CN102257390B - 半乳凝素-3免疫测定法 - Google Patents

半乳凝素-3免疫测定法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于特异性地和定量地检测样品中的半乳凝素-3的方法和组合物。本发明的实施方案包括一种检测测定法，其中捕获结合部分和标记的结合部分特异性识别半乳凝素-3的N端上的非重叠表位。其他实施方案涉及用于建立标示着受试者的心力衰竭的存在和严重度的半乳凝素-3浓度范围的方法和用于基于半乳凝素-3的浓度预测受试者的临床结果的方法。

Description

半乳凝素-3免疫测定法
参考相关申请
本申请要求2008年10月29日提交的美国临时专利申请No.61/109,366的利益和其优先权，将该专利申请的完整公开内容通过参考引入本文。
发明背景
心力衰竭(HF)是美国的主要公共健康问题。约500万人患有该疾病并且患者的数量正在稳步增加。HF是常见的但很严重且复杂的临床综合征，特别是在老年人之中。HF是指其中心脏不能泵动足够的血液满足身体需要的状况。不足的泵动导致血液和其他流体在肝、腹部、下肢和肺中拥塞(congestion)。因此，HF也被称为充血性心力衰竭(CHF)，虽然术语HF是首选的，因为未非所有患者都展示流体拥塞。HF引起患者的逐步恶化，通常导致心血管死亡。因此，大量患者在诊断后1至5年内死亡。然而，其他人可长期保持稳定。HF是与由心肌梗塞或再灌注损伤引起的心脏缺血极其不同的疾病。
HF的症状包括疲劳、虚弱、心跳加快或心律不齐、呼吸短促、持续咳嗽或喘鸣(wheezing)、下肢或腹部肿胀、因液体潴留导致的突然体重增长、缺乏食欲或恶心以及胸痛。目前，HF的重要诊断测试是综合2维超声心动图(comprehensive 2-dimensionalechocardiogram)与多普勒血流研究，一起确定是否存在结构异常。该测试可测定泵出心室的血液分数(射血分数，EF)，其是心脏功能的重要量度。正常心脏的射血分数是约60％。还可使用一个或多个下列测试：放射性核素心室显像术、磁共振成像(MRI)、完全血细胞计数、尿分析、血清电解质、糖血红蛋白和血脂、肾功能和肝功能的测试、甲状腺功能的测试、胸片和12导联心电图(12-leadelectrocardiogram)。此外，可进行生物标记物例如B-型利钠肽(BNP)的血液测试。BNP响应心肌细胞的拉伸而被上调。因此，高水平BNP标示着心脏处于应激下，并且是心力衰竭的良好指标。然而，在心力衰竭中起作用的其他机制例如炎症可能不反映在BNP的增加上。
处于发生HF风险中的患者的早期鉴定可防止快速进展。因此，优选能够在心力衰竭实际发生之前鉴定其中可能会发生心力衰竭的那些患者。此外，优选能够鉴定患有心力衰竭的那些患者，所述患者处于发生严重并发症或早产儿死亡的风险中。
目前的方法可以可靠地排除HF，但不能可靠地证明HF的存在，它们也不能预测已确定的HF的后果。因此存在对用于预测HF症状发作的可能性和评估疾病的严重度、分期和/或预测已确定的心力衰竭的后果的简单可靠方法的需要。
为了发现反映在心力衰竭中起作用的其他机制的另外的生物化学标志物，进行微阵列研究以确定与保持代偿的高血压大鼠相比较在发展至心力衰竭的高血压大鼠中上调的基因(Schroen等人(2004)Circ.Res.95(5)：515-22.)。在发展至心力衰竭的大鼠中最强劲上调的基因是β-半乳糖苷-结合凝集素即半乳凝素-3。该发现被Sharma等人在研究中证实，所述研究显示高水平的半乳凝素-3预示在高血压的大鼠模型中心力衰竭发展(2004 Circulation 110(19)：3121-8)。该研究还显示外源地应用的半乳凝素-3能够诱发心力衰竭和过量胶原沉积。最近，人血浆和血清中半乳凝素-3的浓度与HF的严重度相关联，参见国际专利公开案No.WO2005/040817和相应的美国专利申请No.10/575,745。
半乳凝素构成特征在于其半乳糖特异性结合的一个蛋白质家族。所有半乳凝素在它们的称为糖类识别结构域或CRD的结构区域中共有共同的氨基酸序列。目前，已鉴定了15种哺乳动物半乳凝素。一个亚组包括半乳凝素1、2、5、7、10、13、14和15，其各自包含单个CRD。第二亚组包含一个种类即半乳凝素-3，其包含连接至N末端结构域的单个CDR，所述N末端结构域包含重复的短氨基酸序列例如PGA。第三个半乳凝素亚组包括半乳凝素4、6、8、9和12，其各自包含通过可变长度的连接体连接的两个CRD。全部半乳凝素具有显著的氨基酸序列同源性，并且许多出现在人循环系统中。
现在已有对于半乳凝素-3的测定法，但没有一个适合于常规临床用途。迄今为止适当的测定已经由于半乳凝素-3作为分析物的复杂性而避用现有技术中的方法。难以明确将半乳凝素-3与样品中的其他半乳凝素相区别，因为半乳凝素-3与其他14种哺乳动物半乳凝素，特别地在保守的糖类识别结构域(CRD)中共有高度的序列相似性。其他半乳凝素没有一种与HF具有已知的关系。已阻碍开发特异性、可重现的检测分析的半乳凝素-3的另一个特征是半乳凝素-3结合不同的蛋白质、糖类、核酸和脂质的倾向性。如果开发了在工业上强有力并且敏感度和特异度足以在体液例如血液样品中重现地定量测量半乳凝素-3的测定法，那么HF的诊断和管理可得到改进。
发明概述
现已确定和开发了用于检测临床样品中的半乳凝素-3的方法。现已发现特异性结合半乳凝素-3的N端上至少两个分隔的非重叠表位的两个结合部分可用于各种特定的夹心测定形式，所述测定形式可提供诊断和预测患HF的受试者的后果所需的重现性、特异度和敏感度。因此，本发明提供了用于检测临床样品中半乳凝素-3的水平的方法和试剂盒。这允许改善疾病管理和提供在其病人分类(triage)和管理中有用的诊断/预后信息。
在一个方面，本发明涉及用于检测样品中半乳凝素-3的浓度的试剂盒。所述试剂盒包括两个结合部分例如单克隆抗体，其中至少一个被可检测的标记物标记。所述两个结合部分各自分别结合半乳凝素-3的N末端部分上的间隔的表位，所述N末端部分包含下列113个氨基酸的序列：
MADNFSLHDA  LSGSGNPNPQ  GWPGAWGNQP  AGAGGYPGAS  YPGAYPGQAP
PGAYPGQAPP  GAYPGAPGAY  PGAPAPGVYP  GPPSGPGAYP  SSGQPSATGA
YPATGPYGAP  AGP(SEQ ID NO：1)。
在一个实施方案中，所述结合部分分别结合由下列半乳凝素-3氨基酸序列之一的至少一部分确定的表位：MADNFSLHDALS(SEQ ID NO：1的氨基酸1至12)、MADNFSLHDALSGS(SEQ ID NO：1的氨基酸1至14)、GNPNPQGWPGA(SEQ ID NO：1的氨基酸15至25)、WGNQPAGAGG(SEQ IDNO：1的氨基酸26至35)、YPGQAPPGAYPGQAPPGA(SEQ ID NO：1的氨基酸45至62)、YPGAPGAYPGAPAPGV(SEQ ID NO：1的氨基酸63至78)、YPGAPAPGVYPGPPSGPGA(SEQ ID NO：1的氨基酸70至88)、YPSSGQPSATGA(SEQ ID NO：1的氨基酸89至100)。虽然这些氨基酸序列描述了线性表位，但也可使用由N端的二级和三结构产生的并且包含来自序列隔开的各段的氨基酸的表位。
在另一个实施方案中，用于检测半乳凝素-3的结合部分是单克隆抗体，例如M3/38、9H 3.2和87B5。M3/38检测半乳凝素-3的N端上的线性表位(YPGQAPPGAYPGQAPPGA(SEQ ID NO：1的氨基酸45至62))。从大鼠杂交瘤M3/38.1.2.8 HL.2(其克隆可见于美国典型培养物保藏中心，编号为TIB-166)的上清液制备M3/38。9H 3.2检测半乳凝素-3的最N端上的线性表位(MADNFSLHDALSGS(SEQ ID NO：1的氨基酸1至14))。9H 3.2是使用A蛋白亲和纯化的小鼠单克隆IgG。9H 3.2可获自Millipore(Millipore，290 Concord Road，Billerica，MA01821，USA)，目录号：MAB4033。87B5检测包含GNPNPQGWPGA(SEQ IDNO：1的氨基酸15至25)和YPGAPAPGVYPGPPSGPGAYPSSGQPSATGA(SEQ IDNO：1的氨基酸70至100)的部分的非线性表位。从小鼠-小鼠杂交瘤(X63-Ag8.653xBALB/c小鼠脾细胞)克隆87B5制备87B5，其是使用A蛋白亲和纯化的IgG2a。87B5可获自Immuno-BiologicalLaboratories(IBL，8201 Central Ave NE，Suite P，Minneapolis，MN 55432 USA)。
在另一个方面中，本发明涉及用于检测受试者的样品中人半乳凝素-3的水平的方法。所述方法包括将样品经历双结合部分夹心测定。在该方法中，用可检测的标记物标记所述结合部分中的至少一个，并且每一个结合部分均特异于半乳凝素-3的N末端部分上的分别的非重叠表位，例如上述表位。在一个实施方案中，所述可检测的标记物是酶或荧光基团。夹心测定可提供定量结果或定性结果，例如，标示着高于阈值的半乳凝素-3浓度的存在或不存在的结果。阈值可以在例如5至10ng/ml、10至15ng/ml、15至20ng/ml、20至25ng/ml、25至30ng/ml、30至35ng/ml或35至40ng/ml的范围内。
所述方法可包括如下额外步骤：将测定中获得的结果与使结果与半乳凝素-3浓度相关联的数据集(例如标准曲线)相比较，以确定样品中半乳凝素-3的浓度，然后使半乳凝素-3的推断浓度与受试者将患有或处于患HF的风险中的风险相关联，或评估受试者的HF的分期或严重度。当然，结果也可与受试者患HF或处于发生HF的风险中的风险直接相关联，或用于评估受试者的HF的分期或严重度。可在一段时间内重复所述方法以获得趋势。可考虑其他参数，例如但不限于受试者的身高、体重、年龄、性别、其他生物标志物的水平等，以测定受试者发生HF的风险或评估受试者的HF的分期或其严重度。
在另一个方面中，本发明涉及用于检测受试者的心力衰竭的发展或进展的风险的方法，包括确定受试者的样品中半乳凝素-3的浓度是否超过15至20ng/ml范围内的阈值。
附图概述
图1是由本发明开发的双单克隆夹心测定类型的卡通图。
图2是可用于解释本发明本质的将信号与半乳凝素-3的浓度相关联的示例性假设标准曲线。
图3是可用于解释本发明本质的将信号与半乳凝素-3的浓度相关的另一个示例性假设标准曲线。
图4是在实施例2E中描述的急性失代偿性心力衰竭研究中具有高于和低于17.6ng/ml阈值的基线半乳凝素-3水平的受试者的示例性存活概率曲线。
图5是在实施例2F中描述的慢性心力衰竭研究I中具有高于和低于17.6ng/ml阈值的基线半乳凝素-3水平的受试者的示例性存活概率曲线。
图6是在实施例2G中描述的慢性心力衰竭研究II中具有高于和低于17.6ng/ml阈值的基线半乳凝素-3水平的受试者的示例性存活概率曲线。
本发明的描述
定义
如本文中所使用的术语“定量化”和“定量”是指测量样品中半乳凝素-3的量或者相对于标准或另一种样品测定半乳凝素-3在样品中的相对量(例如，就其在样品中的浓度、质量、摩尔数或体积而言)的过程。
如本文中所使用的术语″心力衰竭″、″HF″、″充血性心力衰竭”或″CHF″是指损害心室充满或射出血液的能力的复杂临床综合征。任何结构或功能性心脏障碍可引起HF，其中大部分HF患者具有受损的左心室(LV)心肌功能。HF的综合征包括呼吸困难(呼吸短促)、疲劳和液体潴留。美国心脏协会(AHA)已鉴定了HF发展中的4个分期。A和B期的患者显示明确的风险因子但还未发生HF。C和D期的患者当前显示或过去已显示HF的症状。例如，A期患者是具有风险因子例如冠状动脉病、高血压或糖尿病的患者，他们未显示受损的左心室(LV)功能。B期患者是无症状的，但具有心脏结构异常或重塑，例如受损的LV功能、肥大或几何室畸变(geometric chamber distortion)。C期患者具有心脏异常并且是有症状的。D期患者具有难治性HF，其中虽然尽最大的医学治疗(medical treatment)，但他们仍然显示症状。他们通常反复住院或不能在不采取专门措施的情况下离开医院。
半乳凝素-3
半乳凝素-3(GenBank登录号：NC_000014.7(基因)和NP_002297.2(蛋白质))是特征在于它们的半乳糖特异性结合的15种哺乳动物β半乳糖苷-结合凝集素或″半乳凝素″之一。半乳凝素-3在文献中被称为LGALS3、MAC-2抗原、糖结合蛋白(CBP)-35，层粘连蛋白结合蛋白、半乳糖-特异性凝集素3、mL-34，L-29，hL-31，εBP和IgE-结合蛋白。半乳凝素-3由羧基末端糖类识别结构域(CRD)和氨基末端串联重复组成(Liu，F.-T.(2000)Role of Galectin-3 ininflammation.In Lectins and Patho1ogy.M.Caron和D.Seve，eds.Harwood Academic Publishers，Amsterdam，The Netherlands，p.51；Liu，F.-T.等人(1995)Am.J.Pathol.147：1016)。半乳凝素-3通常分布在许多器官的上皮和各种炎症细胞，包括巨噬细胞以及树突细胞(dendritic cell)和枯否细胞(Flotte，TJ.等人(1983)Am.J.Pathol.111：112)中。
半乳凝素-3已显示在许多细胞过程中起作用，包括细胞间粘着、细胞-基质相互作用、吞噬、细胞周期、细胞凋亡、血管生成和mRNA剪接。半乳凝素-3已显示通过细胞内和细胞外作用起作用(Sano，H.等人(2000)The Journal of Immunology，165：2156-2164)。其是核不均一核糖核蛋白(hnRNP)的组分(Laing，J.G.等人(1998)Biochemistry 27：5329)，一种pre-mRNA剪接中的因子(Dagher，S.F.等人(1995)Proc.Natl.Acad.ScL USA 92：1213)，并且已发现其控制细胞周期(Kim，H.-R.C.等人(1999)Cancer Res.59：4148)和通过与Bc1-2家族成员相互作用而阻止T细胞凋亡(Yang，R.-Y.等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：6737)。另一方面，已显示从单核/巨噬细胞(Sato，S.等人(1994)J.Biol.Chem.269：4424)和上皮细胞(Lindstedt，R.G.等人(1993)J.Biol.Chem.268：11750)分泌的半乳凝素-3在活化不同类型的细胞例如单核细胞/巨噬细胞(Liu，F.-T.(1993)Immunol Today 14：486)、肥大细胞、中性粒细胞和淋巴细胞(Hsu，D.K.，S.R.等人(1996).Am.J.Pathol.148：1661)中充当细胞外分子。已显示半乳凝素-3充当单核细胞和巨噬细胞的新型化学引诱物(chemoattractant)(Sano，H.等人(2000)The Journal of Immunology，2000，165：2156-2164)。半乳凝素-3牵涉疾病和状况例如癌症、炎症和心力衰竭。如国际专利公开案No.WO2005/040817中所公开的，半乳凝素-3的定量特别适合用于诊断和检测HF的严重度和预测后果的测定法。
与其他哺乳动物半乳凝素不同，半乳凝素-3包含非典型的N-末端结构域，其包含氨基酸序列：
MADNFSLHDA  LSGSGNPNPQ  GWPGAWGNQP  AGAGGYPGAS  YPGAYPGQAP
PGAYPGQAPP  GAYPGAPGAY  PGAPAPGVYP  GPPSGPGAYP  SSGQPSATGA
YPATGPYGAP  AGP(SEQ ID NO：1)。
如可从检查察知的，半乳凝素-3的N端序列与其他哺乳动物半乳凝素的序列不同，其包含多个重复的类型PGAYPG(X)1-4(SEQ ID NO：2)，(其中间插有富含脯氨酸-、甘氨酸-和酪氨酸-的区域)。N末端结构域中重复序列的存在减少了特异于半乳凝素-3的不同潜在表位的数目，使得检测测试的开发变得复杂。然而，现已发现N末端表位可将半乳凝素-3与其他哺乳动物半乳凝素可靠地相区别。通过使用本文中公开的测定，有可能可靠且可重现地使半乳凝素-3临床结果与受试者中HF的存在、严重度和分期相关联。示例性的N末端表位包括但不限于MADNFSLHDALS(SEQ ID NO：1的氨基酸1至12)、MADNFSLHDALSGS(SEQ ID NO：1的氨基酸1至14)、GNPNPQGWPGA(SEQ ID NO：1的氨基酸15至25)、WGNQPAGAGG(SEQ ID NO：1的氨基酸26至35)、YPGQAPPGAYPGQAPPGA(SEQ ID NO：1的氨基酸45至62)、YPGAPGAYPGAPAPGV(SEQ  ID  NO：1的氨基酸63至78)、PGAPAPGVYPGPPSGPGA(SEQ ID NO：1的氨基酸70至88)、YPSSGQPSATGA(SEQ ID NO：1的氨基酸89至100)，其中字母表示标准氨基酸代码。其他表位出现在N端，其中包含在一级结构上间隔开但在三级结构中位于一起的氨基酸，这些表位也可被本发明的测定中使用的粘合剂(binder)所靶向。
利用夹心测定进行半乳凝素-3的检测
根据本发明的方法，可使用特异性结合半乳凝素-3的N末端部分的一对结合部分来定量体液样品中半乳凝素-3的浓度。″结合部分″是指与多肽或肽特异性或优先结合或相互作用的分子。结合部分的实例包括但不限于例如抗体、半乳凝素结合蛋白(GBP)相互作用融合蛋白、肽适体、avimer、Fab、sFv、Adnectins和配体；核酸，例如DNA和RNA(包括核苷酸适体)和脂质例如膜脂质类。
本发明的方法和组合物可用于检测临床样品例如血清中半乳凝素-3的浓度以进行HF的诊断。根据本发明的方法，用于半乳凝素-3的检测的测试样品可以是任何体液或组织样品，包括但不限于全血、血清、血浆或淋巴以及次优选尿、胃汁、胆汁、唾液、汗液和脊髓液、粪便或肌肉活检组织。在一个优选实施方案中，样品是血液样品。在另一个实施方案中，样品是血浆样品。还可使用血清样品。此外，体液可以是经过处理的(例如血清)或未经处理。从受试者获得体液的方法对于本领域技术人员来说是已知的。
根据本发明的方法，使用“夹心”测定法检测和定量半乳凝素-3。在该实施方案中，使用两个分子(″结合部分″)例如特异性结合半乳凝素-3的N端上的非重叠部位(“表位”)的单克隆抗体。参见图1。通常，一个结合部分被固定在固体表面上，在所述固体表达上其结合并且捕获半乳凝素-3。该第一结合部分因而在本文中称为捕获结合部分。第二结合部分被例如荧光基团、酶或有色颗粒可检测地标记，以便第二结合部分与半乳凝素-3-复合物的结合表示半乳凝素-3已被捕获。信号的强度与样品中半乳凝素-3的浓度成比例。因此第二结合部分在本文中也称为检测结合部分或标记结合部分。结合部分可以是任意类型的分子，只要其特异性结合半乳凝素-3的N端的一部分即可。在一个优选实施方案中，使用的结合部分是单克隆抗-半乳凝素-3抗体，即，针对半乳凝素-3的N末端113个氨基酸的隔开部分产生的或以其它方式选择为结合该部分的单克隆抗体。
此类测定方法可称为双位点免疫测定法、“夹心”法或(当抗体是粘合剂时)“夹心免疫测定”。如本领域内已知的，可将捕获和检测抗体同时或相继地与测试样品接触。序贯法(Sequential method)，有时称为″正向(forward)″法，可通过将捕获抗体与样品一起温育和此后在预定的时间上加入标记的检测抗体来完成。可选地，首先可将标记的检测抗体与样品一起温育，然后可将样品与捕获抗体接触(有时称为“反向”法)。在可以为短暂持续时间的任何必需的温育后，检测标记并且也可测量所述标记。此类测定可以以本领域技术人员已知的许多特定形式来执行，包括通过不同的高通量临床实验室分析仪的使用或利用重点照护检验(point of care)或家用测试设备来执行。
在一个实施方案中，侧向流装置(lateral flow device)可用于夹心形式，其中生物样品中高于基线敏感度水平的半乳凝素-3的存在在侧向流测定中将允许在捕获区的上游或捕获区上形成夹层相互作用。参见，例如，美国专利No.6,485,982。本文中使用的捕获区可包含捕获结合部分例如适合于捕获半乳凝素-3的抗体分子，或用于生物素化复合物的捕获的被固定的抗生物素蛋白等。参见，例如，美国专利No.6,319,676。该设备还可掺入适合于在捕获区捕获的发光标记物，半乳凝素3的浓度与捕获部位上的信号强度成比例。适当的标记物包括固定在聚苯乙烯微球体上的荧光标记。也可使用有色颗粒。
可用于本发明的方法的其他测定形式包括但不限于流过装置(flow-through device)。参见，例如，美国专利No.4,632,901。在流过测定(flow-through assay)中，将一种结合部分(例如，抗体)固定在膜表面上的确定区域。然后将该膜覆盖在用作蓄水池的吸收层上以将样品体积(sample volume)抽吸通过装置。在固定后，封闭膜上剩下的蛋白质结合部位以使非特异性相互作用减少至最少。在操作中，将生物样品加至膜并且滤过，从而允许样品中特异于抗体的任意分析物与固定的抗体结合。在第二步骤中，可加入或释放与捕获标志物反应以完成夹心的被标记的第二抗体。可选地，可将第二抗体与样品混合并且在单一步骤中加入。如果半乳凝素-3存在，那么在膜的表面上形成有色斑点。
最常用的酶免疫测定是“酶联免疫吸附测定(ELISA)”。ELISA是使用抗体的标记(例如，酶连接的)形式检测和测量抗原的浓度的技术。存在本领域技术人员公知的不同ELISA形式。本领域内已知的用于ELISA的标准技术描述于″Methods in Immunodiagnosis″，第2版，Rose and Bigazzi，eds.John Wiley & Sons，1980；Campbell等人，″Methods and Immunology″，W.A.Benjamin，Inc.，1964；和Oellerich，M.(1984)，J.Clin.Chem.Clin.Biochem.22：895-904中。
在″夹心ELISA″中，将抗体(例如，抗半乳凝素-3)连接至固相(即，微量滴定板)并且与含有抗原(例如，半乳凝素-3)的生物样品接触。然后洗涤固相以除去未结合的抗原。然后将标记的抗体(例如，酶连接的)与结合抗原结合，从而形成抗体-抗原-抗体夹心。可被连接至抗体的酶的实例是碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、荧光素酶、尿素酶和β-半乳糖苷酶。酶联抗体与底物反应以产生可被测量的显色反应产物。该测量可用于例如通过将测量值与半乳凝素-3标准曲线相比较来推导存在于样品中的半乳凝素-3的浓度。受试者的样品中半乳凝素-3的浓度经测定可在阈值之下或之下。阈值可在例如5至10ng/ml、10至15ng/ml、15至20ng/ml、20至25ng/ml、25至30ng/ml、30至35ng/ml或35至40ng/ml的范围内。
适合用于本发明的试剂盒和方法的本文中描述的任何免疫测定还可使用任意结合部分来替代抗体。
结合部分
在本发明的一个优选实施方案中，抗体半乳凝素-3抗体，优选单克隆抗体，用作结合部分。
单克隆抗体
在本发明的一些优选实施方案中，使用单克隆抗体。单克隆抗体是指源自单个克隆，包括任意真核、原核或噬菌体克隆的抗体。单克隆抗体可包括两种蛋白质即重链和轻链或由其组成。可使用种类广泛的本领域内已知的技术(包括杂交瘤、重组和噬体展示技术或其组合)之一制备单克隆抗体。
抗半乳凝素-3单克隆抗体可使用任意已知的技术，包括杂交瘤法(seminal hybridoma method)例如由Kohler和Milstein(1975)，Nature.256：495描述的此类方法来制备。在杂交瘤法中，用免疫剂免疫小鼠、仓鼠或其他适当的宿主动物以引发产生或能够产生特异性结合所述免疫剂的抗体的淋巴细胞。可选地，可体外免疫所述淋巴细胞。
免疫剂通常包括半乳凝素-3多肽或其融合蛋白的至少一部分。例如，包含任意半乳凝素-3N末端表位的合成多肽或重组多肽可用作免疫剂。示例性N末端表位包括但不限于MADNFSLHDALS(SEQ ID NO：1的氨基酸1至12)、MADNFSLHDALSGS(SEQ ID NO：1的氨基酸1至14)，GNPNPQGWPGA(SEQ ID NO：1的氨基酸15至25)、WGNQPAGAGG(SEQ IDNO：1的氨基酸26至35)、YPGQAPPGAYPGQAPPGA(SEQ ID NO：1的氨基酸45至62)、YPGAPGAYPGAPAPGV(SEQ ID NO：1的氨基酸63至78)、YPGAPAPGVYPGPPSGPGA(SEQ ID NO：1的氨基酸70至88)、YPS SGQPSATGA(SEQ ID NO：1的氨基酸89至100)。可通过将多肽融合至载体蛋白例如匙孔嘁血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH，EMDBiosciences，San Diego，Calif.)、BSA(EMD Biosciences，San Diego，Calif.)或卵白蛋白(Pierce，Rockford，111.)来产生融合蛋白。可按照多种标准方法中的任意方法在使用或不使用佐剂的情况下给哺乳动物施用免疫剂。免疫剂可以只施用一次，但优选按照标准增强时间表施用超过1次。
通常，如果期望人来源的细胞，则使用外周血淋巴细胞(″PBLs″)，或如果期望非人哺乳动物来源，则使用脾细胞或淋巴结细胞。然后使用适当的融合剂例如聚乙二醇将淋巴细胞与永生化细胞系融合，形成杂交瘤细胞群体，并对其筛选对半乳凝素-3的N末端部分上的表位有适当特异性和亲和力的种类(Goding，(1986)Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，Academic Press，pp.59-103)。永生化细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿类动物、牛和人来源的骨髓瘤细胞。通常，使用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。可在优选包含一种或多种抑制未融合的永生化细胞生长和存活的物质的适当培养基中培养杂交瘤细胞。例如，如果亲本细胞缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，那么用于杂交瘤的培养基通常包含次黄嘌呤、氨基蝶呤(aminopterin)和胸苷(″HAT培养基″)，这些物质阻止HGPRT-缺陷型细胞的生长。
优选的永生化细胞系是高效地融合、支持所选择的抗体产生性细胞稳定地高水平表达抗体和对培养基例如HAT培养基敏感的永生化细胞系。更优选的永生化细胞系是鼠骨髓瘤细胞系，其可以例如从SalkInstitute Cell Distribution Center，San Diego，California和美国典型培养物保藏中心，Manassas，Virginia获得。也已描述了人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞用于人单克隆抗体的产生(Kozbor，J.(1984)Immunol.，133：3001；Brodeur等人，Monoclonal Ant ibodyProduction Techniques and Applications，Marcel Dekker，Inc.，New York，(1987)pp.51-63)。
然后例如通过利用标记的半乳凝素-3N末端多肽进行筛选，就抗半乳凝素-3的N端的单克隆抗体的存在测定培养杂交瘤细胞的培养基。优选地，通过免疫沉淀或通过体外结合测定例如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)来测定由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。此类技术和测定在本领域内是已知的。单克隆抗体的结合特异性可以例如利用Munson和Pollard(1980)，Anal.Biochem.，107：220的Scatchard分析来测定。测定结合特异性的各种分析方案可以以试剂盒或作为服务的形式商购获得。
单克隆抗体还可通过重组DNA法，例如美国专利No.4,816,567中描述的重组DNA法来产生。可使用常规方法(例如，通过使用能够特异性结合编码鼠抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)分离编码适当的单克隆抗体的DNA和测定其序列。杂交瘤细胞用作此类DNA的优选来源。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将该载体转染入不产生免疫球蛋白的宿主细胞例如猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。还可以例如通过用人重链和轻链恒定区结构域的编码序列取代同源鼠序列(美国专利No.4,816,567；Morrison等人，(1984)Proc.Natl.Acad.ScL USA，81：6851)或通过将完整或部分的非免疫球蛋白多肽的编码序列共价连接至免疫球蛋白编码序列来修饰DNA。可用这样的非免疫球蛋白多肽替代本发明的抗体的恒定结构域，或可用其替代本发明抗体的一个抗原结合部位的可变结构域，以产生嵌合的二价抗体。
抗体可以是单价抗体。用于制备单价抗体的方法在本领域内是公知的。例如，一个方法包括重组表达免疫球蛋白轻链和经修饰的重链。通常在Fc区中的任意点上截断重链以防止重链交联。可选地，用另一种氨基酸残基置换相关半胱氨酸残基或缺失相关半胱氨酸残基以防止交联。
体外方法也适合用于制备单价抗体。可使用本领域内已知的常规技术消化抗体以产生其片段，特别是Fab片段。
还可使用噬菌体展示文库产生抗体(Hoogenboom和Winter(1991)，J.MoI.Biol.227：381；Marks等人(1991)，J.MoI.Biol，222：581)。Cole等人和Boerner等人的技术也可获得用于制备单克隆抗体(Cole等人(1985)，Monoclonal Antibodies and CancerTherapy，Alan R.Liss，p.77and Boerner等人(1991)，J.Immunol.，147(1)：86-95)。类似地，可通过将免疫球蛋白基因座引入其中已使内源免疫球蛋白基因部分或完全失活的转基因动物例如小鼠中来产生抗体。
还可使用上述已知的选择和/或诱变方法使抗体亲和力成熟。优选亲和力成熟的抗体具有比从其制备成熟抗体的起始抗体大4倍，更优选大9倍，更优选大19或29倍的亲和力。在一个特别优选实施方案中，用于检测半乳凝素-3的抗体是单克隆抗体，例如M3/38、9H3.2和87B5。M3/38检测半乳凝素-3的N端上的线性表位(YPGQAPPGAYPGQAPPGA(SEQ ID NO：1的氨基酸45至62))。M3/38从大鼠杂交瘤M3/38.1.2.8HL.2(其克隆可见于美国典型培养物保藏中心，号为TIB-166)的上清液制备而来。9H3.2检测半乳凝素-3的最N端上的线性表位(MADNFSLHDALSGS(SEQ ID NO：1的氨基酸1至14)。9H 3.2是使用A蛋白亲和纯化的小鼠单克隆IgG。9H3.2可从Millipore(Millipore，290 Concord Road，Billerica，MA 01821，USA)，目录号：MAB4033获得。87B5检测包含部分GNPNPQGWPGA(SEQ IDNO：1的氨基酸15至25)和YPGAPAPGVYPGPPSGPGAYPSSGQPSATGA(SEQID NO：1的氨基酸70至100)的非线性表位。从小鼠-小鼠杂交瘤(X63-Ag8.653xBALB/c小鼠脾细胞)克隆87B5制备87B5，其是使用A蛋白亲和纯化的IgG2a。87B5可从Immuno-Biological Laboratories(IBL，8201 Central Ave NE，Suite P，Minneapolis，MN 55432 USA)获得。
在一个目前优选的实施方案中，捕获结合部分是抗半乳凝素-3单克隆抗体M3/38，标记的检测结合部分是第二抗半乳凝素-3单克隆抗体87B5。此类抗体的给予的名称不是限制性的。在另一个实施方案中，捕获抗体是9H3.2并且标记的检测结合部分是M3/38。也可使用识别上述表位的其他抗体。
可将其他结合部分用于本发明的方法和试剂盒。结合部分的实例包括但不限于蛋白质、肽适体、avimer、Adnectin和配体；核酸，例如DNA和RNA(包括核苷酸适体)和脂质例如膜脂质类。
适体
核苷酸适体是以高亲和力结合选择的靶的小肽或小核苷酸序列。核苷酸适体是通过称为指数富集的配体系统进化技术(SystematicEvolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX，也称为体外选择或体外进化)的选择方法产生的。在该方法中，将靶分子与大型随机产生的寡核苷酸文库接触。通过许多方法，通常是亲和层析将未结合的寡核苷酸分离出混合物。洗脱保持结合的寡核苷酸，并且进行扩增。然后将靶分子与新合成的寡核苷酸接触，重复选择方法数轮，不断增加严格条件以分离掉未结合的序列。然后测定所得的寡核苷酸的序列以确定其身份。参见美国专利申请No.07/536,428；美国专利No.5,475,096和美国专利No.5,270,163。
肽适体通常由短的可变肽结构域组成。肽适体包含在两个末端连接至蛋白质支架的可变肽环。该双结构限制(doublest ructuralconstraint)将肽适体的结合亲和力极大地增加至可与抗体的水平(纳摩尔范围)相当的水平。可变环的长度通常为10至20个氨基酸，并且支架可以是任意蛋白质，所述蛋白质是可溶且紧凑的，例如细菌蛋白质硫氧还蛋白A。可将可变环插入硫氧还蛋白A的还原活性部位，其在野生型蛋白质中为-Cys-Gly-Pro-Cys-环，其中两个半胱氨酸侧链能够形成二硫键。肽适体选择可使用不同系统例如酵母双杂交系统来进行。关于肽适体的进一步论述，参见国际专利公开No.WO2007/117657。
Avimers
Avimer(亲合力多聚体)是包含多个对靶有低亲和力的区域的短肽序列。多个独特低亲和力区域的存在一起产生高亲和力结合部分。小尺寸和高二硫化物密度促成了avimer的低免疫原性。为了鉴定对于目的蛋白质具有高结合亲和力的avimer，通过合成重组产生高度多样性的单体库。可使用噬菌体展示或另一种优选筛选方法针对靶蛋白筛选该单体库。一旦发现候选物，就加入另一个单体并且针对靶筛选二聚体的新文库。在重复后，分离对于其靶具有非常高的结合亲和力的三聚体(参见Silverman等人(2005)，Nature Biotechnology 23，1556-1561)。
Adnectins
Adnectin由人纤连蛋白的某个结构域的天然氨基酸序列主链和1至3个包含随机化序列的靶向环组成。基于特异性识别目的治疗靶的能力筛选和分离Adnectin(参见，例如，美国专利No.6,818,418)。
配体
配体是由″支架″结构域和可变结构域组成的小肽。″支架″结构域包含非半胱氨酸的三螺旋束结构域(基于葡萄球菌蛋白质A的结构)。可变结构域包含可针对目的靶进行筛选的随机产生的序列。构建配体的文库，可筛选文库以发现对目的蛋白质具有高亲和力的候选物。参见Nygren，P.-A.(2008)FEBS Journal 275，2668-2676.
天然存在的结合伴侣
可分离或重组产生结合半乳凝素-3N端的天然存在的半乳凝素-3结合伴侣并且将其用作结合部分。取决于测定法的具体限制，可将半乳凝素-3结合伴侣或其片段用作捕获或检测结合部分。半乳凝素-3结合伴侣的实例包括但不限于分枝菌酸和脂多糖类(Barboni等人(2005)FEBS Letters 579：6749-6755)。此外，循环半乳凝素-3触发自身免疫反应，导致在正常和病理状况下在血清中产生抗半乳凝素-3的自身抗体(Jensen-Jarolim等人(2001)J Clin Immunol.21(5)：348-56；Lim等人，(2002)Biochem Biophys Res Commun.295(1)：119-24；Mathews  等人(1995)J Clin Immunol.15(6)：329-37)。此类自身抗体似乎靶向半乳凝素-3的N末端结构域上的表位(Mathews等人，supra)。
捕获
捕获结合部分的重要性质是其提供了与测试混合物的其余部分分离的方法。因此，如本领域中所知道的，可将捕获结合部分以已固定的或不溶性形式(即，使得能够将复合物与测试溶液的其余部分分离的形式)引入测定。可选地，可通过在将捕获结合部分的可溶性形式引入样品后捕获包含半乳凝素-3的免疫复合物来进行固定。被固定的捕获结合部分的实例是与固相例如磁性颗粒、胶乳粒子、微孔滴定板孔、膜、芯片、珠粒、小槽(cuvette)、阵列或其他反应器或支持物(holder)共价或非共价连接的结合部分。可溶性捕获结合部分的实例是已用配体例如半抗原、生物素等化学修饰的和用作允许选择性捕获包含半乳凝素-3的复合物的钩子(hook)的结合部分。将捕获结合部分偶联至固相的方法在本领域内是公知的。此类方法可以例如利用例如双功能连接剂，或用在接触时结合该分子的反应基团例如环氧化物或咪唑来衍生固相。可在相同的位置中混合抗不同靶蛋白的生物特异性捕获试剂，或可将它们在不同的物理或可寻址的位置连接至固相。
标记物
根据本发明的方法，使用的标记物可选自本领域内通常已知的任意标记物。优选标记物是允许更精确定量的标记物。标记物的实例包括但不限于荧光部分、酶、电化学活性种类、放射性同位素、化学发光分子、胶乳粒子或金颗粒、可检测的配体(例如，可通过配体的标记结合伴侣的二次结合检测的)等。在一个优选实施方案中，标记物是酶或荧光分子。用于将标记物附着至结合部分的方法在本领域内是公知的，并且包括共价和非共价连接。
在一个实施方案中，可用荧光化合物标记结合部分。当将荧光标记的结合部分暴露于适当波长的光时，则可通过发射的荧光检测其存在。其中最常用的荧光标记化合物是Cy3和Cy5(花青染料家族的水溶性荧光染料-″Cy″染料)、异硫氰酸荧光素、罗丹明、phycoerytherin、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛和荧光胺。
在另一个实施方案中，通过将结合部分连接至酶来可检测地标记检测结合部分。从而所述酶在与其底物接触时将以产生可以例如通过分光光度计测量法、荧光测定法或目测法检测的化学部分的方式与底物反应。可用于可检测地标记本发明的结合部分的酶包括但不限于苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-V-类固醇异构酶、酵母乙醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、尿素酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。
还可使用放射性标记的结合部分来实现检测。然后可能通过使用放射免疫测定法检测结合部分。可利用此类方法如γ计数器或闪烁计数器的使用或利用放射自显影术来检测放射性同位素。对于本发明的目的特别有用的同位素是3H、131I、35S、14C，和优选地125I。
还可通过将结合部分偶联至化学发光部分来可检测地标记结合部分。然后通过检测化学反应过程中产生的发光的存在来测定化学发光结合部分的存在。特别有用的化学发光标记化合物的实例是鲁米诺，萤光素、异氨基苯二酰肼、theromatic acridinium ester、咪唑、吖啶盐(acridinium salt)和草酸酯。
半乳凝素-3的可选择形式
半乳凝素-3可能以特征在于可检测地不同质量的多种不同形式存在于样品中。这些形式可因翻译前修饰、翻译后修饰或两者而产生。翻译前修饰形式包括等位基因变体、剪接变体和RNA编辑形式。翻译后修饰形式包括因蛋白酶切(例如，亲本蛋白质的片段)、复合体生成(complexation)、糖基化、磷酸化、脂质化、氧化、甲基化、半胱氨酰化(cystinylation)、磺化(sulphonation)和乙酰化等而产生的形式。半乳凝素-3的修饰形式只要保持相关N末端表位就可根据本发明的方法来检测。
诊断和预后用途
本发明的半乳凝素-3测定可用于鉴定处于发生HF的风险中的受试者或鉴定患有HF的受试者。在该方法中，可监控患者或具有鉴定的发生HF风险的其他受试者的半乳凝素-3水平的变化(使用本发明的免疫测定在一段时间内从体液定量的)。在某些实施方案中，鉴定有发生HF风险的受试者可以在一段时间内，例如每月1次、每季1次、每年2次、每年1次、每2年1次或每5年1次监控他或她的半乳凝素-3水平。
在另一个实施方案中，半乳凝素-3可用作诊断标志物来测定受试者的HF的存在、分期或严重度，或者通过测量样品中半乳凝素-3的浓度并且将该结果与使半乳凝素-3浓度与人受试者的HF疾病的严重度或分期相联系的数据相比较来预测他或她的预后。可将本文中描述的诊断和/或预测预后的方法与本领域内常用的用于诊断和/或预测预后的其他方法(例如使用多普勒分析的超声心电图、放射性核素心室显像术、磁共振成像(MRI)、完全血细胞计数、尿分析、血清电解质、糖血红蛋白和血脂、肾功能和肝功能的测试、甲状腺功能的测试、胸片、12-联导心电图、生物标志物例如BNP的血液测试等)组合。
其他用途
本发明的方法和试剂盒也适合用于检测特征在于半乳凝素-3的浓度增加或减少的其他状况。该半乳凝素-3的表达在炎症(Flotte等人(1983)Am.J.Pathol.111：112.)、细胞增殖(Agrwal，等人(1999)J.Biol.Chem.264：17236)和细胞分化(Nangia-Makker等人(1993).Cancer Res.53：1)过程中通过病毒蛋白的反式激活而上调(Hsu，D.等人(1996)Am.J.Pathol.148：1661)。其表达也受致瘤性转化影响。例如，在淋巴瘤(Hsu，D.等人(1996)Am.J.Pathol.148：1661)和甲状腺癌(Fernadez，P.L.等人(1997)J.Pathol.181：80)的某些类型中发现半乳凝素-3上调，然而在其他恶性肿瘤类型例如结肠癌(Lotz，M.M.等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：3466)、乳腺癌(Castronovo，V.，F.A.等人(1996)J.Pathol.179：43.)、卵巢癌(Van den Brule，F.A.等人(1994)Eur.J.Cancer 30A：1096)和子宫癌(Van den Brule，F.A.等人(1996)Hum.Pathol.27：1185)中半乳凝素-3下调。半乳凝素-3的表达与原发性脑肿瘤的分级和恶性潜能具有强相关性(Bresalier，R.等人(1997).Cancer 80：776)。
半乳凝素-3在许多其他疾病、状况和障碍(包括自身免疫障碍以及糖尿病和高血压的血管并发症)中起作用。已在受炎性疾病影响的组织中检测到半乳凝素-3。例如，在具有炎性眼疾病的患者的眼泪中检测到半乳凝素-3(Hrdlickova-CeIa等人(2001)，Br J Ophthalmol，85：1336-40)。也已在人粥样硬化病变中注意到增加的半乳凝素-3水平(Ohshima等人(2003)，Arthritis Rheum，48：2788-95；Nachtigal等人(1998)，Am J Pathol，152：1199-208)。
试剂盒
本发明还提供了用于定量可用于检测增加的HF风险、诊断HF的存在、测定HF的严重度或预测患HF的受试者预后的半乳凝素-3的试剂盒。所述试剂盒可包括一个或多个用于定量体液中半乳凝素-3的水平的结合部分。例如，试剂盒可包括特异性识别半乳凝素-3的N端上的表位的捕获和检测结合部分。所述捕获和检测结合部分可包括对于半乳凝素-3是免疫特异性的抗体。在一个实施方案中，试剂盒包括两种抗半乳凝素-3单克隆抗体，例如M3/38、9H3.2或87B5。可将试剂盒中提供的捕获结合部分预先连接至固体表面，例如但不限于塑料或玻璃容器或载玻片。试剂盒还可包括用于将样品与结合部分混合的容器。此类容器可适合用于能够检测由检测结合部分产生的信号的检测仪器。试剂盒还可包括一种或多种用于测量标示相同疾病的第二标志物水平的试剂(例如，不同的抗体)。
本发明的试剂盒可额外地包括如下的一个或多个：(1)使用试剂盒测定半乳凝素-3的水平的说明书；(2)针对存在于试剂盒中的任意抗体的被标记的结合伴侣；(3)在其上固定任意此种抗体的固相(例如，试剂条(reagent strip))；和(4)标明诊断、预后或治疗用途或其任意组合的监管机构批准的标签或插入物。如果未提供针对抗体的被标记的结合伴侣，那么可用可检测的标记物例如化学发光部分、酶促部分、荧光部分或放射性部分标记抗体本身。
实施例
可通过下列实施例进一步举例说明本发明。这些实施例仅用于举例说明目的，并且不被解释为以任何方式限定本发明的范围或内容。
实施例1：用于人半乳凝素-3的定量检测的酶联免疫吸附测定
人半乳凝素-3 ELISA是用于定量检测EDTA血浆中的人半乳凝素-3的酶联免疫吸附测定。存在于样品或标准品中的人半乳凝素-3结合到被吸附至微孔(microwell)的抗体。在温育后，在洗涤步骤中除去未结合的材料。加入缀合至抗人半乳凝素-3抗体的HRP，其与被包衣抗体(coating antibody)捕获的半乳凝素-3结合。在温育后，在洗涤步骤中除去未结合的HRP-缀合物，将与HRP有反应性的底物溶液加至孔中。与存在于样品或标准品中的人半乳凝素-3的量成比例地形成有色产物。通过加入酸终止反应，在450nm测量吸光度。根据7个人半乳凝素-3标准品稀释度来制备标准曲线，测定人半乳凝素-3样品浓度。在凝固和分离血液样品后尽可能快地将血浆从血凝块或细胞中移出。在用于测定之前澄清含有可见沉淀的样品。不使用显著溶血的或脂血症样本。将样品等分并且于-20℃下冷冻贮存以避免生物活性人半乳凝素-3的损失。在测定前，将冷冻样品缓慢地恢复至室温并且温和地混合。
制备下列试剂用于测定。通过将50ml的洗涤缓冲液浓缩剂(20x，具有1％Tween 20的PBS)混合入干净的1000ml刻度量筒来制备洗涤缓冲液(1x)。用去离子水使终体积达到1000ml，将溶液温和地混合。将终溶液的pH调整至7.4。将洗涤缓冲液(1x)转移至干净的洗瓶。
通过将5ml测定缓冲液浓缩剂(20x，具有1％ Tween 20和10％ BSA的PBS)加入干净的100ml刻度量筒来制备测定缓冲剂。用去离子水使终体积达到100ml，温和地混合溶液。
在干净的塑料管中将浓缩的HRP-缀合物溶液以1∶100的比例稀释在测定缓冲液(1x)中。通过加入蒸馏水使人半乳凝素-3标准品稀释至60ng/ml，温和地涡旋混合物以确保完全且均一的溶解。使重建的标准品放置10分钟，然后进行稀释。
为了制备外部标准品稀释液，标记7个管(S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7)，每一个标准点一个管。如下以1∶2的比例制备系列稀释物：将225μl样品稀释剂用移液管转移至每一个管中。将225μl重建的标准品(浓度＝60ng/ml)用移液管转移至第一管中，标记为S1，然后混合(标准品1的浓度＝30ng/ml)。将225μl该稀释物用移液器转移至第二管中，标记为S2，充分混合后进行下一次转移。重复该系列稀释5次以上以产生标准曲线的点。样品稀释剂用作空白。
在蒸馏水中重建冻干的人半乳凝素-3至下列体积：高对照(180μl，56-84ng/ml)、中对照(200μl，32-48ng/ml)和低对照(130μl，3.4-5.8ng/ml)。涡旋小瓶以确保内容物的定量溶解。使重建的对照放置10分钟。
应当以一式二份测定每一个样品、标准品、空白和任选对照样品。用每孔约400μl洗涤缓冲液洗涤微孔板条(Microwell strip)2次，在各洗涤之间充分抽吸微孔内容物。使洗涤缓冲液在抽吸前在孔中静置约10至15秒。
在最后的洗涤步骤后，倒空小孔，将微孔板条在吸水纸上轻敲以除去多余的洗涤缓冲液。勿使微孔板条干燥。
将100μl标准品(S1-S7)用移液器转移至根据表1的标准孔中。
表1
描述微孔板条中空白、标准品和样品的排列的实例的表：
将100μl样品稀释剂以一式两份加入空白孔中。将80μl样品稀释剂加入样品孔中。将20μl的每一种样品以一式两份加入样品孔中。用粘性膜覆盖孔，将其在设置在200rpm的微量培养板振荡器上在室温(18至25℃)下温育1小时。除去粘性膜，倒空孔。如上洗涤微孔板条3次。
接着，将100μl稀释的HRP-缀合物加入至全部孔，包括空白孔。用粘性膜覆盖孔，将其在设置在200rpm的微量培养板振荡器上在室温(18至25℃)下温育1小时。除去粘性膜，倒空孔。如上洗涤微孔板条3次。
然后，向各孔中加入100μl TMB底物溶液(四甲基联苯胺)。将微孔板条在室温(18℃至25℃)下温育30分钟，并且避免直接暴露于强光。
通过快速地用移液器将100μl终止溶液(1M磷酸)移至各孔来终止酶反应。在分光光度计上使用450nm作为主波长(primary wavelength)(任选地620nm作为参照波长；610nm至650nm是可接受的)读取各微孔的吸光度。按照制造商的说明书，通过使用空白孔使板读数产生空白。测定样品和标准品的吸光度。计算每一组一式二份标准品和样品的平均吸光度值。
通过将纵坐标上每一个标准品浓度的平均吸光度对横坐标上人半乳凝素-3浓度作图来产生标准曲线。绘制通过图上各点的最佳拟合曲线。参见图2。
对于每一个样品，可通过在纵坐标上找到平均吸光度值，并且使水平线延长至标准曲线来测定循环人半乳凝素-3的浓度。在交点上，使垂线延长至横坐标，读取相应的人半乳凝素-3浓度。
因为以1∶5(20μl样品+80μl样品稀释剂)稀释样品，所以将从标准曲线读取的浓度乘以稀释因子(x5)。代表性标准曲线示于图2中。
表2
使用人半乳凝素-3ELISA的典型数据
测量波长：450nm
参照波长：620nm
性能特征
灵敏度
定义为导致吸光度显著高于稀释介质的吸光度的分析物浓度的人半乳凝素-3检测限(limit of detection，LoD)(平均值+3个标准差)经测定为0.09ng/ml(12个独立测定的平均值)。
重现性
在4个独立的实验中估计批内测定重现性(Intra-assayreproducibility)(测定内的重现性)。使用6个重复的含有不同浓度人半乳凝素-3的8个血浆样品进行每一个测定。在每一个板上产生两个标准曲线。下面的数据显示每一个样品的平均人半乳凝素-3浓度和变异系数(参见表3)。计算的总体批内测定变异系数(intra-assaycoefficient of variation)为4.2％。
表3
每一个样品的平均人半乳凝素-3浓度和变异系数
在4个独立的实验中估计批间测定重现性(Inter-assayreproducibility)(一个实验室内的测定之间的重现性)。使用6个重复的含有不同浓度人半乳凝素-3的8个血浆样品进行每一个测定。对每一个板产生两个标准曲线。下面的数据显示基于每一个样品的24个测定值计算的平均人半乳凝素-3浓度和变异系数。计算的总体批间变异系数(inter-assay coefficient of variation)为4.0％。
表4
每一个样品的平均人半乳凝素-3浓度和变异系数
加标回收率(Spike Recovery)
通过将3个水平的人半乳凝素-3掺入3个个体血浆样品中来估计加标回收率。在4个独立的实验(每一个实验2个重复)测定回收率。未掺杂的血浆样品在这些实验中用作空白。总平均回收率为101％(参见表5)。
表5
稀释液平行度(Dilution Parallelism)
在2倍系列稀释液上分析具有不同水平的人半乳凝素-3的4个血清样品。在4个独立实验(每一个实验4个重复)中测定回收率。总平均回收率为88.6％(参见表6)。
表6
样品稳定性
冻融稳定性
将血浆样品的等分于-20℃下贮存和解冻3次，测定人半乳凝素-3水平。通过冻融作用检测的人半乳凝素-3免疫反应性没有显著的损失。
贮存稳定性
将血浆样品的等分于-20℃、2-8℃、室温(RT)和在37℃下贮存，在24小时后测定人半乳凝素-3水平。在上述条件下贮存期间检测的人半乳凝素-3免疫反应性无显著损失。
实施例2A：用于检测半乳凝素-3的试剂盒
表7显示用于检测半乳凝素-3的示例性试剂盒的成分。
表7：半乳凝素-3测定试剂
*包含防腐剂。
#包含当通过FDA批准的方法测试时将测得对于抗HIV-1/2、抗HCV和HBsAg是阴性的或非反应性的经处理的人血浆。
将一种抗半乳凝素-3抗体M3/38包被至微量滴定板的孔表面，并且用作结合样品中的半乳凝素-3分子的捕获抗体，同时在溶液中提供另一种抗半乳凝素-3抗体即辣根过氧化物酶(HRP)-标记的抗半乳凝素-3抗体(87B5)，其用作检测结合至捕获抗体的半乳凝素-3分子的检测抗体。虽然将M3/38和87B5用于本实施例中，但对于本发明的试剂盒和方法而言这些特定抗体的使用不是必需的。
半乳凝素-3对照(C1和C2)由掺有重组人半乳凝素-3的蛋白质基质组成。
实施例2B：重组半乳凝素-3对照的检测
实施例2A的试剂盒在基于微量滴定板的ELISA测定中用于定量半乳凝素-3水平。试剂盒中包括两种抗半乳凝素-3的单克隆抗体。在于下列段落中更详细描述的测定中，将标准品和质量控制材料引入孔中并且温育60分钟。在该温育过程中，存在于标准品中的半乳凝素-3结合至包被在孔表面上的捕获抗体。随后的洗涤步骤除去与材料一起引入的所有未结合的材料(包括未结合的半乳凝素-3)。然后将检测抗体引入孔中并且温育60分钟。在该时间内，形成抗体-抗原-抗体复合物。在除去任何未结合的检测抗体的洗涤步骤后，加入四甲基联苯胺(TMB)，在HRP存在的情况下产生蓝色。在20分钟后通过加入硫酸终止显色，颜色改变成黄色，以450nm的吸光度读取。从校正曲线读取样本的测试结果。吸光度与样本中的半乳凝素-3水平成比例。
在使用前，使全部测定成分达到室温，进行30分钟。在打开装有板的小袋后，用永不褪色墨水给每一个板条的上表面编号以防它们被无意地从板架(plate frame)上取下。通过使用去离子水，制备10x洗涤浓缩剂(WC)的1∶10稀释物。将稀释的缓冲液于2-8℃下贮存。
通过标准品(S1，重组人半乳凝素-3，12ng/瓶)的系列稀释制备7个半乳凝素-3标准品的组。校正范围为0.156ng/mL至10.0ng/mL。
使用前，使用300μL去离子水，然后加入900μL测定稀释剂来重建一瓶半乳凝素-3标准品(S1)。使小瓶在室温下放置15至20分钟，间歇地涡旋和轻轻地倒转，确保重建的水湿润瓶内的整个表面区域。在使用前获得标准品的完全溶解。
用250μL去离子水重建每一种半乳凝素-3对照(C1和C2)一瓶。使小瓶在室温下放置15至20分钟，间歇地涡旋和轻轻地倒转，确保重建的水湿润瓶内的整个表面区域。在使用前获得C1和C2的完全溶解。
使用测定稀释剂(AD)将每一个重建对照(C1和C2)在一次性硼硅玻璃或聚丙烯或其他低蛋白质结合塑料管或瓶中稀释10倍(1∶10)。通过涡旋或倒转混合每一个稀释物。将最少25μL重建的对照用于稀释。在外部(即非孔内稀释)进行稀释，然后立即使用。
稀释标准品后立即使用。用数字2至7标记6个一次性使用的管。将250μL测定稀释剂(AD)用移液器转移至每一个标记的管中。接着，将250μL半乳凝素-3标准品(S1)用移液器转移至管2，并且轻轻地混合。然后将250μL从管2转移至管3，轻轻混合。然后将250L从管3转移至管4，继续该过程直至管7。
为每一个对照、稀释的标准品和空白指定微量滴定板的孔。以一式二份测试全部样品(即，空白、稀释的标准品和对照)。
将100μl的每一个样品直接从稀释容器转移至用半乳凝素-3捕获抗体覆盖的微量滴定板的两个孔。用干净的板密封物覆盖孔并且在不振荡的情况下于20-25℃温育1小时。
当温育板时，根据下列表8中显示的稀释方案用测定稀释剂按1∶30稀释标记抗体：
表8：检测浓缩剂(30x)*的推荐稀释方案
  条的编号   AD μL   DC μL   条的编号   AD μL   DC μL
  1   1537   53   7   6235   215
  2   2320   80   8   7018   242
  3   3103   107   9   7801   269
  4   3886   134   10   8584   296
  5   4669   161   11   9367   323
  6   5452   188   12   10150   350
*AD＝测定稀释剂；DC＝检测浓缩剂。
然后，除去板密封物，使用程序设置为运行4次洗涤循环(每循环15秒浸泡时间)的机械洗涤器，用每孔400μL稀释的洗涤缓冲液洗涤孔。在第4次洗涤后，通过将孔在吸水纸巾上轻敲倒空孔。
接着，将100μL稀释的检测溶液用移液器转移至每一个孔。用干净的板密封物覆盖孔，在不振荡的情况下于20-25℃温育1小时。除去板密封物，使用程序设置为运行4次洗涤循环的机械洗涤器(每循环15秒浸泡时间)，用每孔400μL稀释的洗涤缓冲液洗涤孔。在第4次洗涤后，通过将孔在吸水纸巾上轻敲倒空孔。
将100μL TMB-底物(TS)用移液器转移至每一个孔中并且将板在黑暗处于20-25℃温育20分钟。
将50μL终止溶液(ST)用移液器转移至每一个孔。使用干净的移液器尖头上下抽吸内容物或通过轻敲板的侧面而混合每一个孔的内容物。孔的内容物从蓝色转变成黄色。从每一个孔的液体表面除去任何气泡，将任何灰尘或液体从孔外部除去。
在加入终止溶液30分钟内在450nm在微量滴定板读数器中测量每一个孔的吸光度。
在完成测定步骤后，使用微量滴定板读数器在450nm处读取每一个标准品和对照的吸光度。使用下列方法确定测定的标准曲线。从所有数据(包括标准品和对照)扣除空白的平均吸光度。计算每一组一式二份的标准品和对照的吸光度(Abs450)值的平均值、标准差和变异系数(CV)。如果对照的任一个具有一式二份大于20％的CV，那么弃去整个板，使用新的试剂再分析全部样品。对于每一个标准品稀释，使用用于三阶多项式曲线拟合与最小均方最佳化(leasts quaresoptimization of the mean)的适当曲线拟合工具。将测量的浓度乘以10(样品和对照的稀释因子)以获得终半乳凝素-3浓度。对照值经验证在可接受的范围内。空白值经验证低于最小校准器刻度。如果空白值超过最低校正值(例如当减去空白时，低校正器值为负)，那么重复测定。
代表性校正曲线示于图3中，每一个稀释标准品的吸光度的代表性值示于表9中。
表9：代表性校正曲线和典型的450nm处的吸光度值
实施例2C：临床样品中重组半乳凝素-3的检测
通过加入临床样品，并入下文中概述的额外步骤来进行实施例2B中概述的方法。
当重建标准品和对照时，使用测定稀释剂(AD)将每一个测试样品在一次性使用的硼硅玻璃或聚丙烯或其他低蛋白质-结合塑料管或瓶中稀释10倍(1∶10)。通过涡旋或倒转混合每一个稀释物，将最少25μL的血清或血浆用于稀释。在外部(即非孔内稀释)进行稀释，然后立即使用。
在完成测定步骤后，使用微量滴定板读数器在450nm处读取每一个样本的吸光度。吸光度与样本中半乳凝素-3的浓度成比例。样本和对照中半乳凝素-3的浓度基于样本的吸光度与具有已知半乳凝素-3浓度的标准品的吸光度相比较的关系。
使用下列方法给每一个单个的板赋予测定的标准曲线。从所有数据(包括标准品、对照和测试样本)扣除空白的平均吸光度。计算每一组一式二份标准品、对照和测试样本的吸光度(Abs450)值的平均值、标准差和变异系数(CV)。再分析具有大于20％的一式二份CV的样本。如果对照的任一个具有一式二份大于20％的CV，那么弃去整个板，使用新的试剂再分析全部样本。对于每一个标准品稀释，使用用于将三阶多项式曲线拟合与最小均方最佳化(least squares optimizationof the mean)的适当曲线拟合工具。基于三阶多项式方程计算未知样本和对照的浓度。将测量的浓度乘以10(样本和对照的稀释因子)以获得终半乳凝素-3浓度。对照值经验证在可接受的范围内。当获得来自测定对照的不可接受的结果时，重复测定。空白值经验证低于最低校准器。如果空白值超过最低校准器值(例如当扣除空白时低校准器值是负的)，则重复测定。
测定的测量范围
使用临床样本的半乳凝素-3测定的测量范围经证实为1.32至96.6ng/mL。用7个覆盖约0.1至10.0ng/mL范围的标准品校正测定。在测定前将每一个测试样品(即，对照或受试者样本)以1∶10预先稀释，从而使测量值落入校准器的范围内。根据临床和实验室标准研究院评价方案6(Clinical Laboratory Standards InstituteEvaluation Protocol 6，CLS I-EP6)建立测定的线性范围。制备血清和血浆样本，将其稀释以覆盖临床上有意义的半乳凝素-3浓度测量值范围。测定被证实在高至96.6ng/mL是线性的。测量范围的低端(lowerend)由定量限度(LoQ)确定，其经测定为1.32ng/mL。
性能特征
精确度
在根据CLSI EP5-A2指导原则的评估中估量测定半乳凝素-3测定的精确度。在20天的时间内每天二轮以一式二份分析覆盖半乳凝素-3浓度范围的3个血浆库。计算轮内、轮间、日间和总精确度的评估值，被认为是可接受的。结果概述于表10中。
表10：半乳凝素-3测定的精确度
根据CLSI EP5-A2指导原则在3个CLIA认证的临床实验室中评估精确度。在这3个CLIA认证的临床实验室位置，总变异系数(CV)的范围为从5.60％至16.89％，所有位置都提供可接受的结果。
分析灵敏度
根据CLSI EP17-A指导原则的推荐确定半乳凝素-3测定的分析灵敏度。
空白限(LoB)：LoB＝0.86ng/mL
检测限(LoD)：LoD＝1.13ng/mL
定量限(LoQ)：LoQ＝1.32ng/mL
分析特异性
当在下列化合物全都以500ng/mL的浓度存在的情况下测试时，半乳凝素-3测定未显示显著的交叉反应性：半乳凝素-1、半乳凝素-2、半乳凝素-4、半乳凝素-7、半乳凝素-8、半乳凝素-9、半乳凝素-12、胶原蛋白I和胶原蛋白III。上述潜有的交叉反应剂的百分比平均交叉反应为或低于0.3％。
线性
根据CLSI-EP6的推荐评估测量范围内的线性。通过将半乳凝素-3掺入血清和血浆样本来制备样品，然后用半乳凝素-3测定进行分析。结果显示测定从1.24至96.6ng/mL是线性的。测量范围的下端由定量限度(LoQ)确定，其在分开的研究中经测定为1.32ng/mL。
总之，半乳凝素-3测定的测量范围是从1.32ng/ml至96.6ng/mL。
干扰物质
根据CLSI EP7-A的推荐就潜在干扰物(内源性和外源性的)的作用评估半乳凝素-3测定。缀合的胆红素(多至5mg/dL)、未缀合的胆红素(多至15mg/dL)、白蛋白(BSA，多至12g/dL)、甘油三酯类(多至3000mg/dL)、胆固醇(多至250mg/dL)和肌酸酐(多至5mg/dL)在测定中未显示任何干扰。纯化的血红蛋白(多至500mg/dL)在半乳凝素-3测定中未显示干扰；然而，压积红细胞裂解物确实显示干扰。人抗小鼠抗体(HAMA)和类风湿因子(RF)引起对半乳凝素-3测定的显著阳性干扰。
当在34种常用药用物质存在的情况下测试时，半乳凝素-3测定未受到显著影响，所述药用物质包括HF药物(参见表11)。
表11：未显示干扰半乳凝素-3测定的常用药物
  醋氨酚   卡维地洛   多巴胺   Lisinopril   奎尼丁
  乙酰水杨酸   卡托普利   依那普利拉   氯沙坦   雷米普利
  氨氯地平   氯霉素   呋塞米   洛伐他汀   螺内酯
  氨苄西林   二氯酚酸   氢氯噻嗪   甲基多巴   茶碱
  抗坏血酸   地高辛   布洛芬   美托洛尔   维拉帕米
  阿替洛尔   地尔硫卓   吲哚美辛   萘普生   华法林
  咖啡因   丙吡胺   利多卡因   硝苯地平
高剂量钩状效应
在高至500ng/mL的半乳凝素-3水平上不存在高剂量钩状效应。
加标回收率
在其中以5个不同的掺入水平：15ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、75ng/mL和90ng/mL将人半乳凝素-3掺入6个受试者匹配的血清和EDTA-血浆样品以及测定稀释剂的研究中，血清中平均百分比回收范围是79.7％至84.6％，总平均百分比回收为81.7％，以及EDTA-血浆中平均百分比回收范围是71.4％至81.4％，总平均百分比回收为78.1％。该研究显示，与测定稀释剂基质相比较而言，血清/血浆基质中半乳凝素-3的掺入量的回收有不同。虽然该效应可能在相似的加标回收实验中被观察到，但其对临床测量不具有影响。
实施例2D：不具有已知心脏病的受试者的临床样品中半乳凝素-3的检测
在一项前瞻性的观察研究中，通过分析1,092个来自不具有已知的心脏病但就年龄和性别分布、HF患者群体而言在其他方面相似的受试者的库存血浆样品来测定半乳凝素-3水平。样本来自年龄在60至80岁之间的女性(n＝572)和年龄在55至80之间的男性(n＝520)。该参照群体如下由不同种族背景的个体组成：黑人(n＝305，27.9％)、高加索人(n＝686，62.8％)、西班牙人(n＝42，3.8％)、亚洲或太平洋岛人(n＝30，2.7％)和未说明的人(n＝29，2.7％)。将来自研究参加者的血浆样品收集入含EDTA的管中。处理血液，随后将血浆于-20℃或更低的温度下冷冻。
通过使用实施例2C中描述的半乳凝素-3测定，全部受试者都具有可检测的半乳凝素-3水平。使用半乳凝素-3参考范围值的分布(参见表12)的非参数法确定了基于正常上限(ULN)值的半乳凝素-3的单个阈值17.6ng/mL。ULN被定义为不依赖于性别或年龄的半乳凝素-3值分布的第90百分位数。
表12：半乳凝素-3水平的分布
实施例2E：具有急性代偿失调性HF的患者的临床样品中半乳凝素-3的检测
为了评估实施例2C中描述的半乳凝素-3测定在经诊断患有急性代偿失调性HF的受试者中的效用，测量来自急性代偿失调性心力衰竭(ADHF)研究的181个库存EDTA血浆样品中的半乳凝素-3水平。ADHF研究是在美国进行的一项前瞻性的观察研究，其招募急诊科中呈现呼吸困难的受试者(4)。测量181个经诊断患有急性代偿失调性HF的受试者的基线样品中的血浆半乳凝素-3浓度。随访受试者4年。将来源于参考范围群体(实施例2D中描述的)的17.6ng/mL的半乳凝素-3阈值用于确定具有升高的基线半乳凝素-3的受试者(n＝68)类别。处于半乳凝素-3水平的最高四分位数中的患者与最低的四分位数相比较具有高出约2倍高的死亡危险。Cox回归存活分析和Kaplan-Meier分析显示，即使在就年龄、性别、纽约心脏学会(NYHA)种类、左心室射血分数、吸烟状态和糖尿病调整后，升高的基线半乳凝素-3仍是死亡风险的重要预测指标(参见图4)。
表13：ADHF研究中HF受试者的死亡危害比
实施例2F：慢性心力衰竭受试者的临床样品中半乳凝素-3的检测(慢性HF研究I)
慢性HF研究I涉及基于必需考虑住院治疗(包括需要静脉内施用药剂)的典型体征和症状组合诊断的NYHA II至IV类。受试者在出院时被招募，此时他们在标准治疗中必须是稳定的。通过对592个受试者的可获得的基线样品使用半乳凝素测定来测量半乳凝素-3的浓度。将来源于参考范围群体(实施例2D中描述的)的17.6ng/mL的半乳凝素-3阈值用于确定具有升高的基线半乳凝素-3的受试者(n＝363)类别。处于半乳凝素-3水平的最高四分位数中的患者在出院后任意时间上的死亡危害与最低四分位数相比较高出约2倍。Cox回归存活分析和Kaplan-Meier分析显示，即使在就年龄、性别、纽约心脏学会(NYHA)种类、左心室射血分数、吸烟状态和糖尿病调整后，升高的基线半乳凝素-3仍是死亡风险的重要预测指标(参见图5)。
表14：慢性HF研究I中HF受试者的死亡危害比
实施例2G：慢性心力衰竭受试者的临床样品中半乳凝素-3的检测(慢性HF研究II)
慢性HF研究II招募具有慢性NYHA III或IV类HF的患者。通过将HF的典型临床体征和症状与减少的左心室收缩功能或左心室射血分数(LVEF)、具有左心室收缩功能代偿的舒张期功能障碍的超声心动图或放射性核素心室造影术发现结合确定HF的诊断。患者在招募时在标准治疗中是稳定的。
通过对232个受试者的基线样品使用半乳凝素测定来测量半乳凝素-3的浓度。将来源于参考范围群体(实施例2D中描述的)的17.6ng/mL半乳凝素-3阈值用于确定具有升高的基线半乳凝素-3的受试者(n＝118)分类。处于半乳凝素-3水平的最高四分位数中的患者在3至6年的跟踪观察期中的死亡危害比最低四分位数相比较高出约1倍。Cox回归存活分析和Kaplan-Meier分析显示，即使在就年龄、性别、纽约心脏学会(NYHA)种类、左心室射血分数、吸烟状态和糖尿病调整后，升高的基线半乳凝素-3仍是死亡风险的重要预测指标(参见图6)。
表15：慢性HF研究II中HF受试者的死亡危害比
通过参考并入
本文中提及的专利文献和科技文章的完全公开内容为了所有目的通过参考并入。
等同物
本发明可以以其他特定的形式来体现而不背离其精神或基本特征。因此上述实施方案在所有方面被认为是举例说明性的而非对本文中描述的发明的限定。本发明的范围从而由所述权利要求而非由上述描述所确定，并且在权利要求等价的意义和范围内的所有改变意在包括于其中。

Claims (9)

1.两个结合部分在制备用于检测受试者中心力衰竭的发生或进展风险的试剂盒中的用途，其中所述试剂盒包含用于检测来自受试者的至少一种体液或组织样品中人半乳凝素-3水平的双结合部分夹心测定法，其中所述结合部分中的至少一个被可检测的标记物标记，其中所述结合部分中的一个包含能够结合半乳凝素-3的M3/38单克隆抗体，所述结合部分中的另一个包含能够结合半乳凝素-3的87B5单克隆抗体。
2.权利要求1的用途，其中所述夹心测定提供了标示着高于阈值的半乳凝素-3浓度的存在或不存在的定性结果。
3.权利要求1的用途，其中所述夹心测定提供了标示着半乳凝素-3浓度的定量结果。
4.权利要求1至3中任一项的用途，其中所述来自受试者的至少一种体液或组织样品包括来自所述受试者的第一样品和来自所述受试者的、在与第一样品不同时间采集的第二样品。
5.权利要求4的用途，其中所述来自受试者的至少一种体液或组织样品包括来自所述受试者的多个样品。
6.权利要求4的用途，其中所述来自受试者的至少一种体液或组织样品包括每月一次采集的样品。
7.权利要求4的用途，其中所述来自受试者的至少一种体液或组织样品包括每年一次采集的样品。
8.权利要求1－3中任一项的用途，其中所述M3/38单克隆抗体被固定在固相上。
9.权利要求1－3中任一项的用途，其中所述87B5单克隆抗体被固定在固相上。
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