MX2011004501A - Inmunoensayo de galectina-3. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a métodos y composiciones para detectar específica y cuantitativamente la galectina-3 en una muestra; las modalidades de la invención incluyen un ensayo de detección en donde una porción de unión de captura y una porción de unión etiquetada reconocen específicamente epítopes no traslapantes en la N-terminal de la galectina-3; modalidades adicionales se dirigen a un método para establecer escalas de las concentraciones de galectina-3 indicadoras de la presencia y severidad de la insuficiencia cardiaca en un sujeto y un método para predecir el resultado clínico de un sujeto con base en la concentración de galectina-3.

Description

INMUNOENSAYO DE GALECTINA-3 INTERREFERENCIA CON SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama el beneficio y la prioridad de la solicitud de patente provisional de EE. UU. No. 61/109,366, presentada el 29 de octubre de 2008, cuya descripción completa se incorpora aquí como referencia.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La falla cardiaca (HF) es un problema mayor de salud pública en los EE. UU. Aproximadamente 5 millones de personas padecen la enfermedad y el número de pacientes crece constantemente. La HF es un síndrome clínico común pero severo y complejo, especialmente entre las personas más viejas. La HF se refiere a una afección en la que el corazón no puede bombear suficiente sangre para cubrir las necesidades del cuerpo. Un bombeo insuficiente conlleva a la congestión de sangre y otros fluidos en el hígado, abdomen, extremidades inferiores y pulmones. De esta manera, la HF también se ha denominado falla congestiva cardiaca (CHF), aunque se prefiere el término HF porque no todos los pacientes presentan congestión de fluido. La HF produce un deterioro gradual del paciente lo que frecuentemente conlleva a mortalidad cardiovascular. De esta manera, una gran cantidad de pacientes mueren en el transcurso de uno a cinco años después del diagnóstico. Sin embargo, otros pueden permanecer estables durante periodos prolongados. La HF es una enfermedad muy diferente de la isquemia cardiaca causada por infarto del miocardio o lesión de reperfusión.

Los síntomas de HF incluyen fatiga, debilidad, latido cardiaco rápido o irregular, dificultad respiratoria, tos persistente o sibilancias, hinchazón de las extremidades inferiores o el abdomen, ganancia de peso repentina por retención de fluido, falta de apetito o náusea, y dolor del pecho. Actualmente, una prueba diagnóstica importante para la HF es el ecocardiograma bidimensional completo junto con estudios de flujo de Doppler para determinar si existen anormalidades estructurales. Esta prueba puede determinar la fracción de sangre bombeada fuera del ventrículo (la fracción de expulsión, FE), que es una medición importante de la función del corazón. La fracción de expulsión para un corazón normal es de aproximadamente 60%. También se pueden usar una o más de las siguientes pruebas: ventriculografía de radionúclido, imagenología de resonancia magnética (IRM), conteo completo de la sangre, urianálisis, electrolitos en suero, glucohemoglobina y lípidos en la sangre, pruebas de la función renal y hepática, pruebas de la función tiroidea, una radiografía del tórax, y un electrocardiograma de 12 derivaciones. Adicionalmente se pueden hacer pruebas de sangre de biomarcadores tales como el péptido natriurético de tipo B (BNP). El BNP es regulado positivamente en respuesta al estiramiento de los cardiomiocitos. De esta manera, un nivel alto de BNP es indicativo de un corazón bajo estrés, y es un buen indicador de la falla cardiaca. Sin embargo, otros mecanismos que pueden tener una función en la falla cardiaca, tales como la inflamación, pueden no ser reflejados por un aumento del BNP.

La identificación temprana de pacientes en riesgo de desarrollar HF puede prevenir un avance rápido. De esta manera, sería preferible poder identificar a los pacientes que probablemente experimentarán falla cardiaca antes de que ocurra realmente. Además, sería preferible poder identificar a los pacientes que padecen falla cardiaca que están en riesgo de desarrollar complicaciones severas o muerte prematura.

Los métodos actuales pueden excluir confiablemente la HF, pero no pueden probar confiablemente la existencia de HF, ni tampoco pueden predecir la consecuencia de la HF establecida. Por lo tanto, existe la necesidad de un método simple y confiable para predecir la probabilidad del inicio de los síntomas de HF y para determinar la severidad, etapa de la enfermedad, o para predecir la consecuencia de una falla cardiaca ya establecida.

Para encontrar marcadores bioquímicos adicionales que reflejen otros mecanismos que puedan tener una función en la falla cardiaca, se hizo un estudio de microarreglo para determinar qué genes son regulados positivamente en las ratas hipertensas que desarrollan falla cardiaca, en comparación con ratas hipertensas que permanecen compensadas (Schroen et al. (2004) Circ. Res. 95(5):515-22.). El gen regulado positivamente con más fuerza en las ratas que desarrollan falla cardiaca, fue la lectina de unión a beta-galactósido, galectina 3. Este hallazgo fue confirmado por un estudio de Sharma et al., que mostró que altos niveles de galectina 3 son predictivos del desarrollo de falla cardiaca en un modelo de hipertensión de rata (2004, Circulation 1 10(19):3121-8). Además, este estudio demostró la capacidad de la galectina 3 aplicada exógenamente para inducir falla cardiaca y exceso de depósito de colágeno. Recientemente se correlacionó la concentración de galectina 3 en plasma y suero humanos con la severidad de la HF; véase la publicación de patente internacional No. WO 2005/040817, y la correspondiente solicitud de patente de EE. UU. No. 10/575,745.

Las galectinas constituyen una familia de proteínas caracterizadas por su unión específica a galactosa. Todas comparten una secuencia de aminoácidos común en regiones de su estructura conocidas como el dominio de reconocimiento de carbohidrato, o CRD. Actualmente se han identificado 15 galectinas de mamífero. Un subgrupo contiene las galectinas 1 , 2, 5, 7, 10, 13, 14 y 15, cada una de las cuales comprende un solo CRD. Un segundo subgrupo contiene una sola especie, la galectina 3, que comprende un solo CRD unido a un dominio N-terminal que comprende repeticiones de secuencias cortas de aminoácidos tales como PGA. Un tercer subgrupo de galectina contiene las galectinas 4, 6, 8, 9 y 12, cada una de las cuales comprende 2 CRD unidos por un enlazador de longitud variable. Todas las galectinas tienen una homología significativa de secuencias de aminoácidos, y muchas aparecen en el sistema circulatorio humano.

Existen pruebas para galectina 3 pero ninguna es adecuada para uso clínico de rutina. Hasta ahora no se ha encontrado una prueba adecuada debido a la complejidad de la galectina 3 como analito. Es difícil distinguir específicamente la galectina 3 de otras galectinas en una muestra, porque la galectina 3 comparte un alto grado de similitud de secuencia con las otras 14 galectinas de mamífero, particularmente en el dominio de reconocimiento de carbohidrato (CDR) conservado. Ninguna de las otras galectinas tiene una relación conocida con la HF. Otra característica de la galectina 3 que ha impedido el desarrollo de una prueba de detección específica y reproducible es la susceptibilidad de la galectina 3 a unirse a varias proteínas, carbohidratos, ácidos nucleicos y lípidos. El diagnóstico y manejo de la HF mejorarían si se desarrollara una prueba industrialmente robusta y suficientemente sensible y específica para medir cuantitativamente, de forma reproducible, la galectina 3 en fluidos corporales como las muestras sanguíneas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Ahora se han identificado y desarrollado métodos para la detección de galectina 3 en muestras clínicas. Se ha descubierto ahora que se pueden usar dos porciones de unión que se unen específicamente a por lo menos dos epítopes separados no traslapados del extremo N de la galectina 3, para producir varios formatos específicos de prueba de sándwich que pueden proveer la reproducibilidad, especificidad y sensibilidad necesarias para diagnosticar y predecir la consecuencia de la HF en los sujetos. Por consiguiente, la presente invención provee métodos y kits para detectar la concentración de galectina 3 en una muestra clínica. Esto permite mejorar el manejo de la enfermedad y provee información diagnóstica/pronostica útil en su jerarquización y manejo.

En un aspecto, la invención se refiere a un kit para detectar la concentración de galectina 3 en una muestra. El kit incluye dos porciones de unión, por ejemplo anticuerpos monoclonales, por lo menos uno de los cuales está marcado con una marca detectable. Las dos porciones de unión se pueden unir, cada una respectivamente, a epitopes espaciados de la porción N-terminal de galectina 3, que comprenden la siguiente secuencia de 113 aminoácidos: MADNFSLHDA LSGSGNPNPQ GWPGAWGNQP AGAGGYPGAS YPGAYPGQAP PGAYPGQAPP GAYPGAPGAY PGAPAPGVYP GPPSGPGAYP SSGQPSATGA YPATGPYGAP AGP (SEQ ID NO: 1) En una modalidad, las porciones de unión se unen respectivamente a un epítope definido por al menos una porción de una de las siguientes secuencias de aminoácidos de galectina 3: MADNFSLHDALS (aminoácidos 1-12 del SEQ ID NO: 1), MADNFSLHDALSGS (aminoácidos 1-14 del SEQ ID NO: 1), GNPNPQGWPGA (aminoácidos 15-25 del SEQ ID NO: 1 ), WGNQPAGAGG (aminoácidos 26-35 del SEQ ID NO: 1), YPGQAPPGAYPGQAPPGA (aminoácidos 45-62 del SEQ ID NO: 1), o YPGAPGAYPGAPAPGV (aminoácidos 63-78 del SEQ ID NO: 1), YPGAPAPGVYPGPPSGPGA (aminoácidos 70-78 de! SEQ ID NO: 1), YPSSGQPSATGA (aminoácidos 89-100 del SEQ ID NO: 1). Aunque estos representan epítopes lineales, también se pueden usar los epítopes creados por la estructura secundaria y terciaria del extremo N y que comprenden aminoácidos de secciones espaciadas de la secuencia.

En otra modalidad, las porciones de unión usadas para detectar la galectina 3 son anticuerpos monoclonales, por ejemplo M3/38, 9H3.2 y 87B5. M3/38 detecta un epítope lineal (YPGQAPPGAYPGQAPPGA (aminoácidos 45-62 del SEQ ID NO: 1)) del extremo N de galectina 3. El M3/38 se preparó del sobrenadante del hibridoma de rata M3/38.1.2.8 HL.2, un clon que se puede encontrar en la American Type Culture Collection con el numero ATCC® TIB-166. 9H3.2 detecta un epítope lineal (MADNFSLHDALSGS (aminoácidos 1-14 del SEQ ID NO: 1 )) del extremo terminal N de galectina 3. El 9H3.2 es una IgG monoclonal de ratón, purificada por afinidad usando la proteína A. El 9H3.2 está disponible de Millipore (Millipore, 290 Concord Road, Billerica, MA 01821 , EE. UU.) No. de catálogo: MAB4033. El 87B5 detecta un epítope no lineal que comprende porciones de GNPNPQGWPGA (aminoácidos 15-25 del SEQ ID NO: 1 ) y YPGAPAPGVYPGPPSGPGAYPSSGQPSATGA (aminoácidos 70-100 del SEQ ID NO: 1). El 87B5 se preparó del clon 87B5 del hibridoma del ratón-ratón (células de bazo de ratón X63-Ag8.653xBALB/c), y es una lgG2a que fue purificada por afinidad usando la proteína A. El 87B5 está disponible de Immuno-Biological Laboratories (IBL, 8201 Central Ave NE, Suite P, Minneapolis, MN 55432, EE. UU.).

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para detectar la concentración de galectina 3 humana en una muestra de un sujeto. El método incluye someter la muestra a una prueba de sándwich de doble porción de unión. En este método, por lo menos una de las porciones de unión se marca con una marca detectable y cada una de las porciones de unión es específica para epítopes respectivos no traslapados de la porción N-terminal de la galectina 3, como los que se describen arriba. En una modalidad la marca detectable es una enzima o un fluoróforo. La prueba de sándwich puede proveer un resultado cuantitativo o un resultado cualitativo, por ejemplo un resultado indicativo de la presencia o ausencia de la concentración de galectina 3 por arriba de un umbral. El umbral puede estar por ejemplo en la escala de 5 - 10 ng/ml, 10 - 15 ng/ml; 15 - 20 ng/ml; 20 -25 ng/ml; 25 - 30 ng/ml; 30 - 35 ng/ml, o 35 - 40 ng/ml.

El método puede incluir el paso adicional de comparar el resultado obtenido en la prueba con un conjunto de datos que relacionan el resultado con una concentración de galectina 3, por ejemplo una curva patrón, para determinar la concentración de galectina 3 en la muestra, y después correlacionar la concentración inferida de galectina 3 con el riesgo que tiene un sujeto de padecer HF o el riesgo de desarrollar HF, o para evaluar la etapa o severidad de la HF del sujeto. Desde luego, el resultado también se puede correlacionar directamente con el riesgo que tiene un sujeto de padecer HF o de desarrollar HF, o para evaluar la etapa o severidad de la HF del sujeto. El método se puede repetir durante un tiempo para obtener una tendencia. Se pueden considerar variables adicionales tales como por ejemplo, sin limitación, la estatura, peso, edad y género del sujeto, las concentraciones de otros biomarcadores, etc., para determinar el riesgo de un sujeto de desarrollar HF, o para evaluar la etapa de la HF del sujeto o su severidad.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para detectar el riesgo de desarrollo o avance de la falla cardiaca en un sujeto, que incluye determinar si la concentración de galectina 3 en una muestra del sujeto rebasa un umbral en la escala de 15-20 ng/ml.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 es un diagrama de una prueba de sándwich monoclonal doble del tipo utilizado por la invención.

La figura 2 es una curva patrón ejemplar hipotética que relaciona la señal con la concentración de galectina 3 y es útil para explicar la naturaleza de la invención.

La figura 3 es una segunda curva patrón ejemplar hipotética que relaciona la señal con la concentración de galectina 3 y es útil para explicar la naturaleza de la invención.

La figura 4 es una curva ejemplar de probabilidad de supervivencia de sujetos con una concentración basal de galectina 3 arriba y abajo de un valor de umbral de 17.6 ng/ml en el estudio de HF aguda descompensada descrito en el ejemplo 2E.

La figura 5 es una curva ejemplar de probabilidad de supervivencia de sujetos con una concentración basal de galectina 3 arriba y abajo de un valor de umbral de 17.6 ng/ml en el estudio I de HF crónica descrito en el ejemplo 2F.

La figura 6 es una curva ejemplar de probabilidad de supervivencia de sujetos con una concentración basal de galectina 3 arriba y abajo de un valor de umbral de 17.6 ng/ml en el estudio II de HF crónica descrito en el ejemplo 2G.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones El término "cuantificar", como se usa aquí, se refiere al proceso de medir la cantidad de galectina 3 o la cantidad relativa de galectina 3 en una muestra, contra un estándar u otra muestra (por ejemplo en función de su concentración, masa, moles, o volumen en una muestra).

Los términos "falla cardiaca", "HF", "falla congestiva cardiaca", o "CHF", como se usan aquí, se refieren al síndrome clínico complejo que deteriora la capacidad del ventrículo para llenarse con sangre o expulsar sangre. Cualquier trastorno cardiaco estructural o funcional puede ocasionar HF, y la mayoría de los pacientes con HF tienen deteriorada la función miocárdica ventricular izquierda (LV). Los síntomas de la HF incluyen disnea (dificultad respiratoria), fatiga y retención de fluido. La American Heart Association (AHA) ha identificado 4 etapas en el desarrollo de la HF. Los pacientes en las etapas A y B muestran factores de riesgo claros pero no han desarrollado todavía la HF. Los pacientes en las etapas C y D muestran actualmente síntomas de HF, o en el pasado los han mostrado. Por ejemplo, los pacientes en la etapa A son aquellos con factores de riesgo tales como enfermedad de la arteria coronaria, hipertensión o diabetes mellitus, pero no muestran deterioro de la función ventricular izquierda (LV). Los pacientes en la etapa B son asintomáticos pero tienen anormalidades o remodelación estructural cardiaca, por ejemplo deterioro de la función LV, hipertrofia o distorsión geométrica de la cámara. Los pacientes en la etapa C tienen anormalidades cardiacas y son sintomáticos. Los pacientes en la etapa D tienen HF refractaria, en la que muestran síntomas a pesar de un tratamiento médico máximo. Por lo regular son hospitalizados recurrentemente o no pueden dejar el hospital sin intervención especializada.

Galectina 3 La galectina 3 (Nos. de Registro GenBank: NC_000014.7 (gen) y NP_002297.2 (proteína)) es una de las 15 lectinas de unión de beta-galactósido de mamífero, o "galectinas", caracterizadas por su unión específica a la galactosa. La galectina 3 ha sido denominada diversamente en la literatura LGALS3, antígeno MAC-2, proteína de unión de carbohidrato (CBP)-35, proteína de unión de laminina, lectina 3 específica de galactosa, mL-34, L-29, hL-31 , épsilon-BP, y proteína de unión de IgE. La galectina 3 está compuesta de un dominio de reconocimiento de carbohidrato (CDR) carboxilo-terminal y repeticiones en tándem amino-terminales (Liu, F.T. (2000) "Role of galectin-3 in inflammation", en "Lectins and Pathology". M. Carón y D. Seve. eds. Harwood Academic Publishers, Amsterdam, Países Bajos, p. 51 ; Liu, F.T. et al. (1995) Am. J. Pathol. 147:1016). La galectina 3 normalmente se distribuye en el epitelio de muchos órganos y varias células inflamatorias que incluyen macrófagos y también células dendríticas y células de Kupfer (Flotte, T.J. et al. (1983) Am. J. Pathol. 1 1 1 :1 12).

Se ha mostrado que la galectina 3 tiene una función en una variedad de procesos celulares que incluyen adhesión célula-célula, interacciones célula-matriz, fagocitosis, ciclo celular, apoptosis, angiogénesis y empalme de ARNm. Se ha mostrado que la galectina 3 funciona por medio de acciones tanto intracelulares como extracelulares (Sano, H. et al. (2000) The Journal of Immunology, 165:2156-2164). Es un componente de la proteína ribonuclear heterogénea nuclear (hnRNP) (Laing, J. G. et al. (1998) Biochemistry 27:5327), un factor en el empalme de pre-ARNm (Dagher, S. F. et al. (1995) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 92:1213), y se ha encontrado que controla el ciclo celular (Kim, H.R.C. et al- (19999) Cáncer Res. 59:4148) y que previene la apoptosis de células T mediante interacción con los miembros de la familia Bc1-2 (Yang, R.Y. et al. (1996) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:6737). Por otra parte, se ha mostrado que la galectina 3, que es secretada de los monocitos/macrófagos (Sato, S. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:4424) y de células epiteliales (Lindstedt, R. G. et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 1 1750), funciona como una molécula extracelular en la activación de varios tipos de células tales como monocitos/macrófagos (Liu, F.T. (1993) ¡mmunol Today 14:486), mastocitos, neutrófilos y linfocitos (Hsu, D. K., S. R. et al. (1996), Am. J. Pathol. 148:1661). Se ha mostrado que la galectina 3 actúa como un quimioatrayente novedoso para monocitos y macrófagos (Sano, H. et al. (2000), The Journal of Immunology, 2000, 165:2156-2164). La galectina 3 se ha implicado en enfermedades y afecciones tales como el cáncer, inflamación y falla cardiaca. Como se describe en la publicación de la patente internacional No. WO 2005/040817, la cuantificación de galectina 3 es particularmente adecuada para usarse en una prueba para diagnosticar y detectar la severidad de la HF y para predecir su consecuencia.

A diferencia de las otras galectinas de mamífero, la galectina 3 comprende un dominio N-terminal atípico que comprende la secuencia de aminoácidos: MADNFSLHDA LSGSGNPNPQ GWPGAWGNQP AGAGGYPGAS YPGAYPGQAP PGAYPGQAPP GAYPGAPGAY PGAPAPGVYP GPPSGPGAYP SSGQPSATGA YPATGPYGAP AGP (SEQ ID NO: 1).

Como puede apreciarse de una inspección, las secuencias del extremo N de galectina 3 son distintas de las secuencias de otras galectinas de mamífero, pero comprenden múltiples repeticiones del tipo PGAYPG(X)i-4 (SEQ ID NO: 2), con regiones intermedias ricas en prolína, glicina y tirosina. La existencia de secuencias repetidas en el dominio N-terminal disminuye el número de diferentes epítopes potenciales específicos para galectina 3, complicando el desarrollo de una prueba de detección. Sin embargo, ahora se ha descubierto que epítopes N-terminales pueden distinguir confiablemente la galectina 3 de otras galectinas de mamífero. Usando las pruebas aquí descritas es posible correlacionar confiable y reproduciblemente los resultados clínicos de galectina 3 con la presencia, severidad y etapa de avance de la HF en un sujeto. Los epítopes N-terminales ejemplares incluyen, sin limitación, ADNFSLHDALS (aminoácidos 1-12 del SEQ ID NO: 1 ), ADNFSLHDALSGS (aminoácidos 1-14 del SEQ ID NO: 1 ), GNPNPQGWPGA (aminoácidos 15- 25 del SEQ ID NO: 1), WGNQPAGAGG (aminoácidos 26-35 del SEQ ID NO: 1), YPGQAPPGAYPGQAPPGA (aminoácidos 45-62 del SEQ ID NO: 1 ), YPGAPGAYPGAPAPGV (aminoácidos 63-78 del SEQ ID NO: 1), YPGAPAPGVYPGPPSGPGA (aminoácidos 70-88 del SEQ ID NO: 1), YPS SGQPSATGA (aminoácidos 89-100 del SEQ ID NO: 1), en donde las letras representan el código estándar de aminoácidos. Otros epítopes en el extremo N que comprenden aminoácidos espaciados aparecen en la estructura primaria pero se presentan juntos en la estructura terciaria, y estos también pueden ser manejados por los enlazadores usados en las pruebas de invención.

Detección de galectina 3 mediante prueba de sandwich De acuerdo con los métodos de la invención, la concentración de galectina 3 se puede cuantificar en una muestra de fluido corporal usando un par de porciones de unión que se unen específicamente a porciones N- terminales de galectina 3. Una "porción de unión" se refiere a una molécula que se une a un polipéptido o péptido, o interacciona selectiva o preferentemente con el mismo. Los ejemplos de las porciones de unión incluyen, sin limitación, proteínas tales como anticuerpos, proteína de fusión de interacción con la proteína de unión de galectina (GBP), aptámeros de péptido, avímeros, Fabs, sFvs, adnectinas y ligandos Affibody®; ácidos nucleicos como ADN y ARN (incluso aptámeros de nucleótido), y lípidos tales como lípidos de membrana.

Los métodos y composiciones de la presente invención se pueden usar para detectar la concentración de galectina 3 en una muestra clínica, tal como el suero, para el diagnóstico de HF. De acuerdo con los métodos de la invención, la muestra de prueba usada en la detección de galectina 3 puede ser cualquier muestra de fluido o tejido corporal, que incluye, sin limitación, sangre completa, suero, plasma, o linfa, y menos preferiblemente orina, jugo gástrico, bilis, saliva, sudor y fluidos espinales, heces o biopsia de músculo. En una modalidad preferida la muestra es una muestra de sangre. En otra modalidad la muestra es una muestra de plasma. También se pueden usar muestras de suero. Además, los fluidos corporales pueden ser procesados (por ejemplo el suero) o no procesados. Los métodos para obtener un fluido corporal de un sujeto son conocidos para los expertos en la materia.

De acuerdo con los métodos de la invención, la galectina 3 se detecta y se cuantifica usando una prueba de "sándwich". En esta modalidad se usan dos moléculas ("porciones de unión"), tales como anticuerpos monoclonales, que se unen específicamente a sitios ("epítopes") no traslapados del extremo N de galectina 3; véase la figura 1. Típicamente, una porción de unión se inmoviliza sobre una superficie sólida en donde se une con la misma y captura la galectina 3. Por lo tanto, esta primera porción de unión también se denomina aquí la porción de unión de captura. Una segunda porción de unión se marca detectablemente, por ejemplo con un fluoróforo, enzima o partícula coloreada, de tal manera que la unión de la segunda porción de unión con el complejo de galectina 3 indica que ha sido capturada la galectina 3. La intensidad de la señal es proporcional a la concentración de galectina 3 en la muestra. Por lo tanto, la segunda porción de unión también se denomina aquí la porción de unión de detección o la porción de unión de marca. Una porción de unión puede ser cualquier tipo de molécula siempre que se una específicamente a una porción del extremo N de la galectina 3. En una modalidad preferida, las porciones de unión usadas son anticuerpos monoclonales anti-galectina 3, esto es, anticuerpos monoclonales desarrollados o seleccionados de otra manera para unirse con porciones separadas de los 1 13 aminoácidos N-terminales de la galectina 3.

Tales procedimientos de prueba pueden ser denominados métodos de prueba inmunométricos de dos sitios, métodos de "sándwich" o (cuando los enlazadores son anticuerpos) "inmunoensayos de sándwich". Como se conoce en la técnica, los anticuerpos de captura y detección se pueden poner en contacto con la muestra de prueba simultáneamente o secuencialmente. Los métodos secuenciales, denominados algunas veces el método "directo", se puede realizar incubando el anticuerpo de captura con la muestra y agregando el anticuerpo de detección marcado a un tiempo predeterminado posterior. Alternativamente, la muestra se puede incubar primero con el anticuerpo de detección marcado y después la muestra se expone al anticuerpo de captura (denominado algunas veces el método "inverso"). Después de cualquier incubación necesaria, que puede ser de corta duración, la marca se detecta y también se puede medir. Tales pruebas se pueden realizar en muchos formatos específicos conocidos para los expertos en la materia, incluso mediante el uso de varios analizadores de laboratorio clínico de alto rendimiento o dispositivos de examen en el lugar de la atención médica o domésticos.

En una modalidad, se puede usar un dispositivo de flujo lateral en el formato de sandwich, en donde la presencia de galectina 3 por arriba de un nivel de sensibilidad basal en una muestra biológica permitirá la formación de una interacción de sandwich en la parte inicial de la prueba de flujo lateral, o en la zona de captura de dicha prueba; véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. No. 6,485,982. La zona de captura, como usa aquí, puede contener porciones unión de captura tales como moléculas de anticuerpo, adecuadas para capturar galectina 3, o avidina inmovilizada o similar para la captura de un complejo biotinilado; véase por ejemplo la patente de EE. UU. No. 6,319,676. El dispositivo también puede incorporar una marca luminiscente adecuada para captura en la zona de captura, siendo la concentración de galectina 3 proporcional a la intensidad de la señal en el sitio de captura. Las marcas adecuadas incluyen marcas fluorescentes inmovilizadas sobre microesferas de poliestireno. También se pueden usar partículas coloreadas.

Otros formatos de prueban que se pueden usar en los métodos de la invención incluyen, sin limitación, dispositivos de flujo pasante; véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. No. 4,632,901. En una prueba de flujo pasante, una porción de unión (por ejemplo un anticuerpo) se inmoviliza en una zona definida sobre una superficie de membrana. Esta membrana se extiende entonces sobre una capa absorbente que actúa como un depósito para bombear volumen de muestra a través del dispositivo. Después de la inmovilización, los sitios restantes de unión de proteína sobre la membrana se bloquean para minimizar las interacciones inespecíficas. Durante la operación se agrega una muestra biológica a la membrana y se filtra a través de la misma, permitiendo que cualquier analito específico para el anticuerpo de la muestra se una al anticuerpo inmovilizado. En un segundo paso, se puede agregar o liberar un anticuerpo secundario marcado que reacciona con el marcador capturado para completar el sandwich. Alternativamente, el anticuerpo secundario se puede mezclar con la muestra y agregarse en un solo paso. Si está presente la galectina 3, se desarrolla una mancha de color sobre la superficie de la membrana.

El ¡nmunoensayo de enzima más común es la "prueba de inmunoabsorbente enlazado a enzima" (ELISA). La ELISA es una técnica para detectar y medir la concentración de un antígeno usando una forma marcada del anticuerpo (por ejemplo enlazado a una enzima). Existen diferentes formas de ELISA que son muy conocidas para los expertos en la materia. Las técnicas estándares conocido para ELISA se describen en "Methods in Immunodiagnosis", 2a edición, Rose and Bigazzi, eds., John Wiley & Sons, 1980; Campbell ef al., "Methods and Immunology", W. A. Benjamín, Inc., 1964; y Oellerich, M. (1984), J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 22:895-904.

En una "ELISA de sandwich", un anticuerpo (por ejemplo, anti-galectina 3) se adhiere a una fase sólida (esto es, una placa de microtítulo) y se expone a una muestra biológica que contiene antígeno (por ejemplo, la galectina 3). La fase sólida se lava entonces para eliminar el antígeno no unido. Un anticuerpo marcado (por ejemplo, enlazado a una enzima) se une entonces al antígeno unido, formando un sándwich de anticuerpo-antígeno-anticuerpo. Los ejemplos de enzimas que se pueden enlazar con el anticuerpo son la fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano, luciferasa, ureasa, y beta-galactosidasa. El anticuerpo enlazado a la enzima reacciona con un substrato para generar un producto de reacción coloreado que se puede medir. Esta medición se puede usar para derivar la concentración de galectina 3 presente en una muestra, por ejemplo comparando la medición con una curva patrón de galectina 3. Se puede determinar si la concentración de galectina 3 en la muestra de un sujeto está arriba o abajo de un umbral. El umbral puede estar en la escala, por ejemplo, de 5 - 10 ng/ml, 10-15 ng/ml, 15-20 ng/ml, 20-25 ng/ml, 25-30 ng/ml, 30-35 ng/ml, o 35 - 40 ng/ml.

Cualquiera de los inmunoensayos aquí descritos adecuados para usarse con los kits y métodos de la presente invención también puede utilizar cualquier porción de unión en el lugar de un anticuerpo.

Porciones de unión En una modalidad preferida de la invención, los anticuerpos anti-galectina 3, preferiblemente anticuerpos monoclonales, se usan corno las porciones de unión.

Anticuerpos monoclonales En modalidades preferidas de la invención se usan anticuerpos monoclonales. Un anticuerpo monoclonal se refiere a un anticuerpo que se deriva de un solo clon, incluso cualquier clon eucariótico, procariótico, o de fago. El anticuerpo monoclonal puede comprender o consistir en dos proteínas, es decir, cadena pesada y ligera. El anticuerpo monoclonal se pueden preparar usando una técnica de una amplia variedad de técnicas conocidas que incluyen el uso de tecnología de hibridoma, recombinación y despliegue de fago, o una combinación de las mismas.

Los anticuerpos monoclonales anti-galectina 3 se pueden preparar usando cualquier método conocido, que incluye los métodos de hibridoma seminal que describen Kohler y Milstein (1975), Nature, 256:495. En un método de hibridoma, un ratón, hámster, u otro animal hospedero adecuado se inmuniza con un agente inmunizante para hacer que los linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos se unan específicamente al agente inmunizante. Alternativamente los linfocitos se pueden inmunizar in vitro.

Típicamente, el agente inmunizante incluirá por lo menos una porción del polipéptido de galectina 3 o una proteína de fusión del mismo. Por ejemplo, se puede usar como agente inmunizante un polipéptido sintético o polipéptido recombinante que comprende cualquier epítope N-terminal de galectina 3. Los epítopes N-terminales ejemplares incluyen, sin limitación: MADNFSLHDALS (aminoácidos 1-12 del SEQ ID NO: 1 ), MADNFSLHDALSGS (aminoácidos 1 -14 del SEQ ID NO 1 ), GNPNPQGWPGA (aminoácidos 15-25 del SEQ ID NO: 1), WGNQPAGAGG (aminoácidos 26-35 del SEQ ID NO: 1 ), YPGQAPPGAYPGQAPPGA (aminoácidos 45-62 del SEQ ID NO. 1), YPGAPGAYPGAPAPGV (aminoácidos 63-78 del SEQ ID NO: 1 ), YPGAPAPGVYPGPPSGPGA (aminoácidos 70-88 del SEQ ID NO: 1 ), YPSSGQPSATGA (aminoácidos 89-100 del SEQ ID NO: 1 ). Una proteína de fusión se puede hacer fusionando un polipéptido con una proteína portadora, por ejemplo hemocianina de lapa (KLH, EMD Biosciences, San Diego, California), BSA (EMD Biosciences, San Diego, California), u ovalbúmina (Pierce, Rockford, Illinois). El agente inmunizante se puede administrar a un mamífero, con o sin adyuvante, de acuerdo con cualquiera método de una variedad de métodos estándares. El agente inmunizante se puede administrar solo una vez, pero preferiblemente se administra más de una vez de acuerdo con programas de refuerzo estándares.

Generalmente se usan linfocitos de sangre periférica ("PBL") si se desean células de origen humano, o se usan células de bazo o células de ganglio linfático si se desean fuentes de mamífero no humano. Después, los linfocitos se fusionan con una línea celular inmortalizada usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una población de células de hibridoma de la que se seleccionan especies que tienen la especificidad y afinidad adecuadas para los epítopes sobre la porción N-terminal de la galectina 3 (Goding (1986) "Monoclonal Antibodies: Principies and Practice", Academic Press, p. 59-103). Las lineas de células inmortalizadas usualmente son células de mamífero transformadas, particularmente células de mieloma de origen de roedor, bovino y humano. Usualmente se utilizan líneas de células de mieloma de rata o ratón. Las células de hibridoma se pueden cultivar en un medio de cultivo adecuado que contiene preferiblemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células inmortalizadas no fusionadas. Por ejemplo, si las células progenitoras carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas típicamente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio de HAT"), dichas sustancias impiden el crecimiento de células deficientes en HGPRT.

Las líneas de celulares inmortalizadas preferidas son aquellas que se fusionan eficientemente, soportan un nivel de expresión alto y estable del anticuerpo por las células productoras de anticuerpos seleccionadas, y son sensibles a un medio tal como el medio HAT. Las líneas de células inmortalizadas preferidas son las líneas de mieloma murino, que pueden obtenerse por ejemplo del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California y la American Type Culture Collection, Manassas, Virginia. También se han descrito líneas de células de mieloma humano y de heteromieloma de ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. (1984) Immunol., 133:3001 ; Brodeur et al, "Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications", Marcel Dekker, Inc., Nueva York (1987) p. 51-63).

El medio de cultivo en el que se cultivan las células de hibridoma se puede probar entonces para determinar la presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el extremo N de galectina 3, por ejemplo examinando con un polipéptido N-terminal de galectina 3 marcado. Preferiblemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina por inmunoprecipitación o mediante una prueba de unión in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o prueba de inmunoabsorbente enlazado a enzima (ELISA). Tales técnicas y pruebas son conocidas. La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal se puede determinar, por ejemplo, mediante el análisis de Scatchard de Munson y Pollard (1980), Anal. Biochem., 107:220. Varios protocolos de análisis para determinar la especificidad de unión están disponibles comercialmente como kits o como un servicio.

Los anticuerpos monoclonales también se pueden hacer por medio de métodos de ADN recombinante, como los que se describen en la patente de EE. UU. No 4,816,567. El ADN que codifica anticuerpos monoclonales adecuados se puede aislar y secuenciar usando los procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótido que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos murinos). Las células de ibridoma sirven como una fuente preferida de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN se puede poner en vectores de expresión que entonces se transfectan en células hospederas, tales como células COS de simios, células de ovario de hámster chino (CHO), o células de mieloma que de otra manera no producen proteína de inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células hospederas recombinantes. El ADN también se pueden modificar, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificadora para los dominios constantes de cadena pesada y ligera en lugar de las secuencias murinas homologas (patentes de EE. UU. No. 4,816,567; Morrison et al. (1984) Proc. Nati. Acad. Sci USA, 81 :6851 ), o uniendo covalente con la secuencia codificadora de inmunoglobulina una parte o toda la secuencia codificadora para un polipéptido no inmunoglobulina. Dicho polipéptido no inmunoglobulina puede sustituir los dominios constantes de un anticuerpo de la invención, o pueden sustituir los dominios variables de un sitio de combinación de antígeno de un anticuerpo de la invención para crear un anticuerpo bivalente quimérico.

Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monovalentes. Los métodos para preparar anticuerpos monovalentes son muy conocidos. Por ejemplo, un método incluye la expresión recombinante de la cadena ligera y la cadena pesada modificada de inmunoglobulina. La cadena pesada se trunca generalmente en cualquier punto de la región Fe, a fin de prevenir el entrelazamiento de la cadena pesada. Alternativamente, los residuos de cisteína relevantes se sustituyen con otro residuo de aminoácido o se suprimen a fin de prevenir el entrelazamiento.

Los métodos in vitro también son adecuados para preparar anticuerpos monovalentes. Usando las técnicas rutinarias conocidas se pueden digerir los anticuerpos para producir fragmentos de los mismos, particularmente fragmentos Fab.

Los anticuerpos también se pueden producir usando colecciones de despliegue de fago (Hoogenboom y Winter (1991 ), J. Mol. Biol 227:381 ; Marks et al. (1991 ), J. Mol. Biol., 222:581 ). Las técnicas de Colé et al. y Boerner et al. también están disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales (Colé ef al. (1985), "Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy", Alan R. Liss, p. 77; y Boerner et al. (1991 ), J. Immunol., 147(l):86-95). Similarmente, se pueden hacer anticuerpos introduciendo locus de inmunoglobulina en animales transgénicos, por ejemplo ratones, en los que los genes endógenos de inmunoglobulina han sido parcial o totalmente desactivados.

La afinidad de los anticuerpos también se puede madurar usando métodos conocidos de selección o mutagénesis como se describe arriba. Los anticuerpos preferidos de afinidad madura tienen una afinidad que es cinco veces, preferiblemente 10 veces, de preferencia 20 o 30 veces mayor que el anticuerpo inicial del cual se prepara el anticuerpo maduro. En una modalidad particularmente preferida, los anticuerpos usados para detectar la galectina 3 son anticuerpos monoclonales, por ejemplo, M3/38, 9H3.2 y 87B5. 3/38 detecta un epítope lineal (YPGQAPPGAYPGQAPPGA (aminoácidos 45-62 del SEQ ID NO: 1 )) en el extremo N de galectina 3. El M3/38 se preparó del sobrenadante del hibridoma de rata M3/38.1.2.8 HL.2, un clon del cual se puede encontrar en la colección American Type Culture Collection con el No. ATCC® TIB-166. El 9H3.2 detecta un epítope lineal (MADNFSLHDALSGS (aminoácidos 1-14 del SEQ ID NO: 1 ) en el extremo N de galectina 3. El 9H3.2 es una IgG monoclonal de ratón, purificada por afinidad usando la proteína A. El 9H3. 2 está disponible de Millipore (Millipore, 290 Concord Road, Billerica, MA 01821 , EE. UU.), No. de catálogo: MAB4033. El 87B5 detecta un epítope no lineal que comprende porciones de GNPNPQGWPGA (aminoácidos 15-25 del SEQ ID NO: 1), y YPGAPAPGVYPGPPSGPGAYPSSGQPSATGA (aminoácidos 70-100 del SEQ ID NO: 1 ). El 87B5 se preparó del clon 87B5 de hibridoma de ratón-ratón (células de bazo de ratón X63-Ag8.653xBALB/c), y es una lgG2a que se purificó por afinidad usando la proteína A. El 87B5 está disponible de Immuno-Biological Laboratories (IBL, 8201 Central Ave NE, Suite P, Minneapolis, MN 55432, EE. UU.).

En una modalidad actualmente preferida, la porción de unión de captura es el anticuerpo monoclonal anti-galectina 3, M3/38, y la porción de unión marcada de detección es un segundo anticuerpo monoclonal anti- galectina 3, 87B5. Las designaciones dadas a estos anticuerpos no son limitativas. En otra modalidad, el anticuerpo de captura es 9H3.2 y la porción de unión marcada de detección es M3/38. También se pueden usar otros anticuerpos que reconocen los epítopes arriba descritos.

Con los métodos y kits de la presente invención se pueden usar otras porciones de unión. Los ejemplos de las porciones de unión incluyen, sin limitación, proteínas, aptámeros de péptido, avímeros, adnectinas y ligandos Affibody®, ácidos nucleicos tales como el ADN y ARN (que incluyen aptámeros de nucleótido), y los lipidos tales como iípidos de membrana.

Aptámeros Los aptámeros de nucleótido son péptidos pequeños o secuencias de nucleótidos pequeñas que se unen con alta afinidad a un objetivo de elección. Los aptámeros de nucleótido se producen mediante un proceso de selección denominado evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial (SELEX), denominado también selección in vitro o evolución in vitro. En este procedimiento, una molécula objetivo se expone a una colección grande de oligonucleótidos generada aleatoriamente. Los oligonucleótidos no enlazados se separan de la mezcla mediante cualquier cantidad de métodos, usualmente cromatografía de afinidad. Los oligonucleótidos que permanecer unidos son eluidos y amplificados. Después, la molécula objetivo se expone a oligonucleótidos recién sintetizados y el proceso de selección se repite durante varias rondas con condiciones crecientemente severas para separar las secuencias no enlazadas. Después se determina la secuencia de los oligonucleótidos resultantes para determinar su identidad; véase la solicitud de patente de EE. UU. No. 07/536,428; la patente de EE. UU. No. 5,475,096; y la patente de EE. UU. No. 5,270, 163.

Los aptámeros de péptido típicamente consisten en un dominio variable corto de péptido. Los aptámeros de péptido comprenden un asa de péptido variable unida a ambos extremos de un armazón de proteína. Esta doble restricción estructural aumenta mucho la afinidad de unión del aptámero de péptido a grados comparables a un anticuerpo (escala nanomolar). La longitud del asa variable es típicamente de 10 a 20 aminoácidos, y el armazón puede ser cualquier proteina que sea soluble y compacta, tal como la proteina bacteriana tiorredoxina A. Un asa variable se puede insertar dentro del sitio activo reductor de tiorredoxina A, que es un asa de -Cys-Gly-Pro-Cys- en la proteína silvestre, siendo capaces las dos cadenas laterales de cisteína de formar un puente de disulfuro. La selección del aptámero de péptido se puede hacer usando diferentes sistemas, tales como el sistema de dos híbridos de levadura. Para una exposición adicional de los aptámeros de péptido véase la publicación de patente Internacional No. WO 2007/117657.

Avimeros Un avímero (multimero de avidez) es una secuencia corta de péptido que contiene múltiples regiones de baja afinidad para un objetivo. La presencia de múltiples regiones únicas de afinidad baja actúa en conjunto para producir una porción de unión de alta afinidad. El tamaño pequeño y la densidad alta de disulfuro contribuyen a la baja inmunogenicidad de los avímeros. Para identificar los avímeros con alta afinidad de unión por una proteina de interés, se crea una reserva de monómeros altamente diversos por medio de recombinación sintética. Esta reserva de monómeros se puede examinar contra una proteína objetivo usando despliegue de fago u otro método de examen preferido. Una vez encontrados los candidatos se agrega otro monómero y la reserva nueva de dímeros se examina contra el objetivo. Después de la iteración se aisla un trímero con afinidad de unión muy alta por su proteina objetivo (véase Silverman et al. (2005), Nature Biotechnology 23, 1556-1561 ).

Adnectinas Una adnectina consiste en un esqueleto de una secuencia natural de aminoácidos de un cierto dominio de fibronectina humana, y de una a tres asas de direccionamiento que contienen una secuencia aleatorizada. Las adnectinas se examinan y aislan basándose en la capacidad de reconocer específicamente un objetivo terapéutico de interés (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. No. 6,818,418).

Ligandos Affibodv ® Los ligandos Affibody® son péptidos pequeños comprendidos de un dominio de "armazón" y un dominio variable. El dominio de "armazón" comprende un dominio de atado de tres hélices no cisteína, una estructura basada en la proteina A estafilocócica. El dominio variable contiene secuencias generadas aleatoriamente que pueden ser examinadas contra un objetivo de interés. Las colecciones de ligandos Affibody® se construyen y las colecciones se examinan para encontrar candidatos con alta afinidad de unión para una proteína de interés; véase Nygren, P.A. (2008) FEBS Journal 275, 2668-2676.

Socios de unión naturales Los socios de unión de galectina 3 naturales que se unen al extremo N de galectina 3 se pueden aislar o producir recombinantemente y se pueden usar como porciones de unión. Los socios de unión de galectina 3 o fragmentos de los mismos se pueden usar como porciones de unión de captura o de detección, dependiendo de las restricciones particulares de la prueba. Los ejemplos de los socios de unión de galectina 3 incluyen, sin limitación, ácidos micólicos y lipopolisacáridos (Barboni et al (2005) FEBS Letters 579:6749-6755). Adicionalmente, la galectina 3 circulante activa una respuesta autoinmune que resulta en la generación de auto-anticuerpos contra galectina 3 en el suero bajo condiciones tanto normales como patológicas (Jensen-Jarolim et al (2001) J Clin Immunoi. 21 (5):348-56; Lim et al. (2002) Biochem Biophys Res Commun. 295(1 ): 19-24; Mathews ef al. (1995) J Clin Immunoi. 5 (6):329-37). Estos auto-anticuerpos parecen hacer blanco contra epítopes sobre el dominio N-terminal de la galectina 3 (Mathews ef al., supra).

Captura La propiedad importante de la porción de unión de captura es que provee un medio de separación del resto de la mezcla de prueba. Por consiguiente, como se entiende en la técnica, la porción de unión de captura puede ser introducida en la prueba en una forma ya inmovilizada o insoluble, esto es, una forma que permite la separación del complejo del resto de la solución de prueba. Alternativamente, la inmovilización se puede hacer mediante la captura de un complejo inmune que comprende galectina 3, subsiguientemente a la introducción de una forma soluble de la porción de unión de captura a la muestra. Los ejemplos de las porciones de unión de captura inmovilizadas son las porciones de unión unidas covalentemente o no covalentemente a una fase sólida tal como una partícula magnética, una partícula de látex, un pocilio de placa de microtítulo, una membrana, un chip, un glóbulo, una cubeta, un arreglo, u otro recipiente o sostén de reacción. Los ejemplos de una porción de unión de captura soluble son una porción de unión que ha sido modificada químicamente con un ligando, por ejemplo, un hapteno, biotina, o similar, y que actúa como un gancho para permitir la captura selectiva del complejo que incluye galectina 3. Los métodos de acoplamiento de la porción de unión de captura a una fase sólida son bien conocidos. Estos métodos pueden utilizar agentes enlazadores bifuncionales, por ejemplo, o la fase sólida se puede modificar con un grupo reactivo, tal como un epóxido o ¡midazol, que se unirá a la molécula por contacto. Los reactivos de captura biospecíficos contra diferentes proteínas objetivo se pueden mezclar en el mismo lugar, o se pueden adherir a fases sólidas en diferentes localizaciones físicas o manejables.

Marcas De acuerdo con los métodos de la invención, la marca usada se puede seleccionar de cualquiera de las que se conocen convencionalmente. Las marcas preferidas son las que permiten una cuantificación más precisa. Los ejemplos de las marcas incluyen, sin limitación, una porción fluorescente, una enzima, una especie electroquímicamente activa, un isótopo radiactivo, una molécula quimioluminiscente, una partícula de látex u oro, un ligando detectable (por ejemplo detectable mediante la unión secundaria de un socio de unión marcado para el ligando), etc. En una modalidad preferida, la marca es una enzima o una molécula fluorescente. Los métodos para fijar la marca a la porción de unión son muy conocidos e incluyen enlace covalente y no covalente.

En una modalidad, la porción de unión se puede marcar con un compuesto fluorescente. Cuando la porción de unión marcada fluorescentemente se expone a la luz de longitud de onda adecuada, su presencia se puede detectar así mediante la fluorescencia emitida. Entre los compuesto de marcación fluorescentes usados más comúnmente están Cy3 y Cy5 (colorantes fluorescentes solubles en agua de la familia de los colorantes de cianina -colorantes "Cy"), isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftalaldehido y fluorescamina.

En otra modalidad, la porción de unión de detección se marca detectablemente enlazando la porción de unión a una enzima. La enzima, a su vez, cuando se expone a su substrato, reacciona con el substrato de tal manera que produce una porción química que se puede detectar, por ejemplo, por medio de espectrofotometría, fluorometría o medios visuales. Las enzimas que se pueden usar para marcar detectablemente las porciones de unión de la presente invención incluyen, sin limitación, malato deshidrogenasa, nucleasa estafilocócica, delta-V-esteroide isomerasa, alcohol deshidrogenasa de levadura, alfa-glicerofosfato deshidrogenasa, triosa fosfato isomerasa, peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, asparaginasa, glucosa oxidasa, beta-galactosidasa, ribonucleasa, ureasa, catalasa, glucosa-VI-fosfato deshidrogenasa, glucoamilasa y acetilcolinesterasa.

La detección también se puede hacer usando una porción de unión marcada radiactivamente. Entonces es posible detectar la porción de unión usando pruebas radioimmunes. El isótopo radiactivo se puede detectar por medios tales como el uso de un contador gamma o un contador de escintilación, o por medio de audorradiografia. Los isótopos que son particularmente útiles para los propósitos de la presente invención son 3H, 1311, 35S, 14C, y preferiblemente 125l.

Una porción de unión también se puede marcar detectablemente acoplándola con un compuesto quimioluminiscente. La presencia de la porción de unión quimioluminiscente se determina entonces detectando la presencia de luminiscencia que surge durante una reacción química . Los ejemplos de compuestos de marcación quimioluminiscente particularmente útiles son luminol, luciferina, isoluminol, éster de acridinio teromático, imidazol, sal de acridinio y éster de oxalato.

Formas alternas de qalectina 3 La galectina 3 pueden existir en una muestra en una pluralidad de formas diferentes caracterizadas por masas detectablemente diferentes. Estas formas pueden resultar de modificaciones previas a la traducción, modificaciones posteriores a la traducción, o ambas. Las formas modificadas antes de la traducción incluyen variantes alélicas, variantes de empalme y formas de edición de ARN. Las formas modificadas posteriormente a la traducción incluyen las formas que resultan, entre otras cosas, del corte proteolítico (por ejemplo fragmentos de una proteína progenitora), formación de complejo, glicosilación, fosforilación, lipidación, oxidación, metilación, cistinilación, sulfonación y acetilación. Las formas modificadas de galectina 3, siempre y que retengan los epítopes N-terminales relevantes, se pueden detectar de acuerdo con los métodos de la presente invención.

Usos diagnósticos v pronósticos La prueba galectina 3 de la invención se puede usar para identificar sujetos en riesgo de desarrollar HF, o para identificar sujetos que padecen HF. En este método, los pacientes u otros sujetos con un riesgo identificado de desarrollar HF se pueden monitorear para determinar los cambios en sus niveles de galectina 3 cuantificados en un fluido corporal en el tiempo usando un inmunoensayo de la invención. En algunas modalidades, un sujeto con un riesgo identificado de desarrollar HF puede monitorear sus niveles de galectina 3 en el tiempo, por ejemplo de forma mensual, trimestral, bianual, anual, cada 2 años, o cada 5 años.

En otra modalidad, la galectina 3 se puede usar como un marcador diagnóstico para determinar la presencia, etapa o severidad de la HF en un sujeto, o para predecir su pronóstico, midiendo la concentración de galectina 3 en una muestra y comparando este resultado con datos que correlacionan la concentración de galectina 3 con la severidad o etapa de la enfermedad HF en sujetos humanos. Los métodos de diagnóstico o pronóstico se pueden combinar con otros métodos de diagnóstico o pronóstico usados comúnmente, tales como ecocardiogramas con análisis de Doppler, ventriculografía de radionúclido, imagenologia de resonancia magnética (IRM), conteo completo de la sangre, urianálisis, electrolitos en suero, glucohemoglobina y lípidos sanguíneos, pruebas de la función renal y hepática, pruebas de la función tiroidea, radiografía del tórax, electrocardiograma de 12 derivaciones, pruebas en sangre de biomarcadores tales como BNP, etc.

Otros usos Los métodos y kits de la presente invención también son adecuados para usarse en la detección de otras afecciones caracterizadas por un aumento o reducción en la concentración de galectina 3. La expresión de esta galectina 3 está regulada positivamente durante la inflamación (Flotte et al. (1983) Am. J. Pathol. 1 1 1 : 1 12), la proliferación celular (Agrwal, et al. (1999) J. Biol. Chem. 264:17236) y diferenciación celular (Nangia-Makker et al (1993), Cáncer Res. 53: 1 ), y durante transactivación por proteínas virales (Hsu, D. et al (1996) Am. J. Pathol 148:1661 ). Su expresión también es afectada por la transformación neoplásica. Por ejemplo, se encuentra regulación positiva de galectina 3 en ciertos tipos de linfomas (Hsu, D. et al (1996) Am. J. Pathol. 148:1661) y carcinoma tiroideo (Fernández, P.L. et al. (1997) J. Pathol. 181 :80), mientras que la galectina 3 es regulada negativamente en otros tipos de malignidades tales como carcinomas del colon (Lotz, M.M. et al. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 90:3466), mama (Castronovo, V., F., A. et al. (1996) J. Pathol 179:43.), ovario (Van den Brüle, F. A. er al. (1994). Eur. J. Cáncer 30A: 1096) y uterino (Van den Brüle, F. A. et al. (1996) Hum. Pathol. 27:1185). La expresión de galectina 3 tiene una fuerte correlación con el grado y potencial maligno de tumores cerebrales primarios (Bresalier, R. et al. (1997), Cáncer 80:776).

La galectina-3 tiene una función en muchas otras enfermedades, afecciones y trastornos que incluyen trastornos autoinmunes y complicaciones vasculares en la diabetes y la hipertensión. La galectina 3 se ha detectado en tejidos afectados por enfermedades inflamatorias. Por ejemplo, la galectina 3 se detectó en las lágrimas de pacientes con enfermedades oculares inflamatorias (Hrdlickova-Cela et al. (2001 ), Br J Ophthalmol, 85: 1336-40). También se observó un incremento de los niveles de galectina 3 en lesiones ateroscleróticas humanas (Oshima et al (2003), Aríhritis Rheum, 48:2788-95; Nachtigal et al. (1998), Am J Pathol, 152:1199-208).

Kits La invención también provee un kit para cuantificar la galectina 3, útil para detectar un aumento del riesgo de HF, diagnosticar la presencia de HF, determinar la severidad de HF, o pronosticar un sujeto con HF. El kit puede comprender una o más porciones de unión para cuantificar la concentración de galectina 3 en un fluido corporal. Por ejemplo, un kit puede comprender porciones de unión de captura y detección que reconocen específicamente epítopes del extremo N de la galectina 3. Las porciones de unión de captura y detección pueden comprender un anticuerpo que es inmunoespecífico para la galectina 3. En una modalidad, el kit comprende dos anticuerpos monoclonales anti-galectina 3, por ejemplo M3/38, 9H3.2, o 87B5. Las porciones de unión de captura presentes en un kit se pueden adherir previamente a una superficie sólida, por ejemplo, sin limitación, un recipiente o portaobjetos de plástico o vidrio. Además, un kit puede comprender recipientes para mezclar la muestra con las porciones de unión. Tales recipientes pueden ser adecuados para usarse con un aparato de detección capaz de detectar la señal producida por la porción de unión de detección. Además, el kit puede comprender uno o más reactivos (por ejemplo un anticuerpo diferente) para medir la concentración de un segundo marcador indicativo de la misma enfermedad.

Adicionalmente, un kit de la invención puede comprender uno o más de lo siguiente: (1) instrucciones para usar el kit para determinar la concentración de galectina 3, (2) un socio de unión marcado para cualquier anticuerpo presente en el kit; (3) una fase sólida (tal como una tira reactiva) sobre la cual se inmoviliza cualquiera de dichos anticuerpos; y (4) una etiqueta o inserto que indica la aprobación regulatoria para su uso diagnóstico, pronóstico o terapéutico, o cualquier combinación de los mismos. Si no se provee un socio de unión marcado para el anticuerpo, el anticuerpo mismo se puede marcar con un marcador detectable, por ejemplo, una porción quimioluminiscente, enzimática, fluorescente, o radiactiva.

EJEMPLOS La invención se ilustra adicionalmente por medio de los siguientes ejemplos. Los ejemplos se proveen únicamente con fines ilustrativos y no se consideran limitativos del alcance o contenido de la invención en modo alguno.

EJEMPLO 1 Prueba de inmunoabsorbente enlazado a enzima para la detección cuantitativa de galectina 3 humana La ELISA de galectina 3 humana es una prueba de inmunoabsorbente enlazado a enzima para la detección cuantitativa de galectina 3 humana en plasma con EDTA. La galectina-3 humana presente en la muestra o estándar se une a los anticuerpos adsorbidos en los micropocillos. Después de incubación, el material no unido se eliminó durante un paso de lavado. Se agregó la HRP conjugada con el anticuerpo anti-galectina 3 de humano y se unió a la galectina 3 capturada por el anticuerpo de recubrimiento. Después de incubación, el HRP-conjugado no unido se eliminó durante un paso de lavado, y se agregó a los pocilios una solución de substrato reactiva con HRP. Se formó un producto coloreado proporcionalmente a la cantidad de galectina 3 humana presente en la muestra o estándar. La reacción se terminó agregando ácido y la absorbancia se midió a 450 nm. Se preparó una curva patrón de 7 diluciones de estándar de galectina 3 y se determinó la concentración de galectina 3 humana en la muestra. El plasma se separó del coágulo o las células tan pronto como fue posible después de la coagulación y separación de la muestra de sangre. Las muestras que contenían un precipitado visible se clarificaron antes de usarse en la prueba. Los especímenes excesivamente hemolizados o lipémicos no se utilizaron. Las muestras se dividieron en alícuotas y se guardaron congeladas a -20 °C para evitar la pérdida de galectina 3 humana bioactiva. Antes de la prueba las muestras congeladas se llevaron lentamente a temperatura ambiente y se mezclaron suavemente.

Los siguientes reactivos se prepararon para usarse en la prueba. El amortiguador de lavado (1x) se preparó mezclando 50 mi de concentrado de amortiguador de lavado (20x, PBS con 1 % de Tween 20) en un cilindro limpio graduado de 1000 mi. El volumen final se llevó a 1000 mi con agua desionizada y la solución se mezcló suavemente. El pH de la solución final se ajustó a 7.4. El amortiguador de lavado (1x) se transfirió a una botella de lavado limpia.

El amortiguador de prueba se preparó agregando 5 mi de concentrado de amortiguador de prueba (20x, PBS con1% de Tween 20 y 10% de BSA) en un cilindro limpio graduado de 100 mi. El volumen final se llevó a 100 mi con agua desionizada y la solución se mezcló suavemente.

Una solución concentrada de HRP-conjugado se diluyó a una proporción de 1 : 100 en amortiguador de prueba (1x) en un tubo de plástico limpio. El estándar de galectina 3 humana se diluyó a 60 ng/ml agregando agua destilada y la mezcla se agitó suavemente para asegurar una solubilización completa y homogénea. El estándar reconstituido se dejó asentar durante 10 minutos antes de hacer las diluciones.

Para hacer una dilución de estándar externo, se marcaron 7 tubos (S1 , S2, S3, S4, S5, S6, S7), uno para cada punto de estándar. Se prepararon diluciones en serie en una proporción de 1 :2 de la siguiente manera: se pipetearon 225 µ? de diluente de muestra en cada tubo. Se pipetearon 225 µ? de estándar reconstituido (concentración = 60 ng/ml) al primer tubo, marcado como S1 , y se mezclaron (concentración del estándar 1 = 30 ng/ml). Se pipetearon 225 µ? de esta dilución al segundo tubo, marcado como S2, y se mezclaron uniformemente antes de la siguiente transferencia. Esta dilución en serie se repitió cinco veces más para crear los puntos de la curva patrón. El diluente de muestra sirvió como blanco.

La galectina 3 humana liofilizada se reconstituyó en agua destilada a los siguientes volúmenes: control alto (180 µ?, 56-84 ng/ml), control medio (200 µ?, 32 - 48 ng/ml), y control bajo (130 µ?, 3.4 - 5.8 ng/ml). Los frascos se agitaron oscilatoriamente para asegurar una solubilización cuantitativa del contenido. Los controles reconstituidos se dejaron asentar durante 10 minutos.

Cada muestra, estándar, blanco y muestra de control opcional, se deben probar por duplicado. Las tiras de micropocillos se lavaron dos veces con aproximadamente 400 µ? por pocilio de amortiguador de lavado, con aspiración completa del contenido del micropocillo entre los lavados. El amortiguador de lavado se dejó asentar en los pocilios durante aproximadamente 10-15 segundos antes de la aspiración.

Después del último paso de lavado, los pocilios se vaciaron y las tiras de micropocillo se golpearon ligeramente sobre papel absorbente para retirar el exceso de amortiguador de lavado. Las tiras de micropocillo no se dejaron secar.

Se pipetearon 100 µ? de los estándares (S1 - S7) en los pocilios de estándares de acuerdo el cuadro 1.

CUADRO 1 Ejemplo de la disposición de los blancos, estándares y muestras en las tiras de micropocillo Se le agregaron 100 µ? de diluente de muestra a los pocilios blancos, por duplicado. Se le agregaron 80 µ? de diluente de muestra a los pocilios de muestra. Se le agregaron 20 µ? de cada muestra a los pocilios de muestra, por duplicado. Los pocilios se cubrieron con una película adhesiva y se incubaron a temperatura ambiente (18 a 25 °C) durante 1 hora sobre un agitador de microplaca puesto a 200 rpm. La película adhesiva se retiró y los pocilios se vaciaron. Las tiras de micropocillo se lavaron tres veces como arriba.

Después se le agregaron 100 pl del HRP-conjugado diluido a todos los pocilios, incluyendo los pocilios blancos. Los pocilios se cubrieron con una película adhesiva y se incubaron a temperatura ambiente (18 a 25 °C) durante 1 hora sobre un agitador de microplaca puesto a 200 rpm. La película adhesiva se retiró y los pocilios se vaciaron. Las tiras de micropocillo se lavaron 3 veces como arriba.

Después, a cada pocilio se le agregaron 100 pl de solución de substrato de TMB (tetrametilbencidína). Las tiras de micropocillos se incubaron a temperatura ambiente (18 a 25 °C) durante 30 min, y se evitó la exposición directa a la luz intensa.

La reacción enzimática se detuvo pipeteando rápidamente 100 pl de solución de detención (ácido fosfórico 1 M) a cada pocilio. La absorbancia de cada micropocillo se leyó en un espectrofotómetro usando 450 nm como la longitud de onda primaria (opcionalmente 620 nm como la longitud de onda de referencia; es aceptable de 610 nm a 650 nm). La lectora de placas se ajustó con el blanco de acuerdo con las instrucciones del fabricante, utilizando los pocilios blancos. Se determinó la absorbancia tanto de las muestras como de los estándares. Se calcularon los valores de absorbancia promedio de cada grupo duplicado de estándares y muestras.

Se creó una curva patrón graficando la absorbancia media de cada concentración estándar sobre las ordenadas, contra la concentración de galectina 3 humana en las abscisas. Se dibujó una curva de mejor ajuste a través de los puntos de la gráfica; véase la figura 2.

Para cada muestra se puede determinar la concentración de galectina 3 humana en circulación encontrando el valor de absorbancia media en las ordenadas y extendiendo una linea horizontal a la curva patrón. En el punto de intersección se extendió una línea vertical hacia la abscisa, y se leyó la concentración correspondiente de galectina 3 humana.

Como las muestras se diluyeron 1 :5 (20 µ? de muestra más 80 pl diluente de muestra), la concentración leída de la curva patrón se multiplicó por el factor de dilución (x 5). En la figura 2 se muestra una curva patrón representativa.

CUADRO 2 Datos típicos usando la ELISA de galectina 3 humana Estándar Concentración D.O. a 450 D.O. media a C.V. (%) de galectina 3 nm 450 nm humana (ng/ml) 1 30.00 2.824 2.778 2.3 30.00 2.733 2 15.00 1.812 1.767 3.5 15.00 1.723 3 7.50 0.889 0.890 0.2 7.50 0.892 4 3.75 0.431 0.440 2.9 3.75 0.449 5 1.88 0.232 0.223 5.7 1.88 0.214 6 0.94 0.123 0.124 1.6 0.94 0.126 7 0.47 0.071 0.072 1.8 0.47 0.072 Blanco 0 0.018 0.018 0 0.018 Longitud de onda de medición: 450 nm Longitud de onda de referencia: 620 nm Características de rendimiento Sensibilidad: Se determinó que el limite de detección (LoD) de galectina 3 humana, definido como la concentración de analito que resulta en una absorbancia significativamente más alta que la del medio de dilución (media más 3 desviaciones estándares), era de 0.09 ng/ml (media de 12 pruebas independientes).

Reproducibilidad: La reproducibilidad intraprueba (reproducibilidad dentro de la prueba) se evaluó en 4 experimentos independientes. Cada prueba se efectuó con 6 duplicados de 8 muestras de plasma que contenían diferentes concentraciones de galectina 3 humana. Se hicieron dos curvas patrón sobre cada placa. Los siguientes datos muestran la concentración media de galectina 3 humana y el coeficiente de variación para cada muestra (véase el cuadro 3). El coeficiente de variación general calculado intraprueba fue del 4.2%.

CUADRO 3 Concentración media de galectina 3 humana y coeficiente de variación para cada muestra La reproducibilidad interprueba (reproducibilidad de prueba a prueba dentro de un laboratorio) se evaluó en 4 experimentos independientes. Cada prueba se efectuó con 6 duplicados de 8 muestras de plasma que contenían diferentes concentraciones de galectina 3 humana. Se hicieron dos curvas patrón sobre cada placa. Los datos siguientes muestran la concentración media de galectina 3 humana y el coeficiente de variación calculado en 24 determinaciones de cada muestra. El coeficiente de variación general calculado interprueba fue de 4.0%.

CUADRO 4 Concentración media de galectina 3 humana y coeficiente de variación de cada muestra Muestra Concentración media de Coeficiente de variación galectina 3 humana (%) (ng/ml) 1 70.0 3.7 2 40.0 4.6 3 4.8 5.0 4 8.7 4.2 5 21.5 3.3 6 87.9 4.0 7 56.8 2.4 8 44.0 4.6 Recuperación de las cantidades añadidas: La recuperación de las cantidades añadidas se evaluó añadiendo 3 concentraciones de galectina 3 humana en 3 muestras de plasma individuales. Las recuperaciones se determinaron en 4 experimentos independientes con 2 duplicados cada uno. Las muestras de plasma sin adición se usaron como blancos en estos experimentos. La recuperación media general fue de 101 % (véase el cuadro 5).

CUADRO 5 Paralelismo de dilución: Se analizaron cuatro muestras de plasma con diferentes concentraciones de galectina 3 humana en diluciones en serie de 2 veces. Las recuperaciones se determinaron en 4 experimentos independientes con 4 duplicados cada uno. La recuperación media global fue de 88.6% (véase el cuadro 6).

CUADRO 6 Muestra Dilución Concentración Concentración Recuperación de esperada de observada de la concentración galectina 3 galectina 3 esperada de humana (ng/ml) humana (ng/ml) galectina 3 humana (%) 1 1:5 — 23.9 — 1:10 11.9 11.2 94.1 1:20 6.0 5.4 90.4 1:40 3.0 <S7 — 2 1:5 — 62.8 — 1:10 31.4 27.9 88.9 1:20 15.7 13.7 87.4 1:40 7.8 7.0 89.5 3 1:5 — 81.5 — 1:10 40.7 36.9 90.5 1:20 20.4 18.3 90.0 1:40 10.2 8.2 80.6 4 1:5 — 40.4 — 1:10 20.2 18.8 93.1 1:20 10.1 8.7 86.2 1:40 5.1 4.3 86.0 Estabilidad de la muestra Estabilidad de congelación-descongelación: Alícuotas de muestras de plasma se guardaron a -20 °C y se congelaron 3 veces, y se determinaron las concentraciones de galectina 3 humana. No hubo pérdida significativa de la inmunorreactividad detectada de galectina 3 humana por congelación y descongelación.

Estabilidad en almacenamiento: Alícuotas de muestras de plasma se guardaron a -20 °C, 2-8 °C, temperatura ambiente (ta.) y 37 °C, y se determinó la concentración de galectina 3 humana después de 24 horas. No hubo pérdida significativa de la inmunorreactividad detectada de galectina 3 humana durante el almacenamiento bajo las condiciones anteriores.

EJEMPLO 2A Kit para la detectar la galectina 3 El cuadro 7 muestra los componentes de un kit ejemplar para la detección de galectina 3.

CUADRO 7 Reactivos para la prueba de galectina 3 * Contiene el conservador ProClin® † Contiene plasma humano procesado determinado como negativo o no reactivo para ant¡-HIV-1 /2, anti- HCV y HBsAg cuando se examinó mediante un método aprobado por la FDA Un anticuerpo anti-galectina 3, M3/38, se aplicó como recubrimiento a la superficie de los pocilios en una placa de microtitulo y sirvió como el anticuerpo de captura para unir las moléculas de galectina 3 en las muestras, mientras que el otro anticuerpo anti-galectina 3 marcado con peroxidasa de rábano (HRP) (87B5) se suministró en solución y funcionó como el anticuerpo de detección para detectar las moléculas de galectina 3 unidas al anticuerpo de captura. Aunque en este ejemplo se usaron M3/38 y 87B5, el uso de estos anticuerpos específicos no es requisito para los kits y métodos de la presente invención.

Los controles de galectina 3 (C1 y C2) estaban comprendidos de una matriz de proteína ala que se añadió galectina 3 humana recombinante.

EJEMPLO 2B Detección de controles de galectina 3 recombinante El kit del ejemplo 2A se usó en una prueba de ELISA basada en una placa de microtitulo para cuantificar las concentraciones de galectina 3. En el kit se incluyeron dos anticuerpos monoclonales contra galectina 3. En la prueba, que se describe en mayor detalle en el párrafo siguiente, los estándares y materiales de control de calidad se introdujeron en los pocilios y se incubaron durante 60 minutos. Durante esta incubación, la galectina 3 presente en los estándares se unió al anticuerpo de captura que recubre la superficie del pocilio. Un paso de lavado subsiguiente removió todo el material no unido introducido con la muestra, incluso la galectina 3 no unida. Después, el anticuerpo de detección se introdujo en el pocilio y se incubó durante 60 minutos. Durante este tiempo se formó un complejo anticuerpo-antígeno-anticuerpo. Después de un paso de lavado para remover cualquier anticuerpo de detección no unido, se agregó el substrato de tetrametilbencidina (TMB), produciendo un color azul en presencia de HRP.

El desarrollo del color se detuvo después de 20 minutos agregando ácido sulfúrico, cambiando el color a amarillo, que se leyó a una absorbancia de 450 nm. Los resultados de prueba de los especímenes se leyeron en la curva de calibración. La absorbancia fue proporcional a las concentraciones de galectina 3 en los especímenes.

Antes de su usarse, todos los componentes de la prueba se llevaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de abrir el saco que contenía las placas, la superficie superior de cada tira se numeró con tinta permanente para el caso de que se soltara inadvertidamente del marco de la placa. Usando agua desionizada se preparó una dilución 1 : 10 de concentrado de lavado (WC) 10x. El amortiguador diluido se guardó a 2-8 °C.

El grupo de siete estándares de galectina 3 se preparó mediante dilución seriada del estándar (S1 , galectina 3 humana recombinante, 12 ng por frasco). La escala de calibración fue de 0.156 ng/ml a 10.0 ng /mi.

Antes de usarse, un frasco del estándar de galectina 3 (S1 ) se reconstituyó con 300 µ? de agua desionízada, seguido por la adición de 900 µ? de diluente de prueba. El frasco se dejó reposar 15-20 minutos a temperatura ambiente con agitación de vórtice periódica e inversión suave, asegurándose de que el agua de reconstitución moje toda el área de superficie dentro del frasco. Se obtuvo la disolución completa del estándar antes de usarse.

Un frasco de cada control de galectina 3 (C1 y C2) se reconstituyó con 250 µ? de agua desionizada. Los frascos se dejaron reposar 15-20 minutos a temperatura ambiente con agitación de vórtice periódica e inversión suave, asegurándose de que el agua de reconstitución moje toda el área de superficie dentro del frasco. Se obtuvo la disolución completa de C1 y C2 antes de usarse.

Cada control reconstituido (C1 y C2) se diluyó 10 veces (1 :10) usando el diluente de prueba (AD) en un tubo de ensayo o frasco desechable de vidrio borosilicato, o de polipropileno u otro plástico de baja unión de proteína. Cada dilución se mezcló por agitación de vórtice o inversión. Para la dilución se usaron como mínimo 25 µ? del control reconstituido. Las diluciones se hicieron externamente (esto es, no se hicieron diluciones en los pocilios) e inmediatamente antes de usarse.

Los estándares se diluyeron inmediatamente antes de usarse. Seis tubos desechables se marcaron con los números 2 a 7. A cada tubo marcado se le agregaron con pipeta 250 µ? del diluente de prueba (AD). Después, al tubo 2 se le agregaron con pipeta 250 pl del estándar de galectina 3 (S1) y se agitó suavemente. Luego se transfirieron 250 µ? del tubo 2 al tubo 3 y se agitó con vórtice suavemente. Después se transfirieron 250 µ? del tubo 3 al 4, y el procedimiento se continuó hasta el tubo 7.

Se designaron los pocilios de una placa de microtitulo para los controles, estándares diluidos y blanco. Todas las muestras se probaron por duplicado (esto es, blanco, estándares diluidos y controles).

Se transfirieron 100 µ? de cada muestra directamente de los recipientes de dilución a los pocilios dobles de la placa de microtitulo recubiertos con anticuerpo de captura de galectina 3. Los pocilios se cubrieron con un sello de placa limpio y se incubaron 1 hora a 20-25 °C sin agitación.

Mientras se incubó la placa, el anticuerpo de marcación se diluyó 1 :30 con el diluente de prueba de acuerdo con el esquema de dilución mostrado abajo en el cuadro 8: CUADRO 8 Esquema de dilución recomendado para el concentrado de detección (30x)* * AD = diluente de prueba; DC = concentrado de detección Después, el sello de la placa se retiró y los pocilios se lavaron con 400 µ? de amortiguador de lavado diluido por pocilio, usando un lavador mecánico programado para correr 4 ciclos de lavado, con 15 segundos de tiempo de remojo por ciclo. Después del cuarto lavado, los pocilios se vaciaron golpeándolos ligeramente sobre una toalla de papel absorbente.

Después, 100 pl de la solución de detección diluida se pipetearon a cada pocilio. Los pocilios se cubrieron con un sello de placa limpio y se incubaron 1 hora a 20-25 °C sin agitación. El sello de la placa se retiró y los pocilios se lavaron con 400 µ? por pocilio de amortiguador de lavado diluido, usando un lavador mecánico programado para correr 4 ciclos de lavado, con 15 segundos de tiempo de remojo por ciclo. Después del cuarto lavado, los pocilios se vaciaron golpeándolos ligeramente sobre una toalla de papel absorbente.

Se pipetearon 100 µ? de substrato de TMB (TS) a cada pocilio y la placa se incubó 20 minutos a 20-25 °C en la oscuridad.

Se pipetearon 50 µ? de la solución de detención (ST) a cada pocilio. El contenido de cada pocilio se mezcló arrastrando el contenido hacia arriba y hacia abajo usando la punta de una pipeta limpia, o golpeando suavemente un lado de la placa. El contenido del pocilio se tornó de azul a amarillo. Se eliminó cualquier burbuja de la superficie de líquido de cada pocilio, y cualquier suciedad o líquido se eliminó del exterior del pocilio.

Se midió la absorbancia de cada pocilio en una lectora de placas de microtitulo a 450 nm, en el transcurso de 30 minutos de la adición de la solución de detención.

Después de terminar los pasos de la prueba, la absorbancia de cada estándar y control se leyó a 450 nm usando la lectora de microplaca. Se hizo una curva patrón para la prueba usando el siguiente procedimiento. La absorbancia promedio del blanco se restó de todos los datos, incluso estándares y controles. Se calculó el promedio, desviación estándar y coeficiente de variación (CV) del valor de absorbancia (Abs45o) para cada serie de estándares duplicados y controles. Si los controles tenían un CV duplicado mayor de 20%, toda la placa se rechazaba y todos los especímenes se volvieron a analizar usando reactivos nuevos. Se usaron herramientas de ajuste de curva adecuados para ajuste de curva polinomial de tercer orden con optimización de mínimos cuadrados de las medias, de cada dilución de estándar. La concentración medida se multiplicó por 10 (factor de dilución de especímenes y controles) para obtener la concentración final de galectina 3. Se verificó que los valores de control estuvieran dentro de escalas aceptables. Se verificó que el valor del blanco fuera menor que el calibrador más bajo. La prueba se repitió si el valor del blanco rebasaba el valor de calibrador más bajo (por ejemplo, el valor del calibrador bajo es negativo cuando se resta el blanco).

En la figura 3 se muestra una curva de calibración representativa y en el cuadro 9 se muestran valores representativos de la absorbancia de cada estándar diluido.

CUADRO 9 Curva de calibración representativa y valores de absorbancia típicos a 450 nm EJEMPLO 2C Detección de galectina 3 recombinante en muestras clínicas Los métodos descritos en el ejemplo 2B se hicieron con la adición de muestras clínicas, incorporando los pasos adicionales descritos a continuación.

Mientras se reconstituían e! estándar y los controles, cada espécimen de prueba se diluyó 10 veces (1 :10) usando el diluente de prueba (AD) en un tubo de ensayo o frasco desechable de vidrio borosilicato o polipropileno u otro plástico de unión de proteína baja. Cada dilución se mezcló por agitación de vórtice o inversión, con un mínimo de 25 µ? de suero o plasma usado para la dilución. Las diluciones se hicieron externamente (esto es, sin diluciones en el pocilio) e inmediatamente antes de usarse.

Después de terminar los pasos de la prueba se leyó la absorbancia de cada espécimen a 450 nm usando la lectora de microplaca. La absorbancia fue proporcional a la concentración de galectina 3 en los especimenes. Las concentraciones de galectina 3 en los especimenes y controles se basaron en la relación de la absorbancia de los especimenes en comparación con la de los estándares, que tienen una concentración conocida de galectina 3.

La curva patrón para la prueba se asignó para cada placa individual usando el siguiente procedimiento. La absorbancia promedio del blanco se restó de todos los datos, incluyendo estándares, controles y especimenes de prueba.

Se calculó el promedio, desviación estándar y el coeficiente de variación (CV) del valor de absorbancia (Abs45o) para cada serie de estándares duplicados, controles y especimenes de prueba. Los especimenes con valores de CV duplicados mayores de 20% se volvieron a analizar. Si cualquiera de los controles tenía un CV duplicado mayor de 20%, toda la placa se rechazaba y todos los especimenes se volvieron a analizar usando reactivos nuevos. Se usaron herramientas de ajuste de curva adecuados para el ajuste de la curva polinomial de tercer orden con optimización de mínimos cuadrados de las medias, de cada dilución de estándar. Las concentraciones de especimenes desconocidos y controles se calcularon basándose en la ecuación polinomial de tercer orden. La concentración medida se multiplicó por 10 (factor de dilución de especímenes y controles) para obtener la concentración final de galectina 3. Se verificó que los valores de control estuvieran dentro de escalas aceptables. Cuando se obtuvieron resultados inaceptables de los controles de la prueba, las pruebas se repitieron. Se verificó que el valor de blanco fuera menor que el calibrador más bajo. La prueba se repitió si el valor del blanco rebasaba el valor de calibrador más bajo (por ejemplo, el valor del calibrador bajo es negativo cuando se resta el blanco).

Medición de la escala de la prueba Se mostró que la escala de medición de la prueba de galectina 3 con los especímenes clínicos era de 1.32 ng/ml a 96.6 ng/ml. La prueba se calibró con siete estándares que abarcaban la escala de aproximadamente 0.1 ng/ml a 10.0 ng/ml. Cada muestra de prueba (esto es, control o espécimen sujeto) se diluyó previamente 1 :10 antes de la prueba permitiendo hacer la medición dentro de la escala abarcada por los calibradores. La l'inealidad de la prueba se estableció de acuerdo con las recomendaciones del protocolo de evaluación 6 del Clinical Laboratory Standars Institute (CLSI-EP6). Los especímenes de suero y plasma se prepararon y se diluyeron para abarcar una escala de medición clínicamente significativa de concentraciones de galectina 3. Se mostró que la prueba era lineal hasta 96.6 ng/ml. El extremo inferior de la escala de medición es definido por el limite de cuantificación (LoQ), que se determinó que era de 1.32 ng/ml.

Características de desempeño Precisión: Se evaluó la precisión de la prueba de galectina 3 de acuerdo con las guías de CLSI EP5-A2. Se analizaron por duplicado tres agrupamientos de plasma que abarcaban una escala de concentraciones de galectina 3, dos corridas por día durante veinte días. Se calcularon los valores dentro de la corrida, de corrida a corrida, de día a día y precisión total, y se consideraron aceptables.

CUADRO 10 Precisión de la prueba de galectina 3 La precisión también se evaluó en tres laboratorios clínicos certificados por la CLIA, de acuerdo con las guías de CLSI EP5-A2. Los coeficientes de variación (CV) totales variaron de 5.60% a 16.89% en los tres laboratorios clínicos certificados por la CLIA, todos ellos dando resultados aceptables.

Sensibilidad analítica: La sensibilidad analítica de la prueba de galectina 3 fue establecida de acuerdo con la recomendación de las guías de CLSI EP17-A.

Límite de blanco (LoB): LoB = 0.86 ng/ml Límite de detección (LoD): LoD = 1 .13 ng/ml Límite de cuantificacion (LoQ): LoQ = 1.32 ng/ml Especificidad analítica: La prueba de galectina 3 no mostró reactividad cruzada significativa cuando se probó en presencia de los siguientes compuestos: galectina 1 , galectina 2, galectina 4, galectina 7, galectina 8, galectina 9, galectina 12, colágeno I y colágeno III, todos a una concentración de 500 ng/ml. El porcentaje medio de reactividad cruzada de los potenciales reactivos cruzados anteriormente indicados es menor o igual que 0.3%.

Linealidad: La linealidad sobre la escala de medición se determinó de acuerdo con las recomendaciones del CLSI-EP6. Las muestras se prepararon añadiendo galectina 3 a especímenes de suero y plasma, seguido por análisis con la prueba de galectina 3. Los resultados muestran que la prueba es lineal de 1.24 ng/ml a 96.6 ng/ml. El extremo inferior de la escala de medición es definido por el límite de cuantificación (LoQ), que se determinó que era de 1.32 ng/ml en un estudio separado.

En resumen, la escala de medición de la prueba de galectina 3 es de 1.32 ng/ml a 96.6 ng/ml.

Sustancias i nterfe rentes: Se evaluaron los efectos de posibles sustancias interferentes sobre la prueba de galectina 3, tanto endógenos como exógenos, de acuerdo con las recomendaciones del CLSI EP7-A. La bilirrubina conjugada (hasta 5 mg/dl), bilirrubina no conjugada (hasta 15 mg/dl), albúmina (BSA, hasta 12 g/dl), triglicéridos (hasta 3000 mg/dl), colesterol (hasta 250 mg/dl) y creatinina (hasta 5 mg/dl) no muestran interferencia alguna en la prueba. La hemoglobina purificada (hasta 500 mg/dl) no muestra interferencia en la prueba de galectina 3; sin embargo, el lisado de células sanguíneas empaquetadas sí muestra interferencia. Los anticuerpos anti-ratón de humano (HAMA) y el factor reumatoide (RF) ocasionan una interferencia positiva significativa en la prueba de galectina 3.

La prueba de galectina 3 no fue afectada significativamente cuando se hizo en presencia de 34 sustancias farmacéuticas comunes, incluso fármacos HF (véase el cuadro 1 1 ).

CUADRO 11 Fármacos comunes que no muestran interferencia en la prueba de galectina 3 Paracetamol Carvedilol Dopamina Lisinopril Quinidina Acido acetilsalicílico Captopril Enalaprilat Losarían Ramipril Amlodipina Cloranfenicol Furosemida Lovastatina Espironolactona Amp'icilina Diclofenaco Hidroclorotiazida etildopa Teofilina Acido ascórbico Digoxina Ibuprofeno etoprolol Verapamilo Atenolol Diltiazem Indometacina Naproxeno Warfarina Cafeína Disopiramida Lidocaína Nifedipina Efecto de gancho de dosis alta: No hay efecto de gancho de dosis alta a las concentraciones de galectina 3 de hasta 500 ng/ml.

Recuperación de cantidades añadidas: En un estudio en donde la galectina 3 humana se añadió a 6 muestras de suero y EDTA-plasma igualadas por sujeto y también diluente de prueba a 5 diferentes concentración de adición: 15 ng/ml; 25 ng/ml, 50 ng/ml, 75 ng/ml y 90 ng/ml, el porcentaje de recuperación promedio en el suero varió de 79.7% a 84.6%, con un porcentaje de recuperación gran promedio de 81.7%, y el porcentaje de recuperación promedio en EDTA-plasma varió de 71.4% a 81.4%, con un porcentaje de recuperación gran promedio de 78.1 %. Este estudio mostró una diferencia en recuperación de cantidades añadidas de galectina 3 en matrices de suero/plasma en comparación con la matriz de diluente de prueba. Aunque este efecto probablemente será observado en experimentos de recuperación similares de cantidades añadidas, no tiene un impacto sobre las mediciones clínicas.

EJEMPLO 2D Detección de galectina 3 en muestras clínicas de sujetos sin enfermedad cardiaca conocida En un estudio prospectivo de observación se determinaron las concentraciones de galectina 3 por análisis de 1 ,092 muestras de plasma reunidas en un banco de sujetos sin enfermedad cardiaca conocida pero que se asemejan por lo demás, por edad y distribución de género, a la población de pacientes de HF. Los especímenes eran de mujeres entre 60 y 80 años de edad (n=572) y de hombres entre los 55 y 80 años (n=520). Esta población de referencia comprendió personas de diferentes antecedentes genéticos, de la siguiente manera: Negros (n=305, 27.9%), Caucásicos (n=686, 62.8%), Hispanos (n=42, 3.8%), Asiáticos u Oceánicos (n=30, 2.7%), y no especificado (n=29, 2.7%). Las muestras de plasma sanguíneo se extrajeron del participante en el estudio en tubos que contenían EDTA. La sangre se procesó y subsiguientemente el plasma sanguíneo se congeló a -20 °C o menos.

Todos los sujetos tenían niveles ¡ndetectables de galectina 3 usando la prueba de galectina 3 descrita en el ejemplo 2C. Un método no paramétrico que usa la distribución de los valores de la escala de referencia de galectina 3 (véase el cuadro 12) estableció un solo umbral de 17.6 ng/ml para la galectina 3 basándose en un limite superior del valor normal (ULN). El ULN se define como el 90° percentil de la distribución de los valores de galectina 3, independiente del género o edad.

CUADRO 12 Distribución de los niveles de galectina 3 EJEMPLO 2E Detección de galectina 3 en muestras clínicas de sujetos con HF aguda descompensada Para determinar la utilidad de la prueba de galectina 3 descrita en el ejemplo 2C en sujetos con diagnóstico con HF aguda descompensada, se midieron los niveles de galectina 3 en 181 muestras de EDTA-plasma reunidas en un banco del estudio de Falla Cardiaca Aguda Descompensada (ADHF). El estudio ADHF fue un estudio prospectivo de observación realizado en los Estados Unidos que enroló sujetos que presentaban disnea en el departamento de emergencias (4). La concentración de galectina 3 en el plasma sanguíneo se midió en muestras básales para 181 sujetos con diagnóstico de HF aguda descompensada. Se dio seguimiento a los sujetos durante cuatro años. El valor de umbral de galectina 3 de 17.6 ng/ml, derivado de la población de la escala de referencia (que se describe en el ejemplo 2D), se usó para definir una categoría de sujetos con galectina 3 basal elevada (n=68). Los pacientes tuvieron un riesgo de muerte aproximadamente 3 veces más alto en el cuartil más alto de niveles de galectina 3, en comparación con el cuartil más bajo. Un análisis de supervivencia por regresión de Cox y análisis de Kaplan-Meier mostró que la galectina 3 basal elevada es un predictor significativo del riesgo de mortalidad, incluso después de ajustar por edad, género, clase según la New York Heart Association (NYHA), fracción de expulsión ventricular izquierda, hábito de fumar y condición diabética (véase la figura 4).

CUADRO 13 Razones de riesgo de mortalidad para sujetos con HF en el estudio de ADHF Razón de riesgo de galectina 3 (95% I.C., valor p) Menor o igual que Mayor de 17.6 ng/ml 17.6 ng/ml Número de sujetos 1 13 68 Modelo 1 (univariado) 1.0 1.90 (1.29-2.80, p=0.001 ) Modelo 2 (ajustado por 1 .0 1 .59 (1.02-2.37, p=0.022) edad y género) Número de muertes a los 54/1 13 (47.8%) 48/68 (70.6%) 48 meses EJEMPLO 2F Detección de galectina 3 en muestras clínicas de sujetos con falla cardiaca crónica (Estudio I de HF crónica) El estudio I de HF crónica incluyó la clase II o IV NYHA diagnosticadas basándose en una combinación de signos y síntomas típicos para los cuales se consideró necesaria la hospitalización, incluso la necesidad de medicamento administrado por vía intravenosa. Los sujetos se enrolaron después de ser dados de alta del hospital en el momento que se encontraban estables con medicamentos estándares. La concentración de galectina 3 se midió usando la prueba de galectina sobre las muestras básales disponibles para 592 sujetos. El valor de umbral de galectina 3 de 17.6 ng/ml, derivado de la población de la escala de referencia (descrita en el ejemplo 2D), se usó para definir una categoría de sujetos con galectina 3 basal elevada (n=363). El riesgo de muerte en cualquier momento después de ser dados de alta del hospital fue aproximadamente 3 veces más alto en los pacientes del cuartil más alto de niveles de galectina 3 en comparación con el cuartil más bajo. El análisis de supervivencia por regresión de Cox y el análisis de Kaplan-Meier mostraron que la galectina 3 basal elevada es un predictor significativo del riesgo de mortalidad, incluso después de ajustar por edad, género, clase según la New York Heart Association (NYHA), fracción de expulsión ventricular izquierda, hábito de fumar y condición diabética (véase la figura 5).

CUADRO 14 Razones de riesgo de mortalidad para sujetos con HF en el estudio I de HF crónica EJEMPLO 2G Detección de galectina 3 en muestras clínicas de sujetos con falla cardiaca crónica (Estudio II de HF crónica) En el estudio II de HF crónica se enrolaron pacientes con HF crónica clase III o IV NYHA. Se estableció un diagnóstico de HF mediante signos y síntomas clínicos de HF en conjunto con hallazgos ecocardiográficos o ventriculográficos de radionúclido de una función sistólica ventricular izquierda o fracción de expulsión ventricular izquierda (LVEF) reducidas, o de disfunción diastólica con función sistólica ventricular izquierda preservada. Los pacientes se encontraban estables con medicamentos estándares en el momento del reclutamiento.

La concentración de galectina 3 se midió usando la prueba de galectina sobre muestras básales de 232 sujetos. El valor de umbral de galectina 3 de 17.6 ng/ml, derivado de la población de escala de referencia (descrita en el ejemplo 2D), se usó para definir una categoría de sujetos con galectina 3 basal elevada (n=1 18). Los pacientes del cuartil más alto de niveles de galectina 3 mostraron un riesgo aproximadamente 2 veces más alto de muerte durante un periodo de seguimiento de 3-6 años, en comparación con el cuartil más bajo. El análisis de supervivencia por regresión de Cox y el análisis de Kaplan-Meier mostraron que la galectina 3 basal elevada es un predictor significativo del riesgo de mortalidad, incluso después de ajustar por edad, género, clase según la New York Heart Association (NYHA), fracción de expulsión ventricular izquierda, hábito de fumar y condición diabética (véase la figura 6).

CUADRO 15 Razones de riesgo de mortalidad para sujetos con HF en el estudio II de HF crónica Razón de riesgo de galectina 3 (95% I.C., valor p) Menor o igual que Mayor de 17.6 ng/ml 17.6 ng/ml Número de sujetos 1 14 1 18 Modelo 1 (univariado) 1.0 1.57 (1.05-2.35, p=0.029) Modelo 2 (ajustado por 1.0 1.52 (1.01 -2.27, p=0.044) edad y género) Número de muertes a los 40 29/1 14 (25.4%) 45/1 18 (38.1 %) meses Incorporación por referencia La descripción completa de cada documento de patente y articulo científico citados en la presente se incorpora por referencia para todo propósito.

Equivalentes La invención se puede realizar en otras formas específicas sin apartarse del espíritu o características esenciales de la misma. Por lo tanto, las modalidades anteriores, en todo aspecto, se consideran ilustrativas y no limitativas de la invención descrita en la presente. Así, el alcance de la invención es indicado por las reivindicaciones anexas más que por la descripción anterior, y todos los cambios comprendidos en el significado y extensión de equivalencia de las reivindicaciones se consideran abarcados por la invención.

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 1 - Un kit para detectar la concentración de galectina 3 en una muestra, el kit comprendiendo: una primera y una segunda porción de unión, una de ellas marcada con una marca detectable, cada porción unida respectivamente a epítopes espaciados de la porción N-terminal de la galectina 3, que comprenden la secuencia de aminoácidos: MADNFSLHDA LSGSGNPNPQ GWPGAWGNQP AGAGGYPGAS YPGAYPGQAP PGAYPGQAPP GAYPGAPGAY PGAPAPGVYP GPPSGPGAYP SSGQPSATGA YPATGPYGAP AGP (SEQ ID NO: 1). 2 - El kit de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la marca detectable es una enzima o un fluoróforo. 3 - El kit de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado además porque las porciones de unión se unen respectivamente a un epítope definido por al menos una porción de una secuencia de aminoácidos de galectina 3 seleccionada del grupo que consiste en: MADNFSLHDALS (aminoácidos 1-12 del SEQ ID NO: 1 ), MADNFSLHDALSGS (aminoácidos 1-14 del SEQ ID NO: 1 ), GNPNPQGWPGA (aminoácidos 15-25 del SEQ ID NO: 1 ), WGNQPAGAGG (aminoácidos 26-35 del SEQ ID NO: 1 ), YPGQAPPGAYPGQAPPGA (aminoácidos 45-62 del SEQ ID NO: 1 ), YPGAPGAYPGAPAPGV (aminoácidos 63-78 del SEQ ID NO: 1), YPGAPAPGVYPGPPSGPGA (aminoácidos 70-88 del SEQ ID NO: 1), y YPSSGQPSATGA (aminoácidos 89-100 del SEQ ID NO: 1 ). 4. - El kit de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado además porque las porciones de unión son anticuerpos monoclonales. 5. - El kit de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque los anticuerpos monoclonales se seleccionan del grupo que consiste en 9H3.2, 87B5 y M3/38. 6. - El kit de conformidad con la reivindicación 4 o 5, caracterizado además porque el anticuerpo se une a un epítope que comprende MADNFSLHDALSGS (aminoácidos 1 -14 del SEQ ID NO: 1 ), GNPNPQGWPGA (aminoácidos 15-25 del SEQ ID NO: 1 ), o YPGAPAPGVYPGPPSGPGA (aminoácidos 70-88 del SEQ ID NO: 1 ). 7. - El kit de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4-6, caracterizado además porque el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo de ratón. 8. - Un método para detectar el nivel de galectina 3 humana en una muestra de un sujeto, el método comprendiendo: someter la muestra a una prueba de sándwich de doble porción de unión, por lo menos una de las porciones de unión estando marcada con una marca detectable, cada porción de unión siendo específica para epítopes respectivos no traslapados de la porción N-terminal de galectina 3, que comprenden la secuencia de aminoácidos: MADNFSLHDA LSGSGNPNPQ GWPGAWGNQP AGAGGYPGAS YPGAYPGQAP PGAYPGQAPP GAYPGAPGAY PGAPAPGVYP GPPSGPGAYP SSGQPSATGA YPATGPYGAP AGP (SEQ ID NO: 1 ). 9.- El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque la prueba de sándwich provee un resultado cualitativo indicativo de la presencia o ausencia de una concentración de galectina 3 arriba de un umbral. 10. - El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque la concentración de umbral de galectina 3 en la muestra del sujeto está en la escala de 15-20 ng/ml. 1 1. - El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque la concentración de umbral de galectina 3 en la muestra del sujeto está en la escala de 20-25 ng/ml. 12.- El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque la concentración de umbral de galectina 3 en la muestra del sujeto está en la escala de 25-30 ng/ml. 13. - El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque la concentración de umbral de galectina 3 en la muestra del sujeto está en la escala de 30-35 ng/ml. 14. - El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque la prueba de sándwich provee un resultado cuantitativo indicativo de la concentración de galectina 3. 15 - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8-14, caracterizado además porque comprende el paso adicional de comparar el resultado de la prueba de sandwich con datos que correlacionan la concentración de galectina 3 en la muestra con datos que relacionan el resultado con el riesgo del sujeto de desarrollar síntomas de falla cardiaca (HF), o con la severidad de una enfermedad de HF diagnosticada en el sujeto. 16. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8-15, caracterizado además porque comprende su repetición durante un tiempo para obtener una tendencia. 17. - Un método para detectar el riesgo de desarrollo o avance de la falla cardiaca en un sujeto, el método comprendiendo determinar si la concentración de galectina 3 en una muestra del sujeto rebasa un umbral de por lo menos 15 ng/ml. 18.- El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque el umbral está en la escala de 15-20 ng/ml. 19.- El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque el umbral está en la escala de 20-25 ng/ml. 20 - El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque el umbral está en la escala de 25-30 ng/ml. 21 .- El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque el umbral está en la escala de 30-35 ng/ml.