CN109106940B - Iellqar作为预防和治疗动脉粥样硬化疾病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医学技术领域，公开了IELLQAR作为预防和治疗动脉粥样硬化疾病药物中的应用。该IELLQAR，能够抑制单核细胞与P、E和L选择糖蛋白结合，进而抑制单核细胞与内皮细胞粘附，并具有抑制炎症的作用。ApoE基因小鼠经高脂饮食诱导后，主动脉可见明显的动脉粥样硬化斑块，IELLQAR干预能够减缓ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化病变，并能够减少动脉粥样硬化斑块局部单核巨噬细胞浸润。本发明从动物实验和体外细胞研究水平均表明，IELLQAR能够抑制单核细胞粘附、炎症因子表达，并通过抗炎机制抑制动脉粥样硬化进展，可预防和治疗动脉粥样硬化相关疾病，具有重要临床应用前景。

Description

IELLQAR作为预防和治疗动脉粥样硬化疾病药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，IELLQAR作为预防和治疗动脉粥样硬化相关疾病的药物应用。

背景技术

心肌梗死是威胁人类健康的主要死因之一，具有发病率高、致死率高的特点。虽然以经皮冠状动脉介入治疗技术为代表的一系列新技术例数不断增加，但过去十年间中国心肌梗死患病率和病死率并没有下降，因此发现心肌梗死早期发病机制并加以防治至关重要。而动脉粥样硬化作为心肌梗死发生中的重要病理机制，其发病机制尚未完全阐明，近些年来越来越多的研究表明动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病，免疫细胞和炎症因子参与动脉粥样硬化的发生、进展，而通过调控炎症免疫细胞反应防治动脉粥样硬化也成为近年来基础研究和临床研究的热点问题。

单核-巨噬细胞系统功能失调及过度活化在动脉粥样硬化早期发生、进展及不稳定斑块形成中发挥重要作用，包括高脂、炎症等不良刺激促进了血管壁对单核细胞的募集；单核细胞分化为M1型巨噬细胞，分泌IL-6、TNF-α等炎症因子，导致内皮细胞、平滑肌细胞凋亡或坏死；单核、巨噬细胞吞噬脂质类物质转化成泡沫细胞，构成不稳定斑块的重要成分等诸多机制参与这一过程。因此，有效遏制单核细胞募集至血管壁及向炎性巨噬细胞过程转化，对早期防治动脉粥样硬化具有重要意义。

白细胞粘附于血管壁涉及细胞边集、捕捉、滚动、铆钉等动态过程，选择糖蛋白与其配体结合在这一过程中发挥始动作用。选择糖蛋白家族是粘附因子中重要成员，包括P选择糖蛋白、E选择糖蛋白和L选择糖蛋白。选择素家族为I型跨膜蛋白其细胞外区结构均由C型凝集素样结构域、表皮生长因子样结构域和补体调节蛋白结构域构成。P选择糖蛋白主要储存在血小板α颗粒和内皮细胞Weibel-Palade小体内，在炎症、血栓等刺激下，迅速转移到细胞表面发挥功能，是内皮细胞激活后最早参与粘附反应的选择蛋白；E选择糖蛋白当受到炎症刺激时可在血管内皮细胞表面表达，它的作用是介导嗜中性粒细胞、单核细胞和T淋巴细胞在血管内皮细胞表面滚动并诱导他们在炎症部位渗出。L选择糖蛋白在所有的白细胞表面持续表达，它能与其他选择蛋白及黏附分子协同参与炎症反应中自细胞的聚集。

已有部分研究显示以选择糖蛋白抗体治疗为代表的靶向免疫调节治疗动脉粥样硬化性疾病具有良好的临床应用前景：SELECT-ACS研究中，非ST段抬高性心肌梗死患者接受经皮冠状动脉介入治疗术(PCI)前应用P选择糖蛋白抗体能够显著降低PCI术后患者血清肌钙蛋白水平；选择糖蛋白拮抗剂-比莫西糖能够缓解支气管哮喘和慢性阻塞性肺疾病发作。但是上述传统生物抗体具有分子量大、生物利用度不高、免疫原性强、个体差异性大、副作用性多等缺点。然而，多肽类药物由几个少数氨基酸组成，化学合成，作为药物具有独特优势：分子量小、无免疫原性、安全性高；结构相对简单，功能较明确、特异性好，不良反应少；分子较小，易于合成，稳定性好。目前多肽类药物广泛应用于药物、疫苗、诊断试剂以及药物先导化合物等诸多领域。IELLQAR为自主合成选择糖蛋白配体模拟多肽，氨基酸序列：Ile-Glu-Leu-Leu-Gln-Ala-Arg；能够竞争性抑制P、E和L选择糖蛋白与其天然配体结合，在既往研究中被报道具有抑制肿瘤细胞转移和小鼠急性腹膜炎模型中性粒细胞渗出的作用，但目前尚未有IELLQAR在抗动脉粥样硬化方面的报道。

发明内容

本发明的目的是针对免疫炎症机制在动脉粥样硬化发生、进展中的作用靶点，弥补现有该领域靶向治疗药物不足，提供一种IELLQAR作为预防和治疗动脉粥样硬化疾病药物中的应用。

为实现上述目的，本发明技术方案如下：

IELLQAR作为预防和治疗动脉粥样硬化疾病药物中的应用。

进一步地，IELLQAR能够抑制单核细胞(PBMC)与P、E和L选择糖蛋白结合，进而抑制PBMC与内皮细胞粘附。

进一步地，IELLQAR能够抑制P、E和L选择糖蛋白激活下PBMC内IL-6，TNF-α和MCP-1基因表达，起到抑制炎症的作用。

进一步地，IELLQAR能够减少斑块局部单核巨噬细胞浸润。

进一步地，IELLQAR的给药溶度范围为1-3mg/kg，显示良好的控制和治疗效果。

该IELLQAR是P、E、L选择糖蛋白配体共同模拟物，能够竞争性抑制选择糖蛋白与其配体结合，进而抑制单核细胞与内皮细胞结合，并能够抑制炎症反应。

本发明有益效果为：通过动物实验证明，该IELLQAR能够有效减缓ApoE基因敲除鼠主动脉动脉粥样硬化的进展，同时减少动脉粥样硬化斑块局部单核细胞浸润。此外，IELLQAR具有抑制单核细胞与内皮细胞的粘附，抑制单核细胞上调IL-6等炎症因子基因作用。本发明从在体内和体外细胞均验证，该IELLQAR能抑制单核细胞粘附、抑制炎症水平，进而抑制动脉粥样硬化进展，有广泛的临床应用前景。

附图说明

图1是IELLQAR竞争性抑制人源外周血单核细胞(PBMC)与P、E、L选择糖蛋白结合。PBMC分别用IELLQAR和P、E、L选择糖蛋白共处理后，与PE(藻红蛋白)标记抗P、E、L选择糖蛋白抗体孵育，随后采用流式细胞学检测单核细胞上P、E、L的荧光强度。(a)IELLQAR对PBMC与P选择糖蛋白结合的抑制率；(b)IELLQAR对PBMC与P选择糖蛋白结合的抑制率；(c)IELLQAR对PBMC与P选择糖蛋白结合的抑制率。

图2是IELLQAR抑制P选择糖蛋白处理下PBMC与内皮细胞粘附。PBMC分别用磷酸盐缓冲液(PBS)或3μM或10μM的IELLQAR和P选择糖蛋白共处理后用绿钙黏素标记，随后与1μg/mL内毒素(LPS)预处理的人脐静脉人皮细胞共孵育，检测PBMC与内皮细胞粘附情况。(a)PBMC粘附情况；(b)PBMC粘附的统计分析柱状图。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

图3是IELLQAR抑制E选择糖蛋白处理下PBMC与内皮细胞粘附。PBMC分别用PBS或3μM或10μM的IELLQAR和E选择糖蛋白共处理后用绿钙黏素标记，随后与1μg/mL LPS预处理的人脐静脉人皮细胞共孵育，检测PBMC与内皮细胞粘附情况。(a)PBMC粘附情况；(b)PBMC粘附的统计分析柱状图。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

图4是IELLQAR抑制L选择糖蛋白处理下PBMC与内皮细胞粘附。PBMC分别用PBS或3μM或10μM的IELLQAR和L选择糖蛋白共处理后用绿钙黏素标记，随后与1μg/mL LPS预处理的人脐静脉人皮细胞共孵育，检测PBMC与内皮细胞粘附情况。(a)PBMC粘附情况；(b)PBMC粘附的统计分析柱状图。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

图5是IELLQAR抑制PBMC表达炎症因子。PBMC经PBS或LPS或P选择糖蛋白或LPS+IELLQAR或P选择糖蛋白+IELLQAR处理后。收集细胞获取mRNA,实时定量荧光PCR检测各组别炎症因子表达水平。(a)不同处理组别PBMC内白细胞介素-6(IL-6)的mRNA表达水平；(b)不同处理组别PBMC内肿瘤坏死因子α(TNF-α)的mRNA表达水平；(c)不同处理组别PBMC内单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)的mRNA表达水平；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。Control代表磷酸盐缓冲液对照组；P-sel代表P选择糖蛋白。

图6是IELLQAR对ApoE基因敲除鼠动脉粥样硬化斑块局部单核细胞浸润的影响，(a)小鼠主动脉窦部石蜡切片CD68(单核巨噬细胞)免疫组织化学染色；(b)CD68阳性成分百分比定量统计分析图。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001.

图7是IELLQAR对ApoE基因敲除鼠动脉粥样硬化的影响，8周鼠龄ApoE基因敲除小鼠高脂饮食12周，分别给与1mg/kg，3mg/kg的IELLQAR干预，生理盐水组别作为对照，尾静脉注射每4周一次，共计12周。(a)小鼠全程主动脉油红O染色结果；(b)血管脂质面积定量分析统计图。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

图8是IELLQAR对ApoE基因敲除鼠主动脉窦部动脉粥样硬化影响。(a)小鼠主动脉窦部石蜡切片H&E染色；(b)板块面积百分比定量统计分析图。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

具体实施方式

为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现对照附图说明本发明的具体实施方式。

1实验材料

1.1 IELLQAR

通过噬菌体展示技术获取IELLQAR，并经高效液相色谱和质谱验证。细胞实验中用磷酸盐缓冲液(PBS)溶解，存储溶度为1mM；动物实验中用生理盐水溶解，存储溶度为1mg/kg，小鼠给药方式为尾静脉注射，每4周一次，给药溶度分别为1mg/kg和3mg/kg。

1.2实验仪器和试剂

台式水平高速离心机；低温高速离心机；DNA、RNA定量仪；流式细胞仪；Real-timePCR扩增仪；PCR仪；荧光倒置显微镜；恒温CO₂细胞培养箱。抗人PE标记P选择糖蛋白、E选择糖蛋白、L选择糖蛋白抗体；绿钙黏素、内毒素和油红O染液；IL-6，TNF-α和MCP-1引物；反转录PCR及Realtime-PCR试剂盒；抗小鼠CD68抗体；H&E染色试剂盒及免疫组化染色试剂盒；高脂饲料(21％脂肪+0.15％胆固醇+常规小鼠饲料)。

1.3实验动物

ApoE基因敲除鼠(B6.129P2-Apoetm1unc/J)。实验小鼠高脂饲养12周构建动脉粥样硬化模型。

1.4实验细胞

人源外周血单核细胞(PBMC)取之健康志愿者外周血，1:2(20mL外周血：40mL淋巴细胞分离液)加入淋巴细胞分离液后以500g x 10分钟分离，小心吸取中间层细胞即为单核细胞。原代人脐静脉内皮细胞，细胞培养基为1640基础培养基+10％胎牛血清+1％青霉素/链霉素抗体，细胞培养于5％CO₂ 37℃细胞培养箱中。

2试验方法

2.1流式细胞学检测选择糖蛋白与单核细胞(PBMC)结合

PBMC经不同溶度(1，3，10μM)IELLQAR+10μg/mL P选择糖蛋白或E选择糖蛋白或L选择糖蛋白预处理2小时，以PBS+选择糖蛋白组别作为对照。随后加入抗人PE标记P选择糖蛋白、E选择糖蛋白、L选择糖蛋白抗体孵育30分钟，随后流式细胞仪检测荧光信号。

抑制率＝IELLQAR处理组别荧光强度/PBS处理组别荧光强度×100％

2.2单核细胞与内皮细胞粘附实验

PBMC经不同溶度(3，10μM)IELLQAR+10μg/mL P选择糖蛋白或E选择糖蛋白或L选择糖蛋白预处理2小时，PBS组别作为对照组，并用绿钙黏素进行荧光标记。随后将荧光标记的不同处理组别的PBMC(1×10⁶/mL)与LPS激活的内皮细胞共孵育30分钟，随后用PBS清洗三次，倒置荧光显微镜下观察PBMC的粘附情况。

2.3 Realtime-PCR检测单核细胞IL-6，TNF-α和MCP-1 mRNA表达

PBMC经10μg/mL P选择糖蛋白或10μg/mL P选择糖蛋白+10μMIELLQAR预处理2小时，PBS处理组作为阴性对照，LPS处理组作为阳性对照。随后收取细胞，提取各组别细胞的mRNA，利用反转录PCR试剂盒获取cDNA，随后加入IL-6，TNF-α和MCP-1扩增引物，在Realtime-PCR仪器内扩增目的片段。

2.4动脉粥样硬化小鼠动物模型建立与分组

8周鼠龄ApoE基因敲除小鼠随机分为3组，每组8只小鼠，分别给予1mg/kg、3mg/kg的IELLQAR和生理盐水干预，尾静脉注射每4周一次共计3次。各组小鼠均给予高脂饮食12周，成功构建动脉粥样硬化小鼠动物模型。

2.5小鼠主动脉油红O染色

12周后获取小鼠主动脉标本，清除多余脂肪组织和纤维结缔组织后，纵向刨开主动脉于4％多聚甲醛固定30分钟，PBS漂洗后浸泡于60％油红O染液(6份油红O染液和4份异丙醇)孵育30分钟，随后用60％异丙醇漂洗，至于体视显微镜下拍照，并经Image Pro Plus(IPP 5.0)软件定量分析斑块负荷情况。

2.6小鼠主动脉窦部H&E染色

获取小鼠主动脉标本，浸泡于4％多聚甲醛固定12-24小时，经脱水、石蜡包埋于主动脉窦部获取5μm的连续石蜡切片。石蜡切片经脱蜡、脱水处理，伊红苏木素染色，经显微镜拍照，Image Pro Plus(IPP 5.0)软件定量分析动脉粥样硬化斑块大小。

2.7小鼠主动脉窦部CD68免疫组织化学染色

小鼠主动脉窦部石蜡切片经脱蜡、脱水、双氧水、血清封闭处理，兔抗小鼠CD68抗体孵育过夜，后经生物素、亲和素孵育，DAB显色阳性成分，经显微镜拍照，Image Pro Plus(IPP 5.0)软件定量分析动脉粥样硬化斑块内单核巨噬细胞浸润情况。

3统计分析

所有数值以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，并进行均数两两比较，以P<0.05认为具有统计学意义。所有数据采用SPSS 21.0统计软件数据包分析。

4研究结果

4.1 IELLQAR能够抑制选择糖蛋白与PBMC结合

PBMC经不同溶度(1，3，10μM)IELLQAR+10μg/mL P选择糖蛋白或E选择糖蛋白或L选择糖蛋白处理后，流式细胞学检测发现IELLQAR能够抑制P、E和L选择糖蛋白与PBMC结合，且抑制率呈现溶度依赖性(图1)。

4.2IELLQAR能够抑制PBMC与内皮细胞结合

通过粘附实验可以发现，3μM IELLQAR能够抑制PBMC在P选择糖蛋白处理下与LPS激活内皮细胞的粘附，且具有统计学差异；10μM IELLQAR可进一步显著抑制PBMC的粘附(图2)。此外，3μM IELLQAR均能抑制PBMC在E选择糖蛋白和L选择糖蛋白处理下与内皮细胞的粘附，且均具有统计学差异，而10μM IELLQAR抑制效果更为显著(图3，4)。

4.3IELLQAR能够抑制PBMC内IL-6，TNF-α和MCP-1 mRNA表达

PBMC经10μg/mL P选择糖蛋白或10μg/mL P选择糖蛋白+10μM IELLQAR或PBS或LPS处理2小时后，检测各处理组别细胞内IL-6，TNF-α和MCP-1 mRNA表达水平，结果显示：与PBS处理组别相比，P选择糖蛋白和LPS组别PBMC内IL-6，TNF-α和MCP-1 mRNA表达含量明显升高，并具有统计学意义；而10μM IELLQAR具有抑制P选择糖蛋白诱导上述细胞因子表达的作用(图5)。

4.4IELLQAR能够抑制ApoE基因敲除小鼠斑块局部单核细胞浸润

ApoE基因敲除小鼠经高脂饮食12周后构建动脉粥样硬化模型，主动脉窦部石蜡切片抗CD68免疫组化染色结果显示，1mg/kgIELLQAR能够减少小鼠主动脉斑块局部单核巨噬细胞的浸润，3mg/kg IELLQAR可以进一步抑制细胞浸润(图6)。

4.5 IELLQAR能够抑制ApoE基因敲除小鼠主动脉动脉粥样硬化

ApoE基因敲除小鼠经高脂饮食12周后构建动脉粥样硬化模型，获取全程主动脉标本，油红O染色结果分析显示：与生理盐水组别相比，1mg/kg的IELLQAR处理组别小鼠主动脉脂质斑块负荷减少，结果具有统计学差异；而3mg/kg的IELLQAR处理组别小鼠脂质斑块负荷进一步减少(图7)。此外，小鼠主动脉窦部石蜡切片H&E染色显示结果与油红染色结果相仿，均提示1mg/kg和3mg/kg IELLQAR均能抑制小鼠动脉粥样硬化的进展(图8)。

5结论：IELLQAR能够抑制单核细胞(PBMC)与P、E和L选择糖蛋白结合，进而抑制PBMC与内皮细胞粘附，此外能够抑制P、E和L选择糖蛋白激活下PBMC内IL-6，TNF-α和MCP-1基因表达。ApoE基因小鼠经高脂饮食诱导后，主动脉可见明显的动脉粥样硬化斑块，IELLQAR干预能够缓解ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化病变，并能够减少斑块局部单核巨噬细胞浸润。本发明从体外细胞研究和在体动物实验两方面表明，选择糖蛋白IELLQAR能够抑制单核细胞粘附、炎症因子表达，并通过抗炎机制抑制动脉粥样硬化进展，具有预防和治疗动脉粥样硬化相关疾病的作用。

Claims (1)

1.IELLQAR在制备用于治疗动脉粥样硬化疾病的药物中的应用。

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