CN101460852A - Mrp8/14水平用于鉴别个体处于急性冠状动脉综合症风险中的应用 - Google Patents

Mrp8/14水平用于鉴别个体处于急性冠状动脉综合症风险中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于确定表现出发展中的急性冠状动脉综合症(ACS)的至少一种症状的个体是否患有急性冠状动脉综合症的风险的方法，包括以下步骤：(a)测量，优选在体外，MRP 8/14的水平，其中(b)如果MRP 8/14的水平至少升高，那么该个体处于患有急性冠状动脉综合症的风险中。本发明另外涉及用于排除表现出发展中的ACS的至少一种症状的个体是否患有ACS的方法、用于评估表现出发展中的ACS的至少一种症状的个体是否没有处于患有ACS的风险中的方法、和用于鉴别表现出发展中的ACS的至少一种症状的个体处于患有ACS的风险中或者没有ACS的方法。

Description

MRP8/14水平用于鉴别个体处于急性冠状动脉综合症风险中的应用
发明领域
本发明涉及标志物用于诊断急性冠状动脉综合症和/或用于排除表现出发展中的急性冠状动脉综合症的至少一种症状的个体是否患有急性冠状动脉综合症的可能性的新应用。此外，本发明描述诊断标志物用于帮助医生在可检测到心肌坏死的标志物之前快速鉴别患有胸痛和/或任何相关临床症状的个体具有急性冠状动脉综合症的新应用。由于这种诊断标志物的新应用，这些个体将优先受益于快速和早期的治疗，产生改进的效果。
发明背景
冠状动脉性心脏病(CHD)仍是西方世界死亡率的最常见原因。
冠状动脉性心脏病，也称为冠状动脉病(CAD)和动脉粥样硬化性心脏病，是包括数种对患者而言表现出不同风险率的冠状动脉心脏事件的通称，需要不同的治疗而且在检查中分别表现出对个体不同的监管级别。
患有冠状动脉性心脏病的个体可以分为没有表现出临床症状的个体和表现出胸痛和其它症状(例如气促)的那些。后一组可以分为具有稳定型心绞痛(SAP)的个体和具有急性冠状动脉综合症(ACS)的那些。ACS患者会表现出不稳定型心绞痛(UAP)或心肌梗塞(MI)。
血管内和管腔内和妨碍心肌供血的过程与CHD的宽临床频谱有关。动脉粥样硬化斑的急性破裂是CAD的严重并发症，这是由于可能发生具有总冠状动脉闭塞和大临床事件(例如ACS，包括MI和死亡)的风险的冠状动脉内血栓的形成(Fuster等，1999)。近来，在观察到炎症标志物是没有心脏血管疾病证据的患者中心脏血管事件的独立预测物的支持下，已经提出炎症是动脉粥样斑破裂的可能原因(Ridker等，2000；Cesari等，2003)。此外，在急性冠状动脉综合症中，各种炎症标志物的水平提高了(De Lemos等，2003；Liuzzo等，1994；Liuzzo等，1999)。
随着大约20年前引入临床实践，对血清肌钙蛋白的测定已经导致在动脉粥样斑破裂的病人的检测中有了大的改进(Cummins等，1987；Katus等，1989)。肌钙蛋白是心肌坏死的高敏感度和特异性的标志物。因此，肌钙蛋白水平的测定确定为用于分析心肌梗塞的有用工具，而且已经成为医生的例行步骤。
然而，主要的仍未解决的问题是在诊断上还不能达到区别非心脏性胸痛或症状(由于是稳定型CAD)和ACS或即将来临的MI，这样无法将急诊室中的患者分成具有稳定型CAD的那些和具有动脉粥样斑侵蚀、动脉粥样斑破裂、冠状动脉血栓症和继发严重心脏血管事件(例如MI)的风险的具有不稳定型CAD的那些。
肌钙蛋白本身并非源自动脉粥样硬化病灶。其在血清中的检测可以反映微观梗死，这是由于病灶内容的栓塞形成和血栓性物质进入心脏微循环中和因此肌钙蛋白也可以指示动脉粥样斑破裂。但肌钙蛋白仅是反应已经进行的心肌坏死的动脉粥样斑破裂而非破裂的冠状动脉病灶的间接指示物。事实上，许多最初表现出胸痛和重复性阴性肌钙蛋白的患者在接下来的30天内具有大的心脏事件，例如心肌梗塞或死亡(Hamm等，1997)。
心肌坏死的指示物作为ACS的标志物也具有如下缺点：它们需要从症状发作开始至少2-3小时来变得可被检测和进而代表心肌破坏，这对接受诊断具有负面影响(Newby等，2001；Alpert等，2000)。
存在对局部炎症过程的早期和更特异性的标志物的紧急临床需求，该标志物允许早期诊断ACS或即将来临的MI，并分离急诊室中的具有源自稳定型CAD的非心脏性胸痛或症状的病人。事实上，已经确定立即冠状动脉血管造影术和初步经皮冠状动脉介入是ACS和MI的当然治疗选择(Widimsky等，2003)，而其延展到具有稳定型CAD和非典型性胸痛的患者则代表了对昂贵急诊资源的不当分配。
WO2004/057341公开了蛋白质钙防卫蛋白用作在心脏血管疾病症状发作之前(也即，在无症状的个体内)的心脏血管疾病的潜在或倾向的有用标志物或指示物。钙防卫蛋白也称作骨髓相关蛋白质8/14复合体(MRP 8/14)、白细胞蛋白质L1复合体、移动抑制因子(MIF)相关蛋白质或囊肿性纤维化抗原，是两种钙结合蛋白质S100A8和S100A9(也称作MRP8和MRP14或钙粒蛋白(calcranulin)A和B)的杂二聚物。其是噬菌细胞活动的标志物(Murao等，1994；Hansson，2005)，具有多种功能，包括钙依赖信号发送、细胞分化、细胞周期进行和细胞骨架-膜相互作用(Schafer等，1996)。MRP8和MRP14主要在骨髓来源的细胞中表达，在单核细胞中占所有胞质蛋白质的1％，在嗜中性粒细胞中占至多30～60％(Hessian等，1993)。然而，一旦这些噬菌细胞激活(会导致细胞内钙的增加并激活蛋白激酶C)，现有细胞质的MRP8和MRP14会快速生成MRP 8/14，其移动到细胞骨架和原生质膜，最终分泌出来(Teigelkamp等，1991；Rammes等，1997；Stroncek等，2005)。这通常是在跨内皮迁移以及MRP 8/14表达性噬菌细胞(例如循环的嗜中性粒细胞和早期分化阶段的单核细胞)而非组织巨噬细胞和激活内皮的相互作用过程中发生的(Odink等，1987；Bhardwaj等，1992；Eue等，2000；Frosch等，2000)。因此，MRP 8/14被证实为最小化炎症活性的指示物，提供其他炎症标志物无法得到的另外信息(Foell等，2004)。特别在例如关节炎、慢性肺炎和肠道疾病以及急性肾同种异体移植排斥的非感染性炎症疾病中，MRP 8/14是用于监控疾病活性和治疗反馈的非常敏感的参数(De Rycke等，2005；Roth等，1992；Rugveit等，1994；Burkhardt等，2001)。依照WO2004/057431，已经发现在心脏血管疾病症状的发作对于个体或第三方(例如医生)是显而易见的之前，在多种体液中异常高的MRP 8/14水平指示着心脏血管疾病的易感性。
Healy等(2006)描述了来自具有急性ST片段升高心肌梗塞(STEMI)或稳定性冠状动脉病的患者的血小板mRNA的表达形式。作者发现MRP 14表达——代表与杂二聚体MRP 8/14不同的另一种生化实体——在STEMI之前升高，而且，考虑在明显健康的女人中的预期的嵌套式案例-对照研究(n＝255案例-对照对)，作者发现在健康个体中现在是杂二聚体的MRP 8/14的血浆浓度的升高预示了未来心脏血管疾病的风险。然而，可以认为是本发明最接近的现有技术的WO2004/057341和Healy等(2006)都没有公开MRP 8/14作为确定表现出胸痛的个体是否已经患有ACS以及因此将在近期患上心脏血管疾病的标志物。而是两者都要求一般性的风险分层，都没有给出数据来证实将显示出正在发展成心肌梗塞的急性冠状动脉综合征症状的患者与具有稳定型冠状动脉病或没有冠状动脉病理的患者区分开。
因此，本发明所要解决的技术问题是提供如下方法：使用具有潜力在显示出CHD早期症状的个体中识别ACS(也即，例如动脉粥样斑块不稳定)的局部脉管过程的早期敏感标志物，或者在发生不可逆转的临床事件和可检测到心肌坏死的血清标志物之前，或者在这种事件已经发生的情况下，以用比任意已知标志物更高的敏感度更早检测到它们。使用这种早期的、敏感性标志物的方法应当可以分别排除表现出发展中的冠状动脉综合症的一种或多种症状的个体是否患有急性冠状动脉综合症的可能性和风险。因此，该个体将受益于尽快的根据需要的适当治疗。这会有助于健康管理中经济的资源利用。
发明内容
本发明的目的是用于确定表现出发展中的急性冠状动脉综合症(anevolving acute coronary syndrome)的至少一种症状的个体是否患有急性冠状动脉综合症的风险的方法，包括以下步骤：(a)测量(优选在体外)MRP 8/14的水平，其中(b)如果MRP 8/14水平至少升高，那么该个体处于患有急性冠状动脉综合症的风险中。用于排除表现出发展中的急性冠状动脉综合症的至少一种症状的个体是否患有急性冠状动脉综合症的可能性的方法也在本发明的范围内。本发明的另一目的是用于评估表现出发展中的急性冠状动脉综合症的至少一种症状的个体是否不处于患有急性冠状动脉综合症的风险中的方法和用于鉴别表现出发展中的急性冠状动脉综合症的至少一种症状的个体处于患有急性冠状动脉综合症的风险中和/或没有急性冠状动脉综合症的方法。
包括用于测量MRP 8/14的装置或试剂的试剂盒也在本发明的范围内，其中该试剂盒包括用于解释与确定个体患有急性冠状动脉综合症的风险相关的任何测量结果的用户手册，以及包括用于测量MRP 8/14的装置或试剂的试剂盒用于确定个体患有急性冠状动脉综合症的风险的应用也在本发明的范围内。本发明帮助医生在可检测到心肌坏死的标志物之前快速鉴别哪些患有胸痛和/或任何相关临床症状的个体具有急性冠状动脉综合症。由于这种诊断标志物的新应用，这些个体将优先受益于快速和早期的治疗，产生改进的效果。
附图说明
图1：在具有ACS的患者中用临时阻塞和抽吸系统进行的全身和局部取样。
图2：与取自大动脉的全身性数值相比，在肇事病灶(culprit lesion)位置的MRP 8/14血清浓度。局部水平明显升高(n＝7；p<0.05)。肇事病灶是对ACS负责的主要病灶。肇事病灶是动脉粥样斑破裂、动脉粥样斑侵蚀和/或血栓形成的结果。
图3：在依照冠状动脉血管造影分类的三种不同组患者中MRP 8/14的全身性浓度(大动脉)：左边是没有冠状动脉病迹象的患者(无CAD)。中间是具有稳定型冠状动脉病的患者(稳定型CAD)。右边是具有冠状动脉病和至少一种清晰可辨的由形态学方面、冠状动脉内部血栓块和局部流动受限定义的肇事病灶的患者(非稳定性CAD)。与另外两组相比，具有非稳定性冠状动脉病的患者显示出明显提高的MRP 8/14水平。
图4：用于检测处于急性冠状动脉综合症风险中的患者的针对MRP8/14的接受器工作特征(receiver-operating-characteristic，ROC)。ROC曲线是用于量化医疗测试精确度的通用方法。其指示了对于所有可能的阈值，真实阳性结果的概率作为假阳性结果的概率的函数。该ROC曲线提供了测试精确度的两个重要指标：边界值(具有最高敏感度和特异性的阈值)和曲线下的面积(AUC)。对于MRP 8/14，边界值为8.0mg/L，具有95％的敏感度和92％的特异性。AUC为0.97。
图5：显示出升高的MRP 8/14和心肌坏死传统标志物的水平的ACS患者百分比和从症状发作到提取血样的时间(h；小时)的关系。用于这三个不同的时间间隔分别的患者数量为4、11和9。
具体实施方式
令人惊奇地，我们发现该骨髓相关蛋白质8/14复合物(MRP 8/14)可以用于从显示出发展中的急性冠状动脉综合症(ACS)的任何症状的个体中识别出那些具有患有ACS可能性的患者，由此排除那些没有ACS的个体。这例如可以将急诊室中出现的患者分成具有稳定型冠状动脉病(CAD)或具有正常冠状动脉的没有心脏性胸痛的那些，和患有ACS和潜在进一步严重的心脏血管病症(例如MI)的那些。
本发明的目的是通过用于确定表现出发展中的ACS的至少一种症状的个体是否患有ACS的风险的方法实现的，其包括以下步骤：
a.测量(优选在体外)MRP 8/14或其变体的水平，其中
b.如果MRP 8/14或其变体的水平至少升高，那么该个体处于患有ACS的风险中。
此外，本发明的目的是通过用于确定表现出发展中的ACS的至少一种症状的个体是否患有ACS的风险的方法实现的，其包括以下步骤：
a.测量(优选在体外)MRP 8/14或其变体的水平，
aa.测量(优选在体外)心肌坏死的标志物和/或炎症标志物和/或金属蛋白酶或其变体的水平，其中
ba.如果心肌坏死的标志物和/或炎症标志物和/或金属蛋白酶与MRP 8/14两者，或其各自变体的水平至少升高，那么该个体处于患有ACS的风险中。
本发明的实施方式包括用于确定表现出发展中的急性冠状动脉综合症的至少一种症状的个体是否患有急性冠状动脉综合症的风险的方法，其包括以下步骤：
a.测量，优选在体外，MRP 8/14或其变体的水平，其中
b.如果MRP 8/14或其变体的水平相当于至少8.0mg/L的血清水平，那么该个体处于患有急性冠状动脉综合症的风险中。
术语“发展中的ACS的症状”是本领域的技术人员已知的。“显示出发展中的ACS的至少一种症状”的个体是指例如表现出正在进行的或起伏不定的静止中胸痛(收缩、挤压、压抑、压缩、窒息、vise-like)，有时结合有消化不良(indisgestion)(Messerli等，2005)、恶心、呕吐、虚弱、眩晕、心悸、冷汗、气促的个体，以及表现出通常认为是非典型胸痛症状(锐痛或刀割似的疼痛，可能位于一个手指尖端的疼痛、胸部随着胸部运动重复的疼痛、连续维持许多小时的疼痛、延续几秒或更短时间的非常短期的疼痛、辐射到下肢的疼痛)的个体。后者疼痛情况需要与典型疼痛一样仔细地评估。患者可能出现在私人诊所中或在急诊室中。术语“显示出症状”、“患有症状”以及其他用于具有症状的同义语预期在本发明的范围内。
本发明的实施方式涉及用于确定表现出气促和/或胸痛的个体是否患有ACS的风险的方法，其包括以下步骤：
a.测量，优选在体外，MRP 8/14或其变体的水平，其中
b.如果MRP 8/14或其变体的水平至少升高，那么该个体处于患有ACS的风险中。
依照本发明，在个体中测定的MRP 8/14水平可以确定个体是否可能患有ACS的风险。更特别地，MRP 8/14的提高水平表明该单独的个体处于患有ACS的风险中。另一方面，没有升高的MRP 8/14水平表示该单独的个体没有处于患有ACS的风险中，即该单独的个体分别没有患有ACS或没有ACS。
因此，通过测定MRP 8/14的水平，可以将个体分到特定的风险组，例如具有患有ACS风险的那些个体和没有患有ACS的那些个体。
因此，本发明的另一方面是用于排除表现出发展中的ACS的至少一种症状的个体是否患有ACS的可能性的方法，包括以下步骤：
a.测量，优选在体外，MRP 8/14或其变体的水平，其中
b.如果MRP 8/14或其变体的水平没有升高，那么该个体没有患有ACS。
此外，本发明的目标通过用于评估表现出发展中的ACS的至少一种症状的个体是否没有处于患有ACS的风险中的方法而实现，其包括以下步骤：
a.测量，优选在体外，MRP 8/14或其变体的水平，其中
b.如果MRP 8/14或其变体的水平没有升高，那么该个体没有处于患有ACS的风险中。
用于鉴别表现出发展中的ACS的至少一种症状的个体处于患有ACS的风险中或者没有ACS的方法也在本发明的范围内，其包括以下步骤：
a.测量，优选在体外，MRP 8/14或其变体的水平，其中
b.如果MRP 8/14或其变体的水平至少升高，那么该个体处于患有ACS的风险，
c.如果MRP 8/14或其变体的水平没有升高，那么该个体没有ACS。
本发明的实施方式涉及前述的任意方法，其中没有升高的MRP 8/14水平相当于小于8.0mg/L的血清水平。
本发明的另一方面是MRP 8/14或其变体用于确定表现出发展中的ACS的至少一种症状的个体是否患有ACS的风险的应用，其包括以下步骤：
a.测定，优选在体外，MRP 8/14或其变体的水平，其中
b.如果MRP 8/14或其变体的水平至少升高，那么该个体处于患有ACS的风险中。
本发明的另一方面是MRP 8/14或其变体用于排除表现出发展中的ACS的至少一种症状的个体是否患有ACS的可能性的应用，其包括以下步骤：
a.测定，优选在体外，MRP 8/14或其变体的水平，其中
b.如果MRP 8/14或其变体的水平没有升高，那么该个体没有患有急性冠状动脉综合症。
前述方法或MRP 8/14的应用中的一种也在本发明的范围内，其中如果该方法显示风险至少提高，那么表明应当在没有不当延误的情况下和/或在医院中进行冠状动脉加强看护。
冠状动脉加强看护包括例如心脏监视、ECG和生化参数的一系列评估、标准给药(例如阿司匹林、硝酸盐、镇痛药、氯吡格雷等)、冠状动脉血管造影术、和经皮冠状动脉介入(如果适当)。
前述方法或MRP 8/14的应用中的一种也在本发明的范围内，其中如果该方法显示个体没有ACS，则表示该个体可以以其它方式治疗，例如可以分送到可能在其当地的普通医生处进行胸痛的可选的、非侵入式鉴别诊断(例如运动负荷试验)。即，该个体将不经过冠状动脉加强看护，例如该个体可以尽可能快地进行进一步的可选的非心脏或心脏检查。因此，该个体将受益于尽快的根据需要的适当治疗。这将有助于健康管理中经济的资源利用。
在本发明的内容中，已经认识到MRP 8/14的水平提供了指示患有ACS的风险的信息。特别地，已经认识到如果MRP 8/14水平没有升高，那么个体患有ACS的风险可以排除。
已经认识到，与心肌坏死的指示物(例如肌钙蛋白)的水平相反，MRP 8/14的水平取决于在动脉粥样斑破裂和早期血栓形成之前和之中的局部过程。在动脉粥样硬化中和特别是在稳定的动脉粥样硬化斑进入脆弱的病灶中的病原链中，发炎细胞(值得一提的是表达MRP 8/14的噬菌细胞)的复原是至关重要的。因此，MRP 8/14的水平似乎是指示与全身动脉粥样硬化负担无关的活性动脉发炎过程是否存在于个体中。本发明认识到能够将MRP 8/14水平提供的信息应用于风险预测的过程中。
与此相反，心肌坏死的指示物(例如肌钙蛋白)的水平仅是反映已经正在进行的心肌坏死而非已经破裂的冠状动脉病灶的斑块破裂的间接指示物。还应当指出的是，许多最初表现出胸痛和重复性阴性肌钙蛋白的患者在接下来的30天内具有大的心脏事件，例如心肌梗塞或死亡(Hamm等，1997)。此外，心肌坏死的指示物作为ACS的标志物也具有以下缺点：其从症状发作开始需要至少2-3小时以使其可检测到和进一步代表心肌损害，这对预测具有负面影响(Newby等，2001；Alpert等，2000)。因此，仅对心肌坏死的指示物(例如肌钙蛋白)的水平的测量可能导致多个关于ACS的风险的假阴性结果。然而，在本发明的上下文中，已经认识到MRP 8/14的水平与心肌坏死标志物和/或炎症标志物和/或金属蛋白酶的水平可以组合、同时或非同时测量，以确定个体是否将患有ACS的风险。已经认识到MRP 8/14与心肌坏死标志物和/或炎症标志物和/或金属蛋白酶提供的信息可以有利地互相补充，因此可以提供改进的风险确定。
有利地，本发明将允许将个体分配到不同的进一步治疗位置，即冠状动脉加强看护。例如，本发明显示增加的风险的个体将优选在在ACS情况下提供改进的介入预防的环境中进一步治疗。这种个体也可以通过例如心脏监视、ECG和生化参数的一系列评估、标准给药(例如阿司匹林、硝酸盐、镇痛药、氯吡格雷等)、冠状动脉血管造影术、和经皮冠状动脉介入治疗(如果合适)，以降低患ACS的风险。相反，依照本发明的方法显示没有患ACS的风险的个体可以以其它方式治疗，例如可以分送到可能在其当地的普通医生处进行胸痛的可选的、非侵入式鉴别诊断(例如运动负荷试验)。因此，该个体将受益于尽快的根据需要的适当治疗。这将有助于健康管理中经济的资源利用，因此最后但并非最不重要地导致在健康管理系统中明显的成本节约。
本发明利用了某些生物标志物，特别是“生化标志物”和“分子标志物”。生物标志物是本领域技术人员已知的。该术语涉及取决于某种状态、疾病或并发症的存在或不存在而不同地存在(即以升高或降低的水平存在)于个体中的分子。术语“生化标志物”和“分子标志物”是本领域技术人员已知的。特别地，生化或分子标志物是基因表达产物，其在某种状态、疾病或并发症的存在或不存在下不同地存在的(例如通过表达或转换(turnover)的升高或降低水平)。通常，分子标志物定义为核酸(例如mRNA)，而生化标志物为蛋白质或肽。适合的生物标志物的水平可以指示特定状态、疾病或风险的存在或不存在，并由此可以诊断或确定该状态、疾病或风险。
本发明特别利用MRP 8/14与心肌坏死标志物和/或炎症标志物和/或金属蛋白酶作为生化标志物。
骨髓相关蛋白质8/14复合物(MRP 8/14)是本领域技术人员公知的。MRP 8/14也称作钙防卫蛋白、白细胞蛋白质L1复合体、移动抑制因子(MIF)相关蛋白质或囊肿性纤维化抗原，以二聚和多聚形式存在。作为二聚物，MRP 8/14包括多肽链S100A8和S100A9(也称作MRP8和MRP14或钙粒蛋白(calcranulin)A和B)。作为三聚物，MRP 8/14是具有非共价键合的两种重链(14kD)和一种轻链(8kD)的36kDa杂三聚物蛋白。MRP 8/14是噬菌细胞活化的标志物(Murao等，1994；Hansson，2005)，具有多种功能，包括钙依赖性信号发生、细胞分化、细胞周期进行和细胞骨架-膜间相互作用(Schafer等，1996)。MRP8和MRP14主要在骨髓来源的细胞中表达，在单核细胞中占所有胞质蛋白质的1％和在嗜中性粒细胞中占不超过30～60％(Hessian等，1993)。
依照本发明的心肌坏死标志物和/或炎症标志物和/或金属蛋白酶包括肌红蛋白、肌酸激酶、肌酸激酶-MB(CK-MB)、肌钙蛋白T和I、C活性蛋白质(CRP)、白细胞介素6(II-6)、血清淀粉状蛋白A(SAA)、髓过氧物酶、可溶性CD40配体(sCD40L)、妊娠相关血浆蛋白质A(PAPP-A)。依照本发明的最优选的标志物是肌红蛋白、肌酸激酶、CK-MB、肌钙蛋白T和肌钙蛋白I。
在本发明的上下文中的术语“变体”涉及与所述蛋白质或肽基本类似的蛋白质或肽。本领域技术人员对术语“基本类似”有很好的理解。特别地，变体可以是与人群中最普遍的肽同工型的氨基酸序列相比显示氨基酸交换的同工型或等位基因。优选，这种基本类似的肽具有与蛋白质和肽的最普遍同工型的至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、最优选至少95％类似的序列。基本类似的还是降解产物，例如蛋白水解降解产物，其仍可通过诊断手段或针对各自全部长度的蛋白质或肽的配体所识别。该术语“变体”还表示涉及剪接变体。该术语“变体”还涉及翻译后改性的肽，例如糖基化肽。“变体”也是在样品的收集之后改性的肽，例如通过标记，特别是放射性或荧光标记与该肽共价或非共价结合。
本发明还包括组合、同时或非同时测量不同标志物。特别地，本发明涉及对MRP 8/14与心肌坏死标志物和/或炎症标志物和/或金属蛋白酶(特别是肌红蛋白、肌酸激酶、CK-MB、肌钙蛋白T和肌钙蛋白I)的组合进行测量。依照本发明，可以将任何其他标志物与MRP 8/14组合测定。这种标志物的实例包括肌红蛋白、肌酸激酶、CK-MB、肌钙蛋白T和I、CRP、II-6、SAA、髓过氧物酶、sCD40L、PAPP-A。
本发明允许确定(或用于对其进行预测)表现出发展中的ACS的至少一种症状的个体是否患有ACS的风险。该术语ACS(“急性冠状动脉综合症”)是本领域技术人员已知的。在本发明的上下文中，该术语ACS包括不稳定型心绞痛、非STEMI和STEMI。
本发明的实施方式涉及上述方法或MRP 8/14的应用中的一种，其中该ACS是作为脉管情况(例如动脉粥样硬化斑破裂、动脉粥样硬化斑侵蚀和/或血栓块形成)的结果发生的ACS。
术语“动脉粥样硬化斑破裂”(在本文的上下文中也简称作“斑块破裂”)以及术语“动脉粥样硬化斑侵蚀”和“血栓形成”是本领域技术人员已知的。动脉粥样硬化斑包含在动脉壁之内的巨噬细胞和其他白血细胞的异常发炎聚集作为大量部分。这些解剖学上的病灶通常开始于儿童晚期，远早于10岁，并随时间发展。静脉不发展动脉粥样化，除非如同在旁路手术中通过手术移用作动脉。该累积通常在动脉管道的内皮里层和平滑肌肉壁之间。尽管早期阶段通常被病理学者根据总的外观将其称作脂肪条纹，但其并不由脂肪(即脂肪细胞)构成。在心脏或动脉问题的情况中，动脉粥样硬化斑通常称作“斑块”。在病理学上，该动脉粥样硬化斑分为三种不同组分：1.粉瘤(“粥样结块”，源自Athera，其是希腊语中的粥)是在大斑块中心位置的柔软的、片状的、微黄色物质的瘤状聚集物，由最靠近动脉管腔的巨噬细胞构成，有时具有2.下层面积的胆固醇结晶物和可能的3.在年长的/晚期病灶的外底部的钙化物。血管造影研究已经确定肇事病灶不会造成明显狭窄，现在证明了是通过叠合血栓的形成使斑块活化而不是狭窄引发了梗塞。在大多数情况下，阻塞血栓块的形成源于动脉粥样斑的破裂、将血栓块物质(磷脂、组织因子、和血小板粘合基质分子)从该动脉粥样斑的核心暴露到血液。冠状动脉血栓症的另一个原因是内皮侵蚀、动脉粥样斑裂缝，在一些情况下可以涉及冠状动脉痉挛。斑块破裂优先发生在该粉瘤的纤维帽薄且免疫系统的活化细胞多的位置。在这种位置，炎症介体和来自活化免疫细胞的蛋白水解酶的结合释放可以弱化该纤维帽并将稳定的斑块转变成脆弱的、不稳定的斑块，其会破裂，引起冠状动脉血栓，并引起ACS。本发明还允许排除显示出发展中的ACS的至少一种症状的个体是否患有ACS的可能性，或者辨别显示出发展中的ACS的至少一种症状的个体是否处于患有ACS的风险中或没有ACS。
没有ACS的个体可能是显示出发展中的ACS的至少一种症状且具有例如心包的、肌与骨骼的、胃肠的、肺部的、精神-植物性的(psycho-vegetative)和精神病学的综合症，特别是没有潜在急性炎症疾病的个体。这种个体将经过相关诊断(例如胃镜检查或CT扫描)和技术人员已知的足够的治疗，例如在精神-植物性症状的情况下的再次确保和药理学镇静作用。如果MRP 8/14的水平没有升高，患者将不经过冠状动脉加强看护，但可以依照其症状经过进一步的、可选的的非心脏或心脏检查。
没有ACS的个体还可以是显示出发展中的ACS的至少一种症状且不患有任何状况的个体，即显示出正在发展中的ACS的至少一种症状的健康个体。
术语“没有ACS的个体”的上述定义也适用于没有患有ACS的个体和没有处于ACS风险中的个体。已经还发现本发明同样地提供了诊断信息。例如，如果本发明的方法指示ACS风险升高，那么该个体可以经过进一步的冠状动脉加强看护。另一方面，如果依照本发明的方法指示没有ACS风险，那么该个体可以作为如上述所示治疗。依照本发明的个体可以是任何经历过(或目前正在经历)心脏血管机能障碍的症状(例如胸痛(心绞痛)、呼吸急促(呼吸困难)、心悸)的个体或患者。特别地，患者可以是显示出症状的个体，所述症状将依照稳定型心绞痛的Canadian Cardiovascular Society(CCS)分类(Campeau，1976)和/或不稳定型心绞痛的Braunwald and Hamm分类(Braunwald，1989；Hamm and Braunwald，2000)将其分类为具有心绞痛。
该CCS分类区分为4类，具体如下所示。第I类：正常身体活动不会造成心绞痛，例如走路、爬楼梯。由于在工作或娱乐时的紧张、快速或长期的发力发生心绞痛。第II类：正常活动的轻微限制。心绞痛发生在快速走路或爬楼梯、爬山、餐后走路或爬楼梯、或遇冷、遇风、或在情绪压力下、或仅在睡醒后的几小时内。以正常步伐和在正常条件下水平走路超过两个街区和爬楼超过正常楼梯的一段。第III类：正常身体活动收到明显限制。心绞痛发生在以正常步伐和在正常条件下水平走路一个到两个街区和爬楼梯的一段。第IV类：无法舒适地进行任何身体活动——休息时也可能出现心绞痛症状。具有ACS的患者通常表现为CCS第IV类。
不稳定型心绞痛的Braunwald和Hamm分类区分为3类和3种相关临床状况，具体如下所示。第I类：初见发作剧烈或加速心绞痛。具有剧烈或频繁的(>3次/天)的初见发作(持续<2月)劳力型心绞痛的患者，或者具有发展为加速心绞痛(即明显更频繁、急性、持续更长时间，或由较前明显减少的劳力促发的心绞痛)的慢性稳定心绞痛但在最近2月内静止状态没有经历疼痛的患者。第II类：静止时亚急性心绞痛。在前月中有一次或多次静止时心绞痛但在前48小时内没有。第III类：静止时急性心绞痛。在前48小时内具有一次或多次静止时心绞痛。在第II和III类中，第I类所述的表现也可能发生。当患者已经无症状或患有已经稳定超过2个月的心绞痛时，不再认为存在不稳定型心绞痛。不稳定型心绞痛发生的相关临床情况分为第A-C类，具体如下所示。第A类：次生不稳定型心绞痛。具有源自清楚识别的症状的次生型不稳定心绞痛的患者，其中所述清楚识别的症状是冠状动脉血管床之外的具有增强的心肌局部缺血的。这种状况降低了心肌供氧或提高了心肌需氧，包括贫血、发烧、感染、低血压、无控高血压、快速性心律失常、不正常情绪压力、甲状腺机能亢进和呼吸衰弱次生的血氧不足。第B类：原发型不稳定型心绞痛。在没有如第A类中所述具有增强局部缺血的心外状况的情况下发生不稳定性心绞痛的患者。第C类：梗塞后不稳定型心绞痛。在文件记录的急性心肌梗塞后前2周内患上不稳定型心绞痛的患者。
特别需要管理表现出依照Braunwald and Hamm分类的症状且具有ACS的患者用于进一步诊断和治疗，和排除具有Braunwald and Hamm分类可能误认的症状且没有ACS的患者。
有利地，本发明允许在这些患者群中鉴别具有风险的患者。在由这些患者所得到的样品中，应当优选测量MRP 8/14以确定ACS风险。
可以用于测定各种肽的水平的方法和诊断装置是本领域技术人员已知的。这些方法包括基于微型板ELISA的方法、全自动或机器人控制免疫测定(例如可获自ElecsysTM分析仪)、CBA(酶的Cobalt BindingAssay，例如可获自Roche-HitachiTM分析仪)和乳胶凝集测定(可获自例如Roche-HitachiTM分析仪)。
此外，本领域的技术人员熟知测量肽或多肽水平的不同方法。术语“水平”涉及肽或多肽在个体或取自个体的样品中的量或浓度。
依照本发明的术语“测量”涉及确定，优选半定量或定量地，蛋白质、肽、多肽或其他感兴趣物质的量或浓度。在本发明的上下文中的特别感兴趣的蛋白质或肽是骨髓相关蛋白质8/14复合物(MRP 8/14)与心肌坏死标志物和/或炎症标志物和/或金属蛋白酶。MRP 8/14和心肌坏死标志物和/或炎症标志物和/或金属蛋白酶的水平可以通过定量、半定量和定性方法以及所有其他测量MRP 8/14和心肌坏死标志物和/或炎症标志物和/或金属蛋白酶的方法测量。例如，认为仅检测MRP 8/14和心肌坏死标志物和/或炎症标志物和/或金属蛋白酶在怀疑包含MRP 8/14与心肌坏死标志物和/或炎症标志物和/或金属蛋白酶的样品中是否存在的方法也包括在本发明的范围内。术语“检测”、“监控”和“确定”以及其他用于测量的通用同义词都考虑在本发明的范围内。
测量可以直接或间接进行。间接测量包括测量细胞响应、结合配体(bound ligand)、标记、或酶反应产物。
在本发明的上下文中，量也涉及浓度。由感兴趣物质在已知量的样品中的总量，显然可以计算出该物质的浓度，反之亦然。
测量可以依照本领域中的任何已知方法进行。以下描述了优选的方法。
在优选实施方式中，该用于测量感兴趣的蛋白质、肽或多肽的水平的方法包括以下步骤：(a)使能够对该蛋白质、肽或多肽起细胞响应的细胞与该蛋白质、肽或多肽接触足够长时间，(b)测量该细胞响应。
在另一优选实施方式中，该用于测量感兴趣的蛋白质、肽或多肽的水平的方法包括以下步骤：(a)使蛋白质、肽或多肽与适合的底物接触足够长时间，(b)测量产物量。
在另一优选实施方式中，该用于测量感兴趣的肽或多肽的水平的方法包括以下步骤：(a)使蛋白质、肽或多肽接触特异性的结合配体，(b)(任选地)将未结合的配体去除，(c)测量结合的配体的量。
优选地，该蛋白质、肽或多肽包含在样品中，尤其是体液或组织样品中，测量该蛋白质、肽或多肽在该样品中的量。
蛋白质、肽和多肽可以在组织、细胞和体液样品中测量，即，优选在体外测量。优选地，感兴趣的蛋白质、肽或多肽是在体液样品中测量的。
依照本发明的组织样品是指获自人或动物体的尸体或活体的任何类型的组织。组织样品可以通过本领域技术人员已知的任何方法，例如通过活组织检查或刮除术获得。
依照本发明的体液可以包括血液、血清、血浆、淋巴、脑液、唾液和尿液。特别地，体液包括血液、血清、血浆和尿液。本发明的实施方式涉及血液中(优选血清和/或血浆中)的MRP 8/14的测量。如果需要可以对该样品进行预处理，其可以在任何方便的不会干扰该测量的介质中制备。体液的样品可以由本领域的任何已知方法得到。
本发明的另一实施方式涉及用于确定个体是否将患有ACS的风险的方法，包括以下步骤：
a.测量血清和/或血浆中MRP 8/14或其变体的水平，该血清和/或血浆优选是从外周循环血液中提取的，其中
b.如果MRP 8/14或其变体的水平至少提高，那么该个体至少存在患ACS的风险。
用于获得细胞样品的方法包括直接制备单细胞或小的细胞组、分离组织(例如使用胰岛素或胶原酶)、和从体液中分离细胞(例如通过过滤或离心)。依照本发明的细胞包括血小板和其他非核细胞，例如红血球。如果需要，可以对该样品进一步处理。特别地，可以依照本领域的已知方法(包括过滤、离心或萃取方法，例如氯仿/苯酚萃取)从该样品中提纯蛋白质、肽或多肽。
为了测量细胞响应，将该样品或经处理的样品添加到细胞培养物中，测量内部或外部细胞响应。该细胞响应可以包括报道基因的表达或物质(例如蛋白质、肽、多肽或小分子)的分泌。
其它优选的测量方法可以包括测量与该感兴趣的蛋白质、肽或多肽特异性结合的配体的量。依照本发明的结合包括共价和非共价结合。依照本发明的配体可以是任何与该感兴趣的蛋白质、肽或多肽结合的任何蛋白质、肽、多肽、核酸或其他物质。已知蛋白质、肽或多肽如果获自或提纯自人体或动物体，可以通过例如糖基化进行改性。依照本发明的适合的配体可以专门或另外通过这种位点结合该蛋白质、肽或多肽。
优选地，该配体应该特异性与该待测量的蛋白质、肽或多肽结合。依照本发明的“特异性结合”是指该配体基本不应当与调查样品中存在的其他蛋白质、肽、多肽或物质结合(与其“交叉反应”)。优选地，该特异性结合的蛋白质或同种型的亲和性应当是任何其他相关蛋白质、肽或多肽的至少3倍高、更优选至少10倍高、甚至更优选至少50倍高。
非特异性结合可以是可容忍的，特别是如果该调查的蛋白质、肽或多肽仍能够辨别和明确测量(例如依照其尺寸(例如在Western Blot上)或通过其在样品中相对较高的量)。
配体的结合可以通过本领域的任何已知方法测量。优选地，该方法是半定量的或定量的。以下描述了适合的方法。
首先，可以直接测量配体的结合，例如通过NMR或表面等离振子共振。
其次，如果该配体还用作感兴趣的肽或多肽的酶活性的底物，可以测量酶反应产物(例如可以通过测量分裂的底物的量来测量蛋白酶的量，例如在Western Blot上)。
为了测量酶反应产物，优选使该底物的量饱和。也可以在反应之前为该底物标记可检测的标记。优选地，使该样品与该底物接触足够长的时间。足够长的时间是指制备可检测的(优选可测量的)量的产物所需的时间。作为测量产物量的替代，可以测量给定(例如可检测的)量的产物出现所需的时间。
再次，该配体可以共价或非共价耦连到使得可以检测和测量该配体的标记上。
标记化(labeling)可以通过直接或间接方法进行。直接标记化包括将该标记直接耦连(共价或非共价)到该配体上。间接标记化包括将第二配体结合(共价或非共价)到该第一配体上。该第二配体应当特异性结合到该第一配体上。所述第二配体可以耦连到适当的标记上，和/或可以是与该第二配体结合的第三配体的目标物(受体)。第二、第三或甚至更高级别配体的使用通常用于增强信号。适合的第二和更高级别配体可以包括抗体、二级抗体和公知的链酶抗生物素-生物素系统(VectorLaboratories，Inc.)。
该配体或底物也可以“贴有”本领域中已知的一个或多个标签(tag)。这种标签然后可以是更高级配体的目标物。适合的标签包括生物素、digoxygenin、His-Tag、谷胱甘肽-S-转移酶、FLAG、GFP、myc-标签、流感A病毒血球凝集素(HA)、麦芽糖结合蛋白质等。在肽或多肽的情况下，该标签优选在N-末端和/或C-末端。
适合的标记(label)是任何可由适合的检测方法检测到的标记。典型的标记包括金颗粒、胶乳球、acridan酯、鲁米诺、钌、酶促活性标记、放射性标记、磁性标记(例如磁性球，包括顺磁性和超顺磁性标记)、和荧光标记。酶促活性标记包括例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶及其衍生物。适用于检测的底物包括二氨基联苯胺(DAB)、3，3＇，5，5＇-四甲基联苯胺、NBT-BCIP(4-硝基蓝四唑氯化物和5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸酯/盐，可作为预制储液获自RocheDiagnostics)、CDP-StarTM(Amersham Biosciences)、ECFTM(AmershamBiosciences)。适合的酶-底物组合可以生成带颜色的反应产物、荧光或化学发光，其可以依照本领域已知的方法测量(例如使用光敏膜或适合的照相系统)。至于测量酶反应，类似地应用上面给出的标准。
典型的荧光标记包括荧光蛋白质(例如GFP及其衍生物)、Cy3、Cy5、Texas Red、Fluorescein和Alexa染料(例如Alexa568)。其他荧光标记可获自例如Molcular Probes(Oregon)。也考虑了量子点作为荧光标记的应用。
典型的放射性标记包括35S、125I、32P、和33P等。放射性标记可以由任何已知和适合的方法检测到，例如光敏膜或磷光成像仪。
依照本发明的适合的测量方法还包括沉淀法(特别是免疫沉淀)、电致化学发光(电致化学发光)、RIA(放射免疫测定)、ELISA(酶联免疫吸附测量)、夹层酶免疫测试、电致化学发光夹层免疫测定(ECLIA)、离解增强镧系元素荧光免疫测定(DELFIA)、闪烁亲近测定(SPA)、浊度测量法、比浊法、乳胶增强比浊法或浊度测量法、固相免疫测试、质谱法(例如SELDI-TOF、MALDI-TOF)或毛细管电泳-质谱法(CEMS)。本领域中已知的其他方法(例如凝胶电泳、2D凝胶电泳、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、Western Blotting)可以单独使用或与上述标记化或其他检测方法结合使用。
优选的配体包括抗体、核酸、蛋白质、肽或多肽、和适体(例如核酸和肽适体)。这种配体有关的方法是本领域中已知的。例如，合适抗体或适体的鉴别和制备也是由商业厂商提供的。本领域的技术人员熟知开发具有更高亲和性或特异性的这种配体的衍生物的方法。例如，可以将随机突变引入该核酸、蛋白质、肽或多肽中。这些衍生物然后可以依照本领域已知的筛选方法(例如噬菌体显示)测试其结合。此处所用的术语“抗体”包括多克隆和单克隆抗体，及其任何改性物或片段，例如Fv、Fab和F(ab)2片段，其能够结合抗原或半抗原。
在另一优选实施方式中，该配体(优选选自核酸、蛋白质、肽、多肽，更优选选自核酸、抗体或适体)以阵列形式存在。所述阵列包括至少一种其他配体，其可以针对感兴趣的蛋白质、肽或多肽。所述其他配体也可以针对在本发明的上下文中没有特别兴趣的蛋白质、肽或多肽。优选地，在该阵列上包括针对本发明的上下文中所感兴趣的至少三种、优选至少五种、更优选至少八种蛋白质、肽或多肽的配体。
依照本发明，术语“阵列”是指固相或凝胶状载体，在其上以一维、二维或三维排列连接或结合有至少两种化合物。这种阵列(包括“基因芯片”、“蛋白质芯片”、和抗体阵列等)通常是本领域技术人员公知的，通常产生在玻璃显微镜载片上，特别是带涂层的玻璃载片(例如多具阳离子涂覆、硝基纤维素涂覆或生物素涂覆的载片)、盖片和膜(例如基于硝基纤维素或尼龙的膜)。
该阵列(array)可以包括结合配体或至少两种各自表达至少一种配体的细胞。
还考虑使用“悬浮阵列”作为依照本发明的阵列(Nolan和Sklar，2002)。在这种悬浮阵列中，该载体(例如微珠或微球体)处于悬浮状态。该阵列由不同的携带不同配体的微珠或微球体(可能带标记的)构成。
本发明还涉及包括用于测量MRP 8/14的装置或试剂的试剂盒。任选地，该试剂盒还可以包括用于测量心肌坏死标志物和/或炎症标志物和/或金属蛋白酶或本说明书中提及的任何其他生物标志物(例如肌红蛋白、肌酸激酶、CK-MB、肌钙蛋白T和肌钙蛋白I等)的装置或试剂。这种装置或试剂可以是本领域技术人员已知的任何适合的装置或试剂。在本说明书中给出了这种装置或试剂及其使用方法的实例。例如，适合的试剂可以是任何类型的特别用于分别测量MRP 8/14、或心肌坏死标志物和/或炎症标志物和/或金属蛋白酶的配体或抗体。该试剂盒还可以包括任何其他认为在各种生物标志物的水平的测量中合适的其他部件，例如适合的缓冲物、过滤器等。任选地，该试剂盒另外可以包括用于解释任何测量结果(关于确定个体患有ACS的风险)的用户手册。特别地，这种手册可以包括关于哪种测量的水平对应于哪种风险组的信息。在该说明书中的其他位置对此详细进行了描述。在本发明的实施方式中，该试剂盒包括公开如下内容的用户手册：如果MRP 8/14的升高水平对应于至少8.0mg/L的血清水平，那么该个体处于患有ACS的风险中；和/或如果MRP 8/14的未升高水平对应于小于8.0mg/L的血清水平，那么该个体没有患ACS。此外，这种用户手册可以提供该试剂盒中的用于测量各生物标志物的水平的部件的正确使用方法。
本发明还涉及所述试剂盒用于确定个体是否患有ACS的风险的应用。本发明进一步涉及所述试剂盒在上面所述任一种方法中的应用。优选的实施方式涉及包括用于测量MRP 8/14的装置或试剂的试剂盒用于确定个体患有ACS的风险的应用。本发明的另一实施方式涉及包括用于测量MRP 8/14的装置或试剂的试剂盒用于排除表现出发展中的ACS的至少一种症状的个体是否患有ACS的可能性。依照本发明，MRP 8/14的测量的水平指示了个体是否患有ACS。如果组合测量MRP 8/14与心肌坏死标志物和/或炎症标志物和/或金属蛋白酶的水平，这类似适用。在本文中所用的术语，即“未提高的水平”、“未升高的水平”和“提高的水平”是本领域中已知的。
例如，MRP 8/14通常存在于所有个体中，可以在人体所有部分中的细胞、组织和体液中发现，并根据该蛋白质在各种组织中的功能用途具有生物学上不同的浓度。本领域的技术人员能够确定用于相关标志物的实际数值，并能够定义该“未提高的水平”、“未升高的水平”和“提高的水平”，其通常可以根据取样位置、处理方法和测定所用技术而有某些变化。例如，可以依照60岁以下显然健康个体的代表性样本中观察到的水平百分率来设定该水平(优选该样本包括至少100、更优选至少500、最优选至少1000个个体)。例如，未提高的水平可以对应在97.5％中观察到的最大水平。可替代地，该水平可以确定为本领域中已知的“正常范围”。
也可以通过对显示出至少一种ACS症状的个体进行研究并且将任何心脏血管病症和个体中观察到的水平建立关联，来确定或进一步限定该水平。这种研究也可以允许根据某些患者子群(例如具有已知冠心病的患者、老年患者或仅患有胸痛的个体)来定制该水平。在本说明中所包括的实施例中也可以获得这种研究可以如何进行的指导。
也可以根据所需的敏感性或排除的特异性(严格性)选择认为“升高的”水平值。所需的敏感性越高，该排除的特异性越低，反之亦然。在上述实例中，为确定每一水平选择的百分比越高，排除标准就越严格，即更少的个体会被认为是“风险个体”。依照本发明的方法还允许分别确定个体患有ACS的风险或可能性。依照本发明，术语“风险”或“可能性”涉及特定事件(更特别地为ACS)的可能性。风险级别可以是未提高的、提高的或高度提高的。“未提高的风险”或“没有可能性”表示明显没有患ACS的风险。
风险程度与MRP 8/14(或MRP 8/14与心肌坏死标志物和/或炎症标志物和/或金属蛋白酶)的水平相关。未提高的MRP 8/14水平表明未提高的风险，提高的MRP 8/14水平表明提高的风险，高度提高的MRP 8/14水平表明高度提高的风险。在MRP 8/14与心肌坏死标志物和/或炎症标志物和/或金属蛋白酶的组合测量情况下，类似地计算风险。然而，如果只有一种标记物(即或者MRP 8/14，或者心肌坏死标志物和/或炎症标志物和/或金属蛋白酶)高度提高而另一标志物的水平仅仅是提高，则可以认为足以表明高度提高的风险。
如前所述，如果MRP 8/14的水平没有提高，那么患者不需要紧急的冠状动脉加强监视，而可以依照其症状进行进一步可选的、非心脏的或心脏的检查。在组合测量的情况下，如果不仅MRP 8/14而且心肌坏死标志物和/或炎症标志物和/或金属蛋白酶的水平都未提高，那么这同样适用。
如上所述，如果依照本发明的方法表明了提高或高度提高的风险，那么优选结果是对该个体进一步治疗。
现在用以下实施例或附图对本发明进行更详细的描述，当然本发明不限于所述实施例或附图。
现在用以下实施例或附图对本发明进行更详细的描述，当然本发明不限于所述实施例或附图。
实施例
实施例1：
患者和程序
本研究包含总共116名患者。所有患者都经历冠状动脉血管造影术。从患有ACS的41名患者的动脉粥样斑破裂的位置采集的血栓的免疫组织化学染色的结果产生假设。依照临床症状、血管造影结果和评估的目标物质，对随后连续的75名研究患者进行分类。
实施例2：
研究人群以实现对来自冠状动脉阻塞位置的血栓和斑块材料的假设产生性分析
从分别经历过用于ST段抬高心肌梗塞(ST-segment elevationmyocardial infarction，STEMI；急性长期胸痛和在两个相邻导联之间ECGST段抬高>0.2mV)或非ST段抬高心肌梗塞(non-ST-segment elevationmyocardial infarction，NSTEMI；典型的静止时胸痛，最后一次发作发生在入院前不超过24小时，且升高的心脏肌钙蛋白T水平>0.03μg/L)的直接或急性冠状动脉经皮介入的41名患者中，使用如前所述的临时阻塞和抽吸系统(a temporary occlusion and aspiration system)(Maier等，2005)取出冠状动脉血栓。
实施例3：
研究人群以评估炎症标志物
根据临床表现(可选择的/紧急的)和血管造影结果，对在UniversityHospital of Zurich经历冠状动脉血管造影术的患者分成三组。
A)心脏冠状动脉正常(n＝14)：该组由没有冠状动脉病的血管造影迹象的患者构成。冠状动脉病是由在任何主要心外膜冠状动脉中任何超过50％的直径狭窄的血管造影证据来定义的。该组包括在瓣膜手术之前经历过诊断性冠状动脉血管造影术的患者和具有胸痛的患者。
B)稳定型冠状动脉病(CAD，n＝22)：在任何主要心外膜冠状动脉中具有至少一个或多个超过50％的直径狭窄且血管造影术结果与稳定型CAD相一致的患者。如果没有冠状动脉病灶显示出表示动脉粥样斑块破裂或冠状动脉内血栓形成的以下所列的形态标志，则被认为是这种情况。
C)具有不稳定型CAD的患者(n＝39)。这组包括表现出ACS和清晰可识别的肇事病灶的患者，并且该患者具有以下五种血管造影方面中的至少两种：a)Ambrose病灶类型II(Ambrose等，1985a；Ambrose等，1985b)，b)具有溃疡化或不规则的病灶，c)血栓形成的标志(即急性完全阻塞、填充性缺陷、在没有钙化情况下的模糊化、不均匀浑浊化、对比染色)，d)在病灶的远处脉管剖面中流动受限，或e)在相应的壁段中壁运动受限。ACS包括具有STEMI、NSTEMI和不稳定型心绞痛(典型的静止时胸痛，最后一次发作发生在入院前不超过24小时，并且或者有有记录的冠状动脉疾病历史，或者具有定义为ST段压低>0.05mV、暂时ST段抬高超过0.05mV或者在两个相邻导联中的T波倒置>0.2mV的局部缺血性ECG变化)的患者。排除标准(exclusion criteria)是C-活性蛋白(CRP)的血清水平≥10mg/L、心肌层和心包膜的炎症状态(即心肌炎、心包炎、短暂性心尖球囊症(transient apical ballooning))、左心室射血分数≤35％或明显充血性心力衰竭。
实施例4：
进行局部和全身评估的研究人群的小组
在具有不稳定型CAD的个体的7个中，对冠状动脉阻塞位置局部和全身进行炎症标志物的评估。
实施例5：
血液、动脉粥样斑块和血栓的局部采集
在41名具有血栓抽吸的患者和7名具有局部和全身血样的患者中，用7F定向导管插入肇事动脉(culprit artery)，并接上0.014英寸PercuSurgeTM GuardWireTM(Maier等，2005)。简要来说，在越过肇事病灶(culprit lesion)之后，远端保护球囊膨胀，用于远端阻塞该肇事血管(culprit vessel)。将ExportTM抽吸导管插在引线之上，用注射器形成从位于阻塞球囊位置的远端直到该肇事病灶的上边界的一条抽吸通道，以从该冠状动脉阻塞部位收集血液、血栓和动脉粥样斑块材料(图1)。然后，进行PCI。
实施例6：
程序
所有患者依照标准技术经过冠状动脉血管造影术。在股动脉的穿孔之后立即从该动脉鞘上取出周边血样。没有CAD和具有稳定型CAD的患者依照目前的指导路线处理(Gibbons等，1999；Gibbons等，2003)，并接受保守性的、介入性的或外科手术的治疗。具有不稳定型CAD的患者经历经皮冠状动脉介入(PCI)。
实施例7：
参数和生化测定
评估周边血液中的以下标志物：MRP 8/14、CK、CK-MB、肌钙蛋白T和CRP。
使用具有测定间变化值(inter-assay variation)为7.2％并且检测限为3.0μg/l的夹层ELISA(a sandwich ELISA，Bühlmann Laboratories，Sch
Figure A200780020188D0026104823QIETU
nenbuch，Switzerland)检测血清中的MRP 8/14。使用MRP 8/14杂二聚物的特异性单克隆抗体(mAb 27E10)作为一抗，采用连接有辣根过氧化物酶的多克隆抗体作为二抗。该抗体对于该MRP 8/14杂二聚物或更高级复合物具有特异性，且不结合MRP-8或MRP-9单体(Hessian和Fisher，2001；Zwadlo等，1986)。在Roche Modular Analytics System上用来自Roche Diagnostics(Rotkreuz，Switzerland)的商业测定分析白蛋白、肌红蛋白、CK和肌钙蛋白T，最大测定间变化值分别为2.8％、4.4％、1.0％和3.7％。在Immulite 2000化学发光分析仪上使用来自Diagnostic Products Corporation(Los Angeles，USA)的商业试剂测定CRP，最大测定间变化值为6.3％，检测限为0.1mg/L。
实施例8：
免疫组织化学
将固体材料在缓冲的仲甲醛4％中保持4-6小时，在50％乙醇中保持24小时，然后石蜡包埋(Leica EG 1160)和二甲苯/乙醇固定(Hypercenter XP，Shandon)，并用显微切片机(Leica RM2035)切割。将该切片(slide)用胰岛素处理1小时，用在Tris-HCl pH 7.6中的4％无脂乳封闭30分钟。使用浓度为1μg/ml的针对人体MRP 8/14的单克隆鼠抗体(IgG1，Clone 27E10，Acris Antibodies GmbH，Hiddenhausen，Germany)(Zwadlo等，1986)，用该切片在4℃对其培养18小时。鼠IgG1用作阴性对照。在洗涤两次之后，在该切片上添加在5％马血清中的生物素化的AffinityPure F(ab＇)2片段山羊抗小鼠IgG(H+L)(JacksonImmunoResearch Lab.，Cambridgeshire，UK)和1％BSA，并在22-24℃对其培养30分钟。再次洗涤之后，添加碱性磷酸酯缀合的链酶抗生物素(Jackson ImmunoResearch Lab.)，并在22-24℃对其培养30分钟。使用Dako Fast Red Substrate System(DakoCytomation，Glostrup，Denmark)进行染色。
实施例9：
数据分析和统计
依照通过Kolmogorov-Smirnov试验评估的其分布，以平均值±标准偏差或以中间值[四分位数间距，IQR]形式给出数据。炎症标记物的水平确定为非正态分布。因此，使用Kruskal-Wallis Test比较各组，并且如果存在明显差别，将Wilcoxon秩和检验(Wilcoxon rank sum test)应用于进一步的成对组比较。使用Spearman＇s秩次-关联测试(Spearman’srank-correlation test)发现MRP 8/14全身性动脉水平和CRP以及其它连续变量(例如白细胞计数等)之间的关联。关联系数rs≥0.7被认为是好的关联，而rs≤0.5被认为是差的关联。使用具有卡方测试(chi-square test)的双向交叉列表来评估百分比的差别。为了测试在检测肇事病灶中MRP8/14的精确度，进行接受器工作特征(ROC)分析。用边界值(具有最好敏感度和特异性的MRP 8/14血清水平)和ROC曲线下的面积描述ROC曲线。使用jmpTM statistical discoveryTM(6.0版本；SAS institute，Inc.)进行统计分析。
P值<0.05被认为是显著的。
实施例10：
患者特征
在血栓的假设产生性免疫组织化学分析(hypothesis-generatingimmunohistochemical analysis)中包括的41位具有ACS的连续患者的特征总结于表1中(参见下页)。
表1
具有血栓免疫组织化学分析的ACS患者
 
特征 ACS患者(n＝41)
人口统计
年龄-岁 54.1±9.1
男性-数(％) 33(80)
风险系数
高胆固醇血症-数(％) 24(59)
高血压-数(％) 13(32)
糖尿病-数(％) 6(15)
家族史-数(％) 10(24)
吸烟-数(％) 29(71)
以前用药
阿司匹林-数(％) 7(17)
抑制素-数(％) 7(17)
临床表现
从标志事件(index event)到血管造影的时间-分钟                                        245[179-323]
在住院时的ECG
正常-数(％) 2(5)
阴性T波>0.2mV-数(％) 1(2)
ST压低>0.05mV-数(％) 3(7)
ST抬高-数(％) 35(86)
住院时的实验室数据
白细胞-×1000/μL 12.4±4.8
肌酸酐-μmol/L 82.6±14.0
血管造影结果
1-脉管疾病-数(％) 23(56)
2-脉管疾病-数(％) 12(29)
3-脉管疾病-数(％) 6(15)
 
慢性梗塞-数(％) 5(12)
钙化-数(％) 11(27)
LVEF，％ 55.1±11.2
肇事病灶
肇事脉管-数(％)
LAD 25(61)
RCA 10(24)
LCx 6(15)
支架血栓-数(％) 1(2)
狭窄程度≥90％-数(％) 41(100)
初始流量<TIMI等级III-数(％) 40(98)
经皮冠状动脉介入
GP-IIb/IIIa拮抗剂-数(％) 37(90)
PCI时间-分钟 25[18-37]
过程
QwMI-数(％) 34(83)
肌钙蛋白T峰值-μg/L 4.6[2.9-6.8]
CK-MB峰值-U/L 302[134-419]
实施例11：
针对表现划分的75名连续患者的特征总结于表2中。
表2
用于评估炎症标志物的研究人群
Figure A200780020188D00301
Figure A200780020188D00311
Figure A200780020188D00312
用于和另外两组进行比较
Figure A200780020188D00313
用于和无CAD的组进行比较
用于和不稳定型CAD的组进行比较
实施例12：
对来自冠状动脉阻塞位置的抽吸的物质和血栓的免疫组织化学染色
41个分析的连续血栓中31个(76％)显示对MRP8/14阳性免疫组织化学染色。MRP8/14+细胞的形态表明其属于噬菌细胞种群。特别地，观察到MRP8/14+细胞的渗透性群聚(infiltrative clustering)。系列剖面证实了巨噬细胞(CD68+)和粒细胞(CD66b+)存在于针对MRP 8/14染色的区域中。在血栓中检测到非常少量的淋巴细胞，对于淋巴细胞(CD3)或血小板(CD42a/b)未见到MRP8/14染色(数据未显示)。在该系列中没有针对MRP 8/14分析全身和/或局部血液样品。基于这些显示了蛋白质大量存在的局部免疫组织化学结果和MRP 8/14的病理生理学作用，产生以下假设：该标志物可能是不稳定型冠状动脉病灶的指示物。
实施例13：
在具有ACS的患者中MRP 8/14的局部水平和全身水平比较
与全身循环相比较，在冠状动脉阻塞位置处MRP 8/14的血清水平提高(22.0[16.2-41.5]对13.4[8.1-14.7]mg/L，p<0.05；图2)。
实施例14：
在三种区别性临床状况中MRP 8/14的全身血清水平：没有冠状动脉病理学、稳定型CAD和急性冠状动脉综合症
与具有正常冠状动脉的对象和急性CAD的患者相比较，具有ACS的患者显示高度提高的MRP 8/14血清水平(15.1[12.1-21.8]对4.8[4.0-6.3]对4.6[3.5-7.1]mg/L，p<0.0001；图3)。从ROC分析中测定边界值(cut-offvalue)为8.0mg/L，其以95％的敏感性、92％的特异性、0.97的AOC辨别了急性冠状动脉综合症。
与此相反，CRP血清水平在各组之间没有差别(数据未示出)。
实施例15：
MRP 8/14的血清水平和其它参数实例之间的关联
MRP 8/14和CRP水平之间没有关联。观察到MRP 8/14和白细胞计数有弱关联(rs＝0.5，p<0.0001)。动脉和静脉MRP 8/14血清水平显示了良好的关联(rs＝0.7，p<0.01)。
实施例16：
与肌红蛋白、CK-MB和肌钙蛋白相比较，从第一症状开始出现MRP8/14
在显示出MI的患者中，从第一症状开始在0-3小时内MRP 8/14已经为100％阳性，早于任何传统标志物肌红蛋白、肌钙蛋白T和CK-MB(图5)。
实施例17：
临床案例
选择University Hospital of Zurich的具有急性胸痛的下面两位患者(患者A和患者B)作为代表性实例，因为尽管有相似的临床症状，一位患者具有潜在的ACS，而另一为具有没有CAD迹象的正常冠状动脉。两位患者都为女性，56岁，具有高血压史，在静止时胸痛两小时之后就诊。在两个案例中病痛都是压迫性的且位于胸骨之后，但通过在胸上进行手压或通过用力吸气都不会引起该疼痛。临床检查不能显示任何其它结果，除了与患者B(118/86)相比，患者A显示出高血压(204/105mmHg)。住院时的心电图(ECG)显示在两个案例中在导联V2-V5中都存在ST段压低(>0.05mV)。两个患者的心肌坏死(即，肌红蛋白)、CK-MB和肌钙蛋白T的初始血浆水平都为阴性。
从这些最初结果中，不能排除ACS，因此，两位患者都类似ACS治疗。这包括连续ECG-监控和对心肌坏死标志物的连续评估。此外，对患者服用阿司匹林、肝素、β-受体阻滞药和硝酸盐。
从住院起5小时从患者B抽取的第二血样显示肌红蛋白(188μg/L)、CK-MB(70U/L)和肌钙蛋白T(1.69μg/L)的水平升高，明显表明了该病人中的ACS。相反，患者A的第二血样分析再次是阴性的。然而，该病人连续遭受胸痛，此外还显示动态ST段变化，暗示着正在发生的冠状动脉过程。因此，两位患者都经过冠状动脉血管造影术，其显示在患者A中的冠状动脉正常，而在患者B中具有明显可识别的肇事病灶的ACS(旋动脉的急性阻塞)。依照本发明，血管造影术中所取的MRP 8/14血清水平对于具有ACS的患者(患者B)而言高于边界值(15.1mg/L)，而没有不稳定或稳定CAD的血管造影信号的患者A显示未升高的MRP8/14值(4.3mg/L)。
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Claims (15)

1.用于确定表现出发展中的急性冠状动脉综合症的至少一种症状的个体是否患有急性冠状动脉综合症的风险的方法，包括以下步骤：
a.测量，优选在体外，MRP 8/14或其变体的水平，其中
b.如果MRP 8/14或其变体的水平至少升高，那么该个体处于患有急性冠状动脉综合症的风险中。
2.权利要求1的方法，其包括以下进一步的步骤：
aa.测量，优选在体外，心肌坏死的标志物和/或炎症标志物和/或金属蛋白酶或其变体的水平，
和以下改进的步骤
ba.如果心肌坏死的标志物和/或炎症标志物和/或金属蛋白酶或其变体的水平与MRP 8/14或其变体的水平两者都至少升高，那么该个体处于患有急性冠状动脉综合症的风险中。
3.权利要求1或2中任意一项的方法，其中该个体表现出胸痛和/或气促。
4.权利要求1～3中任意一项的方法，其中该MRP 8/14的水平是在血清和/或血浆中测定的。
5.权利要求1～4中任意一项的方法，其中升高的MRP 8/14水平对应于至少8.0mg/L的血清水平。
6.权利要求1～5中任意一项的方法，其中另外测量以下生物标志物中的一种或多种的水平：
a)肌红蛋白，
b)肌酸激酶
c)肌酸激酶-MB，
d)肌钙蛋白T，
e)肌钙蛋白I。
7.用于排除表现出发展中的急性冠状动脉综合症的至少一种症状的个体是否患有急性冠状动脉综合症的可能性的方法，包括以下步骤：
a.测量，优选在体外，MRP 8/14或其变体的水平，其中
b.如果MRP 8/14或其变体的水平没有升高，那么该个体没有患急性冠状动脉综合症。
8.用于评估表现出发展中的急性冠状动脉综合症的至少一种症状的个体是否没有处于患有急性冠状动脉综合症的风险中的方法，包括以下步骤：
a.测量，优选在体外，MRP 8/14或其变体的水平，其中
b.如果MRP 8/14或其变体的水平没有升高，那么该个体没有处于患有急性冠状动脉综合症的风险中。
9.用于鉴别表现出发展中的急性冠状动脉综合症的至少一种症状的个体处于患有急性冠状动脉综合症的风险中或者没有急性冠状动脉综合症的方法，包括以下步骤：
a.测量，优选在体外，MRP 8/14或其变体的水平，其中
b.如果MRP 8/14或其变体的水平至少升高，那么该个体处于患有急性冠状动脉综合症的风险中，
c.如果MRP 8/14或其变体的水平没有升高，那么该个体没有急性冠状动脉综合症。
10.权利要求7～9中任意一项的方法，其中MRP 8/14的未升高水平对应于小于8.0mg/L的血清水平。
11.MRP 8/14或其变体在确定表现出发展中的急性冠状动脉综合症的至少一种症状的个体是否患有急性冠状动脉综合症的风险中的用途，包括以下步骤：
a.测量，优选在体外，MRP 8/14或其变体的水平，其中
b.如果MRP 8/14或其变体的水平至少升高，那么该个体处于患有急性冠状动脉综合症的风险中。
12.试剂盒，包括用于测量MRP 8/14的装置或试剂，其中该试剂盒包括用于解释与确定个体患有急性冠状动脉综合症的风险相关的任何测量结果的用户手册。
13.权利要求12的试剂盒，其中该用户手册公开如果升高的MRP8/14水平对应于至少8.0mg/L的血清水平，那么该个体处于患有急性冠状动脉综合症的风险中。
14.包括用于测量MRP 8/14的装置或试剂的试剂盒在确定个体患有急性冠状动脉综合症的风险中的用途。
15.包括用于测量MRP 8/14的装置或试剂的试剂盒在权利要求1～10的任意一项的方法中的用途。
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