ES2352351T3 - Métodos para la estratificación de la insuficiencia cardiaca. - Google Patents
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Abstract
Método para clasificar la insuficiencia cardiaca en un sujeto según las clases I, II, III o IV de la New York Heart Association (NYHA) que comprende a) la determinación de la cantidad del péptido natriurético cerebral (BNP) maduro de 32 aminoácidos en una muestra de orina de dicho sujeto; y b) clasificar si el sujeto padece de insuficiencia cardiaca de acuerdo con las clases I, II, III, o IV de la NYHA en base a la cantidad del BNP maduro de 32 aminoácidos determinado en el paso a), en el que i. una cantidad de 0,8 a 2,4 pg/ml clasifica al sujeto en la clase I de la NYHA, ii. una cantidad de 2,5 a 3,9 pg/ml clasifica al sujeto en la clase II de la NYHA, iii. una cantidad de 4,0 a 12,0 pg/ml clasifica al sujeto en la clase III de la NYHA, y iv. una cantidad superior a 12,0 pg/ml clasifica al sujeto en la clase IV de la NYHA.
Description
Esta invención está relacionada con métodos para clasificar la insuficiencia cardiaca de un sujeto en las clases NYNA I, II, III y IV, en base a la cantidad de péptido
natriurético cerebral (BNP) en una muestra de orina. Además, la presente invención incluye métodos para predecir si
un sujeto se encuentra en riesgo de desarrollar insuficiencia cardiaca acompañada de incidentes cardiovasculares en
base a la cantidades de BNP en una muestra de orina.
Un objetivo de la medicina moderna es proporcionar
pautas de tratamiento personalizadas o individualizadas.
Éstas son pautas de tratamiento que tienen en cuenta las
necesidades o riesgos personales del paciente. Un riesgo
particularmente importante es la presencia de una complicación cardiovascular, en particular una complicación cardiovascular no identificada. Las complicaciones cardiovasculares, en particular las enfermedades cardiacas, son la primera causa de morbilidad y mortalidad en el mundo occidental. Las complicaciones cardiovasculares pueden permanecer
asintomáticas durante largos periodos de tiempo. En consecuencia, el diagnóstico fiable de la presencia de una complicación cardiovascular es más dificultoso y propenso a
errores de lo que generalmente se cree (Svendstrup Nielsen,
L., et al. (2003). N-terminal pro-brain natriuretic peptide
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for discriminating between cardiac and non-cardiac dyspnoea. The European Jounal of Heart Failure).
Se sabe que los péptidos natriuréticos son marcadores
moleculares de la progresión de la enfermedad cardiovascular. La patente WO 02/083913 describe que el péptido natriurético cerebral (BNP) y las variantes del mismo en la
sangre pueden utilizarse para predecir la morbilidad y mortalidad a medio plazo en pacientes que ya sufren de insuficiencia cardiaca. En un intento de diagnosticar enfermedades vasculares, en particular la isquemia miocárdica, la
patente WO 02/089657 también describe varios marcadores
biológicos sanguíneos que pueden utilizarse como indicado-
res de pronóstico para dichas enfermedades y trastornos una
vez se encuentran diagnosticados. Entre otros, el BNP se
menciona como un marcador biológico apropiado. Además Hutfless et al. han demostrado que, en base a la cantidad sanguínea de BNP del paciente tras la cirugía cardiaca, puede
predecirse la morbilidad o la mortalidad en un periodo de
30 días después de dicha cirugía (Hutfless 2004, Utility of
B-type natriuretic peptide in predicting postoperative complications and outcomes in patients undergoing heart surgery. J Am Coll Cardiol 43: 1873-9). No obstante, los resultados del estudio no fueron altamente significativos,
según los autores. Sin embargo, el uso de péptidos natriuréticos como marcadores diagnósticos había sido puesto en
entredicho anteriormente dada la dependencia del nivel de
estos péptidos en varios fluidos corporales, incluyendo la
orina, de una adecuada función renal (McCullough 2003. B
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Type Natriuretic Peptides: A Diagnostic Breakthrough for
Clinicians. Reviews in Cardiovascular Medicine 4: 72-80.).
Wu y sus colaboradores dan a conocer un método para
medir la cantidad de BNP en muestras de plasma procedentes
de pacientes y valorar las clasificaciones NYHA de estos
pacientes en base a las cantidades de BNP medidas (ver Figura 3). El análisis puede utilizarse para evaluar la gravedad de la insuficiencia cardiaca debido al aumento proporcional de las concentraciones de BNP a más del doble
cuando la gravedad de la insuficiencia cardiaca aumenta de
la clase NYHA I a II, de la clase II a la III, y de la clase III a la IV (Alan H.B. Wu, et. al., Clinical Chemistry,
2004, Vol. 50(5) Págs. 867-873).
La patente WO 03/087819 A revela un método para predecir enfermedades cardiacas, tales como la insuficiencia
cardiaca congestiva mediante la determinación de los niveles de un precursor del BNP o de fragmentos de éste, tales
como el extremo N-terminal del proBNP1-21 en una muestra como la orina.
Un inconveniente de los métodos anteriormente conocidos es que generalmente requieren la evaluación de los resultados por parte de un cardiólogo especializado o sólo
pueden aplicarse tras un incidente cardiaco tal como una
cirugía cardiaca previa. Además, la fiabilidad de los medios y métodos descritos con fines diagnósticos, en particular para las formas de insuficiencia cardiaca menos grave, es cuestionable a causa de las incertidumbres mencionadas con anterioridad.
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Por lo tanto, existe desde hace tiempo una clara necesidad de medios y métodos para diagnosticar la insuficiencia cardiaca en pacientes en los que aún no se han identificado enfermedades cardiovasculares o que aún no se han
sometido a cirugía cardiaca. Además, los medios y los métodos deben permitir un diagnóstico rápido y fiable. Específicamente, deben permitir el diagnostico de la insuficiencia cardiaca por un doctor en medicina general y no sólo
por un cardiólogo o un clínico especialista.
Por lo tanto, el problema técnico subyacente a la presente invención es la provisión de métodos para cumplir con
las necesidades anteriormente citadas. Los métodos deberán,
al mismo tiempo, evitar las desventajas de los métodos previamente conocidos mencionados anteriormente. El problema
técnico se soluciona en las realizaciones descritas en las
reivindicaciones y a continuación en este mismo apartado.
De acuerdo con esto, la presente solicitud describe un
método para el diagnóstico de la insuficiencia cardiaca en
un sujeto que consiste en
a) determinar la cantidad de péptido natriurético cerebral (BNP) en una muestra de orina de dicho sujeto; y
b) diagnosticar si el sujeto padece insuficiencia cardiaca en base a la cantidad de BNP determinada en el paso
a).
El método para el diagnóstico es, preferiblemente, un
método in vitro. El paso b) mencionado anteriormente, preferiblemente, incluye una correlación entre la cantidad determinada en el paso a) y un estándar de referencia o va
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rios estándares de referencia, como se describe detalladamente más adelante. Puede además comprender el procesamiento de los datos brutos de la correlación para obtener un
resultado diagnóstico que no necesite una posterior interpretación por un médico especialista. Preferiblemente, en
los pasos a) y/o b), existirá una asistencia mediante auto-
matización total o parcial, por ejemplo, mediante un programa de ordenador adecuado para la correlación y/o procesado de los datos o un equipo robótico y sensible para la
determinación de la cantidad en el paso a).
El término "diagnóstico" tal como se utiliza aquí se
refiere a la valoración de la probabilidad con la que un
sujeto padece o padecerá insuficiencia cardiaca. Como entenderán los expertos en la materia, generalmente no se
pretende que tal valoración sea correcta en el 100% de los
sujetos a diagnosticar. El término, no obstante, requiere
que en una porción estadísticamente significativa de los
sujetos pueda diagnosticarse que sufren de insuficiencia
cardiaca o que están en riesgo de padecer insuficiencia
cardiaca en el futuro. Un experto en la materia puede determinar si una porción es estadísticamente significativa
sin más preámbulos mediante el uso de varias y conocidas
herramientas de evaluación estadística, por ejemplo, la determinación de los intervalos de confianza, la determinación del valor p, el test T de Student, el test de Mann-
Whitney, etc. Pueden encontrarse los detalles en Dowdy y
Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New
York 1983. Los intervalos de confianza preferibles son de
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como mínimo el 90%, como mínimo el 95%, como mínimo el 97%
o como mínimo el 99%. Los valores p son, preferiblemente de
0,1, 0,05, 0,01, 0,005 o 0,0001.
El diagnóstico incluye la monitorización, la confirmación, la subclasificación y la predicción de enfermedad relevante, sus síntomas o sus riesgos. La monitorización se
refiere a realizar un seguimiento de una enfermedad ya
diagnosticada, o una complicación, por ejemplo analizar la
progresión de la enfermedad o la influencia de un tratamiento particular en la progresión de la enfermedad o la
complicación. La confirmación se refiere a reforzar y consolidar un diagnóstico ya realizado mediante el uso de
otros indicadores o marcadores. La subclasificación se refiere a una mejor definición del diagnóstico de acuerdo con
las diferentes subclases de la enfermedad diagnosticada,
por ejemplo definirlo acorde a una forma leve o severa de
la enfermedad, como se discute en detalle a continuación.
La predicción se refiere a pronosticar una enfermedad o
complicación antes de que otros síntomas o marcadores sean
aparentes o estén significativamente alterados. La predicción en este contexto también incluye, preferiblemente,
diagnosticar la prevalencia de la insuficiencia cardiaca.
El término "orina" de acuerdo con la presente invención incluye orina total o fracciones de ésta. Las fracciones son fracciones de orina que contienen péptidos o polipéptidos. Las muestras de orina pueden ser obtenidas mediante cualquier método conocido en la materia. Las muestras pueden someterse a varios pretratamientos conocidos
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antes de aplicar el método de la presente invención (es decir, muestras de orina procesadas).
El término "insuficiencia cardiaca" usado en este aparado se refiere a una función deteriorada del corazón. La
insuficiencia cardiaca se clasifica bajo un sistema de clasificación funcional de acuerdo con la NYHA (New York Heart
Association). Los pacientes de la clase I no presentan síntomas obvios de enfermedad cardiovascular. La actividad física no se encuentra limitada y la actividad física normal
no causa fatiga indebida, palpitaciones o disnea (dificultad respiratoria). No obstante, la ecocardiografía de esfuerzo puede detectar anomalías en dichos pacientes. Los
pacientes de la clase II presentan una limitación leve de
la actividad física. Se encuentran confortables en reposo,
pero la actividad física normal ocasiona fatiga, palpitaciones o disnea. Los pacientes de la clase III muestran una
marcada limitación de la actividad física. Se encuentran
confortables en reposo, pero una actividad física inferior
a la normal ocasiona fatiga, palpitaciones o disnea. Los
pacientes de la clase IV son incapaces de desarrollar actividad física alguna sin molestias. Muestran síntomas de insuficiencia cardiaca en reposo. Si realizan cualquier actividad física, las molestias aumentan. En consecuencia, los
pacientes pueden dividirse en individuos que no muestran
síntomas clínicos e individuos con síntomas (por ejemplo,
disnea). Preferiblemente, la insuficiencia cardiaca es una
insuficiencia cardiaca crónica. Además, preferiblemente, la
insuficiencia cardiaca, como se denomina aquí, está rela
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cionada con la insuficiencia cardiaca de tipo leve o moderado. Los síntomas que acompañan a la insuficiencia cardiaca de tipo leve o moderado a la que aquí se hace referencia
son menos graves, es decir no son síntomas aparentes (por
ejemplo para la clase I) o son síntomas que pertenecen a
las clases II o III. Preferiblemente, el término está relacionado con la insuficiencia cardiaca congestiva, que
puede estar causada por varias enfermedades o trastornos
subyacentes. Como se ha mencionado anteriormente, la insuficiencia cardiaca leve o moderada está relacionada con la
insuficiencia cardiaca de las clases I, II o III según la
NYHA.
Mediante la investigación y monitorización de los síntomas, los pacientes que sufren insuficiencia cardiaca, específicamente aquellos que padecen insuficiencia cardiaca
leve o moderada, con síntomas ambiguos o débiles, difícilmente pueden clasificarse. De acuerdo con la invención, se
ha descubierto que una cantidad de BNP en orina de al menos
0,8 pg/ml es indicativa de insuficiencia cardiaca. Más preferiblemente, un sujeto perteneciente a la clase I de la
NYHA mostrará una cantidad de BNP comprendida entre 0,8
pg/ml y 2,4 pg/ml, más preferiblemente de 1,7 pg/ml en el
ensayo Advia Carteener (Bayer). También preferiblemente, un
sujeto perteneciente a la clase II de la NYHA mostrará una
cantidad de BNP comprendida entre 2,5 y 3,9 pg/ml, más preferiblemente 2,8 pg/ml en el ensayo Advia Carteener. Preferiblemente, un sujeto que pertenezca a la clase III de la
NYHA mostrará una cantidad de BNP comprendida entre 4,0 y
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12,0 pg/ml, más preferiblemente 5,4 pg/ml en el ensayo Advia Carteneer. Una cantidad incluso superior (es decir, superior a 12,0 pg/ml) es indicativa de la clase IV de la
NYHA. La abreviatura "ml" utilizada en este apartado se refiere al volumen de la muestra de orina en mililitros. Los
límites de los rangos anteriormente mencionados y los valores pueden variar estadísticamente (ver el Ejemplo y las
Figuras a continuación). Además, los rangos pueden variar
aún más debido al ensayo específico utilizado para la detección. No obstante, debe entenderse que los métodos de la
presente invención deben permitir la determinación de los
valores de BNP en orina esencialmente con la misma sensibilidad y/o especificidad que las pruebas descritas en el
Ejemplo acompañante (ensayo Advia Carteneen).
La determinación de la cantidad de BNP puede lograrse
mediante cualquiera de los medios conocidos para determinar
la cantidad de un polipéptido o un péptido en una muestra.
Dichos medios incluyen dispositivos y métodos de inmunoensayo, que pueden utilizar moléculas marcadas en varios formatos de ensayo en sándwich, de competición u otros. Dichas
pruebas desarrollan una señal indicativa de presencia o ausencia de BNP. Además, preferiblemente la potencia de la
señal puede correlacionarse directamente o indirectamente
(por ejemplo, proporción inversa) con la cantidad de polipéptido presente en la muestra.
Los dispositivos y los métodos incluyen, además, los
biosensores, dispositivos ópticos acoplados a los inmunoensayos, biochips, dispositivos analíticos como el espectró
metro de masas, espectrómetros de RNM o dispositivos de
cromatografía. Adicionalmente, los métodos incluyen métodos
basados en ELISA en microplaca, inmunoensayos totalmente
automatizados o robotizados (disponibles por ejemplo en los
analizadores Elecsys™), CBA (un ensayo enzimático de unión
a cobalto, disponible por ejemplo en los analizadores Roche-Hitachi™) y ensayos de aglutinación en látex (disponibles por ejemplo en los analizadores Roche-Hitachi™). De
acuerdo con la presente invención, la determinación de la
cantidad está relacionado con la medida de la cantidad o
concentración, preferiblemente de forma semicuantitativa o
cuantitativa. La medición puede realizarse directa o indirectamente. La medición indirecta incluye la medición de
respuestas celulares, de unión de ligando, de marcadores o
de productos de reacción enzimática. En el contexto de la
presente invención, la cantidad también se refiere a la
concentración. Es evidente que, a partir de la cantidad total de una sustancia de interés en una muestra de tamaño
conocido, puede calcularse la concentración de una sustancia y viceversa. La determinación de la cantidad o concentración de BNP en una muestra puede realizarse mediante varias técnicas.
En una realización preferible, el método para medir la
cantidad de BNP incluye los pasos de (a) poner en contacto
una célula capaz de dar una respuesta celular al polipéptido, con el polipéptido durante un periodo de tiempo adecuado, y (b) medir la respuesta celular. Para medir las respuestas celulares, la muestra de orina o muestra de orina
procesada, preferiblemente se añade a un cultivo celular y
entonces se mide una respuesta celular interna o externa.
La respuesta celular puede incluir la expresión de un gen
marcador o la secreción de una sustancia, por ejemplo un
péptido, un polipéptido o una molécula de pequeño tamaño.
En otra realización preferible, el método para medir
la cantidad de BNP incluye los pasos de (a) poner en contacto el polipéptido con un sustrato apropiado durante un
periodo de tiempo adecuado, y (b) medir la cantidad de producto.
En otra realización preferible, el método para medir
la cantidad de BNP incluye los pasos de (a) poner en contacto el polipéptido con un ligando de unión específica,
(b) (opcionalmente) eliminar el ligando no unido y (c) medir la cantidad de ligando unido.
Otros métodos preferibles para la medida pueden incluir la medida de la cantidad de ligando o agente que se
une específicamente al péptido o polipéptido de interés. La
unión, de acuerdo con la presente invención, incluye tanto
la unión covalente como la no covalente. Un ligando, de
acuerdo con la presente invención, puede ser un péptido, un
polipéptido, un ácido nucleico o una molécula de pequeño
tamaño que se une al BNP aquí descrito. Preferiblemente, el
ligando o agente se une específicamente a BNP. "Unión específica" de acuerdo con la presente invención significa que
el ligando o agente no deben unirse de forma sustancial
(presentar reacción cruzada) a otros péptidos, polipéptidos
o sustancias presentes en la muestra a analizar. Preferi
blemente, la proteína unida específicamente debe unirse con
al menos 3 veces más afinidad, más preferiblemente con al
menos 10 veces más afinidad, o aún más preferiblemente con
al menos 50 veces más afinidad, que a cualquier otro péptido o polipéptido relevante. La unión no específica puede
ser tolerable, si aún puede distinguirse y medirse de forma
inequívoca, por ejemplo de acuerdo con su tamaño en un Western Blot, o mediante su abundancia relativamente superior
en la muestra. La unión del ligando puede medirse a través
de cualquier método conocido en la materia. Preferiblemente, el método es semicuantitativo o cuantitativo. Los métodos más apropiados se describen a continuación. En primer
lugar, la unión de un ligando puede medirse directamente,
por ejemplo mediante RMN o resonancia de plasmón en superficie. En segundo lugar, si el ligando también sirve como
sustrato para alguna actividad enzimática del péptido o polipéptido de interés, se puede medir ese producto de la reacción enzimática (por ejemplo la cantidad de una proteasa
puede medirse mediante la detección del sustrato escindido,
por ejemplo en un Western Blot). Para la medida de productos de reacción enzimática, la cantidad de sustrato es preferiblemente saturante. El sustrato puede estar marcado con
una señal detectable previamente a la reacción. Preferiblemente, la muestra se pone en contacto con el sustrato durante un periodo de tiempo adecuado. Un periodo de tiempo
adecuado se refiere al tiempo necesario para que se produzca una cantidad detectable y preferiblemente detectable de
producto. En lugar de medir la cantidad de producto, se
puede medir el tiempo necesario para la aparición de una
cantidad de producto determinada (por ejemplo detectable).
En tercer lugar, el ligando puede estar acoplado de forma
covalente o no covalente a una señal, lo que permite la detección y medida de este ligando. El marcaje puede llevarse
a cabo mediante métodos directos o indirectos. El marcaje
directo involucra el acoplamiento de una señal directamente
al ligando (covalente o no covalentemente). El marcaje indirecto involucra la unión (covalente o no covalente) a un
ligando secundario del primer ligando. El ligando secundario debe unirse específicamente al primer ligando. Dicho
ligando secundario puede acoplarse a una señal adecuada y/o
ser la diana (receptor) de un ligando de unión terciario al
ligando secundario. El uso de ligandos secundarios, terciarios o incluso ligandos de órdenes superiores puede incluir
anticuerpos, anticuerpos secundarios y el extensamente conocido sistema estreptavidina-biotina (Vector Laboratories,
Inc.). El ligando o sustrato también puede marcarse con una
o más colas, como se conoce en la materia. Dichas colas
pueden ser, entonces, dianas de ligandos de órdenes superiores. Las colas apropiadas incluyen la biotina, digoxigenina, colas de His, glutatión S-transferasa, FLAG, GFP, colas de myc, hemaglutinina del virus de la gripe A (HA),
proteína de unión a maltosa y similares. En caso de un péptido o polipéptido, la cola se encuentra preferiblemente en
el extremo N-terminal y/o en el C-terminal. Las señales
apropiadas son todas aquellas que puedan detectarse mediante un método de detección adecuado. Las señales habituales
incluyen las partículas de oro, cuentas de látex, éster de
acridina, luminol, rutenio, señales activas enzimáticamente, marcadores radioactivos, marcadores magnéticos ("por
ejemplo cuentas magnéticas", lo que incluye los marcadores
paramagnéticos y superparamagnéticos), y las señales fluorescentes.
Las señales activas enzimáticamente incluyen, por
ejemplo, la peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, betagalactosidasa, luciferasa y derivados de los mismos. Los
sustratos apropiados para la detección incluyen la diamino-bencidina (DAB), 3,3’-5,5’-tetrametilbencidina, NBTBCIP (cloruro de azul-nitrotetrazolio y 5-bromo-4-cloro-3indolil-fosfato, disponibles en una solución lista para su
uso de Roche Diagnostics), CDP-Star™ (Amersham Biosciences)
y ECF™ (Amersham Biosciences). Una combinación adecuada entre enzima y sustrato puede resultar en un producto de reacción coloreado, fluorescencia o quimioluminiscencia, que
pueden medirse mediante los métodos conocidos en la materia
(por ejemplo usando una película fotosensible o un sistema
de cámara apropiado). Como para la medida de la reacción
enzimática, los criterios expuestos anteriormente se pueden
aplicar análogamente. Entre los marcadores de fluorescencia
típicos encontramos las proteínas fluorescentes (tales como
GFP y sus derivados), Cy3, Cy5, Texas Red, fluoresceína y
los colorantes Alexa (por ejemplo Alexa 568). Otros marcadores fluorescentes están disponibles, por ejemplo, de Molcular Probes (Oregon). También se contempla el uso de puntos cuánticos como marcadores fluorescentes. Entre los mar
cadores radioactivos típicos encontramos S35, I125, P32 , 33P y
similares. Un marcador radioactivo puede ser detectado mediante cualquiera de los métodos conocidos y apropiados,
por ejemplo una película fotosensible o un Phosphorimager.
Entre los métodos adecuados de medida, de acuerdo con la
presente invención, encontramos la precipitación (en particular la inmunoprecipitación), la electroquimioluminiscencia (quimioluminiscencia electrogenerada), RIA (radioinmunoensayo), ELISA (ensayo inmunosorvente ligado a enzimas),
ensayos inmunológicos con enzimas en sándwich, inmunoensayos de electroquimioluminiscencia en sándwich (ECLIA), inmunoensayo de fluorescencia con lantánidos potenciado por
disociación (DELFIA), ensayo de proximidad de centelleo
(SPA), turbidimetría, nefelometría, turbidimetría o nefelometría potenciada por látex, o inmunoensayos en fase sólida. Otros métodos conocidos en la materia (tales como la
electroforesis en gel, electroforesis 2D en gel, electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE), Western
Blot y espectrometría de masas), pueden utilizarse solos o
en combinación con marcajes u otros métodos de detección
descritos anteriormente. Entre los ligandos preferidos encontramos anticuerpos, ácidos nucleicos, péptidos o polipéptidos y aptámeros, por ejemplo aptámeros de ácidos nucleicos o peptídicos. Los métodos con tales ligandos se conocen extensamente en la materia. Por ejemplo, la identificación y producción de anticuerpos o aptámeros adecuados
también puede solicitarse a proveedores comerciales. Los
expertos en la materia están familiarizados con los métodos
para desarrollar derivados de dichos ligandos con una afinidad o especificidad superior. Por ejemplo, se pueden introducir mutaciones aleatorias en los ácidos nucleicos,
péptidos o polipéptidos. Estos derivados pueden ser sometidos a pruebas de unión mediante procedimientos de cribado
conocidos en la materia, por ejemplo la presentación en fagos.
Los anticuerpos a los que aquí se hace referencia incluyen tanto anticuerpos policlonales como monoclonales,
así como fragmentos de los mismos, tales como fragmentos
Fv, Fab y F(ab)2 que son capaces de unirse al antígeno o
hapteno. La presente invención también incluye anticuerpos
híbridos humanizados en los que secuencias de aminoácidos
de un anticuerpo donador no humano que muestra una especificidad antigénica deseada se combina con secuencias de un
anticuerpo aceptor humano. Las secuencias donadoras generalmente incluirán al menos los residuos de aminoácidos del
donador de unión al antígeno, pero también pueden incluir
otros residuos de aminoácidos del anticuerpo donador que
sean relevantes estructuralmente y/o funcionalmente. Dichos
híbridos pueden prepararse mediante múltiples métodos bien
conocidos en la materia.
En otra realización preferible, el ligando, escogido
preferiblemente de entre el grupo que consiste en ácidos
nucleicos, péptidos, polipéptidos, anticuerpos y aptámeros,
está presente en un soporte sólido, preferiblemente un
chip. Dichos soportes sólidos o chips, que incluyen un ligando o agente de unión del BNP son bien conocidos en la
materia e incluyen, entre otros, materiales para columna,
cuentas de poliestireno, cuentas de látex, cuentas magnéticas, partículas metálicas coloides, superficies y chips de
silicona y/o vidrio, tiras de nitrocelulosa, membranas, láminas, duracitos, pocillos y paredes de recipientes de reacción, tubos de plástico etc. disponibles comercialmente.
El ligando o agente puede ser unido a transportadores muy
diferentes. Ejemplos de transportadores bien conocidos incluyen el vidrio, el poliestireno, el cloruro de polivinilo, el polipropileno, el polietileno, el policarbonato, el
dextrano, el nilón, las amilosas, las celulosas naturales o
modificadas, las poliacrilamidas, las agarosas y la magnetita. La naturaleza del transportador puede ser soluble o
insoluble a efectos de la invención. Son bien conocidos los
métodos apropiados para la fijación/inmovilización de dichos ligandos o agentes e incluyen, pero no se limitan a
interacciones iónicas, hidrofóbicas, covalentes y similares. También se contempla la utilización de chips en suspensión, como los chips de acuerdo con la presente invención (Nolan JP, Sklar LA. (2002). Suspension array technology: evolution of the flat-array paradigm. Trends Biotechnol. 20(1):9-12). En dichos chips en suspensión, el transportador, por ejemplo una microcuenta o microesfera, se encuentra en suspensión. El chip está formado por diferentes
microcuentas o microesferas, posiblemente marcadas, portadoras de diferentes ligandos. Los métodos para la producción de dichos chips, por ejemplo en base a la química en
fase sólida y los grupos protectores fotolábiles, son de
conocimiento general (US 5.744.305). Dichos chips también
pueden ponerse en contacto con sustancias o bibliotecas de
sustancias para evaluar su interacción, por ejemplo su
unión o cambio de conformación. Por lo tanto, los chips que
contienen un péptido o un polipéptido, como los definidos
anteriormente, pueden utilizarse para identificar ligandos
con unión específica a dichos péptidos o polipéptidos.
El término "BNP" incluye el BNP maduro. El término
"variantes" también incluye las variantes alélicas codificadas por genes homólogos tanto en humanos como en otras
especies animales. Estos genes homólogos son, preferiblemente, genes parálogos u ortólogos que codifican los polipéptidos mencionados anteriormente. Los BNP preferibles y
las variantes de los mismos a utilizar de acuerdo con la
presente invención se describen en detalle a continuación.
Ambos términos "péptido" y "polipéptido" pueden utilizarse
de forma intercambiable en esta especificación.
Diagnosticar si un sujeto padece insuficiencia cardiaca leve o moderada en base a la cantidad de BNP, incluye la
correlación de una cantidad determinada de BNP con una cantidad de referencia. La cantidad de referencia se determinará simultáneamente o bien por separado. En este último
caso, la referencia se almacenará o registrará de un modo
adecuado y se proporcionará para la correlación. La cantidad de referencia será indicativa de insuficiencia cardiaca. En una realización, la cantidad de referencia será una
cantidad determinada a partir de sujetos o un grupo de sujetos (es decir, un promedio o valor medio de dicho grupo)
que no padecen insuficiencia cardiaca, es decir sujeto(s)
sano(s). Dicho(s) sujeto(s) sano(s) se caracteriza(n) por
presentar un estudio eco-Doppler normal, mostrar un ecocardiograma (ECG) normal, y mostrar unos rangos normales de
los parámetros bioquímicos y hematológicos estándar. Además, los sujetos sanos no deberán mostrar ninguno de los
síntomas descritos por la clasificación NYHA. El diagnóstico se realizará mediante la correlación de la cantidad determinada con dicha cantidad de referencia en la que un incremento en la cantidad en esta comparación con la cantidad
de referencia es indicativa de insuficiencia cardiaca.
La cantidad determinada se compara con las cantidades
de referencia procedentes de sujetos de referencia o grupos
de estos en los que se conoce que padecen insuficiencia
cardiaca. El diagnóstico se realizará mediante la correlación de la cantidad determinada con dicha cantidad de referencia en la que una cantidad similar o incrementada en
comparación con la cantidad de referencia es indicativa de
insuficiencia cardiaca.
Se proporcionará un panel con los valores de referencia, cada uno de los cuales estará correlacionado con un
nivel diferente de los síntomas asociados con la insuficiencia cardiaca, es decir, se proporcionará un valor de
referencia individual para cada una de las clases I, II,
III y IV de insuficiencia cardiaca de acuerdo con la NYHA.
Los valores de referencia preferibles se han discutido anteriormente. Los síntomas de acuerdo con los estándares de
la NYHA ya han sido discutidos en detalle en otra parte de
la especificación. De acuerdo a esta realización, no sólo
es posible diagnosticar si un sujeto padece insuficiencia
cardiaca, sino que también es posible diagnosticar la gravedad de los síntomas que un sujeto determinado puede desarrollar. De este modo, los sujetos que padecen insuficiencia cardiaca también pueden ser identificados y clasificados de un modo fiable en la clase correspondiente de la
NYHA.
Gracias a la presente invención es posible clasificar
la insuficiencia cardiaca en las clases de la NYHA, o asignar el riesgo de desarrollar accidentes cardiovasculares
acompañados de insuficiencia cardiaca mediante el uso de un
dispositivo de ensayo que es fácil de manejar e independiente de la evaluación de un médico altamente especializado. De este modo, dependiendo del método, puede que el médico especialista ya no sea requerido para la realización
del diagnóstico. Para un especialista en medicina general,
ya no serán necesarias herramientas de diagnostico caras
para la realización de un diagnóstico cardiaco. De forma
ventajosa, el uso de orina como muestra evita cualquier
procedimiento invasivo para el sujeto. De forma sorprendente, se ha descubierto en estudios subyacentes a la invención que la cantidad de BNP en orina es al menos, tan valiosa y fiable para el diagnóstico como la cantidad presente en la sangre. Normalmente, se esperaría encontrar niveles ligeramente inferiores de BNP en orina, dado que la mayor parte del aclaramiento para este polipéptido tiene lugar en el riñón mediante la filtración glomerular. De
acuerdo con esto, no se esperaría que (i) hubiese cantidades suficientes de BNP en la orina y (ii) que se pudiese
hacer un diagnostico fiable o una predicción basada en esto, ya que la cantidad de BNP en la orina también depende
de una correcta filtración glomerular. Además, se ha descubierto en estudios subyacentes a esta invención que la cantidad de BNP presente en una muestra de orina es indicativa, no sólo del desarrollo de insuficiencia cardiaca, sino
que también permite una clasificación fiable de dicha insuficiencia cardiaca de acuerdo con los sistemas de clasificación de la NYHA. Esto, permite además, una monitorización
eficiente de la progresión de la enfermedad. Los métodos
descritos aquí pueden aplicarse en estudios relacionados
con la eficacia de los fármacos. Específicamente, es posible determinar de forma fiable si un fármaco o fármaco candidato mejora la insuficiencia cardiaca, las enfermedades
que la acompañan o los síntomas descritos anteriormente. De
este modo, el método de la presente invención también facilitará los ensayos o estudios clínicos.
Las definiciones y explicaciones de los términos efectuadas anteriormente aplican a las realizaciones descritas
a continuación, con los cambios debidos. Lo mismo se aplica
para todas las definiciones y explicaciones que se proporcionan a continuación.
Además, la presente invención describe un dispositivo
para diagnosticar la insuficiencia cardiaca en un sujeto
que comprende
a) los métodos para determinar la cantidad de BNP en
una muestra de orina de dicho sujeto; y
b) los métodos para diagnosticar si un sujeto padece
insuficiencia cardiaca en base a la cantidad de BNP.
El término "dispositivo" tal como se utiliza aquí está
relacionado a un sistema de métodos que comprenden al menos
por los métodos mencionados anteriormente ligados de forma
operativa entre ellos para permitir el diagnóstico de la
insuficiencia cardiaca. Los métodos preferibles para determinar la cantidad de BNP y para diagnosticar la insuficiencia cardiaca se han descrito anteriormente, junto con el
método de la invención. El modo de conectar los medios de
una forma operativa dependerá del tipo de medios incluidos
en el dispositivo. Por ejemplo, si se utilizan medios para
la determinación automática de la cantidad de BNP, los datos obtenidos mediante dichos medios operativos de forma
automática pueden procesarse, por ejemplo, mediante un programa informático a fin de diagnosticar la insuficiencia
cardiaca. Preferiblemente, en tal caso los medios están incluidos en un único dispositivo. Dicho dispositivo puede
incluir de acuerdo con esto una unidad de análisis para la
medida de la cantidad de BNP en una muestra aplicada y una
unidad de computerización para el procesamiento de los datos resultantes para el diagnóstico. Alternativamente, si
se utilizan medios como tiras de ensayo para la determinación de la cantidad de BNP, los medios para el diagnóstico
pueden incluir tiras control o tablas de clasificación de
la cantidad determinada respecto a una cantidad que se conoce está relacionada con la insuficiencia cardiaca o una
cantidad que se conoce es indicativa de un sujeto sano, como se ha discutido anteriormente. Las tiras de ensayo están, preferiblemente, asociadas a un ligando o agente que
se une específicamente a BNP. La tira o dispositivo, preferiblemente, incluye medios para la detección de la unión
del péptido derivado del preproBNP al ligando o agente. Los
medios preferibles para la detección se describen en conexión a las realizaciones relacionadas con el método de la
invención anterior. En tal caso, los medios están ligados
operativamente para que el usuario del sistema integre el
resultado de la determinación de la cantidad y el valor
diagnóstico de este gracias a las instrucciones e interpretaciones dadas en un manual. Los medios pueden aparecer como dispositivos separados en tal realización y, preferiblemente, están empaquetadas conjuntamente en forma de equipo.
El experto en la materia comprenderá como conectar los medios sin mayor esfuerzo. Los dispositivos preferibles son
aquellos que pueden aplicarse sin los conocimientos particulares de un médico especialista, por ejemplo, las tiras
de ensayo o dispositivos electrónicos que simplemente requieran la carga de una muestra. Los resultados pueden proporcionarse en forma de datos brutos de diagnóstico, que
necesiten e interpretación por parte de un médico especialista. Preferiblemente, los datos de salida del dispositivo
son, sin embargo, datos brutos de diagnóstico procesados,
cuya interpretación no requiere de un médico especialista,
es decir, a partir de los resultados debería quedar ineludiblemente claro si un sujeto padece insuficiencia cardia
ca. Otros dispositivos más preferibles comprenden las unidades/ dispositivos de análisis (por ejemplo, biosensores,
chips, soportes sólidos acoplados a ligandos o agentes que
reconocen específicamente BNP, dispositivos de resonancia
de plasmón en superficie, espectrómetros de RMN, espectrómetros de masa, etc.) o unidades/ dispositivos de evaluación, mencionados anteriormente de acuerdo con el método de
la invención.
En vista de lo anterior, en una realización preferible
del método de la presente invención, dicho diagnóstico basado en la cantidad de BNP incluye la comparación de la
cantidad de BNP en una muestra de orina procedente de un
sujeto no afectado de insuficiencia cardiaca o afectado de
insuficiencia cardiaca.
La presente invención también está relacionada con un
método para predecir si un sujeto se encuentra en riesgo de
desarrollar accidentes cardiovasculares después de la insuficiencia cardiaca incluyendo
a) la determinación de la cantidad de BNP en una muestra de orina de dicho sujeto; y
b) la predicción de si un sujeto se encuentra en riesgo de desarrollar accidentes cardiovasculares acompañados
de insuficiencia cardiaca en base a la cantidad de BNP determinada en el paso a).
El término "accidentes cardiovasculares" se refiere a
necrosis cardiovascular acompañado de hospitalización por
cualquier accidente cardiovascular -insuficiencia cardiaca, síndrome coronario agudo, accidente cerebrovascular/
isquemia transitoria, accidente vascular periférico, arritmia o síncope. Además, cualquier episodio ambulatorio nuevo
o cualquier descompensación de la insuficiencia cardiaca
que requiera un incremento en la medicación también puede
incluirse por lo que aquí se entiende por accidente cardiovascular. Los síntomas y signos diagnósticos de los accidentes cardiovasculares son bien conocidos por los médicos
especialistas (véase por ejemplo, Troughton 2000. Treatment
of heart failure guided by plasma aminoterminal brain natriuretic peptide (N-BNP) concentrations. The Lancet, Vol.
355.). Los detalles también se describen en libros de texto
estándar tales como Pschyrembel o Stedman. Los síntomas y
signos pueden ser determinados y evaluados por el médico
especialista teniendo en cuenta otros parámetros adicionales como la edad, el peso, la talla y otras enfermedades o
trastornos, terapias y/o historia clínica del sujeto. Preferiblemente, dichos accidentes cardiovasculares requieren
hospitalización del sujeto y/o están acompañados por mortalidad o mayor morbilidad del sujeto.
Se ha descubierto, de acuerdo con la presente invención, que una cantidad de BNP en orina de al menos 2,67
pg/ml es indicativa de un incremento del riesgo de desarrollar accidentes cardiovasculares y/o mortalidad (necrosis
cardiaca) en el futuro. Debe entenderse que los valores anteriormente mencionados pueden variar dentro de los límites
estadísticos.
Consecuentemente, el método de la presente invención
puede utilizarse para la estratificación del riesgo de un
paciente. De tal manera, las terapias u otros tratamientos
o procedimientos médicos necesarios pueden aplicarse al sujeto. Además, el riesgo de desarrollar insuficiencia cardiaca puede tenerse en cuenta para terapias o procedimientos médicos futuros.
De lo anterior se deduce que, bajo una realización
preferible del método de la invención, dicha predicción en
base a la cantidad de BNP comprende la comparación de la
cantidad de BNP en una muestra de orina del sujeto con la
cantidad de BNP en una muestra de orina de un sujeto del
que se conoce que no ha desarrollado insuficiencia cardiaca, o de un sujeto del que se conoce que ha desarrollado
insuficiencia cardiaca.
En otra realización preferible de los métodos de la
invención, dicho riesgo de desarrollar accidentes cardiovasculares acompañados de insuficiencia cardiaca se refiere
a un periodo pronóstico de al menos 12 meses.
Se ha descubierto en los estudios subyacentes a la
presente invención que la predicción de accidentes cardiovasculares en base a la cantidad de BNP es más fiable y
significativa dentro de un periodo pronóstico de 12 meses.
Otros periodos pronóstico que también se contemplan en la
presente invención son periodos de al menos 1 año.
En otra realización preferible de los métodos de la
invención, dicha insuficiencia cardiaca puede clasificarse
en las clases I, II, III o IV de la New York Heart Association (NYHA).
Como se ha discutido anteriormente, la clasificación
de la insuficiencia cardiaca leve o moderada en las clases
de la NYHA puede realizarse en base a la cantidad de BNP,
es decir, la gravedad de los síntomas que un sujeto desarrollará puede determinarse en base a la cantidad de BNP.
En los estudios subyacentes a la presente invención se
ha descubierto de forma sorprendente, que incluso los pacientes pertenecientes a las clases I y II de la NYHA pueden clasificarse de forma fiable en sus respectivas clases.
Por lo tanto, los síntomas que un sujeto puede desarrollar
pueden predecirse de forma más fiable en relación a la insuficiencia cardiaca leve o moderada. Además, en base al
conocimiento de los síntomas que un sujeto puede desarrollar, la vida de dicho sujeto puede hacerse más cómoda.
En una realización preferible de los métodos de la invención, dicho sujeto es un humano.
El BNP humano al que se hace referencia de acuerdo con
la presente invención, es un polipéptido que comprende 32
aminoácidos de longitud que corresponden a la molécula madura (de los aminoácidos 77 al 108 del preproBNP). La estructura de los polipéptidos se han descrito en detalle en
referencias anteriores, por ejemplo, en la patente WO
02/089657, la patente WO 02/083913 y Bonow 1996, New Insights into the cardiac natriuretic peptides. Circulation
93: 1946-1950. Las referencias anteriores mencionadas se
incorporan aquí como referencia respecto a las secuencias
específicas de BNP y las variantes de las mismas allí descritas. Los BNP a los que se hace referencia de acuerdo con
la presente invención, también incluyen formas alélicas. De
forma específica, se incluyen por lo tanto, las variantes
polipeptídicas que son al menos idénticas en un 60 % a nivel de aminoácido, más preferiblemente idénticas en al menos un 70 %, al menos en un 80 %, al menos en un 90 %, al
menos en un 95 %, al menos en un 98% o al menos en un 99 %
al BNP humano. También se incluyen las variantes polipeptídicas que contengan deleciones o sustituciones de aminoácidos, en comparación con el BNP humano, en las que dichos
polipéptidos contienen las propiedades biológicas o inmunológicas del BNP humano. Estas variantes polipeptídicas tienen el mismo valor diagnóstico y predictivo respecto a la
insuficiencia cardiaca que los BNP específicos a los que
aquí se hace referencia. El BNP puede analizarse de forma
preferible, como se describe en la patente WO 02/089657 o
en el siguiente ejemplo acompañante.
Más preferiblemente, el BNP es BNP humano como se ha
especificado anteriormente.
Las figuras muestran:
Figura 1: La figura 1 muestra una comparación entre la
cantidad de BNP que se encuentra en la orina de pacientes
que padecen insuficiencia cardiaca (pacientes HF, del inglés "heart failure") y controles sanos. El valor de p <
0,001 indica que la diferencia encontrada entre las cantidades es altamente significativa.
Figura 2: La figura 2 muestra diferentes cantidades de
BNP en orina que se encuentran en individuos control sanos
o en individuos que padecen insuficiencia cardiaca de las
clases I, II o III de acuerdo con la New York Heart Asso
ciation (NYHA I, II o III). Como es evidente a partir de la
figura, la cantidad de BNP que se encuentra en la orina de
los individuos puede utilizarse para distinguir la gravedad
de la insuficiencia cardiaca. Las diferencias entre los
grupos fueron estadísticamente significativas.
Figura 3: Curva operativa del receptor (ROC) de la
cantidad de BNP en orina para el diagnóstico de la insuficiencia cardiaca.
Figura 4 Curva operativa del receptor (ROC) de las
cantidades de BNP en orina para el pronóstico de necrosis
cardiaca dentro de una ventana de tiempo de 12 meses tras
la medida de la muestra.
Figura 5: La figura 5 muestra una tabla con los valores umbral más preferibles de la curva ROC de mortalidad
determinados en el estudio subyacente a esta invención.
El siguiente Ejemplo ilustra la invención.
Ejemplo: Valor diagnóstico y pronóstico de BNP en orina.
El propósito de la presente investigación era analizar
la presencia de BNP en la orina humana, para comparar los
niveles encontrados entre los controles y un grupo de enfermos e investigar el valor diagnóstico y pronóstico del
BNP en orina. Los niveles de BNP se midieron en 15 voluntarios sanos y 91 pacientes con insuficiencia cardiaca (pacientes HF). Dentro del grupo HF, 8 pertenecían a la clase
NYHA I, 63 a la clase NYHA II y 20 a la clase NYHA III.
Los niveles de BNP en orina fueron superiores de forma
estadísticamente significativa en los pacientes HF respecto
a los controles (3,28 ± 4.24 frente a 0,54 ± 0,94 pg/ml; p < 0,0001). En las clases con deterioro funcional, la media de los niveles de BNP en orina fueron significativamente elevados (Fig. 3) de acuerdo con un aumento de la gravedad. La 5 curva ROC del BNP para la detección de pacientes HF produjo un área bajo la curva (AUC) de 0,81; p < 0,0001 comparado con la diagonal. A partir de esta curva ROC el punto umbral opcional en este ensayo específico sería de 0,83 pg/ml con una especificidad del 80 % y una sensibilidad del 78 %. 10 Además, para investigar si el BNP urinario era pronóstico de necrosis cardiaca (12 meses) se realizó una curva ROC que produjo una AUC = 0,76 y un p = 0,013 comparado con la diagonal. El punto umbral óptimo para pronosticar la mortalidad cardiaca se calculó en 2,67 pg/ml en este ensayo par
15 ticular. De este modo, las investigaciones actuales muestran que el BNP puede determinarse en muestras de orina humana y que los niveles de BNP en orina pueden utilizarse para el diagnóstico y el pronóstico de pacientes con insuficiencia
20 cardiaca, así como para la caracterización de los estados funcionales de estos pacientes.
Claims (7)
1. Método para clasificar la insuficiencia cardiaca en un sujeto según las clases I, II, III o IV de la New York Heart Association (NYHA) que comprende
a) la determinación de la cantidad del péptido natriurético cerebral (BNP) maduro de 32 aminoácidos en una muestra de orina de dicho sujeto; y
b) clasificar si el sujeto padece de insuficiencia
cardiaca de acuerdo con las clases I, II, III, o IV de la
NYHA en base a la cantidad del BNP maduro de 32 aminoácidos
determinado en el paso a), en el que
i. una cantidad de 0,8 a 2,4 pg/ml clasifica al
sujeto en la clase I de la NYHA,
ii. una cantidad de 2,5 a 3,9 pg/ml clasifica al
sujeto en la clase II de la NYHA,
iii. una cantidad de 4,0 a 12,0 pg/ml clasifica
al sujeto en la clase III de la NYHA, y
iv. una cantidad superior a 12,0 pg/ml clasifica
al sujeto en la clase IV de la NYHA.
2. Método para predecir si un sujeto está en riesgo de desarrollar accidentes cardiovasculares acompañados de insuficiencia cardiaca que comprende
a) la determinación de la cantidad del BNP maduro de
32 aminoácidos en una muestra de orina de dicho sujeto; y
b) la predicción de si un sujeto está en riesgo de
desarrollar accidentes cardiovasculares acompañados de insuficiencia cardiaca en base a la cantidad de BNP maduro de
32 aminoácidos determinado en el paso a); en el que una
cantidad de BNP de al menos 2,67 pg/ml es indicativa de un
incremento de riesgo de desarrollar accidentes cardiovasculares.
3. El método de la reivindicación 2, en el que dicho
5 riesgo de desarrollar accidentes cardiovasculares acompañados de insuficiencia cardiaca está relacionado con un periodo pronóstico de 12 meses.
4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 2 a
3, en el que dicha insuficiencia cardiaca es insuficiencia 10 cardiaca de acuerdo con las clases I, II o III de la NYHA.
5. El método de cualquiera de la reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha insuficiencia cardiaca es una insuficiencia cardiaca crónica.
6. El método de cualquiera de la reivindicaciones 1 a 15 5, en el que dicho sujeto es un humano.
7. La utilización del BNP maduro de 32 aminoácidos en una muestra de orina de un sujeto para la clasificación de la insuficiencia cardiaca en las clases I, II, III o IV de la NYHA.
20 8. La utilización del BNP maduro de 32 aminoácidos en una muestra de orina de un sujeto para predecir si dicho sujeto está en riesgo de desarrollar insuficiencia cardiaca.
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