CN107383192B

CN107383192B - 半乳糖凝集素-3检测试剂盒

Info

Publication number: CN107383192B
Application number: CN201710589093.XA
Authority: CN
Inventors: 劳滔滔; 张雁; 林潮喜
Original assignee: Shenzhen Beinuobo Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Jinshun New Materials Technology Co., Ltd.
Priority date: 2017-07-19
Filing date: 2017-07-19
Publication date: 2018-08-24
Anticipated expiration: 2037-07-19
Also published as: CN107383192A

Abstract

本申请提供了用于结合人半乳糖凝集素‑3的抗体或其抗原结合部分，所述抗体选自第一抗体、第二抗体或者二者的组合，包含所述抗体或其抗原结合部分的检测试剂盒，利用所述抗体或其抗原结合部分检测人半乳糖凝集素‑3的含量的方法，所述抗体或其抗原结合部分在检测人半乳糖凝集素‑3中的应用，以及所述抗体或其抗原结合部分在制备检测样品中人半乳糖凝集素‑3的含量的试剂盒中的用途。

Description

半乳糖凝集素-3检测试剂盒

技术领域

本申请大体上涉及生物检测领域，具体而言，本申请提供了用于结合人半乳糖凝集素-3的抗体或其抗原结合部分，所述抗体选自第一抗体、第二抗体或者二者的组合，包含所述抗体或其抗原结合部分的检测试剂盒，利用所述抗体或其抗原结合部分检测人半乳糖凝集素-3的含量的方法，所述抗体或其抗原结合部分在检测人半乳糖凝集素-3中的应用，以及所述抗体或其抗原结合部分在制备检测样品中人半乳糖凝集素-3的含量的试剂盒中的用途。

背景技术

半乳糖凝集素是一类糖粘合蛋白家族。所有半乳糖凝集素在其称为糖类识别结构域或CRD的结构域中共有共同的氨基酸序列。目前，已鉴定了15种哺乳动物半乳糖凝集素。一个亚组包括半乳糖凝集素1、2、5、7、10、13、14和15，其各自包含单个CRD。第二亚组包含一个种类即半乳糖凝集素-3，其包含连接至N末端结构域的单个CDR，而N末端结构域包含重复的短氨基酸序列例如PGA。第三个半乳糖凝集素亚组包括半乳糖凝集素4、6、8、9和12，其各自包含通过可变长度的接头连接的两个CRD。全部半乳糖凝集素具有显著的氨基酸序列同源性，并且许多出现在人循环系统中。

半乳糖凝集素-3是半乳糖凝集素家族里面一个结构特殊的成员，其表达与上皮细胞以及包括巨噬细胞，嗜中性细胞和肥大细胞等在内的免疫细胞相关。半乳糖凝集素-3参与心力衰竭(HF)相关的多种重要的生物学过程，如肌成纤维细胞增生、纤维化、组织修复、心脏重塑和炎症反应等。由于血液或血清等体液中半乳糖凝集素-3的含量能够反映人体的疾病状况，譬如慢性心脏衰竭等，所以准确定量半乳糖凝集素-3可以用来鉴定或预测疾病，用来评估疾病的严重程度，分期或预测疾病后果，或监视用药效果等临床或科研需要。

迄今为止的测定方法难以明确将半乳糖凝集素-3与其它半乳糖凝集素相区别，因为半乳糖凝集素-3与其它14种哺乳动物半乳糖凝集素，特别是在保守的糖类识别结构域(CRD)中共有高度的序列相似性。阻碍开发特异性、可重现的检测分析的半乳糖凝集素-3的另一因素是半乳糖凝集素-3结合不同的蛋白质、糖类、核酸和脂质的倾向性。

发明内容

为了实现对人半乳糖凝集素-3的测定，本申请提供了用于结合人半乳糖凝集素-3的抗体或其抗原结合部分，所述抗体选自第一抗体、第二抗体或者二者的组合，包含所述抗体或其抗原结合部分的检测试剂盒，利用所述抗体或其抗原结合部分检测人半乳糖凝集素-3的含量的方法，所述抗体或其抗原结合部分在检测人半乳糖凝集素-3中的应用，以及所述抗体或其抗原结合部分在制备检测样品中人半乳糖凝集素-3的含量的试剂盒中的用途，具体如下。

第一方面，本申请提供了抗体或其抗原结合部分，所述抗体选自第一抗体、第二抗体或者二者的组合，所述第一抗体和第二抗体能分别结合人半乳糖凝集素-3的C末端部分上的非连续的表位，所述C末端部分包含如下氨基酸序列：

MLITILGTVKPNANRIALDFQRGNDVAFHFNPRFNENNRRVIVCNTKLDNNWGREERQSVFPFESGKPFKIQVLVEPDHFKVAVNDAHLLQYNHRVKKLNEISKLGISGDIDLTSASYTMI(SEQ ID NO:1)。

在一些实施方案中，所述第一抗体和第二抗体分别结合由人半乳糖凝集素-3氨基酸序列的至少一部分确定的表位，所述半乳糖凝集素-3氨基酸序列的至少一部分选自：

MLITILGTVKPN(SEQ ID NO:1的氨基酸1至12)、

MLITILGTVKPNAN(SEQ ID NO:1的氨基酸1至14)、

IALDFQRGND(SEQ ID NO:1的氨基酸15至25)、

VAFHFNPRFN(SEQ ID NO:1的氨基酸26至35)、

TKLDNNW(SEQ ID NO:1的氨基酸45至62)、

GREERQSVFPFESGK(SEQ ID NO:1的氨基酸63至78)、

VFPFESGKPFKIQVLVEP(SEQ ID NO:1的氨基酸70至88)、

DHFKVAVNDAHL(SEQ ID NO:1的氨基酸89至100)。

在一些实施方案中，所述抗体为单克隆抗体。

在一些实施方案中，所述单克隆抗体为兔单克隆抗体。

在一些实施方案中，所述抗原结合部分是Fab、F(ab)’₂或单链Fv。

在一些实施方案中，所述第一抗体包含SEQ ID NO:2所示的HCDR1，SEQ ID NO:3所示的HCDR2，SEQ ID NO:4所示的HCDR3，SEQ ID NO:5所示的LCDR1，SEQ ID NO:6所示的LCDR2和SEQ ID NO:7所示的LCDR3，所述第二抗体包含SEQ ID NO:8所示的HCDR1，SEQ IDNO:9所示的HCDR2，SEQ ID NO:10所示的HCDR3，SEQ ID NO:11所示的LCDR1，SEQ ID NO:12所示的LCDR2和SEQ ID NO:13所示的LCDR3。

第二方面，本申请提供了用于检测人受试者的样品中半乳糖凝集素-3的含量的试剂盒，其包含第一方面的抗体或其抗原结合部分，以及使用试剂盒测定半乳糖凝集素-3的含量的说明书，其中所述抗体包括所述第一抗体和所述第二抗体，所述第一抗体或其抗原结合部分用可检测的标记物标记，或者所述第二抗体或其抗原结合部分用可检测的标记物标记。

在一些实施方案中，所述可检测的标记物包括酶、化学发光化合物、荧光团、显色物质或以上的组合。

在一些实施方案中，所述酶为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。

在优选的实施方案中，所述酶为辣根过氧化物酶。

在一些实施方案中，所述样品选自血液、血清、血浆、淋巴和以上的组合。

在优选的实施方案中，所述样品为血液。

在一些实施方案中，未用可检测的标记物标记的抗体被预先连接在固体表面上。

在一些实施方案中，所述固体表面为塑料或玻璃容器或载玻片。

在一些实施方案中，所述试剂盒还包含标准品，所述标准品为由细菌表达的全长的重组人半乳糖凝集素-3蛋白。

在一些实施方案中，所述试剂盒还包含质控品，所述质控品为来自人血清的天然半乳糖凝集素-3的阴性和阳性质控品，并且其中所述质控品中添加了肝素。

在一些实施方案中，所述试剂盒中还包含缓冲液，优选添加了0.1％Tween-20的PBS pH7.2。

在一些实施方案中，将半乳糖凝集素-3的含量与增加的心力衰竭(HF)风险、诊断HF的存在、测定HF的严重程度或预测其HF的预后相关联。

第三方面，本申请提供了用于检测体外样品中人半乳糖凝集素-3的水平的方法，所述方法利用第一方面的抗体或其抗原结合部分，

其中所述抗体包括所述第一抗体和所述第二抗体，

其中所述第一抗体或其抗原结合部分用于捕获人半乳糖凝集素-3，并且所述第二抗体或其抗原结合部分用可检测的标记物标记；或者所述第二抗体或其抗原结合部分用于捕获人半乳糖凝集素-3，并且所述第一抗体或其抗原结合部分用可检测的标记物标记，并且

其中所述抗体或其抗原结合部分通过免疫学方法来检测人半乳糖凝集素-3的水平。

在优选的实施方案中，所述样品为血液。

在一些实施方案中，所述免疫学方法选自酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫荧光、免疫化学发光、免疫沉淀和以上的组合。

在优选的实施方案中，所述免疫学方法为ELISA。

第四方面，本申请提供了第一方面的抗体或其抗原结合部分在检测样品中人半乳糖凝集素-3的水平中的用途，其中所述抗体包括所述第一抗体和所述第二抗体。

在优选的实施方案中，所述样品为血液。

第五方面，本申请提供了第一方面的抗体或其抗原结合部分在制备检测样品中人半乳糖凝集素-3的含量的试剂盒中的用途，其中所述抗体包括所述第一抗体和所述第二抗体。

在优选的实施方案中，所述样品为血液。

第六方面，本申请提供了一种多肽，其包含人半乳糖凝集素-3的C末端部分，所述C末端部分包含如下氨基酸序列：

附图简要说明

图1为本申请采用B细胞体外克隆技术获得特异性识别半乳糖凝集素-3的免疫球蛋白抗体的示意图。

图2为利用本申请的抗体进行的ELISA测定所绘制的标准曲线。

图3为人血液中的半乳糖凝集素-3测定及其与心衰的关系图，图3A显示了心衰患者的半乳糖凝集素-3含量明显升高，其中N末端前脑利钠肽(NT-proBNP)是目前公认的诊断心衰的客观指标。图3B显示了患者死亡率、NT－proBNP以及半乳糖凝集素－3含量的相关性。

实施方案详细描述

除非另外指明，否则本发明的实施将采用本领域常规的分子生物学、微生物学、细胞生物学、生物化学以及免疫学技术。

除非另外指明，否则本申请中所用的术语具有本领域技术人员通常所理解的含义。

定义

本文中所用的术语“心力衰竭”或“HF”是指损害心室充满或射出血液的能力的复杂临床综合征。任何结构或功能性心脏障碍可引起HF，其中大部分HF患者具有受损的左心室(LV)心肌功能。HF的综合征包括呼吸困难(呼吸短促)、疲劳和液体潴留。

本文所用的术语“受试者”指活人或非人生物体。本文优选的受试者是人受试者。

本文所用的术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合位点”或“靶结合位点”意指保留与抗原或靶特异性结合的能力的结合蛋白(例如抗体或受体)的一个或多个片段，例如免疫球蛋白可变结构域(例如VH或VL)。抗体的抗原结合部分可为全长抗体的片段。术语“抗原结合部分”包含的结合片段的例子包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，包含在铰链区由二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)包含单个可变结构域的dAb片段；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，由分开基因编码的Fv的VL和VH可使用重组法通过合成接头进行连接，使其成为单条蛋白质链，其中VH和VL区配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv))。此类scFv也包含在术语“抗原结合部分”内，与其他形式的单链抗体例如包含一对串联Fv片段(VH-CH1-VH-CH1)的双抗体和“线性抗体”一样，所述一对串联Fv片段连同互补轻链多肽一起形成一对抗原结合位点。并非抗原结合部分的每一个氨基酸均可与抗原结合。例如，抗体的可变结构域包含互补决定区(CDR)和构架区(FR)。

本文所用的术语“CDR”意指在免疫球蛋白可变区序列内的互补决定区。在重链和轻链的可变区中各自存在三个CDR，其对于重链和轻链可变区各自指定为CDR1、CDR2和CDR3。术语“CDR组”指在能够结合抗原的单个可变区中出现的一组三个CDR。这些CDR的确切边界已根据不同的系统进行限定。由Kabat描述的系统(Kabat等人(1971)Ann.NYAcad.Sci.190:382-391；Kabat等人(1987)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第四版US Govt.Printing Off.No.165-492；Kabat等人(1991)Sequences ofProteins of Immunological Interest,第五版.NIH公开号91-3242)不仅提供了可应用于任何抗体可变区的明确的残基编号系统，还提供了限定三个CDR的精确残基边界。这些CDR可被称为Kabat CDR。CDR区的氨基酸残基比抗体的重链和轻链可变区中的其他氨基酸残基更可变(例如高变)。Chothia及同事(Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:877-883)发现Kabat CDR内的某些亚部分采取几乎相同的肽主链构象，尽管在氨基酸序列水平上具有大的多样性。这些亚部分被指定为L1、L2和L3或H1、H2和H3，其中“L”和“H”分别指定轻链和重链区。这些区可被称为Chothia CDR，其具有与Kabat CDR重叠的边界。限定与Kabat CDR重叠的CDR的其他边界已由Padlan(1995)FASEBJ.9:133-139和MacCallum(1996)J.Mol.Biol.262(5):732-45描述。另外其他CDR边界定义可能不严格遵循本文系统之一，但仍与Kabat CDR重叠。本文的抗体或其抗原结合部分可利用根据这些系统中的任一个限定的CDR。

半乳糖凝集素-3

半乳糖凝集素-3(GenBank登录号：NC_000014.7(基因)和NP_002297.2(蛋白质))是能特异性结合半乳糖的15种哺乳动物β半乳糖苷-结合凝集素或“半乳糖凝集素”之一。半乳糖凝集素-3在文献中被称为LGALS3、MAC-2抗原、糖结合蛋白(CBP)-35、层粘连蛋白结合蛋白、半乳糖-特异性凝集素3、mL-34，L-29，hL-31，εBP和IgE-结合蛋白。半乳糖凝集素-3由羧基末端糖类识别结构域(CRD)和氨基末端串联重复组成(Liu，F.-T.(2000)Role ofGalectin-3in inflammation.Lectins and Patho1ogy.M.Caron和D.Seve，eds.HarwoodAcademic Publishers，Amsterdam，The Netherlands，p.51；Liu，F.-T.等人(1995)Am.J.Pathol.147：1016)。半乳糖凝集素-3通常分布在许多器官的上皮和各种炎症细胞，包括巨噬细胞以及树突细胞和枯否细胞(Flotte，TJ.等人(1983)Am.J.Pathol.111：112)中。

半乳糖凝集素-3已显示在许多细胞过程中起作用，包括细胞间粘着、细胞-基质相互作用、吞噬、细胞周期、细胞凋亡、血管生成和mRNA剪接。半乳糖凝集素-3已显示通过细胞内和细胞外作用起作用(Sano，H.等人(2000)The Journal of Immunology，165：2156-2164)。其是核不均一核糖核蛋白(hnRNP)的组分(Laing，J.G.等人(1998)Biochemistry27：5329)，一种pre-mRNA剪接中的因子(Dagher，S.F.等人(1995)Proc.Natl.Acad.ScL USA92：1213)，并且已发现其控制细胞周期(Kim，H.-R.C.等人(1999)Cancer Res.59：4148)和通过与Bc1-2家族成员相互作用而阻止T细胞凋亡(Yang，R.-Y.等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：6737)。另一方面，已显示从单核/巨噬细胞(Sato，S.等人(1994)J.Biol.Chem.269：4424)和上皮细胞(Lindstedt，R.G.等人(1993)J.Biol.Chem.268：11750)分泌的半乳糖凝集素-3在活化不同类型的细胞例如单核细胞/巨噬细胞(Liu，F.-T.(1993)Immunol Today 14：486)、肥大细胞、中性粒细胞和淋巴细胞(Hsu，D.K.，S.R.等(1996)Am.J.Pathol.148：1661)中充当细胞外分子。已显示半乳糖凝集素-3充当单核细胞和巨噬细胞的新型化学引诱物(Sano，H.等人(2000)The Journal ofImmunology，2000，165：2156-2164)。半乳糖凝集素-3牵涉诸如癌症、炎症和心力衰竭(HF)的疾病。如国际专利公开案No.WO2005/040817中所公开的，半乳糖凝集素-3的定量特别适合用于诊断和检测HF的严重程度和预测后果的测定法。

与其它哺乳动物半乳糖凝集素不同，人半乳糖凝集素-3包含特定的C末端结构域，其包含如下氨基酸序列：

本发明人发现，通过靶向C末端结构域可将半乳糖凝集素-3与其它哺乳动物半乳糖凝集素可靠地区分开来。通过使用本文中所公开的抗体，并结合本领域内公知的免疫测定法，例如ELISA，能够可靠地且可重复地检测出样品中的半乳糖凝集素-3的水平，并将其与受试者中例如HF的存在，严重程度和分期等相关联。示例性的C末端表位包括但不限于MLITILGTVKPN(SEQ ID NO:1的氨基酸1至12)、MLITILGTVKPNAN(SEQ ID NO:1的氨基酸1至14)、IALDFQRGND(SEQ ID NO:1的氨基酸15至25)、VAFHFNPRFN(SEQ ID NO:1的氨基酸26至35)、TKLDNNW(SEQ ID NO:1的氨基酸45至62)、GREERQSVFPFESGK(SEQ ID NO:1的氨基酸63至78)、VFPFESGKPFKIQVLVEP(SEQ ID NO:1的氨基酸70至88)、DHFKVAVNDAHL(SEQ ID NO:1的氨基酸89至100)，其中字母表示标准氨基酸代码。虽然这些氨基酸序列描述了线性表位，但也可使用由N端的二级和三级结构产生的并且包含来自序列非连续的各段的氨基酸的表位。而且，本领域技术人员应理解，用于与本文所公开的两个抗体结合的两个C末端表位应当相距至少5个氨基酸、至少6个氨基酸、至少7个氨基酸、至少8个氨基酸、至少9个氨基酸、至少10个氨基酸、至少11个氨基酸，至少12个氨基酸，至少13个氨基酸、至少14个氨基酸、至少15个氨基酸或者相距不影响两个抗体与表位相结合的任何距离。两个表位的距离是本领域技术人员能够常规地确定的。

抗体或其抗原结合部分

本申请中的抗半乳糖凝集素-3抗体选自第一抗体、第二抗体或者二者的组合，所述第一抗体和第二抗体能分别结合人半乳糖凝集素-3的C末端部分上的非连续的表位，所述C末端部分包含如下氨基酸序列：

在一些实施方案中，抗半乳糖凝集素-3抗体为单克隆抗体，优选兔抗体。

试剂盒

本申请提供了用于检测人受试者的样品中半乳糖凝集素-3的含量的试剂盒，其包含抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包括所述第一抗体和所述第二抗体，所述第一抗体或其抗原结合部分用可检测的标记物标记，或者所述第二抗体或其抗原结合部分用可检测的标记物标记，每一种抗体或其抗原结合部分分别地与C末端部分上的非连续的表位结合，所述C末端部分包含如下氨基酸序列：

半乳糖凝集素-3的含量可用于检测增加的HF风险、诊断HF的存在、测定HF的严重程度或预测患HF的受试者的预后。

试剂盒中的一种抗体或其抗原结合部分用作捕获抗体，并可被固定在固体表面上以用于捕获半乳糖凝集素-3。而另一种抗体或其抗原结合部分用作检测抗体，并与可检测的标记物连接，所述可检测的标记物包括酶、化学发光化合物、荧光团、显色物质或以上的组合，这些均为本领域内已知的。

例如，可被连接至抗体的酶的实例包括但不限于碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、荧光素酶、尿素酶和β-半乳糖苷酶

可将试剂盒中提供的一种抗体或其抗原结合部分预先连接至固体表面，例如但不限于塑料或玻璃容器或载玻片。试剂盒还可包含用于将样品与抗体混合的容器。此类容器可适合用于能够检测由检测单克隆抗体产生的信号的检测仪器。本申请的试剂盒中还包含实施检测所用的缓冲液例如PBS pH7.2+0.1％Tween-20以及标准品例如由细菌表达的全长的重组半乳糖凝集素3蛋白，这在本领域内是公知的。试剂盒还可包含质控品，例如来自人血清的天然半乳糖凝集素-3的阴性和阳性质控品，其中在质控品中添加了肝素。

本申请的试剂盒可额外地包含以下的一个或多个：(1)使用试剂盒测定半乳糖凝集素-3的水平的说明书；(2)一种被可检测的标记物标记的单克隆抗体或其抗原结合部分；和(3)在其上固定任一抗体或其抗原结合部分的固相。如果未提供标记的抗体，那么可用可检测的标记物例如化学发光部分、酶促部分、荧光部分或放射性部分标记抗体本身。

用于检测体外样品中人半乳糖凝集素-3的水平的方法

根据上文的描述，可使用能结合人半乳糖凝集素-3的C末端部分的抗体或其抗原结合部分来定量样品中半乳糖凝集素-3的水平。用于半乳糖凝集素-3的检测的测试样品可以是任何体液或组织样品，包括但不限于血液、血清、血浆或淋巴以及次优选尿、胃汁、胆汁、唾液、汗液和脊髓液、粪便或肌肉活检组织。在一个优选实施方案中，样品是血液样品。在另一个实施方案中，样品是血浆样品。还可使用血清样品。此外，体液可以是经过处理的(例如血清)或未经处理的。从受试者获得体液的方法对于本领域技术人员来说是已知的。

根据本申请，可以利用上文所述的抗体或其抗原结合部分，通过免疫学方法来检测半乳糖凝集素-3的水平。例如，可以使用“夹心”测定法检测和定量半乳糖凝集素-3。在该方法中，通常，一个抗体被固定在固体表面上，以便结合并且捕获半乳糖凝集素-3。该抗体因而在本文中称为捕获抗体。第二抗体被例如荧光基团、酶或有色颗粒可检测地标记，以便第二抗体与半乳糖凝集素-3-复合物的结合表示半乳糖凝集素-3已被捕获。信号的强度与样品中半乳糖凝集素-3的浓度成比例。因此第二抗体在本文中也称为检测抗体或标记抗体。

此类测定方法可称为双位点免疫测定法、“夹心”法或(当抗体是粘合剂时)“夹心免疫测定”。如本领域内已知的，可将捕获和检测抗体同时或相继地与测试样品接触。序贯法(Sequential method)，有时称为“正向(forward)”法，可通过将捕获抗体与样品一起温育和此后在预定的时间上加入标记的检测抗体来完成。可选地，首先可将标记的检测抗体与样品一起温育，然后可将样品与捕获抗体接触(有时称为“反向”法)。此类测定可以以本领域技术人员已知的许多特定形式来执行，包括通过不同的高通量临床实验室分析仪的使用或利用重点照护检验(point of care)或家用测试设备来执行。

最常用的酶免疫测定是“酶联免疫吸附测定(ELISA)”。ELISA是使用抗体的标记(例如，酶连接的)形式检测和测量抗原的浓度的技术。存在本领域技术人员公知的不同ELISA形式。本领域内已知的用于ELISA的标准技术描述于“Methods inImmunodiagnosis”，第2版，Rose and Bigazzi，eds.John Wiley&Sons，1980；Campbell等人，“Methods and Immunology”，W.A.Benjamin，Inc.，1964；和Oelleric，M.(1984，J.Clin.Chem.Clin.Biochem.22：895-904中。

在“夹心ELISA”中，将抗体(例如，抗半乳糖凝集素-3)连接至固相(即，微量滴定板)并且与含有抗原(例如，半乳糖凝集素-3)的生物样品接触。然后洗涤固相以除去未结合的抗原。然后将标记的抗体(例如，酶连接的)与结合抗原结合，从而形成抗体-抗原-抗体夹心。可被连接至抗体的酶的实例是碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、荧光素酶、尿素酶和β-半乳糖苷酶。酶联抗体与底物反应产生可被测量的显色反应产物。该测量可用于例如通过将测量值与半乳糖凝集素-3标准曲线相比较来推导存在于样品中的半乳糖凝集素-3的浓度。

免疫荧光法是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体(或抗原)作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光，可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。

化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay,CLIA)是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。化学发光免疫分析用化学发光剂直接标记抗原或抗体进行免疫分析。常用于标记的化学发光物质有吖啶酯类化合物——acridin ium ester(A E)，是有效的发光标记物，其通过起动发光试剂作用而发光，强烈的直接发光在一秒钟内完成，为快速的闪烁发光。吖啶酯作为标记物用于免疫分析，其化学反应简单、快速、无须催化剂，检测小分子抗原采用竞争法，大分子抗原则采用夹心法，非特异性结合少，本底低；与大分子的结合不会减小所产生的光量，从而增加灵敏度。

免疫沉淀是利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。抗体与样品中相应的蛋白结合后，再与蛋白A/G(ProteinA/G)或二抗偶联的琼脂糖或Sepharose珠子孵育，通过离心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗体-目的蛋白复合物，沉淀经过洗涤后，重悬于电泳上样缓冲液，煮沸，在高温及还原剂的作用下，抗原与抗体解离，离心收集上清，上清中包括抗体、目的蛋白和少量的杂蛋白。

标记物

本申请的试剂盒以及检测方法中使用的标记物可选自本领域内通常已知的任意标记物。优选标记物是允许更精确定量的标记物。标记物的实例包括但不限于荧光部分、酶、电化学活性种类、放射性同位素、化学发光分子、胶乳粒子或金颗粒、可检测的配体等。在一个优选实施方案中，标记物是酶或荧光分子。用于将标记物附着至抗体的方法在本领域内是公知的，并且包括共价和非共价连接。

在一个实施方案中，可用荧光化合物标记抗体。当将荧光标记的抗体暴露于适当波长的光时，则可通过发射的荧光检测其存在。其中最常用的荧光标记化合物是Cy3和Cy5(花青染料家族的水溶性荧光染料-“Cy”染料)、异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛和荧光胺。

在另一个实施方案中，通过将抗体连接至酶来可检测地标记检测抗体。从而所述酶在与其底物接触时将与底物反应，这种反应可以例如通过分光光度计测量法、荧光测定法或目测法检测。可用于可检测地标记本发明的抗体的酶包括但不限于苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-V-类固醇异构酶、酵母乙醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、尿素酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。

还可使用放射性标记的抗体来实现检测。然后可通过使用放射免疫测定法检测抗体。可利用此类方法如γ计数器或闪烁计数器的使用或利用放射自显影术来检测放射性同位素。对于本申请的目的特别有用的同位素是³H、¹³¹I、³⁵S、¹⁴C，和优选的¹²⁵I。

还可通过将抗体偶联至化学发光部分来可检测地标记抗体。然后通过检测化学反应过程中产生的发光的存在来测定化学发光抗体的存在。特别有用的化学发光标记化合物的实例是鲁米诺，萤光素、异氨基苯二酰肼、咪唑、吖啶盐和草酸酯。

实施例

提供以下实施例仅仅是对本申请的一些实施方案进行举例说明，没有任何限制的目的或性质。此外，如没有特别说明，实施例中的方法将按照本领域的常规方案进行。

实施例1：兔单克隆抗体的获得

将人半乳糖凝集素-3免疫兔子获取表达抗体的B淋巴细胞，采用B细胞体外克隆技术获得特异性识别半乳糖凝集素-3的免疫球蛋白抗体。具体方法如图1所示。

将编码人半乳糖凝集素-3C末端的121个氨基酸(SEQ ID NO:1)的cDNA克隆到pET21载体上，并将该载体转化进BL21细菌中。然后进行分离纯化以获得3mg人重组半乳糖凝集素-3蛋白，并将其与完全弗氏免疫佐剂以1:1体积比混合，然后对2月龄1.5公斤左右的新西兰大白兔进行4次皮下免疫注射加一次腹腔加强免疫。每一次免疫注射间隔3周，最后一次皮下注射后对兔子血液的免疫效价进行ELISA分析。简言之，用上述人重组半乳糖凝集素包被96孔ELISA板，检测梯度稀释的兔子血清(1:1000，1:4000，1:16000，1:64000和1:256000)。

取效价达到1:64000的兔子的血液，1200rpm离心5分钟后用红细胞裂解液(购自Biolegend)去除红细胞。对剩下的白细胞采用流式细胞分选技术，用抗－CD19，抗－IgM和抗－IgA抗体(购自Biolegend)标记白细胞，筛选出CD19阳性，IgM阴性，IgA阴性的兔子B记忆细胞。将每个B细胞培养于384孔微量滴定板的一个孔中，用MEM/F12培养基(购自Cellgro)进行培养。384孔微量滴定板事先用表达CD40L的小鼠成纤维细胞铺板。小鼠成纤维细胞从13.5日胎龄的胚胎提取，用DMEM(含10％FBS)培养基体外培养4天后转染表达CD40L的质粒(购自Origene)。48小时后将小鼠成纤维细胞以10000个/孔铺板。经过12天培养，B记忆细胞发生增殖，并分泌单克隆抗体。采用上述ELISA方法筛选阳性B细胞克隆。

用RNA miniprep试剂盒(购自Qiagen)分离阳性孔中的B细胞的RNA，并用逆转录酶(购自Biosystems)逆转录成cDNA。然后采用下述兔子抗体特异性引物进行PCR扩增：

HC－For：CTTAAGCTTCCACCATGGAGACTGGGCTGCGCTG(SEQ ID NO:14)

HC－Rev：TCCCTCGAGCTATTTACCCGGAGAGCGGG(SEQ ID NO:15)

LC－For：CTTAAGCTTCCACCATGGACACGAGGGCCCCCAC(SEQ ID NO:16)

LC－Rev：TCCCTCGAGCTAACAGTCACCCCTATTGA(SEQ ID NO:17)

扩增条件为：95℃变性30秒；95℃ 10秒，65℃ 30秒，72℃ 120秒，35个循环；72℃延伸5分钟。将兔抗体Ig重链和轻链的扩增产物分别插入pCDNA3.1(购自LIFE TECH)表达载体中。用该载体通过脂质体(Lipofactamine 2000，购自LIFE TECH)转染HEK293细胞(购自LIFE TECH)，过量表达特异性抗体，采用蛋白A柱子(购自LIFE TECH)分离纯化特异性兔子抗体。

本实施例共获得48个兔子单克隆抗体。

实施例2：从实施例1鉴定的单克隆抗体中筛选专一针对半乳糖凝集素-3的单克隆抗体对

对获得的48个兔子单克隆抗体进行进一步鉴定。利用棋盘法鉴定捕捉抗体和检测抗体对。简言之，将所有48个抗体以1ng/ml(用PBS调整抗体浓度)的浓度，每孔25μl的量铺到384孔微量滴定板作为捕捉抗体，每个捕捉抗体铺47孔，16小时后，每孔添加50μl的含1％BSA的PBS进行封闭。然后将10ng/ml全长人重组半乳糖凝集素－3(购自Peprotech)(用含0.1％BSA的PBS调整半乳糖凝集素-3的浓度)以每孔25μl的量添加到384孔微量滴定板内，PBST清洗5遍后用生物素标记的除其本身之外的抗体，作为检测抗体(浓度为1ng/ml，每孔加25μl)来检测对应的孔。

对人半乳糖凝集素-3的同源蛋白，包括人半乳糖凝集素-1，2，4，5，6，7，12，和13(购自Peprotech)进行交叉反应检测。简言之，用人半乳糖凝集素-1，2，4，5，6，7，12，和13铺板，分别用ELISA检测所获得的48个抗体，剔除阳性信号的抗体。获得一对对人半乳糖凝集素-3具有专一性的兔子单克隆抗体。

经测序，一种抗体包含SEQ ID NO:2所示的HCDR1，SEQ ID NO:3所示的HCDR2，SEQID NO:4所示的HCDR3，SEQ ID NO:5所示的LCDR1，SEQ ID NO:6所示的LCDR2和SEQ ID NO:7所示的LCDR3，另一种抗体包含SEQ ID NO:8所示的HCDR1，SEQ ID NO:9所示的HCDR2，SEQID NO:10所示的HCDR3，SEQ ID NO:11所示的LCDR1，SEQ ID NO:12所示的LCDR2和SEQ IDNO:13所示的LCDR3

实施例3：利用实施例2中获得的抗体检测标准品和样品中的半乳糖凝集素-3的含量

将捕捉抗体(两个抗体互为捕捉抗体和检测抗体)稀释于1mM碳酸钠(pH9.0)包被液中至浓度为1μg/ml，取25μl包被384孔微量滴定板的各孔，4℃过夜，用去离子水清洗两遍后，用含1％BSA的PBST(PBS+0.1％Tween-20)封闭1小时，PBST(PBS+0.1％Tween-20)清洗三遍后依次加入25μl标准品(其为全长人重组半乳糖凝集素－3，购自Peprotech)，其用含1％BSA的PBST(PBS+0.1％Tween-20)稀释至浓度分别为0，0.3125，0.625，1.25，2.5，5，10ng/ml)，质控品(购自PeproTech，其中所述质控品为来自人血清的天然半乳糖凝集素-3的阴性和阳性质控品，并且其中所述质控品中添加了肝素)和临床患者样品(其NT-proBNP含量已知，几个临床患者样品中，部分患者被诊断为心衰，部分为健康人群)，室温孵育60分钟。期间标准品和样品中的半乳糖凝集素-3结合到捕捉抗体上，随后用PBST(PBS+0.1％Tween-20)洗三遍，洗去孔中所有未结合的物质，包括未绑定的半乳糖凝集素-3。然后向各孔中加入25μl的1μg/ml的HRP标记的检测抗体，孵育60分钟。经过孵育，滴定板内形成了抗体-抗原-抗体复合物。洗板去除任何未结合的检测抗体，添加25μl反应底物四甲基联苯胺(TMB)孵育20分钟，含有HRP的孔中溶液变成蓝色。然后通过在每孔中加100μl的硫酸来终止反应，颜色变成黄色，用EnVision 2102酶标仪在450nm处读取吸光度。吸光度的强弱和标本中的半乳糖凝集素-3的含量正相关。

利用该实施例测定的结果绘制的标准曲线如图2所示。发明人还发现，比较正常人和心衰患者的样品中的半乳糖凝集素-3的含量，心衰患者的人半乳糖凝集素-3含量明显升高(图3)，证明该对抗体能够有效用于检测血液中的人半乳糖凝集素-3含量。

序列表

<110> 深圳市倍诺博生物科技有限公司

<120> 半乳糖凝集素-3检测试剂盒

<130> 16C12145CN

<160> 17

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 121

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Met Leu Ile Thr Ile Leu Gly Thr Val Lys Pro Asn Ala Asn Arg Ile

1 5 10 15

Ala Leu Asp Phe Gln Arg Gly Asn Asp Val Ala Phe His Phe Asn Pro

20 25 30

Arg Phe Asn Glu Asn Asn Arg Arg Val Ile Val Cys Asn Thr Lys Leu

35 40 45

Asp Asn Asn Trp Gly Arg Glu Glu Arg Gln Ser Val Phe Pro Phe Glu

50 55 60

Ser Gly Lys Pro Phe Lys Ile Gln Val Leu Val Glu Pro Asp His Phe

65 70 75 80

Lys Val Ala Val Asn Asp Ala His Leu Leu Gln Tyr Asn His Arg Val

85 90 95

Lys Lys Leu Asn Glu Ile Ser Lys Leu Gly Ile Ser Gly Asp Ile Asp

100 105 110

Leu Thr Ser Ala Ser Tyr Thr Met Ile

115 120

<210> 2

<211> 21

<212> PRT

<213> 兔

<400> 2

Thr Cys Lys Ala Ser Phe Phe Thr Leu Ser Tyr Trp Ser Met Trp Trp

1 5 10 15

Arg Arg Gln Ala Pro

20

<210> 3

<211> 19

<212> PRT

<213> 兔

<400> 3

Gly Leu Glu Trp Ile Trp Trp Ile Asp Asn Gly Ser Gly Ser Thr Tyr

1 5 10 15

Tyr Ala Ser

<210> 4

<211> 16

<212> PRT

<213> 兔

<400> 4

Ala Arg His Gly Ser Leu Trp Gly Thr Gly Ile Trp Val Thr Val Ser

1 5 10 15

<210> 5

<211> 19

<212> PRT

<213> 兔

<400> 5

Pro Gly Ala Thr Phe Ala Gln Trp Ser Thr Gln Trp Pro Ser Pro Val

1 5 10 15

Ser Thr Ala

<210> 6

<211> 19

<212> PRT

<213> 兔

<400> 6

Ile Ser Cys Gln Ala Pro Gln Thr Val Tyr Asn Asn Asn Leu Ala Trp

1 5 10 15

Trp Tyr Gln

<210> 7

<211> 21

<212> PRT

<213> 兔

<400> 7

Asp Ala Ala Thr Tyr Trp Cys Leu Thr Thr Gly Tyr Ser Ile Gly Gly

1 5 10 15

Asp Met Tyr Val Phe

20

<210> 8

<211> 22

<212> PRT

<213> 兔

<400> 8

Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asp Thr Ile Asp Trp Tyr Tyr Ser Cys

1 5 10 15

Trp Val Arg Gln Ala Pro

20

<210> 9

<211> 18

<212> PRT

<213> 兔

<400> 9

Ile Ser Cys Ile Tyr Gly Gly Ser Trp Trp Gly Ser Thr Pro Tyr Ala

1 5 10 15

Thr Trp

<210> 10

<211> 25

<212> PRT

<213> 兔

<400> 10

Arg Tyr Thr Ser Gly Asp Gly Thr Ser Tyr Gly Trp Pro Met Ala Phe

1 5 10 15

Thr Pro Trp Met Pro Gly Thr Leu Val

20 25

<210> 11

<211> 21

<212> PRT

<213> 兔

<400> 11

Gly Ala Arg Trp Ala Asp Val Val Met Thr Ser Thr Pro Ser Ala Thr

1 5 10 15

Glu Pro Val Gly Gly

20

<210> 12

<211> 22

<212> PRT

<213> 兔

<400> 12

Ser Glu Ser Ile Ser Ser Arg Leu Leu Ala Trp Tyr Trp Gln Lys Pro

1 5 10 15

Gly Gln Ser Pro Lys Leu

20

<210> 13

<211> 26

<212> PRT

<213> 兔

<400> 13

Leu Glu Cys Ala Asp Ala Ala Thr Pro Tyr Ser Leu Tyr Gly Trp Tyr

1 5 10 15

Gly Ser Ser Tyr Ile Trp Ala Phe Gly Gly

20 25

<210> 14

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

cttaagcttc caccatggag actgggctgc gctg 34

<210> 15

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

tccctcgagc tatttacccg gagagcggg 29

<210> 16

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

cttaagcttc caccatggac acgagggccc ccac 34

<210> 17

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

tccctcgagc taacagtcac ccctattga 29

Claims

1.抗体或其抗原结合部分，所述抗体选自第一抗体、第二抗体或者二者的组合，其中所述第一抗体包含SEQ ID NO:2所示的HCDR1，SEQ ID NO:3所示的HCDR2，SEQ ID NO:4所示的HCDR3，SEQ ID NO:5所示的LCDR1，SEQ ID NO:6所示的LCDR2和SEQ ID NO:7所示的LCDR3，所述第二抗体包含SEQ ID NO:8所示的HCDR1，SEQ ID NO:9所示的HCDR2，SEQ ID NO:10所示的HCDR3，SEQ ID NO:11所示的LCDR1，SEQ ID NO:12所示的LCDR2和SEQ ID NO:13所示的LCDR3；并且所述抗原结合部分是Fab、F(ab)’₂或单链Fv。

2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体为单克隆抗体。

3.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体为兔单克隆抗体。

4.用于检测人受试者的样品中半乳糖凝集素-3的含量的试剂盒，其包含权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，以及使用试剂盒测定半乳糖凝集素-3的含量的说明书，其中所述抗体包括所述第一抗体和所述第二抗体，所述第一抗体或其抗原结合部分用可检测的标记物标记，或者所述第二抗体或其抗原结合部分用可检测的标记物标记。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其中所述可检测的标记物包括酶、化学发光化合物、荧光团、或以上的组合。

6.如权利要求4所述的试剂盒，其中所述可检测的标记物包括显色物质。

7.权利要求5所述的试剂盒，其中所述酶为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。

8.如权利要求4所述的试剂盒，其中所述样品选自血液、血清、血浆、淋巴和以上的组合。

9.如权利要求4所述的试剂盒，其中未用可检测的标记物标记的抗体被预先连接在固体表面上。

10.如权利要求9所述的试剂盒，其中所述固体表面为塑料或玻璃容器。

11.如权利要求9所述的试剂盒，其中所述固体表面为载玻片。

12.如权利要求4-11中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含以下中的一种或多种：标准品，质控品，和缓冲液。

13.如权利要求12所述的试剂盒，其中所述缓冲液为添加了0.1％Tween-20的PBSpH7.2。

14.权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合部分在制备检测样品中人半乳糖凝集素-3的含量的试剂盒中的用途，其中所述抗体包括所述第一抗体和所述第二抗体。

15.如权利要求14所述的用途，其中所述样品选自血液、血清、血浆、淋巴和以上的组合。

16.如权利要求14所述的用途，其中所述第一抗体或其抗原结合部分用于捕获人半乳糖凝集素-3，并且所述第二抗体或其抗原结合部分用可检测的标记物标记；或者所述第二抗体或其抗原结合部分用于捕获人半乳糖凝集素-3，并且所述第一抗体或其抗原结合部分用可检测的标记物标记。

17.如权利要求14所述的用途，其中所述抗体或其抗原结合部分通过免疫学方法来检测人半乳糖凝集素-3的水平。

18.如权利要求17所述的用途，其中所述免疫学方法选自酶联免疫吸附测定、免疫荧光、免疫化学发光、免疫沉淀和以上的组合。