KR20170016857A - 셀렉틴 및 icam/vcam 펩티드 리간드 접합체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 내피 세포에 결합할 수 있으며, 포유동물에서의 내피 기능장애의 발생 및 중증도를 감소시키는 데 유용한 펩티드 접합체에 관한 것이다.
[대표도]
도 1A
[대표도]
도 1A
Description
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2014년 5월 12일에 출원된 미국 출원 제61/992,056호를 우선권 주장하며, 그의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
연방정부에서 지원된 연구 또는 개발에 관한 진술
본 발명은 미국 국립 보건원에 의해 수여된 T32DK101001 하의 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에서 특정 권리를 갖는다.
이 섹션은 본 개시내용의 보다 양호한 이해를 용이하게 하도록 도울 수 있는 측면을 도입한다. 따라서, 이들 진술은 이 관점에서 읽혀야 하며, 종래 기술이거나 아닌 것에 관한 허용으로 이해되지 않아야 한다.
내막 과다형성은 혈관 손상 및 질환의 결과로서 형성된다. 손상된 혈관에서, 혈소판은 혈관 내의 노출된 콜라겐에 결합하며, 그 상에서 활성화되게 된다. 활성화된 혈소판은 혈전 형성을 뒷받침하고, 염증성 시토카인을 방출하며, 혈액으로부터 혈관 조직 내로 단핵구를 동원한다. 그 후, 단핵구는 내막층 내로의 평활근 세포 (SMC) 이동, 및 세포외 기질 (ECM) 분비를 자극하는 시토카인을 비롯한 인자를 분비하며, 이는 내막 과다형성을 초래한다. 요독증 및 다른 대사 장애로 인해 모든 당뇨병 환자에 존재하는 기능장애성 내피는 노출된 콜라겐과 유사한 혈소판 결합 및 활성화를 뒷받침한다. 또한, 기능장애성 및 손상된 내피는 혈액으로부터 혈관벽 내로의 백혈구 이동을 뒷받침한다. 기능장애성 내피는 또한 세포-세포 연접이 손실되고, 세포 사이의 간극으로 인해 누출성이 되며, 나중에 혈소판 결합에 접근가능한 이들 간극에서 잠재적으로 기저의 콜라겐이 노출된다. 따라서, 취급 동안 기계적 혈관 손상의 결과로서, 내피 세포 (EC)의 손실로 인해 존재하는 노출된 콜라겐, 및 기능장애성 및 손상된 EC는 내막 과다형성을 뒷받침한다.
당질층, 즉, 내피를 덮고 있는 음이온성 글리코사미노글리칸 층의 손실은 기능장애성 내피 및 염증의 특징이다. 당질층의 손실은 만성 염증 및 EC 기능장애에서 발현되는 ICAM 및 VCAM을 비롯한 세포 표면 수용체를 드러낸다. 당질층 손실은 또한 수용체 P-셀렉틴 및 E-셀렉틴을 노출시키며, 이들은 손상 및 염증으로 인해 세포 표면 상에 일시적으로 발현되고, 당뇨병 환자의 경우에서와 같이 기능장애성 내피에서 만성적으로 발현된다. 셀렉틴은 혈관벽 내로의 단핵구 및 호중구 이동의 첫번째 단계인 EC 상의 백혈구 롤링을 용이하게 한다. 롤링 후, 백혈구는 ICAM 및 VCAM에 보다 견고하게 결합한다. 그 후, 이들은 이들이 시토카인을 방출하는 조직 내로 이동하고, 내막으로의 SMC 이동 및 ECM 합성을 자극한다. 마지막 결과는 내막 과다형성이며, 이는 외향 재형성을 방지하고, 장기간 혈전증을 촉진시킬 수 있다.
내피를 통한 백혈구 이동은 또한 패혈증의 경우에서와 같이 조직 및 기관 침윤을 초래할 수 있다. 이 큰 침윤은 기관 부전, 및 넓은 규모로, 다중계 기관 부전을 초래할 수 있다.
본 개시내용은 혈류에 노출된 내피 셀렉틴 및/또는 ICAM/VCAM 수용체를 글리코사미노글리칸 (GAG), 예컨대 더마탄 술페이트에 접합된 펩티드 리간드로 표적화함으로써 손상된/기능장애성 내피의 문제를 다룬다. 따라서, 한 실시양태에서, 글리코사미노글리칸 및 약 1개 내지 약 50개의 펩티드 리간드를 포함하는 펩티드 접합체이며, 여기서 펩티드 리간드는 셀렉틴, ICAM 및/또는 VCAM 수용체에 결합하는 것인 펩티드 접합체가 본원에서 제공된다. 펩티드 접합체는 또한 본원에서 EC-SEAL 접합체로 지칭될 수 있다. 특정 실시양태에서, EC-SEAL 접합체는 글리코사미노글리칸에 결합된 알킬 꼬리를 추가로 포함한다.
일부 측면에서, 글리코사미노글리칸은 덱스트란, 콘드로이틴, 콘드로이틴 술페이트, 더마탄, 더마탄 술페이트, 헤파란 술페이트, 헤파린, 케라틴, 케라탄 술페이트, 또는 히알루론산이다. 일부 측면에서, 펩티드(들)는 링커를 통해 글리코사미노글리칸에 공유 결합된다. 일부 측면에서, 링커는 N-[β-말레이미도프로피온산]히드라지드 (BMPH), 3-(2-피리딜디티오)프로피오닐 히드라지드 (PDPH) 또는 펩티드 GSG이다. 일부 측면에서, EC-SEAL 접합체는 약 3개 내지 약 50개, 또는 5개 내지 약 40개의 펩티드 리간드를 포함한다. 일부 측면에서, 펩티드 리간드는 i) IELLQAR (서열식별번호 (SEQ ID NO): 1); IELLQARGSC (서열식별번호: 2); IDLMQAR (서열식별번호: 3); IDLMQARGSC (서열식별번호: 4); QITWAQLWNMMK (서열식별번호: 5); QITWAQLWNMMKGSC (서열식별번호: 6), NAFKILVVITFGEK (서열식별번호: 7); NAFKILVVITFGEKGSC (서열식별번호: 8); ITDGEA (서열식별번호: 9); ITDGEAGSC (서열식별번호: 10); DGEATD (서열식별번호: 11); 또는 DGEATDGSC (서열식별번호: 12); 또는 ii) i)의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하며, 셀렉틴, ICAM 및/또는 VCAM에 결합할 수 있는 펩티드로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 측면에서, EC-SEAL 접합체는 기능장애성 내피에 근접한 20 μM 내지 1000 μM의 펩티드 리간드의 혈장 농도를 달성하도록 투여된다. 일부 측면에서, EC-SEAL 접합체는 기능장애성 내피에 근접한 100 μM 내지 400 μM의 펩티드 리간드의 혈장 농도를 달성하도록 투여된다.
일부 측면에서, EC-SEAL 접합체는 셀렉틴에 결합할 수 있는 약 5개 내지 약 40개의 펩티드 리간드를 포함한다. 일부 측면에서, EC-SEAL 접합체는 ICAM 및/또는 VCAM에 결합할 수 있는 약 5개 내지 약 40개의 펩티드 리간드를 포함한다. 일부 측면에서, EC-SEAL 접합체는 셀렉틴에 결합할 수 있는 약 5개 내지 약 20개의 펩티드 리간드 및 ICAM 및/또는 VCAM에 결합할 수 있는 약 5개 내지 약 20개의 펩티드 리간드를 포함한다. 일부 측면에서, EC-SEAL 접합체는 더마탄 술페이트 또는 콘드로이틴 술페이트 및 약 3개 내지 약 25개의 펩티드 리간드를 포함하며, 펩티드 리간드는 셀렉틴, ICAM 및/또는 VCAM에 결합한다. 일부 측면에서, EC-SEAL 접합체는 더마탄 술페이트 및 약 10, 15, 20 또는 30개의 펩티드 리간드를 포함하며, 펩티드 리간드는 셀렉틴, ICAM 및/또는 VCAM에 결합한다. 일부 측면에서, EC-SEAL 접합체는 더마탄 술페이트 및 셀렉틴에 결합할 수 있는 약 10개의 펩티드 리간드 및 ICAM 및/또는 VCAM에 결합할 수 있는 약 10개의 펩티드 리간드를 포함한다.
본 개시내용의 한 측면은 펩티드 리간드, 글리코사미노글리칸, 및 임의적 알킬 꼬리를 포함하는 EC-SEAL 접합체이다. 따라서, 이러한 EC-SEAL 접합체의 구조는 하기 화학식의 것일 수 있다:
(R)m-GAG-(P)n
상기 식에서,
R은 선형 또는 분지형 C2-25 알킬 쇄이고;
GAG는 글리코사미노글리칸이고;
각각의 P는 독립적으로 1종 이상의 셀렉틴-결합 단위, ICAM-결합 단위 및/또는 VCAM-결합 단위를 포함하는 3개 내지 약 50개의 아미노산의 펩티드이고;
n은 1 내지 50의 정수이고;
m은 0, 1, 2, 또는 3이다.
GAG는 임의의 글리코사미노글리칸, 예컨대 알기네이트, 아가로스, 덱스트란, 콘드로이틴, 더마탄, 더마탄 술페이트, 헤파린, 헤파란 술페이트, 케라틴, 히알루로난, 또는 이들의 조합일 수 있다.
이러한 EC-SEAL 접합체는 혈소판 활성화를 억제하고, 포유동물 혈관에의 혈소판 결합을 억제하고, 내막 과다형성을 억제하고, 포유동물 혈관에서의 염증을 억제하고, 혈전증을 억제하고, 혈관연축을 억제하고, 내피 세포 증식을 자극하고, 포유동물 혈관에서 노출된 셀렉틴, ICAM, VCAM, 또는 이들의 조합에 결합할 수 있다. 예를 들어, 이러한 EC-SEAL은 용혈 환자에서의 다발성 기관 부전의 발생을 억제하거나 감소시킬 수 있다.
따라서, 한 실시양태에서, 본 개시내용은 내피 기능장애와 연관된 질환을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 또한, 한 실시양태에서, 이를 필요로 하는 환자에서 내피 기능장애를 치료 또는 억제하는 방법이 제공된다. 본 개시내용의 또 다른 측면은 하나 이상의 내피 세포를 본원에 기재된 임의의 EC-SEAL 접합체와 접촉시키는 것을 포함하는 방법이다.
내피 기능장애와 연관된 질환의 비-제한적 예로는 아테롬성동맥경화증, 관상 동맥 질환, 당뇨병, 고혈압, 고콜레스테롤혈증, 류마티스 관절염, 전신 홍반성 루푸스, 녹내장, 요독증, 패혈증, 및 기관 부전을 들 수 있다. 일부 측면에서, 투여는 정맥내, 복강내, 국소 또는 이식된 장치를 통한 것이다.
일부 측면에서, 내피 기능장애는 침투된 내피 내층 또는 손상된 내피 세포를 특징으로 한다. 일부 측면에서, 내피 기능장애는 당질층의 손실을 특징으로 한다. 일부 측면에서, 내피 기능장애는 내피 세포의 표면 상에 발현되며 순환에 노출된 셀렉틴 단백질을 특징으로 한다. 일부 측면에서, 부위는 염증을 앓고 있다.
한 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에서 제공된 바와 같은 EC-SEAL 접합체를 제공하고; EC-SEAL을 적어도 하나의 기능장애성 내피 세포에 투여하는 것을 포함하며, 여기서 EC-SEAL은 기능장애성 내피 세포 상의 셀렉틴 분자의 생성을 억제하도록 투여되는 것인, 내피 세포 기능장애를 억제하는 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 본원에서 제공된 바와 같은 EC-SEAL 접합체는 세포에서 염증 반응을 억제한다. 일부 측면에서, EC-SEAL 접합체는 혈소판 결합을 억제한다. 일부 측면에서, EC-SEAL 접합체는 내막 과다형성을 억제한다. 일부 측면에서, EC-SEAL 접합체는 만성 염증을 억제한다. 일부 측면에서, EC-SEAL 접합체는 다중계 기관 부전을 억제한다. 일부 측면에서, EC-SEAL 접합체는 녹내장을 치료한다. 일부 측면에서, EC-SEAL 접합체는 내피 세포 증식을 자극한다.
또한, 한 실시양태에서, 유효량의 본원에서 제공된 바와 같은 EC-SEAL 접합체를 포함하는 제약 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 혈관 부위에서의 염증을 예방 또는 감소시키는 방법이며, 여기서 부위는 (a) 침투된 내피 내층 또는 손상된 내피 세포를 포함하고, (b) 혈관 중재 시술을 받고 있지 않는 것 내지 그로부터 회복되고 있는 것인 방법이 제공된다.
일부 측면에서, 혈관 중재 시술은 경피 관상동맥 중재 (PCI) 시술을 포함한다.
일부 측면에서, 환자는 혈관 중재 시술을 받고 있지 않거나 그로부터 회복되고 있다. 일부 측면에서, 혈관 중재 시술은 경피 관상동맥 중재 (PCI) 시술을 포함한다. 일부 측면에서, 혈관 중재 시술은 혈관을 벗겨내는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 개시내용은 EC-SEAL 접합체를 포함하며, EC-SEAL 접합체가 환자에서의 벗겨진 혈관에 결합하는 것인 환자에서의 혈관 중재술에 사용하기 위한 화합물을 제공한다. 일부 측면에서, EC-SEAL 접합체는 혈소판 활성화를 억제한다. 일부 측면에서, EC-SEAL 접합체는 벗겨진 혈관에의 혈소판 결합을 억제한다. 일부 측면에서, EC-SEAL 접합체는 내막 과다형성을 억제한다. 일부 측면에서, EC-SEAL 접합체는 혈관의 벗겨짐으로부터 초래되는 염증을 억제한다.
일부 측면에서, EC-SEAL 접합체는 혈전증을 억제한다. 일부 측면에서, EC-SEAL 접합체는 혈관연축을 억제한다. 일부 측면에서, EC-SEAL 접합체는 내피 세포 증식을 자극한다. 일부 측면에서, EC-SEAL 접합체는 벗겨진 혈관 상의 노출된 콜라겐에 결합한다.
도 1A 및 1B는 5 ng/ml TNFα 또는 동등 부피의 PBS로 4시간 동안 자극시킨 후, 2 mg/ml 비오틴-EC-SEAL로 1시간 동안 처리한 인간 관상동맥 내피 세포 (HAEC)의 영상을 나타낸다 (실시예 2 참조). 사용된 EC-SEAL 분자 (DS-QAR20 -비오틴)는 셀렉틴 리간드 펩티드 (IELLQARGSC, 서열식별번호: 2), 및 산화된 더마탄 술페이트의 접합체였다. 이러한 처리 후, 세포를 세정하고, 고정하고; 그 후 HAEC 상의 셀렉틴에의 DS-QAR20 -비오틴 결합을 아비딘-알렉사플루오르로 프로빙하였다. 도 1A는 DS-QAR20-비오틴이 결합된 (적색), 이러한 처리 후의 TNFα 자극된 내피 세포 (시톡스 (SYTOX)-그린으로 표지된 핵)를 나타내며, 황색 화살표는 DS-QAR20 -비오틴의 특히 큰 코팅을 갖는 세포 (적색 영역)를 강조하기 위한 것이다. 도 1B는 DS-QAR20 -비오틴으로 처리된 PBS 자극된 내피 세포를 나타내며, 이는 TNFα로 자극되지 않은 세포에 비해 DS-QAR20 -비오틴의 결합이 거의 일어나지 않음을 나타낸다. 축적 막대는 30 μm이다.
도 2는 내피 세포 (EC)에 대한 셀렉틴-결합 EC-SEAL 접합체의 상대적 결합 친화도를 나타낸다.
도 3은 내피 세포 (EC)에 대한 ICAM-결합 EC-SEAL 접합체의 상대적 결합 친화도를 나타낸다.
도 4는 내피 세포 (EC)에 대한 단일 셀렉틴 또는 ICAM-결합 EC-SEAL 접합체, 및 셀렉틴 및 ICAM-결합 펩티드 둘 다를 갖는 EC-SEAL 접합체의 상대적 결합 친화도를 나타낸다.
도 2는 내피 세포 (EC)에 대한 셀렉틴-결합 EC-SEAL 접합체의 상대적 결합 친화도를 나타낸다.
도 3은 내피 세포 (EC)에 대한 ICAM-결합 EC-SEAL 접합체의 상대적 결합 친화도를 나타낸다.
도 4는 내피 세포 (EC)에 대한 단일 셀렉틴 또는 ICAM-결합 EC-SEAL 접합체, 및 셀렉틴 및 ICAM-결합 펩티드 둘 다를 갖는 EC-SEAL 접합체의 상대적 결합 친화도를 나타낸다.
달리 정의되지 않는다면, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 이 개시내용이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 사용된 하기 용어는 하기 의미를 갖는다.
본원에 사용된 용어 "포함하는" 또는 "포함하다"는 조성물 및 방법이 인용된 요소를 포함하지만, 다른 것들을 배제하지 않음을 의미하는 것으로 의도된다. 조성물 및 방법을 정의하는 데 사용되는 경우 "본질적으로 이루어진"은 진술된 목적을 위한 조성물에 대한 임의의 본질적 중요성의 다른 요소를 배제하는 것을 의미할 것이다. 따라서, 본원에 정의된 바와 같은 요소로 본질적으로 이루어진 조성물은 청구된 기본적이며 신규한 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 다른 물질 또는 단계를 배제하지 않을 것이다. "이루어진"은 다른 성분 및 실질적 방법 단계의 미량 초과 요소를 배제하는 것을 의미할 것이다. 각각의 이들 전이 용어에 의해 정의된 실시양태는 이 개시내용의 범위 내에 있다.
범위를 포함하여 수치 지정, 예를 들어, 온도, 시간, 양, 및 농도 앞에 사용되는 경우 용어 "약"은 (+) 또는 (-) 10%, 5% 또는 1% 달라질 수 있는 근사치를 지시한다.
본원에 사용된 용어 "조성물"은 그의 임의의 고체 형태를 비롯한 적어도 1종의 제약 활성 성분을 함유하는 치료 목적으로 의도된 환자에게 투여하기에 적합한 제제를 지칭한다. 조성물은 화합물의 개선된 제제를 제공하는 적어도 1종의 제약상 허용되는 성분, 예컨대 적합한 담체를 포함할 수 있다.
펩티드 접합체
본 개시내용은 혈관의 내피 세포 내층을 손상, 요독증, 산화 스트레스 및 염증으로부터 보호하는 펩티드 접합체에 관한 것이다. 펩티드 접합체는 수술적으로 영향받은 혈관 뿐만 아니라 카테터삽입된 혈관의 내피 세포 내층의 보호에 특히 유용한 S/E 셀렉틴-결합 및 ICAM-결합 항호중구/단핵구 내강 내층 (EC-SEAL)을 형성할 수 있다.
EC-SEAL 펩티드 접합체는 셀렉틴, ICAM 및/또는 VCAM에 결합할 수 있는 1종 이상의 펩티드 리간드를 포함한다. 펩티드 리간드는 글리코사미노글리칸 (GAG), 예컨대 더마탄 술페이트에 접합되며, 접합체는 또한 1개 내지 약 3개의 소수성 꼬리(들) (예를 들어, 알킬 꼬리)를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 EC-SEAL 접합체는, EC-SEAL 접합체가 셀렉틴, ICAM 및/또는 VCAM에 결합할 수 있도록 1종 이상의 유형의 펩티드 리간드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 셀렉틴-결합 펩티드 및 ICAM-결합 펩티드 둘 다를 포함하는 EC-SEAL 접합체가 본원에 포함된다. 또한, 셀렉틴-결합 펩티드 및 VCAM-결합 펩티드 둘 다를 포함하는 EC-SEAL 접합체, 또는 ICAM-결합 펩티드 및 VCAM-결합 펩티드 둘 다를 포함하는 EC-SEAL 접합체가 포함된다. 또한, 펩티드 리간드는 단일 펩티드 내에 1종 이상의 셀렉틴, ICAM 및/또는 VCAM-결합 단위 (또는 서열)를 포함할 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 셀렉틴-결합 단위 (또는 서열) 및 ICAM-결합 단위 (또는 서열) 둘 다를 갖는 펩티드를 포함하는 EC-SEAL 접합체가 본원에 개시된다. 또한, 셀렉틴-결합 단위 (또는 서열) 및 VCAM-결합 단위 (또는 서열) 둘 다를 포함하는 EC-SEAL 접합체가 포함된다. 또한, ICAM-결합 단위 (또는 서열) 및 VCAM-결합 단위 (또는 서열) 둘 다를 포함하는 EC-SEAL 접합체가 포함된다.
펩티드 리간드는 다양한 구조를 가질 수 있는 합성 펩티드이다. 본원에 사용된 용어 "펩티드 리간드"는 펩티드 (또는 아미드) 결합에 의해 연결된 아미노산의 쇄를 지칭하는 것으로 의도된다. 한 실시양태에서, 펩티드 리간드는 약 3개 내지 약 120개의 아미노산, 또는 약 3개 내지 약 110개의 아미노산, 또는 약 3개 내지 약 100개의 아미노산, 또는 약 3개 내지 약 90개의 아미노산, 또는 약 3개 내지 약 80개의 아미노산, 또는 약 3개 내지 약 70개의 아미노산, 또는 약 3개 내지 약 60개의 아미노산, 또는 약 3 내지 약 50개의 아미노산, 또는 약 3개 내지 약 40개의 아미노산, 또는 약 5개 내지 약 120개의 아미노산, 또는 약 5개 내지 약 100개의 아미노산, 또는 약 5개 내지 약 90개의 아미노산, 또는 약 5개 내지 약 80개의 아미노산, 또는 약 5개 내지 약 70개의 아미노산, 또는 약 5개 내지 약 60개의 아미노산, 또는 약 5개 내지 약 50개의 아미노산, 또는 약 5개 내지 약 40개의 아미노산, 또는 약 5개 내지 약 30개의 아미노산, 또는 약 5개 내지 약 20개의 아미노산, 또는 약 5개 내지 약 10개의 아미노산을 포함한다. 펩티드 리간드는 다양한 길이의 것일 수 있지만, 전형적으로, 펩티드 리간드는 약 5개 내지 약 40개의 아미노산을 갖는다. 유용한 펩티드 리간드의 예로는 하기 펩티드 서열 (또는 단위)을 들 수 있으며, 이는 셀렉틴: IELLQAR (서열식별번호: 1); IELLQARGSC (서열식별번호: 2); IDLMQAR (서열식별번호: 3); IDLMQARGSC (서열식별번호: 4); QITWAQLWNMMK (서열식별번호: 5); QITWAQLWNMMKGSC (서열식별번호: 6), 및 이들의 조합에 결합할 수 있다. 셀렉틴은 S-, P- 또는 E-셀렉틴일 수 있다. 펩티드 서열을 E-셀렉틴-결합 친화도 (또는 E-셀렉틴-결합 단위)에 대해 스크리닝하는 다양한 방법은 관련 기술분야에 통상적이다 (예를 들어, 문헌 [Martens, C. L. et al. J. Biol. Chem. 1995, 270(36), 21129-21136]; 및 [Koivunen, E. et al. J. Nucl. Med. 1999, 40, 883-888] 참조).
본원에 개시된 EC-SEAL 접합체 및 방법에 사용될 수 있는 E-셀렉틴-결합 친화도 (또는 E-셀렉틴-결합 단위)를 갖는 것으로 나타난 다른 펩티드 서열로는 LRRASLGDGDITWDQLWDLMK (서열식별번호: 13), HITWDQLWNVMN (서열식별번호: 14), QITWAQLWNMMK (서열식별번호: 5), YGNSNITWDQLWSIMNRQTT (서열식별번호: 15), WTDTHITWDQLWHFMNMGEQ (서열식별번호: 16), EPWDQITWDQLWIIMNNGDG (서열식별번호: 17), HITWDQLWLMMS (서열식별번호: 18), DLTWEGLWILMT (서열식별번호: 19), RGVWGGLWSMTW (서열식별번호: 20), DYSWHDLWFMMS (서열식별번호: 21), KKEDWLALWRIMSVPDEN (서열식별번호: 22), RNMSWLELWEHMK (서열식별번호: 23), KEQQWRNLWKMMS (서열식별번호: 24), SQVTWNDLWSVMNPEVVN (서열식별번호: 25) 및 RSLSWLQLWDWMK (서열식별번호: 26) (예를 들어, 문헌 [Martens, C. L. et al. J. Biol. Chem. 1995, 270(36), 21129-21136] 참조), DITWDQLWDLMK (서열식별번호: 27) (예를 들어, 문헌 [Koivunen, E. et al. J. Nucl. Med. 1999, 40, 883-888] 참조), DITWDELWKIMN (서열식별번호: 28), DYTWFELWDMMQ (서열식별번호: 29), DMTHDLWLTLMS (서열식별번호: 30), EITWDQLWEVMN (서열식별번호: 31), HVSWEQLWDIMN (서열식별번호: 32), HITWDQLWRIMT (서열식별번호: 33), DISWDDLWIMMN (서열식별번호: 34), QITWDQLWDLMY (서열식별번호: 35), RNMSWLELWEHMK (서열식별번호: ), AEWTWDQLWHVMNPAESQ (서열식별번호: 36), HRAEWLALWEQMSP (서열식별번호: 37), KKEDWLALWRIMSV (서열식별번호: 38), KRKQWIELWNIMS (서열식별번호: 39), WKLDTLDMIWQD (서열식별번호: 40) 및 HITWDQLWNVMLRRAASLG (서열식별번호: 41) (예를 들어, 문헌 [Simanek, E. E. Chem. Rev. 1998, 98, 833-862] 참조), 또는 이들의 조합을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않으며, 상기 문헌 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
펩티드 서열을 ICAM-결합 친화도 (또는 ICAM-결합 단위)에 대해 스크리닝하는 다양한 방법은 관련 기술분야에 통상적이다 (예를 들어, 문헌 [Martens, C. L. et al. J. Biol. Chem. 1995, 270(36), 21129-21136]; 및 [Koivunen, E. et al. J. Nucl. Med. 1999, 40, 883-888] 참조). ICAM에 결합할 수 있는 유용한 펩티드 리간드의 예로는 하기를 들 수 있다: NAFKILVVITFGEK (서열식별번호: 7); NAFKILVVITFGEKGSC (서열식별번호: 8); ITDGEA (서열식별번호: 9); ITDGEAGSC (서열식별번호: 10); DGEATD (서열식별번호: 11); DGEATDGSC (서열식별번호: 12), 및 이들의 조합.
본원에 개시된 EC-SEAL 접합체 및 방법에 사용될 수 있는 ICAM-결합 친화도 (또는 ICAM-결합 단위)를 갖는 것으로 나타난 다른 펩티드 서열로는 EWCEYLGGYLRYCA (서열식별번호: 42) (예를 들어, 문헌 [Welply, J. K. et al. Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics 1996, 26(3): 262-270] 참조), FEGFSFLAFEDFVSSI (서열식별번호: 43) (예를 들어, 미국 공개 제WO2014059384호 참조), NNQKIVNLKEKVAQLEA (서열식별번호: 44), NNQKIVNIKEKVAQIEA (서열식별번호: 45), NNQKLVNIKEKVAQIEA (서열식별번호: 46), YPASYQR (서열식별번호: 47), YQATPLP (서열식별번호: 48), GSLLSAA (서열식별번호: 49), FSPHSRT (서열식별번호: 50), YPFLPTA (서열식별번호: 51) 및 GCKLCAQ (서열식별번호: 52) (예를 들어, 미국 특허 제8,926,946호 참조), GGTCGGGGTGAGTTTCGTGGTAGGGATAATTCTGTTTGGGTGGTT (서열식별번호: 53), EWCEYLGGYLRCYA (서열식별번호: 54) (예를 들어, 문헌 [Koivunen, E. et al. J. Nucl. Med. 1999, 40, 883-888] 참조), GRGEFRGRDNSVSVV (서열식별번호: 55) (예를 들어, 중국 공개 제CN1392158호 참조), QTSVSPSKVI (서열식별번호: 56), PSKVILPRGG (서열식별번호: 57), LPRGGSVLVTG (서열식별번호: 58), 및 QTSVSPSKVILPRGGSVLVTG (서열식별번호: 59) (예를 들어, 문헌 [Tibbetts, S. A. et al. Peptides 21 (2000) 1161-1167] 참조), 및 이들의 조합을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않으며, 상기 문헌 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
펩티드 서열을 VCAM-결합 친화도 (또는 VCAM-결합 단위)에 대해 스크리닝하는 다양한 방법은 관련 기술분야에 통상적이다 (예를 들어, 문헌 [Martens, C. L. et al. J. Biol. Chem. 1995, 270(36), 21129-21136]; 및 [Koivunen, E. et al. J. Nucl. Med. 1999, 40, 883-888] 참조). 본원에 개시된 EC-SEAL 접합체 및 방법에 사용될 수 있는 VCAM-결합 친화도 (또는 VCAM-결합 도메인)를 갖는 것으로 나타난 다른 펩티드 서열로는 YRLAIRLNER (서열식별번호: 60), YRLAIRLNERRENLRIALRY (서열식별번호: 61) 및 RENLRIALRY (서열식별번호: 62) (예를 들어, 유럽 공개 제EP1802352호 참조), 및 이들의 조합을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않으며, 상기 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
펩티드 리간드 서열에는 가변성이 존재할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 합성 펩티드 리간드는 1종 이상의 보존적 아미노산 치환의 포함에 의해 변형될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 바와 같이, 보존적 치환에 의해 펩티드의 임의의 비-중요 아미노산을 변경시키는 것은, 대체 아미노산의 측쇄가 대체된 아미노산의 측쇄에의 유사한 결합 및 접촉을 형성할 수 있어야 하기 때문에, 그 펩티드의 활성을 유의하게 변경시키지 않아야 한다. 따라서, 본원에 기재된 임의의 펩티드 서열은 그에 대해 적어도 약 80% 서열 동일성, 또는 적어도 약 83% 서열 동일성, 또는 적어도 약 85% 서열 동일성, 또는 적어도 약 90% 서열 동일성, 또는 적어도 약 95% 서열 동일성, 또는 적어도 약 98% 서열 동일성을 갖는 서열이 EC-SEAL 접합체에 혼입되며, 단 서열이 셀렉틴, ICAM 및/또는 VCAM에 결합할 수 있도록 변형될 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 펩티드 리간드는 예를 들어, 임의의 아미노산 서열과 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 98% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
한 실시양태에서, 펩티드 리간드, 또는 펩티드의 결합 단위는 약 1 mM 미만, 또는 약 900 μM 미만, 또는 약 800 μM 미만, 또는 약 700 μM 미만, 또는 약 600 μM 미만, 또는 약 500 μM 미만, 또는 약 400 μM 미만, 또는 약 300 μM 미만, 또는 약 200 μM 미만, 또는 약 100 μM 미만의 해리 상수 (K d )로 셀렉틴, ICAM 및/또는 VCAM에 결합한다.
일부 실시양태에서, EC-SEAL 접합체는 콜라겐-결합 단위를 갖는 1종 이상의 펩티드 리간드(들)를 추가로 포함한다. 콜라겐-결합 단위는 셀렉틴, ICAM 및/또는 VCAM 결합 단위와 동일하거나 상이한 펩티드 내에 위치할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 펩티드 리간드는 1종 이상의 셀렉틴, ICAM 및/또는 VCAM-결합 단위 및 콜라겐-결합 단위를 포함한다. 콜라겐-결합 단위는 콜라겐 원섬유형성에 정상적으로 또는 정상적이지 않게 관여하는 단백질의 부분과 아미노산 상동성을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 이들 단위는 작은 류신-풍부 프로테오글리칸, 혈소판 수용체 서열, 또는 콜라겐 원섬유형성을 조절하는 단백질의 아미노산 서열에 대해 상동성 또는 서열 동일성을 갖는다. 다양한 실시양태에서, 콜라겐-결합 단위는 RRANAALKAGELYKSILY (서열식별번호: 63), GELYKSILY (서열식별번호: 64), RRANAALKAGELYKCILY (서열식별번호: 65), GELYKCILY (서열식별번호: 66), RLDGNEIKR (서열식별번호: 67), AHEEISTTNEGVM (서열식별번호: 68), NGVFKYRPRYFLYKHAYFYPPLKRFPVQ (서열식별번호: 69), CQDSETRTFY (서열식별번호: 70), TKKTLRT (서열식별번호: 71), GLRSKSKKFRRPDIQYPDATDEDITSHM (서열식별번호: 72), SQNPVQP (서열식별번호: 73), SYIRIADTNIT (서열식별번호: 74), KELNLVYT (서열식별번호: 75), 또는 GSITTIDVPWNV (서열식별번호: 76)로부터 선택되는 아미노산 서열; 또는 그에 대해 적어도 약 80% 서열 동일성, 또는 적어도 약 83% 서열 동일성, 또는 적어도 약 85% 서열 동일성, 또는 적어도 약 90% 서열 동일성, 또는 적어도 약 95% 서열 동일성, 또는 적어도 약 98% 서열 동일성을 갖되, 단 서열이 콜라겐에 결합할 수 있는 것인 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 콜라겐-결합 단위는 각각 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Chiang, T.M., et al. J. Biol. Chem., 2002, 277: 34896-34901], [Huizinga, E.G. et al., Structure, 1997, 5: 1147-1156], [Romijn, R.A., et al., J. Biol. Chem., 2003, 278: 15035-15039], 및 [Chiang, et al., Cardio. & Haemato. Disorders-Drug Targets, 2007, 7: 71-75]에 기재된 바와 같은 폰 빌레브란트 인자 (vWF) 또는 혈소판 콜라겐 수용체의 콜라겐-결합 도메인(들)과 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 83%, 또는 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 비-제한적 예는 vWF로부터 유래된 WREPSFCALS (서열식별번호: 77)이다.
아미노산 서열을 콜라겐-결합 친화도 (또는 콜라겐-결합 도메인)에 대해 스크리닝하는 다양한 방법은 관련 기술분야에 통상적이다. 본원에 개시된 펩티도글리칸 및 방법에 사용될 수 있는 콜라겐-결합 친화도를 갖는 것으로 나타난 다른 아미노산 서열로는 βAWHCTTKFPHHYCLYBip (서열식별번호: 78), βAHKCPWHLYTTHYCFTBip (서열식별번호: 79), βAHKCPWHLYTHYCFT (서열식별번호: 80), 등 (여기서, Bip는 비페닐알라닌이고, βA는 베타-알라닌임) (문헌 [Abd-Elgaliel, W.R., et al., Biopolymers, 2013, 100(2), 167-173] 참조), GROGER (서열식별번호: 81), GMOGER (서열식별번호: 82), GLOGEN (서열식별번호: 83), GLOGER (서열식별번호: 84), GLKGEN (서열식별번호: 85), GFOGERGVEGPOGPA (서열식별번호: 86) 등 (여기서, O는 4-히드록시프롤린임) (문헌 [Raynal, N., et al., J. Biol. Chem., 2006, 281(7), 3821-3831] 참조), HVWMQAPGGGK (서열식별번호: 87) (문헌 [Helms, B.A., et al., J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 11683-11685] 참조), WREPSFCALS (서열식별번호: 77) (문헌 [Takagi, J., et al., Biochemistry, 1992, 31, 8530-8534] 참조), WYRGRL (서열식별번호: 88) 등 (문헌 [Rothenfluh D.A., et al., Nat Mater. 2008, 7(3), 248-54] 참조), WTCSGDEYTWHC (서열식별번호: 89), WTCVGDHKTWKC (서열식별번호: 90), QWHCTTRFPHHYCLYG (서열식별번호: 91) 등 (U.S. 2007/0293656 참조), STWTWNGSAWTWNEGGK (서열식별번호: 92), STWTWNGTNWTRNDGGK (서열식별번호: 93) 등 (WO/2014/059530 참조), CVWLWEQC (서열식별번호: 94) (문헌 [Depraetere H., et al., Blood. 1998, 92, 4207-4211]; 및 [Duncan R., Nat Rev Drug Discov, 2003, 2(5), 347-360] 참조), CMTSPWRC (서열식별번호: 95) 등 (문헌 [Vanhoorelbeke, K., et al., J. Biol. Chem., 2003, 278, 37815-37821] 참조), CPGRVMHGLHLGDDEGPC (서열식별번호: 96) (문헌 [Muzzard, J., et al., PLoS one. 4 (e 5585) I-10] 참조), KLWLLPK (서열식별번호: 112) (문헌 [Chan, J. M., et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A., 2010, 107, 2213-2218] 참조), 및 CQDSETRTFY (서열식별번호: 113) 등 (U.S. 2013/0243700 참조)을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않으며, 상기 문헌 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
아미노산의 "보존적 치환" 또는 펩티드의 "보존적 치환 변이체"는 1) 펩티드의 2차 구조; 2) 아미노산의 전하 또는 소수성; 및 3) 측쇄의 벌키성 또는 이들 특징 중 임의의 하나 이상을 유지하는 아미노산 치환을 지칭한다. 예시적으로, 널리 공지된 용어 "친수성 잔기"는 세린 또는 트레오닌에 관한 것이다. "소수성 잔기"는 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 발린 또는 알라닌 등을 지칭한다. "양으로 하전된 잔기"는 리신, 아르기닌, 오르니틴, 또는 히스티딘에 관한 것이다. "음으로 하전된 잔기"는 아스파르트산 또는 글루탐산을 지칭한다. "벌키 측쇄"를 갖는 잔기는 페닐알라닌, 트립토판 또는 티로신 등을 지칭한다. 아미노산 약어 및 예시적인 보존적 아미노산 치환의 목록은 표 1에 주어진다.
<표 1>
펩티드 리간드에서의 비-보존적 치환은 또한 이들이 펩티드의 결합 활성에 과도하게 영향을 미치지 않고/거나, 하기: 혈소판 활성화, 내피에의 혈소판 결합, 혈전증, 내피의 벗겨짐으로부터 초래되는 염증, 내막 과다형성, 및/또는 혈관연축 중 임의의 것의 억제에 있어서의 그의 유효성, 또는 내피 세포 증식의 자극 또는 벗겨진 혈관에의 결합에 있어서의 그의 유효성을 감소시키지 않는 한 존재할 수 있다.
합성 펩티드 리간드(들)에 부착된 글리코사미노글리칸 (GAG 또는 글리칸으로 약칭됨)은 알기네이트, 아가로스, 덱스트란, 콘드로이틴, 더마탄, 더마탄 술페이트, 헤파린, 헤파란 술페이트, 케라틴, 및 히알루로난으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 한 실시양태에서, 글리칸은 더마탄 술페이트, 덱스트란, 및 헤파린으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 글리칸은 더마탄 술페이트이다. 더마탄 술페이트는 대부분 피부에서, 그러나 또한 혈관, 심장 판막, 힘줄, 폐 및 장 점막에서 발견되는 천연 글리코사미노글리칸이다. 피부 및 다른 기관의 주요 구성요소로서의 그의 역할 외에, 더마탄 술페이트는 상처의 복구, 혈액 응고의 조절, 및 감염에 대한 반응에 역할을 하는 것으로 믿어지지만, 이들 프로세스에서의 그의 역할은 널리 이해되어 있지 않다.
펩티드 리간드(들)는 글리코사미노글리칸에 직접 연결되거나, 링커를 통해 글리코사미노글리칸에 연결될 수 있다. 링커는 각각의 예에서 그의 각각이 임의로 치환되는 알킬렌, 헤테로알킬렌, 시클로알킬렌, 시클로헤테로알킬렌, 아릴렌, 및 헤테로아릴렌으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 1종 이상의 2가 단편을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 헤테로알킬렌은 선형 또는 분지형 알킬렌 기의 하나 이상의 탄소 원자를 각각의 예에서 산소, 질소, 인 및 황으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 원자로 대체하는 것으로부터 초래되는 기를 나타낸다.
각각의 글리코사미노글리칸은 그에 연결된 약 1개 내지 약 50개, 또는 약 3개 내지 약 50개의 펩티드 리간드를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 각각의 글리코사미노글리칸은 적어도 3개의 펩티드 리간드, 또는 적어도 5개의 펩티드 리간드, 또는 적어도 8개의 펩티드 리간드, 또는 적어도 10개의 펩티드 리간드, 또는 적어도 15개의 펩티드 리간드, 또는 적어도 20개의 펩티드 리간드, 또는 적어도 25개의 펩티드 리간드에 공유 결합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 각각의 글리코사미노글리칸은 약 5개 내지 약 45개의 펩티드 리간드, 또는 약 7개 내지 약 45개의 펩티드 리간드, 또는 약 8개 내지 약 40개의 펩티드 리간드, 또는 약 10개 내지 약 35개의 펩티드 리간드, 또는 약 10개 내지 약 30개의 펩티드 리간드, 또는 약 15개 내지 약 30개의 펩티드 리간드에 공유 결합될 수 있다.
EC-SEAL 접합체는 또한 EC-SEAL 접합체의 소수성을 조절하는 데 유용할 수 있는 1개 내지 약 3개의 알킬 꼬리를 포함할 수 있다. 예를 들어, 나노미립자 EC-SEAL 접합체는 알킬 꼬리가 사용되는 경우 미셀을 형성할 수 있다. EC-SEAL 미셀은 추가의 유리 EC-SEAL을 혈관 부위로, 예컨대 누공의 내강으로 전달하기 위해 생체내에서 서서히 해리되는 나노입자를 형성한다. 본원에 사용된 용어 "알킬 꼬리"는 실질적으로 소수성 알킬 쇄를 지칭하는 것으로 의도된다. 알킬 쇄는 전형적으로 2개 내지 약 25개의 탄소 원자, 보다 특히 2개 내지 약 18개의 탄소 원자를 갖는 포화 1가 히드로카르빌 기를 포함한다. 알킬 쇄는 선형, 분지형 또는 시클릭 기를 포함할 수 있으며, 알킬 쇄 (또는 알킬 꼬리)가 실질적으로 소수성인 한, 불포화의 부위 및/또는 다른 임의적 관능기를 포함할 수 있다. 사용되는 알킬 꼬리는 일반적으로 2 내지 18개의 탄소 (C2-18) 알킬 쇄이다. 일부 실시양태에서, 알킬 꼬리 (즉, 알킬 쇄)는 2 내지 25개의 탄소 원자 (C2-25), 또는 3 내지 25개의 탄소 원자 (C3-25), 또는 4 내지 14개의 탄소 원자 (C4-14), 또는 5 내지 12개의 탄소 원자 (C5-12)를 갖는다. 예를 들어, 알킬 쇄, 예컨대 이소프로필 (C3), 부틸 (C4), 헥실 (C6), 옥틸 (C8), 데실 (C10), 또는 도데실 (C12)이 사용될 수 있다. 알킬 쇄 (즉, 알킬 꼬리)는 글리코사미노글리칸의 관능기에 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 알킬 꼬리 및 글리코사미노글리칸 사이의 에테르, 에스테르, 아미드, 아미노, 또는 아실 연결을 사용하는 것이 편리하다.
따라서, EC-SEAL 접합체는 하기 화학식의 구조를 가질 수 있다:
(R)m-GAG-(P)n
상기 식에서,
R은 선형 또는 분지형 C2-25 알킬 쇄이고;
GAG는 글리코사미노글리칸이고;
각각의 P는 독립적으로 1종 이상의 셀렉틴-결합 단위, ICAM-결합 단위 및/또는 VCAM-결합 단위를 포함하는 3개 내지 약 50개의 아미노산의 펩티드이고;
n은 1 내지 50의 정수이고;
m은 0, 1, 2, 또는 3이다.
제조 방법
EC-SEAL 접합체는 이용가능한 절차, 또는 본원에 기재된 임의의 절차에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 합성 펩티드 리간드(들)는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 이용가능한 고체상 펩티드 합성 프로토콜에 따라 합성될 수 있다. 한 실시양태에서, 펩티드 전구체를 널리 공지된 Fmoc 프로토콜에 따라 고체 지지체 상에서 합성하고, 트리플루오로아세트산으로 지지체로부터 절단하고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 이용가능한 방법에 따라 크로마토그래피에 의해 정제한다.
합성 펩티드 리간드는 또한 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 이용가능한 생명공학의 방법을 이용하여 합성될 수 있다. 한 실시양태에서, 바람직한 펩티드 리간드에 대한 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 재조합 DNA 기술에 의해 발현 카세트 또는 발현 벡터 (예를 들어, 펩티드의 친화도 정제를 위한 친화도 태그를 혼입시키는 플라스미드) 내로 라이게이션하고, 숙주 세포를 펩티드 리간드의 재조합 발현을 허용하는 발현 카세트 또는 발현 벡터로 형질감염 또는 형질전환시킨 후, 펩티드를 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 공지된 방법에 따라 (예를 들어, 친화도 정제에 의해) 숙주 유기체 또는 성장 배지로부터 단리한다. 재조합 DNA 기술 방법은 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001)]에 기재되어 있으며, 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.
펩티드 (또는 폴리펩티드 또는 펩티드 영역)는 특정 퍼센트 (예를 들어, 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 65%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 83%, 또는 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99%)의 또 다른 서열에 대한 "서열 동일성"을 가지며, 이는 정렬되는 경우, 염기 (또는 아미노산)의 퍼센트가 2개의 서열의 비교에서 동일한 것을 의미한다. 이 출원에 개시된 임의의 서열 ("참조 서열")에 대해, 참조 서열에 대해 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 65%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 83%, 또는 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 갖는 서열은 또한 본 개시내용 내에 있음을 유념한다. 유사하게, 본 개시내용은 또한 참조 서열에 비해 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개의 치환, 결실 또는 부가를 갖는 서열을 포함한다.
합성 펩티드 리간드를 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법을 이용하여, 펩티드의 유리 아미노 기를 환원제의 존재 하에서 글리칸의 알데히드 관능부와 반응시킴으로써 클리칸에 접합시켜 펩티드 글리칸 접합체를 수득할 수 있다. 한 실시양태에서, 글리칸 (예를 들어 다당류 또는 글리코사미노글리칸)의 알데히드 관능부는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법에 따라 글리칸을 메타과아이오드산나트륨과 반응시킴으로써 형성된다.
글리칸의 소수화는 적합하게 관능화된 글리칸 (예를 들어, 아민 관능기를 함유하는 글리칸)을 소수성 모이어티 (예를 들어, 알킬 쇄의 글리시딜 에테르 접합체, 예컨대 이소프로필 (C3), 부틸 (C4), 헥실 (C6), 옥틸 (C8), 데실 (C10), 또는 도데실 (C12) 글리시딜 에테르)와 접합시킴으로써 달성될 수 있다. 알킬 쇄는 전형적으로 EC-SEAL 접합체의 소수화에 이용되지만, 다른 관능기도 또한 알킬 꼬리에 혼입될 수 있음이 고려된다 (예를 들어, 아미노, 티오, 에테르 등).
합성 펩티드 리간드를, 글리칸의 알데히드 관능부를 가교제, 예를 들어, 3-(2-피리딜디티오)프로피오닐 히드라지드 (PDPH)와 반응시켜 중간체 글리칸을 형성하고, 추가로 중간체 글리칸을 유리 티올 기를 함유하는 펩티드와 반응시켜 펩티드 글리칸 접합체를 수득함으로써 글리칸에 접합시킬 수 있다. 본원에 기재된 임의의 다양한 실시양태에서, 펩티드의 서열은 글리칸 또는 글리칸-링커 접합체에 대한 부착점을 제공하는 글리신-시스테인 절편을 포함하도록 변형될 수 있다. 본원에 기재된 임의의 실시양태에서, 가교제는 N-[β-말레이미도프로피온산]히드라지드 (BMPH)일 수 있다.
구체적인 실시양태를 선행 단락에 기재하였지만, 본원에 기재된 EC-SEAL 접합체는 글리칸 (예를 들어, 다당류 또는 글리코사미노글리칸)에의 펩티드의 접합을 위한 임의의 관련 기술분야에 인지된 방법을 사용함으로써 제조될 수 있다. 이는 직접적으로 또는 연결기, 예컨대 2가 링커를 통해 간접적으로 공유, 이온, 또는 수소 결합을 포함할 수 있다. 접합체는 전형적으로 접합체의 각각의 성분 상의 산, 알데히드, 히드록시, 아미노, 또는 히드라조 기 사이의 아미드, 에스테르 또는 이미노 결합의 형성을 통한 글리칸에의 펩티드의 공유 결합에 의해 형성된다. 이들 방법 모두는 관련 기술분야에 공지되어 있거나, 이 개시내용의 실시예 섹션에 또는 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Hermanson G.T., Bioconjugate Techniques, Academic Press, pp. 169-186 (1996)]에 추가로 기재되어 있다. 링커는 전형적으로 약 1개 내지 약 30개의 탄소 원자, 보다 전형적으로 약 2개 내지 약 20개의 탄소 원자를 포함한다. 보다 낮은 분자량 링커 (즉, 약 20 내지 약 500의 대략 분자량을 갖는 것들)가 전형적으로 사용된다.
또한, 접합체의 링커 부분의 구조적 변형은 본원에서 고려된다. 예를 들어, 아미노산은 링커에 포함될 수 있으며, 천연 발생 아미노산, 뿐만 아니라 통상적인 합성 방법으로부터 이용가능한 것들을 포함하나 이에 제한되지 않는 다수의 아미노산 치환은 접합체의 링커 부분에 이루어질 수 있다. 또 다른 측면에서, 베타, 감마, 및 보다 장쇄 아미노산은 1종 이상의 알파 아미노산 대신 사용될 수 있다. 또 다른 측면에서, 링커는 그에 포함된 아미노산의 수를 변화시킴으로써, 또는 보다 많은 또는 보다 적은 베타, 감마, 또는 보다 장쇄 아미노산을 포함시킴으로써 짧아지거나 길어질 수 있다. 유사하게, 본원에 기재된 링커의 다른 화학적 단편의 길이 및 형상은 변형될 수 있다.
따라서, 본원에 기재된 임의의 실시양태에서, 임의의 1종 이상의 합성 펩티드 리간드(들)는 1개 내지 약 5개의 아미노산을 포함하는 스페이서 서열을 가질 수 있다. 천연 또는 비천연의 임의의 아미노산은 스페이서 서열이 펩티드의 의도된 결합을 유의하게 방해하지 않는 한, 스페이서 서열에 사용될 수 있다. 예시적인 스페이서로는 임의로 시스테인 (예를 들어, GC, GCG, GSGC (서열식별번호: 99), 또는 GGC) 및/또는 세린 (예를 들어, GSG, 또는 GSGSG (서열식별번호: 100))을 포함하는, 1개 내지 5개의 글리신 단위 (예를 들어, G, GG, GGG, GGGG (서열식별번호: 97), 또는 GGGGG (서열식별번호: 98)), 또는 1개 내지 5개의 아르기닌 단위 (예를 들어, R, RR, RRR 등)를 포함하는 짧은 서열을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 스페이서는 또한 아미노산 스페이서가 있거나 없는 비-아미노산 모이어티, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 6-아미노헥산산, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 스페이서는 펩티드의 C-말단 또는 N-말단 중 어느 하나에 부착되어 글리칸 또는 글리칸-링커 접합체에 대한 부착점을 제공할 수 있다.
특정 실시양태에서, 스페이서는 하나 초과의 결합 부위 (선형 또는 분지형일 수 있음)를 포함하며, 따라서 분지된 구축물을 생성한다. 스페이서 상의 결합 부위는 동일하거나 상이할 수 있으며, 바람직한 펩티드 서열이 (예를 들어 아미드 결합을 통해) 그에 결합될 수 있도록, 임의의 적합한 결합 부위, 예컨대 아민 또는 카르복실산 모이어티일 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 스페이서는 1종 이상의 리신, 글루탐산 또는 아스파르트산 잔기를 함유한다. 이러한 구축물은 화학식 PnL (상기 식에서, P는 셀렉틴, ICAM 및/또는 VCAM-결합 서열이고, L은 스페이서이고, n은 2 내지 약 10, 또는 2 내지 8, 또는 2 내지 6, 또는 2 내지 5, 또는 2 내지 4의 정수, 또는 2, 또는 3, 또는 4, 또는 5, 또는 6, 또는 7, 또는 8, 또는 9, 또는 10임)의 1종 초과의 셀렉틴, ICAM 및/또는 VCAM-결합 단위를 갖는 펩티드를 제공할 수 있다. 예를 들어, 스페이서 L은 2, 3, 또는 4개의 결합 부위를 제공하는 아미노산 서열, 예컨대 KGSG (서열식별번호: 111), KGC, KKGSG (서열식별번호: 101), KKGC (서열식별번호: 102), KKKGSG (서열식별번호: 103), 또는 KKKGC (서열식별번호: 104) 등일 수 있다.
본원에 기재된 EC-SEAL 접합체에서, 펩티드 리간드는 예를 들어, C-말단, N-말단과 같은 임의의 적합한 부착점에서 또는 아미노산 상의 측쇄를 통해 글리칸에 결합될 수 있다. 예를 들어, 펩티드는 펩티드의 아미노산의 측쇄, 예컨대 글루탐산 또는 아스파르트산 잔기의 측면을 통해 글리칸에 결합될 수 있다. 또한, 펩티드 리간드는 선형, 분지형일 수 있거나, 1종 이상의 시클릭 펩티드 서열을 함유할 수 있다.
사용 방법
EC-SEAL 접합체는 내피에의 혈소판 결합을 억제하고/거나, 혈액 중의 다른 세포의 노출된 상피에의 결합을 억제하고/거나, 혈소판 활성화를 억제하고/거나, 혈전증을 억제하고/거나, 내피의 벗겨짐으로부터 초래되는 염증을 억제하고/거나, 내막 과다형성을 억제하고/거나, 혈관연축을 억제하는 데 사용될 수 있다. 본원에 기재된 EC-SEAL 접합체는 또한 내피 세포 증식을 자극할 수 있으며, 혈관의 표면에 결합할 수 있다. 임의의 이들 실시양태에서, 이들 상기언급된 효과는 혈관 중재 시술, 예컨대 카테터-기반 시술 동안 일어날 수 있다. 임의의 이들 실시양태에서, 임의의 상기-기재된 EC-SEAL 접합체가 사용될 수 있다.
본 개시내용은 한 실시양태에서, 내피 기능장애와 연관된 질환을 앓고 있는 환자의 치료를 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 개시내용은 또한 유효량의 본원에서 제공된 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 내피에의 혈소판 결합, 혈소판 활성화, 혈전증, 내피의 벗겨짐으로부터 초래되는 염증, 내막 과다형성, 및/또는 혈관연축 중 하나 이상을 억제하는 것, 또는 내피 세포 증식의 자극에 있어서의 또는 벗겨진 혈관에의 결합에 있어서의 그의 유효성에 관한 것이다. 조성물은 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 EC-SEAL 접합체를 포함한다.
본원에서 제공된 바와 같은 EC-SEAL 접합체는 급성 및 만성 질환 둘 다에서 내피 기능장애 또는 손상의 염증성 영향을 감소시킬 수 있다. 이러한 접합체는 기능장애성 내피에의 혈소판 결합을 억제하거나 감소시키며, 따라서 혈소판-매개된 염증을 감소시키는 것으로 고려된다. 염증은 혈소판 프로세스, 예컨대 혈소판-혈소판 결합, 혈소판-백혈구 결합, 백혈구 혈구누출의 용이화, 또는 단순히 국소 및 부위 시토카인의 혈소판으로부터의 방출을 통해 활성화될 수 있다.
또한, 일부 실시양태에서, 내피 기능장애를 앓고 있는 혈관 부위에서의 염증을 예방 또는 감소시키는 방법이 제공된다. 방법은 본 개시내용의 EC-SEAL 접합체를 포함하는 제약 조성물을 부위에 투여하는 것을 수반한다.
본원에 기재된 바와 같이, EC-SEAL 접합체는 이들이 충분한 양의 시간 동안 결합되어 잔류할 수 있는 혈류에 노출된 내피 셀렉틴 및 ICAM/VCAM 수용체를 표적화하여 벗겨진 내피에의 혈소판 결합을 예방하며, 결과적으로 혈소판 활성화, 혈전증, 내피의 벗겨짐으로부터 초래되는 염증, 내막 과다형성, 및 혈관연축을 예방한다. 따라서, 이들 EC-SEAL 접합체는 기능장애성 내피 세포에서의 셀렉틴 또는 ICAM/VCAM의 생성을 억제함으로써 염증 반응을 억제할 수 있다.
용어 "내피 기능장애"는 또한 "내피 세포 (EC) 기능장애", "기능장애성 내피" 또는 "기능장애성 내피 세포"로도 지칭된다. 내피 기능장애는 내피 세포의 세포 표면 상의 ICAM 및 VCAM 수용체 또는 셀렉틴 수용체의 드러남 또는 노출로 측정될 수 있다. P-셀렉틴 및 E-셀렉틴은 손상 및 염증으로 인해 세포 표면 상에 일시적으로 발현된, 및 기능장애성 내피에서 만성적으로 발현된 노출된 셀렉틴 수용체의 예이다.
일부 실시양태에서, 내피 기능장애는 침투된 내피 내층 또는 손상된 내피 세포를 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 내피 기능장애는 당질층의 손실을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 내피 기능장애는 내피 세포의 표면 상에 발현되며 순환에 노출된 셀렉틴 단백질을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 부위는 염증을 앓고 있다.
본원에 사용된 "내피 기능장애와 연관된 질환"은 적어도 부분적으로 내피 기능장애에 의해 유발된 또는 내피 기능장애를 유도하는 인간 질환 또는 상태를 지칭한다. 따라서, 내피 기능장애와 연관된 질환의 치료는 질환의 치료, 기능장애성 내피의 회복, 또는 기능장애성 내피로부터 발생하는 상태 또는 증상, 예컨대 염증, 내막 과다형성, 및 혈전증의 예방 또는 개선을 지칭한다.
일부 실시양태에서 개시된 바와 같이, EC-SEAL 접합체는 기능장애성 내피 세포를 억제하여 염증성 질환을 치료하거나, 억제하거나, 약화시킬 수 있다. 기능장애성 내피 세포는 문헌 [Ley, "The role of selectins in inflammation and disease", Vol. 9, Elsevier Science, (2003)]에 의해 입증된 바와 같이 염증 및 다른 염증성 질환과 연관된다. 다른 염증성 질환 및 자가면역 질환의 예로는 아테롬성동맥경화증, 관상 동맥 질환, 당뇨병, 고혈압, 고콜레스테롤혈증, 류마티스 관절염, 전신 홍반성 루푸스, 녹내장, 요독증, 패혈증, 및 기관 부전을 들 수 있다.
셀렉틴 수용체의 생성을 억제하고, VCAM/ICAM 수용체를 가림으로써, EC-SEAL 접합체는 이들 일과성 또는 만성 질환을 앓고 있는 환자를 치료하는 데 사용될 수 있다. 이들 질환을 억제하거나 약화시키는 것과 연관된 셀렉틴 억제의 증거는 문헌 [Ridings et al., "A dual-binding antibody to E- and L-selectin attenuates sepsis-induced lung injury", Vol. 152, American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, (1995)], [Weyrich et al., "In Vivo Neutralization of P-Selectin Protects Feline Heart and Endothelium in Myocardial Ischemia and Reperfusion Injury", Vol. 91, The American Society for Clinical Investigation, (1993)]에 의해 뒷받침되며, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다. 일부 암은 또한 염증 및 만성 염증과 연관되며, 따라서, EC-SEAL 접합체는 신생물성 세포 성장을 치료하거나, 억제하거나, 약화시키는 데 사용될 수 있음이 관련 기술분야에 공지되어 있다.
예시적인 실시양태에서, 본 개시내용의 EC-SEAL 접합체는 예를 들어, 벗겨진 내피에의 혈소판 결합, 혈소판 활성화, 혈전증, 내피의 벗겨짐으로부터 초래되는 염증, 내막 과다형성, 및 혈관연축 중 어느 하나 또는 조합을 예방하기 위해서를 포함하여 혈관 중재 시술에 사용될 수 있다. 본원에 기재된 EC-SEAL 접합체는 또한 기능장애성 내피 세포에서의 셀렉틴 또는 ICAM/VCAM의 생성을 억제함으로써 염증 반응을 억제할 수 있다.
투여 및 제제
본원에 기재된 EC-SEAL 접합체는 환자 (예를 들어, 혈소판 활성화, 예컨대 혈전증, 벗겨진 내피에의 혈소판 결합, 혈전증, 내피의 벗겨짐으로부터 초래되는 염증, 내막 과다형성, 또는 혈관연축에 관여하는 것을 억제하는 치료가 필요한 환자)에게 투여될 수 있다. 다양한 실시양태에서, EC-SEAL 접합체는 예를 들어 정맥내로 또는 근육 내로 투여될 수 있다. 비경구 투여를 위한 적합한 경로로는 혈관내, 정맥내, 동맥내, 근육내, 피부, 피하, 경피, 진피내, 및 표피내 전달을 들 수 있다. 비경구 투여를 위한 적합한 수단으로는 바늘 (미세바늘을 포함함) 주사, 주입 기술, 및 카테터-기반 전달을 들 수 있다.
본원에 기재된 임의의 EC-SEAL 접합체의 제약 조성물은 비경구 투여 또는 카테터-기반 전달용으로 제제화될 수 있다. 예를 들어, 이러한 조성물은
a) 제약상 활성량의 1종 이상의 EC-SEAL 접합체;
b) 약 pH 4.5 내지 약 pH 9 범위의 pH를 제공하는 제약상 허용되는 pH 완충제;
c) 약 0 내지 약 300 밀리몰 범위의 농도의 이온 농도 변형제; 및
d) 약 0.25% 내지 약 10% 총 화학식량의 농도 범위의 수용성 점도 변형제 또는 a), b), c), 또는 d)의 임의의 개별적 성분을 포함할 수 있거나, a), b), c) 및 d)의 임의의 조합이 제공된다.
본원에 기재된 다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법에 사용하기 위한 pH 완충제는 통상의 기술자에게 공지된 제제이며, 예를 들어, 아세테이트, 보레이트, 카르보네이트, 시트레이트, 및 포스페이트 완충제, 뿐만 아니라 염산, 수산화나트륨, 산화마그네슘, 인산일칼륨, 비카르보네이트, 암모니아, 탄산, 염산, 시트르산나트륨, 시트르산, 아세트산, 인산수소이나트륨, 보락스, 붕산, 수산화나트륨, 디에틸 바르비투르산, 및 단백질, 뿐만 아니라 다양한 생물학적 완충제, 예를 들어, TAPS, 비신 (Bicine), 트리스 (Tris), 트리신 (Tricine), HEPES, TES, MOPS, PIPES, 카코딜레이트, 또는 MES를 들 수 있다.
본원에 기재된 다양한 실시양태에서, 이온 농도 변형제로는 관련 기술분야에 공지된 제제, 예를 들어, 글리세린, 프로필렌 글리콜, 만니톨, 글루코스, 덱스트로스, 소르비톨, 염화나트륨, 염화칼륨, 및 다른 전해질을 들 수 있다.
유용한 점도 조정제로는 이온성 및 비-이온성 수용성 중합체; 가교된 아크릴산 중합체, 예컨대 "카르보머" 과의 중합체, 예를 들어, 카르보폴 (Carbopol)® 등록상표 하에 상업적으로 얻을 수 있는 카르복시폴리알킬렌; 친수성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 옥시드, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체, 및 폴리비닐알콜; 셀룰로스성 중합체 및 셀룰로스성 중합체 유도체, 예컨대 히드록시프로필 셀룰로스, 히드록시에틸 셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스 프탈레이트, 메틸 셀룰로스, 카르복시메틸 셀룰로스, 및 에테르화된 셀룰로스; 검, 예컨대 트라가칸트 및 크산탄 검; 알긴산나트륨; 젤라틴, 히알루론산 및 그의 염, 키토산, 겔란 또는 이들의 임의의 조합을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 전형적으로, 비-산성 점도 향상제, 예컨대 중성 또는 염기성 제제는 제제의 바람직한 pH의 달성을 용이하게 하기 위해 사용된다.
본원에 기재된 다양한 실시양태에서, 비경구 제제는 적합하게는 멸균 비-수용액으로서 또는 적합한 비히클, 예컨대 멸균, 피로겐-무함유수와 함께 사용되는 건조된 형태로서 제제화될 수 있다. 예를 들어, 동결건조에 의한 멸균 조건 하에서의 비경구 제제의 제조는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 이용가능한 표준 제약 기술을 사용하여 용이하게 달성될 수 있다.
본원에 기재된 다양한 실시양태에서, 비경구 제제의 제조에 사용되는 EC-SEAL 접합체의 용해도는 적절한 제제화 기술의 사용, 예컨대 용해도-향상 조성물, 예컨대 만니톨, 에탄올, 글리세린, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 폴록사머, 및 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 것들의 혼입에 의해 증가될 수 있다.
본원에 기재된 다양한 실시양태에서, 비경구 투여용 제제는 즉시 및/또는 변형 방출을 위한 것으로 제제화될 수 있다. 변형 방출 제제로는 지연, 지속, 펄스, 제어, 표적화 및 프로그램화 방출 제제를 들 수 있다. 따라서, 1종 이상의 EC-SEAL 접합체는 활성 화합물의 변형 방출을 제공하는 이식된 데포로서 투여용 고체, 반-고체, 또는 틱소트로픽 액체로서 제제화될 수 있다. 이러한 제제의 예시적인 예로는 약물-코팅된 스텐트 및 공중합체성 (dl-락트, 글리콜)산 (PGLA) 미소구를 들 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 1종 이상의 EC-SEAL 접합체, 또는 1종 이상의 EC-SEAL 접합체를 포함하는 조성물은 적절할 경우 연속적으로 투여될 수 있다.
본원에 기재된 임의의 실시양태에서, EC-SEAL 접합체는 임의의 적합한 방식으로 혈관내로 환자 내로 (예를 들어, 동맥 또는 정맥 내로) 투여될 수 있다. 본원에 기재된 다양한 실시양태에서, EC-SEAL 접합체는 혈관 중재술 이전에, 동안, 또는 후에 환자의 혈관 내로 투여될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 혈관 중재술, 예컨대 경피 관상동맥 중재술 (PCI)로는 예를 들어, 스텐팅, 죽종절제술, 이식, 및 혈관성형술, 예컨대 풍선 혈관성형술을 들 수 있다. 예시적으로, 혈관 중재술은 동맥, 예컨대 관상 동맥 또는 정맥을 일시적으로 폐색시키는 것을 포함하는 것 (예를 들어, 풍선 혈관성형술)일 수 있거나, 이는 동맥 또는 정맥을 일시적으로 폐색시키는 것을 포함하지 않는 것 (예를 들어, 비-풍선 혈관성형 시술, 풍선 혈관성형술을 포함하지 않는 스텐팅 시술 등)일 수 있다. 예시적인 전달 방식으로는 카테터, 비경구 투여, 풍선 상의 코팅, 다공성 풍선을 통해, 코팅된 스텐트, 및 이들의 임의의 조합 또는 임의의 다른 공지된 혈관 중재 시술 동안 약물의 전달 방법을 들 수 있다. 한 예시적인 실시양태에서, 표적 혈관으로는 관상 동맥, 예를 들어, 천연 관상 동맥 뿐만 아니라 예를 들어, 초기 관상 동맥 우회 시술에서 환자 내로 이식된 것들을 비롯한, 환자의 심장 조직에 혈액을 공급하는 임의의 혈관을 들 수 있다.
본원에 기재된 임의의 실시양태에서, 그 내로 EC-SEAL 접합체가 투여되도록 되어있고, 그 상에서 혈관 중재 시술이 수행되도록 되어있는 표적 혈관은 폐색, 예컨대 협착증 또는 혈관을 통한 감소된 혈류를 유발하는 완전 또는 부분적 폐색의 일부 다른 형태를 함유할 수 있다. 따라서, EC-SEAL 접합체는 환자 내로 경피적으로 삽입되고, 환자의 혈관을 통해 표적 혈관에 꿰어진 카테터 (예를 들어, 확장 카테터, 오버-더-와이어 (over-the-wire) 혈관성형술 풍선 카테터, 주입 카테터, 급속 교환 또는 모노레일 카테터, 또는 관련 기술분야에 공지된 임의의 다른 카테터 장치)를 통해 혈관에 전달될 수 있다. 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제7,300,454호에 기재된 것을 비롯한 다양한 카테터-기반 장치가 관련 기술분야에 이용가능하다. 카테터가 사용되는 본원에 기재된 다양한 실시양태에서, EC-SEAL 접합체를 전달하는 데 사용되는 카테터는 그를 통해 혈관 중재술이 수행되도록 되어있는 동일한 카테터일 수 있거나, 이는 상이한 카테터 (예를 들어, 동일하거나 상이한 피부 절개를 통해 환자 내로 경피적으로 삽입된 및/또는 동일하거나 상이한 경로를 통해 환자의 혈관을 통해 표적 혈관에 꿰어진 상이한 카테터)일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, EC-SEAL 접합체는 표적 혈관 내로 직접 주사될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, EC-SEAL 접합체는 전신적으로 전달될 (즉, 표적 혈관에 직접 전달되는 것이 아니라, 카테터-기반 전달 없이 비경구 투여에 의해 전달될) 수 있다.
혈관이 폐색 (예를 들어, 협착증)을 함유하는 경우, 투여는 EC-SEAL 접합체를 폐색의 부위에 또는 폐색에 대해 원위로 또는 둘 다로 표적 혈관에 직접 전달함으로써 수행될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, EC-SEAL 접합체는 폐색에 대해 근위의 하나 이상의 부위에 전달될 수 있다. 예시적으로, 카테터 팁은 EC-SEAL 접합체가 전달되고 있는 동안 고정되어 유지될 수 있거나, 카테터 팁은 EC-SEAL 접합체가 전달되고 있는 동안 움직일 수 있다 (예를 들어, 초기에 폐색에 대해 원위인 위치로부터 근위 방향으로, 폐색으로 또는 그를 통해, 또는 폐색에 대해 근위인 위치로).
상기 지시된 바와 같이, EC-SEAL 접합체는 혈관 중재술, 예를 들어, 경피 관상동맥 중재술 이전의 시간에 환자의 혈관 내로 직접 투여될 수 있다. 예를 들어, EC-SEAL 접합체의 전달은 혈관 중재술 직전에 (예를 들어, 혈관 중재술 이전에 약 1시간 내에, 예컨대 약 30분 내에, 약 15분 내에, 및/또는 약 5분 내에) 수행될 수 있다. 임의로, 표적 혈관으로 직접 EC-SEAL 접합체의 전달은 혈관 중재 시술의 전부 또는 일부 동안 및/또는 이러한 시술의 완료에 후속하여 연속될 수 있거나, 표적 혈관으로 직접 EC-SEAL 접합체의 전달은 혈관 중재 시술의 시작 이전에 중단되고, 이어서 재-시작되지 않을 수 있다. 본원에 기재된 임의의 실시양태에서, EC-SEAL 접합체의 전달은 연속적일 수 있거나, 이는 단일 또는 다중 투여를 통해 실행될 수 있다. EC-SEAL 접합체가 표적 혈관에 투여되기 이전에, 동안, 또는 후에, 동일한 EC-SEAL 접합체 또는 1종 이상의 상이한 EC-SEAL 접합체가 투여될 수 있다.
본원에 기재된 임의의 실시양태에서, EC-SEAL 접합체는 단독으로 또는 적합한 제약 담체 또는 희석제와 조합으로 투여될 수 있다. EC-SEAL 접합체 제제에 사용되는 희석제 또는 담체 성분은 이들이 EC-SEAL 접합체의 바람직한 효과를 감소시키지 않도록 선택될 수 있다. EC-SEAL 접합체 제제는 임의의 적합한 형태일 수 있다. 적합한 투여 형태의 예로는 EC-SEAL 접합체의 수용액, 예를 들어, 등장성 염수, 5% 글루코스 또는 다른 널리 공지된 제약상 허용되는 액체 담체, 예컨대 알콜, 글리콜, 에스테르 및 아미드 중의 용액을 들 수 있다.
EC-SEAL 접합체의 적합한 투여량은 표준 방법에 의해, 예를 들어 실험 동물 모델에서 또는 임상 시험에서 용량-반응 곡선을 확립함으로써 결정될 수 있다. 예시적으로, (단일 볼루스로 또는 시간 경과에 따라 투여되는) EC-SEAL 접합체의 적합한 투여량으로는 1 ng/kg 내지 약 10 mg/kg, 100 ng/kg 내지 약 1 mg/kg, 약 1 μg/kg 내지 약 500 μg/kg, 또는 약 100 μg/kg 내지 약 400 μg/kg을 들 수 있다. 각각의 이들 실시양태에서, 용량/kg은 환자 질량 또는 체중의 킬로그램 당 용량을 지칭한다. 다른 예시적인 측면에서, 유효 용량은 용량 당 약 0.01 μg 내지 약 1000 mg, 용량 당 1 μg 내지 약 100 mg, 또는 용량 당 약 100 μg 내지 약 50 mg, 또는 용량 당 약 500 μg 내지 약 10 mg 또는 용량 당 약 1 mg 내지 10 mg, 또는 용량 당 약 1 내지 약 100 mg, 또는 용량 당 약 1 mg 내지 5000 mg, 또는 용량 당 약 1 mg 내지 3000 mg, 또는 용량 당 약 100 mg 내지 3000 mg, 또는 용량 당 약 1000 mg 내지 3000 mg 범위일 수 있다.
혈관 중재술, 예컨대 경피 관상동맥 중재술은 EC-SEAL 접합체 이전에, 동안, 또는 후에 임의의 통상적인 절차에 의해 수행될 수 있다. 본 개시내용의 방법과 함께 사용하기 위해 고려되는 혈관 중재 시술의 예로는 스텐팅, 죽종절제술, 및 혈관성형술, 예컨대 풍선 혈관성형술을 들 수 있다. 혈관 중재 시술은 혈관을 일시적으로 폐색시키는 것을 포함하는 것 (예를 들어, 풍선 혈관성형술)일 수 있거나, 이는 혈관을 일시적으로 폐색시키는 것을 포함하지 않는 것 (예를 들어, 비-풍선 혈관성형 시술, 풍선 혈관성형술을 포함하지 않는 스텐팅 시술 등)일 수 있다. 예시적인 전달 방식으로는 카테터, 비경구 투여, 풍선 상의 코팅, 다공성 풍선을 통해, 코팅된 스텐트, 및 이들의 임의의 조합 또는 임의의 다른 공지된 혈관 중재 시술 동안 약물의 전달 방법을 들 수 있다.
또한, 본원에 기재된 임의의 제제는 카테터-기반 장치의 존재 또는 부재 하에서 EC-SEAL 접합체 (예를 들어, 1종 이상의 유형)을 투여하는 데 사용될 수 있음이 고려된다. EC-SEAL 접합체는 부형제 중에서 제제화될 수 있다. 본원에 기재된 임의의 실시양태에서, 부형제는 약 0.4 mg/ml 내지 약 6 mg/ml 범위의 농도를 가질 수 있다. 다양한 실시양태에서, 부형제의 농도는 약 0.5 mg/ml 내지 약 10 mg/ml, 약 0.1 mg/ml 내지 약 6 mg/ml, 약 0.5 mg/ml 내지 약 3 mg/ml, 약 1 mg/ml 내지 약 3 mg/ml, 약 0.01 mg/ml 내지 약 10 mg/ml, 및 약 2 mg/ml 내지 약 4 mg/ml 범위일 수 있다.
EC-SEAL 접합체의 투여량은 환자 상태, 치료되는 질환 상태, 투여 경로 및 조직 분포, 및 다른 치료적 치료의 공동-사용의 가능성에 따라 유의하게 달라질 수 있다. 환자에게 투여되는 유효량은 신체 표면적, 환자 중량 또는 질량, 및 환자 상태의 의사 평가에 기초한다. 다양한 예시적인 실시양태에서, 유효 용량은 약 1 ng/kg 내지 약 10 mg/kg, 100 ng/kg 내지 약 1 mg/kg, from 약 1 μg/kg 내지 약 500 μg/kg, 또는 약 100 μg/kg 내지 약 400 μg/kg 범위일 수 있다. 각각의 이들 실시양태에서, 용량/kg은 환자 질량 또는 체중의 킬로그램 당 용량을 지칭한다. 다른 예시적인 측면에서, 유효 용량은 용량 당 약 0.01 μg 내지 약 1000 mg, 용량 당 1 μg 내지 약 100 mg, 또는 용량 당 약 100 μg 내지 약 50 mg, 또는 용량 당 약 500 μg 내지 약 10 mg 또는 용량 당 약 1 mg 내지 10 mg, 또는 용량 당 약 1 내지 약 100 mg, 또는 용량 당 약 1 mg 내지 5000 mg, 또는 용량 당 약 1 mg 내지 3000 mg, 또는 용량 당 약 100 mg 내지 3000 mg, 또는 용량 당 약 1000 mg 내지 3000 mg 범위일 수 있다. 본원에 기재된 임의의 다양한 실시양태에서, 유효 용량은 용량 당 약 0.01 μg 내지 약 1000 mg, 용량 당 1 μg 내지 약 100 mg, 용량 당 약 100 μg 내지 약 1.0 mg, 약 50 μg 내지 약 600 μg, 약 50 μg 내지 약 700 μg, 약 100 μg 내지 약 200 μg, 약 100 μg 내지 약 600 μg, 약 100 μg 내지 약 500 μg, 약 200 μg 내지 약 600 μg, 또는 약 100 μg 내지 약 50 mg, 또는 용량 당 약 500 μg 내지 약 10 mg 또는 용량 당 약 1 mg 내지 10 mg 범위일 수 있다. 다른 예시적인 실시양태에서, 유효 용량은 1 μg, 10 μg, 25 μg, 50 μg, 75 μg, 100 μg, 125 μg, 150 μg, 200 μg, 250 μg, 275 μg, 300 μg, 350 μg, 400 μg, 450 μg, 500 μg, 550 μg, 575 μg, 600 μg, 625 μg, 650 μg, 675 μg, 700 μg, 800 μg, 900 μg, 1.0 mg, 1.5 mg, 2.0 mg, 10 mg, 100 mg, 또는 100 mg 내지 30 g일 수 있다.
EC-SEAL 접합체를 투여하기 위한 임의의 유효 처방이 사용될 수 있다. 예를 들어, EC-SEAL 접합체는 단일 용량으로서, 또는 다중-용량 매일 처방으로서 투여될 수 있다. 또한, 시차 처방, 예를 들어, 주 당 1 내지 5일이 매일 치료에 대한 대안으로서 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 1종 이상의 유형의 EC-SEAL 접합체와 조합된 콜라겐 결합 펩티도글리칸 (예를 들어, US 2013/0190246에 기재된 DS-SILY 접합체)을 포함하는 혼합된 미셀이 또한 제제화될 수 있다. DS-SILY 및 EC-SEAL 접합체는 둘 다 알킬 꼬리를 가지며, 따라서 DS-SILY-꼬리:EC-SEAL-꼬리 (예를 들어, 1:1)를 조합함으로써, 혼합된 미셀은 내피에, 또는 노출된 ICAM, VCAM, 셀렉틴, 및/또는 콜라겐에 결합하도록 생성된다. 알킬 꼬리 구조는 미셀 형성을 위해 및 시간 경과에 따른 미셀의 해리를 위해 최적화될 수 있다.
본원에 기재된 다양한 실시양태에서, 환자는 EC-SEAL 접합체의 다중 주사로 치료된다. 한 실시양태에서, 환자는 EC-SEAL 접합체로 다수회 (예를 들어, 약 2회 내지 약 50회), 예를 들어, 12 내지 72시간 간격으로 또는 48 내지 72시간 간격으로 주사된다. EC-SEAL 접합체의 추가의 주사는 초기 주사(들) 후 수일 또는 수개월의 간격으로 환자에게 투여될 수 있다.
본원에 기재된 임의의 실시양태에서, 펩티드 부분, 글리칸 부분, 또는 둘 다에서 상이한 2종 이상의 EC-SEAL 접합체의 조합물이 단일 EC-SEAL 접합체 대신 사용될 수 있음이 이해되어야 한다.
또한, 상기 실시양태에서, 화합물, 조성물 및 방법의 특정 측면은 목록의 대안, 예컨대, 예시적으로 임의의 1종 이상의 GAG 및 펩티드에 대한 선택에서 제시됨이 인식된다. 따라서, 본 개시내용의 다양한 대안적인 실시양태는 그들 목록의 개별적 구성원, 뿐만 아니라 그들 목록의 다양한 하위집합을 포함함이 이해되어야 한다. 각각의 그들 조합은 목록의 방식에 의해 본원에 기재된 것으로 이해되어야 한다.
EC-SEAL 접합체는 제제화 전에, 동안 및/또는 후에 멸균될 수 있다. 본원에 사용된 "멸균" 또는 "멸균하다" 또는 "멸균된"은 내독소 및 감염성 제제를 포함하나 이에 제한되지 않는 원하지 않는 오염물을 제거함으로써 EC-SEAL 접합체를 소독하는 것을 의미한다.
다양한 예시적인 실시양태에서, EC-SEAL 접합체는 프로필렌 옥시드 또는 에틸렌 옥시드 처리, 기체 플라즈마 멸균, 감마 방사선, 전자 빔, 및/또는 과산, 예컨대 과아세트산으로의 멸균을 비롯한 통상적인 멸균 기술을 사용하여 소독될 및/또는 멸균될 수 있다. EC-SEAL 접합체의 구조 및 생물속성적 특성에 악영향을 미치지 않는 멸균 기술이 사용될 수 있다. 예시적인 멸균 기술로는 EC-SEAL 접합체를 과아세트산에 노출시키는 것, 1 내지 4 Mrad 감마선 조사 (또는 1 내지 2.5 Mrad의 감마선 조사), 에틸렌 옥시드 처리, 멸균 여과, 또는 기체 플라즈마 멸균을 들 수 있다. 한 실시양태에서, EC-SEAL 접합체는 하나 이상의 멸균 공정으로 처리될 수 있다. 예를 들어, EC-SEAL 접합체는 멸균 여과로 처리될 수 있다. EC-SEAL 접합체는 플라스틱 랩 또는 호일 랩에 포장될 수 있고, 이러한 용기에 정치시킨 후 추가로 멸균될 수 있는 임의의 유형의 용기 내로 분배될 수 있다.
EC-SEAL 접합체는 미네랄, 아미노산, 당, 펩티드, 단백질, 비타민 (예컨대 아스코르브산), 라미닌, 콜라겐, 피브로넥틴, 히알루론산, 피브린, 엘라스틴, 아그레칸, 성장 인자 (예컨대 표피 성장 인자, 혈소판-유래된 성장 인자, 전환 성장 인자 베타, 또는 섬유모세포 성장 인자), 글루코코르티코이드, 예컨대 덱사메타손, 점탄성 변경제, 예컨대 이온성 및 비-이온성 수용성 중합체; 아크릴산 중합체; 친수성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 옥시드, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체, 및 폴리비닐알콜; 셀룰로스성 중합체 및 셀룰로스성 중합체 유도체, 예컨대 히드록시프로필 셀룰로스, 히드록시에틸 셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스 프탈레이트, 메틸 셀룰로스, 카르복시메틸 셀룰로스, 및 에테르화된 셀룰로스; 폴리(락트산), 폴리(글리콜산), 락트산 및 글리콜산의 공중합체, 또는 다른 천연 및 합성 둘 다의 중합체성 제제와 조합될 수 있다.
키트
EC-SEAL 접합체는 1종 이상의 유형의 키트에 제공될 수 있다. 키트는 하나 이상의 용기를 갖는 패키징을 포함할 수 있으며, 그의 적어도 하나는 EC-SEAL 접합체를 함유한다. 키트는 또한 키트의 성분의 사용을 위한 지침서를 함유할 수 있다. 한 실시양태에서, 키트는 1종 이상의 EC-SEAL 접합체를 보유하는 하나 이상의 통, 바이알, 또는 용기를 포함한다. 키트는 또한 임의의 하기 성분을 포함할 수 있다: EC-SEAL 접합체의 1종 이상의 제제 또는 농축물 (투여량), 완충제, 멸균제 또는 소독제, 주사기, 바늘, 단백질 또는 다당류, 및/또는 키트 시약을 사용하는 방법을 기재한 지침 자료. 임의의 이들 실시양태에서, 키트는 카테터, 스텐트, 풍선, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 성분을 함유할 수 있다. EC-SEAL 접합체는 예를 들어, 완충제 중 또는 물 중에서 동결건조될 수 있다.
본원에 기재된 임의의 실시양태에서, 혈관 중재술을 수행하기 위한 키트, 예컨대 상기 기재된 키트가 고려된다. 키트는 카테터 또는 스텐트 및 1종 이상의 EC-SEAL 접합체를 포함할 수 있다. EC-SEAL 접합체는 상기 논의된 임의의 제제에 및 단일 혈관 중재술을 수행하는 데 필요한 양으로, 예컨대 1 ng/kg 내지 약 10 mg/kg, 100 ng/kg 내지 약 1 mg/kg, 약 1 μg/kg 내지 약 500 μg/kg, 또는 약 100 μg/kg 내지 약 400 μg/kg으로 제공될 수 있다. 각각의 이들 실시양태에서, 용량/kg은 환자 질량 또는 체중의 킬로그램 당 용량을 지칭한다. 본원에 기재된 다양한 실시양태에서, 제제에 제공되는 유효 용량은 용량 당 약 0.01 μg 내지 약 1000 mg, 용량 당 1 μg 내지 약 100 mg, 또는 용량 당 약 100 μg 내지 약 50 mg, 또는 용량 당 약 500 μg 내지 약 10 mg 또는 용량 당 약 1 mg 내지 10 mg, 또는 용량 당 약 1 내지 약 100 mg, 또는 용량 당 약 1 mg 내지 5000 mg, 또는 용량 당 약 1 mg 내지 3000 mg, 또는 용량 당 약 100 mg 내지 3000 mg, 또는 용량 당 약 1000 mg 내지 3000 mg 범위일 수 있다.
제조품은 또한 임의의 이들 실시양태에 대해 고려된다. 본원에 기재된 임의의 키트 또는 제조품 실시양태에서, 키트 또는 제조품은 EC-SEAL 접합체의 용량 또는 다중 용량을 포함할 수 있다. EC-SEAL 접합체는 1차 용기, 예를 들어, 유리 바이알, 예컨대 고무 스토퍼 및/또는 알루미늄 절취 제거 씰을 갖는 앰버 유리 바이알에 있을 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 1차 용기는 플라스틱 또는 알루미늄일 수 있으며, 1차 용기는 밀봉될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 1차 용기는 조성물을 광으로부터 추가로 보호하기 위한 2차 용기 내에 함유될 수 있다.
본원에 기재된 임의의 실시양태에서, 키트 또는 제조품은 사용을 위한 지침서를 함유할 수 있다. 다른 적합한 키트 또는 제조품 성분으로는 부형제, 붕괴제, 결합제, 염, 국소 마취제 (예를 들어, 리도카인), 희석제, 보존제, 킬레이트화제, 완충제, 강장제, 소독제, 습윤화제, 유화제, 분산제, 안정화제 등을 들 수 있다. 이들 성분은 별개로 또는 EC-SEAL 접합체와 혼합하여 이용가능할 수 있다. 본원에 기재된 임의의 조성물 실시양태는 키트 또는 제조품을 제제화하는 데 사용될 수 있다.
본원에 기재된 다양한 실시양태에서, 키트는 하나 초과의 카테터 또는 스텐트, 및 각각 EC-SEAL 접합체 제제를 단일 또는 다중 혈관 중재술을 수행하는 데 필요한 양으로 함유하는 복수의 별개의 용기를 함유할 수 있다. 예를 들어, 확장 카테터, 오버-더-와이어 혈관성형술 풍선 카테터, 주입 카테터, 급속 교환 또는 모노레일 카테터 등을 비롯한 임의의 유형의 스텐트 또는 카테터는 키트와 함께 포함될 수 있다.
이하는 대안적인 실시양태이다.
1. 펩티드 리간드, 글리코사미노글리칸, 및 임의적 알킬 꼬리를 포함하는 EC-SEAL 접합체.
2. 하기 화학식의 구조를 포함하는 진술 1의 EC-SEAL 접합체:
a. 알킬-GAG(P)n.
b. 상기 식에서: 알킬은 C2-18 알킬 쇄이고;
1. GAG는 글리코사미노글리칸, 예컨대 알기네이트, 아가로스, 덱스트란, 덱스트란 술페이트, 콘드로이틴, 콘드로이틴 술페이트, 더마탄, 더마탄 술페이트, 헤파린, 헤파란 술페이트, 케라틴, 케라탄 술페이트, 히알루로난, 또는 이들의 조합이고;
2. P는 셀렉틴, 및 ICAM 또는 VCAM에 결합할 수 있는 5개 내지 약 40개의 아미노산의 펩티드이고;
3. n은 3 내지 50의 정수이다.
3. 글리코사미노글리칸 (예를 들어, GAG 기)이 헤파린, 콘드로이틴 술페이트 및 헤파란 술페이트인 진술 1 또는 2의 EC-SEAL 접합체.
4. EC-SEAL 접합체가 내피 세포에 결합하는 것인 임의의 진술 1 내지 3의 EC-SEAL 접합체.
5. EC-SEAL 접합체가 포유동물의 혈관 중의 내피 조직에 결합하는 것인 임의의 진술 1 내지 4의 EC-SEAL 접합체.
6. EC-SEAL 접합체가 혈소판 활성화를 억제하고, 포유동물 혈관에의 혈소판 결합을 억제하고, 내막 과다형성, 포유동물 혈관에서의 염증을 억제하고, 혈전증을 억제하고, 혈관연축을 억제하고, 내피 세포 증식을 자극하고, 포유동물 혈관 중의 노출된 셀렉틴, ICAM, VCAM, 또는 이들의 조합에 결합하는 것인 임의의 진술 1 내지 5의 EC-SEAL 접합체.
7. EC-SEAL 접합체가 용혈 환자에서의 동정맥 누공 부전의 발생을 억제하거나 감소시키는 것인 임의의 진술 1 내지 6의 EC-SEAL 접합체.
8. EC-SEAL 접합체가 C3-16 알킬 쇄, 또는 C4-15 알킬 쇄, 또는 C5-14 알킬 쇄, 또는 C3-12 알킬 쇄인 알킬 꼬리 (예를 들어, 알킬 기)를 갖는 것인 임의의 진술 1 내지 7의 EC-SEAL 접합체.
9. 글리코사미노글리칸 (예를 들어, GAG 기)이 더마탄 술페이트, 덱스트란, 히알루로난, 헤파린 또는 이들의 조합인 임의의 진술 1 내지 8의 EC-SEAL 접합체.
10. 글리코사미노글리칸 (예를 들어, GAG 기)이 더마탄 술페이트인 임의의 진술 1 내지 9의 EC-SEAL 접합체.
11. 펩티드 리간드 (예를 들어, P 기)가 5개 내지 약 35개의 아미노산의 펩티드, 또는 5개 내지 약 30개의 아미노산의 펩티드, 또는 5개 내지 약 25개의 아미노산의 펩티드인 임의의 진술 1 내지 10의 EC-SEAL 접합체.
12. 펩티드 리간드가 임의의 IELLQAR (서열식별번호: 1); IELLQARGSC (서열식별번호: 2); IDLMQAR (서열식별번호: 3); IDLMQARGSC (서열식별번호: 4); QITWAQLWNMMK (서열식별번호: 5); QITWAQLWNMMKGSC (서열식별번호: 6), NAFKILVVITFGEK (서열식별번호: 7); NAFKILVVITFGEKGSC (서열식별번호: 8); ITDGEA (서열식별번호: 9); ITDGEAGSC (서열식별번호: 10); DGEATD (서열식별번호: 11); 또는 DGEATDGSC (서열식별번호: 12)에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩티드인 임의의 진술 1 내지 11의 EC-SEAL 접합체.
13. 펩티드 리간드가 임의의 IELLQAR (서열식별번호: 1); IELLQARGSC (서열식별번호: 2); IDLMQAR (서열식별번호: 3); IDLMQARGSC (서열식별번호: 4); QITWAQLWNMMK (서열식별번호: 5); QITWAQLWNMMKGSC (서열식별번호: 6), NAFKILVVITFGEK (서열식별번호: 7); NAFKILVVITFGEKGSC (서열식별번호: 8); ITDGEA (서열식별번호: 9); ITDGEAGSC (서열식별번호: 10); DGEATD (서열식별번호: 11); 또는 DGEATDGSC (서열식별번호: 12)에 대해 적어도 80%, 또는 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 펩티드인 임의의 진술 1 내지 12의 EC-SEAL 접합체.
14. 펩티드 리간드가 가교제를 통해 글리코사미노글리칸에 연결된 것인 임의의 진술 1 내지 13의 EC-SEAL 접합체.
15. 임의의 진술 1 내지 14의 EC-SEAL 접합체를 포함하는 조성물.
16. 부형제 또는 담체를 포함하는 진술 15의 조성물.
17. 제약상 허용되는 부형제 또는 담체를 포함하는 진술 15 또는 16의 조성물.
18. 비경구, 혈관내, 정맥내, 동맥내, 근육내, 피부, 피하, 경피, 진피내, 및/또는 표피내 투여용으로 제제화된 임의의 진술 15 내지 17의 조성물.
19. 바늘 또는 주입용 장치를 사용하여 비경구 투여용으로 제제화된 임의의 진술 15 내지 18의 조성물.
20. 카테터를 통해, 풍선 상의 코팅으로서, 다공성 풍선을 통해, 또는 스텐트 상의 코팅으로서 포유동물에의 투여용으로 제제화된 임의의 진술 15 내지 19의 조성물.
21. 임의의 진술 1 내지 14의 EC-SEAL 접합체, 또는 임의의 진술 15 내지 20의 조성물을 혈관 중재술 동안 또는 후에 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 혈관 중재술을 위한 방법.
22. EC-SEAL 접합체가 포유동물의 혈관 중의 내피 조직에 결합하는 것인 진술 21의 방법.
23. EC-SEAL 접합체가 내피 기능장애를 개선시키는 것인 진술 21 또는 22의 방법.
24. EC-SEAL 접합체가 혈소판 활성화를 억제하고, 포유동물 혈관에의 혈소판 결합을 억제하고, 내막 과다형성, 포유동물 혈관에서의 염증을 억제하고, 혈전증을 억제하고, 혈관연축을 억제하고, 내피 세포 증식을 자극하고, 포유동물 혈관에서 노출된 셀렉틴, ICAM, VCAM, 또는 이들의 조합에 결합하는 것인 임의의 진술 21 내지 23의 방법.
25. EC-SEAL 접합체가 용혈 환자에서의 동정맥 누공 부전의 발생을 억제하거나 감소시키는 것인 임의의 진술 21 내지 24의 방법.
26. 임의의 진술 1 내지 14의 EC-SEAL 접합체, 또는 임의의 진술 15 내지 20의 조성물, 및 EC-SEAL 접합체 또는 조성물을 사용하기 위한 지침서를 포함하는 키트.
27. 완충제, 멸균제 또는 소독제, 주사기, 바늘, 단백질 또는 다당류, 카테터, 스텐트, 풍선, 및 이들의 조합을 추가로 포함하는 진술 26의 키트.
하기 비-제한적 실시예는 본 개시내용의 측면의 개발을 예시한다.
실시예
실시예
1:
셀렉틴
및
ICAM
결합 펩티드 접합체
3종의 셀렉틴-결합 펩티드 및 3종의 ICAM-결합 펩티드를 EC-SEAL 분자의 개발을 위해 선택하였다. 펩티드의 선택은 하기 기준에 기초하였다:
1) 친수성, 이는 접합체 분자를 합성하고, 최종 생성물이 혈액을 비롯한 수용액에 가용성인 것을 보장하기 위해 사용되는 커플링 화학을 용이하게 할 수 있음;
2) 관능화된 글리코사미노글리칸에 커플링하는 시스테인 티올의 이용률; 및
3) 1차 표적에 대한 상대적 결합 친화도.
표 2에서의 펩티드를 EC-SEAL 분자의 조사 및 잠재적 개발을 위해 선택하였다.
<표 2>
셀렉틴 및 ICAM 표적화 펩티드 서열
* 아미노산 GSC는 접합을 위해 각각의 펩티드의 C-말단에 첨가될 것이다.
# 펩티드는 E-셀렉틴 및 S-셀렉틴 둘 다에 결합한다.
실시예
2:
셀렉틴
-결합
EC
-
SEAL은
내피 세포에
결합한다
이 실시예는 더마탄 술페이트에 접합된 셀렉틴에 결합하는 펩티드를 포함하는 1세대 EC-SEAL 분자를 기재할 뿐만 아니라, 내피 세포에의 이 EC-SEAL 분자의 결합을 예시한다.
방법
펩티도글리칸 합성: 더마탄 술페이트 (DS)를 산화의 정도가 메타과아이오드산나트륨의 양을 다양화시킴으로써 제어된 과아이오드산염 산화에 의해 산화시켰다. 실온에서 2시간 동안 광으로부터 보호하여 산화시킨 후, 산화된 더마탄 술페이트를 바이오-겔 (Bio-gel) P-6 (바이오래드 (BioRad))으로 패킹된 컬럼을 사용한 크기 배제 크로마토그래피에 의해 1xPBS pH 7.2 내로 탈염하였다. 헤테로이관능성 가교제 3-말레이미도프로피온산 히드라지드 (BMPH)를 산화된 더마탄 술페이트에 더마탄 술페이트의 양에 비해 30배 몰 과량으로 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 광으로부터 보호하면서 반응시켰다. 그 후, 중간체 더마탄 술페이트-가교제 생성물을 바이오-겔 P-6 컬럼 및 구동 완충제로서 1xPBS pH 7.2를 사용한 크기 배제 크로마토그래피에 의해 과량의 가교제를 정제하였다. 더마탄 술페이트에 부착된 가교제의 수를 가교제 농도 대 흡수의 표준 곡선의 사용으로 분광분석적으로 측정된, 215 nm 가교제 피크 면적으로부터 측정된 가교제의 소비에 의해 계산하였다.
유리 펩티드 IELLQARGC (서열식별번호: 105; 때로 QAR로 지칭됨)를 디메틸포름아미드 (DMF)에 10 mg/mL의 농도로 용해시키고, 부착된 가교제의 수에 대해 1몰 과량으로 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 최종 생성물 DS-QARn을 구동 완충제로서 밀리포어 (Millipore) 물을 갖는 바이오-겔 P-6 컬럼을 사용한 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 최종 생성물을 즉시 동결하고, 동결건조시키고, 추가의 시험까지 -20℃에서 저장하였다.
펩티도글리칸의 비오틴 표지된 형태를 또한 DS-BMPH의 몰 당 QAR비오틴 1몰을 1시간 동안 반응시킨 후, 비표지된 QAR을 첨가하여 반응을 완료시키고, DS-QARn -비오틴을 형성함으로써 합성하였다.
세포 배양: 인간 대동맥 내피 세포 (HAEC) (인비트로젠 (Invitrogen))를 성장 배지 (저 혈청 성장 보충제로 보충된 배지 200; 인비트로젠)에서 배양하였다. 계대 3 내지 5로부터의 세포를 모든 실험에 사용하였다. 달리 언급되지 않는다면 성장 배지를 모든 실험에 사용하였다.
HAEC에의 DS - QAR의 결합: HAEC를 이비디 (Ibidi) 혈관신생 μ-슬라이드 (이비디) 상으로 성장 배지에 1x105 세포/cm2로 시딩하고, 24시간 동안 부착시켰다. 성장 배지를 흡인하고, 세포를 1 ng/mL 종양 괴사 인자-α (TNF-α)를 함유하는 성장 배지에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. TNF-α-자극된 배지를 흡인하고, 150 mM 염화칼슘을 갖는 트리스 완충된 염수 (TBS) 중 50 μM EC-SEAL20 -비오틴을 각각의 웰에 첨가하였다. 세포를 37℃에서 15분 동안 인큐베이션하고, TBS로 3회 세정하였다. 그 후, 세포를 TBS 중 1% BSA로 실온에서 30분 동안 차단하였다. 세포 핵을 1 μg/mL 시톡스 (SYTOX) 그린 (인비트로젠)을 사용하여 10분 동안 염색하였다. 플레이트를 1% BSA를 함유하는 TBS로 3회 세정하였다. EC-SEAL20 -비오틴을 스트렙타비딘-딜라이트 (Dylight) 633 (써모 사이언티픽 (Thermo Scientific))을 사용하여 검출하였다. 플레이트를 1% BSA bef를 함유하는 TBS로 3회 세정하였다. 세포를 60x 대물렌즈를 갖는 올림푸스 (Olympus) FV1000 공초점 현미경을 사용하여 가시화하였다. TNF-α 자극이 결여된 세포를 대조군으로서 사용하였다.
결과
산화된 더마탄 술페이트 (DS, MW 60KDa)를 각각의 더마탄 술페이트 분자에 대해 평균 20개의 셀렉틴-결합 펩티드 (각각 서열 IELLQAR을 가짐, 서열식별번호: 106)의 부착을 위한 스캐폴드로서 사용하였다. 이러한 구축물은 시험된 1세대 EC-SEAL 분자였다.
이 1세대 EC-SEAL 분자의 결합을 평가하기 위해, 인간 대동맥 내피 세포를 5 ng/ml TNFα에 4시간 동안 노출시켜 염증 및 E- 및 P-셀렉틴의 상향조절을 유도한 후, 세포를 2 mg/ml 비오틴-EC-SEAL로 1시간 동안 처리하였다. 대조군으로서, 일부 인간 관상동맥 내피 세포를 동등 부피의 PBS에 4시간 동안 노출시킨 후, 2 mg/ml 비오틴-EC-SEAL로 1시간 동안 처리하였다. 이러한 처리 후, 세포를 세정하고, 고정하고, 아비딘-알렉사플루오르로 프로빙하였다.
도 1A는 결합된 EC-SEAL 분자 (적색으로, 황색 화살표는 일부 세포 주위의 EC-SEAL을 지적함)를 갖는 TNFα 자극된 내피 세포 (핵-그린)의 영상을 나타낸다. 도 1B는 EC-SEAL로 처리된 PBS 자극된 내피 세포의 영상을 나타내며, 이는 염증 및 E-셀렉틴 및 P-셀렉틴의 상향조절이 유도되지 않은 경우 EC-SEAL 분자가 거의 또는 전혀 결합되지 않음을 나타낸다.
따라서, 1세대 EC-SEAL은 이들 인간 대동맥 세포에는 결합하였지만, TNF-α의 부재 하에서 배양된 내피 세포에는 결합하지 않았다 (도 1).
실시예
3: 펩티드 대 글리코사미노글리칸
스캐폴드의
최적 비율
이 실시예는 펩티드 리간드 대 글리코사미노글리칸 (GAG) 스캐폴드 분자의 최적 비율을 평가하는 데 사용될 수 있는 실험을 기재한다.
펩티드 동일성 및 GAG 당 최적 펩티드 비율을 측정하기 위해, 골격 당 펩티드의 수를 먼저 조사한 후, 셀렉틴- 대 ICAM-결합 펩티드의 상이한 비율을 평가한다.
상이한 접합체 분자를 접합체에 대한 골격으로서 더마탄 술페이트를 사용하여 각각의 셀렉틴-결합 펩티드 및 각각의 ICAM-결합 펩티드에 대해 생성한다. 접합체 분자를 더마탄 술페이트 골격 및 단지 하나의 유형의 셀렉틴-결합 펩티드 또는 단지 하나의 유형의 ICAM-결합 펩티드의 골격 당 10, 15, 20, 또는 30개의 펩티드로 제조하였다. 각각의 분자는 또한 문헌 [Paderi et al., Biomaterials 32:2516-23 (2011)]에 의해 기재된 바와 같이 분자의 존재를 모니터링하기 위한 비오틴 태그로 표지된 평균 1개의 펩티드를 함유할 것이다.
HUVEC 세포를 TNF-α-활성화된 및 비활성화된 내피 세포 상의 커버리지의 정도를 평가하는 데 사용할 수 있다. TNF-α는 E-셀렉틴 및 ICAM 합성을 활성화한다 (Sakhalkar et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. 100:15895-900 (2003)). TNF-α-활성화된 및 비활성화된 내피 세포를 별개로 선택된 펩티드 접합체와 혼합한다. 세포 커버리지의 정도를 4시간에서, 및 그 후 7일 동안 매일, 활성화된 내피 세포에 결합하지만, 비활성화된 내피 세포에는 결합하지 않는 접합체에 대해 모니터링한다. 배지는 연속된 TNF-α 자극으로 격일로 변경될 것이다. 펩티드 접합체에 의한 세포의 커버리지는 2가지 방식으로 평가할 수 있다. 먼저, 세포 커버리지는 형광 아비딘으로 염색함으로써 평가할 수 있다. 둘째로, 세포, 예컨대 활성화된 내피에 정상적으로 결합할 것인 HL60 세포의 결합을 평가할 수 있다 (Fukuda et al., Cancer Res 60:450-6 (2000)). 내피 세포 배양물을 백혈구 세포주 HL60으로 챌린지할 수 있고, 활성화된 내피에의 HL60 결합의 억제를 평가할 수 있다. 시토카인 분비는 문헌 [Scott et al., PloS one 8:e82456 (2013)]에 의해 기재된 바와 같이 메소 스케일 디스커버리 (Meso Scale Discovery) (MSD)를 사용하여 평가할 수 있다. 감소된 시토카인 분비는 감소된 염증을 지시한다 (Butterfield et al., Biochemistry 49:1549-55 (2010)).
하기 EC-SEAL 접합체 (펩티드 접합체)를 합성하고, 상기 기재된 바와 같이 시험하였다.
* 각각의 펩티드는 DS에의 접합을 위해 GC를 포함하였다.
상기 표에서, DS는 더마탄 술페이트를 나타내고, IDL (IDLMQARGC (서열식별번호: 107)), IEL (IELLQARGC (서열식별번호: 108)) 및 QIT (QITWAQLWMMKGC (서열식별번호: 109))는 셀렉틴-결합 펩티드이고, ITD (ITDGEAGC 서열식별번호: 114) 및 DGE (DGEATDGC (서열식별번호: 110))는 세포내 부착 분자 (ICAM)-결합 펩티드이다. 각각의 분자는 표지 목적으로 평균적으로 1개의 비오티닐화된 펩티드를 함유한다.
내피 세포 (EC)에 대한 각각의 EC-SEAL 접합체의 상대적 결합 친화도를 측정하기 위해, EC를 시딩하여 96-웰 플레이트에서 단층을 형성하였다. 그 후, 배양물을 세포 배양 배지에서 5 ng/mL 종양 괴사 인자-α (TNF-α)로 4시간 동안 자극시켰다. 배지의 제거 후, 세포를 1시간 동안 150 mM 염화칼슘을 갖는 트리스 완충된 염수 (TBS) ('대조군') 또는 150 mM 염화칼슘을 갖는 TBS 중 EC-SEAL의 각각의 변이체 30 μM ('ABC-##')로 처리하였다. 처리를 제거하고, 세포를 세정하고, 스트렙타비딘-HRP (TBS 중 1% 소 혈청 알부민 (BSA) 중 1:200)를 각각의 웰에 첨가하고, 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 세정 후, 색 시약의 기질 용액을 각각의 웰에 첨가하고 (1:1 과산화수소 : 테트라메틸벤지딘), 다시 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 최종 반응을 2N 황산 (H2SO4)을 사용하여 중지시키고, 흡광도를 M5 플레이트 리더 (Plate Reader) 상에서 450 nm 및 540 nm에서 판독하였다.
도 2 및 3은 상기 기재된 바와 같은 EC-SEAL 접합체에 대한 내피 세포-결합 실험 결과를 나타낸다. 이들 결과는 EC-SEAL 접합체가 실제로 EC에 결합하고 있으며, 각각의 펩티드 군 (및 각각의 펩티드 군 내의 변이체)은 TNF-α 자극된 세포에 대해 다양한 결합 친화도를 가짐을 지시한다. 구체적으로, IEL (셀렉틴-결합) 및 DGE (ICAM-결합)는 최상의 결합을 나타내는 것으로 나타난 반면, QIT (셀렉틴-결합)는 최하를 갖는 것으로 나타난다. 또한, DS 분자 당 30개의 펩티드로의 처리는 모든 펩티드 군에서 결합 친화도를 감소시킨 경향이 있음이 주목된다.
셀렉틴 및 ICAM 수용체 둘 다를 표적화하는 것은 결합 친화도를 증가시킬 것으로 고려되었으며, 따라서 셀렉틴 및 ICAM-결합 펩티드 둘 다를 갖는 EC-SEAL 접합체를 더마탄 술페이트 (DS)를 사용하여 합성하고, 시험하였다. EC-SEAL 접합체는 DS 당 평균 약 10개의 IEL (IELLQARGC (서열식별번호: 108)) 펩티드 및 평균 약 10개의 DGE (DGEATDGC (서열식별번호: 110)) 펩티드를 가졌다. EC-SEAL 접합체 (IEL/DGE-10,10으로 약칭됨)를 단일 수용체-결합 펩티드 EC-SEAL 접합체에 비해 EC에의 결합을 측정하기 위해 시험하였다. 세포 시딩 및 자극을 이전에 기재된 바와 같이 수행하고, 3 μM 처리를 적용하여 상대적 결합 친화도를 측정하였다 (도 4). 이들 결과는 조합된 셀렉틴/ICAM-결합 분자가 실제로 GAG 당 총 약 펩티드 리간드를 갖는 각각의 단일 셀렉틴 또는 ICAM-결합 변이체보다 더 큰 EC에의 결합을 나타냄을 지시한다.
실시예
4:
EC
-
SEAL에
대한 제제 및 전달 방법
이 실시예는 증가된 내피 세포 활성화의 경우 본원에 기재된 EC-SEAL 접합체로 세포 코팅을 용이하게 하는 방법을 기재한다. 생체내에서 서서히 해리하여 추가의 유리 EC-SEAL을 혈관의 내강으로 전달할 것인 EC-SEAL 접합체의 나노입자를 사용할 수 있다.
DS를 지방족 꼬리로 말단-관능화하여 미셀 형성을 유도하는 방법은 하기에 기재된다. 모든 GAG는 손쉬운 접합이 달성될 수 있는 환원 말단을 갖는다. 본 발명자들은 생체내에서 약 48시간에 걸쳐 해리하는 미셀을 개발하기 위해 환원 말단에서의 접합을 이용할 것이다. 이들 미셀은 노출된 내피 조직에 결합하고, 최초 48시간에 걸쳐 추가의 EC-SEAL을 방출하도록 설계된다. 미셀은 추가의 내피 세포 활성화 또는 손실의 경우 새롭게 벗겨진 영역을 코팅하기 위해 및 나중의 시점에서 셀렉틴 및 ICAM을 상향조절하는 내피 세포를 코팅하기 위해 추가의 EC-SEAL을 제공한다.
미셀 합성: 아민 관능성을 DS의 환원 말단에 첨가하기 위해, 본 발명자들이 이전에 수행한 바와 같이 (Butterfield et al., Biochemistry 49:1549-55 (2010)), DS를 중탄산암모늄의 포화 용액에서 실온에서 4 내지 5시간 동안 인큐베이션한 후, 연장 동결건조시켜 미반응된 중탄산암모늄을 제거할 것이다. 관능화 후, 상기 기재된 바와 같이, 소수성 꼬리를 GAG (예를 들어, 더마탄 술페이트)에 접합시킨 후, 펩티드 리간드, 또는 셀렉틴 및 ICAM-결합 펩티드의 조합물 중 어느 하나를 GAG (예를 들어, 더마탄 술페이트)에 접합시킬 것이다. 꼬리는 EC-SEAL-알킬 꼬리를 수성 환경에서 미셀 내로 강제할 것이다. 본원에 기재된 1종 이상의 유형의 EC-SEAL 접합체와 조합된 US 2013/0190246에 기재된 DS-SILY 접합체를 포함하는 혼합된 미셀은 또한 제제화되고, 사용될 수 있다. DS-SILY 및 EC-SEAL 접합체는 둘 다 알킬 꼬리를 가질 수 있다. 1:1 DS-SILY-꼬리:EC-SEAL-꼬리를 조합함으로써, 내피에, 또는 노출된 ICAM, VCAM, 셀렉틴, 및/또는 콜라겐에 결합될 것인 혼합된 미셀이 생성된다. DS-SILY-꼬리 및 EC-SEAL-꼬리 분자의 방출은 전달 후 48-시간 기간에 걸쳐 임의의 새롭게 노출된 콜라겐 또는 활성화된 내피 세포를 코팅할 수 있다. 알킬 꼬리 구조는 미셀 형성을 위해 및 시간 경과에 따른 미셀의 해리를 위해 최적화될 수 있다.
아민 변형된 더마탄 술페이트의 소수화는 알킬 쇄의 글리시딜 에테르 접합체, 예컨대 이소프로필 (C3), 부틸 (C4), 헥실 (C6), 옥틸 (C8), 데실 (C10), 또는 도데실 (C12) 글리시딜 에테르를 이용함으로써 달성될 것이다. 글리시딜 에테르 및 아민 사이의 반응은 다른 이용가능한 친핵체, 예컨대 물 또는 히드록실 단위에 비해 선호적으로 일어난다 (Shechter et al., Industrial & Engineering Chemistry 48:94-7 (1956)). 생성된 알킬 DS의 상대적 소수성은 C3 내지 C12 범위의 정확한 알킬 꼬리 길이를 선택함으로써 제어될 수 있다. DS-아민 및 알킬 글리시딜 에테르 사이의 반응은 하기와 같이 달성될 것이다. DS (1.0 g)를 이소프로판올 70 mL에 교반하면서 분산시킬 것이다. 이어서, 소정 몰량의 알킬 글리시딜 에테르를 혼합물에 첨가하고, 63℃에서 3시간 동안 반응시킬 것이다. 생성된 알킬화된 DS를 여과에 의해 수집하고, 톨루엔으로 세척하여 과량의 미반응된 알킬 글리시딜 에테르를 제거할 것이다. 알킬화된 DS를 동결건조시켜 건조 물질을 얻을 것이다. 이 방법은 후속의 술폰화 시, 빈약하게 가용성인 로테논의 용해도를 보조할 수 있는 미셀을 형성한 키토산 알킬레이트를 합성하는 데 성공적으로 사용되었다 (Lao et al., Carbohydrate Polymers 82:1136-42 (2010)).
미셀 특징화 : CMC / 직경 /제타 전위: 알킬화된-DS의 임계 미셀 농도 (CMC)를 제타사이저를 사용하여 측정할 것이다. CMC 초과의 농도와 대조적으로, CMC 미만의 농도에서, 산란광의 강도는 물의 그것과 유의하게 상이하지 않다. 또한, 얻어진 자기상관 함수는 노이즈 비율에 대해 빈약한 신호를 나타내며, 크기 분포 정보는 얻어지지 않는다 (quimica.udea.edu.co /~coloides/Anexo1.pdf). 2006 (2006)의 웹사이트 참조). 미셀 크기 및 제타 전위를 또한 혈청 단백질의 존재가 있거나 없이 다양한 농도에서 특징화하여 단백질의 영향 및 그와의 상호작용을 연구할 것이다 (Takeuchi K-I et al., FEBS letters 397:207-9 (1996)).
미셀 해리 : 형광 (M5 플레이트 리더를 사용하여 다양한 파장에서 방출 스펙트럼을 모니터링함)을 사용하여 환경의 소수성에 따라 상이한 형광 스펙트럼을 나타내는 피렌을 사용하여 미셀 해리를 측정할 것이다 (Wilhelm et al., Macromolecules 24:1033-40 (1991)). 이 기술은 본 발명자들이 피렌 형광에서의 변화를 측정함으로써 혈청 및 전혈의 존재 하에서 내피 세포 표면 상의 미셀의 해리를 측정하는 것을 허용할 것이다. 중요하게는, EC-SEAL을 콜라겐 내피 세포 표면 상의 검출용 비오틴으로 표지할 수 있다. 이는 미셀이 해리함에 따라 EC-SEAL 접합체가 그의 표적에 결합함을 입증할 것이다.
미셀 해리 및 콜라겐 및 활성화된 내피 세포에의 결합: 본 발명자는 이전에 이비디 플로우 키트 (마르틴스라이드 (Martinsried), 독일)를 사용하여 콜라겐 표면에의 세포 결합을 평가하였다 (Paderi et al., Biomaterials 32:2516-23 (2011)). 유사한 절차를 사용하여 미셀 결합을 평가하고, 유동 하에서 미셀 해리, 및 미셀 해리 시 콜라겐 및 활성화된 내피 세포에의 DS-SILY-꼬리 및 EC-SEAL-꼬리 결합을 평가할 것이다. 간략하게, 각각의 채널을 원섬유성 콜라겐으로, 또는 원섬유성 콜라겐 및 활성화된 내피 세포의 패치로 코팅할 것이다. 과량의 콜라겐 및 비결합된 내피 세포를 채널을 통해 PBS로 광범위 세정함으로써 유동 채널로부터 제거할 것이다. 미셀을 채널에서 2 mM의 농도로 37℃에서 15분 동안 인큐베이션하고, 비결합된 미셀을 PBS로 세정할 것이다. 대조군 채널은 미셀로 처리되지 않은 콜라겐 및 내피 세포로 이루어질 것이다. 전혈을 주사기 펌프에 의해 1000 s-1의 생리학적 관련 전단 속도에 상응하는 5.6 mL/h의 유속으로 유동 채널을 통해 통과시킬 것이다 (Badimon et al., Circulation 78:1431-42 (1988)). 단기간 실험을 위해, 5분의 유동 후, PBS pH 7.4를 동일한 유속으로 10분 동안 통과시켜 비결합된 세포를 세척하였다. 장기간 실험을 위해, 5분 동안 유동에 노출 후, 혈액을 완전 배지에 대해 교환할 것이고, 세포를 24시간 동안 인큐베이터로 복귀시킨 후, 다시 5분 동안 유동에 노출시키고, 영상화하고, 추가의 24시간 동안 인큐베이터로 복귀시킬 것이다. 그 후, 이를 다시 5분 동안 유동에 노출시키고, 최종 시간을 영상화할 것이다. 각각의 유동 채널의 명시야 및 형광 영상을 10X 대물렌즈로 취할 것이다. 영상을 미셀 커버리지, 세포 커버리지에 대해, 및 DS-SILY-꼬리 또는 EC-SEAL-꼬리 커버리지에 대해 영상화된 아비딘-Cy5의 적용의 추가된 단계로, 각각 이미지제이 (ImageJ) (NIH, 미국 메릴린드주 베데스다) 및 매트랩 (MatLab) (매트웍스 (Mathworks), 미국 메사추세츠주 나티크)를 사용하여 역치를 구하고, 정량화할 것이다.
일단 최적 제제가 결정되면 (미셀을 형성하고, 약 48시간에 걸쳐 해리하고, 콜라겐 및 활성화된 내피 세포에 결합함), 본 발명자들은 전달 형성이 미셀 및 유리 DS-SILY 및 유리 EC-SEAL 둘 다를 함유하는 경우 미셀 결합을 평가함으로써 시스템을 추가로 챌린지하여 미셀의 결합이 유리 DS-SILY 및 EC-SEAL의 존재 하에서 일어나는 것을 보장할 것이다. 미셀은 단위 당 보다 큰 수의 결합 펩티드를 갖기 때문에, 미셀이 결합을 위해 유리 분자와 유효하게 경쟁하지 않을 것이라고 생각할 이유는 없다. 그러나, 50:50, 75:25 및 90:10 유리 분자:미셀의 비율을 이전의 단락에 기재된 유동 시스템에서 평가하여 유리 분자 및 미셀 둘 다의 유효 결합을 뒷받침하는 비율을 측정할 것이다.
유리 분자 및 미셀의 결합을 가장 양호하게 뒷받침하는 비율을 본 발명자들이 DS-SILY 분자에 대해 수행한 바와 같이 (Paderi et al., Biomaterials 32:2516-23 (2011)), 전혈로 30분, 24시간 및 48시간에서 챌린지하여 혈소판 결합을 평가할 것이다. 이 비율을 또한 HUVEC 및 백혈구 세포주 HL60 공동-배양 모델에서 평가할 것이며, 여기서, HUVECS를 TNFα로 챌린지하고, 최적 비율로 처리하고, HL60으로 챌린지하고, DS-SILY/EC-SEAL 코팅, HL60 결합, 및 시토카인 생성에 대해 평가한다.
이러한 절차의 완료 시, DS-SILY 및 EC-SEAL 꼬리 크기는 미셀 형성을 유도하고, 48-시간 기간에 걸친 해리를 허용하도록 적절하게 조정된다. 본 발명자들은 또한 미셀로부터의 해리 후 콜라겐 및 활성화된 내피 세포에 각각 결합하는 DS-SILY 및 EC-SEAL의 능력을 평가할 것이다. 이에 기초하여, 본 발명자들은 미셀을 형성하는 데 사용된 DS-SILY-꼬리 및 EC-SEAL-꼬리에 접합된 셀렉틴 및 ICAM 펩티드의 수를 추가로 조정하여 새롭게 노출된 콜라겐 및 활성화된 내피 세포에의 결합의 가능성을 최적화할 수 있다.
대안적인 접근법: 알킬화가 환원 말단 이외의 위치에서 일어날 경우, 본 발명자들은 환원 말단에서 새로운 아민을 생성하기 전에 먼저 모든 아민을 아세틸화할 것이다. 이는 DS 1 g을 실온에서 포름아미드 10 mL에 용해시키고, 소정 몰량의 피리딘 및 아세트산 무수물을 첨가함으로써 수행될 것이다. 반응 혼합물을 12시간 동안 교반한 후, 증류수에 대해 3일 동안 투석 (MWCO 3,500 Da)하고, 동결건조시킬 것이다. 이를 유사한 콘드로이틴 술페이트에 성공적으로 적용하여 콘드로이틴 술페이트의 아세틸화를 달성하였다 (Li & Na, Biomacromolecules 12:1724-30 (2011)). 이들 반응은 제어된 방식으로 DS에의 알킬 쇄의 첨가에 유효하며, 이는 미셀 및 나노입자의 자기-응집을 초래하는 것으로 입증되었다.
대안적인 커플링 화학은 필요할 경우 사용될 수 있다. 아민은 카르보디이미드 화학을 통한 반응에 감수성이기 때문에, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 (EDC)를 중간체로서 이용하여 지방산을 DS-아민과 직접 반응시킬 수 있다. 이 반응을 달성하기 위해, DS-아민 (1 g)을 적당하게 산성 수용액 (약 100 ml, pH 5 내지 6)에 용해시키고, 메탄올 85 mL로 희석할 것이다. 선택 지방산을 DS 용액에 소정 몰 비율로 첨가한 후, EDC 메탄올 용액 (1:1 몰 EDC:지방산)을 실온에서 교반하면서 적가할 것이다. 24시간 후, 반응물을 과량의 메탄올에 부어 침전시킬 것이다. 침전된 물질을 메탄올, 및 에테르로 연속적으로 세척한 후, 동결건조시킬 것이다. 이전에, 리놀레산 (LA)을 이 방법에 의해 키토산에 접합시켜 LA-키토산 나노입자의 자기-응집을 달성하였으며, 이는 1M NaCl 용액의 첨가 시 200 내지 600 nm의 크기 범위로 나노입자로 자발적으로 형성되었다 (Chen et al., J. Agricult. & Food Chem. 51:3135-9 (2003)).
콜라겐, 셀렉틴, ICAM, 및/또는 VCAM 표면 상의 미셀의 전계 방출 주사 전자 현미경검사를 비롯한 추가의 특징화 기술을 제타 사이징, 공초점 현미경검사, 및 ELISA가 상호작용을 특징화하는 데 불충분한 경우 사용될 수 있다. 피렌이 미셀 해리의 모니터링을 허용하기에 충분하게 민감하지 않은 경우, 이전에 세포-다당류 상호작용을 검정하는 데 사용된 형광으로 접합된 다당류 나노입자를 사용할 수 있다 (Huang et al., Pharmaceutical research 19:1488-94 (2002). 이는 형광단을 알킬화된-더마탄 술페이트에 직접 접합시킴으로써 달성될 것이다. 잠재적으로 생체내 영상화를 허용할 것인 근적외선 염료를 비롯한 폭넓은 범위의 형광 염료를 더마탄 술페이트에 접합시킬 수 있다 (Leevy et al., Bioconjugate chemistry 19:686-92 (2008)).
참고문헌
본원에 참조되거나 언급된 모든 특허 및 간행물은 본 개시내용이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자의 기술의 수준을 지시하며, 각각의 이러한 참조된 특허 또는 간행물은 이것이 그 전문이 개별적으로 참조로 포합되거나 그 전문이 본원에 설명된 것과 동일한 정도로 구체적으로 본원에 참조로 포함된다. 출원인은 이 명세서 내에 임의의 이러한 인용된 특허 또는 간행물로부터의 임의의 및 모든 자료 및 정보를 물리적으로 포함시킬 권리를 갖는다.
본원에 기재된 구체적인 방법 및 조성물은 바람직한 실시양태의 대표이며, 예시적인 것이고, 본 발명의 범위에 대한 제한으로 의도되지 않는다. 다른 목적, 측면, 및 실시양태는 이 명세서의 숙고 시 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 일어날 것이며, 청구항의 범위에 의해 한정되는 바와 같은 본 발명의 정신 내에 포함된다. 본 발명의 범위 및 정신으로부터 벗어나지 않고 본원에 개시된 본 발명에 대해 다양한 치환 및 변형이 이루어질 수 있음은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 명백할 것이다. 본원에 예시적으로 기재된 본 발명은 적합하게 필수로서 구체적으로 본원에 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 또는 제한 또는 제한들의 부재 하에서 실시될 수 있다.
본원에 예시적으로 기재된 방법 및 공정은 적합하게 단계의 순서를 달리하여 실시될 수 있으며, 방법 및 공정은 반드시 본원에 또는 청구범위에 지시된 단계의 순서에 제한되지는 않는다. 본원에 및 첨부된 청구범위에 사용된 단수 형태 ("a", "an" 및 "the")는 맥락이 명백하게 달리 나타내지 않는다면 복수 언급대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "핵산" 또는 "프로모터"에 대한 언급은 복수의 이러한 핵산 또는 프로모터 (예를 들어, 핵산의 용액 또는 일련의 프로모터) 등을 포함한다. 어떠한 경우에도, 특허는 본원에 구체적으로 개시된 구체적인 실시예 또는 실시양태 또는 방법에 제한되는 것으로 해석되지 않을 수 있다. 어떠한 경우에도, 특허는 이러한 진술이 구체적으로 및 정성화 또는 유보 없이 출원인에 의한 응답 서면에 표현적으로 채택되지 않는다면, 특허 상표청의 임의의 심사관 또는 임의의 다른 공무원 또는 고용인에 의해 이루어진 임의의 진술에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않을 수 있다.
사용된 용어 및 표현은 제한이 아니라 설명의 용어로서 사용되며, 나타난 및 기재된 특징 또는 그의 부분의 임의의 등가물을 배제하기 위한 이러한 용어 및 표면의 사용으로의 의도가 없지만, 청구된 바와 같은 본 발명의 범위 내에서 다양한 변형이 가능함이 인식된다. 따라서, 본 발명을 바람직한 실시양태 및 임의적 특징에 의해 구체적으로 개시하였지만, 본원에 개시된 개념의 변형 및 변경은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 취해질 수 있으며, 이러한 변형 및 변경은 첨부된 청구범위 및 본 발명의 진술에 의해 한정되는 바와 같은 이 발명의 범위 내인 것으로 간주됨이 이해될 것이다.
본 발명의 하기 진술은 명세서의 상기 설명에 따라 본 발명의 다양한 실시양태를 기재하고 요약하는 것으로 의도된다.
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Ala
<210> 45
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 45
Asn Asn Gln Lys Ile Val Asn Ile Lys Glu Lys Val Ala Gln Ile Glu
1 5 10 15
Ala
<210> 46
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 46
Asn Asn Gln Lys Leu Val Asn Ile Lys Glu Lys Val Ala Gln Ile Glu
1 5 10 15
Ala
<210> 47
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 47
Tyr Pro Ala Ser Tyr Gln Arg
1 5
<210> 48
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 48
Tyr Gln Ala Thr Pro Leu Pro
1 5
<210> 49
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 49
Gly Ser Leu Leu Ser Ala Ala
1 5
<210> 50
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 50
Phe Ser Pro His Ser Arg Thr
1 5
<210> 51
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 51
Tyr Pro Phe Leu Pro Thr Ala
1 5
<210> 52
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 52
Gly Cys Lys Leu Cys Ala Gln
1 5
<210> 53
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 53
ggtcggggtg agtttcgtgg tagggataat tctgtttggg tggtt 45
<210> 54
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 54
Glu Trp Cys Glu Tyr Leu Gly Gly Tyr Leu Arg Cys Tyr Ala
1 5 10
<210> 55
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 55
Gly Arg Gly Glu Phe Arg Gly Arg Asp Asn Ser Val Ser Val Val
1 5 10 15
<210> 56
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 56
Gln Thr Ser Val Ser Pro Ser Lys Val Ile
1 5 10
<210> 57
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 57
Pro Ser Lys Val Ile Leu Pro Arg Gly Gly
1 5 10
<210> 58
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 58
Leu Pro Arg Gly Gly Ser Val Leu Val Thr Gly
1 5 10
<210> 59
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 59
Gln Thr Ser Val Ser Pro Ser Lys Val Ile Leu Pro Arg Gly Gly Ser
1 5 10 15
Val Leu Val Thr Gly
20
<210> 60
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 60
Tyr Arg Leu Ala Ile Arg Leu Asn Glu Arg
1 5 10
<210> 61
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 61
Tyr Arg Leu Ala Ile Arg Leu Asn Glu Arg Arg Glu Asn Leu Arg Ile
1 5 10 15
Ala Leu Arg Tyr
20
<210> 62
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 62
Arg Glu Asn Leu Arg Ile Ala Leu Arg Tyr
1 5 10
<210> 63
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 63
Arg Arg Ala Asn Ala Ala Leu Lys Ala Gly Glu Leu Tyr Lys Ser Ile
1 5 10 15
Leu Tyr
<210> 64
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 64
Gly Glu Leu Tyr Lys Ser Ile Leu Tyr
1 5
<210> 65
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 65
Arg Arg Ala Asn Ala Ala Leu Lys Ala Gly Glu Leu Tyr Lys Cys Ile
1 5 10 15
Leu Tyr
<210> 66
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 66
Gly Glu Leu Tyr Lys Cys Ile Leu Tyr
1 5
<210> 67
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 67
Arg Leu Asp Gly Asn Glu Ile Lys Arg
1 5
<210> 68
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 68
Ala His Glu Glu Ile Ser Thr Thr Asn Glu Gly Val Met
1 5 10
<210> 69
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 69
Asn Gly Val Phe Lys Tyr Arg Pro Arg Tyr Phe Leu Tyr Lys His Ala
1 5 10 15
Tyr Phe Tyr Pro Pro Leu Lys Arg Phe Pro Val Gln
20 25
<210> 70
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 70
Cys Gln Asp Ser Glu Thr Arg Thr Phe Tyr
1 5 10
<210> 71
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 71
Thr Lys Lys Thr Leu Arg Thr
1 5
<210> 72
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 72
Gly Leu Arg Ser Lys Ser Lys Lys Phe Arg Arg Pro Asp Ile Gln Tyr
1 5 10 15
Pro Asp Ala Thr Asp Glu Asp Ile Thr Ser His Met
20 25
<210> 73
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 73
Ser Gln Asn Pro Val Gln Pro
1 5
<210> 74
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 74
Ser Tyr Ile Arg Ile Ala Asp Thr Asn Ile Thr
1 5 10
<210> 75
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 75
Lys Glu Leu Asn Leu Val Tyr Thr
1 5
<210> 76
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 76
Gly Ser Ile Thr Thr Ile Asp Val Pro Trp Asn Val
1 5 10
<210> 77
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 77
Trp Arg Glu Pro Ser Phe Cys Ala Leu Ser
1 5 10
<210> 78
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Beta-Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> Bip
<400> 78
Ala Trp His Cys Thr Thr Lys Phe Pro His His Tyr Cys Leu Tyr Xaa
1 5 10 15
<210> 79
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Beta-Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> Bip
<400> 79
Ala His Lys Cys Pro Trp His Leu Tyr Thr Thr His Tyr Cys Phe Thr
1 5 10 15
Xaa
<210> 80
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Beta-Ala
<400> 80
Ala His Lys Cys Pro Trp His Leu Tyr Thr His Tyr Cys Phe Thr
1 5 10 15
<210> 81
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> 4-hydroxyproline
<400> 81
Gly Arg Xaa Gly Glu Arg
1 5
<210> 82
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> 4-hydroxyproline
<400> 82
Gly Met Xaa Gly Glu Arg
1 5
<210> 83
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> 4-hydroxyproline
<400> 83
Gly Leu Xaa Gly Glu Asn
1 5
<210> 84
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> 4-hydroxyproline
<400> 84
Gly Leu Xaa Gly Glu Arg
1 5
<210> 85
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 85
Gly Leu Lys Gly Glu Asn
1 5
<210> 86
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> 4-hydroxyproline
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> 4-hydroxyproline
<400> 86
Gly Phe Xaa Gly Glu Arg Gly Val Glu Gly Pro Xaa Gly Pro Ala
1 5 10 15
<210> 87
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 87
His Val Trp Met Gln Ala Pro Gly Gly Gly Lys
1 5 10
<210> 88
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 88
Trp Tyr Arg Gly Arg Leu
1 5
<210> 89
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 89
Trp Thr Cys Ser Gly Asp Glu Tyr Thr Trp His Cys
1 5 10
<210> 90
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 90
Trp Thr Cys Val Gly Asp His Lys Thr Trp Lys Cys
1 5 10
<210> 91
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 91
Gln Trp His Cys Thr Thr Arg Phe Pro His His Tyr Cys Leu Tyr Gly
1 5 10 15
<210> 92
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 92
Ser Thr Trp Thr Trp Asn Gly Ser Ala Trp Thr Trp Asn Glu Gly Gly
1 5 10 15
Lys
<210> 93
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 93
Ser Thr Trp Thr Trp Asn Gly Thr Asn Trp Thr Arg Asn Asp Gly Gly
1 5 10 15
Lys
<210> 94
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 94
Cys Val Trp Leu Trp Glu Gln Cys
1 5
<210> 95
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 95
Cys Met Thr Ser Pro Trp Arg Cys
1 5
<210> 96
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 96
Cys Pro Gly Arg Val Met His Gly Leu His Leu Gly Asp Asp Glu Gly
1 5 10 15
Pro Cys
<210> 97
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 97
Gly Gly Gly Gly
1
<210> 98
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 98
Gly Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 99
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 99
Gly Ser Gly Cys
1
<210> 100
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 100
Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
<210> 101
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 101
Lys Lys Gly Ser Gly
1 5
<210> 102
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 102
Lys Lys Gly Cys
1
<210> 103
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 103
Lys Lys Lys Gly Ser Gly
1 5
<210> 104
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 104
Lys Lys Lys Gly Cys
1 5
<210> 105
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 105
Ile Glu Leu Leu Gln Ala Arg Gly Cys
1 5
<210> 106
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 106
Ile Glu Leu Leu Gln Ala Arg
1 5
<210> 107
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 107
Ile Asp Leu Met Gln Ala Arg Gly Cys
1 5
<210> 108
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 108
Ile Glu Leu Leu Gln Ala Arg Gly Cys
1 5
<210> 109
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 109
Gln Ile Thr Trp Ala Gln Leu Trp Met Met Lys Gly Cys
1 5 10
<210> 110
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 110
Asp Gly Glu Ala Thr Asp Gly Cys
1 5
<210> 111
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 111
Lys Gly Ser Gly
1
<210> 112
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 112
Lys Leu Trp Leu Leu Pro Lys
1 5
<210> 113
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 113
Cys Gln Asp Ser Glu Thr Arg Thr Phe Tyr
1 5 10
<210> 114
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 114
Ile Thr Asp Gly Glu Ala Gly Cys
1 5
Claims (29)
- 글리코사미노글리칸 및 약 3개 내지 약 50개의 펩티드 리간드를 포함하는 펩티드 접합체이며, 여기서 펩티드 리간드는 셀렉틴, ICAM 및/또는 VCAM에 결합하는 것인 펩티드 접합체.
- 제1항에 있어서, 글리코사미노글리칸에 결합된 (C2-18) 알킬 꼬리를 추가로 포함하는 펩티드 접합체.
- 제1항에 있어서, 글리코사미노글리칸이 덱스트란, 덱스트란 술페이트, 콘드로이틴, 콘드로이틴 술페이트, 더마탄, 더마탄 술페이트, 헤파란 술페이트, 헤파린, 케라틴, 케라탄 술페이트, 또는 히알루론산인 펩티드 접합체.
<청구항 3>
제1항에 있어서, 펩티드 리간드가 링커를 통해 글리코사미노글리칸에 공유 결합된 것인 펩티드 접합체. - 제1항에 있어서, 링커가 N-[β-말레이미도프로피온산]히드라지드 (BMPH), 3-(2-피리딜디티오)프로피오닐 히드라지드 (PDPH) 또는 펩티드 GSG인 펩티드 접합체.
- 제1항에 있어서, EC-SEAL 접합체가 약 5개 내지 약 40개의 펩티드를 포함하는 것인 펩티드 접합체.
- 제1항에 있어서, 펩티드 리간드가
i) IELLQAR (서열식별번호 (SEQ ID NO): 1); IELLQARGSC (서열식별번호: 2); IDLMQAR (서열식별번호: 3); IDLMQARGSC (서열식별번호: 4); QITWAQLWNMMK (서열식별번호: 5); QITWAQLWNMMKGSC (서열식별번호: 6), NAFKILVVITFGEK (서열식별번호: 7); NAFKILVVITFGEKGSC (서열식별번호: 8); ITDGEA (서열식별번호: 9); ITDGEAGSC (서열식별번호: 10); DGEATD (서열식별번호: 11); 또는 DGEATDGSC (서열식별번호: 12); 또는
ii) i)의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하며, 셀렉틴, ICAM 및/또는 VCAM에 결합할 수 있는 펩티드 리간드
로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 펩티드 접합체. - 제1항에 있어서, 셀렉틴에 결합할 수 있는 약 5개 내지 약 40개의 펩티드 리간드를 포함하는 펩티드 접합체.
- 제1항에 있어서, ICAM 및/또는 VCAM에 결합할 수 있는 약 5개 내지 약 40개의 펩티드 리간드를 포함하는 펩티드 접합체.
- 제1항에 있어서, 셀렉틴에 결합할 수 있는 약 5개 내지 약 20개의 펩티드 리간드 및 ICAM 및/또는 VCAM에 결합할 수 있는 약 5개 내지 약 20개의 펩티드 리간드를 포함하는 펩티드 접합체.
- 더마탄 술페이트 또는 콘드로이틴 술페이트 및 약 3개 내지 약 25개의 펩티드 리간드를 포함하는 펩티드 접합체이며, 여기서 펩티드 리간드는 셀렉틴, ICAM 및/또는 VCAM에 결합하는 것인 펩티드 접합체.
- 더마탄 술페이트 및 약 10, 15, 20 또는 30개의 펩티드 리간드를 포함하는 펩티드 접합체이며, 여기서 펩티드 리간드는 셀렉틴, ICAM 및/또는 VCAM에 결합하는 것인 펩티드 접합체.
- 더마탄 술페이트 및 셀렉틴에 결합할 수 있는 약 10개의 펩티드 리간드 및 ICAM 및/또는 VCAM에 결합할 수 있는 약 10개의 펩티드 리간드를 포함하는 펩티드 접합체.
- 유효량의 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 펩티드 접합체를 포함하는 제약 조성물을 내피 기능장애와 연관된 질환을 앓고 있는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 내피 기능장애와 연관된 질환을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법.
- 제13항에 있어서, 내피 기능장애와 연관된 질환이 아테롬성동맥경화증, 관상 동맥 질환, 당뇨병, 고혈압, 고콜레스테롤혈증, 류마티스 관절염, 전신 홍반성 루푸스, 녹내장, 요독증, 패혈증, 및 기관 부전으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제13항 또는 제14항에 있어서, 투여가 정맥내, 복강내, 국소 또는 이식된 장치를 통한 것인 방법.
- 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 혈관 중재 시술을 받고 있지 않거나 그로부터 회복되고 있는 것인 방법.
- 제16항에 있어서, 혈관 중재 시술이 경피 관상동맥 중재 (PCI) 시술을 포함하는 것인 방법.
- 제16항에 있어서, 혈관 중재 시술이 혈관을 벗겨내는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 내피 기능장애가 침투된 내피 내층 또는 손상된 내피 세포를 특징으로 하는 것인 방법.
- 제13항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 내피 기능장애가 당질층의 손실을 특징으로 하는 것인 방법.
- 제13항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 내피 기능장애가 내피 세포의 표면 상에 발현되며 순환에 노출된 셀렉틴 단백질을 특징으로 하는 것인 방법.
- 제13항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 부위가 염증을 앓고 있는 것인 방법.
- 제13항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 펩티드 접합체가 기능장애성 내피에 근접한 20 μM 내지 1000 μM의 펩티드 리간드의 혈장 농도를 달성하도록 투여되는 것인 방법.
- 제23항에 있어서, 펩티드 접합체가 기능장애성 내피에 근접한 100 μM 내지 400 μM의 펩티드 리간드의 혈장 농도를 달성하도록 투여되는 것인 방법.
- 유효량의 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 펩티드 접합체를 포함하는 제약 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 혈관 부위에서의 염증을 예방 또는 감소시키는 방법이며, 여기서 부위는 (a) 침투된 내피 내층 또는 손상된 내피 세포를 포함하고, (b) 혈관 중재 시술을 받고 있지 않는 것 내지 그로부터 회복되고 있는 것인 방법.
- 제25항에 있어서, 혈관 중재 시술이 경피 관상동맥 중재 (PCI) 시술을 포함하는 것인 방법.
- 펩티드 리간드, 글리코사미노글리칸, 및 1 내지 3개의 임의적 알킬 꼬리(들)를 포함하는 펩티드 접합체이며, 여기서 펩티드 리간드는 IELLQAR (서열식별번호: 1); IELLQARGSC (서열식별번호: 2); IDLMQAR (서열식별번호: 3); IDLMQARGSC (서열식별번호: 4); QITWAQLWNMMK (서열식별번호: 5); QITWAQLWNMMKGSC (서열식별번호: 6), NAFKILVVITFGEK (서열식별번호: 7); NAFKILVVITFGEKGSC (서열식별번호: 8); ITDGEA (서열식별번호: 9); ITDGEAGSC (서열식별번호: 10); DGEATD (서열식별번호: 11); 및 DGEATDGSC (서열식별번호: 12)의 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 것인 펩티드 접합체.
- 제27항의 펩티드 접합체를 포함하는 조성물.
- 하나 이상의 내피 세포를 제27항의 EC 펩티드 접합체와 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
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