CN117120460A

CN117120460A - 分子超结构及其使用方法

Info

Publication number: CN117120460A
Application number: CN202280022782.1A
Authority: CN
Inventors: J·S·佩因特
Original assignee: Immunex Corp
Current assignee: Immunex Corp
Priority date: 2021-01-26
Filing date: 2022-01-25
Publication date: 2023-11-24

Abstract

本文提供了包含与糖胺聚糖(GAG)分子共价键合的基于胎球蛋白A的分子(AHSG)的生物缀合物。

Description

分子超结构及其使用方法

相关申请的交叉引用

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2021年1月26日提交的美国临时申请序列号63/141,977和2021年5月21日提交的美国临时申请序列号63/191,839的优先权益，这两个申请特此明确地通过引用整体并入用于所有目的。

技术领域

本文描述的主题总体上涉及一种分子超结构，该分子超结构包括与硫酸化GAG主链结合的生长因子，诸如卵泡抑素。

背景技术

衰老影响身体的所有器官和组织。例如，免疫系统丧失防御感染和癌症的能力并且无法支持适当的伤口愈合。同时，先天免疫系统介导的炎症反应被放大，致使老年个体易患自身免疫和炎症性疾病，定义为“炎症衰老”。在适应性免疫系统中观察到最相关的变化，其特征在于原初T细胞减少和记忆细胞伴随增加，TCR库逐渐减少及体外增殖减少。

衰老期间肌肉质量及其再生能力的丧失(肌肉减少症)，降低了进行日常生活活动所需的力量和运动能力。肌肉减少症表现为神经支配、干细胞功能(卫星细胞)和肌肉内稳态的内分泌调节的变化，这些变化促成肌纤维损失和功能下降。30岁后，人每年损失约0.5％-1％的肌肉质量，65岁后下降速率急剧加快。

卫星细胞与通常促进损伤后肌肉修复的肌肉结缔组织成纤维细胞及浸润性巨噬细胞和嗜中性粒细胞之间的功能失调性相互作用，推测会促成老年机体的肌肉再生减少。因此，解决肌肉衰老降低的再生方法应该同时针对免疫系统和肌肉干细胞区室。

再生医学基于正常个体发育和组织发育的复现。它采用递送特定的活细胞群作为替代疗法，或者采用递送支持和影响原位形态发生的化学线索。生理途径的阐明和一般称为“生长因子”的重组形态发生素的产生引起了极大兴趣，并进行了大量临床试验。许多这些试验的结果令人失望，因缺乏有效性和商品成本上升而受到阻碍。历史上用于组织再生的流行生长因子包括血管生成素(Ang)；碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)；骨形态发生蛋白(BMP)；表皮生长因子(EGF)；成纤维细胞生长因子(FGF)；肝细胞生长因子(HGF)；胰岛素样生长因子(IGF)；神经生长因子(NGF)；血小板源性生长因子(PDGF)；转化生长因子(TFG)；血管内皮生长因子(VEGF)。

因子输注的简单递送缺乏对特定细胞群的靶向性，并且可产生短暂的、弱的生物反应。生长因子的超生理浓度的作用难以预料，并且在施用后不久，由于快速降解或与组织组分的非特异性结合，输注不会提供足够的局部浓度来产生期望的作用。

为了解决这个问题，已经采取了两种策略：将生长因子化学固定到基质中或固定到基质上，以及物理包封生长因子。

从化学的角度来看，非共价掺入是基于静电荷对生长因子的吸收。蛋白质诸如肝素、纤连蛋白、明胶和小寡肽可进行化学或物理包被，以提供特定的生物位点来固定生长因子或形态发生素。含有纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白或糖胺聚糖硫酸肝素、硫酸软骨素、透明质酸或多种合成水凝胶的生物聚合凝胶可用作细胞外基质模拟材料来固定生长因子。

生长因子的共价掺入也可以提供更长时间的释放。因子可经由官能团与聚合物缀合，官能团可通过共聚或化学处理或物理处理掺入。例如，表皮生长因子(EGF)经由星形聚(环氧乙烷)(PEO)共价偶联到氨基-硅烷玻璃上，并且TGF-β1共价缀合到聚(乙二醇)PEG水凝胶上。然而，这种方法的局限性包括偶联位点的不可预测性，以及在固定期间由于对生物活性官能团的破坏而损害生长因子的生物活性。

天然存在的材料诸如蚕丝、角蛋白、胶原、明胶、纤维蛋白原、弹性蛋白、壳聚糖、透明质酸、淀粉、角叉菜胶、纤维素和藻酸盐作为药物载体也获得了广泛关注。它们通常溶于水，允许温和的制造条件，这些制造条件对生长因子的生物活性相对无害。

多种合成聚合物，包括聚(α-羟基酸)、聚(原酸酯)、聚(酸酐)、聚(氨基酸)、糊精、聚(糖苷)(PGA)、聚(l-丙交酯)(PLA)及它们的共聚物(PLG酸)、弹性蛋白样多肽(ELP)、聚(乙二醇)(PEG)已用于生长因子包封。

因子从载体中释放的速率可以通过控制因子扩散或基质降解来调节。然而，使用天然聚合物作为递送媒介物的潜在问题是降解速率难以控制，而合成主链无法为结合的生长因子的蛋白水解降解提供保护。甚至，载体聚合物的片段可产生毒性。结合的生长因子易受半胱氨酸蛋白酶的酶促分解。另外，发现由水解酶释放的载体片段与受试者中鉴定的特异性循环抗体产生II型免疫应答。可调节的基质降解和随后基于扩散的递送系统需要生长因子/形态发生素递送。一种更好的递送系统，即所谓的“按需释放”，对由pH、温度、酶或药物触发的局部环境信号做出反应，这些信号会触发工程化底物的裂解。然而，这些复合物仍然没有对吸附的生长因子的蛋白酶保护，并且在被水解酶降解后，所得复合物迅速分散，或者被细胞内化，并且在没有生长因子-受体相互作用的机会的情况下被降解。

最后，基于生长因子的疗法可能是不平衡的；使用单一肽或有限的肽组合可能由于不平衡的受体激活而产生意外的结果，或者由于缺乏某些辅因子或载体蛋白而无效。因此，需要提供一种允许靶向递送和长期和/或持续释放生长因子的递送媒介物。

发明内容

为了解决这个问题，使用从源自干细胞的体外工程化特定细胞群获得的组合物，确保所有因子以原始细胞发育阶段特定的平衡比例存在。

在一些实施方案中，描述了一种分子超结构，其包括位于核心的胎球蛋白A分子(AHSG)，该分子在胱抑素1结构域的N端与糖胺聚糖(GAG)分子的羧基端连接。该结构可以进一步负载有在其肝素结合结构域(HBD)处静电结合到GAG延伸区的卵泡抑素或形成HBD的其它生长因子。

在一些实施方案中，描述了使用纯化的单个组分通过合成方法产生分子超结构的方法。在一些实施方案中，通过自组装方法产生所述结构的方法包括部分分化的干细胞的细胞培养物、暴露于细胞的液体培养基和一组交联剂，其中培养的细胞被特异性诱导以产生非磷酸化的单链胎球蛋白A和至少作为具有HBD的生长因子的卵泡抑素。

在一些实施方案中，描述了使用本文产生的分子超结构来解决骨-肌肉萎缩和各种非特异性炎症疾患(包括年龄相关炎症)的免疫调节。

附图说明

当结合附图阅读时，将更好地理解发明内容以及本发明的以下具体实施方式。应当注意，本发明不限于附图中所示的准确实施方案。

图1是分子超结构的示例性表示。

具体实施方式

本文提到的所有参考文献和出版物都明确地通过引用整体并入用于所有目的。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科技术语均具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。必须指出，除非上下文另外清楚地指出，否则如本文和在所附权利要求书中所使用，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数个指示物。因此，例如，提及“一种肽”包括多种肽。

术语“约”在数字名称(例如温度、时间、量和浓度，包括范围)前面使用时，指示可能有(+)或(-)10％、5％或1％变化的近似值。

在某些实施方案中，本文提供了一种合成生物缀合物，其包含硫酸化GAG和一个或多个单链非磷酸化AHSG分子或单链非磷酸化AHSG分子的片段，其中所述一个或多个单链非磷酸化AHSG分子或单链非磷酸化AHSG分子的片段与所述硫酸化GAG共价缀合。

如本文所用，术语“生物缀合物”是指包含糖胺聚糖(GAG)和与糖胺聚糖共价键合的一个或多个AHSG分子或其AHSG片段(天然的或合成的)的合成缀合物。GAG部分可以合成制备或从动物来源获得。在一些实施方案中，AHSG分子或其片段可以经由AHSG分子或AHSG片段(例如，N端或氨基酸侧链)上的末端氨基与GAG上的羧基之间，或者经由AHSG分子或AHSG片段(例如，C端或氨基酸侧链)上的羧基与GAG上合适的氮原子或氧原子共价结合到GAG上。在一些实施方案中，术语生物缀合物包括肽聚糖。

如本文所用，术语“GAG”是指具有大量以糖苷键连接的单糖的化合物，该化合物也可以称为“糖胺聚糖”或“聚糖”。在某些实施方案中，GAG包含以交替方式与糖醛酸连接的2-氨基糖，并且包括诸如肝素、硫酸乙酰肝素、软骨素、角蛋白和皮肤素的聚合物。因此，可用于本文所述的实施方案中的GAG的非限制性实例包括藻酸盐、琼脂糖、葡聚糖、硫酸葡聚糖、软骨素、硫酸软骨素(CS)、皮肤素、硫酸皮肤素(DS)、硫酸乙酰肝素、肝素(Hep)、角蛋白、硫酸角质素和透明质酸(HA)，包括它们的衍生物。在某些实施方案中，改变GAG的分子量以定制合成生物缀合物的作用(参见，例如，Radek,K.A.等人，Wound Repair Regen.,2009,17:118-126；和Taylor,K.R.等人，J.Biol.Chem.,2005,280:5300-5306，其通过引用整体明确并入用于所有目的)。在一个实施方案中，GAG通过氧化和碱消除而降解(参见，例如，Fransson,L.A.等人，Eur.J.Biochem.,1980,106:59-69，其通过引用整体明确并入用于所有目的)，以提供具有较低分子量(例如，约10kDa至约50kDa)的降解GAG。在一些实施方案中，GAG是未修饰的。在某些实施方案中，GAG为化学修饰的。

在某些实施方案中，硫酸化GAG是硫酸乙酰肝素(HS)、肝素(HEP)、硫酸软骨素(CS)、硫酸皮肤素(DS)、硫酸角质素(KS)或它们的衍生物。在某些实施方案中，硫酸化GAG是化学修饰的GAG。如本文所用，术语“化学修饰的GAG”旨在包括GAG(或糖胺聚糖)的衍生物。例如，化学修饰的GAG可以包括一种或多种化学衍生，诸如但不限于部分N-硫酸化衍生物、部分O-硫酸化衍生物和/或部分O-羧甲基化衍生物，或它们的组合。在某些实施方案中，GAG是非氧化的(即，不含氧化裂解的糖环)。在某些实施方案中，硫酸化GAG是化学硫酸化的GAG。

在一个实施方案中，GAG是肝素，其中肝素可以包括肝素衍生物，诸如但不限于硫酸化的、部分N-去硫酸化和/或部分O-去硫酸化的肝素衍生物、部分O-羧甲基化的肝素衍生物或它们的组合。在某些实施方案中，肝素是非氧化肝素(即，不含氧化裂解的糖环)并且不含醛官能团。肝素衍生物和/或提供肝素衍生物，诸如部分N-去硫酸化肝素和/或部分O-去硫酸化肝素(即，2-O和/或6-O-去硫酸化肝素)的方法是本领域已知的(参见，例如，Kariya等人，J.Biol.Chem.,2000,275:25949-5958；Lapierre等人，Glycobiology,1996,6(3):355-366，其通过引用整体明确并入用于所有目的)。还考虑到部分O-羧甲基化的肝素(或任何GAG)衍生物，诸如可以根据Prestwich等人(US 2012/0142907；US2010/0330143，其通过引用明确地整体并入用于所有目的)制备的那些衍生物，可用于提供本文公开的生物缀合物。

在一个实施方案中，GAG是硫酸皮肤素(DS)。DS的生物学功能广泛，并且包括生长因子FGF-2、FGF-7和FGF-10的结合和激活，这些生长因子会促进内皮细胞和角化细胞的增殖和迁移。在一些实施方案中，硫酸皮肤素的重量范围为约10kDa至约70kDa。在一个实施方案中，硫酸皮肤素的分子量为约46kDa。在另一个实施方案中，硫酸皮肤素通过氧化和碱消除而降解(参见例如，Fransson,L.A.等人，Eur.J.Biochem.,1980,106:59-69，其通过引用整体明确并入用于所有目的)，以提供具有低分子量(例如，约10kDa)的降解硫酸皮肤素。

GAG的各种分子量可用于本文所述的合成生物缀合物，诸如约650-700Da至约50kDa的单个二糖单元。在一些实施方案中，肝素为约10kDa至约20kDa。在一些实施方案中，肝素高达约15kDa、或约16kDa、或约17kDa、或约18kDa、或约19kDa、或约20kDa。在某些实施方案中，肝素可以在不裂解一个或多个糖环的条件下氧化(参见，例如Wang等人，Biomacromolecules 2013,14(7):2427-2432，其通过引用明确地整体并入用于所有目的)。

在某些实施方案中，合成生物缀合物包含一个或多个单链非磷酸化AHSG分子或单链非磷酸化AHSG分子的片段在N端与硫酸化GAG共价缀合。在某些实施方案中，AHSG分子或其片段在N端经由酰胺键与硫酸化GAG共价缀合。

在某些实施方案中，AHSG分子或AHSG片段经由接头与硫酸化GAG键合。如本文所用，术语“接头”旨在指生物缀合物的将AHSG分子或AHSG片段连接到GAG上的任选部分。在此类实施方案中，接头可以包含1-100个线性链原子，并且是可裂解的或不可裂解的。在某些实施方案中，接头是不可裂解的。在某些实施方案中，接头包含肽接头(例如，1-10个或1-5个氨基酸)。考虑到任何天然或非天然的氨基酸都可以用于接头序列，只要接头序列不会显著干扰AHSG分子或AHSG片段的预期结合。接头可以与AHSG分子或AHSG片段(包括侧链、C端或N端)的任何合适的氨基酸结合。在某些实施方案中，AHSG分子或AHSG片段通过接头与硫酸化GAG的主链共价缀合。

在本文描述的各种实施方案中，AHSG分子或AHSG片段可以通过包含一个或多个保守性氨基酸取代而被修饰。如本领域技术人员所熟知的，通过保守取代改变肽的任何非关键氨基酸应该不会显著改变该肽的活性，因为置换氨基酸的侧链应该能够与已经被置换的氨基酸的侧链形成类似的键和触点。非保守取代也是可能的，只要它们基本上不影响AHSG分子或AHSG片段的结合活性。

在某些实施方案中，所述一个或多个单链非磷酸化AHSG分子或单链非磷酸化AHSG分子的片段与胎球蛋白-A具有至少约80％序列同一性。如本文所用，术语“序列同一性”是指两种肽或蛋白质之间的氨基酸残基同一性或核苷酸同一性水平。当所比较序列中的某个位置被相同的氨基酸占据时，则该位置处的分子是相同的。肽(或多肽或肽区)与另一序列具有一定百分比(例如，至少约60％，或至少约65％，或至少约70％，或至少约75％，或至少约80％，或至少约83％，或至少约85％，或至少约90％，或至少约95％，或至少约98％或至少约99％)的“序列同一性”，意指比对时，该百分比的氨基酸在比较两个序列中相同。注意，对于本文公开的任何序列(“参考序列”)，与参考序列具有至少约60％，或至少约65％，或至少约70％，或至少约75％，或至少约80％，或至少约83％，或至少约85％，或至少约90％，或至少约95％，或至少约98％，或至少约99％序列同一性的序列也在本公开范围内。同样，本公开还包括与参考序列相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸残基取代、缺失或添加的序列。在某些实施方案中，在本文指定的任何一个或多个序列中，可以通过其上一个、两个、三个或最多五个、最多十个或最多二十个氨基的添加、缺失和/或取代来修饰该序列。

在某些实施方案中，单链非磷酸化AHSG分子的片段包含胎球蛋白-A的TGFβ结合序列。在某些实施方案中，单链非磷酸化AHSG分子的片段与胎球蛋白-A的TGFβ结合序列具有至少80％或至少约83％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％的序列同一性。

在某些实施方案中，单链非磷酸化AHSG分子的片段包含选自SEQ ID NO:1-4或SEQID NO:11的氨基酸序列。在某些实施方案中，单链非磷酸化AHSG分子的片段包含SEQ IDNO:1。在某些实施方案中，单链非磷酸化AHSG分子的片段包含SEQ ID NO:2。在某些实施方案中，单链非磷酸化AHSG分子的片段包含SEQ ID NO:3。在某些实施方案中，单链非磷酸化AHSG分子的片段包含SEQ ID NO:4。在某些实施方案中，单链非磷酸化AHSG分子的片段包含SEQ ID NO:11。

在某些实施方案中，单链非磷酸化AHSG分子的片段包含选自SEQ ID NO:1-4或SEQID NO:11的氨基酸序列，或者是SEQ ID NO:1-4或SEQ ID NO:11中任一者的片段，该片段包含SEQ ID NO:12的片段。在某些实施方案中，单链非磷酸化AHSG分子的片段包含SEQ IDNO:1，或SEQ ID NO:1的片段，该片段包含SEQ ID NO:12的片段。在某些实施方案中，单链非磷酸化AHSG分子的片段包含SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:2的片段，该片段包含SEQ ID NO:12的片段。在某些实施方案中，单链非磷酸化AHSG分子的片段包含SEQ ID NO:3，或SEQ IDNO:3的片段，该片段包含SEQ ID NO:12的片段。在某些实施方案中，单链非磷酸化AHSG分子的片段包含SEQ ID NO:4，或SEQ ID NO:4的片段，该片段包含SEQ ID NO:12的片段。在某些实施方案中，单链非磷酸化AHSG分子的片段包含SEQ ID NO:11，或SEQ ID NO:11的片段，该片段包含SEQ ID NO:12的片段。

在某些实施方案中，单链非磷酸化AHSG分子的片段包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列或与SEQ ID NO:12具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，单链非磷酸化AHSG分子的片段与SEQ ID NO:12具有至少80％序列同一性、至少90％序列同一性、至少95％序列同一性或至少99％序列同一性。

在某些实施方案中，单链非磷酸化AHSG分子的片段包含约3至约120个氨基酸，或约3至约110个氨基酸，或约3至约100个氨基酸，或约3至约90个氨基酸，或约3至约80个氨基酸，或约3至约70个氨基酸，或约3至约60个氨基酸，或约3至约50个氨基酸，或约3至约40个氨基酸，或约5至约120个氨基酸，或约5至约100个氨基酸，或约5至约90个氨基酸，或约5至约80个氨基酸，或约5至约70个氨基酸，或约5至约60个氨基酸，或约5至约50个氨基酸，或约5至约40个氨基酸，或约5至约30个氨基酸，或约5至约20个氨基酸，或约5至约10个氨基酸。

在某些实施方案中，对于每个GAG，单链非磷酸化AHSG分子或其片段的数目可以基于被GAG主链上的AHSG分子或其片段官能化的二糖单元的百分比描述为“官能化百分比(％)”。例如，GAG上存在的可用二糖单元的总数可以通过将单个二糖单元的分子量(或平均分子量)(例如，约550-800Da，或约650-750Da)除以GAG的分子量(例如，约25kDa至约70kDa，或甚至约100kDa)来计算。在GAG不含常规“二糖单元”(例如，藻酸)的实施方案中，用于本文呈现的计算中的GAG上存在的可用二糖单元的总数可以通过将单个糖单元的分子量(或平均分子量)除以GAG的分子量，然后乘以2来计算。

因此，在某些实施方案中，GAG包含约1％至约50％，或约5％至约30％的用AHSG分子或其片段进行的官能化，或约10％至约30％的用AHSG分子或其片段进行的官能化，或约20％的用AHSG分子或其片段进行的官能化，其中AHSG分子或其片段的官能化百分比(％)由GAG上用AHSG分子或其片段进行官能化的二糖单元的百分比决定。在一些实施方案中，用AHSG分子或其片段对GAG进行官能化的百分比(％)为约1％至约75％、1％至约50％、或约3％至约40％、或约5％至约30％、或约10％至约30％，或约5％、或约10％、或约15％、或约20％、或约25％、或约30％、或约35％、或约40％、或约45％、或约50％。在某些实施方案中，硫酸化GAG包含约1％至约75百分比(％)的官能化，其中所述百分比(％)官能化由硫酸化GAG上的二糖单元的百分比决定，所述二糖单元被单链非磷酸化AHSG分子或单链非磷酸化AHSG分子的片段官能化。

在某些实施方案中，合成生物缀合物包含1至约20、或1至约15、或1至约12、或1至约10、或1至约9、或1至约8、或1至约7、或1至约6、或1至5、或1至4、或1至3、或1至2个单链非磷酸化AHSG分子或单链非磷酸化AHSG分子的片段。在某些实施方案中，合成生物缀合物包含1至5个单链非磷酸化AHSG分子或单链非磷酸化AHSG分子的片段。

在某些实施方案中，AHSG分子或其片段的数目在组合物中变化。在本文所述的任何实施方案中，对于每个硫酸化GAG，AHSG分子或其片段的数目是平均值，其中组合物中的某些生物缀合物可能具有每个硫酸化GAG更多的AHSG分子或其片段，而某些合成生物缀合物具有每个硫酸化GAG更少的AHSG分子或其片段。因此，在某些实施方案中，本文所述的AHSG分子或其片段的数目是合成生物缀合物的组合物中的平均数。例如，在某些实施方案中，合成生物缀合物是其中对于每个GAG，AHSG分子或其片段的平均数为约5的组合物。在其它实施方案中，对于每个硫酸化GAG，单链非磷酸化AHSG分子或单链非磷酸化AHSG分子的片段的平均数为1至约20，或1至约15，或1至约12，或1至约10，或1至约9，或1至约8，或1至约7，或1至约6，或1至5，或1至4，或1至3，或1至2。

在某些实施方案中，合成生物缀合物包含一个单链非磷酸化AHSG分子或单链非磷酸化AHSG分子的片段。

在某些实施方案中，合成生物缀合物包含单链非磷酸化AHSG分子或单链非磷酸化AHSG分子的片段，以及一个或多个硫酸化GAG，其中所述一个或多个硫酸化GAG与单链非磷酸化AHSG分子或单链非磷酸化AHSG分子的片段共价缀合。

在一个实施方案中，本公开的合成生物缀合物与卵泡抑素直接或间接结合。如本文使用的术语“结合(binding)”或“结合(bind)”意在包括分子之间的相互作用，该相互作用可以使用例如杂交测定法、表面等离子共振、ELISA、竞争性结合测定法、等温滴定量热法、噬菌体展示、亲和色谱法、流变学或免疫组织化学来检测。这些术语还意在包括分子之间的“结合”相互作用。结合可以是“直接的”或“间接的”。“直接”结合包括分子之间的直接物理接触。分子之间的“间接”结合包括分子同时与一个或多个分子直接物理接触。这种结合可以导致包含相互作用分子的“复合物”的形成。“复合物”是指两个或更多个分子通过共价键或非共价键、相互作用或力结合在一起。因此，还提供了包含如本文所公开的合成生物缀合物的组合物，或包含该组合物的组合物，其中该组合物还包含卵泡抑素。在某些实施方案中，卵泡抑素以合成生物缀合物的1至5倍过量存在。在某些实施方案中，卵泡抑素以5倍过量、或4倍过量、或3倍过量、或2倍过量存在，或与合成生物缀合物以1:1的比率存在。

在某些实施方案中，卵泡抑素以1:1卵泡抑素/二糖单元的比率存在于GAG上。在某些实施方案中，卵泡抑素以1:2卵泡抑素/二糖单元存在于GAG上。在某些实施方案中，卵泡抑素以高达1:2卵泡抑素/二糖单元存在于GAG上。在某些实施方案中，合成生物缀合物的组合物包含在GAG上平均比率为2:1至1:2或1:1至1:2的卵泡抑素/二糖单元。

在某些实施方案中，本文公开的分子超结构提供a)一种或多种具有HB结构域的生长因子的结合，b)对生长因子针对半胱氨酸蛋白酶的保护，c)抗炎作用，d)TGFb隔离和e)矿物隔离。超结构具有硫酸化GAG主链，其在羧基端通过胱抑素结构域1的氨基端的共价酯键被天然AHSG分子官能化。

该构建体进一步附接生长因子。如图1中所见，示例性的GAG是肝素，并且示例性的生长因子是卵泡抑素，然而也可以附接其它GAG或生长因子。分子超结构可以包括位于核心的胎球蛋白A分子(AHSG)，该分子在胱抑素1结构域的N端与糖胺聚糖(GAG)分子的羧基端连接。该结构可以进一步负载有在其肝素结合结构域(HBD)处静电结合到GAG延伸区的卵泡抑素或形成HBD的其它生长因子。

碳二亚胺偶联化学呈现了将分子共价接枝到各种基底上的最流行的方法之一。在这些偶联剂中，用于生物偶联目的的主要交联分子是1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)。EDC介导羧酸基团和氨基基团之间的缀合反应，在生理pH的水性环境中引起稳定的分子间酰胺键的形成。

组合物

在一个实施方案中，生物缀合物以组合物的形式施用。本公开提供了用于施用(例如用于局部施用或全身施用)的包含生物缀合物和药学上可接受的载体的组合物。在某些实施方案中，该组合物被配制用于局部施用，诸如但不限于肌内注射或关节内注射。在某些实施方案中，该组合物被配制用于全身施用或注射，诸如但不限于肌内施用或静脉内施用。在某些实施方案中，施用模式取决于生物缀合物的大小，例如，可以采用较短的主链进行全身施用。

可以使用本领域普通技术人员已知的药学上可接受的载体，包括水或盐水。如本领域已知的，组分及其相对量由预期的用途和递送方法决定。可以选择组合物中采用的稀释剂或载体，使得它们不会降低生物缀合物的期望效果。合适的组合物的实例包括水溶液，例如，在等渗盐水、5％葡萄糖中的溶液。可以使用其它熟知的药学上可接受的液体载体，诸如醇、二醇、酯和酰胺。在某些实施方案中，该组合物还包含一种或多种赋形剂，诸如但不限于离子强度调节剂、增溶剂、糖(诸如甘露醇或山梨醇)、pH缓冲剂、表面活性剂、稳定聚合物、防腐剂和/或助溶剂。

在某些实施方案中，该组合物是水溶液。水溶液基于易于配制，以及能够通过将溶液滴入而容易地施用此类组合物而适合用于组合物配制物中。在某些实施方案中，组合物是悬浮液、粘性或半粘性凝胶或其它类型的固体或半固体组合物。在一些实施方案中，组合物是本领域熟知的泡沫、软膏、洗液、凝胶、喷雾剂和脂质体的形式。可替代地，局部施用是经由选自泵-导管系统、连续或选择性释放装置或粘附屏障的装置将提供的生物缀合物输注到治疗部位。在某些实施方案中，该组合物是直接施加于静脉或动脉内壁或接触静脉或动脉内壁的溶液。在一些实施方案中，该组合物包含聚合物基质。在其它实施方案中，该组合物是可吸收的。在某些实施方案中，该组合物包含pH缓冲剂。在一些实施方案中，该组合物含有润滑性增强剂。

在某些实施方案中，聚合物基质或聚合材料用作该组合物的药学上可接受的载体或支持物。本文所述的聚合材料可包含天然或非天然聚合物，例如糖、肽、蛋白质、层粘连蛋白、胶原、透明质酸、离子和非离子水溶性聚合物；丙烯酸聚合物；亲水性聚合物，诸如聚环氧乙烷、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物和聚乙烯醇；纤维素聚合物和纤维素聚合物衍生物，诸如羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素和醚化纤维素；聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、乳酸和乙醇酸的共聚物，或其它天然和合成的聚合试剂。在某些实施方案中，本文提供的组合物配制成膜、凝胶、泡沫或和其它剂型。

合适的离子强度调节剂包括例如甘油、丙二醇、甘露醇、葡萄糖、右旋糖、山梨醇、氯化钠、氯化钾和其它电解质。

在某些实施方案中，可能需要增强生物缀合物的溶解度。在此类情况下，可以通过使用适当的配制技术来增加溶解度，诸如掺入增溶组合物，诸如甘露醇、乙醇、甘油、聚乙二醇、丙二醇、泊洛沙姆和本领域已知的其它物质。

在某些实施方案中，该组合物含有润滑性增强剂。如本文所用，润滑性增强剂是指一种或多种能够改变药学上可接受的载体的粘度的药学上可接受的聚合材料。合适的聚合材料包括但不限于：离子和非离子水溶性聚合物；透明质酸及其盐、硫酸软骨素及其盐、葡聚糖、明胶、壳聚糖、结冷胶、其它生物缀合物或多糖，或它们的任何组合；纤维素聚合物和纤维素聚合物衍生物，诸如羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素和醚化纤维素；胶原和改性胶原；半乳甘露聚糖，诸如瓜尔胶、刺槐豆胶和塔拉胶，以及源自前述天然树胶的多糖和含有甘露糖和/或半乳糖部分作为主要结构组分的类似天然树胶或合成树胶(例如羟丙基瓜尔胶)；树胶，诸如黄蓍胶和黄原胶；结冷胶；藻酸盐和藻酸钠；壳聚糖；乙烯基聚合物；亲水性聚合物，诸如聚环氧乙烷、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物和聚乙烯醇；羧基乙烯基聚合物或交联丙烯酸聚合物，诸如“卡波姆”聚合物家族，例如可以Carbopol^TM商标商业获得的羧基聚亚烷基；和各种其它粘性或粘弹性物质。在一个实施方案中，润滑性增强剂选自透明质酸、皮肤素、软骨素、肝素、类肝素、角蛋白、葡聚糖、壳聚糖、藻酸盐、琼脂糖、明胶、羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素和醚化纤维素、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚维酮、卡波姆941、卡波姆940、卡波姆971P、卡波姆974P或它们的药学上可接受的盐。在一个实施方案中，将润滑性增强剂与生物缀合物同时施加。可替代地，在一个实施方案中，将润滑性增强剂与生物缀合物依序施加。在一个实施方案中，润滑性增强剂是硫酸软骨素。在一个实施方案中，润滑性增强剂是透明质酸。润滑性增强剂可以改变组合物的粘度。

在一些实施方案中，生物缀合物可以与以下物质组合：矿物质、氨基酸、糖、肽、蛋白质、维生素(诸如抗坏血酸)或层粘连蛋白、胶原、纤连蛋白、透明质酸、纤维蛋白、弹性蛋白或聚集蛋白聚糖(aggrecan)，或生长因子(诸如表皮生长因子、血小板源性生长因子、转化生长因子β或成纤维细胞生长因子)，以及糖皮质激素(诸如地塞米松)或粘弹性改变剂(诸如离子和非离子水溶性聚合物)；丙烯酸聚合物；亲水性聚合物，诸如聚环氧乙烷、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物和聚乙烯醇；纤维素聚合物和纤维素聚合物衍生物，诸如羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素和醚化纤维素；聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、乳酸和乙醇酸的共聚物，或其它天然和合成的聚合试剂。

用于本文组合物中的合适pH缓冲剂包括例如乙酸盐、硼酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐和磷酸盐缓冲剂，以及盐酸、氢氧化钠、氧化镁、磷酸一钾、碳酸氢盐、氨、碳酸、盐酸、柠檬酸钠、柠檬酸、乙酸、磷酸氢二钠、硼砂、硼酸、氢氧化钠、二乙基巴比妥酸和蛋白质，以及各种生物缓冲剂，例如TAPS、Bicine、Tris、Tricine、HEPES、TES、MOPS、PIPES、甲次砷酸盐或MES。在某些实施方案中，将适当的缓冲体系(例如，磷酸钠、乙酸钠、柠檬酸钠、硼酸钠或硼酸)添加到组合物中，以防止储存条件下的pH漂移。在一些实施方案中，缓冲液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液(即，含有磷酸钠、氯化钠，并且在一些配制物中，含有氯化钾和磷酸钾)。具体浓度将根据所采用的剂而变化。在某些实施方案中，添加pH缓冲体系(例如，磷酸钠、乙酸钠、柠檬酸钠、硼酸钠或硼酸)以将pH维持在约pH 4至约pH 8、或约pH5至约pH 8、或约pH 6至约pH 8、或约pH 7至约pH 8的范围内。在一些实施方案中，选择缓冲液以将pH维持在约pH 4至约pH 8的范围内。在一些实施方案中，pH为约pH 5至约pH 8。在一些实施方案中，缓冲液是盐水缓冲液。在某些实施方案中，pH为约pH 4至约pH 8，或约pH 3至约pH 8，或约pH 4至约pH 7。在一些实施方案中，组合物是膜、凝胶、贴剂或液体溶液的形式，该形式包含聚合物基质、pH缓冲剂、润滑性增强剂和生物缀合物，其中该组合物任选地包含防腐剂；并且其中所述组合物的pH在约pH 4至约pH 8的范围内。

可以将生物缀合物灭菌以去除不需要的污染物，包括但不限于内毒素和传染物。可以使用不会对生物缀合物的结构和生物嗜性产生不利影响的灭菌技术。在某些实施方案中，可以使用常规灭菌技术对生物缀合物进行消毒和/或灭菌，所述常规灭菌技术包括环氧丙烷或环氧乙烷处理、无菌过滤、气体等离子体灭菌、γ辐射、电子束和/或用过酸诸如过乙酸灭菌。在一个实施方案中，可以使生物缀合物经受一个或多个灭菌过程。可替代地，生物缀合物可以包装在任何类型的容器中，包括塑料包装或铝箔包装，并且可以进一步灭菌。

在一些实施方案中，将防腐剂添加到组合物中以防止使用期间的微生物污染。添加到组合物中的合适防腐剂包括苯扎氯铵、苯甲酸、对羟基苯甲酸烷基酯、苯甲酸烷基酯、氯丁醇、氯甲酚、鲸蜡醇、脂肪醇(诸如十六醇)、汞的有机金属化合物(诸如乙酸盐、苯基汞硝酸盐或硼酸盐)、重氮烷基脲、己二酸二异丙酯、二甲基聚硅氧烷、EDTA盐、维生素E及它们的混合物。在某些实施方案中，防腐剂选自苯扎氯铵、氯丁醇、溴化苯十二辛铵、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯乙醇、依地酸二钠、山梨酸或聚季铵盐-1。在某些实施方案中，所述组合物包含防腐剂。在一些实施方案中，防腐剂以约0.001％至约1.0％w/v的水平采用。在某些实施方案中，所述组合物不含防腐剂并且称为“未防腐的”。在一些实施方案中，单位剂量组合物是无菌的，但未防腐的。

在一些实施方案中，生物缀合物和其它试剂的单独施用或依序施用对于促进组合物的递送是必要的。在某些实施方案中，生物缀合物和其它剂可以以不同的给药频率或间隔施用。例如，生物缀合物可以每天施用，而另一种剂可以不那么频繁地施用。另外，正如对本领域技术人员来说显而易见的是，可以使用相同的施用途径或不同的施用途径来施用生物缀合物和其它剂。

可以使用任何施用生物缀合物的有效方案。例如，生物缀合物可以作为单剂量施用，或者作为多剂量每日方案施用。进一步地，交错方案，例如每周1至5天，可用作每日治疗的替代方案。

在各种实施方案中，生物缀合物可以局部施用，诸如通过膜、凝胶、贴剂或液体溶液施用。在一些实施方案中，所提供的组合物在缓冲的无菌水溶液中。在某些实施方案中，溶液的粘度为约1至约100厘泊(cps)，或约1至约200cps，或约1至约300cps，或约1至约400cps。在一些实施方案中，溶液的粘度为约1至约100厘泊。在某些实施方案中，溶液的粘度为约1至约200厘泊。在某些实施方案中，溶液的粘度为约1至约300厘泊。在某些实施方案中，溶液的粘度为约1至约400厘泊。在某些实施方案中，溶液是可注射液体溶液的形式。在其它实施方案中，将该组合物配制成粘性液体，即粘度从几百到几千厘泊的凝胶或软膏。在这些实施方案中，生物缀合物分散或溶解在适当的药学上可接受的载体中。

本公开所考虑的示例性组合物也可以用于通过注射施用，包括含有芝麻油、玉米油、棉籽油或花生油以及酏剂、甘露醇、右旋糖或无菌水溶液和类似药物媒介物的水或油悬浮液或乳液。盐水中的水溶液通常也用于注射，但在本公开的上下文中不太优选。也可以采用乙醇、甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等(及其合适的混合物)、环糊精衍生物和植物油。例如，通过使用诸如卵磷脂的包衣，在分散体的情况下通过保持所需的颗粒大小，以及通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。防止微生物作用可通过各种抗细菌和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞(thimerosal)等)来达成。

用于药物递送的膜是本领域熟知的，并且包含无毒、无刺激性的聚合物，不含可浸出的杂质，诸如多糖(例如，纤维素、麦芽糖糊精等)。在一些实施方案中，聚合物是亲水性的。在其它实施方案中，聚合物是疏水性的。该膜粘附于施加它的组织上，并在约一周的时间内缓慢吸收到体内。在本文所述的薄膜剂型中使用的聚合物是可吸收的并且表现出足够的剥离、剪切和拉伸强度，这是本领域熟知的。在一些实施方案中，该膜是可注射的。在某些实施方案中，在手术干预之前、期间或之后，将膜施用于患者。

本文所用的凝胶是指一种固体胶状材料，其可以具有从柔软和脆弱到坚硬和坚韧的性质。如本领域熟知的，凝胶是一种非流体胶体网络或聚合物网络，其通过流体在其整个体积中膨胀。水凝胶是一种包含亲水性聚合物链网络的凝胶，有时作为其中水为分散介质的胶体凝胶被发现。水凝胶是高吸收性的，并且可以含有高含量的水，诸如大于90％的水。在一些实施方案中，本文所述的凝胶包含天然或合成的聚合物网络。在一些实施方案中，凝胶包含亲水性聚合物基质。在其它实施方案中，凝胶包含疏水性聚合物基质。在一些实施方案中，凝胶具有与天然组织非常相似的柔性度。在某些实施方案中，凝胶是生物相容的和可吸收的。在某些实施方案中，在手术干预之前、期间或之后，将凝胶施用于患者。

示例性的配制物可以包含：a)一种或多种如本文所述的生物缀合物；b)药学上可接受的载体；和c)作为基质网络的亲水性聚合物，其中所述组合物配制成粘性液体，即粘度从几百到几千厘泊的凝胶或软膏。在这些实施方案中，生物缀合物分散或溶解在适当的药学上可接受的载体中。

在某些实施方案中，生物缀合物或包含生物缀合物的组合物在配制之前、期间或之后冻干。因此，本文还提供了包含如本文所述的生物缀合物的冻干组合物或包含冻干组合物的组合物。

生物缀合物的合适剂量可以通过标准方法确定，例如通过在实验室动物模型或临床试验中建立剂量-反应曲线确定，并且可以根据患者状况、所治疗的疾病状态、施用途径和组织分布以及联合使用其它治疗性治疗的可能性而显著变化。施用于患者的有效量基于体表面积、患者重量或质量以及医师对患者状况的评估。在各种示例性实施方案中，剂量范围为约0.01μg至约10g。例如，对于全身递送，剂量可以为约10g，或约5g，或约1g。在其它说明性实施方案中，有效剂量范围为每剂约100μg至约10g，或每剂约100μg至约1g，或每剂约100μg至约500mg，每剂约0.01μg至约100mg，或每剂约100μg至约50mg，或每剂约500μg至约10mg，或每剂约1mg至10mg，或每剂约1至约100mg，或每剂约1mg至500mg，或每剂约1mg至200mg，或每剂约10mg至100mg，或每剂约10mg至75mg，或每剂约10mg至50mg，或每剂约10mg，或每剂约20mg，或每剂约30mg，或每剂约40mg，或每剂约50mg，或每剂约60mg，或每剂约70mg，或每剂约80mg，或每剂约90mg，或每剂约100mg。在本文所述的各个实施方案的任一个实施方案中，有效剂量范围为每剂约0.01μg至约1000mg，每剂1μg至约100mg，每剂约100μg至约1.0mg，每剂约50μg至约600μg，每剂约50μg至约700μg，每剂约100μg至约200μg，每剂约100μg至约600μg，每剂约100μg至约500μg，每剂约200μg至约600μg或每剂约100μg至约50mg，或每剂约500μg至约10mg，或每剂约1mg至约10mg。

在某些实施方案中，适于本文所述的化合物的日剂量为约0.01mg/kg至约2.5mg/kg体重。在一些实施方案中，较大受试者(包括但不限于人)的指示日剂量在约0.5mg至约100mg的范围内，方便地以分剂量(包括但不限于每天最多四次)施用或以缓释形式施用。在某些实施方案中，用于口服施用的合适单位剂型包含约1mg至约50mg活性成分。前述范围仅是建议性的，因为关于个体治疗方案的变量数目很大，并且与这些推荐值的有相当大的偏差并不少见。在某些实施方案中，剂量根据许多变量改变，不限于所用化合物的活性、待治疗的疾病或疾患、施用模式、个体受试者的需要、所治疗的疾病或疾患的严重程度以及医师的判断。

在某些实施方案中，此类治疗方案的毒性和治疗功效在细胞培养物或实验动物中通过标准药学程序确定，包括但不限于LD₅₀(对50％群体致死的剂量)和ED₅₀(在50％群体中治疗有效的剂量)的确定。毒性作用与治疗作用之间的剂量比是治疗指数并且可表示为LD₅₀与ED₅₀的比率。在某些实施方案中，表现出高治疗指数的化合物是优选的。在一些实施方案中，从细胞培养测定和动物研究中获得的数据用于配制用于人的剂量范围。在具体实施方案中，此类化合物的剂量在包括ED₅₀的具有最小毒性的循环浓度范围内。在某些实施方案中，剂量可取决于所采用的剂型和所使用的施用途径在此范围内变化。

实施例

实施例1：化学硫酸化糖胺聚糖(GAG)的一般程序。

糖胺聚糖(例如，葡聚糖、软骨素、皮肤素、肝素、角蛋白、透明质酸等)可以从商业来源购买。糖胺聚糖转化为四丁胺盐，四丁胺盐溶于N,N-二甲基甲酰胺中，向其中添加溶于N,N-二甲基甲酰胺中的N,N-二甲基甲酰胺三氧化硫复合物。在70℃下1小时后，通过添加冷水终止反应。用10N NaOH将pH调节至pH 9。用3个体积的用乙酸钠饱和的乙醇沉淀硫酸化物质，并通过离心收集。用75％乙醇洗涤所得沉淀三次，使用超声破碎沉淀，接着进行离心。将硫酸化物质溶解在水中，透析去除盐，并冻干。

实施例2：通过以下步骤实现使用纯化组分的合成生物缀合物的合成。

1.在2-4℃下，利用碳二亚胺连接剂激活硫酸化GAG[硫酸乙酰肝素(HS)、肝素(HEP)、硫酸软骨素(CS)、硫酸皮肤素(DS)或硫酸角质素(KS)]中的一种或其混合物。常见方法使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺/N-羟基磺基琥珀酰亚胺(EDC/sNHS)来激活GAG上的羧酸部分。对于可溶性凝胶使用低分子量GAG，或对于更一致的凝胶使用较高分子量。

2.添加与GAG单体摩尔比为2:1的AHSG，并在恒温混匀仪上在8℃下温育15分钟。在该步骤中，AHSG的胱抑素结构域1的N端与GAG的EDC/sNHS激活的羧酸基团偶联形成限定的生物杂交基质。

3.通过蒸馏水透析洗涤该组合物至少5小时。

4.将组合物重悬于生理缓冲液中。

5.将生长因子与GAG单体以2:1的摩尔比添加到溶液中。

6.将佐剂(氨基酸、肽、细胞因子、N-乙酰半胱氨酸等)添加到溶液中。

7.用生理缓冲液将溶液体积调节至最终浓度。

8.将溶液经过γ照射并且包装在无菌容器中。

替代合成法使用细胞培养基组合物，该细胞培养基组合物预先暴露于产生GAG和生长因子的细胞培养物(条件培养基，CM)。对于这种方法，步骤包括：

1.收集CM并通过0.1μm滤膜过滤。

2.通过蒸馏水透析洗涤该组合物至少3小时。

3.将EDC/NHS在低温(8℃)下添加到恒温混匀仪中，并低速搅拌30分钟。

4.通过蒸馏水透析洗涤该组合物至少5小时。

5.将佐剂(生长因子、氨基酸、肽、细胞因子、N-乙酰半胱氨酸等)添加到溶液中。

6.将溶液经过γ照射并且包装在无菌容器中。

实施例3.测试生物缀合物的体外系统包括体外细胞培养物，其中添加不同浓度的生物缀合物以建立剂量效应关系。

此类系统包括在不允许分化的条件下体外繁殖的原代成肌细胞的培养物。测试生物缀合物以评价肌肉祖细胞(成肌细胞)的生长速率。进一步测试生物缀合物，以在相同的体外系统上评价成肌细胞分化、融合率、细胞核和线粒体中的含量以及ATP含量。

通过在外周血单核细胞培养物(PBMC)中的细胞因子释放来测试对免疫系统的影响。将不同剂量的生物缀合物添加到PBMC培养物中24-48小时，然后通过ELISA或Luminex测定法分析上清液中的细胞因子。然后通过流式细胞术或通过细胞内染色(ICS)分析PBMC的各种淋巴细胞，以获得另外的细胞因子。

设计另外的研究以研究对其它细胞群体的影响，其它细胞群体包括神经元、骨细胞、软骨细胞、上皮细胞、肝细胞、心肌细胞、脂肪细胞和其它细胞。

进行体内实验以评估生物缀合物的安全性和功效。通过已确立的测试方法，在各种给药方案中使用幼年、成年和老年动物建立对肌肉、关节、免疫系统、代谢、脂肪生成、认知功能的影响。

使用这种方法的优点之一包括包含特化细胞培养物的整个分泌组，然而确切的结构不太可预测，因为碳二亚胺偶联反应可接合混合物中任何分子的氨基基团。为了防止培养基中存在的小氨基酸和肽的偶联，在CM上进行截留分子量为10kDa的初始透析。

本文所述的组合物提供了载体或缓释构建体。该组合物是亲水性的，并且静电结合的生长因子的释放是通过主链的缓慢扩散或酶促降解。

人胎球蛋白-A(以前称为α2HS-糖蛋白，AHSG)是一种多功能糖蛋白，在幼年生物中泛在分泌，在成年期几乎仅由肝实质细胞分泌。细胞培养物来源的AHSG以非磷酸化单链形式分泌，与从人血清中分离的双链部分磷酸化形式完全不同。

使用AHSG作为官能分子的优点：

1.广泛的蛋白酶抑制。AHSG组合物中的两个胱抑素结构域属于半胱氨酸蛋白酶抑制剂的胱抑素超家族，从而为附着的生长因子的酶促降解提供保护。

2.胎球蛋白-A也是已知的具有抗炎特征的负急性期反应物。AHSG通过先天免疫细胞直接抑制PAMP诱导的HMGB1释放来提供抗炎作用。

3.另外，AHSG是一种矿物伴侣，附着于羟基磷灰石晶体上，并抑制体外和体内的钙化。组织，并且尤其是血管钙化，是衰老中熟知的现象。

4.通过AHSG的特异性结合结构域阻抑TGFb1，允许抑制衰老的许多负面影响。

许多生长因子，诸如BMP-2、BMP-7、VEGF、PDG和FGF-2，特异性地与ECM的硫酸化GAG相互作用。本文所述的构建体特别集中于卵泡抑素(FST)的使用，然而不排除具有类似生物活性的其它生长因子或肽的使用。

卵泡抑素是一种包括一个N端结构域和三个随后的FST结构域的多结构域蛋白，其特征在于存在带正电荷的碱性氨基酸簇，这些氨基酸簇与GAG链的空间限定的带负电荷的磺基或羧基形成离子对。FST在第一个FS结构域的高度碱性的12-残基区段(残基75-86)结合肝素。复合物将其定位于细胞表面，并促进FST结合的配体的内吞作用，从而充当配体的中和机制。FST没有已知的受体，然而与充当FST配体的激活素A和肌肉生长抑制素的相互作用得到了很好的表征。

肌肉生长抑制素和激活素A是TGF-β家族成员，其作用是限制骨骼肌肉质量。肌肉生长抑制素和激活素A通过阻抑卫星细胞分化和融合成粗的肌纤维的能力，降低肌肉对急性损伤和慢性损伤的再生能力。另外，肌肉生长抑制素以剂量依赖性方式减少幼年和老年骨髓干细胞(BMSC)的增殖，而激活素A增加幼年和老年BMSC的矿化。激活素A还指导单核细胞/巨噬细胞、髓样树突细胞和T细胞亚群的发育，以促进2型和调控性免疫应答。

从患者收集的血清数据表明，衰老伴随着激活素A和肌肉生长抑制素表达的变化，以及骨和肌肉祖细胞对这些因子的应答的变化。因此，抑制肌肉生长抑制素和激活素A活性可能对增加肌肉质量和力量有效，同时减弱由老化引起的免疫缺陷。

本公开还公开了用于产生CM的体外细胞培养系统。该系统包括来自人多能或多潜能干细胞的部分分化细胞群。细胞最初暴露于含有bFGF和激活素A的无血清培养基。当达到汇合时，从组合物中去除bFGF和激活素A，并且使培养物在超生理浓度的信号传导氨基酸即精氨酸和亮氨酸的存在下分化1-3天。分化后，收集上清液后每天添加新鲜培养基。进一步使用上清液产生本文所述的组合物。

对如上所述获得的部分分化的多能干细胞的3种不同培养物的上清液的分析揭示9.56+/-3.18μg/L FST和2.86+/-0.42mg/L的AHSG。这些蛋白质的检测浓度远高于正常成人中的浓度：FST 3.5+/-0.2μg/L和AHSG：0.58±0.12mg/L。

示例性的起始群体是起源于胚胎的多能干细胞群(胚胎干细胞)或诱导多能干细胞。作为FST来源的细胞的示例性物种是人，然而考虑到FST的高度保守性质，可以使用广泛的物种，包括非哺乳动物物种(即鱼或昆虫)。在某些实施方案中，考虑到异基因分子的潜在免疫原性质，AHSG和硫酸化GAG的物种是人。由各种系统(细菌、昆虫或哺乳动物)产生的重组人蛋白也是用于合成的AHSG和卵泡抑素的示例性替代来源。

表1提供了包含在本文描述和使用的AHSG分子中的示例性序列。

表1.胎球蛋白A蛋白同种型(不包括信号肽序列；TGF-β结合结构域加下划线)

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在目前为止所描述的实施方案的审查和/或补充中，下面阐述了本发明主题的各个方面，这里的重点是以下实施方案的相互关系和可互换性。换句话说，除非另有明确陈述或者逻辑上不合理，否则重点在于实施方案的每个特征可以与每个和所有其它特征相组合。在没有明确参考附图的情况下，本文描述的实施方案在以下段落中重述和扩展。

在许多实施方案中，合成生物缀合物包括硫酸化GAG和一个或多个单链非磷酸化AHSG分子或单链非磷酸化AHSG分子的片段，其中所述一个或多个单链非磷酸化AHSG分子或单链非磷酸化AHSG分子的片段与硫酸化GAG共价缀合。

在一些实施方案中，硫酸化GAG是硫酸乙酰肝素(HS)、肝素(HEP)、硫酸软骨素(CS)、硫酸皮肤素(DS)、硫酸角质素(KS)或它们的衍生物。

在一些实施方案中，硫酸化GAG是化学修饰的GAG。

在一些实施方案中，硫酸化GAG是化学硫酸化的GAG。

在一些实施方案中，所述一个或多个单链非磷酸化AHSG分子或单链非磷酸化AHSG分子的片段在N端与硫酸化GAG共价缀合。

在一些实施方案中，所述一个或多个单链非磷酸化AHSG分子或单链非磷酸化AHSG分子的片段在N端经由酰胺键与硫酸化GAG共价缀合。

在一些实施方案中，所述一个或多个单链非磷酸化AHSG分子或单链非磷酸化AHSG分子的片段与胎球蛋白-A具有至少90％序列同一性。

在一些实施方案中，单链非磷酸化AHSG分子的片段包含胎球蛋白-A的TGFβ结合序列。

在一些实施方案中，单链非磷酸化AHSG分子的片段与胎球蛋白-A的TGFβ结合序列具有至少80％序列同一性、至少90％序列同一性、至少95％序列同一性或至少99％序列同一性。

在一些实施方案中，单链非磷酸化AHSG分子的片段包含选自SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:11的氨基酸序列。

在一些实施方案中，单链非磷酸化AHSG分子的片段包含选自SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:11的氨基酸序列，或者是SEQ ID NO:1-4或SEQ ID NO:11中任一者的片段，该片段包含SEQ ID NO:12的片段。

在一些实施方案中，单链非磷酸化AHSG分子的片段包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列或与SEQ ID NO:12具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，单链非磷酸化AHSG分子的片段与SEQ ID NO:12具有至少80％序列同一性、至少90％序列同一性、至少95％序列同一性或至少99％序列同一性。

在一些实施方案中，硫酸化GAG包含约1至约75百分比(％)的官能化，其中所述百分比(％)官能化由硫酸化GAG上的二糖单元的百分比决定，所述二糖单元被单链非磷酸化AHSG分子或单链非磷酸化AHSG分子的片段官能化。

在一些实施方案中，合成生物缀合物包含1至20个单链非磷酸化AHSG分子或单链非磷酸化AHSG分子的片段。

在一些实施方案中，合成生物缀合物包含1至5个单链非磷酸化AHSG分子或单链非磷酸化AHSG分子的片段。

在一些实施方案中，合成生物缀合物包含一个单链非磷酸化AHSG分子或单链非磷酸化AHSG分子的片段。

在一些实施方案中，所述一个或多个单链非磷酸化AHSG分子或单链非磷酸化AHSG分子的片段通过接头与硫酸化GAG共价缀合。

在一些实施方案中，所述一个或多个单链非磷酸化AHSG分子或单链非磷酸化AHSG分子的片段通过接头与硫酸化GAG的主链共价缀合。

在许多实施方案中，合成生物缀合物包括单链非磷酸化AHSG分子或单链非磷酸化AHSG分子的片段，以及一个或多个硫酸化GAG，其中所述一个或多个硫酸化GAG与单链非磷酸化AHSG分子或单链非磷酸化AHSG分子的片段共价缀合。

在许多实施方案中，组合物包括如任一前述权利要求所述的合成生物缀合物，其中对于每个硫酸化GAG，单链非磷酸化AHSG分子或单链非磷酸化AHSG分子的片段的平均数为1至约10。

在许多实施方案中，组合物包括如权利要求1-20中任一项所述的合成生物缀合物，其中对于每个硫酸化GAG，单链非磷酸化AHSG分子或单链非磷酸化AHSG分子的片段的平均数为1至约5。

在一些实施方案中，该组合物还包含卵泡抑素。

在一些实施方案中，卵泡抑素以合成生物缀合物的1至5倍过量存在。

在许多实施方案中，一种用于治疗年龄相关的疾病或病症的方法，包括向有需要的患者施用有效量的如权利要求1-20中任一项所述的合成生物缀合物或如权利要求21或22所述的组合物。

在一些实施方案中，一种用于治疗影响骨-肌肉系统的疾病的方法，包括向有需要的患者施用有效量的如权利要求1-20中任一项所述的合成生物缀合物或如权利要求21或22所述的组合物。

在许多实施方案中，一种用于治疗免疫失调的方法，包括向有需要的患者施用有效量的如权利要求1-20中任一项所述的合成生物缀合物或如权利要求30或31所述的组合物。

在许多实施方案中，如权利要求21-23中任一项所述的方法，其中如权利要求1-16中任一项所述的合成生物缀合物，或如权利要求21或22的组合物通过肌内、关节内或静脉内施用。

在一些实施方案中，如权利要求1-16中任一项所述的合成生物缀合物，或如权利要求17或18所述的组合物以按体重约0.01mg/kg至约2.5mg/kg的量施用。

在许多实施方案中，组合物包括经至少一个AHSG分子官能化的硫酸化GAG主链，其中所述硫酸化GAG主链是硫酸乙酰肝素(HS)、肝素(HEP)、硫酸软骨素(CS)、硫酸皮肤素(DS)或硫酸角质素(KS)，并且其中所述至少一个AHSG分子是单链且非磷酸化的。

在一些实施方案中，所述硫酸化GAG主链结合具有肝素结合结构域的肽，并且其中所述肽是卵泡抑素(FST)。在一些实施方案中，所述卵泡抑素是从细胞培养物中收集的天然分子，或者是具有结合激活素A和肌肉生长抑制素的类似功能的合成肽。在一些实施方案中，所述硫酸化GAG主链、所述至少一个AHSG分子和FST从同一体外细胞培养物中获得。在一些实施方案中，所述体外细胞培养物源自人干细胞，并且其中所述人干细胞为胚胎干细胞或诱导多能干细胞。

在许多实施方案中，产生分子结构的方法包括以下步骤：使用交联剂将GAG分子的羧基端与至少一个AHSG分子的N端偶联以产生交联结构；通过透析去除过量的交联剂；将所述交联结构和生长因子偶联；并且在生理缓冲液中稀释所偶联的交联结构和生长因子。

在一些实施方案中，生长因子包括卵泡抑素。

在许多实施方案中，产生分子结构的方法包括以下步骤：获得包含至少一个GAG分子和至少一个AHSG分子的细胞培养上清液；通过透析去除低于10kDa的分子以产生包含所述至少一个GAG分子和所述至少一个AHSG分子的透析上清液；将碳二亚胺交联剂与透析上清液混合，其中所述至少一个GAG分子的羧基端与所述至少一个AHSG分子的N端偶联以产生交联结构；并且通过透析去除过量的碳二亚胺交联剂。

在一些实施方案中，该方法还包括在将碳二亚胺交联剂与透析上清液混合之前向透析上清液中添加附加肽的步骤。

在许多实施方案中，可注射医疗制剂包括：合成生物缀合物，其包含单链非磷酸化AHSG分子或单链非磷酸化AHSG分子的片段，以及一个或多个硫酸化GAG，其中所述一个或多个硫酸化GAG与单链非磷酸化AHSG分子或单链非磷酸化AHSG分子的片段共价缀合；和药学上可接受的载体。

在一些实施方案中，该制剂还包括氨基酸。

在一些实施方案中，该制剂还包括小肽。

在一些实施方案中，该制剂是冻干的。

在一些实施方案中，该制剂通过γ辐射灭菌。

在一些实施方案中，该制剂包装在一次性医疗器械中。

在许多实施方案中，治疗医学疾患的方法包括以下步骤：施用一种组合物，该组合物包含：合成生物缀合物，所述合成生物缀合物包含单链非磷酸化AHSG分子或单链非磷酸化AHSG分子的片段，以及一个或多个硫酸化GAG，其中所述一个或多个硫酸化GAG与单链非磷酸化AHSG分子或单链非磷酸化AHSG分子的片段共价缀合；和药学上可接受的载体。

在一些实施方案中，该组合物通过注射施用。

在一些实施方案中，该医学疾患是影响骨-肌肉系统的疾病。

在一些实施方案中，该医学疾患是免疫失调。

在一些实施方案中，该医学疾患与年龄相关。

条款

示例性实施方案在以下编号的条款中有阐述。

条款1.一种合成生物缀合物，其包含硫酸化GAG和一个或多个单链非磷酸化AHSG分子或单链非磷酸化AHSG分子的片段，其中所述一个或多个单链非磷酸化AHSG分子或单链非磷酸化AHSG分子的片段与所述硫酸化GAG共价缀合。

条款2.如条款1所述的合成生物缀合物，其中所述硫酸化GAG是硫酸乙酰肝素(HS)、肝素(HEP)、硫酸软骨素(CS)、硫酸皮肤素(DS)、硫酸角质素(KS)或它们的衍生物。

条款3.如条款2或3所述的合成生物缀合物，其中所述硫酸化GAG是化学修饰的GAG。

条款4.如任一前述条款所述的合成生物缀合物，其中所述硫酸化GAG是化学硫酸化GAG。

条款5.如任一前述条款所述的合成生物缀合物，其中所述一个或多个单链非磷酸化AHSG分子或单链非磷酸化AHSG分子的片段在N端与所述硫酸化GAG共价缀合。

条款6.如任一前述条款所述的合成生物缀合物，其中所述一个或多个单链非磷酸化AHSG分子或单链非磷酸化AHSG分子的片段在N端经由酰胺键与所述硫酸化GAG共价缀合。

条款7.如任一前述条款所述的合成生物缀合物，其中所述一个或多个单链非磷酸化AHSG分子或单链非磷酸化AHSG分子的片段与胎球蛋白-A具有至少90％序列同一性。

条款8.如条款1-7中任一项所述的合成生物缀合物，其中单链非磷酸化AHSG分子的所述片段包含胎球蛋白-A的TGFβ结合序列。

条款9.如条款8所述的合成生物缀合物，其中单链非磷酸化AHSG分子的所述片段与胎球蛋白-A的所述TGFβ结合序列具有至少80％序列同一性、至少90％序列同一性、至少95％序列同一性或至少99％序列同一性。

条款10.如条款1-9中任一项所述的合成生物缀合物，其中单链非磷酸化AHSG分子的所述片段包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:11的氨基酸序列。

条款11.如条款1-9中任一项所述的合成生物缀合物，其中单链非磷酸化AHSG分子的所述片段包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:11的氨基酸序列，或者是SEQ ID NO:1-4或SEQ ID NO:11中任一者的片段，所述片段包含SEQ ID NO:12的片段。

条款12.如条款1-9中任一项所述的合成生物缀合物，其中单链非磷酸化AHSG分子的所述片段包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列或与SEQ ID NO:12具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。

条款13.如条款1-9中任一项所述的合成生物缀合物，其中所述单链非磷酸化AHSG分子的所述片段与SEQ ID NO:12具有至少80％序列同一性、至少90％序列同一性、至少95％序列同一性或至少99％序列同一性。

条款14.如任一前述条款所述的合成生物缀合物，其中所述硫酸化GAG包含约1至约75百分比(％)的官能化，其中所述百分比(％)官能化由所述硫酸化GAG上的二糖单元的百分比确定，所述二糖单元被单链非磷酸化AHSG分子或单链非磷酸化AHSG分子的片段官能化。

条款15.如任一前述条款所述的合成生物缀合物，其中所述合成生物缀合物包含1至20个单链非磷酸化AHSG分子或单链非磷酸化AHSG分子的片段。

条款16.如任一前述条款所述的合成生物缀合物，其中所述合成生物缀合物包含1至5个单链非磷酸化AHSG分子或单链非磷酸化AHSG分子的片段。

条款17.如任一前述条款所述的合成生物缀合物，其中所述合成生物缀合物包含一个单链非磷酸化AHSG分子或单链非磷酸化AHSG分子的片段。

条款18.如任一前述条款所述的合成生物缀合物，其中所述一个或多个单链非磷酸化AHSG分子或单链非磷酸化AHSG分子的片段通过接头与所述硫酸化GAG共价缀合。

条款19.如任一前述条款所述的合成生物缀合物，其中所述一个或多个单链非磷酸化AHSG分子或单链非磷酸化AHSG分子的片段通过接头与所述硫酸化GAG的主链共价缀合。

条款20.一种合成生物缀合物，其包含单链非磷酸化AHSG分子或单链非磷酸化AHSG分子的片段，以及一个或多个硫酸化GAG，其中所述一个或多个硫酸化GAG与所述单链非磷酸化AHSG分子或单链非磷酸化AHSG分子的片段共价缀合。

条款21.一种组合物，其包含如任一前述条款所述的合成生物缀合物，其中对于每个硫酸化GAG，单链非磷酸化AHSG分子或单链非磷酸化AHSG分子的片段的平均数为1至约10。

条款22.一种组合物，其包含如条款1-20中任一项所述的合成生物缀合物，其中对于每个硫酸化GAG，单链非磷酸化AHSG分子或单链非磷酸化AHSG分子的片段的平均数为1至约5。

条款23.一种组合物，其包含如条款1-20中任一项所述的合成生物缀合物，或如条款21或22所述的组合物，其中所述组合物还包含卵泡抑素。

条款24.如条款23所述的组合物，其中所述卵泡抑素以所述合成生物缀合物的1至5倍过量存在。

条款25.一种用于治疗年龄相关的疾病或病症的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的如条款1-20中任一项所述的合成生物缀合物或如条款21或22所述的组合物。

条款26.一种用于治疗影响骨-肌肉系统的疾病的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的如条款1-20中任一项所述的合成生物缀合物或如条款21或22所述的组合物。

条款27.一种用于治疗免疫失调的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的如条款1-20中任一项所述的合成生物缀合物或如条款30或31所述的组合物。

条款28.如条款21-23中任一项所述的方法，其中如条款1-16中任一项所述的合成生物缀合物或如条款21或22所述的组合物通过肌内、关节内或静脉内施用。

条款29.如条款24所述的方法，其中如条款1-16中任一项所述的合成生物缀合物或如条款17或18所述的组合物以按体重约0.01mg/kg至约2.5mg/kg的量施用。

条款30.一种组合物，其包含经至少一个AHSG分子官能化的硫酸化GAG主链，其中所述硫酸化GAG主链是硫酸乙酰肝素(HS)、肝素(HEP)、硫酸软骨素(CS)、硫酸皮肤素(DS)或硫酸角质素(KS)，并且其中所述至少一个AHSG分子是单链且非磷酸化的。

条款31.如条款30所述的组合物，其中所述硫酸化GAG主链结合具有肝素结合结构域的肽，并且其中所述肽是卵泡抑素(FST)。

条款32.如条款31所述的组合物，其中所述卵泡抑素是从细胞培养物中收集的天然分子，或者是具有结合激活素A和肌肉生长抑制素的类似功能的合成肽。

条款33.如条款31所述的组合物，其中所述硫酸化GAG主链、所述至少一个AHSG分子和FST从同一体外细胞培养物中获得。

条款34.如条款33所述的组合物，其中所述体外细胞培养物源自人干细胞，并且其中所述人干细胞为胚胎干细胞或诱导多能干细胞。

条款35.一种产生分子结构的方法，其包括以下步骤：

使用交联剂将GAG分子的羧基端与至少一个AHSG分子的N端偶联以产生交联结构；

通过透析去除过量的交联剂；

将所述交联结构和生长因子偶联；并且

在生理缓冲液中稀释所偶联的交联结构和生长因子。

条款36.如条款35所述的方法，其中所述生长因子包括卵泡抑素。

条款37.一种产生分子结构的方法，其包括以下步骤：

获得包含至少一个GAG分子和至少一个AHSG分子的细胞培养上清液；

通过透析去除低于10kDa的分子以产生包含所述至少一个GAG分子和所述至少一个AHSG分子的透析上清液；

将碳二亚胺交联剂与所述透析上清液混合，其中所述至少一个GAG分子的羧基端与所述至少一个AHSG分子的N端偶联以产生交联结构；并且

通过透析去除过量的所述碳二亚胺交联剂。

条款38.如条款37所述的方法，其还包括在将所述碳二亚胺交联剂与所述透析上清液混合之前向所述透析上清液中添加附加肽的步骤。

条款39.一种可注射医疗制剂，其包含：

合成生物缀合物，所述合成生物缀合物包含单链非磷酸化AHSG分子或单链非磷酸化AHSG分子的片段，以及一个或多个硫酸化GAG，其中所述一个或多个硫酸化GAG与所述单链非磷酸化AHSG分子或单链非磷酸化AHSG分子的片段共价缀合；和

药学上可接受的载体。

条款40.如条款39所述的可注射医疗制剂，其还包含氨基酸。

条款41.如条款39所述的可注射医疗制剂，其还包含小肽。

条款42.如条款39所述的可注射医疗制剂，其中所述制剂是冻干的。

条款43.如条款39所述的可注射医疗制剂，其中所述制剂通过γ辐射灭菌。

条款44.如条款39所述的可注射医疗制剂，其中所述制剂包装在一次性医疗器械中。

条款45.一种治疗医学疾患的方法，其包括以下步骤：

施用组合物，所述组合物包含：合成生物缀合物，其包含单链非磷酸化AHSG分子或单链非磷酸化AHSG分子的片段，以及一个或多个硫酸化GAG，其中所述一个或多个硫酸化GAG与所述单链非磷酸化AHSG分子或单链非磷酸化AHSG分子的片段共价缀合；和药学上可接受的载体。

条款46.如条款45所述的方法，其中所述组合物通过注射施用。

条款47.如条款45所述的方法，其中所述医学疾患是影响骨-肌肉系统的疾病。

条款48.如条款45所述的方法，其中所述医学疾患是免疫失调。

条款49.如条款45所述的方法，其中所述医学疾患与年龄相关。

参考文献：

Sakamoto Y，Shintani Y，Harada K，Abe M，Shitsukawa K，SaitoS.Determination of free follistatin levels in sera of normal subjects andpatients with various diseases.Eur J Endocrinol.1996Sep；135(3)：345-51

Wang，Z.，Wang，Z，Lu，W et al.Novel biomaterial strategies for controlledgrowth factor delivery for biomedical applications.NPG Asia Mater 9，e435(2017)doi 10.1038/am 2017.171

Bowser M1，Herberg S，Arounleut P，Shi X，Fulzele S，Hill WD，Isales CM，Hamrick MW Effects or the activin A-myostatin-follistatin system on agingbone and muscle progenitor cells.Exp Gerontol 2013Feb；48(2)：290-7.doi：101016/jexger 2012.11004Epub 2012Nov 21.

Claims

1.一种合成生物缀合物，其包含硫酸化GAG和一个或多个单链非磷酸化AHSG分子或单链非磷酸化AHSG分子的片段，其中所述一个或多个单链非磷酸化AHSG分子或所述单链非磷酸化AHSG分子的片段与所述硫酸化GAG共价缀合。

2.如权利要求1所述的合成生物缀合物，其中所述硫酸化GAG是硫酸乙酰肝素(HS)、肝素(HEP)、硫酸软骨素(CS)、硫酸皮肤素(DS)、硫酸角质素(KS)或它们的衍生物。

3.如权利要求1所述的合成生物缀合物，其中所述硫酸化GAG是化学修饰的GAG。

4.如权利要求1所述的合成生物缀合物，其中所述硫酸化GAG是化学硫酸化GAG。

5.如权利要求1所述的合成生物缀合物，其中所述一个或多个单链非磷酸化AHSG分子或所述单链非磷酸化AHSG分子的片段在N端与所述硫酸化GAG共价缀合。

6.如权利要求1所述的合成生物缀合物，其中所述一个或多个单链非磷酸化AHSG分子或所述单链非磷酸化AHSG分子的片段在N端经由酰胺键与所述硫酸化GAG共价缀合。

7.如权利要求1所述的合成生物缀合物，其中所述一个或多个单链非磷酸化AHSG分子或所述单链非磷酸化AHSG分子的片段与胎球蛋白-A具有至少90％序列同一性。

8.如权利要求1所述的合成生物缀合物，其中所述单链非磷酸化AHSG分子的所述片段包含胎球蛋白-A的TGFβ结合序列。

9.如权利要求8所述的合成生物缀合物，其中所述单链非磷酸化AHSG分子的所述片段与胎球蛋白-A的所述TGFβ结合序列具有至少80％序列同一性、至少90％序列同一性、至少95％序列同一性或至少99％序列同一性。

10.如权利要求1所述的合成生物缀合物，其中所述单链非磷酸化AHSG分子的所述片段包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:11的氨基酸序列。

11.如权利要求1所述的合成生物缀合物，其中所述单链非磷酸化AHSG分子的所述片段包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:11的氨基酸序列，或者是SEQ ID NO:1-4或SEQ ID NO:11中任一者的片段，所述片段包含SEQ ID NO:12的片段。

12.如权利要求1所述的合成生物缀合物，其中所述单链非磷酸化AHSG分子的所述片段包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列或与SEQ ID NO:12具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。

13.如权利要求1所述的合成生物缀合物，其中所述单链非磷酸化AHSG分子的所述片段与SEQ ID NO:12具有至少80％序列同一性、至少90％序列同一性、至少95％序列同一性或至少99％序列同一性。

14.如权利要求1所述的合成生物缀合物，其中所述硫酸化GAG包含约1至约75百分比(％)的官能化，其中所述百分比(％)官能化由所述硫酸化GAG上的二糖单元的百分比确定，所述二糖单元被单链非磷酸化AHSG分子或所述单链非磷酸化AHSG分子的片段官能化。

15.如权利要求1所述的合成生物缀合物，其中所述合成生物缀合物包含1至20个单链非磷酸化AHSG分子或所述单链非磷酸化AHSG分子的片段。

16.如权利要求1所述的合成生物缀合物，其中所述合成生物缀合物包含1至5个单链非磷酸化AHSG分子或所述单链非磷酸化AHSG分子的片段。

17.如权利要求1所述的合成生物缀合物，其中所述合成生物缀合物包含一个单链非磷酸化AHSG分子或所述单链非磷酸化AHSG分子的片段。

18.如权利要求1所述的合成生物缀合物，其中所述一个或多个单链非磷酸化AHSG分子或所述单链非磷酸化AHSG分子的片段通过接头与所述硫酸化GAG共价缀合。

19.如权利要求1所述的合成生物缀合物，其中所述一个或多个单链非磷酸化AHSG分子或所述单链非磷酸化AHSG分子的片段通过接头与所述硫酸化GAG的主链共价缀合。

20.一种合成生物缀合物，其包含至少一个单链非磷酸化AHSG分子或至少一个单链非磷酸化AHSG分子的片段，以及一个或多个硫酸化GAG，其中所述一个或多个硫酸化GAG与所述单链非磷酸化AHSG分子或所述单链非磷酸化AHSG分子的片段共价缀合。

21.如权利要求20所述的合成生物缀合物，其中对于每个硫酸化GAG，所述至少一个单链非磷酸化AHSG分子或所述至少一个单链非磷酸化AHSG分子的所述片段的平均数为1至约10。

22.如权利要求20所述的合成生物缀合物，其中对于每个硫酸化GAG，所述至少一个单链非磷酸化AHSG分子或所述至少一个单链非磷酸化AHSG分子的所述片段的平均数为1至约5。

23.如权利要求20所述的合成生物缀合物，其中所述生物缀合物还包含卵泡抑素。

24.如权利要求23所述的合成生物缀合物，其中所述卵泡抑素以所述硫酸化GAG的1至5倍过量存在。

25.一种用于治疗患者的医学疾患的方法，其包括以下步骤：

向有需要的患者施用有效量的合成生物缀合物，所述合成生物缀合物包含至少一个单链非磷酸化AHSG分子或至少一个单链非磷酸化AHSG分子的片段，以及一个或多个硫酸化GAG，其中所述一个或多个硫酸化GAG与所述单链非磷酸化AHSG分子或所述单链非磷酸化AHSG分子的片段共价缀合。

26.如权利要求25所述的方法，其中所述医学疾患是年龄相关的疾病或病症。

27.如权利要求25所述的方法，其中所述医学疾患是影响骨-肌肉系统的疾病。

28.如权利要求25所述的方法，其中所述医学疾患是免疫失调。

29.如权利要求25所述的方法，其中所述合成生物缀合物通过肌内、关节内或静脉内施用。

30.如权利要求25所述的方法，其中所述合成生物缀合物以按体重约0.01mg/kg至约2.5mg/kg的量施用。

31.一种组合物，其包含经至少一个AHSG分子官能化的硫酸化GAG主链，其中所述硫酸化GAG主链是硫酸乙酰肝素(HS)、肝素(HEP)、硫酸软骨素(CS)、硫酸皮肤素(DS)或硫酸角质素(KS)，并且其中所述至少一个AHSG分子是单链且非磷酸化的形式。

32.如权利要求31所述的组合物，其中所述组合物还包含具有肝素结合结构域的肽，其中所述硫酸化GAG主链结合具有肝素结合结构域的肽，并且其中具有所述肝素结合结构域的所述肽是卵泡抑素(FST)。

33.如权利要求32所述的组合物，其中所述卵泡抑素是从细胞培养物中收集的天然分子，或者是具有结合激活素A和肌肉生长抑制素的类似功能的合成肽。

34.如权利要求32所述的组合物，其中所述硫酸化GAG主链、所述至少一个AHSG分子和FST从单一体外细胞培养物中获得。

35.如权利要求34所述的组合物，其中所述单一体外细胞培养物源自人干细胞，并且其中所述人干细胞为胚胎干细胞或诱导多能干细胞。

36.一种产生分子结构的方法，其包括以下步骤：

通过透析去除过量的交联剂；

将所述交联结构和生长因子偶联；并且

在生理缓冲液中稀释所述偶联的交联结构和生长因子。

37.如权利要求36所述的方法，其中所述生长因子包括卵泡抑素。

38.一种产生分子结构的方法，其包括以下步骤：

通过透析去除过量的所述碳二亚胺交联剂。

39.如权利要求38所述的方法，其还包括在将所述碳二亚胺交联剂与所述透析上清液混合之前向所述透析上清液中添加附加肽的步骤。

40.一种可注射医疗制剂，其包含：

合成生物缀合物，其包含单链非磷酸化AHSG分子或单链非磷酸化AHSG分子的片段，以及一个或多个硫酸化GAG，其中所述一个或多个硫酸化GAG与所述单链非磷酸化AHSG分子或所述单链非磷酸化AHSG分子的片段共价缀合；和

药学上可接受的载体。

41.如权利要求40所述的可注射医疗制剂，其还包含氨基酸。

42.如权利要求40所述的可注射医疗制剂，其还包含小肽。

43.如权利要求40所述的可注射医疗制剂，其中所述制剂是冻干的。

44.如权利要求40所述的可注射医疗制剂，其中所述制剂通过γ辐射灭菌。

45.如权利要求40所述的可注射医疗制剂，其中所述制剂包装在一次性医疗器械中。

46.一种治疗医学疾患的方法，其包括以下步骤：

施用组合物，所述组合物包含：合成生物缀合物，其包含单链非磷酸化AHSG分子或单链非磷酸化AHSG分子的片段，以及一个或多个硫酸化GAG，其中所述一个或多个硫酸化GAG与所述单链非磷酸化AHSG分子或所述单链非磷酸化AHSG分子的片段共价缀合；和药学上可接受的载体。

47.如权利要求46所述的方法，其中所述组合物通过注射施用。

48.如权利要求46所述的方法，其中所述医学疾患是影响骨-肌肉系统的疾病。

49.如权利要求46所述的方法，其中所述医学疾患是免疫失调。

50.如权利要求46所述的方法，其中所述医学疾患与年龄相关。