくない汚染物質を除去するために滅菌され得る。バイオコンジュゲートの構造及び生体栄養特性に悪影響を及ぼさない滅菌技術が使用され得る。特定の実施形態において、バイオコンジュゲートは、プロピレンオキシドまたはエチレンオキシド処理、無菌濾過、ガスプラズマ滅菌、ガンマ線照射、電子線、及び／または過酢酸などの過酸を用いた滅菌を含む従来の滅菌技術を使用して消毒及び／または滅菌され得る。一実施形態において、バイオコンジュゲートは、１つ以上の滅菌工程に供され得る。あるいは、バイオコンジュゲートは、プラスチックラップまたはホイルラップを含むいずれの種類の容器に包まれてもよく、さらに滅菌されてもよい。

いくつかの実施形態において、使用中の微生物汚染を防ぐために、組成物に防腐剤が添加される。組成物に添加される適切な防腐剤としては、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、アルキルパラベン、安息香酸アルキル、クロロブタノール、クロロクレゾール、セチルアルコール、ヘキサデシルアルコールなどの脂肪族アルコール、酢酸塩、硝酸フェニル水銀、またはホウ酸フェニル水銀などの水銀の有機金属化合物、ジアゾリジニル尿素、アジピン酸ジイソプロピル、ジメチルポリシロキサン、ＥＤＴＡ塩、ビタミンＥ及びその混合物が挙げられる。特定の実施形態において、防腐剤は、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、臭化ベンゾドデシニウム、メチルパラベン、プロピルパラベン、フェニルエチルアルコール、エデト酸二ナトリウム、ソルビン酸、またはポリクオタニウム－１から選択される。特定の実施形態において、組成物は防腐剤を含む。いくつかの実施形態において、防腐剤は、約０．００１％～約１．０％ｗ／ｖのレベルで使用される。特定の実施形態において、組成物は防腐剤を含まず、「保存されない」と見なされる。いくつかの実施形態において、単位用量組成物は、滅菌されているが、保存されない。

いくつかの実施形態において、組成物の送達を促進するために、バイオコンジュゲート及び他の薬剤の別個のまたは連続した投与が必要である。特定の実施形態において、バイオコンジュゲート及び他の薬剤は、異なる投薬頻度または投薬間隔で投与され得る。例えば、バイオコンジュゲートは、毎日投与することができるが、他の薬剤は、より少ない頻度で投与することができる。さらに、当業者には明らかなように、バイオコンジュゲート及び他の薬剤は、同様な投与経路または異なる投与経路を用いて投与することができる。

バイオコンジュゲートを投与するための任意の効果的なレジメンを使用することができる。例えば、バイオコンジュゲートは、単回投薬として、または毎日の複数回投薬レジメンとして投与することができる。さらに、毎日の治療の代わりに、例えば週に１～５日の変則的レジメンを使用することもできる。

様々な実施形態において、バイオコンジュゲートは、フィルム、ゲル、パッチ、または溶液などによって局所的に投与することができる。いくつかの実施形態において、提供される組成物は、緩衝化された滅菌水溶液中にある。特定の実施形態において、溶液は、約１～約１００センチポイズ（ｃｐｓ）、または約１～約２００ｃｐｓ、または約１～約３００ｃｐｓ、または約１～約４００ｃｐｓの粘度を有する。いくつかの実施形態において、溶液は、約１～約１００ｃｐｓの粘度を有する。特定の実施形態において、溶液は、約１～約２００ｃｐｓの粘度を有する。特定の実施形態において、溶液は、約１～約３００ｃｐｓの粘度を有する。特定の実施形態において、溶液は、約１～約４００ｃｐｓの粘度を有する。特定の実施形態において、溶液は、注射可能な溶液の形態である。他の実施形態において、組成物は、粘稠な、すなわち、数百から数千ｃｐｓの粘度を有する液体、ゲル、または軟膏として製剤化される。これらの実施形態において、バイオコンジュゲートは、適切な薬学的に許容される担体中に分散または溶解される。

本開示により企図される例示的な組成物は、水性もしくは油性懸濁液、またはゴマ油、トウモロコシ油、綿実油、もしくはピーナッツ油を伴う乳剤、ならびにエリキシル剤、マンニトール、デキストロース、または無菌水溶液、及び類似の薬学的ビヒクルを含む注射による投与用であってもよい。生理食塩水の水溶液も従来から注射に使用されているが、本開示の関連においてはあまり好ましくない。エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど（及びこれらの好適な混合物）、シクロデキストリン誘導体、及び植物油も使用し得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散の場合には必要とされる粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって、維持することができる。微生物の作用は、種々の抗細菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって抑制し得る。

薬物送達に使用されるフィルムは、当該技術分野で周知であり、多糖類（例えば、セルロース、マルトデキストリンなど）などの浸出性不純物を含まない非毒性、非刺激性のポリマーを含む。いくつかの実施形態において、ポリマーは親水性である。他の実施形態において、ポリマーは疎水性である。フィルムは、貼付した組織に密着し、約１週間かけてゆっくりと体内に吸収される。本明細書に記載の薄膜剤形に使用されるポリマーは、吸収性を有し、当該技術分野で周知のように、十分な剥離強度、せん断強度、及び引張強度を示す。いくつかの実施形態において、フィルムは注射可能である。特定の実施形態において、フィルムは、外科的介入の前、最中、または後に患者に投与される。

本明細書で使用されるゲルは、柔らかく弱いものから硬くて強いものまでの範囲の特性を有し得る固体のゼリー状の材料を指す。当該技術分野で周知のように、ゲルは、流体によってその全体積にわたって拡張される非流体コロイドネットワークまたはポリマーネットワークである。ヒドロゲルは、親水性のポリマー鎖のネットワークを含むゲルの一種であり、水が分散媒であるコロイドゲルとして見られることもある。ヒドロゲルは、吸収性が高く、例えば水分が９０％を超えるなど、高い割合で水を含むことができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のゲルは、天然または合成ポリマーネットワークを含む。いくつかの実施形態において、ゲルは、親水性ポリマーマトリックスを含む。他の実施形態において、ゲルは、疎水性ポリマーマトリックスを含む。いくつかの実施形態において、ゲルは、天然組織と非常に類似した程度の柔軟性を有する。特定の実施形態において、ゲルは、生体適合性及び吸収性を有する。特定の実施形態において、ゲルは、外科的介入の前、最中、または後に患者に投与される。

例示的な製剤は、ａ）本明細書に記載の１つ以上のバイオコンジュゲート；ｂ）薬学的に許容される担体；ｃ）マトリックスネットワークとしての親水性ポリマーを含み得、ただし、当該組成物は、粘稠な、すなわち、数百から数千ｃｐｓの粘度を有する液体、ゲル、または軟膏として製剤化される。これらの実施形態において、バイオコンジュゲートは、適切な薬学的に許容される担体中に分散または溶解される。

特定の実施形態において、バイオコンジュゲート、またはそれを含む組成物は、製剤化前、製剤化中、または製剤化後に凍結乾燥される。したがって、本明細書では、本明細書に記載のバイオコンジュゲートまたはそれを含む組成物を含む凍結乾燥組成物も提供される。

バイオコンジュゲートの好適な用量は、標準的な方法、例えば実験動物モデルまたは臨床試験において用量反応曲線を確立することによって決定することができ、患者の状態、治療されている病状、投与経路及び組織分布、ならびに他の治療法の併用の可能性に応じて大幅に変動し得る。患者に投与される有効量は、体表面積、患者の体重または質量、及び患者の状態に関する医師の評価に基づく。様々な例示的な実施形態において、用量は、約０．０１μｇ～約１０ｇの範囲である。例えば、全身送達の場合、用量は、約１０ｇ、または約５ｇ、または約１ｇであり得る。他の例示的な実施形態において、有効用量は、１回当たり約１００μｇ～約１０ｇ、または１回当たり約１００μｇ～約１ｇ、または１回当たり約１００μｇ～約５００ｍｇ、１回当たり約０．０１μｇ～約１００ｍｇ、または１回当たり約１００μｇ～約５０ｍｇ、または１回当たり約５００μｇ～約１０ｍｇ、または１回当たり約１ｍｇ～１０ｍｇ、または１回当たり約１～約１００ｍｇ、または１回当たり約１ｍｇ～５００ｍｇ、または１回当たり約１ｍｇ～２００ｍｇ、または１回当たり約１０ｍｇ～１００ｍｇ、または１回当たり約１０ｍｇ～７５ｍｇ、または１回当たり約１０ｍｇ～５０ｍｇ、または１回当たり約１０ｍｇ、または１回当たり約２０ｍｇ、または１回当たり約３０ｍｇ、または１回当たり約４０ｍｇ、または１回当たり約５０ｍｇ、または１回当たり約６０ｍｇ、または１回当たり約７０ｍｇ、または１回当たり約８０ｍｇ、または１回当たり約９０ｍｇ、または１回当たり約１００ｍｇの範囲である。本明細書に記載の様々な実施形態のいずれかにおいて、有効用量は、１回当たり約０．０１μｇ～約１０００ｍｇ、１回当たり１μｇ～約１００ｍｇ、約１００μｇ～約１．０ｍｇ、約５０μｇ～約６００μｇ、約５０μｇ～約７００μｇ、約１００μｇ～約２００μｇ、約１００μｇ～約６００μｇ、約１００μｇ～約５００μｇ、約２００μｇ～約６００μｇ、または１回当たり約１００μｇ～約５０ｍｇ、または１回当たり約５００μｇ～約１０ｍｇ、または１回当たり約１ｍｇ～約１０ｍｇの範囲である。

特定の実施形態において、本明細書に記載の化合物に適した１日の投薬量は、体重１ｋｇ当たり約０．０１～約２．５ｍｇである。いくつかの実施形態において、ヒトを含めるがこれに限定されないより大きな対象における示された１日の投薬量は、約０．５ｍｇ～約１００ｍｇの範囲で、１日最大４回を含むがこれに限定されない分割用量で、または持続放出形態で好都合に投与される。特定の実施形態において、経口投与に好適な単位剤形は、約１～約５０ｍｇの活性成分を含む。個々の治療レジームに関する変数の数は多く、これらの推奨値から大幅に逸脱することは珍しいことではないので、前述の範囲は、単なる示唆にすぎない。特定の実施形態において、用量は、使用される化合物の活性、治療される疾患または疾状、投与方法、個別対象の要件、治療されている疾患または疾状の重症度、及び医師の判断に限定されない多くの変数に応じて変更される。

特定の実施形態において、そのような治療レジメンの毒性及び治療有効性は、ＬＤ_５０（集団の５０％致死用量）及びＥＤ_５０（集団の５０％に治療上有効な用量）を測定することを含めるが、これらに限定されない細胞培養物または実験動物における標準薬学的手順により決定される。毒性と治療効果との間の用量比は治療指数であり、ＬＤ_５０とＥＤ_５０との間の比として表現され得る。特定の実施形態において、高い治療指数を示す化合物が好ましい。いくつかの実施形態において、細胞培養アッセイ及び動物研究から入手されるデータは、ヒトにおいて使用するための投薬量の範囲を公式化する際に使用される。具体的な実施形態において、そのような化合物の投薬量は、最少の毒性でＥＤ_５０を含む血中濃度の範囲内に収まる。特定の実施形態において、投薬量は、用いられる投薬形態及び利用される投与経路に依存してこの範囲内で変動する。

実施例１：グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を化学的に硫酸化する一般的な手順。

グリコサミノグリカン（例えば、デキストラン、コンドロイチン、デルマタン、ヘパリン、ケラチン、ヒアルロン酸など）は、商業的供給元から購入することができる。グリコサミノグリカンをテトラブチルアミン塩に変換し、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドに溶解し、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドに溶解したＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド三酸化硫黄複合体をそれに添加する。７０℃で１時間後、冷水を加えて反応を停止する。１０ＮのＮａＯＨを用いてｐＨをｐＨ９に調整する。硫酸化物質を酢酸ナトリウムで飽和させた３倍量のエタノールで沈殿させ、遠心分離により収集する。得られたペレットを７５％のエタノールで３回洗浄し、超音波を使用してペレットを粉砕し、続いて遠心分離を行う。硫酸化物質を水に溶解し、透析して塩を除去し、凍結乾燥する。

実施例２：精製された成分を使用した合成バイオコンジュゲートの合成は、以下のステップによって達成される。
１．硫酸化ＧＡＧ［ヘパラン硫酸（ＨＳ）、ヘパリン（ＨＥＰ）、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）、デルマタン硫酸（ＤＳ）、またはケラタン硫酸（ＫＳ）］の１つまたはそれらの混合物は、２℃～４℃でカルボジイミド結合剤を利用して活性化される。一般的な方法では、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド／Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミド（ＥＤＣ／ｓＮＨＳ）を使用して、ＧＡＧ上のカルボン酸部分を活性化する。可溶性ゲルには低分子量のＧＡＧを使用するか、またはより安定したゲルにはより高分子量のＧＡＧを使用する。
２．ＡＨＳＧをＧＡＧモノマーと２：１のモル比で加え、サーモミキサーで８℃で１５分間インキュベートする。このステップでは、ＡＨＳＧのシスタチンドメイン１のＮ末端がＧＡＧのＥＤＣ／ｓＮＨＳ活性化カルボン酸基に結合し、定義されたバイオハイブリッドマトリックスを形成する。
３．組成物は、蒸留水透析により少なくとも５時間洗浄される。
４．組成物は、生理学的緩衝液中に再懸濁される。
５．成長因子を、ＧＡＧモノマーと２：１のモル比で溶液に添加する。
６．アジュバント（アミノ酸、ペプチド、サイトカイン、Ｎ－アセチルシステインなど）を溶液に添加する。
７．溶液の体積は、生理学的緩衝液で最終濃度に調整される。
８．溶液はガンマ線照射され、滅菌容器に包装される。

別の合成では、ＧＡＧ及び成長因子の両方を生成する細胞培養（馴化培地（ＣＭ））に事前に曝露された細胞培養培地組成物を使用する。このアプローチは、次のステップを含む。
１．ＣＭを収集し、０．１μｍフィルター膜で濾過する。
２．組成物は、蒸留水透析により少なくとも３時間洗浄される。
３．ＥＤＣ／ＮＨＳを低温（８℃）でサーモミキサーに加え、低速で３０分間撹拌する。
４．組成物は、蒸留水透析により少なくとも５時間洗浄される。
５．アジュバント（成長因子、アミノ酸、ペプチド、サイトカイン、Ｎ－アセチルシステインなど）を溶液に添加する。
６．溶液はガンマ線照射され、滅菌容器に包装される。

実施例３．バイオコンジュゲートを試験するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ系は、線量効果関係を確立するためにバイオコンジュゲートを様々な濃度で添加するｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養を含む。

このようなシステムは、分化を許容しない条件下でｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖する初代筋芽細胞の培養を含む。バイオコンジュゲートは、筋肉前駆細胞（筋芽細胞）の成長速度を評価するために試験される。バイオコンジュゲートは、筋芽細胞の分化、融合速度、核及びミトコンドリアの含有量、ＡＴＰ含有量について同様のｉｎ ｖｉｔｒｏ系での評価のために、さらに試験される。

免疫系への影響は、末梢血単核細胞培養物（ＰＢＭＣ）におけるサイトカイン放出によって試験される。ＰＢＭＣ培養物に様々な用量のバイオコンジュゲートを２４～４８時間添加し、その後上清をＥＬＩＳＡまたはＬｕｍｉｎｅｘアッセイによりサイトカインについて分析する。次いで、ＰＢＭＣは、追加のサイトカインに対してフローサイトメトリーまたは細胞内染色（ＩＣＳ）を行い、様々なリンパ球について分析される。

追加の研究は、ニューロン、骨細胞、軟骨細胞、上皮細胞、肝細胞、心筋細胞、脂肪細胞及び他の細胞を含む他の細胞集団に対する影響を研究するために設計される。

バイオコンジュゲートの安全性と有効性を評価するために、ｉｎ ｖｉｖｏ実験が行われる。確立された試験方法により、筋肉、関節、免疫系、代謝、脂肪生成、認知機能への影響を立証するために、若い、成体、及び老齢動物を様々な投薬レジメンに使用する。

この方法を使用する利点の１つは、特殊な細胞培養のセクレトーム全体が含まれることである。しかしながら、カルボジイミドカップリング反応の場合、混合物中の任意の分子のアミノ基と結合する可能性があるので、正確な構造は予測が難しい。培地中に存在する小さなアミノ酸とペプチドの結合を防ぐために、１０ｋＤａのカットオフ分子量で最初の透析がＣＭに対して実行される。

本明細書に記載の組成物は、担体または徐放性構築物を提供する。組成物は親水性であり、静電的に結合した成長因子は、主鎖のゆっくりとした拡散または酵素分解によって放出される。

ヒトフェチュインＡ（以前にはα２ＨＳ糖タンパク質（ＡＨＳＧ）と呼ばれていた）は、多機能糖タンパク質であり、若い生物では遍在的に分泌され、成体ではほぼ独占的に肝実質細胞によって分泌される。細胞培養由来ＡＨＳＧは、ヒト血清から単離された二本鎖部分リン酸化型とは対照的に、非リン酸化一本鎖型で分泌される。

ＡＨＳＧを機能性分子として使用する利点は、次のとおりである。
１．広範囲のプロテアーゼ阻害。ＡＨＳＧ組成物中の２つのシスタチンドメインは、システインプロテアーゼ阻害剤のシスタチンスーパーファミリーに属しているため、結合した成長因子の酵素分解に対する保護を付与する。
２．フェチュインＡは、抗炎症特性を持つ陰性急性期反応物としても知られている。ＡＨＳＧは、自然免疫細胞によるＰＡＭＰ誘導性ＨＭＧＢ１放出を直接阻害することにより、抗炎症効果をもたらす。
３．さらに、ＡＨＳＧはミネラルシャペロンであり、ヒドロキシアパタイト結晶に結合し、ｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏの両方で石灰化を阻害する。組織、特に血管の石灰化は、よく知られた老化による現象である。
４．ＡＨＳＧの特異的結合ドメインによるＴＧＦｂ１の抑制により、老化の多くの否定的な面が抑制され得る。

ＢＭＰ－２、ＢＭＰ－７、ＶＥＧＦ、ＰＤＧ、ＦＧＦ－２などの多くの成長因子は、ＥＣＭの硫酸化ＧＡＧと特異的に相互作用する。本明細書に記載の構築物は、特にホリスタチン（ＦＳＴ）の使用に焦点が当てられているが、同様の生物学的活性を有する他の成長因子またはペプチドの使用を排除するものではない。

ホリスタチンは、Ｎ－末端ドメインとそれに続く３つのＦＳＴドメインを含むマルチドメインタンパク質であり、ＧＡＧ鎖の空間的に定義された負に荷電したスルホ基またはカルボキシル基とイオン対を形成する正に荷電した塩基性アミノ酸のクラスターが存在することが特徴である。ＦＳＴは、最初のＦＳドメインの塩基性の高い１２残基セグメント（残基７５～８６）でヘパリンに結合する。この複合体は、ＦＳＴを細胞表面に局在させ、ＦＳＴに結合したリガンドのエンドサイトーシスを促進し、リガンドの中和機構として機能する。ＦＳＴの既知の受容体はないが、ＦＳＴのリガンドとして機能するアクチビンＡ及びミオスタチンとの相互作用が非常によく特徴付けられている。

ミオスタチン及びアクチビンＡは、骨格筋量を制限するように作用するＴＧＦ－βファミリーのメンバーである。ミオスタチン及びアクチビンＡは、衛星細胞が分化して太い筋線維に融合する能力を抑制することにより、急性及び慢性損傷に対する筋肉の再生能力を低下させる。さらに、ミオスタチンは、若い骨髄幹細胞（ＢＭＳＣ）と老化した骨髄幹細胞の両方の増殖を用量依存的に減少させる一方、アクチビンＡは、若いＢＭＳＣと老化したＢＭＳＣの両方の石灰化を増加させる。アクチビンＡはまた、単球／マクロファージ、骨髄性樹状細胞、及びＴ細胞サブセットの発生を指示し、２型及び調節性免疫反応を促進する。

患者から収集された血清データは、老化がアクチビンＡ及びミオスタチンの発現の変化、ならびにこれらの因子に対する骨及び筋肉前駆細胞の反応の変化を伴うことを示唆する。したがって、ミオスタチン及びアクチビンＡ活性の阻害は、老化によって引き起こされる免疫不全を軽減しながら、筋肉量及び筋力を増加させるのに効果的であり得る。

本開示ではさらに、ＣＭを生成するために使用されるｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養系が開示される。当該培養系は、ヒト多能性幹細胞または多分化能性幹細胞からの部分的に分化した細胞集団を含む。細胞は、最初にｂＦＧＦ及びアクチビンＡを含む無血清培地に曝露される。コンフルエントに達したら、ｂＦＧＦ及びアクチビンＡを組成物から除去し、培養物を超生理学的濃度のシグナル伝達アミノ酸アルギニン及びロイシンの存在下で１～３日間分化させる。分化後、上清を回収した後、毎日新しい培地を加える。上清は、本明細書に記載の組成物を生成するためにさらに使用される。

上記のように得られた部分分化した多能性幹細胞の３つの異なる培養物からの上清を分析し、９．５６＋／－３．１８μｇ／Ｌ ＦＳＴ及び２．８６＋／－０．４２ｍｇ／ＬのＡＨＳＧが明らかになった。これらのタンパク質の検出濃度は、正常なヒト成人の濃度よりもはるかに高い：ＦＳＴ３．５＋／－０．２μｇ／Ｌ及びＡＨＳＧ：０．５８±０．１２ｍｇ／Ｌ。

例示的な出発集団は、胚（胚性幹細胞）または人工多能性幹細胞に由来する多能性幹細胞集団である。例示的なＦＳＴ源としての細胞種はヒトであるが、ＦＳＴの高度に保存された性質を考慮すると、非哺乳類種（つまり、魚や昆虫）を含む広範囲の種を使用することができる。特定の実施形態において、異種分子の潜在的な免疫原性を考慮すると、ＡＨＳＧ及び硫酸化ＧＡＧの種はヒトである。様々な系（細菌、昆虫、または哺乳動物）によって生成される組換えヒトタンパク質も、合成のためのＡＨＳＧ及びホリスタチンの例示的な代替供給源である。

表１には、本明細書に記載され使用されるＡＨＳＧ分子に含まれた例示的な配列が提供される。

これまで説明した実施形態の検討及び／または補足として、本主題の様々な態様を以下に説明するが、ここでは以下の実施形態の相互関係及び互換可能性に重点を置く。換言すれば、明示的に別段の記載がないか、または論理的に妥当ではない場合を除き、実施形態の各特徴を他のあらゆる特徴と組み合わせることができるという事実に重点を置く。本明細書に記載の実施形態は、図を明示的に参照することなく、以下の段落で再説明及び展開する。

多くの実施形態において、合成バイオコンジュゲートは、硫酸化ＧＡＧと、１つ以上の単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片とを含み、１つ以上の単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片は、硫酸化ＧＡＧに共有結合する。

いくつかの実施形態において、硫酸化ＧＡＧは、ヘパラン硫酸（ＨＳ）、ヘパリン（ＨＥＰ）、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）、デルマタン硫酸（ＤＳ）、ケラタン硫酸（ＫＳ）、またはそれらの誘導体である。

いくつかの実施形態において、硫酸化ＧＡＧは、化学的に修飾されたＧＡＧである。

いくつかの実施形態において、硫酸化ＧＡＧは、化学的に硫酸化されたＧＡＧである。

いくつかの実施形態において、１つ以上の単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片は、Ｎ末端で硫酸化ＧＡＧに共有結合する。

いくつかの実施形態において、１つ以上の単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片は、アミド結合を介して、Ｎ末端で硫酸化ＧＡＧに共有結合する。

いくつかの実施形態において、１つ以上の単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片は、フェチュインＡに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。

いくつかの実施形態において、単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片は、フェチュインＡのＴＧＦβ結合配列を含む。

いくつかの実施形態において、単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片は、フェチュインＡのＴＧＦβ結合配列に対して、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。

いくつかの実施形態において、単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び配列番号１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態において、単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び配列番号１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号１２の断片を含む配列番号１～４または配列番号１１のいずれか１つの断片である。

いくつかの実施形態において、単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片は、配列番号１２のアミノ酸配列または配列番号１２に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態において、単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片は、配列番号１２に対して、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。

いくつかの実施形態において、硫酸化ＧＡＧは、約１～約７５パーセント（％）官能化が進行し、パーセント（％）官能化は、単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片で官能化された硫酸化ＧＡＧの二糖単位のパーセントによって決定される。

いくつかの実施形態において、合成バイオコンジュゲートは、１～２０個の単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片を含む。

いくつかの実施形態において、合成バイオコンジュゲートは、１～５個の単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片を含む。

いくつかの実施形態において、合成バイオコンジュゲートは、１個の単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片を含む。

いくつかの実施形態において、１つ以上の単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片は、リンカーを介して硫酸化ＧＡＧに共有結合する。

いくつかの実施形態において、１つ以上の単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片は、リンカーを介して硫酸化ＧＡＧの主鎖に共有結合する。

多くの実施形態において、合成バイオコンジュゲートは、単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片と、１つ以上の硫酸化ＧＡＧとを含み、１つ以上の硫酸化ＧＡＧが、単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片に共有結合する。

多くの実施形態において、組成物は、先行請求項のいずれかに記載の合成バイオコンジュゲートを含み、硫酸化ＧＡＧ当たりの単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片の平均個数は、１～約１０個である。

多くの実施形態において、組成物は、請求項１～２０のいずれか１項に記載の合成バイオコンジュゲートを含み、硫酸化ＧＡＧ当たりの単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片の平均個数は、１～約５個である。

いくつかの実施形態において、組成物は、さらにホリスタチンを含む。

いくつかの実施形態において、ホリスタチンは、合成バイオコンジュゲートの１～５倍過剰に存在する。

多くの実施形態において、加齢に関連した疾患または障害を治療する方法であって、それを必要とする患者に、有効量の請求項１～２０のいずれか１項に記載の合成バイオコンジュゲート、または請求項２１もしくは２２に記載の組成物を投与することを含む当該方法。

多くの実施形態において、骨筋系に影響を与える疾患を治療する方法であって、それを必要とする患者に、有効量の請求項１～２０のいずれか１項に記載の合成バイオコンジュゲート、または請求項２１もしくは２２に記載の組成物を投与することを含む当該方法。

多くの実施形態において、免疫調節不全を治療する方法であって、それを必要とする患者に、有効量の請求項１～２０のいずれか１項に記載の合成バイオコンジュゲート、または請求項３０もしくは３１に記載の組成物を投与することを含む当該方法。

多くの実施形態において、請求項１～１６のいずれか１項に記載の合成バイオコンジュゲート、または請求項２１もしくは２２に記載の組成物は、筋肉内、関節内、または静脈内に投与される、請求項２１～２３のいずれか１項に記載の方法。

いくつかの実施形態において、請求項１～１６のいずれか１項に記載の合成バイオコンジュゲート、または請求項１７もしくは１８に記載の組成物は、体重１ｋｇ当たり約０．０１～約２．５ｍｇの範囲の量で投与される。

多くの実施形態において、組成物は、少なくとも１つのＡＨＳＧ分子で官能化された硫酸化ＧＡＧ主鎖を含み、硫酸化ＧＡＧ主鎖は、ヘパラン硫酸（ＨＳ）、ヘパリン（ＨＥＰ）、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）、デルマタン硫酸（ＤＳ）、またはケラタン硫酸（ＫＳ）であり、少なくとも１つのＡＨＳＧ分子は、単鎖でありかつ非リン酸化されている。

いくつかの実施形態において、硫酸化ＧＡＧ主鎖は、ヘパリン結合ドメインを有するペプチドに結合し、当該ペプチドは、ホリスタチン（ＦＳＴ）である。いくつかの実施形態において、ホリスタチンは、細胞培養物から収集された天然分子、または結合するアクチビンＡ及びミオスタチンと同様の機能を有する合成ペプチドである。いくつかの実施形態において、硫酸化ＧＡＧ主鎖、少なくとも１つのＡＨＳＧ分子、及びＦＳＴは、同様のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物中で得られる。いくつかの実施形態において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物はヒト幹細胞から由来し、ヒト幹細胞は胚性多能性幹細胞または人工多能性幹細胞である。

多くの実施形態において、分子構造を生成する方法は、架橋剤を使用してＧＡＧ分子のカルボキシル末端を少なくとも１つのＡＨＳＧ分子のＮ末端と結合させ、架橋構造を生成するステップと、透析により過剰量の架橋剤を除去するステップと、架橋構造と成長因子とを結合させるステップと、結合した架橋構造及び成長因子を生理学的緩衝液で希釈するステップとを含む。

いくつかの実施形態において、成長因子は、ホリスタチンを含む。

多くの実施形態において、分子構造を生成する方法は、少なくとも１つのＧＡＧ分子及び少なくとも１つのＡＨＳＧ分子を含む細胞培養上清を得るステップと、透析により１０ｋＤａ未満の分子を除去し、少なくとも１つのＧＡＧ分子及び少なくとも１つのＡＨＳＧ分子を含む透析した上清を作製するステップと、カルボジイミド架橋剤を透析した上清と混合するステップであって、少なくとも１つのＧＡＧ分子のカルボキシル末端が少なくとも１つのＡＨＳＧ分子のＮ末端と結合して架橋構造を生成する当該ステップと、過剰量のカルボジイミド架橋剤を透析により除去するステップとを含む。

いくつかの実施形態において、当該方法は、カルボジイミド架橋剤を透析した上清と混合する前に、透析した上清に追加のペプチドを添加するステップをさらに含む。

多くの実施形態において、注入可能医薬製剤は、単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片と、１つ以上の硫酸化ＧＡＧとを含む合成バイオコンジュゲートであって、１つ以上の硫酸化ＧＡＧが、単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片に共有結合する当該合成バイオコンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む。

いくつかの実施形態において、製剤はまた、アミノ酸も含む。

いくつかの実施形態において、製剤はまた、小ペプチドも含む。

いくつかの実施形態において、製剤は凍結乾燥される。

いくつかの実施形態において、製剤はガンマ線照射によって滅菌される。

いくつかの実施形態において、製剤は、使い捨ての医療デバイスに包装される。

多くの実施形態において、医学的状態の治療方法は、単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片と、１つ以上の硫酸化ＧＡＧとを含む合成バイオコンジュゲートであって、１つ以上の硫酸化ＧＡＧが、単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片に共有結合する当該合成バイオコンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む組成物を投与するステップを含む。

いくつかの実施形態において、組成物は、静脈注射によって投与される。

いくつかの実施形態において、医学的状態は、骨筋系に影響を与える疾患である。

いくつかの実施形態において、医学的状態は、免疫調節不全である。

いくつかの実施形態において、医学的状態は、加齢による状態である。
条項
例示的な実施形態は、以下の番号付き条項に記載する。
条項１．硫酸化ＧＡＧと、１つ以上の単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片とを含む合成バイオコンジュゲートであって、前記１つ以上の単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片は、前記硫酸化ＧＡＧに共有結合する、前記合成バイオコンジュゲート。
条項２．前記硫酸化ＧＡＧは、ヘパラン硫酸（ＨＳ）、ヘパリン（ＨＥＰ）、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）、デルマタン硫酸（ＤＳ）、ケラタン硫酸（ＫＳ）、またはそれらの誘導体である、条項１に記載の合成バイオコンジュゲート。
条項３．前記硫酸化ＧＡＧは、化学的に修飾されたＧＡＧである、条項２または３に記載の合成バイオコンジュゲート。
条項４．前記硫酸化ＧＡＧは、化学的に硫酸化されたＧＡＧである、先行条項のいずれかに記載の合成バイオコンジュゲート。
条項５．前記１つ以上の単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片は、Ｎ末端で前記硫酸化ＧＡＧに共有結合する、先行条項のいずれかに記載の合成バイオコンジュゲート。
条項６．前記１つ以上の単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片は、アミド結合を介してＮ末端で前記硫酸化ＧＡＧに共有結合する、先行条項のいずれかに記載の合成バイオコンジュゲート。
条項７．前記１つ以上の単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片は、フェチュインＡに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、先行条項のいずれかに記載の合成バイオコンジュゲート。
条項８．単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片は、フェチュインＡのＴＧＦβ結合配列を含む、条項１～７のいずれか１項に記載の合成バイオコンジュゲート。
条項９．単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片は、フェチュインＡのＴＧＦβ結合配列に対して、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、条項８に記載の合成バイオコンジュゲート。
条項１０．単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の前記断片は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び配列番号１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、条項１～９のいずれか１項に記載の合成バイオコンジュゲート。
条項１１．単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の前記断片は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び配列番号１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号１２の断片を含む配列番号１～４または配列番号１１のいずれか１つの断片である、条項１～９のいずれか１項に記載の合成バイオコンジュゲート。
条項１２．単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の前記断片は、配列番号１２のアミノ酸配列または配列番号１２に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、条項１～９のいずれか１項に記載の合成バイオコンジュゲート。
条項１３．単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の前記断片は、配列番号１２に対して、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、条項１～９のいずれか１項に記載の合成バイオコンジュゲート。
条項１４．前記硫酸化ＧＡＧは、約１～約７５パーセント（％）官能化が進行し、前記パーセント（％）官能化は、単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片で官能化された前記硫酸化ＧＡＧの二糖単位のパーセントによって決定される、先行条項のいずれかに記載の合成バイオコンジュゲート。
条項１５．前記合成バイオコンジュゲートは、１～２０個の単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片を含む、先行条項のいずれかに記載の合成バイオコンジュゲート。
条項１６．前記合成バイオコンジュゲートは、１～５個の単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片を含む、先行条項のいずれかに記載の合成バイオコンジュゲート。
条項１７．前記合成バイオコンジュゲートは、１個の単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片を含む、先行条項のいずれかに記載の合成バイオコンジュゲート。
条項１８．前記１つ以上の単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片は、リンカーを介して前記硫酸化ＧＡＧに共有結合する、先行条項のいずれかに記載の合成バイオコンジュゲート。
条項１９．前記１つ以上の単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片は、リンカーを介して前記硫酸化ＧＡＧの主鎖に共有結合する、先行条項のいずれかに記載の合成バイオコンジュゲート。
条項２０．単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片と、１つ以上の硫酸化ＧＡＧとを含む合成バイオコンジュゲートであって、前記１つ以上の硫酸化ＧＡＧが、前記単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片に共有結合する、前記合成バイオコンジュゲート。
条項２１．先行条項のいずれかに記載の合成バイオコンジュゲートを含む組成物であって、硫酸化ＧＡＧ当たりの単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片の平均個数は、１～約１０個である、前記組成物。
条項２２．条項１～２０のいずれか１項に記載の合成バイオコンジュゲートを含む組成物であって、硫酸化ＧＡＧ当たりの単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片の平均個数は、１～約５個である、前記組成物。
条項２３．条項１～２０のいずれか１項に記載の合成バイオコンジュゲート、または条項２１もしくは２２に記載の組成物を含む組成物であって、ホリスタチンをさらに含む、前記組成物。
条項２４．前記ホリスタチンは、前記合成バイオコンジュゲートの１～５倍過剰に存在する、条項２３に記載の組成物。
条項２５．加齢に関連した疾患または障害を治療する方法であって、それを必要とする患者に、有効量の条項１～２０のいずれか１項に記載の合成バイオコンジュゲート、または条項２１もしくは２２に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
条項２６．骨筋系に影響を与える疾患を治療する方法であって、それを必要とする患者に、有効量の条項１～２０のいずれか１項に記載の合成バイオコンジュゲート、または条項２１もしくは２２に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
条項２７．免疫調節不全を治療する方法であって、それを必要とする患者に、有効量の条項１～２０のいずれか１項に記載の合成バイオコンジュゲート、または条項３０もしくは３１に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
条項２８．条項１～１６のいずれか１項に記載の合成バイオコンジュゲート、または条項２１もしくは２２に記載の組成物は、筋肉内、関節内、または静脈内に投与される、条項２１～２３のいずれか１項に記載の方法。
条項２９．条項１～１６のいずれか１項に記載の合成バイオコンジュゲート、または条項１７もしくは１８に記載の組成物は、体重１ｋｇ当たり約０．０１～約２．５ｍｇの範囲の量で投与される、条項２４に記載の方法。
条項３０．少なくとも１つのＡＨＳＧ分子で官能化された硫酸化ＧＡＧ主鎖を含む組成物であって、前記硫酸化ＧＡＧ主鎖は、ヘパラン硫酸（ＨＳ）、ヘパリン（ＨＥＰ）、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）、デルマタン硫酸（ＤＳ）、またはケラタン硫酸（ＫＳ）であり、前記少なくとも１つのＡＨＳＧ分子は、単鎖でありかつ非リン酸化されている、前記組成物。
条項３１．前記硫酸化ＧＡＧ主鎖は、ヘパリン結合ドメインを有するペプチドに結合し、前記ペプチドは、ホリスタチン（ＦＳＴ）である、条項３０に記載の組成物。
条項３２．前記ホリスタチンは、細胞培養物から収集された天然分子、または結合するアクチビンＡ及びミオスタチンと同様の機能を有する合成ペプチドである、条項３１に記載の組成物。
条項３３．前記硫酸化ＧＡＧ主鎖、前記少なくとも１つのＡＨＳＧ分子、及びＦＳＴは、同様のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物中で得られる、条項３１に記載の組成物。
条項３４．前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物は、ヒト幹細胞から由来し、前記ヒト幹細胞は、胚性多能性幹細胞または人工多能性幹細胞である、条項３３に記載の組成物。
条項３５．分子構造を生成する方法であって、
架橋剤を使用してＧＡＧ分子のカルボキシル末端を少なくとも１つのＡＨＳＧ分子のＮ末端と結合させ、架橋構造を生成するステップと、
透析により過剰量の前記架橋剤を除去するステップと、
前記架橋構造と成長因子とを結合させるステップと、
前記結合した架橋構造及び成長因子を生理学的緩衝液で希釈するステップと、を含む前記方法。
条項３６．前記成長因子はホリスタチンを含む、条項３５に記載の方法。
条項３７．分子構造を生成する方法であって、
少なくとも１つのＧＡＧ分子及び少なくとも１つのＡＨＳＧ分子を含む細胞培養上清を得るステップと、
透析により１０ｋＤａ未満の分子を除去し、前記少なくとも１つのＧＡＧ分子及び前記少なくとも１つのＡＨＳＧ分子を含む透析した上清を作製するステップと、
カルボジイミド架橋剤を前記透析した上清と混合するステップであって、前記少なくとも１つのＧＡＧ分子のカルボキシル末端が前記少なくとも１つのＡＨＳＧ分子のＮ末端と結合して架橋構造を生成する前記ステップと、
過剰量の前記カルボジイミド架橋剤を透析により除去するステップと、を含む前記方法。
条項３８．前記カルボジイミド架橋剤を前記透析した上清と混合する前に、前記透析した上清に追加のペプチドを添加するステップをさらに含む、条項３７に記載の方法。
条項３９．注射可能な医薬製剤であって、
単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片と、１つ以上の硫酸化ＧＡＧとを含む合成バイオコンジュゲートにおいて、前記１つ以上の硫酸化ＧＡＧが、前記単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片に共有結合する前記合成バイオコンジュゲートと、
薬学的に許容される担体とを含む、前記注射可能な医薬製剤。
条項４０．アミノ酸をさらに含む、条項３９に記載の注射可能な医薬製剤。
条項４１．小ペプチドをさらに含む、条項３９に記載の注射可能な医薬製剤。
条項４２．前記製剤は、凍結乾燥される、条項３９に記載の注射可能な医薬製剤。
条項４３．前記製剤は、ガンマ線照射によって滅菌される、条項３９に記載の注射可能な医薬製剤。
条項４４．前記製剤は、使い捨ての医療デバイスに包装される、条項３９に記載の注射可能な医薬製剤。
条項４５．医学的状態の治療方法であって、
単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片と、１つ以上の硫酸化ＧＡＧとを含む合成バイオコンジュゲートにおいて、前記１つ以上の硫酸化ＧＡＧが、前記単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片に共有結合する前記合成バイオコンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む組成物を投与するステップを含む、前記方法。
条項４６．前記組成物は、注射によって投与される、条項４５に記載の方法。
条項４７．前記医学的状態は、骨筋系に影響を与える疾患である、条項４５に記載の方法。
条項４８．前記医学的状態は、免疫調節不全である、条項４５に記載の方法。
条項４９．前記医学的状態は、加齢による状態である、条項４５に記載の方法。

参考文献：
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Claims (50)

1. 硫酸化ＧＡＧと、１つ以上の単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片とを含む合成バイオコンジュゲートであって、前記１つ以上の単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは前記単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片は、前記硫酸化ＧＡＧに共有結合する、前記合成バイオコンジュゲート。
2. 前記硫酸化ＧＡＧは、ヘパラン硫酸（ＨＳ）、ヘパリン（ＨＥＰ）、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）、デルマタン硫酸（ＤＳ）、ケラタン硫酸（ＫＳ）、またはそれらの誘導体である、請求項１に記載の合成バイオコンジュゲート。
3. 前記硫酸化ＧＡＧは、化学的に修飾されたＧＡＧである、請求項１に記載の合成バイオコンジュゲート。
4. 前記硫酸化ＧＡＧは、化学的に硫酸化されたＧＡＧである、請求項１に記載の合成バイオコンジュゲート。
5. 前記１つ以上の単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは前記単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片は、Ｎ末端で前記硫酸化ＧＡＧに共有結合する、請求項１に記載の合成バイオコンジュゲート。
6. 前記１つ以上の単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは前記単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片は、アミド結合を介してＮ末端で前記硫酸化ＧＡＧに共有結合する、請求項１に記載の合成バイオコンジュゲート。
7. 前記１つ以上の単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは前記単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片は、フェチュインＡに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１に記載の合成バイオコンジュゲート。
8. 前記単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の前記断片は、フェチュインＡのＴＧＦβ結合配列を含む、請求項１に記載の合成バイオコンジュゲート。
9. 前記単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の前記断片は、フェチュインＡのＴＧＦβ結合配列に対して、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、請求項８に記載の合成バイオコンジュゲート。
10. 前記単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の前記断片は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び配列番号１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の合成バイオコンジュゲート。
11. 前記単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の前記断片は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び配列番号１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号１２の断片を含む配列番号１～４または配列番号１１のいずれか１つの断片である、請求項１に記載の合成バイオコンジュゲート。
12. 前記単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の前記断片は、配列番号１２のアミノ酸配列または配列番号１２に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の合成バイオコンジュゲート。
13. 前記単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の前記断片は、配列番号１２に対して、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、請求項１に記載の合成バイオコンジュゲート。
14. 前記硫酸化ＧＡＧは、約１～約７５パーセント（％）官能化が進行し、前記パーセント（％）官能化は、単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは前記単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片で官能化された前記硫酸化ＧＡＧの二糖単位のパーセントによって決定される、請求項１に記載の合成バイオコンジュゲート。
15. 前記合成バイオコンジュゲートは、１～２０個の単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは前記単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片を含む、請求項１に記載の合成バイオコンジュゲート。
16. 前記合成バイオコンジュゲートは、１～５個の単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは前記単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片を含む、請求項１に記載の合成バイオコンジュゲート。
17. 前記合成バイオコンジュゲートは、１個の単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは前記単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片を含む、請求項１に記載の合成バイオコンジュゲート。
18. 前記１つ以上の単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは前記単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片は、リンカーを介して前記硫酸化ＧＡＧに共有結合する、請求項１に記載の合成バイオコンジュゲート。
19. 前記１つ以上の単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは前記単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片は、リンカーを介して前記硫酸化ＧＡＧの主鎖に共有結合する、請求項１に記載の合成バイオコンジュゲート。
20. 少なくとも１つの単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは少なくとも１つの単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片と、１つ以上の硫酸化ＧＡＧとを含む合成バイオコンジュゲートであって、前記１つ以上の硫酸化ＧＡＧが、前記単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは前記単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片に共有結合する、前記合成バイオコンジュゲート。
21. 硫酸化ＧＡＧ当たりの前記少なくとも１つの単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは前記少なくとも１つの単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の前記断片の平均個数は、１～約１０個である、請求項２０に記載の合成バイオコンジュゲート。
22. 硫酸化ＧＡＧ当たりの前記少なくとも１つの単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは前記少なくとも１つの単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の前記断片の平均個数は、１～約５個である、請求項２０に記載の合成バイオコンジュゲート。
23. 前記バイオコンジュゲートは、ホリスタチンをさらに含む、請求項２０に記載の合成バイオコンジュゲート。
24. 前記ホリスタチンは、前記硫酸化ＧＡＧの１～５倍過剰に存在する、請求項２３に記載の合成バイオコンジュゲート。
25. 患者の医学的状態を治療する方法であって、それを必要とする患者に、少なくとも１つの単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは少なくとも１つの単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片と、１つ以上の硫酸化ＧＡＧとを含む合成バイオコンジュゲートにおいて、前記１つ以上の硫酸化ＧＡＧが、前記単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは前記単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片に共有結合する、有効量の前記合成バイオコンジュゲートを投与するステップを含む、前記方法。
26. 前記医学的状態は、加齢に関連した疾患または障害である、請求項２５に記載の方法。
27. 前記医学的状態は、骨筋系に影響を与える疾患である、請求項２５に記載の方法。
28. 前記医学的状態は、免疫調節不全である、請求項２５に記載の方法。
29. 前記合成バイオコンジュゲートは、筋肉内、関節内、または静脈内に投与される、請求項２５に記載の方法。
30. 前記合成バイオコンジュゲートは、体重１ｋｇ当たり約０．０１～約２．５ｍｇの範囲の量で投与される、請求項２５に記載の方法。
31. 少なくとも１つのＡＨＳＧ分子で官能化された硫酸化ＧＡＧ主鎖を含む組成物であって、前記硫酸化ＧＡＧ主鎖は、ヘパラン硫酸（ＨＳ）、ヘパリン（ＨＥＰ）、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）、デルマタン硫酸（ＤＳ）、またはケラタン硫酸（ＫＳ）であり、前記少なくとも１つのＡＨＳＧ分子は、単鎖でありかつ非リン酸化型である、前記組成物。
32. 前記組成物は、ヘパリン結合ドメインを有するペプチドをさらに含み、前記硫酸化ＧＡＧ主鎖は、ヘパリン結合ドメインを有する前記ペプチドに結合し、前記ヘパリン結合ドメインを有する前記ペプチドは、ホリスタチン（ＦＳＴ）である、請求項３１に記載の組成物。
33. 前記ホリスタチンは、細胞培養物から収集された天然分子、または結合するアクチビンＡ及びミオスタチンと同様の機能を有する合成ペプチドである、請求項３２に記載の組成物。
34. 前記硫酸化ＧＡＧ主鎖、前記少なくとも１つのＡＨＳＧ分子、及びＦＳＴは、単一のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物から得られる、請求項３２に記載の組成物。
35. 前記単一のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物は、ヒト幹細胞から由来し、前記ヒト幹細胞は、胚性多能性幹細胞または人工多能性幹細胞である、請求項３４に記載の組成物。
36. 分子構造を生成する方法であって、
    架橋剤を使用してＧＡＧ分子のカルボキシル末端を少なくとも１つのＡＨＳＧ分子のＮ末端と結合させ、架橋構造を生成するステップと、
    透析により過剰量の前記架橋剤を除去するステップと、
    前記架橋構造と成長因子とを結合させるステップと、
    前記結合した架橋構造及び成長因子を生理学的緩衝液で希釈するステップと、を含む前記方法。
37. 前記成長因子はホリスタチンを含む、請求項３６に記載の方法。
38. 分子構造を生成する方法であって、
    少なくとも１つのＧＡＧ分子及び少なくとも１つのＡＨＳＧ分子を含む細胞培養上清を得るステップと、
    透析により１０ｋＤａ未満の分子を除去し、前記少なくとも１つのＧＡＧ分子及び前記少なくとも１つのＡＨＳＧ分子を含む透析した上清を作製するステップと、
    カルボジイミド架橋剤を前記透析した上清と混合するステップであって、前記少なくとも１つのＧＡＧ分子のカルボキシル末端が前記少なくとも１つのＡＨＳＧ分子のＮ末端と結合して架橋構造を生成する前記ステップと、
    過剰量の前記カルボジイミド架橋剤を透析により除去するステップと、を含む前記方法。
39. 前記カルボジイミド架橋剤を前記透析した上清と混合する前に、前記透析した上清に追加のペプチドを添加するステップをさらに含む、請求項３８に記載の方法。
40. 注射可能な医薬製剤であって、
    単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片と、１つ以上の硫酸化ＧＡＧとを含む合成バイオコンジュゲートにおいて、前記１つ以上の硫酸化ＧＡＧが、前記単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは前記単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片に共有結合する前記合成バイオコンジュゲートと、
    薬学的に許容される担体とを含む、前記注射可能な医薬製剤。
41. アミノ酸をさらに含む、請求項４０に記載の注射可能な医薬製剤。
42. 小ペプチドをさらに含む、請求項４０に記載の注射可能な医薬製剤。
43. 前記製剤は、凍結乾燥される、請求項４０に記載の注射可能な医薬製剤。
44. 前記製剤は、ガンマ線照射によって滅菌される、請求項４０に記載の注射可能な医薬製剤。
45. 前記製剤は、使い捨ての医療デバイスに包装される、請求項４０に記載の注射可能な医薬製剤。
46. 医学的状態の治療方法であって、
    単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片と、１つ以上の硫酸化ＧＡＧとを含む合成バイオコンジュゲートにおいて、前記１つ以上の硫酸化ＧＡＧが、前記単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子もしくは前記単鎖非リン酸化ＡＨＳＧ分子の断片に共有結合する前記合成バイオコンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む組成物を投与するステップを含む、前記方法。
47. 前記組成物は、注射によって投与される、請求項４６に記載の方法。
48. 前記医学的状態は、骨筋系に影響を与える疾患である、請求項４６に記載の方法。
49. 前記医学的状態は、免疫調節不全である、請求項４６に記載の方法。
50. 前記医学的状態は、加齢による状態である、請求項４６に記載の方法。

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