CN111912982B - 半乳凝素-3在肝癌骨转移中诊断、治疗和预后的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术的技术领域，具体涉及半乳凝素‑3在肝癌骨转移中诊断、治疗和预后的应用。所述的半乳凝素‑3作为肝癌骨转移中诊断、治疗和预后靶点的作用，还提供了检测半乳凝素‑3表达量的试剂在制备肝癌骨转移中诊断、治疗和预后试剂的应用。所述半乳凝素‑3通过促进破骨细胞前体的分化和成熟，从而促进肝癌骨转移，可以预测病人发生骨转移的风险，从而达到预防骨转移的作用。相比现有使用的检测试剂盒只能在骨转移发生以后检测，所述半乳凝素‑3能够更特性和更敏感地早期预测肝癌骨转移的发生、诊断肝癌骨转移、预测疾病进展、评估治疗效果、指导药物使用和预后评价的试剂盒，以及作为治疗骨转移的靶标。

Description

半乳凝素-3在肝癌骨转移中诊断、治疗和预后的应用
技术领域
本发明属于生物技术的技术领域，具体涉及半乳凝素-3在肝癌骨转移中诊断、治疗和预后的应用。
背景技术
肝细胞癌（HCC）是世界上最常见的癌症之一，也是死亡的主要原因，导致HCC死亡的主要原因是肝外转移。目前，手术切除或肝移植仍然是HCC患者的主要治疗方法，不幸的是，大多数患者在首次HCC诊断时已经达到晚期癌症阶段，并且只有约20~30%的患者有资格接受外科手术，此外，尽管早期HCC（BCLC A期）的5年生存率很高（50-75％），但由于根治性手术切除或消融后复发率为50-70％，HCC的预后仍然有限。
晚期癌症患者的发病率基本上是由骨转移引起的，大多数患有骨转移的患者会遇到并发症，即所谓的骨骼相关事件，这些事件可概括为高钙血症，严重的骨痛，病理性骨折，脊髓受压以及由于骨不稳定而进行的骨外科手术。因此，通过骨靶向治疗不仅可以减少并发症的发生，而且可以提高整体生存率，因此，早期诊断和明确预测可能发生骨骼并发症的患者对改善这些患者的临床管理非常有意义。
目前，早期发现或监测HCC骨转移主要依赖于影像学，血清甲胎蛋白（AFP）水平和组织活检。尽管如此，成像和病理检查仍然在诊断准确性和敏感性方面存在局限性，而常见的血清标志物显示出较差的诊断性能。
肝癌骨转移的组织形态学显示，根据肿瘤类型这些生物标记物通常根据其对骨形成或吸收的反应而分成骨形成和吸收标记物，他们在血清和/或尿液中的测定为将其用于诊断，评估骨转移患者的预后和治疗提供了机会。
肝细胞癌骨转移类型大部分都是溶骨性骨转移，目前骨吸收标记物主要由I型胶原交联氨基末端肽（NTX）。NTX是破骨细胞溶解骨基质后产生的稳定特异的终产物，能够反映破骨细胞的活性，多项研究肯定了其在实体瘤骨转移诊断和疗效评价中的作用，研究发现，NTX对骨转移的诊断有重要的参考意义，可协助及时诊断恶性肿瘤骨转移，OSTEOMARK®NTx Serum是一种竞争性抑制酶联免疫吸附试验(ELISA/EIA)定量测定人血清中NTX，但此方法需要形成骨转移并且骨溶解增加时，才能检测得到NTX的水平，不能起到预防作用，又NTX水平受多方面因素影响，诊断参考分布范围较大。
因此，找到一种检测早期HCC和监测HCC骨转移的稳健方法至关重要。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提供一种半乳凝素-3在肝癌骨转移中诊断、治疗和预后的应用，所述半乳凝素-3作为早期预测肝癌骨转移的发生、诊断肝癌骨转移、预测疾病进展、评估治疗效果、指导药物使用和预后评价的靶标。
本发明的技术内容如下：
本发明提供了半乳凝素-3在肝癌骨转移中诊断、治疗和预后的应用。
所述的半乳凝素-3作为肝癌骨转移中诊断、治疗和预后靶点的作用。
本发明还提供了检测半乳凝素-3表达量的试剂在制备肝癌骨转移中诊断、治疗和预后试剂的应用。
本发明还提供了一种肝癌骨转移检测试剂盒，所述试剂盒包括能够定量检测半乳凝素-3表达水平的试剂，所述试剂盒包括采用western blot或ELISA试剂盒。
所述半乳凝素-3作为肝癌骨转移中诊断、治疗和预后靶点的应用；所述半乳凝素-3通过促进破骨细胞前体的分化和成熟，从而促进肝癌骨转移，可以预测病人发生骨转移的风险，从而达到预防骨转移的作用。
本发明的有益效果如下：
本发明的半乳凝素-3（Gal-3，以下称LGALS3）能够在特异性骨转移的肝癌细胞系上清中高表达，相比现有使用的检测试剂盒只能在骨转移发生以后检测，所述半乳凝素-3能够更特性和更敏感地早期预测肝癌骨转移的发生、诊断肝癌骨转移、预测疾病进展、评估治疗效果、指导药物使用和预后评价的试剂盒，以及作为治疗骨转移的靶标。
附图说明
图1为半乳凝素-3在特异性骨转移的肝癌细胞系上清中高表达；
图2为半乳凝素-3促进破骨细胞前体的分化和成熟示意图；
图3为半乳凝素-3促进肝癌骨转移示意图；
图4为RAW 264.7细胞的相差显微照片和F-actin的IF染色图像；
图5为对培养在骨片上的RAW 264.7细胞进行骨吸收测定的结果图；
图6为指定实验组小鼠骨转移标准化BLI信号及无骨转移Kaplan-Meier生存曲线；
图7为代表性小鼠骨病变和组织学图像；
图8为LGALS3在不同肝组织的代表性图像；
图9为LGALS3低表达与高表达HCC/BM无骨转移生存曲线的Kaplan-Meier分析；
图10为通过ELISA分析健康者与患者血清的LGALS3表达。
具体实施方式
以下通过具体的实施案例以及附图说明对本发明作进一步详细的描述，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定。
若无特殊说明，本发明的所有原料和试剂均为常规市场的原料、试剂。
实施例1
半乳凝素-3在肝癌骨中诊断或者治疗或者预后的应用：
通过采用肝癌原代细胞HCCLM3-P和高骨转移潜能细胞HCCLM3-BM4的总蛋白进行质谱检测和分析，结果如图1所示，图1中的图a为HCCLM3-BM4细胞与HCCLM3-P细胞表达异常蛋白的火山图分析，可见与HCCLM3-P细胞相比，HCCLM3-BM4细胞中LGALS3表达显著升高，可见LGALS3可应用于肝癌骨转移的诊断；
图b为ELISA分析肝癌细胞中分泌蛋白LGALS3水平，与正常的肝上皮细胞THLE3，和具有低转移潜能的肝癌细胞系Bel-7402和HCCLM3-P细胞相比，具有高转移潜能的肝癌细胞系MHCC97H和HCCLM3-BM4的细胞上清中LGALS3的分泌水平显著升高，可见LGALS3可应用于肝癌骨转移的预测。
下述为采用LGALS3酶联免疫吸附试验试剂盒对肝癌患者血液样品进行LGALS3的水平表达测试：
1）采集肝癌患者的血液样品收集到血清分离管中，凝块形成后，2000 x g离心10分钟，收集血清，将样品稀释至25%，并进行测定，为稀释血清储存于-20℃以下，避免反复的冻融循环；
2）按照LGALS3酶联免疫吸附试验试剂盒的使用说明对血样品进行测试：
血清样品在室温下保存约1.0 h以使其完全解冻；
使用小鼠LGALS3酶联免疫吸附试验试剂盒(ab203369，Abcam，Cambridge，MA)测定小鼠血清上清液中LGALS3的水平；
使用人LGALS3酶联免疫吸附试验试剂盒(ab188394，Abcam，Cambridge，MA.)测定人血清和HCC细胞培养基中的LGALS3水平，并根据试剂盒的使用说明进行分析。
本发明所述半乳凝素-3通过促进破骨细胞前体的分化和成熟，从而促进肝癌骨转移，可以预测病人发生骨转移的风险，从而达到预防骨转移的作用，由下述附图的结果以及分析可见：
图2为采用BAS，或从HCCLM3/Flag-tagged LGALS3细胞的条件培养基（CM）纯化的LGALS3去处理破骨细胞前体RAW 264.7细胞，然后对LGALS3、Flag-LGALS3、CD98和整合素αvβ3进行IF染色，可见用HCCLM3/Flag-tagged LGALS3细胞的条件培养基（CM）纯化的LGALS3处理RAW 264.7细胞后显著促进了其融合，并且与已有研究报道过的与破骨细胞前体融合相关的CD98、整合素αvβ3存在共定位。
图3为将破骨细胞进行分化检测，使用指示CM、BSA或从HCCLM3/Flag-taggedLGALS3细胞的条件培养基（CM）纯化的LGALS3处理破骨细胞前体RAW 264.7细胞，观察形成的TRAP+的多核细胞的数目；结果显示，用纯化的LGALS3处理破骨细胞前体促进了破骨细胞的分化成熟，而敲低和抑制了LGALS3后反而抑制了破骨细胞的分化成熟，提示LGALS3在破骨细胞分化成熟中起着重要作用。
图4中左图为RAW 264.7细胞的相差显微照片（上）和F-actin的IF染色图像（中下），结果显示用纯化的LGALS3处理破骨细胞前体促进了破骨细胞融合和破骨细胞伪足的形成，抑制LGALS3反而抑制了破骨细胞融合和破骨细胞伪足的形成，再次证明了LGALS3具有促进破骨细胞前体分化成熟和融合的作用。
图5中为对培养在骨片上的RAW 264.7细胞进行骨吸收测定的结果图，固定骨片进行扫描电镜(SEM)(左)和定量每个骨片的吸收坑数(右)。结果显示用纯化的LGALS3处理后促进了破骨细胞的骨吸收，抑制LGALS3反而抑制了破骨细胞的骨吸收，提示着LGALS3具有促进破骨细胞骨吸收作用。
图6为指定实验组小鼠骨转移标准化BLI信号及无骨转移Kaplan-Meier生存曲线，n=8/组，结果显示，用高表达LGALS3或者使用富含LGALS3的条件培养基（CM）处理细胞，再通过左心室注射到小鼠体内，显著促进了肿瘤细胞转移到小鼠四肢，而敲低或者抑制了LGALS3则抑制了肿瘤细胞转移到小鼠四肢。这个结果提示着LGALS3促进肝癌的骨转移。
图7中左上图为，代表性小鼠骨病变的BLI、µCT(纵向和小梁切片)和组织学(H&E和TRAP染色)图像，尺寸条，50µm。
右上、右下：对转移灶骨-肿瘤界面的µCT溶骨病灶区和TRAP+破骨细胞进行定量(右上)，左上图为实验骨参数(右下)。这些结果证明了肝细胞癌细胞分泌的LGALS3促进了肝癌的骨转移发生和在体内的发展。然而，在肝细胞癌细胞中沉默LGALS3或者用LGALS3-中和抗体治疗小鼠，显著降低了肝癌细胞的骨骼转移能力和骨溶解破坏作用，表现为延迟骨转移的发生，较小的骨转移瘤负担和较少的骨溶解性病变，表明LGALS3是抑制肝癌骨转移的重要靶点。
图8中左图显示LGALS3在正常肝组织(n=23)、无骨转移的HCC组织(n= 437)、有骨转移的原发性HCC组织(n=38)和骨转移部位的HCC组织(n=6)的代表性图像(左)和定量(右)(左)。尺寸条, 50µm.病人组织在福尔马林中固定再石蜡固定切片，后面进行免疫组化实验。结果显示，与正常肝组织和无骨转移病人组织相比，在有骨转移的病人组织中LGALS3表达水平显著升高。
图9为LGALS3低表达与高表达HCC/BM无骨转移生存曲线的Kaplan-Meier分析(n =38；P = 0.0002，对数秩检验)。结果显示高水平的LGALS3显著促进肝癌的骨转移。
图10为通过ELISA分析健康供者(21例)、无骨转移的HCC供者(35例)、有骨转移的HCC供者(26例)血清的LGALS3表达。与健康供者和无骨转移病人相比，在有骨转移的病人血清中LGALS3表达水平显著升高。
由以上实验以及相关实验数据以及附图所示，本发明所述半乳凝素-3在肝癌骨转移中诊断、治疗和预后的应用。所述的半乳凝素-3作为肝癌骨转移中诊断、治疗和预后靶点的作用。
相比现有使用的检测试剂盒只能在骨转移发生以后检测，所述半乳凝素-3能够更特性和更敏感地早期预测肝癌骨转移的发生、诊断肝癌骨转移、预测疾病进展、评估治疗效果、指导药物使用和预后评价的试剂盒，以及作为治疗骨转移的靶标。

Claims (1)

1.检测血液和组织中半乳凝素-3表达量的试剂在制备肝癌骨转移中诊断、预后试剂的应用。
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