KR20220147624A - 가용성 clec-2와 혈소판 수에 기초한 혈소판 활성화 측정 방법 - Google Patents
가용성 clec-2와 혈소판 수에 기초한 혈소판 활성화 측정 방법 Download PDFInfo
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Abstract
생체 내의 혈소판 활성화를 보다 잘 반영하는 바이오 마커를 개발해, 혈전 지혈 질환의 검사 등에 이용할 수 있는 혈소판 활성화 상태 파악을 보조하는 방법을 제공한다。
상기의 혈소판 활성화 상태 파악을 보조하는 방법은, (1) 피검 대상 유래의 피검 시료 중의 가용성 CLEC-2 농도와 혈소판 수를 측정하는 공정, (2) 상기 가용성 CLEC-2 농도를 상기 혈소판 수로 나누어 가용성 CLEC-2 농도 값을 계산하는 단계를 포함하고, 원한다면, (3) 보통의 건강한 대상으로부터 유래된 시험 샘플을 사용하여 수득된 가용성 CLEC-2 농도/혈소판 수의 값과 비교하는 단계를 추가로 포함한다.
상기의 혈소판 활성화 상태 파악을 보조하는 방법은, (1) 피검 대상 유래의 피검 시료 중의 가용성 CLEC-2 농도와 혈소판 수를 측정하는 공정, (2) 상기 가용성 CLEC-2 농도를 상기 혈소판 수로 나누어 가용성 CLEC-2 농도 값을 계산하는 단계를 포함하고, 원한다면, (3) 보통의 건강한 대상으로부터 유래된 시험 샘플을 사용하여 수득된 가용성 CLEC-2 농도/혈소판 수의 값과 비교하는 단계를 추가로 포함한다.
Description
본 발명은, 가용성(可溶型) CLEC-2와 혈소판 수(血小板數)에 기초한 혈소판 활성화 측정 방법 및 혈전 지혈 질환의 검사 방법에 관한 것이다.
혈관 내에 형성된 혈전은, 광범위한 인간의 질병 중에서도 생사에 관련되는 중대한 병인인자로 여겨지고 있다. 혈소판에 의한 혈전의 증대나 혈소판 응집의 적층은, 심각한 심근경색, 만성 불안정 협심증, 일과성 허혈, 말초혈관 장애, 동맥혈전증,폐색성 동맥경화증, 폐혈전 색전증, 그리고 스텐트의 재협착과 같은 질환을 일으킨다. 선진국에서는 혈전에 의한 관상 동맥 폐색이나 뇌순환 장애가 사인의 상위로 인정되어, 혈전증의 제압은 세계적인 긴급한 과제이다. 또한, 자연재해 발생시에는, 재해피난시의 심부정맥혈전증 및 폐색전증(정맥혈전이 혈류에 걸려 폐동맥을 폐색하는 질환)의 예방이 환기되고 있어, 그 대처가 중요시되고 있다. 혈소판에는, 혈소판 내에 과립, 혈소판 표면에 많은 막당단백질이 존재하고, 혈소판 활성화에 수반하여 과립의 방출이나 막당단백질의 구조변화가 일어나며, 그 중 일부는 혈소판 활성화 마커(マ―カ―, marker)로서 이용되고 있다.
혈소판 제4인자(PF4) 및 β-트롬보글로불린(β-トロンボグロブリン;βTG）은, 혈소판의 α과립 중에 포함되고, 혈소판의 활성화에 수반하여 방출되기 때문에, 종래부터 혈소판 활성화 머커로서 이용되고 있다. 그러나, 채혈 등의 경미한 자극으로도 과립 중의 물질이 방출되기 때문에, 혈소판 활성화 억제제 칵테일이 들어있는 전용 채혈관과 20게이지(G) 이상의 굵은 채혈침을 이용하여 구혈대를 하지 않고 채혈하고, 곧바로 얼음 냉각한다는 번거로운 과정을 밟지않으면 안되는 등, 채혈 수술이나 검체 처리에 제약이 많고, 그것에 더하여 데이터의 신뢰성 측면에서 임상에서는 별로 이용되지 않는다.
또한, 최근, 혈소판의 활성화에 수반하여 프로테아제(プロテア―ゼ)에 의해 절단된 막 당단백질(膜糖タンパク質)이 혈소판 활성화 마커로서의 이용 가치가 높아지고 있다. 구체적으로는, vonWillebrand인자(vWF)수용체 GPIba나 콜라겐(コラ-ゲン)수용체 GPVI가 대표적인 분자로서 들 수 있으나, 어떤 것도 임상적인 의의에 관한 지견이 부족하고, 또한 특정의 리간드 의존적인 방출 반응이기 때문에, 혈소판의 활성화 상태를 정확하게 반영하고 있는가 불명확한 점이 많다.
CLEC-2 (C-type lectin-like receptor 2)는, 2006년에 이노우(井上)에 등에 의해 확인(同定)된 C형 렉틴 패밀리에 속하는 혈소판 활성화 수용체다(특허문헌 1, 2). 또한, 근년의 연구 성과에 의해, CLEC-2는 혈소판 활성화에 수반하는 막표면으로부터 유리(遊離)하고, 가용성으로 되어 방출되는 것이 보고되고 있다(비특허문헌 1, 특허문헌 3). 또한, 가용성 CLEC-2를 몇몇 병태(病態)로 측정한 문헌은 출판되어 왔지만, 그 임상 응용에 대해서는 분명하지 않은 점이 많다. (비특허문헌 2)
[비특허문헌１] Platelets 2015; 26(8): 711-719
[비특허문헌２] Thrombosis Research, 2019, Vol. 178, p. 54-58
본 발명의 과제는, 생체 내의 혈소판 활성화를 보다 잘 반영하는 바이오 마커(バイオマ-カ-)를 개발하고, 혈전 지혈 질환의 검사 등에 이용하는 것이다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위하여 예의 검토를 수행했다. 그 결과, 이전에 보도된 혈장 중 가용성 CLEC-2(이하, sCLEC-2로 칭할 수 있음)농도는 생체 중의 혈소판 활성화의 정도를 반영하는 것이나, 반드시 그것만으로는 정확한 진단을 할 수 없다는 것을 발견했다. sCLEC-2는 혈소판이 활성화할 때에, 혈소판으로부터 혈장 중에 방출되는 분자로서, 혈장 중 sCLEC-2의 농도를 측정하는 것은 혈소판의 활성화 정도를 반영하는 것으로 기대되었다. 그러나, 다양한 병태의 혈액을 이용하여 검토하면, 혈장 중 sCLEC-2 농도는 혈소판의 활성화를 어느 정도 반영하지만, 그 농도는 혈액 중의 혈소판 수에도 양(正)의 상관을 나타내는 것이 판명되었다. 혈 중의 혈소판 수는 사람에 따라 다르고 또한 병태에 따라 증감하는 경우도 있다. 혈장 중 sCLEC-2 농도는 혈소판이 활성화하여도 혈소판 수가 적은 경우는 낮아지고, 역으로 혈소판의 활성화가 약하게 되어도 혈소판 수가 증가한 경우는 높아져 버려서, 반드시 생체 중의 혈소판의 활성화 정도를 반영하지 않을 수도 있음을 발견했다. 그래서 혈장 중 sCLEC-2 농도를 혈소판 수로 나누면 혈소판 당의 sCLEC-2 방출량을 알 수 있었고, 이것을 지표로 하는 쪽이 혈소판의 활성화를 보다 잘 반영하는 것은 아닌가 하고 생각하여 검토를 진행했다. 그 결과 혈장 중의 sCLEC-2 농도/혈소판 수는 혈장 중 sCLEC-2 농도 그 자체 보다 혈전성 질환의 병태를 반영하는 것을 발견하여, 이 지표가 혈전 지혈 질환의 검사에도 사용할 수 있음을 발견했다. 이상의 지견에 의해, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.
본 발명은 이하를 제공한다:
[1] (1) 피검 대상 유래의 피검 시료 중의 가용성 CLEC-2 농도와 혈소판 수를 측정하는 공정, 및
(2) 상기 가용성 CLEC-2 농도 및 상기 혈소판 수로부터 혈소판 활성화 상태를 파악하는 공정을 포함하는, 혈소판 활성화 상태의 파악을 보조하는 방법.
[2] (1) 피검 대상 유래의 피검 시료 중의 가용성 CLEC-2 농도와 혈소판 수를 측정하는 공정, 및
(2) 상기 가용성 가용성 CLEC-2 농도를 상기 혈소판 수로 나눔에 의해, 가용성 CLEC-2 농도/혈소판 수의 값을 계산하는 공정을 포함하는, 혈소판 활성화 상태의 파악을 보조하는 방법.
[3] 보통의 건강한 대상에 유래하는 피검 시료를 사용하여 수득된 가용성 CLEC-2 농도/혈소판 수의 값과 비교하는 단계를 추가로 포함하는, [2]의 방법.
[4] 상기 가용성 CLEC-2 농도/혈소판의 값이, 혈전 지혈 질환의 병태를 반영하는 마커인, [2] 또는 [3]의 방법.
[5] 상기 혈전 지혈 질환이, 파종성 혈관내 응고증후군(DIC),심근경색, 협심증, 뇌경색, 폐색성 동맥경화증, 심부정맥혈전증, 폐혈전색전증, 심원성 뇌경색, 항인지질 증후군, 패혈증 중 어느 하나인, [4]의 방법.
[6] 혈전 지혈 질환 환자를 대상으로서, 당해 혈전 지혈 질환의 예후 또는 치료 경과를 머니터링하는 수법으로서 사용하기 위한, [1] ~ [5] 중 어느 하나의 방법.
[7] (1) 피검 대상 유래의 피검 시료 중의 가용성 CLEC-2 농도와 혈소판 수를 기억할 수 있는 기억 수단,
(2) 상기 가용성 CLEC-2 농도를 상기 혈소판 수로 나눔에 의해, 가용성 CLEC-2 농도/혈소판 수의 값을 계산할 수 있는 계산 수단,
(3) 얻어진 피검 대상의 상기 가용성 CLEC-2 농도/혈소판 수의 값을, 보통의 건강한 대상의 가용성 CLEC-2 농도/혈소판 수의 값과 비교할 수 있는 비교 수단, 및
(4) 상기 비교에 의해 얻어진 결과를 표시할 수 있는 표시 수단,
을 포함하는, 혈소판 활성화 상태를 파악하기 위한 시스템.
[8] 프로세서 및 상기 프로세서의 제어화에 있는 메모리를 포함하는 컴퓨터를 구비하고, 상기 메모리에는, 하기 공정:
(1) 피검 대상 유래의 피검 시료 중의 가용성 CLEC-2 농도와 혈소판 수를 상기 메모리에 기억시키는 기억 공정,
(2) 상기 가용성 CLEC-2 농도를 상기 혈소판 수로 나눔에 의해, 가용성 CLEC-2 농도/혈소판 수의 값을 계산하는 계산 공정,
(3) 상기 계산 공정으로 얻어진 상기 가용성 CLEC-2 농도/혈소판 수의 값을, 보통의 건강한 대상의 가용성 CLEC-2 농도/혈소판 수의 값과 비교하는 비교 공정, 및
(4) 상기 비교 공정에서 얻어진 결과를 표시하는 표시 공정,
을 상기 컴퓨터에 실행하기 위한 프로그램이 기억되어 있는, 혈소판 활성화 상태를 파악하기 위한 시스템.
[9] [7] 또는 [8]의 시스템을 구비한, 전자 챠트(電子カルテ), 임상 검사 장치 또는 병원 내 검사 시스템.
[10] (1) 가용성 CLEC-2 측정 시약 및 /또는 혈소판 측정 시약, 및
(2) 가용성 CLEC-2 농도/혈소판 수의 값과, 혈소판 활성화 상태와의 관련을 기재한 첨부 문서를 포함하는, 혈소판 활성화 상태의 파악용 키트.
본 발명에 의하면, 혈소판 당 sCLEC-2 방출량을 알 수 있고, 혈액 중의 혈소판 활성화 상태를 정확하게 파악하는 것이 가능해진다. 이것에 의해, sCLEC-2 농도/혈소판 값과 임상적 유용성에 대한 충분한 검증이 가능하게 되어, 혈전 지혈 질환의 병태를 반영하는 마커로서의 이용이 기대되고, 특히, 마커로서 사용할 수 있는 유효한 검사가 적은 심근경색, 뇌경색, 폐색성 동맥경화증, 파종성 혈관내응고증후군(DIC), 패혈증 등 동맥성의 혈전 지혈 질환에 있어서의 마커로서도 이용이 기대된다.
[도 1] 패혈증 환자의 DIC 비발증례(n-DIC), 패혈증 환자의 DIC의 발증례 (DIC), 전(全)패혈증 환자(전패혈증)에 있어서, 혈소판 수(PLT) 및 sCLEC-2 농도 (sCLEC-2)의 상관을 보여주는 그래프이다.
[도 2] 보통의 건강한 사람, 패혈증 환자의 DIC 비발증례(DIC 없음), 패혈증 환자의 DIC 발증례(DIC 있음)에 있어서, sCLEC-2 농도(sCLEC-2), 혈소판 수(PLT), sCLEC-2 농도/혈소판 수(sCLEC-2/PLT)를 보여주는 그래프이다.
[도 3] sCLEC-2 농도(실선), sCLEC-2 농도/혈소판 수(점선)에 관련하는 ROC 곡선이다.
[도 2] 보통의 건강한 사람, 패혈증 환자의 DIC 비발증례(DIC 없음), 패혈증 환자의 DIC 발증례(DIC 있음)에 있어서, sCLEC-2 농도(sCLEC-2), 혈소판 수(PLT), sCLEC-2 농도/혈소판 수(sCLEC-2/PLT)를 보여주는 그래프이다.
[도 3] sCLEC-2 농도(실선), sCLEC-2 농도/혈소판 수(점선)에 관련하는 ROC 곡선이다.
본 발명의 방법에는, 이하에 한정되는 것은 아니나, 가용성 CLEC-2 농도/혈소판 수의 측정 방법 (또는 결정 방법), 혈소판 활성화 상태의 파악을 보조하는 방법, 혈전 지혈 질환의 진단 방법 (또는 검출 방법), 혈전 지혈 질환의 진단을 보조하는 방법, 혈전 지혈 질환의 진단을 위하여 가용성 CLEC-2 농도/혈소판 수를 측정(또는 결정)하는 방법 등을 포함하며, 어떤 방법도, (1) 피검 대상 유래의 피검 시료 중의 가용성 CLEC-2 농도와 혈소판 수를 측정하는 공정, (2) 상기 가용성 CLEC-2 농도 및 상기 혈소판 수로부터 혈소판 활성화 상태를 파악하는 공정을 포함하며, 보다 구체적으로는, (1) 피검 대상 유래의 피검 시료 중의 가용성 CLEC-2 농도와 혈소판 수를 측정하는 공정, (2) 상기 가용성 CLEC-2 농도를 상기 혈소판 수로 나눔에 의해, 가용성 CLEC-2 농도/혈소판 수의 값을 계산하는 공정을 포함하며, 소망하는 대로, 보통의 건강한 대상에 유래하는 피검 시료를 사용해서 얻은 가용성 CLEC-2 농도/혈소판 수의 값과 비교하는 공정을 추가로 포함할 수 있다. 가용성 CLEC-2 농도 및 혈소판 수로부터 혈소판 활성화 상태를 파악하는 공정은, 예를 들면, 가용성 CLEC-2 농도/혈소판 수의 값을 계산하고, 건강한 대상의 가용성 CLEC-2 농도/혈소판 수의 값과 비교함에 의해 실시할 수 있지만, 가용성 CLEC-2 농도 및 혈소판 수를 사용해서 혈소판 활성화 상태를 통합적으로 판단할 수도 있다. 이하, 가용성 CLEC-2 농도/혈소판 수의 값을 사용하는 실시예를 주로 설명하지만, 본 발명은 이러한 실시예에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 용어 「CLEC-2」는, C형 랙틴패밀리(レクチンファミリ-)에 속하는 혈소판 활성화 수용체이며, 통상, 혈소판의 막에 존재하나, 혈소판의 활성화와 함께, 혈액 중에 방출된다. 본 명세서에 있어서 용어 「가용성 CLEC-2（sCLEC-2）」는, 이와 같은 혈소판으로부터 유리(遊離)하여, 혈액 중(버퍼(バッファ-) 중에서 인큐베이팅하는 경우는 버퍼중)에 검출되는 CLEC-2 또는 CLEC-2 유래의 분자인 것을 의미한다.
sCLEC-2에는, 환원 조건 아래 SDS 폴리아크릴아미드겔(ポリアクリルアミドゲル) 전기 영동(SDS-PAGE)에서의 분자량 약 40 kDa의 단백질, 분자량 약 32 kDa의 단백질, 분자량 약 25 kDa의 단백질 등이 포함된다.
분자량 약 40 kDa의 단백질, 분자량 약 32 kDa의 단백질은 혈소판 막표면에 존재하며, 혈소판 활성화에 수반하여 생산되는 마이크로파티클에 포함된 상태로 방출되는 것으로 추정된다. 이들에는 당 사슬(糖鎖)이 부가되어 있다고 생각된다.
한편, 분자량 약 25 kDa의 단백질은 혈소판의 활성화에 따라 프로테아제에 의해 절단되어 혈소판으로부터 유리(遊離)하는 것으로 생각된다.
본 발명에서는 상기와 같은 가용성 CLEC-2의 양을 측정한다. sCLEC-2는 분자량 약 40 kDa의 단백질, 분자량 약 32 kDa의 단백질 및 분자량 약 25 kDa의 단백질을 통합하여 검출하여도 좋고, 분자량 약 25 kDa의 단백질만을 검출해도 좋다.
측정에 사용하는 시료는 사람 유래인 것이 바람직하지만 실험동물의 병태 파악 등을 위해 사람 이외의 동물 유래의 시료를 사용해도 좋다. 실험동물로는 특별히 제한되지 않는데, 예를 들어 모르모트, 기니피그, 래트, 마우스, 친칠라(チンチラ) 등을 들 수 있다.
본 발명 방법은, 혈전 지혈 질환의 검사에도 적절하게 사용된다. 본 명세서에서 말하는 「지혈」은, 혈소판 및 응고 인자가 공동으로 유혈 또는 출혈을 효과적으로 적절히 멈추는 것을 의미한다. 본 명세서에서 사용하는 「혈전 지혈 질환」은, 과도한 출혈이나 비정상적인 혈액 응고를 포함하는 상태나 질환이 포함되지만,이에 국한되는 것은 아니다. 비정상적인 혈액 응고는 심각한 관상 부전 증후군, 심근 경색, 불안정 협심증, 난치성 협심증, 혈전용해 치료 후 관상 동맥 내 혈전성 폐색, 관상 동맥 혈관 성형술 후의 관상 동맥 내 혈전성 폐색, 혈전에 의한 혈관 질환, 뇌경색, 색전성 뇌졸중, 혈전성 뇌졸중, 일시적 뇌허혈 발작, 정맥혈전증, 심부정맥혈전증, 폐동맥색전, 응고장애, 파종성 혈관내 응고증후군, 혈전성 미세혈관장애증, 혈전성혈소판감소성 자반병, 폐색성 혈전혈관염, 헤파린(ヘパリン)기인성 혈소판 감소증과 관련된 혈전증, 체외순환에 의한 혈전 합병증, 심장 또는 기타 혈관내 카테터(カテ-テル), 대동맥 내 벌룬펌프(バル-ンポンプ), 동맥 스텐트(ステント) 또는 심장 판막과 같은 기구로 인한 혈전 합병증, 및 인공 기관의 설치가 필요한 상태를 포함한 질환, 항인지질 항체 증후군, 그리고 패혈증과 같은 혈전지혈 이상을 수반하는 중증 감염과 관련이 있는 것이지만, 이것에 한정되는 것은 아니다.
예를 들면, sCLEC-2 농도/혈소판 수의 값이 보통의 건강한 정상인 또는 비혈전 지혈 질환군과 비교해서 많은 경우는 혈전 지혈 질환을 앓고 있을 가능성 혹은 병을 앍을 위험이 높다고 할 수 있다. 이러한 비교를 바탕으로, sCLEC-2 농도/혈소판 수의 값으로 표현되는 혈소판 활성화 정도와 각종 질환의 상관을 표준 데이터로서 사용할 수도 있다.
구체적인 예를 들자면, 심근경색이나 뇌경색 환자에서 sCLEC-2 농도와 혈소판 수를 측정하고, 그 비율이 높은 값이 되면 생체내의 혈소판 활성화가 발생하고 있다고 판단할 수 있으며, 항혈소판 약의 투여, 증량, 혹은 다른 종류의 항혈소판 약의 추가 투여 등의 대책을 강구할 수 있다.
또한, 당뇨병 환자 등 심근경색이나 뇌경색의 하이 리스크 환자에서 sCLEC-2 농도와 혈소판 수를 측정하여 sCLEC-2 농도/혈소판 수가 높은 값인 환자에게는 아스피린 등의 항혈소판 약을 1차 예방으로 투여하는 등의 사용법도 가능하다고 생각된다.패혈증과 같이 혈전지혈 이상을 동반한 중증 감염증에서는 혈전 지혈 이상의 정도로부터 그 진단에 사용할 수도 있다. 또한, 아스피린, 클로비도그렐(クロビドグレル) 등의 항혈소판 약을 복용하고 있는 환자에서 sCLEC-2 농도와 혈소판 수의 측정을 시행하여, 높은 값이면 항혈소판 약의 증량, 다른 종류의 항혈소판 약으로의 변경 혹은 추가 투여 등을 검토하는 것도 가능하다.
또한, 만성 관절류마티스에서는 혈소판 마이크로 파티클이 악화 증가 인자로 되고 있다는 보고가 있으며,CLEC-2는 마이크로 파티클 상에서도 발현되기 때문에, 만성 관절류마티스 환자에서도 sCLEC-2 농도/혈소판 수가 상승할 가능성이 있어서, 만성 관절류마티스의 검사에도 유용하다.
또한, CLEC-2는 생체 내에서는 포도플라닌(ポドプラニン)이라는, 특정 종양 세포에서 발현되는 막 단백질과 결합하여, 그 전이를 촉진하는 것으로 보고되었으며, 포도플라닌 발현 종양 환자에서, 혈중 종양이 혈소판을 활성화시켜, sCLEC-2 농도/혈소판 수를 증가시킬 수 있다. 따라서, sCLEC-2 농도/혈소판 수는 암 전이 마커로서 사용될 가능성이 있다.
CLEC-2의 존재를 검출하는 방법은, 특별히 제한되지 않지만, sCLEC-2를 인식하는 항체(이하, 이것을 「항-sCLEC-2 항체」라고 칭하는 경우가 있음)를 이용한 면역학적 방법이 바람직하다. 면역학적으로 단백질을 검출하는 방법으로서는, 예를 들면, 효소 면역 측정법(ELISA법), 화학발광 면역측정법, 형광항체법, 방사 면역 측정법, 면역 크로마토그래피 등의 표지 항체를 이용한 면역 측정법, 혹은, 웨스턴 블롯팅법, 라텍스 응집법, 면역비탁법 등의 그 자체 공지의 통상 사용되는 방법이면 어떠한 방법으로도 사용할 수 있지만, 그 중에서도 조작의 간편성이나 측정 정밀도의 점에서 표지 항체를 이용한 면역 측정법이 바람직하게 사용된다. 수술 중 진단을 위해 신속하게 결과를 얻을 수 있는 것이 바람직하기 때문에, 화학 발광 면역 측정법, 면역 크로마토 그래피 등이 특히 바람직하게 사용된다.
혈소판 수의 측정은, 통상은 자동 혈구 계수기(혈산계)를 이용하여 측정을 행하지만, 혈구 계수판과 현미경을 이용하여 계수하는 것도 가능하다.
대상이 되는 피검자 (특히 환자)로부터, 예를 들어 혈장 채혈용의 채혈관에서 검체를 채취한다. 혈소판 수의 계측도 고려하면 EDTA가 들어있는 채혈관이 적합하지만, 헤파린, 구연산이 들어있는 것도 가능하다. 혈장 중 sCLEC-2 농도 측정용과 혈소판 수 측정용의 샘플을 1개의 채혈관에서 얻어도 되지만, 동시 채혈이면, 각각 다른 채혈관이어도 좋다. 혈장 중ｓCLEC-2 농도는 예를 들면 2000g으로 20분 정도 원심분리한 혈장을 사용하여 측정하지만, 원심의 조건은 이것에 한정되는 것은 아니며 전혈을 이용한 측정계일 수도 있다. 이하, 혈장 중 sCLEC-2 농도의 측정을 예로 들어 설명하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 혈중 혈소판 수는 EDTA와 같은 항응고제가 들어있는 전혈(全血)을 사용한다.
혈장 중의 sCLEC-2 농도를 예를 들면 pg/mL로 표시하고, 혈중 혈소판 수를 예를 들면 1000개/mm３로 표현하며, sCLEC-2 농도/혈소판 수를 계산한다. 여기서 사용하는 sCLEC-2의 농도는 ng/mL, ng/L 등의 임의의 단위를 사용하여도 좋고, 혈소판 수도 10000 개/mm３등 임의의 단위를 사용하는 것이 가능하나. 비교하기 위해서는 통일된 단위를 사용해야 한다.다양한 단위를 사용함으로써, sCLEC-2 농도/혈소판 수는 다양한 값을 취할 수 있지만, 본질적으로 동일한 개념의 것이다.
비율의 계산은 sCLEC-2 농도를 측정하는 임상 검사 기기에서 나온 측정값과 혈소판 수를 측정하는 혈산계에서 나온 측정값을 사용하여 행한다. 이 계산은 양측의 계측기와 연결된 병원의 검사 시스템, 병원의 시스템, 또는 전자 챠트 등의 시스템 상에서 자동적으로 계산하는 것이 일상의 진료상 바람직하지만, 두 측정기의 데이터를 연결하는 시스템을 구축해도 되고, sCLEC-2 농도와 혈소판 수를 동시 계측할 수 있는 기계를 구축하는 것도 가능하다. 또한 두 데이터를 사용하여 손으로 계산해도 좋다.
본 발명에서 얻어진 상기 표준 데이터는, 혈장 중의 가용성 CLEC-2 농도/혈소판 수와 혈소판 활성화의 정도나 각종 질환과의 상관을 나타내는 한, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 판정용 임계치, 혹은 판정용 임계치를 산출하기 위한 오리지널 데이터 또는 통계 처리 데이터 등을 들 수 있다. 해당 표준 데이터는, 첨부 문서에 기재되어도 좋고, 별도로 데이터 시트로 첨부되어도 좋다. 또한, 첨부되는 문서의 형태는 종이, CD-ROM 등의 전자 매체, 홈페이지 등으로부터의 다운로드도 포함된다.
sCLEC-2는, 혈소판의 활성화에 수반하여 혈액 속으로 방출된다. 기존의 혈소판 활성화마커(マ-カ-), 예를 들면, PF4, βTG는, 채혈에 의한 물리적인 압력에 의해 과립이 자극되어, 비특이적 방출을 일으키는 것이 문제로 되고 있지만, sCLEC-2는 혈소판 활성화를 유발하는 시그날 전달 의존적인 방출 기전이며, 생체 내의 혈소판의 활성화를 보다 정확하게 반영하는 마커가 될 수 있다고 생각된다. 또한, CLEC-2는 인간에서는 혈소판·거핵구계로 발현이 거의 제한되기 때문에, 위양성이 적은 특이적인 마커가 된다.
유사한 기전으로 방출되는 가용성 GPVI는, GPVI 수용체 특이적인 아고니스트(アゴニスト) 자극에서는, 강력하게 생산되지만, 다른 공지 된 혈소판 활성화 아고니스트 자극에서는 그 생산이 매우 약하다.즉, 자극의 종류에 따라 생산량이 변하면, 마커로서의 해석이 매우 어려워진다. 그러나, sCLEC-2는, 특이적인 아고니스트 자극은 물론, 공지된 아고니스트 자극에서도 비슷한 수준으로 생산되기 때문에, 혈소판 활성화의 정량적 마커로서 최적인 분자이다.
이 sCLEC-2는, 채혈 조작의 제약을 받지 않는 것도 이점의 하나로서 들 수 있다. 즉, sCLEC-2는, 채혈 등의 경미한 자극으로 방출되는 PF4, βTG와 달리, 강한 혈소판 활성화에 의해 유리하기 때문에, 특수한 채혈 조작을 필요로 하지 않는다. 또한, 급성관 증후군 환자 혈장 중의 sCLEC-2 농도는 보통의 건강한 정상인의 수치보다 유의하게 상승하고 있는 데이터도 얻어져, 발병·예후의 예측이나 치료 효과의 판정을 실시하기 위한 모니터로서의 이용 가치도 높고, 종래의 활성화 마커와 비교하여 비약적으로 우수한 마커라고 생각된다. 또한, 뇌경색 환자 혈장에서도 sCLEC-2 농도는 상승하고, 또한 혈장 중의 sCLEC-2 농도가 높은 환자는 예후가 나쁘다는 것을 나타내고 있다.
본 발명에서는 이 혈장 중의 sCLEC-2 농도가 혈 중의 혈소판 수와 양(正)의 상관성을 갖는 것을 발견하였다. 즉, 혈소판이 많은 개체에서는 혈장 중 sCLEC-2 농도가 높아지고, 혈소판이 적은 개체에서는 혈장 중 sCLEC-2 농도가 낮아지는 경향이 보인다. 그 결과, 혈장 중의 sCLEC-2 농도는 혈 중의 혈소판 수의 영향을 받아 버려서 반드시 혈소판의 활성화를 나타내지 않는 경우가 있다.
따라서 혈장 중 sCLEC-2 농도를 혈 중 혈소판 수로 나누어 혈소판 당 sCLEC-2 방출량을 계산하여 이것을 지표로 하여 혈전성 질환의 진단을 하면, 혈 중 혈소판 수에 의존하는 것 없이, 혈소판의 활성화 정도를 평가할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면 혈장 중 sCLEC-2 농도를 pg/mL로 나타내고(A), 혈 중 혈소판 수를 1000개/㎟로 나타내고(B), A를 B로 나눈 숫자를 혈소판 활성화의 지표로 한다.
파종성 혈관내 응고증후군(DIC)은, 혈소판에 수반하여 활성화하는 전형적인 혈전 지혈 질환이다. 이 질환 환자에서는, 혈소판의 활성화와 함께 혈소판 수가 줄어든다. 이 병태를, 패혈증에 합병한 DIC군(DIC를 가진 패혈증 환자군)과 합병하지 않은 비DIC군((DIC를 가지지 않은 패혈증 환자군)을 이용하여, 혈장 중 sCLEC-2 농도와 sCLEC-2 농도/혈소판 수 양쪽으로 검토한 결과, sCLEC-2 농도/혈소판 수가 DIC에 대한 높은 진단 효율을 보였다. 즉, sCLEC-2 농도/혈소판 수는 DIC 군에서 유의하게 높은 값을 나타낸 것에 대하여, 혈장 중 sCLEC-2 농도는 DIC군이 비DIC 군에 대해 높은 값을 나타냈지만, 통계적 유의차는 얻지 못했다. 또한 DIC 군에서 sCLEC-2 농도/혈소판 수는 DIC 병태의 중증도와도 유의한 상관도 보였다. 따라서 이 sCLEC-2 농도/혈소판 수는 혈장 중 sCLEC-2 농도에 비해 훨씬 효율적이고 유용한 진단 지표가 될 수 있다고 말할 수 있다. 또한 보통의 건강한 정상인의 데이터와 비교하면 패혈증 환자는 DIC의 유무에 관계없이 sCLEC-2 농도/혈소판이 높은 값을 보였다. 따라서, 혈전 지혈 이상을 수반하는 중증 감염증인 패혈증의 유용한 진단 지표도 된다고 말할 수 있다.
이 지표는, 급성 관상 증후군 (협심증, 심근 경색), 뇌경색 등의 혈소판 혈전을 원인으로 하는 혈전 지혈 질환에서도, 혈중 혈소판 수의 영향을 받지 않고 혈소판 활성을 판정할 수 있으므로, sCLEC-2 농도에 비교하여 보다 효율적으로 유용한 지표이다.
본 발명에는, 지금까지 언급한 본 발명 방법을 실시하는데 이용할 수 있는 시스템, 상기 시스템을 구비한 전자 챠트(電子カルテ), 임상 검사 장치, 또는 병원내 검사 시스템, 본 발명 방법을 실시하는데 이용할 수 있는 키트 등이 포함된다.
본 발명의 시스템에는, 예를 들면, 가용성 CLEC-2 농도/혈소판 수를 측정(또는 결정)하기 위한 시스템, 혈소판 활성화 상태를 파악하기 위한 시스템, 혈전 지혈 질환의 진단을 보조하기 위한 시스템, 혈전 지혈 질환을 진단(또는 검출)하기 위한 시스템, 혈전 지혈 질환의 진단을 위하여 가용성 CLEC-2 농도/혈소판 수를 측정(또는 결정) 하기 위한 시스템 등이 포함된다.
본 발명의 어떤 시스템에도, (1) 피검대상 유래의 피검 시료 중의 가용성 CLEC-2 농도와 혈소판 수를 기억할 수 있는 기억 수단, (2) 상기 가용성 CLEC-2 농도를 상기 혈소판 수로 나눔에 의해, 가용성 CLEC-2 농도/혈소판 수의 값을 계산할 수 있는 계산 수단, (3) 얻어진 피검 대상의 상기 가용성 CLEC-2 농도/혈소판 수의 값을, 보통의 건강한 대상의 가용성 CLEC-2 농도/혈소판 수의 값과 비교할 수 있는 비교 수단, 및 (4) 상기 비교에 의해 얻어진 결과를 표시할 수 있는 표시 수단을 포함할 수 있다.
또는, 본 발명의 임의의 시스템은 프로세서 및 상기 프로세서의 제어하에 있는 메모리를 포함하는 컴퓨터를 포함하고, 상기 메모리는 (1) 피검 대상 유래의 피검 시료 중의 가용성 CLEC-2 농도와 혈소판 수를 상기 메모리에 기억시키는 기억 공정, (2) 상기 가용성 CLEC-2 농도를 상기 혈소판 수로 나눔에 의해, 가용성 CLEC-2 농도/혈소판 수의 값을 계산하는 계산 공정, (3) 상기 계산 공정으로 얻어진 상기 가용성 CLEC-2 농도/혈소판 수의 값을, 보통의 건강한 대상의 가용성 CLEC-2 농도/혈소판 수의 값과 비교하는 비교 공정, 및 (4) 상기 비교 공정에서 얻어진 결과를 표시하는 표시 공정을 상기 컴퓨터에 실행시키기 위한 프로그램을 기록시켜 둘 수 있다.
본 발명의 전자 챠트(電子カルテ), 임상 검사 장치, 또는 병원 내 검사 시스템에는, 본 발명의 시스템을 탑재시킬 수 있다.
본 발명의 시스템, 또는 본 발명의 전자 챠트, 임상 검사 장치, 또는 병원 내 검사 시스템 (이하, 본 발명의 시스템 등이라고 함)을 사용하여 본 발명 방법을 실시 할 수있다. 본 발명의 시스템 등을 이용하여 측정(또는 결정)할 수 있는 「가용성 CLEC-2 농도/혈소판 수의 값」, 본 발명의 시스템 등을 이용하여 파악할 수 있는 「상태, 질환 등」과 이들의 「판정·판단 기준 등」, 「가용성 CLEC-2 농도 및 혈소판 수」의 각 측정 방법 등에 대해서는, 본 발명 방법에 관해서 전술한 설명을 그대로 적용할 수 있다.
본 발명의 키트에는, 예를 들면, 가용성 CLEC-2 농도/혈소판 수의 측정(또는 결정)용 키트, 혈소판 활성화 상태의 파악용 키트, 혈전 지혈 질환의 진단(또는 검출)용 키트, 혈전 지혈 질환을 진단하기 위한 가용성 CLEC-2 농도/혈소판 수의 측정(또는 결정)용 키트 등이 포함된다.
본 발명의 키트에는, (1) 가용성 CLEC-2측정 시약 및 /또는 혈소판 측정 시약, (2) 가용성 CLEC-2 농도/혈소판 수의 값과, 혈소판 활성화 상태와의 연관을 기재한 첨부 문서를 포함할 수 있다.
상기 첨부 문서에는, sCLEC-2 농도/혈소판 수의 계산법을 넣어두는 것도 중요하다. 이 키트를 사용해서 혈장 중의 sCLEC-2 농도와 sCLEC-2 농도/혈소판 수의 양쪽을 사용하여 혈소판 활성화의 평가용 또는 지혈 질환의 진단용의 키트로 할 수 있다. 상기 시약 키트를 사용하여 sCLEC-2 농도/혈소판 수를 계산하면, 혈소판 활성화 이상증이나 혈전증 등의 질환의 검출을 필요시에 간편·신속하게 행할 수 있어서, 그 결과를 다른 질환과의 감별이나 치료 방침의 결정 등에 도움이 될 수 있다.
또한, 본 발명의 키트에 포함된 상기 첨부 문서는, 적어도, 혈장 중 sCLEC-2 농도/혈소판 수와 혈소판 활성화의 정도나 각종 질환과의 관계를 언급하는 것이라면, 특별히 한정되는 것은 아니고, 상기 언급에 더하여, 예를 들어, 본 발명의 키트를 사용한 면역학적 측정의 실시 순서에 관한 설명, 얻어진 측정치에 기초하여 혈장 중 sCLEC-2 농도/혈소판 수와 혈소판 활성화 정도나 각종 질환을 검출하는 순서에 관한 설명, 키트 자체의 보존·취급 등에 관한 주의사항 등을 포함할 수 있다.
[실시예]
이하, 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하나, 이것들은 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
《실시예 1: 인간 혈장 중의 sCLEC-2 농도의 측정》
특허 제6078845호 명세서의 실시예 6에 따라서, 인간 혈장 중의 sCLEC-2 농도(pg/mL)를 측정했다.
특허 제 6078845호 공보의 실시예에서 제작한 마우스 항인간 CLEC-2 모노클로날 항체(1-11D5, 3-11E6 항체)를 이용하여 샌드위치 ELISA계를 구축했다. 즉, 0.05 mol/L 탄산 완충액（pH 9.5)로 정제한 1-11D5 항체(F(ab)'2)을 10 μg/mL로희석하여, 면역플레이트(イムノプレ-ト, Maxisorp, NUNC)에 100 μL／웰(ウェル) 첨가했다. 4 ℃에서 하룻밤 반응 후, 0.05 ％ Tween-20을 포함하는 붕산 완충 생리 식염수(BBS)로 3 회 세정하고, 1 % 소혈청 알부민(BSA)을 포함하는 인산 완충 생리식염수(PBS)를 각 웰에 200 μL 첨가하고 블로킹하였다. 다음으로 '샘플' 및 '표준 시료(standard)로서, 특허 제6078845호 공보의 실시예 3에서 작성한 인간 CLEC-2(hCLEC-2) 단백질'를 10 % SuperBlock, 0.1 % 옥탄산나트륨, 0.14 mol/L 염화나트륨/PBS를 사용하여 희석하였다. 또한 측정 샘플로서 혈장을 사용하는 경우는 5배 이상으로 희석하고, 각각 100 μL/웰로 첨가하고, 37 ℃에서 1시간 반 진탕(
)하면서 반응시킨 후, 마찬가지로 3회 세정했다. 특허 제 6078845호 공보의 실시예 5에서 조제한 Biotin 표지된 3-11E6 항체(F(ab)'2-Biotin)를 10 % SuperBlock, 0.1 % 옥탄산나트륨, 0.14 mol/L 염화나트륨/PBS로 1.0 ㎍/mL로 희석하고, 각 웰에 100 μL 첨가하였다. 37 ℃에서 1시간, 진탕시키면서 반응시킨 후, 동일한 방법으로 3회 세정했다. 이어서, AMDEX streptavidin-conjugated horseradish peroxidase(GE Healthcare)를 10 % SuperBlock,0.1 % 옥탄산나트륨, 0.14 mol/L 염화나트륨/PBS로 희석하고, 각 웰에 100 μL 첨가하였다.37 ℃에서 1시간 진탕하면서 반응시킨 후, 동일한 방법으로 5회 세정하고, 테트라메틸벤지딘(テトラメチルベンジジン;TMB) 용액을 각 웰 100 μL 첨가하였다.실온에서 약 20 분간 반응 후, 2 N 황산 용액으로 반응을 정지시켰다. 플레이트 분광 광도계(BIO-TEK INSTRUMENTS사 /EL312e)로 450 nm (-620 nm)의 흡광도를 측정하였다.
《실시예 2:인간 전혈 중의 혈소판 수 측정》
인간 전혈 중의 혈소판 수의 측정은, Sysmex 사의 자동 혈구 측정 장치 (XN-550)를 사용하여 수행하였다. 혈소판 수는 1000 개/mm 3 으로 나타냈다.
《실시예 ３:ｓCLEC-2 농도/ 혈소판 수의 산출》
실시예 1에서 측정한 sCLEC-2 농도의 측정값, 실시예 2에서 측정한 혈소판 수, 이들 값으로부터 산출한 sCLEC-2 농도/혈소판 수의 값을 표 1에 나타낸다. 측정 검체는, 패혈 증례 32례(파종성 혈관내 응고 증후군(DIC) 발증례가 20례, 비DIC 발증예가 12례)이며, 일본 구급 의학회 급성기 DIC 진단 기준에 의해 진단했다. 또한, 각 측정치는 입원 1일째에 채취한 검체의 측정치이다. 또한 보통의 건강한 사람 37례의 혈장 중 sCLEC-2 농도와 혈중혈소판 수를 측정하고, sCLEC-2 농도/혈소판 수를 계산하였다. 보통의 건강한 사람의 sCLEC-2 농도, 혈소판 수, sCLEC-2 농도/혈소판 수의 평균 ±표준 편차는 각각 87 ± 38.9 (pg/mL), 263 ± 63.4(1000개/mm3), 0.34 ± 0.15였다.
전패혈증 환자, 패혈증 환자의 DIC 발증례(DIC), 패혈증 환자의 DIC 비발증례(n-DIC)마다에, 실시예 1에서 측정한 sCLEC-2 농도의 측정치(sCLEC-2), 실시예 2에서 측정한 혈소판 수(PLT)의 상관을 조사한 결과, sCLEC-2 농도와 혈소판 수 사이에 통계적으로 유의한 상관이 관찰되었다(도 1). 패혈증 환자의 DIC 발증례, 패혈증 환자의 DIC 비발증례와의 사이에서 sCLEC-2 농도 및 혈소판 수로부터 산출한 sCLEC-2 농도/혈소판 수의 값을 산출하여 비교를 한 결과, sCLEC-2 농도에서는 두 그룹 간에 유의한 상관 관계가 보이지 않았지만 (p = 0.25), sCLEC-2 농도/혈소판 수에서는 두 그룹간에 유의한 차이 (p = 0.0008)가 있음을 확인했다(도 2). 이를 통해 sCLEC-2는 혈소판 활성화뿐만 아니라 혈소판 수에도 영향을 받았으며, 혈소판 수당 sCLEC-2 양의 쪽이 더 혈소판의 활성을 나타내는 것으로 확인되었다. 또한, 패혈증이면 DIC의 유무에 관계없이 보통의 건강한 사람보다 sCLEC-2 농도 및 sCLEC-2 농도/혈소판이 높은 값을 나타내기 때문에 이들은 패혈증의 진단에도 유용한 것을 보였다.
《실시예 ４: ROC 곡선에 기초한 바이오 마커로서의 평가》
실시예 3에서 얻어진 측정값 및 계산값을 이용하여 ROC (Receiver Operatorating Characteristic) 곡선을 작성하고, 곡선하면적(AUC)을 산출하였다. 도 3에 sCLEC-2 농도의 결과(실선)와 sCLEC-2 농도/혈소판 수의 결과(점선)를 나타낸다. ROC 곡선의 AUC는 sCLEC-2 농도가 0.628, sCLEC-2 농도/혈소판 수가 0.866, 혈소판 수가 0.732였다. AUC는 1.0에 가까울수록 진단능이 높다고 여겨지며, sCLEC-2 농도/혈소판 수가 최상의 진단능을 나타냈다.
본 발명은, 혈소판 활성화 상태를 파악하는데 이용할 수 있고, 혈전 지혈 질환 등의 검사에 이용할 수 있다.
Claims (10)
- (1) 피검 대상 유래의 피검 시료 중의 가용성 CLEC-2 농도와 혈소판 수를 측정하는 공정, 및
(2) 상기 가용성 CLEC-2 농도 및 상기 혈소판 수로부터 혈소판 활성화 상태를 파악하는 공정을 포함하는, 혈소판 활성화 상태 파악을 보조하는 방법. - (1) 피검 대상 유래의 피검 시료 중의 가용성 CLEC-2 농도와 혈소판 수를 측정하는 공정, 및
(2) 상기 가용성 CLEC-2 농도를 상기 혈소판 수로 나눔으로써, 가용성 CLEC-2 농도/혈소판 수의 값을 계산하는 공정을 포함한, 혈소판 활성화 상태 파악을 보조하는 방법. - 건강한 대상에서 유래된 피검 시료를 사용하여 얻은 가용성 CLEC-2 농도/혈소판 수의 값과 비교하는 단계를 추가로 포함하는, 청구항 2 항에 기재된 방법.
- 상기 가용성 CLEC-2 농도/혈소판의 값이, 혈전 지혈 질환의 병태를 반영하는 마커인, 청구항 2 또는 3의 방법.
- 상기 혈전 지혈 질환이, 파종성 혈관내 응고증후군(DIC), 심근경색, 협심증, 뇌경색, 폐색성 동맥경화증, 심부정맥혈전증, 폐혈전 색전증, 심원성 뇌경색, 항인지질 증후군, 패혈증 중 어느 것인, 청구항 4에 기재된 방법.
- 혈전 지혈 질환 환자를 대상으로서, 상기 혈전 지혈 질환의 예후 또는 치료 경과를 모니터링하는 방법으로서 사용하기 위한, 청구항 1 ~ 5의 어느 한 항에 기재된 방법.
- (1) 피검 대상 유래의 피검 시료 중의 가용성 CLEC-2 농도와 혈소판 수를 기억할 수 있는 기억 수단,
(2) 상기 가용성 CLEC-2 농도를 상기 혈소판 수로 나눔으로써, 가용성 CLEC-2 농도/혈소판 수의 값을 계산할 수 있는 계산 수단,
(3) 얻어진 피검 대상의 상기 가용성 CLEC-2 농도/혈소판 수의 값을, 보통의 건강한 대상의 가용성 CLEC-2 농도/혈소판 수의 값과 비교할 수 있는 비교 수단, 및
(4)상기 비교에 의해 얻어진 결과를 표시할 수 있는 표시 수단을 포함하는,
혈소판 활성화 상태를 파악하기 위한 시스템. - 프로세서 및 상기 프로세서의 제어화에 있는 메모리를 포함하는 컴퓨터를 구비하고, 상기 메모리에는, 하기 공정：
(1) 피검 대상 유래의 피검 시료 중의 가용성 CLEC-2 농도와 혈소판 수를 상기 메모리에 기억시키는 기억 공정,
(2) 상기 가용성 CLEC-2 농도를 상기 혈소판 수로 나누어 가용성 CLEC-2 농도/혈소판 수의 값을 계산하는 계산 공정,
(3)상기 계산 공정에서 얻어진 상기 가용성 CLEC-2 농도/혈소판 수의 값을, 보통의 건강한 대상의 가용성 CLEC-2 농도/혈소판 수의 값과 비교하는 비교 공정, 및
(4) 상기 비교 공정에서 얻어진 결과를 표시하는 표시 공정을 상기 컴퓨터에 실행되도록 하기 위한 프로그램이 기록되어 있는, 혈소판 활성화 상태를 파악하기 위한 시스템. - 청구항 7 또는 8에 기재된 시스템을 구비한 전자 챠트, 임상 검사 장치 또는 병원내 검사 시스템.
- (1) 가용성 CLEC-2측정 시약 및/또는 혈소판 측정 시약, 및
(2) 가용성 CLEC-2 농도/혈소판 수의 값과, 혈소판 활성화 상태와의 관련을 기재한 첨부 문서를 포함하는 혈소판 활성화 상태 파악용 키트.
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