CN1867827A - 用于诊断骨髓前体细胞(BMPs)和/或血液来源的循环前体细胞(BDPs)的心血管功能性的体外方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于分析与心血管疾病有关的哺乳动物的样品的体外方法。所述方法包括以下步骤：a)利用细胞特异表面标志，分离骨髓前体细胞(BMPs)和/或血液来源的循环前体细胞(BDPs)，以及b)利用适当的迁移试验，测定所分离的BMPs和/或BDPs的心血管功能性。本发明所述方法可作为试剂盒在心血管疾病的诊断和/或预后领域中应用，用于心血管疾病治疗的监测和/或用于细胞治疗的层化，该细胞治疗利用干细胞和前体细胞的植入以增加缺血组织的灌注和/或用于组织损伤的再生(例如心衰)。本发明还涉及利用适合的迁移分析，分离特异骨髓前体细胞的体外方法。所述的BMPs和/或BDPs可用于心血管疾病的治疗，该心血管疾病选自稳定型冠心病、急性冠状动脉综合征、急性心肌梗塞、慢性缺血性心肌病(ICMP)、扩张性心肌病(DCM)或引起心机能不全的其它因素。

Description

用于诊断骨髓前体细胞(BMPs)和/或血液来源的循环前体细胞 (BDPs)的心血管功能性的体外方法
本发明涉及用于分析与心血管疾病相关的哺乳动物的样品的体外方法，其中所述方法包含以下步骤：a)利用细胞特异表面标志分离骨髓前体细胞(BMPs)和/或血液来源的循环前体细胞(BDPs)，以及b)利用适合的迁移分析检测所分离的BMPs和/或BDPs的心血管功能性。本发明所述方法可作为试剂盒应用于心血管疾病的诊断和/或预后分析，用于该心血管疾病治疗的监测和/或用于预期细胞治疗的分层(stratification)，该细胞治疗利用干细胞和/或前体细胞以增加缺血性组织的灌注或用于组织损伤的再生(例如，心机能不全)。在另一方面，本发明还涉及用于分离特异的骨髓前体细胞(BMPs)和/或血液来源的循环前体细胞(BDPs)的体外方法，包括：a)从哺乳动物供体中采样，b)利用细胞特异表面标志从所获得的样品中分离BMPs和/或BDPs，以及c)利用适合的迁移分析检测所分离的BMP和/或BDP的心血管功能性。根据本发明，这些BMPs和/或BDPs可用于心血管疾病的治疗，并可与其它物质(inter alia)存在于药物组合物中，所述心血管疾病选自稳定的冠心病、急性冠状动脉综合征、急性心肌梗塞、慢性缺血性心肌病(ICMP)、扩张性心肌病(DCM)或引起心机能不全的其它因素。
梗塞后心力衰竭是发病和死亡的主要原因。虽然对闭塞动脉立即再灌注使死亡率显著降低(Lange RA，Hillis LD.急性心肌梗塞中的再灌注治疗(Reperfusion therapy in acute myocardial infarction)N Engl J Med.2002：346：954-5)，但是由梗塞面积的渐进性扩大和左心室腔的扩张表征的心室重塑过程使幸存于急性心肌梗塞的可测定部分患者的心力衰竭的发展(Pfeffer MA，Braunwald E.心肌梗塞后的心室重塑。实验观察和临床证据(Ventricular remodeling after myocardial infarction.Experimentalobservations and clinical implications).Circulation.1990：81：1161-72)。逆转重塑的主要目标是刺激新血管形成以及加强梗塞面积内心肌细胞的再生。
最近的实验和临床研究显示，特异骨髓前体细胞(BMPs)和/或血液来源的循环前体细胞(BDPs)的移植改善了急性心肌梗塞后的再生(参见Kawamoto A，Gwon HC，Iwaguro H，Yamaguchi J1，Uchida S，Masuda H，Silver M，Ma H，Keamey M，Isner JM，Asahara T.内皮祖细胞体外扩增后回输对心肌缺血的治疗潜在性(Therapeutic potential of ex vivo expandedendothelial progenitor cells for myocardial ischemia).Circulation.2001；103：634-7.，Kocher AA，Schuster MD，Szabolcs MJ，Takuma S，Burkhoff D，Wang J，Homma S，Edwards NM，Itescu S.源于人骨髓的成血管细胞对缺血性心肌的新血管形成防止心肌细胞细胞凋亡，减少重塑及改进心功能(Neovascularization of ischemic myocardium by humanbone-marrow-derived angioblasts prevents cardiomyocyte apoptosis，reducesremodeling and improves cardiac function).Nat Med.2001：7：430-6.，FuchsS，Baffour R，Zhou YF，Shou M，Pierre A，Tio FO，Weissman NJ，Leon MB，Epstein SE，Komowski R.自体骨髓的经心内传输增强了猪的慢性实验性心肌缺血的侧枝灌注和局部功能(Transendocardial delivery of autologousbone marrow enhances collateral perfusion and regional function in pigs withchronic experimental myocardial ischemia).J Am Coil Cardiol.2001；37：1726-32.)。因此，利用骨髓干细胞/前体细胞的所述细胞治疗是用于改善缺血性心脏病患者中新血管形成和心功能的新观念。的确，已显示出对急性心肌梗塞患者进行成人前体细胞的冠状动脉内输注是可能的和安全的，以及伴随着局部和总体LV(左心室)功能的显著改进。然而，关于由所述输注引起的具体改进的情况仍然不清楚。另外，对于利用骨髓干细胞/前体细胞的靶向的及有效的细胞治疗，必需保证被移植的骨髓前体细胞(BMPs)和/或血液来源的循环前体细胞(BDPs)显示最高可能的再生能力，从而有效。
因此，本发明的目的是提供改进方法，其用于心血管疾病的诊断和/或预测，用于该心血管疾病治疗的监测和/或用于对预期细胞治疗的分层，所述细胞治疗基于骨髓前体细胞(BMPs)和/或血液来源的循环前体细胞(BDPs)以增加缺血组织的灌注或用于诸如心机能不全的组织损伤的再生。
本发明的另一目的是提供鉴别及分离对所述细胞治疗有效和适合的骨髓前体细胞(BMPs)和/或源于血液的循环前体细胞(BDPs)的安全方法。
最后，本发明的另一目的是提供包含适合所述细胞治疗的，并根据本发明被分离的骨髓前体细胞(BMPs)和/或源于血液的循环前体细胞(BDPs)的药物组合物。
根据本发明第一方面，本发明一个目的是提供了用于分析来自与心血管疾病有关的哺乳动物的样品的体外方法，其中本发明所述方法包含以下步骤：a)利用细胞特异表面标志分离骨髓前体细胞(BMPs)和/或源于血液的循环前体细胞(BDPs)，以及b)利用适合的迁移分析，测定/检测所分离的BMPs和/或BDPs的心血管功能性。
令人惊讶地是，本发明发现存在于新血管形成能力和骨髓前体细胞(BMPs)和/或源于血液的循环前体细胞(BDPs)的迁移能力之间的关系。这使得迁移分析作为有价值的工具，用于分析来自与心血管疾病有关的哺乳动物的样品。
此外，本发明还惊讶地发现在某些供体和/或心脏病发作患者的骨髓中可能存在功能异常，由此，直接从该骨髓中取得的那些细胞(例如，BMPs，通过穿刺)在其能够形成新生血管，以及支持心脏再生的功能方面受到限制。通过本发明的分析，可将这些供体有效地排除，以及同时可鉴别有更高危险的、具有较差的新血管形成能力的患者。随后，可对这些患者进行适当的治疗，特别是，以预防和/或支持的方式进行治疗。可选择地，通过这些分析，也可鉴别更好地受益于前体细胞治疗的患者。
在本发明的上下文中，上述BMPs和/或BDPs的特性可理解为“心血管功能性”。
Vasa等人(参见Vasa M.等人，Circ Res 2001 Ju1 6；89(1)：E1-7)描述了循环内皮前体细胞(EPCs)的数量和迁移活性与冠心病(CAD)危险因素呈反相关。冠心病患者的EPCs显示功能缺损。借助于博伊登室(Boyden-chamber)中的迁移分析(朝作为“化学引诱剂”的VEGF的方向迁移)，根据所述迁移能力，检验所述EPCs的功能性活性。利用源于骨髓的循环前体细胞(EPCs)的参与，发生出生后的新血管形成，该源于骨髓的循环前体细胞来源于由较不成熟细胞的细胞表面标志CD34或CD133表征的造血干细胞。所述CD34+细胞在小鼠模型中的缺血区域克隆。在所述实验中，CD34+细胞的注射促进了新血管形成，以及改善了这些小鼠的心功能。此外，与健康人比较，检验CAD(冠心病)患者体内EPCs的数量和功能性活性，以及危险因子对EPCs的数量和功能性活性的影响。CAD患者中 CD34 + KDR +(＝VEGF受体)双阳性细胞的数量显著地低于健康人，然而，在患者和健康人中，CD34+细胞或较少分化的CD133+细胞的总数是 无区别的。在CAD患者体内，EPCs的迁移能力减少。Vasa等人说明EPCs活性的减少可产生CAD患者体内新生血管形成的减少。然而，没有提及根据对骨髓前体细胞(BMPs)和/或源于血液的循环前体细胞(BDPs)的分析，患者分层的可能性。
此外，Vasa等人(参见Vasa M.et al.，Circu1ation，2001 Jun19；103(24)：2885-90)公开了通过抑制素治疗，稳定性CAD患者体内循环的内皮前体细胞(EPCs)增加。因此，抑制素有利于EPCs导致的新血管形成。应用迁移分析，检测EPCs的功能性活性。然而，没有被提及根据对骨髓前体细胞(BMPs)和/或源于血液的循环前体细胞(BDPs)的分析，患者分层的可能性。
Emerson等人(参见Circulation 2003，107，2294-2302)公开了多潜能干细胞能够分化为心肌细胞和内皮细胞。因此，其可以改善缺血性心脏病患者的心功能和灌注。因此可以检验，骨髓细胞是否可以借助注射导管被安全地注入患者的心肌中。此外还公开了将自体的单个核骨髓细胞直接注射入发展期的冠心病患者的左心室缺血区中。利用密度梯度离心法从骨髓细胞中分离所述前体细胞，以及应用基于不同细胞表面标志的FACS分析将其表征， 但是并不能分离。因此，根据表3的内容，造血前体细胞只是所注入的细胞的较少部分(大约2.5％)，而T细胞、B细胞和单核细胞为主要部分。作为造血前体细胞，分别描述为CD34+CD45lo细胞或者CD133+CD45lo细胞。所述单个核骨髓细胞被检验其“成活力”和“集落形成能力”。将所述骨髓细胞在含有肝素和5％人血清白蛋白的盐水中进行注射。然而，也没有提及根据对骨髓前体细胞(BMPs)和/或源于血液的循环前体细胞(BDPs)的分析，患者分层的可能性。此外，使用的是未被分离的内皮前体细胞，而不是进一步分离的总单个核骨髓细胞。
Kawamoto等人(参见Circulation 2003，107，461-468)公开了来自外周血液的内皮前体细胞(EPCs)可以作为CD34+单个核细胞被分离。在缺血性疾病中，从骨髓中动员EPCs以在开始新血管形成的区域克隆并分化为成熟内皮细胞。因此，检验将前体细胞直接移植进心肌内是否促进了缺血组织的新血管形成。在猪缺血模型中，将自体同源的前体细胞直接注入心肌内增加了新血管形成。此外，人前体细胞被 异源地注入大鼠的心缺血区域中。为此，作为富含EPC的细胞部分，人单个核CD34+外周血细胞被应用。
Aicher等人(参见Circulation 2003，107，2134-2139)公开了在输注大鼠体内后，放射性标记的EPCs在不同组织中形成集落。为此，该出版物描述了系统，其中将 源于健康供体的人EPCs异种移植入大鼠体内，在该大鼠中预先操作性地诱发了梗塞，或者移植入无梗塞的对照大鼠中。未公开EPCs的分离，以及未提及作为CD34+外周血细胞的分类。将细胞培养，即扩增，随后用111indiumoxine放射性标记以能够检验EPCs在输注后，在受体生物体中的分布区域。也检测在放射性标记后，所述细胞的“功能性能力”是否不同于未标记的细胞。应用迁移分析，即，根据所述细胞朝生长因子VEGF方向的迁移检测所述的“功能性能力”。结果显示仅约1％的总注入的细胞在心脏中形成集落。技术人员因此推测EPCs的迁移能力与细胞在靶组织中、也可在梗塞区中的集落形成有关。然而，用 非放射性标记的细胞实施该“质量控制”也是不明显的，特别是在所述出版物中，将非标记的细胞用作 参考。
最后，Wolfrum等人(参见Arterioscler Thromb Vasc Biol 2003，23，729-736)一般性地描述了抑制素对内皮细胞的作用。
优选的是本发明所述方法还包含将所述样品的检验结果与参考值和/或与参比样品的结果进行比较。这样的参考值可能来自所述治疗过程中单独治疗的患者，或者是大规模研究的结果。通常，参考值来源于所谓的健康对照组。本领域所属技术人员能够容易地选择适合的研究方案以获得适合的参考值。
本发明所述方法中，所述欲检验的样品优选地来源于人。由此，欲检验的所述样品可选自骨髓、外周血液或其部分、以及细胞培养悬液或其部分。所述个体样品的选择依赖于欲检验的所述前体细胞的种类和用于测定该前体细胞特征的所述方法。还优选地，在血液收集时，将抗凝剂，特别是肝素或EDTA加入到外周血液中。这使其它的处理步骤变得容易。本发明另一方面中，利用穿刺从骨髓中获得欲检验的所述样品。该收集是获得BMP的基础。本发明的另一处理方法可包含通过应用密度梯度离心法和/或诸如免疫磁性法的免疫学方法、特别是通过应用FACS的分离。因此，根据本发明，还优选的是BMP的选择性特异表面标志，其选自CD34、CD45和/或CD133，以及BDP的特异表面标志选自VEGFR2、CD105、vWF和/或CD31。
根据本发明的优选方法，所述迁移分析是在博伊登室或其改良形式中实施的。然而，对于所属技术人员显而易见的是可在不偏离本发明的范围内，使用能测定所述迁移能力的其它方法。特别是，涉及所述迁移分析的实施方案适合所述分析的自动化和/或适合“现场即时”分析的实现。
本发明所述方法中，所述迁移分析特别优选地通过将SDF-1或VEGF作为BMP或BDP的化学引诱剂来实施。如所附实施例所示，SDF-1是用于BMP的优选刺激剂，以及VEGF是用于BDP的优选刺激剂。也可使用PlGF或MCP-1。
Voermans等人(参见Voermans C，et al.Exp Haematol 2001Dec；29(12)：1456-64)公开了SDF-1在诱导造血前体细胞(CD34(+)细胞)迁移中的作用以及各自迁移分析。
细胞治疗成功的先决条件是所谓的“回巢(homing)”，即细胞的定向迁移以在期望的靶区中形成集落，特别是，在选择血管内的给药途径的情况下。因此，发明人认为成年前体细胞朝其生理学的化学引诱剂方向的迁移能力可反映其迁移至梗塞区域内的能力。的确，由人前体细胞的静脉内输注诱导的移植的细胞迁移入受侵袭组织内，以及新血管形成的改善与SDF-1诱导的BMP迁移能力以及VEGF诱导的BDP迁移能力紧密相关。然而，这些仍然是未证实的假设，该假设仅在本发明中实施的实验中被证实。此外，出乎意料的是所述迁移能力作为独立的预测因素是如此地适当，使得据此的诊断学改进了CAD治疗。总之，与所注入的前体细胞的功能性活性相关的局部收缩性心肌功能的改善公开了前体细胞的迁移能力与用于急性心肌梗塞患者的细胞治疗的成功之间存在因果关系。因此本发明公开了新诊断方法，该方法使心血管疾病患者的细胞治疗的改进/最佳化变得可能。根据前体细胞功能性活性的测定，所述方法能够作出可靠的预测，预测所述个体是否得益于用于受损心肌组织的再生的细胞治疗(自身前体细胞的移植)，或者该治疗是否最有可能不成功，因为所述细胞具有不足以克隆到所述靶组织的能力。
本发明所述方法可总是用于所有心血管疾病的诊断和/或治疗，从前体细胞的移植中获得治疗益处。优选地，本发明所述方法中，所述心血管疾病选自稳定的和不稳定心绞痛、稳定的冠心病、急性冠状动脉综合征、心肌梗塞、急性心肌梗塞、急性心脏综合征、冠心病、慢性缺血性心肌病(ICMP)、扩张性心肌病(DCM)或心机能不全的其他因素。
根据本发明另一方面，可在细胞输注所述哺乳动物之前，立即实施本发明所述方法。如上文所述，通过本发明所述分析，可有效地排除那些供体，以及可同时鉴别有较高危险的、显示较差的新血管形成能力的患者。随后可对这些患者进行适当地治疗，且特别是预防性的和/或支持性的治疗。可选择地，也可通过该分析鉴别能够从前体细胞治疗中获得增加的益处的患者。本发明所述方法的另一方面涉及了治疗，其中对于欲治疗的所述患者，特别是所述哺乳动物，所检验的分离的BMP和/或BDP是自体同源的和/或异源的。
本发明另一方面涉及了诊断试剂盒，其除了用于实施本发明所述方法的工具外，还包含适合的组分和/或赋形剂。所述试剂盒可由一个或多个分离的容器组成。特别是，所述适合的组分可以是手册或是比色图，用于比对基于参考值的测量结果。
根据本发明，所述试剂盒优选地用于心血管疾病的诊断和/或预后，用于该心血管疾病治疗的监测和/或用于预期性细胞治疗的分层，该细胞疗法利用干细胞和前体细胞以改善缺血组织的灌注或用于诸如心机能不全的组织损伤的再生。
本发明另一方面还涉及用于分离特异的骨髓前体细胞(BMPs)和/或源于血液的循环前体细胞(BDPs)的体外方法。其中所述方法包含步骤a)从哺乳动物供体中获得样品，b)利用细胞特异表面标志，从所获得的样品中分离(BMPs)和/或(BDPs)，以及c)利用适合的迁移分析，测定所分离的BMPs和/或BDPs的心血管功能性。根据本发明，优选的是欲检验的样品来源于哺乳动物，特别是人。
如上文所述，本发明所述方法可应用来自供体的所有干细胞和前体细胞种群，与所述样品的获得方式无关，其中预计该细胞种群包含适合的BMPs或BDPs。优选地，本发明所述方法中，欲检验的所述样品选自骨髓、外周血液或其部分、以及细胞培养悬液或其部分。特别优选的是本发明的方法中，欲检验的所述样品以适当的方式得自骨髓。欲检验的所述样品优选地利用穿刺从骨髓中获得。
因为在收集过程中获得的主要是不同前体细胞的异源混合物的事实，本发明的优选方法包含利用密度梯度离心法和/或免疫学方法的分离。用于分离的特别优选方法是通过应用FACS或免疫磁性分离实施的，其中所述细胞特异表面标志，对于BMP可选自CD34、CD45和/或CD133，以及对于BDP可选自VEGFR2、CD105、vWF和/或CD31。
如上文所述，在本发明另一方面中，所述迁移分析是在博伊登室或其改良(见上文)中实施的。以及在此情况中，用于所述迁移分析的化学引诱剂优选为SDF-1、VEGF、PlGF或MCP-1。
本发明的基本方面是测定得自具体供体的前体细胞的心血管功能性。利用本发明所述方法获得了关于所获得的前体细胞对所述细胞治疗的实用性和有效性的发现，以此发现为基础，可调节该疗法以适应个别患者。如上文已经表明的，认为在特别供体或患者，特别是ICMB患者的骨髓中，存在着影响所述前体细胞的心血管功能性的机能障碍。为了能够“补偿”这些具体情况中损伤，另一方面，本发明提供了方法，其中所分离的BMPs和/或BDPs被进一步地遗传修饰以改进所述细胞的心血管功能性。用于遗传修饰BMPs和/或BDPs的方法，以及合适的遗传构建体是所属技术人员公知的，并可由该技术人员容易地制备和应用。在某些患者中，心血管功能性损伤的确切的遗传机制依然是未知的，然而本发明的实验得到源于这些供体的所述前体细胞的迁移是受损的结果。为了弥补这些损伤，解决途径是利用那些对各自的化学引诱剂特异的受体(特别是，对BMP的SDF-1，以及对BDP的VEGF)转染所述前体细胞。因此，一个途径是利用CXCR4表达构建体或影响CXCR4调节的构建体，转染BMP，从中认为受损的BMPs中存在下调。另一途径是诸如CD49或其它因子的整合素(integrins)的修饰，该整合素与诸如VCAM-1或其它因子相互作用。
另一方面还涉及利用本发明上述方法产生的特异骨髓前体细胞(BMP)或源于血液的循环前体细胞(BDP)。本发明的这些特异骨髓前体细胞(BMP)或源于血液的循环前体细胞(BDP)可作为对于所述哺乳动物/患者(即各自的受体)自体同源的(自身)和/或异源的(外来)分离的BMPs和/或分离的BDPs存在。自然地，细胞混合物也是可能存在的。
如上文所述，所分离的BMPs和/或BDPs可用于所述细胞治疗的情况。因此本发明的另一方面涉及用于产生药物组合物的方法，该方法首先包含如上所述的本发明的方法，以及还包含通过与常规的药物可接受载体和/或稀释剂的混合，配制该药物组合物。各自适合的载体和/或稀释剂是所属领域技术人员所公知的，并可非常容易地适合各自的特定应用。优选地，在先前植入的支架以外，注入所述前体细胞。
本发明另一方面还涉及根据本发明所产生的药物组合物。本发明的所述制剂还可存在与其它的药物活性物质的混合物形式。因此，优选地，所述物质选自阿司匹林、氯吡格雷、ACE-抑制剂、β-受体阻断剂、抑制素、特别是阿伐他汀、促红细胞生成素和/或VEGF。其它物质也是可能的，只要其不对所给药的前体细胞的心血管功能性产生负面影响。
最后，本发明涉及了本发明的特异BMP和/或BDP或本发明的药物组合物在心血管疾病治疗中的应用，该心血管疾病选自稳定的和不稳定心绞痛、稳定的冠心病、急性冠状动脉综合征、心肌梗塞、急性心肌梗塞、急性心脏综合征、冠心病、慢性缺血性心肌病(ICMP)、扩张性心肌病(DCM)或心机能不全的其它因素。因此优选地，本发明的应用中，所述治疗包含将细胞输注所述哺乳动物体内。因此，如上所述，也可进行其它药物活性物质的给药，特别优选的是所述治疗还包含抑制素、特别是阿伐他汀、VEGF和/或促红细胞生成素的给药。
最近，本发明人实施的实验显示CAD患者的所述前体细胞的迁移能力与在后肢缺血的裸鼠中移植后的新血管的改善是非常密切相关的(r＝0,783；p＝0,001；n＝11)。因此，在将所述前体细胞冠状动脉内注入急性心肌梗塞患者体内之前即刻，发明人关注检测所移植的前体细胞的迁移能力，使所移植的前体细胞的功能特征与4个月后产生效果的定量结果相关联。该结果表明，注入的前体细胞的迁移能力预示LV心室泵功能的改善，以及梗塞大小的减少，提示在所述前体细胞的迁移能力与细胞治疗后患者体内的心功能再生之间有因果关系，该患者患有心肌损伤的急性心肌梗塞。
因此本发明第一次表明所移植的前体细胞的功能性能力是后来的区域左心室功能改善的主要的独立性决定因素，其预示冠状动脉内细胞移植后梗塞面积的减少。有趣的是，通过其迁移活性测定的所述细胞的功能性活性比所述细胞计数更具有信息性。总之，这些数据第一次公开了在前体细胞治疗与心肌损伤后患者中的左心室泵功能的改善/心室再生之间有因果关系。
先前的实验性检验表明在实验性诱导心肌梗塞后由于刺激的新血管生成产生的所述心室功能的改善，该新血管生成通过增加的心肌血流量、休眠心肌的复苏、心肌纤维化的减少以及在梗塞周围区域中减少的肥大肌细胞细胞凋亡作用的降低，导致了后来的心肌重塑(参见Kawamoto A，Gwon HC，Iwaguro H，Yamaguchi J1，Uchida S，Masuda H，Silver M，Ma H，Kearney M，Isner JM，Asahara T.体外扩增后回输的内皮祖细胞对心肌缺血的治疗潜在性(Therapeutic potential of ex vivo expanded endothelialprogenitor cells for myocardial ischemia).Circulation.2001；103：634-7.，Kocher AA，Schuster MD，Szabolcs MJ，Takuma S，Burkhoff D，Wang J，Homma S，Edwards NM，Itescu S.源于人骨髓的成血管细胞对缺血心肌的新血管形成防止心肌细胞的细胞凋亡，减少重塑及改善心功能(Neovascularization of ischemic myocardium by humanbone-marrow-derived angioblasts prevents cardiomyocyte apoptosis，reducesremodeling and improves cardiac function).Nat Med.2001：7：430-6.，Takahashi T，Kalka C，Masuda H，Chen D，Silver M，Keamey M，Magner M，Isner JM，Asahara T.用于新血管形成的骨髓来源的内皮祖细胞的缺血性和细胞因子诱导的动员(Ischemia-and cytokine-induced mobilization ofbone marrow-derived endothelial progenitor cells for neovascularization).Nat Med.1999：5：434-8.，Murohara T，Ikeda H，Duan J，Shintani S，Sasaki K，Eguchi H，Onitsuka I，Matsui K，Imaizumi T.移植的源于脐带血的内皮前体细胞增加了出生后的新血管形成(Transplanted cord blood-derivedendothelial precursor cells augment postnatal neovascularization).J ClinInvest.2000：105：1527-36.)。另外据报道，BMPs的心肌内注射导致了显著数量的收缩心肌的再生，这表明成人前体细胞的局部给药后，心肌的新增殖可改善心急梗塞的后果。的确，本发明人最近证明BDPs仍保持了其转分化成功能性心肌细胞的能力(参见Badorff C，Brandes RP，PoppR，Rupp S，Urbich C，Aicher A，Fleming I，Busse R，Zeiher AM，Dimmeler S.血液来源的成人内皮祖细胞转分化成功能上有活性的心肌细胞functionally active cardio myocytes(Transdifferentiation of blood-derivedhuman adult endothelial progenitor cells into functionally activecardiomyocytes.)Circulation.2003：107：1024-32.)。BMPs也如此(参见OrlicD，Kajstura J，Chimenti S，Jakoniuk I，Anderson SM，Li B，Picket J，McKayR，Nadal-Ginard B，Bodine DM，Leri A，Anversa P.骨髓细胞使梗塞的心肌再生(Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium).Nature.2001；410：701-5.)。
显然，本研究未能公开前体细胞治疗后发生的与左心室重塑进程的改善相关的细胞机制。然而，对后肢缺血患者实施的最近的研究表明将前体细胞肌内注射进腓肠肌导致在后肢灌注的显著改善(参见Tateishi-Yuyama E，Matsubara H，Murohara T，Ikeda U，Shintani S，MasakiH，Amano K，Kishimoto Y，Yoshimoto K，Akashi H，Shimada K，Iwasaka T，Imaizumi T.通过骨髓细胞的自体同源移植，对肢体缺血的患者进行治疗性的血管生成；初步研究及随机对照试验(Therapeutic angiogenesis forpatients with limb ischaemia by autologous transplantation of bone-marrowcells；a pilot study and a randomised controlled trial.)Lancet.2002；360：427-35)。与前体细胞的冠状动脉内注入与所述靶区中灌注指数的改善是相关的事实一致，这些数据显示所述前体细胞在梗塞面积内的集落形成可导致改善的新血管形成，这可导致LV扩张的减少，以及通过休眠心肌的复苏、心肌纤维化的减少、及所述梗塞周围区域中细胞凋亡作用的减少维持了收缩性能。另外，植入的前体细胞不仅可以释放许多血管生成生长因子，由此扩大了梗塞边缘带中内源性新血管形成进程，而且其释放了吸引循环的或组织停留的心脏前体细胞的因子，由此扩大了所述心肌的内源性修复机制。最后，虽然注入的前体细胞的数目不预示随后的功能性改善，但是我们不能排除此可能性：停留的前体细胞可能分化成功能上有活性的心肌细胞，这导致显著数量的收缩心肌的再生。在实验性研究中，收缩性细胞与非收缩性细胞之间的移植比较显示，所述心室收缩的改善特异地依赖于收缩性细胞，然而所述心室扩张的改善独立于细胞类型。(参见Hutcheson KA，Atkins BZ，Hueman MT，Hopkins MB，Glower DD，Taylor DA.利用骨骼肌成肌细胞及成纤维细胞的心肌细胞成形对心肌性能的益处比较(Comparison of benefits on myocardialperformance of cellular cardiomyoplasty with skeletal myoblasts andfibroblasts).Cell Transplant.2000；9：359-68.，Sakai T，Li RK，Weisel RD，Mickle DA，Jia ZQ，Tomita S，Kim EJ，Yau TM.胎儿细胞移植：三种细胞类型的比较(Fetal cell transplantation：a comparison of three cell types.)JThorac Cardiovasc Surg.1999；118：715-24.)。在本研究中，所述收缩功能显著地改进，这与源于骨髓的成血管细胞移植后的所述实验结果一致(参见Kocher AA，Schuster MD，Szabolcs MJ，Takuma S，Burkhoff D，Wang J，Homma S，Edwards NM，Itescu S.源于人骨髓的成血管细胞的缺血心肌的新血管形成防止心肌细胞的细胞凋亡、减少重塑及改善心功能(Neovascularization of ischemic myocardium by humanbone-marrow-derived angioblasts prevents cardiomyocyte apoptosis，reducesremodeling and improves cardiac function.)Nat Med.2001：7：430-6.)。
总之，本发明公开了以前体细胞的迁移能力为主要的和独立的决定因素，预测细胞治疗后，成人前体细胞的冠状动脉内注入后，功能性的改进及梗塞面积的减少。此外，本发明能够改善移植前成人前体细胞的功能性能力，以进一步改善缺血性损伤后心脏的再生。
本研究的所述数据进一步显示，从缺血性心肌病患者的骨髓中分离的单个核细胞展示了其在支持裸鼠体内新血管形成方面显著减少的活性，该新血管形成是在间断后肢缺血的诱导后发生的。因此，通过测定其集落形成活性及其对SDF-1的迁移反应，分离自ICMP患者的BMP的功能性能力是显著减少的。这些来自ICMP患者的BMPs在后肢缺血的小鼠体内的注入显示了在股动脉的单侧结扎后，其显著减少的重建后肢灌注的能力。因此可推断减少的功能性活性限制了来自ICMP患者的BMPs的新血管形成的潜在性。来自ICMP患者的BMPs的功能缺损也可限制其对医学细胞治疗的治疗潜在性，特别是，如果使用血管内给药途径，这要求所述前体细胞针对化学引诱剂的梯度从血管中溢出，以迁移进缺血组织内。在所述治疗前，前体细胞的迁移及集落形成活性的监测可作为替代者来鉴别从所述细胞治疗中获得更大收益的患者。在其它方面，最近的实验性研究表明，来自健康供体小鼠的全功能性BMPs可重建在损伤的新血管形成的小鼠模型中的年龄相关的宿主心脏的血管发生。因此，吸引人的是推测在输注前对功能性损伤的BMPs进行药理学或基因操作可改善其功能性活性，并随后改善患者从所述治疗中获得的治疗性益处。
参考附图，通过以下实施例对本发明做了进一步描述。然而并不限于以下实施例。在附图中，
图1显示定量左心室血管造影术，其显示了接受血液来源的循环前体细胞(BDP)或骨髓来源的前体细胞(BMP)患者、以及非随机对照组的患者，在基线及追踪观察时的射血分数(A)、收缩期末的和舒张期末容积(B)。
图2利用对全部研究组的回归线，显示了基线的左心室射血分数与射血分数的改善之间的相关性。
图3显示患者的功能性改进及梗塞大小减少的平均值，其说明具有较低或较高迁移能力的前体细胞。
图4显示对BMP中前体细胞标记物的流式细胞分析，该BMP来自健康对照组和患有稳定的缺血性心肌病患者。a-c，在所述两组之间未观察到明显差别。以及
图5显示来自健康对照组和患有稳定的缺血性心肌病患者的BMPs的功能性活性。a，14天后测定的集落(克隆)形成单位/5×105BMPs。b，BMPs响应间质细胞衍生的因子1(SDF-1)的迁移能力。以及c，应用BioCoat侵入分析，测量血管内皮生长因子(VEGF)。d，SDF-1诱导的迁移与集落形成能力之间的相关性。以及e，VEGF诱导的迁移与集落形成能力之间的相关性。
                           实施例
患者
所述研究包括18岁至75岁的患者，如果患者有首次急性ST段升高的心肌梗塞，该心肌梗塞通过用GPIIb/IIIa封闭的冠状支架被急性处理。淘汰标准是存在心源性休克(限定为收缩压＜80mmHg，这需要静脉内压力机或主动脉内气囊反向搏动，balloon-antipulse)、急性再灌注处理后需要输血的大出血、白血球减少症史、血小板减少症、肝或肾功能不全、恶性疾病的迹象或不愿意参与者。德国法兰克福的法兰克福大学的大学医院(Universitaetsklinikun)伦理委员会认可了实施的所述研究方案，且所实施的研究符合赫尔辛基宣言。每个患者都签署了知情同意书。
因为内部参照组反映了医院提供的护理标准，选择与研究人群的射血分数、梗塞位置及梗塞大小相匹配的15名患者，通过支架植入实施急性再灌注治疗，并获得急性的和4个月后追踪观察的成对的LV-血管造影照片。
实施的研究方案
早期公开了所述研究方案(参见Assmus B，Schachinger V，Teupe C，Britten M，Lehmann R，Dobert N，Grunwald F，Aicher A，Urbich C，MartinH，Hoelzer D，Dimmeler S，Zeiher AM.祖细胞的移植和急性心肌梗塞中再生增强(Transplantation of Progenitor Cells and Regeneration Enhancementin Acute Myocardial Infarction)(TOPCARE-AMI).Circulation.2002；106：3009-17.)。简而言之，将患者随机分组，以在AMI 4天后，接受骨髓前体细胞(BMP)和/或血液来源的循环前体细胞(BDP)的冠状动脉内输注。
在细胞移植的当天早晨，从接受骨髓前体细胞的患者体内获得50ml骨髓抽吸物。经密度梯度离心获得源于骨髓的单个核细胞(BMCs)。两次洗涤步骤后，将所述细胞再混悬在10ml X-vivo 10培养液(Biowhittaker)中。所述细胞混悬液由异源细胞群组成，该异源细胞群除造血前体细胞之外，还含有其它细胞类型(例如侧种群细胞、基质细胞等等)，通过FACS分析，应用针对抗人CD34(FITC，Becton Dickinson)、抗CD45(BectonDickinson)，CD14(BD Pharmingen，圣地亚哥，美国)，CXCR4(BDPharmingen)，CD49d(BD  Pharmingen)和CD 133(Miltenyl Biotech，Bergisch Gladbach，DE)的直接结合的抗体，测定该造血前体细胞。总体上，每一个患者被注入平均值是5.5±3.6×106的CD34/CD45阳性细胞(在219±82×106单个核细胞中)。
在接受血液来源的循环前体细胞(BDP)的患者中，随机分组后，立即收集250ml静脉血(所述AMI后24小时)。将单个核细胞混悬在X-vivo-15培养液(Biowhittaker，Apen，DE)中，该培养基含有1ng/ml无载体的人重组体VEGF(R&D，Wiesbaden，DE)、0.1μM阿伐他汀(辉瑞，Freiburg，德国)和20％的取自每一个体患者的人血清。以6.4×105细胞/mm2的密度将所述细胞接种在纤维结合蛋白包被的平皿(Roche，Grenzach，DE)。培养三天后，用0.5mM EDTA洗掉所述细胞，洗涤两次，然后将该细胞再混悬在终容积为10ml的X-vivo 10培养液中。所得的细胞混悬液(所注入的细胞的平均值为17±12×106)含有异源的前体细胞群。然而，大于90％的所述细胞显示了内皮特征，这是通过Dil-乙酰化LDL摄取、凝集素的结合以及典型的内皮标记蛋白的表达显示的，该内皮标记蛋白包括VEGFR2(KDR)(ReliaTech，Braunschweig，DE)、内皮糖蛋白(CD105)(NeoMarkers，Asbach.DE)血管假性血友病因子(vWF)(致癌基因，Schwalbach，DE)以及血小板内皮细胞粘附分子-1(PECAM-1/CD31)(参见Dianova，Hamburg；Assmus B，Schachinger V，Teupe C，Britten M，Lehmann R，Dobert N，Grunwald F，AicherA，Urbich C，Martin H，HoelzerD，Dimmeler S，ZeiherAM.祖细胞的移植和急性心肌梗塞中再生增强(Transplantation of Progenitor Cells and Regeneration Enhancement inAcute Myocardial Infarction)(TOPCARE-AMI).Circulation.2002；106：3009-17.，Dimmeler S，Aicher A，Vasa M，Mildner-Rihm C，AdierK，Tiemann M，Rutten H，Fichtlscherer S，Martin H，Zeiher AM.HMG-CoA还原酶抑制剂(抑制素)经PI 3-激酶/Akt途径增加内皮祖细胞(HMG-CoAreductase inhibitors(statins)increase endothelial progenitor cells via the PI3-kinase/Akt pathway)J din Invest.2001；108：391-7.，Vasa M，FichtlschererS，AicherA，AdIerK，Urbich C，Martin H，Zeiher AM，Dimmeler S.循环内皮祖细胞的数量和迁移活性与冠心病危险因素呈反相关(Number andmigratory activity of circulating endothelial progenitor cells inverselycorrelate with risk factors for coronary artery disease)Circ Res.2001；89：E1-7.，Vasa M，Fichtlscherer S，Adier K，AicherA，Martin H，ZeiherAM，Dimmeler S.通过对稳定的冠心病患者进行抑制素治疗，使循环内皮祖细胞增加(Increase in circulating endothelial progenitor cells by statinstherapy in patients with stable coronary artery disease)Circulation.2001，-103：2885-90.)。
经支架内突出的、在金属丝上面的气囊式导管将所述细胞注入，该支架是在急性期方法的过程初期植入的。并且用低压膨胀该气囊以完全封闭血流3分钟，从而使所述内皮组织产生对所注入的细胞的粘附和潜在游移。该操作重复三次以输注总共10ml前体细胞，通过所述气囊的放气来回流3分钟分开每次的操作，并使局部缺血扩大最小化。随着冠状动脉内细胞移植的完成后，重复冠状动脉血管造影以确定血管的开放和造影剂的无限制性流动。
测定移植的前体细胞的迁移能力
在冠状动脉内细胞输注之前，将前体细胞样品立即再悬浮于500μl内皮-基础培养液中(EBM，细胞系统)，计数，然后将2×104细胞置于改良的博伊登室的上室内。接着，将该述室置于24孔培养板中，该培养板含有EBM，以及用于测量循环的血液来源的细胞的迁移能力的50ng/ml VEGF或者用于测量骨髓来源的前体细胞的迁移能力的100ng/mlSDF-1。在37℃下孵育24小时后，用PBS洗涤所述过滤器的底面，以及用2％多聚甲醛固定。为了测量，用DAPI将细胞核染色。由盲检者在5个随机显微视野中人工计数迁移至下室的细胞(Vasa M，Fichtlscherer S，Aicher A，AdIer K，Urbich C，Martin H，Zeiher AM，Dimmeler S.与冠心病风险因素呈反相关的循环内皮祖细胞的数目和迁移活性(Number andmigratory activity of circulating endothelial progenitor cells inverselycorrelate with risk factors for coronary artery disease.Circ Res.2001；89：E1-7.，Asahara T，Takahashi T，Masuda H，Kalka C，Chen D，Iwaguro H，Inai Y，Silver M，Isner JM.通过对骨髓来源的内皮祖细胞的动员，VEGF参与出生后的新血管形成(VEGF contributes to postnatalneovascularization by mobilizing bone marrow-derived endothelialprogenitor cells)Embo J.1999；18：3964-72.)。
集落形成单位的分析
将BMPs(1×105/皿)接种在包含干细胞因子、G-CSF、GM-CSF、白介素-3，白介素-6(细胞系统，St.Katharinen，德国)的甲基纤维素培养板上(Methocult GF H4535)。在相差显微镜检查法下检测该培养板，经孵育14天后，由两位不同的研究者计数粒细胞-巨噬细胞(CFU-GM；集落)的集落形成单位。
左心室血管造影术
根据标准记录指南获得LV血管造影照片。应用面积-长度-方法，计算LV射血分数和射血容积(参见Dodge HT Sh，Ballew DW，et al.用于测量人左心室容积的双平面摄心血管造影术的应用(The use of biplaneangiography for the measurement of left ventricule volume in man).EurHeart J.1960；60：762-776.)，以及应用中心线-弦(chord)-方法测定心室壁的区域运动(参见Sheehan F，Bolson E，Dodge H，Mathey D，Schofer J，WooH.用于表征区域心室功能的中心线方法的优点和应用(Advantages andapplications of the centreline method for characterizing regional ventricularfunction)Circulation.1986；74：293-305.)。
统计分析
连续变量以平均值±SD给出。用卡方(Chi-Square)检验或Fischer’s精确检验比较分类变量。应用配对信号检验，以非参数的方式进行原始的和追踪的数据之间的统计比较。应用Spearman相关计算线性的非参数相关性。应用线性的回归模型进行多变量分析。如果p＜0.05，则认为有统计显著性。应用SPSS(11.0版，SPSS Inc.)实施所有的统计分析。
表I中显示了所述研究人群的人口统计学、临床及血管造影特征。任何基线参数中无显著差别。
前体细胞治疗对LV功能的作用
图1和表I显示了冠状动脉内前体细胞输注之前和4个月之后，LV射血分数、收缩末期和舒张末期LV容积。前体细胞的移植与LV射血分数的显著改善(49.2±10％提高到58.3±10％，p＜0,001，图1A)以及LV收缩末期容积的显著减少(55.2±18ml减少到44.1±19ml，p＝0.009，图1B)是相关的，与所注入的细胞类型无关。区域心室壁运动的详细分析产生了邻近梗塞中央区的边缘区域中最显著的改善(表2)。
与此相反，在未接受前体细胞输注但是以其它方式被同时处理的参照组患者中，没有检测到显著变化(图1和表2)。因此，尽管有相似的起始值，但是四个月后，在所述参照组中，总体LV射血分数的改善是非常低的(p＝0.024)以及收缩末期LV容积相对增加(p＝0.002)。
在所述前体细胞治疗的患者中LV功能的改善是用超声波心动图证实的，以及那些在间断追踪观察12个月的患者中，维持该LV功能的改善(BDP n＝14，BMP n＝10)。在追踪观察期间，这些患者中没有一人发生任何恶性心率失常。
图2显示在基线LV射血分数与4个月追踪观察期间所述射血分数的改善之间存在着严格的负相关。这表明由于所述射血分数的改善，那些有LV功能最严重缺损的患者获得最大的收益，这与所注入的细胞类型无关。用MRI测量前体细胞治疗对梗塞大小的作用
那些接受一系列初期MRI及4个月追踪观察的26名患者在LV射血分数的改善(50.7±8％至60.5±8％，p＜0.001)或收缩末期LV容积的减少(53.7±17ml至40.8±15ml，p＜0.002)方面，与所述全部研究没有不同。重要的是，冠状动脉内前体细胞输注将扩张晚期的容积从39.3±34ml显著减少到31.6±28ml，p＜0.038，这表示梗塞大小的显著减少。此外，在接受BDP患者和接受BMP患者之间的比较中无显著差别。
移植的前体细胞的数量和迁移能力
如果使用总细胞计数或亚型(例如，CD34/CD45或CD34/CD133阳性细胞)，所注入的前体细胞的绝对数与总体或区域LV功能的改善或梗塞大小的减少不相关(总射血分数为：BDP：r＝-0.73，p＝0.2；BMP：r＝-0.147，p＝0.517；梗塞大小为：BDP：r＝-0.187，p＝0.5；BMP：r＝-0.084，p＝0.776)。将所述细胞计数划分为两部分时，在功能改善中未发现显著差别。
与此相反，将所述前体细胞迁移能力在平均值分为高于和低于平均值两部分时，与接受具有较低迁移能力的前体细胞的患者相比较，在接受具有高迁移能力的细胞的患者中，显示了区域LV功能的显著改进，该显著改进是通过梗塞区边缘区中定量的LV血管造影术显示的(图3)。如图3所示，与接受具有较低迁移能力的前体细胞的患者比较，在接受具有高迁移能力的细胞的患者中，晚期扩张的绝对减少是显著升高的。
然而，在所述细胞移植前，两组间在起始线的所述临床变量和所述功能参数，例如，总LV射血分数、LV舒张末期和收缩末期容积或区域的LV功能都没有差异(表3)，因此这排除了所述疾病的严重性对基线上细胞迁移活性的任何可能的作用。
对功能改善及梗塞大小减少的独立预测因子的多变量分析
为了在前体细胞冠状动脉内输注进急性心肌梗塞患者的梗塞动脉后，鉴别影响所述功能改善及梗塞大小减少的独立预测因子，本发明人实施了包括所有参数的多变量分析，该参数经单变量分析在统计学上是显著的或几乎显著的，或者从中可公知它们会影响LV功能或梗塞大小。如表4A所示，所移植的前体细胞的迁移能力依然是影响梗塞大小减少的、最强的统计学显著的独立预测因素，该梗塞大小是通过扩张晚期容积的减少测量的。其它预测因素只是基线射血分数，然而梗塞的原始大小和年龄、性别或血管再形成的时间都不是独立预测因素。同样地，如表4B中概述的，所述迁移能力也独立地预示着局部LV功能改进。因此，所注入的细胞的迁移能力是在对急性心肌梗塞患者前体细胞治疗后，影响功能改善和梗塞面积减少的主要的独立决定因素。
BMPs的数量和迁移能力
利用18名有ICMP患者和8名志愿者的骨髓抽吸物，对BMPS的特征和功能性活性进行检验。表5描述了研究人群的基线特征。
为了检验与全部对照比较，与ICMP患者的BMPs相关的前体细胞的数量是否减少，测定以标记蛋白CD34的表达为特征的造血前体细胞的数量。在健康对照组和患有ICMP患者中，CD34+/CD45+的数量是相似的(图4)。另外，在两组之间，定义为CD133+/CD34+细胞以及未指定的系阴性(line-)/CD34+的造血前体细胞未成熟亚型没有差别(图4)。
通过测量所述集落形成及迁移活性，另外测定了骨髓抽吸物中前体细胞的活性。有趣的是，与来自健康对照组的BMP比较，来自患有ICMP患者的BMPs显示了显著减少的集落形成单位数量(37.3±25.0 CFU-GM/皿对113.8±70.4 CFU-GM/皿，p＝0.009)(图5a)。与来自健康对照组的BMPs比较，患有ICMP患者的BMPs中，对SDF-1和VEGF的迁移反应也是显著减少的(VEGF：34±24.2对54.8±29.3细胞/显微视野；p＝0.027；SDF-1：46.3±26.2对108.6±40.4细胞/显微视野；p＝0.001)(图5b和5c)。相应的，所述集落形成能力与对SDF-1的迁移反应是紧密相关的(r＝0.65；p＜0.001)(图5d)。
BMPs功能性活动的独立预测因子
SDF-1诱导的迁移，但是不是基础迁移或者VEGF诱导的迁移与后肢缺血模型中新血管形成的功能性改进相关(r＝0.78；p＜0.001)(图6)。BMP的集落形成活性也与所述细胞的新血管形成活性显著相关(r＝0.74；p＜0.001)。所述患者的不同的临床基线特征也与BMPs在后肢缺血的小鼠模型中的疗效相关(表6，左栏)，但是当所述分析限于ICMP患者时，除了SDF-1诱导的迁移外，所有的变量没有统计显著性(表6，右栏)。
为了预测如上所述的BMPs制剂的新血管形成的功能性改进的阈值，根据SDF-1和VEGF的作用，测定示例性潜在的阈值并产生以下的值：
表A：BMPs的迁移
 SDF迁移(×1000)   VEGF迁移(×1000)
  N   有效的  82   83
  不足的  253   252
  中值  70.2500   43.0000
  百分点
  25  38.1250   22.0000
  33.333  47.6667   25.0000
  50  70.2500   43.0000
  66.666  104.0000   78.2500
  75  120.7500   96.0000
所述数字表明24小时内，使用的500.000个细胞中有多少个细胞游走。因此，100×1000意味着20％细胞游走。
为了预测如上所述的BDPs制剂的新血管形成的功能性改进的阈值，根据VEGF的作用，测定示例性潜在的阈值并产生以下的值：
表B：BDP的迁移
  VEGF迁移(×1000)
  N   有效的   120
  不足的   215
  中值   4.8500
  百分点
  25   2.2250
  33.333   2.8667
  50   4.8500
  66.666   7.7667
  75   10.7000
根据利用SDF-1试验的中值，由此BMP的可接受的(优选的)阈值是70×1000移行的细胞(即大约14％)。根据利用VEGF试验的中值，由此BMP的可接受的(优选的)阈值是43×1000移行的细胞(即大约8.6％)。
相反，根据利用VEGF试验的中值，由此BDP的可接受的(优选的)阈值是4.85×1000移行的细胞(即大约1％)。
尽管事实上并非所有的细胞群体都相同地迁移，但是根据所有细胞的总体迁移，因此可获得关于以下事实的信息：所述患者体内的细胞是如何迁移的，以及这些细胞是否合适。
表1：研究人群的人口统计学、临床及血管造影特征
  BDP组   BMP组   对照组(非随机化的)   P值
  n＝23   n＝23   n＝15   无显著性(n.s.)
  年龄(岁)男性(％)   50±1087   52±1086   54±1380   n.s.n.s.
  高血压(％)高脂血症(％)糖尿病(％)吸烟者(％)包装年KHE家族史(％)   577178332±2426   4860279135±2350   6080773n.b.40   n.s.n.s.n.s.n.s.n.s.n.s.
  KHE(1/2/3血管病％)KHE史(％)梗塞面积(前面/下面)(％)梗塞的血管(％)LADLCXRCAPTCA初期治疗/支架(n)新血管形成时间(平均值/中值)TIMI III流动后再灌注(％)射血分数(视觉地评定)   74/26/0065/356122179117±27/48743±11   59/41/0050/5046457332±49/149140±8   9/3/3060/405313349316±24/5n.b.(未分析)40±7   n.s.n.s.n.s.n.s.n.s.n.s.n.s.n.s.n.s.n.s.
  急性MI期的CPR(n)肌酸激酶最大值(U/l)*   0940±725   2781±630   1915±740   n.s.n.s.
  CK MB最大值(U/l)*释放后的药物治疗阿司匹林(％)氯吡格雷(％)ACE-抑制剂(％)β阻断剂(％)抑制素(％)   104±6710010096100100   94±106100100100100100   146±128931009310093   n.s.n.s.n.s.n.s.n.s.n.s.
  对细胞治疗的支撑时间(h)注入的细胞数目(Mio.)细胞治疗前白细胞数目(/nl)C反应蛋白(mg/dl)肌钙蛋白T(ng/ml)细胞治疗后24小时白细胞数目(/nl)C-反应蛋白(mg/dl)肌钙蛋白T(ng/ml)CPR＝心肺复苏*没有CPR患者   119±2717±1212.4±4.22.8±2.22.0±1.48.5±2.12.6±2.31.3±1.0   111±41219±8212.8±3.63.2±2.42.2±1.99.8±1.93.1±1.91.5±1.2   --------   n.s.＜0.001n.s.n.s.0.02n.s.n.s.
表2：定量的总体和区域的LV功能
  BDP(n＝23)   基线   追踪观察  P值
  射血分数(％)舒张末期容积(ml)收缩末期容积(ml)   49±10107±2553±14   58±10108±3345±18  0.004n.s.0.035
  区域心壁运动(SD/弦(Chord))梗塞梗塞中心梗塞边缘 -1.5±0.3-1.6±0.4-1.5±0.2 -0.7±0.6-0.8±0.7-0.5±0.6 ＜0.001＜0.001＜0.001
  BMP(n＝23)   基线   追踪观察  P值
  射血分数(％)舒张末期容积(ml)收缩末期容积(ml)   49±10114±2957±21   59±9101±3343±21  0.003n.s.0.003
  区域心壁运动(SD/弦)梗塞梗塞中心梗塞边缘 -1.5±0.3-1.7±0.4-1.4±0.2 -0.5±0.6-0.7±0.6-0.4±0.7 ＜0.001＜0.001＜0.001
  对照(n＝15)   基线   追踪观察  P值
  射血分数(％)舒张末期容积(ml)收缩末期容积(ml)   50.3±9.3101.3±22.650.9±16.7   52.6±9.4120.0±47.057.6±30.6  0.3790.1080.363
  区域心壁运动(SD/弦)   n.d.(未检测)   n.d.  -
表3：接受具有高迁移能力的细胞的患者与接受具有较低迁移能力的前体细胞的患者之间进行比较的基线参数
  基线   高迁移能力n＝16   低迁移能力n＝15   P值
  年龄(岁)性别(男性/女性)危险因子数目(％)梗塞面积(前面/下面％)   48±1115/12.7±0.975/25   50±913/22.6±0.960/40   n.s.n.s.n.s.n.s.
  射血分数(％)舒张末期容积(ml)收缩末期容积(ml)   48±8104±2253±15   49±12118±2559±20   n.s.n.s.n.s.
  区域壁运动(SD/弦)梗塞梗塞中心梗塞边缘 -1.5±0.2-1.7±0.3-1.4±0.2 -1.5±0.3-1.6±0.3-1.5±0.3   n.s.n.s.n.s.n.s.
  间隔壁运动值扩张晚期容积(ml)   7.0±2.439±44   6.7±3.035±22   n.s.n.s.
表4A：梗塞大小减少的独立预测因子的多变量分析
  Δ扩张晚期容积r P值
  性别年龄血管再形成的时间基线射血分数基线扩张晚期容积高/低迁移   -0.094-0.0990.3290.7840.184-0.883   n.s.n.s.n.s.0.016n.s.0.007
表4B：LV功能区域改善的独立预测因子的多变量分析
  Δ间隔壁运动值r P值
  性别年龄血管再形成时间基线射血分数基线间隔壁运动值高/低迁移   0.0760.60.1650.403-0.735-0.619   n.s.0.035n.s.n.s.0.0080.021
表5：研究人群的基线参数
  ICMP患者   健康对照组  P值
  n＝18   n＝8
  年龄(岁)男性(％)   59.4±13.488.9   54±1387.5  ＜0.0010.65
  高血压(％)高脂血症(％)糖尿病(％)吸烟者(％)KHE家族史(％)   57701782.452.9   025037.525.0  ＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001
  KHE(1/2/3血管病％)KHE史(％)梗塞面积(前面的/下面的)(％)射血分数(视觉评定)释放后的药物治疗阿司匹林(％)氯吡格雷(％)ACE-抑制剂(％)   17.6/52.9/29.410065/3537.8±11.1100100100   n.a.(未分析)n.a.n.a.62.6±3.1000 ＜0.001
  β阻断剂(％)抑制素(％)   100100   00
  C-反应蛋白(mg/dl)白细胞数目(×103/nl)   3.0±2.57.9±3.7   2.9±1.76.8±2.9   0.510.85
表6：临床特征及体外测量结果与BMPs在后肢缺血的小鼠模型中的新血管形成能力之间的关系的单变量线性回归分析
  患者和健康对照组   仅患者
  r   P值   r   P值
  年龄性别高血压高脂血症KHE家族史糖尿病危险因子数目NYHA分类射血分数(％)基础迁移SDF-1诱导的迁移VEGF诱导的迁移集落形成能力   -0.380.032-0.646-0.598-0.403-0.641-0.540-0.6300.7200.3800.7810.3520.740   0.0640.870.0010.0020.0190.0010.0060.0010.0010.061＜0.0010.078＜0.001   0.260-0.165-0.2040.1140.134-0.0880.174-0.1160.3150.4560.6340.3740.074   0.330.490.430.680.610.740.520.660.2730.050.0040.130.785

Claims (34)

1.用于分析与心血管疾病相关的哺乳动物的样品的体外方法，所述方法包括以下步骤：
a)利用细胞特异表面标志，分离骨髓前体细胞(BMPs)和/或血液来源的循环前体细胞(BDPs)，以及
b)利用适合的迁移分析，测定所分离的BMPs和/或BDPs的心血管功能性。
2.如权利要求1所述方法，其还包括将所述样品的检测结果与参考值和/或参比样品的结果进行比较。
3.如权利要求1或2所述方法，其中欲检测的所述样品来源于人。
4.如权利要求1-3中任一权利要求所述方法，其中欲检测的所述样品选自骨髓、外周血或其部分和细胞培养混悬液或其部分。
5.如权利要求4所述方法，其中所述外周血被加入凝结抑制剂，特别是肝素或EDTA。
6.如权利要求4所述方法，其中欲检测的所述样品利用穿刺从所述骨髓获得。
7.如权利要求1-6中任一权利要求所述方法，其中所述分离通过密度梯度离心手段、细胞特异表面标志和/或免疫学方法来进行。
8.如权利要求7所述方法，其中所述分离通过应用FACS或免疫磁性分离法来进行。
9.如权利要求1-8中任一权利要求所述方法，其中BMPs的所述细胞特异表面标志选自CD34、CD45和/或CD133，以及BDPs的所述细胞特异表面标志选自VEFGR2、CD105、vWF和/或CD31。
10.如权利要求1-9中任一权利要求所述方法，其中所述迁移分析在博伊登室或改良的博伊登室实施。
11.如权利要求1-10中任一权利要求所述方法，其中所述迁移分析通过应用SDF-1、VEGF、SDF-1或P1GF或者MCP-1来实施。
12.如权利要求1-11中任一权利要求所述方法，其中所述心血管疾病选自稳定或不稳定心绞痛、稳定型冠心病、急性冠状动脉综合征、心肌梗塞、急性心肌梗塞、急性心脏综合征、冠心病、慢性缺血性心肌病(ICMP)、扩张性心肌病(DCM)、心机能不全或心衰弱的其它因素。
13.如权利要求1-12中任一权利要求所述方法，其中所述方法在细胞注入进所述哺乳动物之前即刻实施。
14.如权利要求1-13中任一权利要求所述方法，其中所检验的分离的BMPs和/或BDPs对所述哺乳动物是自体同源的或异源的。
15.诊断试剂盒，其包含用于实施权利要求1-14中任一权利要求所述方法的工具，任选地还包括附加组分和/或赋形剂。
16.权利要求15所述试剂盒在心血管疾病的诊断和/或预后中的用途，其用于该心血管疾病治疗的监测和/或用于预期细胞治疗分层的BMPs或BDPs的心血管功能性的测定，所述预期细胞治疗利用干细胞和祖细胞以增加所述缺血组织的灌注或用于所述组织损伤，特别是心机能不全中的再生，和/或用于患者的鉴别，所述患者受益于在所述细胞的再次移植前对其BMPs或BDPs进行体外预处理再回输以改进所述心血管功能性。
17.用于分离特异骨髓前体细胞(BMPs)和/或血液来源的循环前体细胞(BDPs)的体外方法，其包括：
a)从哺乳动物供体中采集样品，
b)从所获得的所述样品中分离BMPs和/或BDPs，以及
c)利用适合的迁移分析，测定所分离的BMPs和/或BDPs的心血管功能性。
18.如权利要求17所述方法，其中欲检验的所述样品源于人。
19.如权利要求17或18所述方法，其中欲检验的所述样品选自骨髓、外周血或其部分以及细胞培养混悬液或其部分。
20.如权利要求19所述方法，其中欲检验的所述样品利用穿刺从所述骨髓获得。
21.如权利要求17-20中任一权利要求所述方法，其中所述分离通过密度梯度离心手段、细胞特异表面标志和/或免疫学方法来进行。
22.如权利要求21所述方法，其中所述分离通过应用FACS或免疫磁性分离法来进行。
23.如权利要求17-22中任一权利要求所述方法，其中BMPs的所述细胞特异表面标志选自CD34、CD45和/或CD133，以及BDPs的所述细胞特异表面标志选自VEFGR2、CD105、vWF和/或CD31。
24.如权利要求17-23中任一权利要求所述方法，其中所述迁移分析在博伊登室或改良的博伊登室实施。
25.如权利要求17-24中任一权利要求所述方法，其中所述迁移分析通过应用SDF-1、VEGF、SDF-1或P1GF、MCP-1来实施。
26.如权利要求17-25中任一权利要求所述方法，其中所述分离的BMPs和/或BDPs还进行遗传修改，特别是为了改进所述细胞的所述心血管功能性。
27.权利要求17-26中任一权利要求所述方法产生的特异骨髓前体细胞(BMP)或血液来源的循环前体细胞(BDP)。
28.如权利要求27所述的特异骨髓前体细胞(BMP)或血液来源的循环前体细胞(BDP)，其中所述分离的BMP和/或BDP对于所述哺乳动物是自体同源的和/或异体同源的。
29.用于制备药物组合物的方法，其包括权利要求1-26中任一权利要求所述的方法，以及通过与常规的药物可接收载体和/或稀释剂的混合配制所述药物组合物。
30.如权利要求29所述方法，其中所述配制还包括与抑制素，特别是阿伐他汀、VEGF和/或促红细胞生成素混合。
31.权利要求29或30的方法生产的药物组合物。
32.权利要求27或28所述的特异BMP和/或BDP或权利要求31所述的药物组合物在心血管疾病的治疗中的应用，所述心血管疾病选自稳定和不稳定心绞痛、稳定冠心病、急性冠状动脉综合征、心急梗塞、急性心急梗塞、急性心脏综合征、冠心病、慢性缺血性心肌病(ICMP)、扩张性心肌病(DCM)、心机能不全或心衰弱的其它因素。
33.如权利要求32所述的应用，其中所述治疗包括将所述细胞注入所述哺乳动物。
34.如权利要求32所述的应用，其中所述治疗还包括抑制素，特别是阿伐他汀、VEGF和/或促红细胞生成素的给药。
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