ES2350581T3 - Procedimiento in vitro para el diagnóstico de la funcionalidad cardiovascular de células progenitoras de médula ósea (bmp) y/o células progenitoras circulantes derivadas de la sangre (bdp). - Google Patents
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Abstract
Procedimiento in vitro para la estratificación de pacientes con enfermedades cardiovasculares para una terapia celular programada basada en células progenitoras de médula ósea (BMP) y/o células progenitoras circulantes derivadas de la sangre (BDP) para aumentar la perfusión de tejidos isquémicos o para la regeneración de la pérdida de tejido, en el que el procedimiento comprende las siguientes etapas: a) aislamiento de BMP y/o BDP mediante marcadores de superficie específicos de célula a partir de una muestra, y b) comprobación de la funcionalidad cardiovascular de las BMP y/o BDP aisladas mediante un ensayo de migración adecuado.
Description
La presente invención se refiere a un procedimiento in vitro para la estratificación de pacientes con enfermedades cardiovasculares para una terapia celular programada basada en células progenitoras de médula ósea (BMP) y/o células progenitoras circulantes derivadas de la sangre (BDP) para aumentar la perfusión de tejidos isquémicos o para la regeneración de la pérdida de tejido, en el que el procedimiento comprende las siguientes etapas: a) aislamiento de BMP y/o BDP mediante marcadores de superficie específicos de célula de una muestra, y b) comprobación de la funcionalidad cardiovascular de las BMP y/o BDP aisladas mediante un ensayo de migración adecuado. El procedimiento puede usarse en el ámbito del diagnóstico y/o del pronóstico de enfermedades cardiovasculares, para el control de su terapia y/o para la estratificación para una terapia celular programada con células madre y/o progenitoras para aumentar la perfusión de tejidos isquémicos o para la regeneración de la pérdida de tejido (por ejemplo, insuficiencia cardiaca). En un aspecto adicional, la presente divulgación describe entonces un procedimiento in vitro para el aislamiento de células progenitoras de médula ósea (BMP) y/o células progenitoras circulantes derivadas de la sangre (BDP) específicas que comprende: a) extracción de una muestra de un donante mamífero, b) aislamiento de las BMP y/o BDP mediante marcadores de superficie específicos de célula de la muestra así obtenida y c) comprobación de la funcionalidad cardiovascular de las BMP y/o BDP aisladas mediante un ensayo de migración adecuado. Las enfermedades cardiovasculares se seleccionan del grupo compuesto por enfermedad cardiaca coronaria estable, síndrome coronario agudo, infarto de miocardio agudo, miocardiopatía isquémica crónica (MCIC), miocardiopatía dilatada (MCD) u otras causas de insuficiencia cardiaca.
El fallo cardiaco post–infarto sigue siendo la causa principal de morbilidad y mortalidad. Aunque una rápida reperfusión de las arterias obstruidas causa tasas de mortalidad significativamente reducidas (Lange RA, Hillis LD. “Reperfusion therapy in acute myocardial infarction”. N. Engl. J. Med. 2002: 346: 954–5), los procesos de remodelación ventricular, que se caracterizan por la expansión progresiva de la región de infarto y la dilatación de la cavidad ventricular izquierda, conducen al desarrollo de fallo cardiaco en una parte apreciable de los pacientes que sobreviven a un infarto de miocardio agudo (Pfeffer MA, Braunwald E. “Ventricular remodeling after myocardial infarction. Experimental observations and clinical implications”. Circulation. 1990: 81: 1161–72). El objetivo principal de revertir una remodelación sería la estimulación de la neovascularización así como un reforzamiento de la regeneración de miocitos cardiacos dentro de la región de infarto.
Experimentos y estudios clínicos recientes han mostrado que el transplante de células progenitoras de médula ósea (BMP) y/o células progenitoras circulantes derivadas de la sangre (BDP) específicas mejoran la regeneración después de un infarto de miocardio agudo (Kawamoto A, Gwon HC, Iwaguro H, Yamaguchi Jl, Uchida S, Masuda H, Silver M, Ma H, Kearney M, Isner JM, Asahara T. “Therapeutic potential of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for myocardial ischemia”. Circulation. 2001; 103: 634–7, Kocher AA, Schuster MD, Szabolcs MJ, Takuma S, Burkhoff D, Wang J, Homma S, Edwards NM, Itescu S. “Neovascularization of ischemic myocardium by human bone–marrowderived angioblasts prevents cardiomyocyte apoptosis, reduces remodeling and improves cardiac function”. Nat. Med. 2001: 7: 430–6, Fuchs S, Baffour R, Zhou YF, Shou M, Pierre A, Tio FO, Weissman NJ, Leon MB, Epstein SE, Komowski R. “Transendocardial delivery of autologous bone marrow enhances collateral perfusion and regional function in pigs with chronic experimental myocardial ischemia”. J. Am. Coil. Cardiol. 2001; 37: 1726–32). La terapia celular con células progenitoras/madre de médula ósea es por tanto una nueva opción para la mejora de la neovascularización y de la función cardiaca en enfermedad cardiaca isquémica. Así, ha podido mostrarse efectivamente que la infusión intracoronaria de células progenitoras adultas en pacientes con infarto de miocardio agudo es practicable y segura y que está asociada a mejoras significativas de la función VI (ventricular izquierda) regional y global. Las circunstancias exactas de la mejora por la infusión permanecen sin embargo dudosas. Para una terapia celular selectiva y eficaz con células progenitoras/madre de médula ósea es además necesario asegurar que se transplantan células progenitoras de médula ósea (BMP) y/o células progenitoras circulantes derivadas de la sangre (BDP) que presenten una capacidad de regeneración lo más alta posible y por tanto eficacia.
Es por tanto objetivo de la presente invención facilitar un procedimiento mejorado para la estratificación de pacientes con enfermedades cardiovasculares para una terapia celular programada basada en células progenitoras de médula ósea (BMP) y/o células progenitoras circulantes derivadas de la sangre (BDP) para aumentar la perfusión de tejidos isquémicos o para la regeneración de la pérdida de tejido, por ejemplo, en insuficiencia cardiaca.
La presente divulgación describe además un procedimiento seguro con el que pueden identificarse y aislarse células progenitoras de médula ósea (BMP) y/o células progenitoras circulantes derivadas de la sangre (BDP) eficaces y adecuadas para la terapia celular.
Según un primer aspecto de la presente invención, se consigue un objetivo de la invención mediante un procedimiento in vitro para la estratificación de pacientes con enfermedades cardiovasculares para una terapia celular programada basada en células progenitoras de médula ósea (BMP) y/o células progenitoras circulantes derivadas de la sangre (BDP) para aumentar la perfusión de tejidos isquémicos o para la regeneración de la pérdida de tejido, en el que el procedimiento según la invención comprende las siguientes etapas: a) aislamiento de células progenitoras de médula ósea (BMP) y/o células progenitoras circulantes derivadas de la sangre (BDP) mediante marcadores de superficie específicos de célula y b) comprobación/determinación de la funcionalidad cardiovascular de las BMP y/o BDP aisladas mediante un ensayo de migración adecuado.
Sorprendentemente, se ha podido encontrar ahora que existe una relación directa entre la capacidad de neovascularización y la capacidad de migración de células progenitoras de médula ósea (BMP) y/o células progenitoras circulantes derivadas de la sangre (BDP). Esto posibilita el uso de un ensayo de migración como herramienta valiosa para el análisis de una muestra de un mamífero con respecto a enfermedades cardiovasculares.
Además, se ha podido encontrar sorprendentemente que las células progenitoras de médula ósea de algunos donantes y/o pacientes de infarto de miocardio presentan una disfunción por la cual las células que pueden extraerse directamente de la médula ósea (BMP, por ejemplo mediante punción) están limitadas en su función de poder formar nuevos vasos y apoyar la regeneración cardiaca. Mediante el ensayo según la invención, pueden excluirse eficazmente dichos donantes. Al mismo tiempo, pueden identificarse los pacientes que, debido a una capacidad migratoria reducida de sus BMP o BDP, presentan un riesgo elevado. Estos pacientes pueden tratarse entonces adecuada y particularmente de modo preventivo y/o auxiliar. Como alternativa, pueden identificarse también mediante este ensayo pacientes que pueden experimentar un beneficio elevado mediante una terapia con células progenitoras. Ambas de las propiedades citadas anteriormente de las BMP y/o BDP, la capacidad de migración y la capacidad de neovascularización de las células, se entienden en el ámbito de la presente invención como “funcionalidad cardiovascular”.
Vasa et al. (Vasa M. et al., Circ. Res. 6 de julio de 2001; 89(1): E1–7) describen que el número y la actividad migratoria de células progenitoras endoteliales circulantes (EPC) se correlacionan de forma inversa con factores de riesgo para enfermedades arteriales coronarias (EAC). Las EPC de pacientes con enfermedades arteriales coronarias muestran perjuicios funcionales. La actividad funcional de las EPC se examina mediante la capacidad migratoria, que se determina con la ayuda de un ensayo de migración en una cámara de Boyden (migración en dirección a VEGF como “quimioatractor”). La nevovascularización postnatal se realiza mediante la participación de células progenitoras circulantes derivadas de médula ósea (EPC) que proceden de células madre hematopoyéticas, que se caracterizan por los marcadores de superficie celular CD34 o CD133 para células menos maduras. Las células CD34+ se establecen en regiones isquémicas en modelos de ratón, la inyección de células CD34+ potencia la neovascularización en los ensayos y mejora la función cardiaca en estos ratones. Adicionalmente, se examina el número y actividad funcional de las EPC en pacientes con EAC (enfermedad arterial coronaria) en comparación con personas sanas, y también la influencia de los factores de riesgo sobre el número y actividad funcional de las EPC. El número de células CD34+ KDR+ (= receptor de VEGF) dobles positivas es claramente menor en pacientes con EAC que en personas sanas, pero el número total de células CD34+ o células CD133+ menos diferenciadas no es distinto en pacientes y personas sanas. La capacidad migratoria de las EPC está reducida en pacientes con EAC. Vasa et al. expresan la conjetura de que la actividad reducida de las EPC podría contribuir a una neovascularización reducida en pacientes con EAC. Sin embargo, no se menciona la posibilidad de una estratificación de pacientes basándose en un análisis de las células progenitoras de médula ósea (BMP) y/o las células progenitoras circulantes derivadas de la sangre (BDP).
Además, Vasa et al. (Vasa M. et al., Circulation, 19 de junio de 2001; 103(24): 2885–90) describen un aumento de las células progenitoras endoteliales (EPC) circulantes mediante terapia con estatinas en pacientes con EAC estable. A este respecto, se apoya la neovascularización por EAC mediante estatinas. Se determina la actividad funcional de las EAC mediante un ensayo migratorio. Sin embargo, no se menciona igualmente la posibilidad de una estratificación de pacientes basándose en un análisis de las células progenitoras de médula ósea (BMP) y/o las células progenitoras circulantes derivadas de la sangre (BDP).
Emerson et al. (en Circulation 2003, 107, 2294–2302) describen que las células madre y progenitoras adultas son capaces de diferenciarse en cardiomiocitos y células endoteliales. Por tanto, podrían mejorar la función cardiaca y la circulación en enfermedades cardiacas isquémicas. Por tanto, se examina si las células de médula ósea pueden inyectarse de forma segura con la ayuda de un catéter de inyección en el músculo cardiaco de pacientes. Se describe entonces la inyección de células de médula ósea mononucleares autólogas directamente en la región isquémica de la cavidad cardiaca izquierda de pacientes con enfermedad cardiaca coronaria en pacientes en estadio avanzado. Las células progenitoras se aíslan de la médula ósea mediante centrifugación en gradiente de densidad y se caracterizan con la ayuda de un análisis de FACS mediante distintos marcadores de superficie celular, pero no se separan. A este respecto, las células progenitoras hematopoyéticas según la Tabla 3 del documento son sólo una proporción reducida de las células inyectadas (aprox. 2,5 %), mientras que los linfocitos T y B forman la parte principal. Se describen como células progenitoras hematopoyéticas células CD34+ CD45lo o CD133+ Cd45lo. Se examina en las células de médula ósea mononucleares la “viabilidad” y “capacidad clonogénica”. Se inyectan las células de médula ósea en solución salina con heparina y 5 % de seroalbúmina humana. Sin embargo, no se menciona igualmente la posibilidad de una estratificación de pacientes basándose en un análisis de las células progenitoras de médula ósea (BMP) y/o las células progenitoras circulantes derivadas de la sangre (BDP). No se usan además en conjunto células progenitoras endoteliales aisladas, sino células de médula ósea mononucleares no fraccionadas adicionalmente.
Kawamoto et al. Circulation 2003,107, 461–468 describen que pueden aislarse células progenitoras endoteliales (EPC) de sangre periférica en forma de células mononucleares CD34+. En enfermedades isquémicas, se movilizan las EPC de la médula ósea, se establecen en la región de neovascularización incipiente y se diferencian hasta células endoteliales maduras. Se examina por tanto si el transplante de células progenitoras directamente al músculo cardiaco potencia la neovascularización en tejidos isquémicos. La infusión de células progenitoras autólogas directamente en el músculo cardiaco elevaba la neovascularización en modelos de isquemia en cerdos. Además, se infundieron células progenitoras humanas heterólogas en regiones cardiacas isquémicas de ratas. Para ello, se usan células de sangre periférica CD34+ mononucleares humanas como fracción celular enriquecida en EPC.
Aicher et al. (Circulation 2003, 107, 2134–2139) describen el establecimiento de EPC marcadas radiactivamente en distintos tejidos después de infusión en ratas. La publicación describe para ello un sistema en el que se xenotransplantan EPC humanas, que proceden de donantes sanos, a ratas en las que se ha inducido antes quirúrgicamente un infarto o a animales de control sin infarto. No se describe el aislamiento de EPC y no se cita la clasificación como células de sangre periférica CD34+. Se cultivan las células, es decir se expanden, y a continuación se marcan radiactivamente con 111In–oxina para poder examinar la distribución de las EPC en el organismo receptor después de la infusión. Se examina igualmente si la actividad funcional de las células después del marcaje radiactivo se diferencia de las células no marcadas. Esta actividad funcional se examina mediante un ensayo de migración, es decir, mediante la migración de las células en dirección al factor de crecimiento VEGF. Se muestra que sólo aproximadamente un 1 % de las células infundidas totales se establecen en el corazón. El experto deduce de esto que la capacidad migratoria de las EPC está relacionada con el establecimiento de las células en tejidos diana, posiblemente también en la región de infarto. No era sin embargo evidente llevar a cabo este “control de calidad” también con células no marcadas radiactivamente, particularmente se usaron células no marcadas como referencia en la publicación.
Por último, Wolfrum et al. (Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2003, 23, 729–736) describen en general el efecto de las estatinas sobre las células endoteliales.
Se prefiere un procedimiento según la invención que comprende además la comparación de los resultados obtenidos a partir de la sonda examinada con un valor de referencia y/o el resultado de una muestra de referencia. Dichos valores de referencia pueden obtenerse a partir de pacientes para tratar individualmente en el curso de la terapia o son el resultado de estudios a gran escala. Habitualmente, el valor de referencia procede del denominado grupo de control sano. El experto en este campo es capaz de seleccionar sin problemas protocolos de estudio adecuados para poder obtener así valores de referencia adecuados.
Se prefiere un procedimiento según la invención en el que la muestra a examinar procede de seres humanos. A este respecto, la muestra a examinar según la invención puede seleccionarse del grupo compuesto por médula ósea, sangre periférica o fracciones de la misma y suspensiones de cultivo celular o fracciones del mismo. La selección de la muestra individual depende del tipo de células progenitoras a examinar y del procedimiento para la determinación de las propiedades de las células progenitoras. Se prefiere adicionalmente, en el caso de extracción de sangre de la sangre periférica, añadir un inhibidor de la coagulación, particularmente heparina o EDTA. Esto facilita las etapas de procesamiento adicionales. En un aspecto adicional de la presente invención, se extrae la muestra a examinar mediante punción de la médula ósea. Esta extracción representa el fundamento para la obtención de las BMP. El procesamiento adicional puede comprender según la invención un aislamiento usando centrifugación de gradiente de densidad y/o procedimientos inmunológicos, por ejemplo, procedimientos inmunomagnéticos, particularmente usando FACS. A este respecto, se prefiere adicionalmente según la invención que el marcador de superficie específico de célula seleccionado para BMP se seleccione de CD34, CD45 y/o CD133, y que el marcador de superficie específico de célula seleccionado para BDP se seleccione de VEGFR2, CD105, vWF y/o CD31.
Según un procedimiento preferido de la presente invención, se lleva a cabo el ensayo de migración en una cámara de Boyden o en una versión modificada de la misma. Resulta evidente sin embargo para el experto que pueden usarse procedimientos adicionales para la determinación de la capacidad migratoria, sin apartarse del ámbito de la presente invención. Esto se refiere particularmente a formas de realización del ensayo de migración que están adaptadas para la automatización del ensayo y/o su práctica en un ensayo “de diagnóstico inmediato”.
Se prefiere especialmente un procedimiento según la invención en el que el ensayo de migración se lleva a cabo usando SDF–1 o VEGF como quimioatractor para BMP o BDP. Como se observa en los ensayos adjuntos, es un estimulante preferido para BMP SDF–1 y para BDP VEGF. Pueden usarse también PIGF o MCP–1.
Voermans et al. (Voermans C, et al. Exp. Haematol. diciembre de 2001; 29(12): 1456– 64) describen el papel de la migración inducida por SDF–1 de células progenitoras
hematopoyéticas (células CD34(+)) y un correspondiente ensayo migratorio.
Una condición para el éxito de la terapia celular es el denominado “orientamiento”, o sea la migración selectiva de células para establecimiento en regiones diana deseadas, particularmente en caso de seleccionar una vía de administración intravascular. Por tanto, se ha supuesto por los inventores que la capacidad migratoria de células progenitoras adultas en dirección a sus quimioatractores fisiológicos podía reflejar su capacidad de migrar a la región de infarto. Efectivamente, se correlacionan estrechamente la migración de células transplantadas al tejido afectado y la mejora de la neovascularización que se ha inducido mediante infusión intravenosa de células progenitoras humanas con la capacidad migratoria inducida, por ejemplo, por SDF–1 para BMP y con la capacidad migratoria inducida por VEGF para BDP. Estas eran hasta ahora sin embargo conjeturas no documentadas que sólo se confirmaron mediante los ensayos llevados a cabo en el ámbito de la presente invención. Era además inesperado que esta capacidad migratoria fuera tan adecuada como factor de predicción independiente que conllevara una mejora de los diagnósticos basados en la misma en el tratamiento de EAC. En conjunto, la mejora de la función de miocardio contractiva local dependiente de y asociada a la actividad funcional de las células progenitoras infundidas da a conocer una relación causal entre la capacidad migratoria de células progenitoras y el éxito de la terapia celular en pacientes con infarto de miocardio agudo. La presente descripción da a conocer por tanto un nuevo procedimiento de diagnóstico con cuya ayuda se posibilita una mejora/optimización de la terapia celular en pacientes con enfermedades cardiovasculares. El procedimiento permite, mediante la determinación de la actividad funcional de las células progenitoras, hacer predicciones fiables de si el paciente respectivo de una terapia celular (transplante de células progenitoras propias) se beneficiará de la regeneración del tejido de músculo cardiaco dañado o destruido o de si esta terapia no tendrá probablemente éxito porque las células tienen una capacidad demasiado baja de establecerse en el tejido diana.
Los procedimientos dados a conocer pueden usarse siempre en el diagnóstico y/o terapia de todas las enfermedades cardiovasculares en las que se espere una ventaja terapéutica por un transplante de células progenitoras. Se prefiere un procedimiento según la invención en el que las enfermedades cardiovasculares se seleccionan del grupo compuesto por angina estable e inestable, enfermedad cardiaca coronaria estable, síndrome coronario agudo, infarto de miocardio, infarto de miocardio agudo, síndrome cardiaco agudo, enfermedad arterial coronaria, miocardiopatía isquémica crónica (MCIC), miocardiopatía dilatada (MCD), insuficiencia cardiaca u otras causas de fallo cardiaco.
Según un aspecto adicional de la presente divulgación, el procedimiento descrito puede llevarse a cabo inmediatamente antes de una infusión celular en el mamífero. Como ya se ha indicado anteriormente, pueden excluirse eficazmente mediante el ensayo descrito aquellos donantes, y al mismo tiempo identificarse pacientes, con un riesgo elevado de presentar malas capacidades de neovascularización. Estos pacientes pueden tratarse entonces adecuada y particularmente de modo preventivo y/o auxiliar. Como alternativa, pueden identificarse también mediante este ensayo pacientes que pueden experimentar un beneficio elevado mediante una terapia con células progenitoras. Esto se refiere en un aspecto adicional del procedimiento según la presente invención a una terapia en la que las BMP y/o BDP aisladas examinadas para los pacientes a tratar son autólogas.
Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a un kit de diagnóstico que contiene, además de agentes para la práctica del procedimiento citado según la invención, eventualmente componentes y/o coadyuvantes adicionales adecuados. El kit puede estar compuesto por uno o varios envases separados. Los componentes adecuados pueden ser particularmente instrucciones de uso o tablas de colores para la comparación de los resultados de medida mediante los valores de referencia.
Según la descripción, se usa el kit preferiblemente para el diagnóstico y/o pronóstico de enfermedades cardiovasculares, para el control de su terapia y/o para estratificación para una terapia celular programada con células madre y progenitoras para aumentar la perfusión de tejidos isquémicos o para la regeneración de la pérdida de tejido, como por ejemplo en insuficiencia cardiaca.
Un aspecto adicional de la presente invención se refiere entonces a un procedimiento in vitro para el aislamiento de células progenitoras de médula ósea (BMP) y/o células progenitoras circulantes derivadas de la sangre (BDP) específicas, en el que el procedimiento comprende las etapas de a) extracción de una muestra de un donante mamífero, b) aislamiento de (BMP) y/o (BDP) mediante marcadores de superficie específicos de célula a partir de la muestra así obtenida y c) comprobación de la funcionalidad cardiovascular de las BMP y/o BDP aisladas mediante un ensayo de migración adecuado. Se prefiere según la invención que la muestra a determinar proceda de un mamífero, particularmente de seres humanos.
Como ya se ha mencionado anteriormente, el procedimiento puede llevarse a cabo en todas las poblaciones de células madre y progenitoras obtenidas a partir de un donante independientemente de la muestra del procedimiento de aislamiento, de las que se conjetura que contienen estas BMP o BDP adecuadas. Se prefiere un procedimiento en el que la muestra a examinar se selecciona del grupo compuesto por médula ósea, sangre periférica o fracciones de la misma y suspensiones de cultivo celular o fracciones del mismo. Se prefiere particularmente un procedimiento en el que la muestra a examinar se extrae de forma adecuada de la médula ósea. Se prefiere que la muestra a examinar se extraiga mediante
punción de la médula ósea.
Debido al hecho de que en una extracción se obtiene principalmente una mezcla heterogénea de células progenitoras distintas, un procedimiento preferido comprende el aislamiento usando centrifugación de gradiente de densidad y/o procedimientos inmunológicos. Se realiza un procedimiento de aislamiento especialmente preferido usando FACS o separación inmunomagnética, en el que el marcador de superficie específico de célula para BMP se puede seleccionar de CD34, CD45 y/o CD133, y para BDP se puede seleccionar de VEGFR2, CD105, vWF y/o CD31.
Como ya se ha mencionado anteriormente, se lleva a cabo en un aspecto adicional de la presente invención el ensayo de migración en una cámara de Boyden o en un desarrollo avanzado de la misma (véase anteriormente). Se prefiere también aquí que el quimioatractor usado para el ensayo de migración sea SDF–1, VEGF, P1GF o MCP–1.
Es un aspecto esencial de la presente invención la determinación de la funcionalidad cardiovascular de las células progenitoras que se han extraído de un donante mamífero. Basándose en los conocimientos obtenidos mediante el procedimiento según la invención sobre la viabilidad y eficacia de las células progenitoras obtenidas para la terapia celular, puede adaptarse esta terapia a pacientes individuales. Como ya se ha indicado anteriormente, se conjetura que en la médula ósea de determinados donantes o pacientes, particularmente en pacientes con MCIC, está presente una perturbación que perjudica a la funcionalidad cardiovascular de las células progenitoras. Para poder “contrarrestar” este perjuicio en dichos casos, la presente divulgación describe en un aspecto adicional un procedimiento en el que las BMP y/o BDP aisladas se modifican genéticamente de manera adicional para mejorar la funcionalidad cardiovascular de las células. Los procedimientos para modificar genéticamente las BMP y/o BDP y los constructos genéticos adecuados para ello son bien conocidos por el experto y los puede preparar y usar fácilmente. Los mecanismos genéticos exactos del perjuicio de la funcionalidad cardiovascular en determinados pacientes no son conocidos hasta ahora, pero los experimentos de la presente divulgación han dado como resultado que la migración de las células progenitoras procedentes de estos donantes está perjudicada. Para poder contrarrestar este perjuicio, habría que transfectar una preparación de las células progenitoras con aquellos receptores que fueran específicos de los quimioatractores respectivos (particularmente SDF–1 para BMP y VEGF para BDP). Así, una preparación sería la transfección de BMP con constructos de expresión de CXCR4 o constructos interferentes en la regulación de CXCR4, que se ha conjeturado que podría presentarse regulado negativamente en las BMP perjudicadas. Otra preparación sería la modificación de integrinas como, por ejemplo, CD49a u otros factores como, por ejemplo, VCAM–1 o factores que
interaccionan con el mismo.
Un aspecto adicional describe entonces una célula progenitora de médula ósea (BMP) o célula progenitora circulantes derivada de la sangre (BDP) específica que se prepara mediante un procedimiento anteriormente descrito. Esta célula progenitora de médula ósea (BMP) o célula progenitora circulantes derivada de la sangre (BDP) específica según la presente divulgación puede ser autóloga (propia) en forma de BMP aislada y/o BDP aislada para el mamífero/paciente (o sea el receptor respectivo). Son naturalmente posibles también mezclas de células.
Como ya se ha mencionado anteriormente, las BMP y/o BDP aisladas pueden usarse en el ámbito de la terapia celular. Además, se describe por tanto un procedimiento para la preparación de una composición farmacéutica, que comprende en primer lugar un procedimiento según la invención citado anteriormente y además una formulación de la composición farmacéutica mediante mezclado con portadores y/o agentes de dilución convencionales farmacéuticamente aceptables. Los correspondientes portadores y/o agentes de dilución adecuados son bien conocidos por el experto y pueden adaptarse muy fácilmente a las aplicaciones específicas respectivas. Preferiblemente, se infunden las células progenitoras a través de la prótesis endovascular previamente implantada.
La formulación puede presentarse además en mezcla con sustancias farmacéuticamente activas adicionales. Se prefieren a este respecto sustancias que se seleccionan de estatinas, eritropoyetina y/o VEGF. Son también concebibles otras sustancias, a condición de que estas no perjudiquen desventajosamente la funcionalidad cardiovascular de las células progenitoras administradas.
Por último, la presente descripción se refiere al uso de una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares, seleccionadas del grupo compuesto por angina estable e inestable, enfermedad cardiaca coronaria estable, síndrome coronario agudo, infarto de miocardio, infarto de miocardio agudo, síndrome cardiaco agudo, enfermedad arterial coronaria, miocardiopatía isquémica crónica (MCIC), miocardiopatía dilatada (MCD), insuficiencia cardiaca u otras causas de fallo cardiaco. Se describe a este respecto un uso que comprende el tratamiento con la infusión celular del mamífero. A este respecto, pueden administrarse también, como se cita anteriormente, otras sustancias farmacéuticamente activas, con particular preferencia el tratamiento comprende además la administración de estatinas, particularmente VEGF y/o eritropoyetina.
Experimentos llevados a cabo recientemente por los inventores han dado como resultado que la capacidad migratoria de las células progenitoras de pacientes con EAC se correlacionaba muy estrechamente con la mejora neovascular después del transplante en ratones desnudos después de isquemia de miembro posterior (r = 0,783; p = 0,001; n = 11). Por tanto, los inventores se concentraron en la medida de la capacidad migratoria de las células progenitoras transplantadas inmediatamente antes de la infusión intracoronaria en pacientes con infarto de miocardio agudo, para poner en relación las características funcionales de las células progenitoras transplantadas con los resultados cuantitativos del desenlace después de 4 meses. Los resultados mostraron que una alta capacidad migratoria de las células progenitoras infundidas predecía una mejora de la función de bombeo del ventrículo izquierdo y una reducción del tamaño de infarto, lo que deja suponer una relación causal entre la capacidad de migración de las células progenitoras y la regeneración de la función cardiaca después de una terapia celular en pacientes con infarto de miocardio agudo con el miocardio dañado.
La presente invención muestra por tanto por primera vez que la capacidad funcional de las células progenitoras transplantadas es un determinante independiente principal de la mejora subsiguiente en la función ventricular izquierda regional y que predice una reducción del tamaño de infarto después del transplante celular intracoronario. De forma interesante, la actividad funcional de las células, como se determina mediante su actividad migratoria, era más informativa que el número de células. En conjunto, estos datos describen por primera vez una relación causal entre la terapia de células progenitoras y la mejora de la función de bombeo/regeneración ventricular del ventrículo izquierdo en pacientes después de lesión del miocardio.
Los exámenes experimentales precedentes dejan suponer que la mejora en la función ventricular después de infarto de miocardio inducido experimentalmente se basa en una neoangiogénesis estimulada que causa una remodelación miocárdica tardía mediante un flujo sanguíneo miocárdico reforzado, la recuperación del miocardio inactivo, la reducción de la fibrosis miocárdica y una tasa de apoptosis reducida de los miocitos hipertróficos en la región periinfartada (Kawamoto A, Gwon HC, Iwaguro H, Yamaguchi Jl, Uchida S, Masuda H, Silver M, Ma H, Kearney M, Isner JM, Asahara T. “Therapeutic potential of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for myocardial ischemia”. Circulation. 2001; 103: 634–7., Kocher AA, Schuster MD, Szabolcs MJ, Takuma S, Burkhoff D, Wang J, Homma S, Edwards NM, Itescu S. “Neovascularization of ischemic myocardium by human bone–marrow–derived angioblasts prevents cardiomyocyte apoptosis, reduces remodeling and improves cardiac function”. Nat. Med. 2001: 7: 430–6., Takahashi T, Kalka C, Masuda H, Chen D, Silver M, Kearney M, Magner M, Isner JM, Asahara T. “Ischemia– and cytokine–induced mobilization of bone marrow–derived endothelial progenitor cells for neovascularization”. Nat. Med. 1999: 5: 434–8., Murohara T, Ikeda H, Duan J, Shintani S, Sasaki K, Eguchi H, Onitsuka I, Matsui K, Imaizumi T. “Transplanted cord blood–derived endothelial progenitor cells augment postnatal neovascularization”. J. Clin. Invest. 2000: 105: 1527–36.). Adicionalmente, se ha referido que la inyección intramiocárdica de BMP conducía a la regeneración de cantidades significativas de miocardio autocontráctil, lo que deja suponer que la nueva producción de miocardio puede conducir a una mejora del desenlace del infarto de miocardio en relación con la alimentación local de células progenitoras adultas. Efectivamente, los inventores han podido mostrar recientemente que las BDP mantienen su capacidad de transdiferenciación en miocitos cardiacos funcionales (Badorff C, Brandes RP, Popp R, Rupp S, Urbich C, Aicher A, Fleming I, Busse R, Zeiher AM, Dimmeler S. “Transdifferentiation of blood–derived human adult endothelial progenitor cells into functionally active cardiomyocytes”. Circulation. 2003: 107: 1024–32.). Esto es válido también para las BMP (Orlic D, Kajstura J, Chimenti S, Jakoniuk I, Anderson SM, Li B, Picket J, McKay R, Nadal–Ginard B, Bodine DM, Leri A, Anversa P. “Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium”. Nature. 2001; 410: 701–5).
Evidentemente, el presente estudio no puede dar a conocer los mecanismos celulares que están asociados a los procesos de remodelación de ventrículo izquierdo mejorados que tienen lugar con relación a una terapia de células progenitoras. Sin embargo, un estudio reciente que se llevó a cabo en pacientes con isquemia de miembro posterior, mostraba que la inyección intramuscular de células progenitoras en los músculos gemelos conducía a una mejora significativa en la perfusión de miembro posterior (Tateishi–Yuyama E, Matsubara H, Murohara T, Ikeda U, Shintani S, Masaki H, Amano K, Kishimoto Y, Yoshimoto K, Akashi H, Shimada K, Iwasaka T, Imaizumi T. “Therapeutic angiogenesis for patients with limb ischaemia by autologous transplantation of bone–marrow cells; a pilot study and a randomised controlled trial”. Lancet. 2002; 360: 427–35). En consonancia con que una infusión intracoronaria de células progenitoras estaba asociada a un índice de perfusión mejorado en la región diana, estos datos indican que el establecimiento de células progenitoras en la región de infarto puede conducir a una neovascularización mejorada que puede conducir a una reducción de la dilatación del VI y a la conservación del rendimiento contráctil mediante la recuperación del miocardio inactivo, la reducción de la fibrosis miocárdica y la apoptosis en la región periinfartada. Adicionalmente, las células progenitoras migradas pueden no sólo liberar una pluralidad de factores de crecimiento angiogénicos, con lo que se refuerzan los procesos de neovascularización endógenos en la zona límite del infarto, sino que liberan también factores que atraen células progenitoras cardiacas circulantes o residentes en tejido, con lo que se refuerzan los mecanismos de reparación endógenos del miocardio. Por último, aunque el número de células progenitoras infundidas no prediga la mejora funcional subsiguiente, no puede excluirse la posibilidad de que las células progenitoras establecidas se hayan diferenciado posiblemente hasta cardiomiocitos funcionalmente activos, lo que conduciría a una regeneración de cantidades significativas de miocardio autocontráctil. Las comparaciones entre el transplante de células contráctiles frente a no contráctiles en estudios experimentales mostraron que la mejora de la contracción ventricular era específicamente dependiente de las células contráctiles, mientras que la dilatación ventricular mejoraba independientemente de los tipos de célula (Hutcheson KA, Atkins BZ, Hueman MT, Hopkins MB, Glower DD, Taylor DA. “Comparison of benefits on myocardial performance of cellular cardiomyoplasty with skeletal myoblasts and fibroblasts”. Cell Transplant. 2000; 9: 359–68, Sakai T, Li RK, Weisel RD, Mickle DA, Jia ZQ, Tomita S, Kirn EJ, Yau TM. “Fetal cell transplantation: a comparison of three cell types”. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 1999; 118: 715–24). En el presente estudio, la función sistólica mejoraba claramente, lo que coincide con los resultados experimentales después del transplante de angioblastos derivados de médula ósea (Kocher AA, Schuster MD, Szabolcs MJ, Takuma S, Burkhoff D, Wang J, Homma S, Edwards NM, Itescu S. “Neovascularization of ischemic myocardium by human bone–marrow–derived angioblasts prevents cardiomyocyte apoptosis, reduces remodeling and improves cardiac function”. Nat. Med. 2001: 7: 430–6.).
En resumen, la descripción da a conocer la capacidad migratoria de las células progenitoras como un determinante principal e independiente para predecir una mejora de la función cardiaca y la reducción del tamaño de infarto en relación con la infusión intracoronaria de células progenitoras adultas después de terapia celular. Además, la invención posibilita también una mejora de la actividad funcional de células progenitoras aisladas antes de un transplante, para mejorar así adicionalmente la regeneración cardiaca mediante una terapia celular después de lesión isquémica.
Los datos del presente estudio muestran adicionalmente que las células mononucleares que se aislaron de la médula ósea de pacientes con miocardiopatía isquémica presentan una actividad significativamente reducida en el apoyo de la neovascularización en ratones desnudos después de la inducción de isquemia de miembro posterior por interrupción. Así, se redujo significativamente la capacidad funcional de las BMP, determinada mediante su actividad formadora de colonias y su respuesta migratoria al SDF–1, en BMP que se aislaron de pacientes con MCIC. La inyección de estas BMP de pacientes con MCIC en ratones con isquemia de miembro posterior mostró una capacidad significativamente reducida de reconstituir la perfusión del miembro posterior después de ligamiento unilateral de la arteria femoral. Puede concluirse por tanto que la actividad funcional reducida limita el potencial de neovascularización de las BMP de pacientes con MCIC. El perjuicio funcional de las BMP de pacientes con MCIC puede limitar también su potencial terapéutico para terapia celular médica, particularmente cuando se usa una vía intravascular de administración, que requiere que las células progenitoras se extravasen frente a un gradiente de un quimioatractor para migrar a tejidos isquémicos. El control de la actividad migratoria y formadora de colonias de las células progenitoras antes de la terapia puede servir como indicativo para la identificación de pacientes que podrían conseguir una mayor ventaja de la terapia celular. Por otro lado, un estudio experimental reciente deja suponer que las BMP totalmente funcionales de ratones donantes sanos pueden reconstituir la angiogénesis reducida causada por la edad en un modelo de ratón. Por tanto, parece prometedor que una manipulación farmacológica o genética de las BMP perjudicadas funcionalmente antes de la infusión pueda mejorar su actividad funcional y consiguientemente pueda mejorar la ventaja terapéutica del paciente ante la terapia.
La invención se describirá detalladamente ahora en los siguientes ejemplos con referencia a las Figuras adjuntas, sin que deba limitarse sin embargo a éstas. Las figuras muestran:
la Figura 1 una angiografía ventricular izquierda cuantitativa que muestra la fracción de eyección (A), los volúmenes telesistólico y telediastólico (B) en el valor inicial y el seguimiento de pacientes que recibieron células progenitoras circulantes derivadas de la sangre (BDP) o derivadas de médula ósea (BMP) y de pacientes del grupo de control no aleatorizado;
la Figura 2 la correlación entre los valores iniciales de la fracción de eyección del ventrículo izquierdo y la mejora de la fracción de eyección con la curva de regresión para todo el grupo de estudio:
la Figura 3 el valor medio de mejora funcional y la reducción del tamaño de infarto en pacientes que muestran células progenitoras con capacidad migratoria baja o alta;
la Figura 4 el análisis de citometría de flujo de marcadores de células progenitoras en BMP de controles sanos y de pacientes con miocardiopatía isquémica estable, a–c, no se observaron diferencias significativas entre los dos grupos, y
la Figura 5 la actividad funcional de las BMP de controles sanos y de pacientes con miocardiopatía isquémica estable, a, se determinaron las unidades de formación de colonia por 5 x 105 BMP después de 14 días, b, la capacidad migratoria de las BMP en respuesta al factor 1 derivado de células estromales (SDF–1) y, c, se midió el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) usando el ensayo de invasión BioCoat®, d, correlación entre la migración inducida por SDF–1 y la capacidad de formación de colonia y, e, correlación entre la migración inducida por VEGF y la capacidad de formación de colonia. Ejemplos Pacientes
Se admitieron en los estudios pacientes de entre 18 y 75 años en caso de que tuvieran un primer infarto de miocardio agudo con elevación de ST que se hubiera tratado de forma aguda mediante prótesis endovascular coronaria con bloqueo de GPIIb/IIIa. Eran criterios de exclusión la presencia de choque cardiogénico (definido como una presión sanguínea sistólica < 10,7 kPa que requiriera vasotensores intravenosos o globo de contrapulsación aórtica), hemorragias graves que requirieran transfusión sanguínea después de tratamiento de reperfusión aguda, historial de leucopenia, trombocitopenia, disfunción hepática o renal, señales de enfermedades malignas o reluctancia a tomar parte. El comité ético de la Clínica Universitaria de la Universidad Johann Wolfgang Goethe en Frankfurt, Alemania, aprobó el protocolo del estudio llevado a cabo y el estudio se llevó a cabo en cumplimiento con la Declaración de Helsinki. Cada paciente recibió un consentimiento informado por escrito.
Se seleccionaron como grupo de referencia interno que reflejara el patrón de cuidados que se administraban en el hospital 15 pacientes, que se compararon por fracción de eyección, lugar de infarto y tamaño de infarto con la población de estudio, en los que se llevó a cabo una terapia de reperfusión aguda mediante implante de prótesis endovascular y estaban disponibles para angiogramas de VI agudo y de seguimiento de 4 meses apareados. Protocolo del estudio llevado a cabo
El protocolo de estudio se ha descrito previamente (Assmus B, Schachinger V, Teupe C, Britten M, Lehmann R, Dobert N, Grunwald F, AicherA, Urbich C, Martin H, Hoelzer D, Dimmeler S, Zeiher AM. “Transplantation of Progenitor Cells and Regeneration Enhancement in Acute Myocardial Infarction (TOPCARE–AMI)”. Circulation. 2002; 106: 3009–17). Resumiendo, se asignó aleatoriamente a pacientes la recepción de una infusión intercoronaria de células progenitoras de médula ósea (BMP) y/o células progenitoras circulantes derivadas de la sangre (BDP) 4 días después del IMA.
En los pacientes que recibieron células progenitoras de médula ósea (BMP), se obtuvieron la mañana del día del transplante de células 50 ml de aspirado de médula ósea. Las células mononucleares derivadas de médula ósea (BMC) se obtuvieron mediante centrifugación en gradiente de densidad. Después de dos etapas de lavado, se resuspendieron las células en 10 ml de medio X–vivo 10 (Biowhittaker). La suspensión celular estaba compuesta por poblaciones celulares heterogéneas que, además de células progenitoras hematopoyéticas, que se determinaron mediante análisis de FACS usando anticuerpos conjugados directamente frente a CD34 (FITC, Becton Dickinson), anti–CD45 (Becton Dickinson), CD 14 (BD Pharmingen, San Diego, US), CXCR4 (BD Pharmingen), CD49d (BD Pharmingen) y CD133 (Miltenyl Biotech, Bergisch Gladbach, Alemania) humanos, contenían también otros tipos celulares (por ejemplo, células de poblaciones secundarias, células estromales, etc.). En conjunto, se infundieron un valor medio de 5,5 ± 3,6 x 106 células positivas de CD34/CD45 (aprox. el 2,5 % de 219 ± 82 x 106 células mononucleares) por
paciente.
En los pacientes que recibieron células progenitoras circulantes derivadas de la sangre (BDP), se recogieron 250 ml de sangre venosa inmediatamente después de la asignación aleatoria (24 horas después del IMA). Se suspendieron células mononucleares en medio X– vivo–15 (Biowhittaker, Apen, Alemania), se completó con VEGF recombinante humano exento de vehículo 1 ng/ml (R&D, Wiesbaden, Alemania), atorvastatina 0,1 µM (Pfizer, Freiburg, Alemania) y suero humano al 20 %, extraído de cada paciente individual. Se sembraron las células a una densidad de 6,4 x105 células/mm2 sobre placas recubiertas con fibronectina (Roche, Grenzach, Alemania), Después de 3 días de cultivo, se retiraron por lavado las células con EDTA 0,5 mM, se lavaron dos veces y se resuspendieron en un volumen final de 10 ml de medio X–vivo 10. La suspensión celular obtenida (media de células inyectadas 17 ± 12 x 106) recibió una población heterogénea de células progenitoras. Sin embargo, más de un 90 % de las células mostraban características endoteliales, como captación de LDL mediante Dil acetilado y unión a lecitina y se mostró la expresión de proteínas marcadoras de endotelio típicas incluyendo VEGFR2 (KDR) (ReliaTech, Braunschweig, Alemania), endoglina (CD105) (NeoMarkers, Asbach, Alemania), factor de Willebrand (vWF) (Oncogene, Schwalbach, Alemania) y molécula de adhesión a células endoteliales–plaquetas 1 (PECAM–1/CD31) (Dianova, Hamburgo) (Assmus B, Schachinger V, Teupe C, Britten M, Lehmann R, Dobert N, Grunwald F, AicherA, Urbich C, Martin H, Hoelzer D, Dimmeler S, Zeiher AM. “Transplantation of Progenitor Cells and Regeneration Enhancement in Acute Myocardial Infarction (TOPCARE– AMI)”. Circulation. 2002; 106: 3009–17, Dimmeler S, Aicher A, Vasa M, Mildner–Rihm C, Adier K, Tiemann M, Rutten H, Fichtlscherer S, Martin H, Zeiher AM. “HMG–CoA reductase inhibitors (statins) increase endotelial progenitor cells via the PI 3–kinase/Akt pathway”. J. Clin. Invest. 2001; 108: 391–7, Vasa M, Fichtlscherer S, Aicher A, Asier K, Urbich C, Martin H, ZeiherAM, Dimmeler S. “Number and migratory activity of circulating endothelial progenitor cells inversely correlate with risk factors for coronary artery disease”. Circ. Res. 2001; 89: E1–7., Vasa M, Fichtlscherer S, Adier K, Aicher A, Martin H, Zeiher AM, Dimmeler S. “Increase in circulating endothelial progenitor cells by statin therapy in patients with stable coronary artery disease”. Circulation. 2001, 103: 2885–90).
Se infundieron las células mediante un catéter con globo a través del alambre, que se insertó en la prótesis endovascular implantada previamente durante el procedimiento de reperfusión aguda, y se bombeó a baja presión para bloquear totalmente el flujo sanguíneo durante 3 minutos para posibilitar una adhesión y potencial transmigración de las células infundidas a través del endotelio. Se repitió esta maniobra 3 veces para posibilitar la infusión de los 10 ml completos de células progenitoras, interrumpida por 3 minutos de reflujo por desinflado del globo para minimizar una isquemia extensa. Después de completado el transplante de células intracoronario, se repitió una angiografía coronaria para asegurar la apertura de los vasos y un flujo sin obstáculos de material de contraste.
Determinación de la capacidad migratoria de las células progenitoras transplantadas
Inmediatamente antes de la infusión intracoronaria de células, se resuspendió una muestra de células progenitoras en 500 µl de medio basal endotelial (EBM, Cell Systems), se recontó y se dispusieron 2 x 104 células en la cámara superior de una cámara de Boyden modificada. Se dispuso entonces la cámara en una placa de cultivo de 24 pocillos que contenía EBM y VEGF 50 ng/ml para la medida de la capacidad migratoria de las células progenitoras circulantes derivadas de la sangre o SDF–1 100 ng/ml para la medida de la capacidad migratoria de las células progenitoras derivadas de médula ósea. Después de 24 horas de incubación a 37 ºC, se lavó el lado inferior del filtro con PBS y se fijó con paraformaldehído al 2 %. Para la medida, se colorearon los núcleos celulares con DAPI. Se recontaron manualmente las células que migraban a la cámara inferior en 5 campos microscópicos aleatorios por un investigador ajeno (Vasa M, Fichtlscherer S, Aicher A, Asier K, Urbich C, Martin H, Zeiher AM, Dimmeler S. “Number and migratory activity of circulating endothelial progenitor cells inversely correlate with risk factors for coronary artery disease”. Circ. Res. 2001; 89: E1–7, Asahara T, Takahashi T, Masuda H, Kalka C, Chen D, Iwaguro H, Inai Y, Silver M, Isner JM. “VEGF contributes to postnatal neovascularization by mobilizing bone marrow–derived endothelial progenitor cells”. Embo. J. 1999; 18: 3964–72.). Ensayo de unidades formadoras de colonia
Se sembraron BMP (1 x 105 por placa) sobre placas de metilcelulosa (Methocult GF H4535, que contenían los factores de células madre G–CSF, GM–CSF, interleucina 3, interleucina 6, CellSystems, St. Katharinen, Alemania). Se examinaron las placas por microscopía de contraste de fases y se recontaron las unidades formadoras de colonia de granulocitos–macrófagos (UFC–GM; colonias) después de 14 días de incubación por dos investigadores distintos. Angiografía ventricular izquierda
Se obtuvieron los angiogramas de VI según las directrices de registro estándar. Se calcularon la fracción y volúmenes de eyección de VI usando el procedimiento de superficie y longitud (Dodge HT Sh, Ballew DW, et al. “The use of biplane angiography for the measurement of left ventricule volume in man”. Eur. Heart J. 1960; 60: 762–776) y se determinó el movimiento de pared regional mediante el uso del procedimiento de cuerda de línea media (Sheehan F, Bolson E, Dodge H, Mathey D, Schofer J, Woo H. “Advantages and applications of the centerline method for characterizing regional ventricular function”. Circulation. 1986; 74: 293–305).
Las variables continuas se representan como media ± DE. Las variables categóricas se compararon con la prueba de chi cuadrado o la prueba exacta de Fischer. Las comparaciones estadísticas entre datos iniciales y de seguimiento se llevaron a cabo de modo no paramétrico usando la prueba de signos apareados. La correlación lineal no paramétrica se calculó usando la correlación de Spearman. El análisis multivariante se llevó a cabo usando el modelo de regresión lineal. Se aceptó significación estadística en caso de p < 0,05. Todos los análisis estadísticos se llevaron a cabo usando SPSS (versión 11.0, SPSS Inc.).
Se muestran las características demográficas, clínicas y angiográficas de la población de estudio en la Tabla I. No había diferencias significativas en ninguno de los parámetros de valores iniciales. Efectos de la terapia de células progenitoras sobre la función del VI
La Figura 1 y la Tabla I muestran la fracción de eyección del VI, los volúmenes de VI telesistólico y telediastólico antes y 4 meses después de la infusión intracoronaria de células progenitoras. El transplante de células progenitoras estaba asociado a una profunda mejora de la fracción de eyección del VI de 49,2 ± 10 % a 58,3 ± 10 % (p < 0,001, Figura 1A) y una significativa reducción del volumen telesistólico del VI de 55,2 ± 18 ml a 44,1 ± 19 ml (p = 0,009, Figura 1B), independientemente del tipo celular infundido. Un análisis detallado del movimiento de pared regional dio como resultado las mejoras más claras en la región límite que limita con la región de infarto central (Tabla 2).
En contraposición a ello, no se verificaron alteraciones significativos en el grupo de referencia de pacientes que no habían recibido infusión de células progenitoras, pero sin embargo se habían tratado igual (Figura 1 y Tabla 2). Por tanto, la mejora de la fracción de eyección del VI global en el grupo de referencia era significativamente menor (p= 0,024), a pesar de valores de inicio similares, y aumentó en lugar de ello el volumen de VI telesistólico después de 4 meses (p= 0,002).
Se confirmó la mejora de la función del VI en pacientes tratados con células progenitoras mediante ecocardiografía y se mantuvo en aquellos pacientes que se sometieron a un análisis posterior al cabo de 12 meses (BDP n = 14, BMP n = 10). Ninguno de estos pacientes experimentó ninguna arritmia maligna durante el tiempo de seguimiento.
La Figura 2 muestra que había una correlación inversa estrecha entre los valores iniciales de partida de la fracción de eyección del VI y la mejora de la fracción de eyección durante los 4 meses de seguimiento, lo que demostraba que aquellos pacientes con perjuicios más graves en la función del VI se beneficiaban más con respecto a la mejora de la fracción de eyección, independientemente del tipo celular infundido.
Efectos de la terapia de células progenitoras sobre el tamaño de infarto medido mediante IRM
26 pacientes que se sometieron a una IRM en serie inicial y después de 4 meses de seguimiento no se eligieron en el estudio total con respecto a la mejora de la fracción de eyección del VI (de 50,7 ± 8 % a 60,5 ± 8 %, p < 0,001) o la reducción del volumen telesistólico del VI (de 53,7 ± 17 ml a 40,8 ± 15 ml, p < 0,002). De forma importante, en una infusión intracoronaria de células progenitoras, estaba presente una reducción significativa del volumen de realce tardío de 39,3 ± 34 a 31,6 ± 28 ml, p < 0,038, lo que indicaba una reducción significativa del tamaño de infarto. De nuevo, no había diferencias significativas entre los pacientes que recibieron BDP en comparación con los pacientes de BMP. Número y capacidad migratoria de las células progenitoras transplantadas
El número absoluto de células progenitoras infundidas no se correlacionaba con una función de VI global o regional mejorada ni con una reducción del tamaño de infarto cuando se usaban recuentos celulares totales o de subgrupos (por ejemplo, células positivas de CD34/CD45 o CD34/CD133) (fracción de eyección global: BDP: r= –0,73, p= 0,2; BMP: r= – 0,147, p= 0,517; tamaño de infarto: BDP: r= –0,187, p= 0,5; BMP: r= –0,084, p= 0,776). No se encontraron diferencias significativas en la mejora funcional cuando los recuentos celulares se dicotomizaron.
En contraposición con esto, la dicotomización de la capacidad migratoria de las células progenitoras en aquellas por encima y por debajo del valor medio, dio como resultado que los pacientes que recibieron células con una alta capacidad migratoria mostraban una mejora significativa de la función del VI regional, como se ha mostrado mediante angiografía de VI cuantitativa en la zona límite de la región de infarto, comparados con pacientes que recibieron células progenitoras con una baja capacidad migratoria (Figura 3). Como se representa en la Figura 3, la reducción absoluta de la significación del realce tardío era mayor en pacientes que recibieron células con una alta capacidad migratoria comparados con aquellos que recibieron células progenitoras con baja capacidad migratoria.
Sin embargo, ni las variables clínicas ni los parámetros funcionales antes del transplante de células como, por ejemplo, fracción de eyección del VI global, volúmenes telediastólico y telesistólico del VI o función del VI regional, diferían entre ambos grupos en los valores iniciales de partida (Tabla 3), lo que excluía por tanto cualquier efecto potencial adicional de la gravedad de la enfermedad sobre la actividad migratoria celular en el valor inicial. Análisis multivariante de factores de predicción independientes de la mejora funcional y la reducción del tamaño de infarto
Para identificar los factores de predicción independientes de la mejora funcional y la reducción del tamaño de infarto en asociación con la infusión intracoronaria de células progenitoras en las arterias infartadas de pacientes con infarto de miocardio agudo, los inventores llevaron a cabo un análisis multivariante que incluía todos los parámetros que eran estadísticamente significativos o aproximadamente mediante análisis univariante o de los que era conocido que influían en la función del VI o el tamaño de infarto. Como se muestra en la Tabla 4A, la capacidad migratoria de las células progenitoras transplantadas seguía siendo el factor de predicción independiente estadísticamente más significativo de la reducción del tamaño de infarto, como se midió mediante la reducción del volumen de realce tardío. El único otro factor de predicción independiente era la fracción de eyección de los valores iniciales, mientras que ni el tamaño de infarto inicial ni la edad, sexo o tiempo hasta revascularización seguían siendo factores de predicción independientes. Igualmente, como se resume en la Tabla 4B, la capacidad migratoria predecía también independientemente la mejora de la función del VI regional. Por tanto, la capacidad migratoria de las células infundidas es un determinante independiente principal de la mejora funcional y de la reducción del tamaño de infarto en la terapia con células progenitoras en pacientes con infarto de miocardio agudo. Número y capacidad migratoria de las BMP
Se examinaron las características y actividad funcional de las BMP usando aspirados de médula ósea de 18 pacientes con MCIC y 8 voluntarios totales. Se representan en la Tabla 5 las características de los valores iniciales de las poblaciones de estudio.
Para examinar si se reduce el número de células progenitoras con respecto a las BMP en pacientes con MCIC en comparación con el control total, se determinó el número de células progenitoras hematopoyéticas, que se caracterizan por la expresión de la proteína marcadora CD34. El número de CD34+/CD45+ era similar tanto en controles sanos como en pacientes de MCIC (Figura 4). Además, no se diferencia tampoco entre los grupos (Figura 4) el subconjunto inmaduro de células progenitoras hematopoyéticas, que se han definido como células CD133+/CD34+ y linaje–/CD34+.
Se determinó la actividad de células progenitoras de las células progenitoras de aspirados de médula ósea además mediante la medida de la actividad formadora de colonias y la migración. De forma interesante, las BMP de pacientes con MCIC mostraron un número significativamente reducido de unidades formadoras de colonia, comparadas con las BMP de controles sanos (37,3 ± 25,0 UFC–GM/placa frente a 113,8 ± 70,4 UFC–GM/placa, p = 0,009) (Figura 5a). La respuesta migratoria a SDF–1 y VEGF estaba también significativamente reducida en las BMP de pacientes con MCIC, comparadas con las BMP de controles sanos (VEGF: 34 ± 24,2 frente a 54,8 ± 29,3 células/campo microscópico; p = 0,027; SDF–1: 46,3 ± 26,2 frente a 108,6 ± 40,4 células/campo microscópico; p = 0,001) (Figuras 5b y c). Análogamente, se correlacionaba estrechamente la capacidad formadora de colonias con la respuesta migratoria a SDF–1 (r = 0,65; p < 0,001) (Figura 5d).
Factores de predicción independientes para la actividad funcional de BMP
5 La migración inducida por SDF–1, pero no la migración basal o la migración inducida por VEGF, se correlacionaba con la mejora funcional de la neovascularización en el modelo de isquemia en miembro posterior (r = 0,78; p< 0,001) (Figura 6). La actividad formadora de colonia de las BMP estaba también asociada significativamente a la capacidad de neovascularización de las células (r = 0,74; p< 0,001). Las distintas características basales
10 clínicas de los pacientes estaban también asociadas al efecto terapéutico de las BMP en el modelo de ratón de isquemia en miembro posterior (Tabla 6, columna izquierda), pero todas las variables menos la migración inducida por SDF–1 perdían su significación estadística cuando el análisis se limitaba a pacientes con MCIC (Tabla 6, columna derecha) Para una predicción del valor umbral de la mejora funcional de la neovascularización, se
15 determinó, por ejemplo, un valor umbral potencial para una preparación de BMP como se describe anteriormente que dio como resultado los siguientes valores basados en SDF–1 y VEGF:
Tabla A: Migración de BMP
- Migración por SDF (x 1000)
- Migración por VEGF (x 1000)
- N
- Válido 82 83
- Ausente
- 253 252
- Media
- 70,2500 43,0000
- Percentil
- 25
- 38,1250 22,0000
- 33,333
- 47,6667 25,0000
- 50
- 70,2500 43,0000
- 66,666
- 104,0000 78,2500
- 75
- 120,7500 96,0000
Los valores numéricos indican cuántas células de las 500.000 células usadas 20 transmigran en 24 h. 100 x 1000 significa así que el 20 % de las células transmigran.
Para una predicción del valor umbral de la mejora funcional de la neovascularización, se determinó, por ejemplo, un valor umbral potencial para una preparación de BDP como se describe anteriormente que dio como resultado los siguientes valores basados en VEGF:
- N
- Válido 120
- Ausente
- 215
- Media
- 4,8500
- Percentil
- 25
- 2,2250
- 33,333
- 2,8667
- 50
- 4,8500
- 66,666
- 7,7667
- 75
- 10,7000
Para las BMP, sería por tanto un valor umbral aceptable (más preferido), basado en la media en el examen con SDF–1, 70 x 1000 células migradas (es decir, aprox. un 14 %). Para las BMP, sería por tanto un valor umbral aceptable (más preferido), basado en la media en el examen con VEGF, 43 x 1000 células migradas (es decir, aprox. un 8,6 %).
5 Para las BDP, sería en cambio un valor umbral aceptable (más preferido), basado en la media en el examen con VEGF, 4,85 x 1000 células migradas (es decir, aprox. un 1 %).
A pesar del hecho de que no todas las poblaciones celulares migran igual, puede obtenerse por tanto una información basada en la migración total de todas las células de lo bien que migran las células del paciente y de si éstas son por tanto adecuadas.
- Grupo de BDP
- Grupo de BMP Controles (no aleatorizados) Valor de p
- n= 23
- n= 23
- n= 15 n.s.
- Edad (años)
- 50 ± 10 52 ± 10 54 ± 13 n.s.
- Sexo masculino (%)
- 87 86 80 n.s.
- Hipertensión (%)
- 57 48 60 n.s.
- Hiperlipidemia (%)
- 7 60 80 n.s.
- Diabetes (%)
- 17 27 7 n.s.
- Tabaquismo (%)
- 83 91 73 n.s.
- Cajetillas diarias x año
- 32 ± 24 35 ± 23 n.d. n.s.
- Historial familiar de ECC (%)
- 26 50 40 n.s.
- ECC (1/2/3 enfermedades vasculares %)
- 74/26/0 59/41/0 9/3/3 n.s.
- Historial de ECC (%)
- 0 0 0 n.s.
- Región de infarto (anterior/inferior)
- 65/35 50/50 60/40 n.s.
- Grupo de BDP
- Grupo de BMP Controles (no aleatorizados) Valor de p
- (%)
- Vasos anexos al infarto (%)
- n.s.
- LAD
- 61 46 53 n.s.
- LCX
- 22 4 13 n.s.
- RCA
- 17 5 34 n.s.
- Terapia primaria
- 91 73 93 n.s.
- PTCA/prótesis endovascular(es) tiempo para la neovascularización (valor medio/media)
- 17 ± 27/4 32 ± 49/14 16 ± 24/5 n.s.
- Flujo TIMI III después de reperfusión (%)
- 87 91 n.d. n.s.
- Fracción de eyección (evaluada visualmente)
- 43 ± 11 40 ± 8 40 ± 7 n.s.
- RCP durante IM agudo (n)
- 0 2 1 n.s.
- Creatina cinasa máx. (U/1)*
- 940 ± 725 781 ± 630 915 ± 740 n.s.
- CK MB máx. (U/1)*
- 104 ± 67 94 ± 106 146 ± 128 n.s.
- Medicación después del alta
- Aspirina (%)
- 100 100 100 n.s.
- Clopidogel (%)
- 100 100 100 n.s.
- Inhibidor de ACE (%)
- 96 100 93 n.s.
- Bloqueante beta (%)
- 100 100 100 n.s.
- Estatina (%)
- 100 100 93 n.s.
- Tiempo de prótesis endovascular hasta terapia celular (h)
- 119 ± 27 111 ± 41 – n.s.
- Número de células inyectadas (millones)
- 17 ± 12 219 ± 82 – <0,001
- Antes de la terapia celular
- Número de leucocitos (/nl)
- 12,4 ± 4,2 12,8 ± 3,6 – n.s.
- Proteína C reactiva (mg/dl)
- 2,8 ± 2,2 3,2 ± 2,4 – n.s.
- Troponina T (ng/ml)
- 2,0 ± 1,4 2,2 ± 1,9 –
- 24 horas después de la terapia celular
- Grupo de BDP
- Grupo de BMP Controles (no aleatorizados) Valor de p
- Número de leucocitos (/nl)
- 8,5 ± 2,1 9,8 ± 1,9 – 0,02
- Proteína C reactiva (mg/dl)
- 2,6 ± 2,3 3,1 ± 1,9 – n.s.
- Troponina T (ng/ml)
- 1,3 ± 1,0 1,5 ± 1,2 – n.s.
- RCP= resucitación cardiopulmonar * sin pacientes con RPC
Tabla 2: Función de VI cuantitativa global y regional
- BDP (n= 23)
- Valor inicial Seguimiento Valor de p
- Fracción de eyección (%)
- 49 ± 10 58 ± 10 0,004
- Volumen telediastólico (ml)
- 107 ± 25 108 ± 33 n.s.
- Volumen telesistólico (ml)
- 53 ± 14 45 ± 18 0,035
- Movimiento de pared regional (DE/cuerda)
- Infarto
- –1,5 ± 0,3 –0,7 ± 0,6 <0,001
- Centro del infarto
- –1,6 ± 0,4 –0,8 ± 0,7 <0,001
- Límite del infarto
- –1,5 ± 0,2 –0,5 ± 0,6 <0,001
- BMP (n= 23)
- Valor inicial Seguimiento Valor de p
- Fracción de eyección (%)
- 49 ± 10 59 ± 9 0,003
- Volumen telediastólico (ml)
- 114 ± 29 101 ± 33 n.s.
- Volumen telesistólico (ml)
- 57 ± 21 43 ± 21 0,003
- Movimiento de pared regional (SD/cuerda)
- Infarto
- –1,5 ± 0,3 –0,5 ± 0,6 <0,001
- Centro del infarto
- –1,7 ± 0,4 –0,7 ± 0,6 <0,001
- Límite del infarto
- –1,4 ± 0,2 –0,4 ± 0,7 <0,001
- Control (n= 15)
- Valor inicial Seguimiento Valor de p
- Fracción de eyección (%)
- 50,3 ± 9,3 52,6 ± 9,4 0,379
- Volumen telediastólico (ml)
- 101,3 ± 22,6 120,0 ± 47,0 0,108
- Volumen telesistólico (ml)
- 50,9 ± 16,7 57,6 ± 30,6 0,363
- Movimiento de pared regional (SD/cuerda)
- n.d. n.d. –
Tabla 3: Parámetros del punto de partida entre pacientes que recibieron células con alta capacidad migratoria comparados con aquellos que recibieron células progenitoras con baja capacidad migratoria
- Valor inicial
- Alta capacidad migratoria, n= 16 Baja capacidad migratoria, n= 15 Valor de p
- Edad (años)
- 48 ± 11 50 ± 9 n.s.
- Sexo (masc./fem.)
- 15/1 13/2 n.s.
- Número de factores de riesgo (%)
- 2,7 ± 0,9 2,6 ± 0,9 n.s.
- Área de infarto (ant./inf., %)
- 75/25 60/40 n.s.
- Fracción de eyección (%)
- 48 ± 8 49 ± 12 n.s.
- Volumen telediastólico (ml)
- 104 ± 22 118 ± 25 n.s.
- Volumen telesistólico (ml)
- 53 ± 15 59 ± 20 n.s.
- Movimiento de pared regional (DE/cuerda)
- n.s.
- Infarto
- –1,5 ± 0,2 –1,5 ± 0,3 n.s.
- Centro del infarto
- –1,7 ± 0,3 –1,6 ± 0,3 n.s.
- Límite del infarto
- –1,4 ± 0,2 –1,5 ± 0,3 n.s.
- Valor de movimiento de la pared de separación
- 7,0 ± 2,4 6,7 ± 3,0 n.s.
- Volumen de realce tardío (ml)
- 39 ± 44 35 ± 22 n.s.
Tabla 4A: Análisis multivariante de los factores de predicción independientes de la
reducción del tamaño de infarto
- � del volumen de realce tardío r
- Valor de P
- Sexo
- –0,094 n.s.
- Edad
- –0,099 n.s.
- Tiempo hasta revascularización
- 0,329 n.s.
- Valores iniciales de fracción de eyección
- 0,784 0,016
- Valores iniciales de volumen de realce tardío
- 0,184 n.s.
- Migración alta/baja, r= coeficiente de correlación
- –0,883 0,007
Tabla 4B: Análisis multivariante de los factores de predicción independientes de la mejora regional de la función de VI
- � del valor de movimiento de la pared de separación r
- Valor de P
- Sexo
- 0,076 n.s.
- Edad
- 0,6 0,035
- Tiempo hasta revascularización
- 0,165 n.s.
- Valores iniciales de fracción de eyección
- 0,403 n.s.
- Valores iniciales del valor de movimiento de la pared de separación
- –0,735 0,008
- Migración alta/baja, r= coeficiente de correlación
- –0,619 0,021
Tabla 5: Características de los valores iniciales de la población de estudio
- Pacientes con MCIC
- Control sano Valor de P
- Edad (años)
- 59,4 ± 13,4 54 ± 13 <0,001
- Sexo masculino (%)
- 88,9 87,5 0,65
- Hipertensión (%)
- 57 0 <0,001
- Hiperlipidemia (%)
- 70 25 <0,001
- Diabetes (%)
- 17 0 <0,001
- Tabaquismo (%)
- 82,4 37,5 <0,001
- Historial familiar de ECC (%)
- 52,9 25,0 <0,001
- ECC (1/2/3 enfermedades vasculares %)
- 17,6/52,9/29,4 n.a.
- Historial de ECC (%)
- 100 n.a.
- Región de infarto (anterior/inferior) (%)
- 65/35 n.a.
- Fracción de eyección (evaluada visualmente)
- 37,8 ± 11,1 62,6 ± 3,1 <0,001
- Medicación después del alta
- Aspirina (%)
- 100 0
- Clopridogel (%)
- 100 0
- Inhibidor de ACE (%)
- 100 0
- Bloqueante beta (%)
- 100 0
- Estatina (%)
- 100 0
- Proteína C reactiva (mg/dl)
- 3,0 ± 2,5 2,9 ± 1,7 0,51
- Número de leucocitos (x103/nl)
- 7,9 ± 3,7 6,8 ± 2,9 0,85
Tabla 6: Análisis de regresión lineal univariante de la relación entre características clínicas así como las medidas in vitro y la capacidad de neovascularización de las BMP en un modelo de ratón de isquemia de miembro posterior
- Pacientes y controles sanos
- Sólo pacientes
- r
- Valor de P r Valor de P
- Edad
- –0,38 0,064 0,260 0,33
- Sexo
- 0,032 0,87 –0,165 0,49
- Hipertensión
- –0,646 0,001 –0,204 0,43
- Hiperlipidemia
- –0,598 0,002 0,114 0,68
- Historial familiar de ECC
- –0,403 0,001 0,134 0,61
- Diabetes
- –0,641 0,001 –0,088 0,74
- Número de factores de riesgo
- –0,540 0,006 0,174 0,52
- Clasificación de la NYHA
- –0,630 0,001 –0,116 0,66
- Fracción de eyección (%)
- 0,720 0,001 0,315 0,273
- Migración basal
- 0,380 0,061 0,456 0,05
- Migración inducida por SDF–1
- 0,781 <0,001 0,634 0,004
- Migración inducida por VEGF
- 0,352 0,078 0,374 0,13
- Capacidad de formación de colonia
- 0,740 <0,001 0,074 0,785
- r= coeficiente de correlación
Claims (13)
- REIVINDICACIONES
- 1.
- Procedimiento in vitro para la estratificación de pacientes con enfermedades cardiovasculares para una terapia celular programada basada en células progenitoras de médula ósea (BMP) y/o células progenitoras circulantes derivadas de la sangre (BDP) para aumentar la perfusión de tejidos isquémicos o para la regeneración de la pérdida de tejido, en el que el procedimiento comprende las siguientes etapas:
a) aislamiento de BMP y/o BDP mediante marcadores de superficie específicos de célula a partir de una muestra, y b) comprobación de la funcionalidad cardiovascular de las BMP y/o BDP aisladas mediante un ensayo de migración adecuado. -
- 2.
- Procedimiento según la reivindicación 1, que comprende además la comparación de los resultados obtenidos a partir de la muestra examinada con un valor de referencia y/o el resultado de una muestra de referencia.
-
- 3.
- Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que la muestra a examinar se selecciona del grupo compuesto por médula ósea, sangre periférica o fracciones de la misma y suspensiones de cultivo celular o fracciones del mismo.
-
- 4.
- Procedimiento según la reivindicación 3, en el que la muestra a examinar se ha extraído mediante punción de la médula ósea.
-
- 5.
- Procedimiento según la reivindicación 3, en el que se añade a la sangre periférica un inhibidor de la coagulación.
-
- 6.
- Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el aislamiento comprende el uso de centrifugación en gradiente de densidad y/o procedimientos inmunológicos.
-
- 7.
- Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el marcador de superficie específico de célula para BMP se selecciona de CD34, CD45 y/o CD133, y para BDP se selecciona de VEGFR2, CD105, vWF y/o CD31.
-
- 8.
- Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el ensayo de
migración se lleva a cabo en una cámara de Boyden o cámara de Boyden modificada. -
- 9.
- Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el ensayo de migración se lleva a cabo usando SDF–1 para BMP o VEGF para BDP, o P1GF o MCP–1.
-
- 10.
- Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 9, en el que las enfermedades cardiovasculares se seleccionan del grupo compuesto por angina estable e inestable, enfermedad cardiaca coronaria estable, síndrome coronario agudo, infarto de miocardio, infarto de miocardio agudo, síndrome cardiaco agudo, enfermedad arterial coronaria, miocardiopatía
510 isquémica crónica (MCIC), miocardiopatía dilatada (MCD), insuficiencia cardiaca u otras causas de un fallo cardiaco. - 11. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 10, en el que las BMP y/o BDP aisladas examinadas son autólogas de los pacientes.15
- 12. Procedimiento in vitro para la comprobación de la funcionalidad cardiovascular de células progenitoras de médula ósea (BMP) y/o células progenitoras circulantes derivadas de la sangre (BDP) específicas a partir de una muestra de un donante mamífero, que comprende:a) facilitar una muestra y 20 b) llevar a cabo un procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 11.
- 13. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que las BMP y/o BDP aisladas se modifican genéticamente de manera adicional.
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