WO2022255348A1 - 可溶型ｃｌｅｃ２を用いた急性脳血管障害のリスク評価方法 - Google Patents
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Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
Definitions
- the present invention relates to a method for evaluating the risk of acute cerebrovascular accident using soluble CLEC2.
- Stroke is a group of diseases that includes ischemic stroke, which occurs when a blood vessel in the brain is clogged, that is, cerebral infarction, and hemorrhagic stroke, which occurs when a blood vessel in the brain is cut, that is, cerebral hemorrhage and subarachnoid hemorrhage. It is the second most common cause of death, after ischemic heart disease. Stroke is not only a major cause of death, but it often leaves severe aftereffects even after survival, and is a major factor in the need for nursing care. Therefore, it is necessary to have a system that enables prevention, early diagnosis, prompt response after diagnosis, and care and risk management by a wide range of medical professionals.
- cerebral infarction occurs when a blood vessel in the brain narrows or when a blood clot formed in another place blocks a blood vessel in the brain, preventing oxygen and nutrients from reaching the brain. Necrosis of nerve cells in the brain causes various disorders.
- the thrombus that causes cerebral infarction is classified into cardiogenic cerebral embolism, in which a thrombus formed in the heart travels through the blood vessels and clogs an artery in the brain, and noncardiogenic cerebral infarction, which is caused by a thrombus formed in a place other than the heart. broadly classified.
- fibrin is considered to be the main thrombus, and anticoagulants (warfarin and DOAC) that suppress the formation of fibrin are used for treatment and secondary prevention.
- the main thrombus is considered to be platelets, and antiplatelet drugs (aspirin, clopidogrel, etc.) that suppress platelet activation are used for treatment and secondary prevention. That is, since the treatments for cardiogenic cerebral ischemic stroke and non-cardiogenic stroke are clearly different, it is important to correctly diagnose whether it is cardiogenic or non-cardiogenic.
- Cardiogenic cerebral infarction is a relatively large infarct caused by a thrombus formed due to stasis of blood flow in the atria due to atrial fibrillation, which travels through the bloodstream and reaches the brain to cause an infarction.
- the diagnosis is made based on the observation of a large infarction in MRI images and information on past conditions such as atrial fibrillation, arrhythmia, and heart disease.
- non-cardiogenic cerebral infarction is roughly classified into atheromatous and lacunar.
- Atherosclerotic cerebral infarction clogs relatively large arteries and lacunar clogs small blood vessels, so diagnosis is made based on information such as the size of the infarct from MRI images, the state of arteriosclerosis, and metabolic abnormalities from blood tests.
- Atrial fibrillation is detected by an electrocardiogram, but it can be persistent or sudden, and sudden cases are difficult to detect easily. In addition, there are many cases in which images of atherogenic cerebral infarction and cardiogenic cerebral infarction cannot be clearly distinguished.
- TIA transient ischemic attack
- TIA refers to a condition in which blood vessels are constricted or clogged with thrombus, similar to cerebral infarction, but the event is transient, and symptoms similar to cerebral infarction occur transiently.
- TIA was considered to be the disappearance of ischemic symptoms in the brain within 24 hours.
- Today due to advances in imaging technology, there are more and more cases of cerebral infarction being detected by imaging even after symptoms have disappeared. defined as "temporary neurological dysfunction due to focal ischemia of the brain, spinal cord, or retina without acute infarction," and distinguishes between infarction and TIA, regardless of symptom duration.
- a patient with disappearance of symptoms but a cerebral infarction seen on imaging is defined as a cerebral infarction
- a TIA is defined as a patient whose symptoms have disappeared and no cerebral infarction is observed on imaging.
- the WHO World Health Organization
- International Classification of Diseases ICD-11, 2018
- TIA must not have an infarct focus, and the concept of judging by imaging has become a global consensus.
- TIA cerebrovascular diseases
- cerebral infarction cerebral hemorrhage
- subarachnoid hemorrhage subarachnoid hemorrhage
- TIA is clearly distinguished as a separate disease from cerebral infarction. Diagnosis of a TIA is extremely important, even when symptoms have disappeared. That's because TIA patients often have an early onset of stroke. As a result of multiple clinical studies, it has been reported that 10 to 15% of TIA cases develop cerebral infarction within 3 months, and half of them develop within 48 hours, which is conventionally believed. It turns out that stroke often develops much earlier than expected. Based on such data, the Japan Stroke Society recommends that "immediate start of preventive treatment when TIA is suspected" in the "Stroke Treatment Guidelines" issued in 2009. In other words, TIA is said to be a precursor to cerebral infarction, which is a serious disease.
- the presence or absence of a lesion is required for the diagnosis of TIA. (17% within 6 hours, 37% after 24 hours).Also, it is said that many of the cases in which there was no lesion in the first DWI show lesions in the second DWI. That is, according to the definition of cerebral infarction when a lesion is observed on the image and TIA when no lesion is detected, the timing of DWI has a great influence on the diagnosis.
- CLEC2 C-type lectin-like receptor 2
- sCLEC2 soluble CLEC-2
- thrombus formation when a blood vessel is ruptured, platelets are first activated and aggregated to form a primary thrombus. Subsequent thrombi are assumed to form.
- the platelet system and the coagulation system are mutually activated, and a hemostatic thrombus formed of platelets, fibrin, and red blood cells involved in them is observed.
- Cerebral infarction is a serious disease with a high mortality rate, and even if death is avoided, sequelae often remain.
- about 15% of TIA cases are known to cause cerebral infarction, so early diagnosis and preventive treatment are extremely important. This is because if TIA can be diagnosed, appropriate antithrombotic therapy can significantly reduce the probability of subsequent cerebral infarction.
- Patients diagnosed with TIA should be monitored by a doctor for, for example, one week after the onset of cerebral infarction. It is also possible to significantly improve the aftereffects. This is because the earlier the treatment of cerebral infarction, the better, and it is a race against time.
- a diagnosis of TIA is made by interviewing clinical symptoms and assessing the patient's risk. Namely, paralysis of limbs on one side (movement disorder), numbness on one side (sensory disturbance), speech impediment, slurred speech (speech disorder), blurred vision on one side (visual impairment), and numbness on one side
- the main symptom is difficulty in seeing certain things (visual field disorder), but these symptoms disappear within a few minutes to an hour at most.
- Patient risk assessment is also widely performed to compensate for the difficulty of such interviews.
- the ABCD2 score is typical, but it is evaluated by scoring Age (age), Blood Pressure (blood pressure), Clinical Feature (clinical symptoms), Diabetes (diabetes), Duration of Symptoms (duration of symptoms) It is something to do. This is only an evaluation of the risk of developing cerebral infarction afterward, and does not diagnose TIA itself. Thus, there is no objective imaging test or blood test that can augment clinical inquiry in diagnosing TIA.
- an object of the present invention is to provide a simple, rapid and objective risk assessment method by a blood test that can reinforce the clinical symptom inquiry for the diagnosis of TIA, and to provide a risk assessment method for acute cerebrovascular disorders such as cerebral infarction and TIA.
- An object of the present invention is to provide a simple, rapid, and objective blood test-based risk assessment method that can supplement images, electrocardiograms, and conventional blood tests for the differential diagnosis of cardiogenic and non-cardiogenic diseases.
- the present inventors have made intensive studies to solve the above problems. As a result, it was found that the sCLEC2 concentration in the blood of TIA patients was significantly elevated compared to healthy subjects. The present inventors have found that sCLEC2 can be at a high level even in a state where there is no infarction and no thrombus can be confirmed, such as in TIA, but not in a state where there is an infarction and thrombus is present, such as cerebral infarction. This is consistent with the fact that TIA patients have a high probability of having a stroke in the near future.
- an appropriate threshold that is, a cutoff value is required to determine the risk using sCLEC2 concentration.
- the TIA cutoff value for the blood sCLEC2 concentration is preferably 66 pg/mL or more and 148 pg/mL or less.
- infarction images cannot be used to determine cardiogenic or non-cardiogenic cardiogenicity.
- sCLEC2 in the blood of cerebral infarction patients was measured, it was found that sCLEC2 measured values were significantly higher in non-cardiogenic patients than in cardiogenic patients. Based on this knowledge, D-dimer, a biomarker indicating the presence of fibrin thrombi, was simultaneously measured, and the ratio of sCLEC2 to D-dimer (sCLEC2/D-dimer ratio) was calculated. It was found that the sCLEC2/D-dimer ratios in patients with cardiogenic disease were significantly higher than those in cardiogenic patients. That is, sCLEC2 represents platelet activity, and D-dimer represents the presence of fibrin thrombus. By using the ratio of sCLEC2 to D-dimer for determining cardiogenicity, it is possible to provide a method for assisting more accurate diagnosis in addition to conventional methods.
- the present invention provides: [1] Risk of acute cerebrovascular accident, including the step of measuring the concentration of soluble CLEC2 present in blood collected from patients suspected of having acute cerebrovascular accident or diagnosed with acute cerebrovascular accident How to do the evaluation.
- [2] A method for risk assessment of a patient suspected of having acute cerebrovascular accident or a patient diagnosed with acute cerebrovascular accident comprising: (1) providing a blood sample from said patient; (2) determining the concentration of soluble CLEC2 in the sample; (3) correlating the soluble CLEC2 concentration with the presence or absence of acute cerebrovascular accident in the patient, the likelihood of outcome, or whether it is cardiogenic or non-cardiogenic;
- the method of [1] comprising [3] A method for risk assessment of a patient suspected of having acute cerebrovascular accident or a patient diagnosed with acute cerebrovascular accident, wherein the soluble CLEC2 concentration and the presence of acute cerebrovascular accident in the patient or correlating absence, likelihood of outcome, or whether cardiogenic or non-cardiogenic, assessing whether said patient is at risk based on changes
- a method for risk assessment of a patient suspected of having acute cerebrovascular accident or a patient diagnosed with acute cerebrovascular accident comprising: (1) providing a blood sample from said patient; (2) determining the concentration of soluble CLEC2 in the sample; (3) measuring the platelet count in the sample; (4) dividing the soluble CLEC-2 concentration by the platelet count; (5) correlating the value obtained by dividing the soluble CLEC2 concentration by the platelet count with the presence or absence of acute cerebrovascular accident in the patient, the possibility of outcome, or whether it is cardiogenic or non-cardiogenic; process, The method of [1], comprising [6] A method for assessing the risk of acute cerebrovascular accident in a patient suspected of having acute cerebrovascular accident or diagnosed with acute cerebrovascular accident, wherein the acute cerebrovascular accident is transient cerebral ischemia Stroke, and in the step of correlating the value obtained by dividing the soluble CLEC2 concentration by the platelet count with the transient ischemic attack, the cutoff value of the value obtained by dividing the soluble
- a method for assessing the risk of acute cerebrovascular accident in a patient suspected of having acute cerebrovascular accident or diagnosed with acute cerebrovascular accident, wherein said acute cerebrovascular accident is cardiogenic or non-cardiac Any of the methods of [1] to [4], which provides materials for determining whether the substance is priming.
- a method for risk assessment of acute cerebrovascular accident in a patient suspected of having acute cerebrovascular accident or diagnosed with acute cerebrovascular accident comprising: (1) providing a blood sample from said patient; (2) determining the concentration of soluble CLEC2 in the sample; (3) measuring the platelet count in the sample; (4) dividing the soluble CLEC-2 concentration by the coagulation fibrinolysis marker; (5) The value obtained by dividing the soluble CLEC2 concentration by the coagulation fibrinolytic marker, and the presence or absence of acute cerebrovascular accident in the patient, the possibility of outcome, or whether it is cardiogenic or non-cardiogenic correlating; The method of [1], comprising [9] A method for assessing the risk of acute cerebrovascular accident in a patient suspected of having acute cerebrovascular accident or diagnosed with acute cerebrovascular accident, wherein the coagulation and fibrinolysis marker is D-dimer.
- a method for assessing the risk of acute cerebrovascular accident in a patient suspected of having acute cerebrovascular accident or diagnosed with acute cerebrovascular accident, wherein providing a sample derived from the patient is The method of any one of [1] to [9], which is collected from the patient within 48 hours after the onset of symptoms of vascular disorder.
- the step of determining the soluble CLEC2 concentration is a highly sensitive immunoassay, such as a chemiluminescence immunoassay, an electrochemiluminescence immunoassay, or a fluorescence immunoassay; either way.
- Measure (or determine) the soluble CLEC2 concentration in the sample (or the soluble CLEC-2 concentration divided by the platelet count, or the soluble CLEC-2 concentration divided by the coagulation fibrinolytic marker) a method for risk assessment of acute cerebrovascular accident
- Measure (or determine) the soluble CLEC2 concentration in the sample (or the soluble CLEC-2 concentration divided by the platelet count, or the soluble CLEC-2 concentration divided by the coagulation fibrinolytic marker) a method to aid in risk assessment of acute cerebrovascular accident
- the soluble CLEC2 concentration in the sample or the value obtained by dividing the soluble CLEC-2 concentration by the platelet count, or the soluble CLEC-2 concentration with a coagulation fibrinolytic marker method of measuring (or determining)
- FIG. 1 is a graph comparing plasma concentrations of sCLEC2 between TIA patients and healthy subjects.
- FIG. 10 is an ROC curve (Receiver Operating Characteristic Curve) when TIA is diagnosed by measuring sCLEC2 concentration in blood.
- FIG. 3 is a graph comparing sCLEC2 concentrations in 3 groups of healthy subjects, cardiogenic cerebral infarction patients, and non-cardiogenic cerebral infarction patients by measuring sCLEC2 concentrations in healthy subjects and cerebral infarction patients. It is a ROC curve when differential diagnosis of cardiogenic cerebral infarction and non-cardiogenic cerebral infarction is made using sCLEC concentration of cerebral infarction patients.
- ROC curve when differential diagnosis of cardiogenic cerebral infarction and non-cardiogenic cerebral infarction is made using the D-dimer concentration of cerebral infarction patients.
- Fig. 10 is a ROC curve when the sCLEC2/D-dimer ratio of cerebral infarction patients is used to make a differential diagnosis between cardiogenic cerebral infarction and non-cardiogenic cerebral infarction.
- CLEC2 is a platelet-activating receptor belonging to the C-type lectin family, normally present in the platelet membrane, but is released into the blood following platelet activation.
- soluble CLEC2 sCLEC2
- sCLEC2 refers to CLEC2 or CLEC2-derived molecules released from such platelets and detected in blood (in buffer when incubated in buffer).
- sCLEC2 is said to include a protein with a molecular weight of about 40 kDa, a protein with a molecular weight of about 32 kDa, a protein with a molecular weight of about 25 kDa, etc. in SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) under reducing conditions (Non-Patent Document 1).
- SDS-polyacrylamide gel electrophoresis SDS-polyacrylamide gel electrophoresis
- Non-Patent Document 1 A protein with a molecular weight of about 40 kDa and a protein with a molecular weight of about 32 kDa are present on the platelet membrane surface and are presumed to be released in a state contained in microparticles produced with platelet activation. It is considered that sugar chains are added to these.
- a protein with a molecular weight of about 25 kDa is considered to be cleaved by protease and released from platelets along with platelet activation.
- the amount of sCLEC2 as described above is measured.
- sCLEC2 may detect a protein with a molecular weight of about 40 kDa, a protein with a molecular weight of about 32 kDa, and a protein with a molecular weight of about 25 kDa collectively, or may detect only a protein with a molecular weight of about 25 kDa.
- the sCLEC2 concentration used in the present invention may be used alone or in combination with other biomarkers.
- a value obtained by dividing the sCLEC2 concentration by the platelet count (hereinafter sometimes referred to as C2PAC index) may be used.
- C2PAC index a value obtained by dividing the sCLEC2 concentration by the platelet count
- the sCLEC2 concentration is interpreted to include both the case of using the sCLEC2 concentration and the case of dividing the sCLEC2 concentration by the platelet count.
- the samples used for measurement are preferably derived from humans, but samples derived from animals other than humans may be used to understand the pathology of experimental animals.
- Experimental animals include, but are not limited to, guinea pigs, rats, mice, dogs, and the like.
- the method for detecting the presence of sCLEC2 is not particularly limited, but an immunological method using an antibody that recognizes sCLEC2 (hereinafter sometimes referred to as "anti-sCLEC2 antibody”) is preferred.
- immunologically detecting proteins include enzyme immunoassay (ELISA method), chemiluminescence immunoassay, electrochemiluminescence immunoassay, fluorescence immunoassay, radioimmunoassay, and immunochromatography. Any method can be used as long as it is an immunoassay method using a labeled antibody such as , Western blotting method, latex agglutination method, immunoturbidimetric method, and the like.
- a sample is collected from the target subject (especially a patient), for example, using a blood collection tube for plasma blood collection.
- a collection tube containing citric acid, which leaves little residual platelets, is usually suitable, but a tube containing heparin or EDTA is also possible.
- a blood collection tube containing EDTA is used for blood platelet count measurement, but separate blood collection tubes may be used for simultaneous blood collection.
- Plasma sCLEC2 concentration is measured, for example, by using plasma that has been centrifuged at 2000 g for about 20 minutes, but the conditions for centrifugation are not limited to this, and a measurement system using whole blood may also be used.
- the measurement of plasma sCLEC2 concentration will be described as an example, but the present invention is not limited to this. It is preferable that blood is collected from the patient before 48 hours have passed since the symptoms appeared, but even if 48 hours have passed, it can be used in the present invention. More preferably within 24 hours, still more preferably within 18 hours, and most preferably within 12 hours.
- acute cerebrovascular accident includes, but is not limited to, ischemic stroke such as cerebral infarction and TIA.
- TIA means a case in which cerebral infarction-like symptoms are transiently exhibited, but infarction cannot be confirmed by imaging examination.
- Cerebral infarction-like symptoms include, for example, paralysis of the limbs on one side (motor disorder), numbness on one side (sensory disturbance), inability to speak or speak slurred words (speech disorder), and difficulty seeing in one eye. (visual impairment), difficulty seeing things on one side (visual field impairment), and the like, but are not limited to these.
- a patient with cerebral infarction is a patient with an infarct image confirmed in the brain by MRI, CT, etc., in addition to the above clinical symptoms.
- Cerebral infarction is a state in which a cerebral artery is occluded (infarction), and it is clear that there is a thrombus in this case. It is considered to be In addition, disseminated intravascular coagulation (DIC), thrombotic microangiopathy (TMA), and deep vein thrombosis are pathological conditions in which clots are clearly observed, so it is natural that sCLEC2 is elevated. Conceivable. However, the presence of thrombus cannot be confirmed in a state where infarction cannot be confirmed, such as TIA, and it was thought that thrombosis-related markers (for example, D-dimer is famous) would not rise so much. The concentration of sCLEC2, which is suggested to be used as a biomarker, has increased, and it was surprising that it can be used as a blood biomarker for TIA risk assessment.
- the sCLEC2 concentration value of a patient suspected of having TIA is higher than that of healthy subjects or non-thrombotic disease groups, it can be judged that the possibility of TIA is high. Based on such a comparison, the sCLEC2 concentration before and after prophylactic treatment for cerebral infarction in TIA patients can be compared to predict the risk of developing cerebral infarction.
- the threshold value is appropriately set and used by comparing the sCLEC2 concentration in the patient-derived sample and the sCLEC2 concentration in the healthy subject-derived sample. can do.
- TIA can be evaluated when a significant change in sCLEC2 concentration is detected from the chronological record of sCLEC2 concentration measured before onset in the same patient.
- the blood sCLEC2 concentration is measured in a patient who describes symptoms suspected of TIA, and if the value is higher than that of healthy subjects, the possibility of TIA is high. Furthermore, it is possible to perform a test and administer an antiplatelet drug such as aspirin or an anticoagulant drug such as warfarin according to the risk determination. In addition, sCLEC2 concentration measurement is performed after taking antiplatelet drugs or anticoagulants as treatment after being diagnosed with TIA, and if the level is high, a treatment strategy can be determined, such as changing to a different type of drug or adding an additional dose. It contributes to the study for the purpose.
- an antiplatelet drug such aspirin or an anticoagulant drug such as warfarin
- sCLEC2 concentration measurement is performed after taking antiplatelet drugs or anticoagulants as treatment after being diagnosed with TIA, and if the level is high, a treatment strategy can be determined, such as changing to a different type of drug or adding an additional dose. It contributes to the study for the purpose.
- the original data or statistically processed data for calculating the determination threshold value data showing the correlation between the sCLEC2 concentration in plasma and the degree of platelet activation or various diseases may be used.
- a method for calculating the cut-off value analysis is performed to create an ROC curve (Receiver Operating Characteristic Curve) from the measured sCLEC2 value in plasma, and both the sensitivity and specificity of diagnosis are 80% or more. can be used as a cut-off value.
- a cutoff value can be calculated by performing a similar analysis when using a C2PAC index, which is a value obtained by dividing the sCLEC2 concentration by the platelet count.
- the cutoff value when using the C2PAC index can be 0.7.
- sCLEC2 is released into the blood with platelet activation.
- Existing platelet activation markers such as platelet factor 4 (PF4) and ⁇ -thromboglobulin ( ⁇ TG) have a problem of causing non-specific release due to physical stimulation by blood collection, but sCLEC2 is a signaling-dependent release mechanism that triggers platelet activation, and can be a marker that more accurately reflects platelet activation in vivo.
- PF4 platelet factor 4
- ⁇ TG ⁇ -thromboglobulin
- CLEC2 since CLEC2 is almost exclusively expressed in the platelet/megakaryocyte system in humans, it can be a platelet-specific marker with less false positives. Therefore, by measuring sCLEC2, it becomes possible to diagnose the platelet activation state at an early stage, and it can be used for the diagnosis of TIA.
- the measured sCLEC2 concentration may be divided by platelets and used for risk assessment. If the sCLEC2 concentration decreases with treatment, platelet activation tends to be suppressed. However, if the sCLEC2 concentration continues to be high or increases, the antithrombotic drug should be reviewed, added, or increased. can be done.
- the sCLEC2 concentration divided by the platelet count is referred to as the C2PAC index, and what is described as the sCLEC2 concentration in the diagnosis of TIA, even if not explicitly described as the C2PAC index, All can be performed by replacing the sCLEC2 concentration with the C2PAC index.
- the platelet count is usually measured using an automatic blood cell counter (hematometer), but a blood cell counter and a microscope are used. It is also possible to count using
- the C2PAC index which expresses the sCLEC2 concentration in plasma, for example, in pg/mL, expresses the blood platelet count, for example, in 1,000/mm 3 , and calculates the sCLEC2 concentration/platelet count.
- Any unit such as ng/mL or ng/L may be used for the concentration of sCLEC2 used in , and any unit such as 10,000/ mm3 may be used for the platelet count. Units should be used.
- the sCLEC2 concentration/index can take on different values, but essentially the same concept.
- ratio calculations will often be performed using measurements from a clinical laboratory instrument that measures sCLEC2 concentrations and from a hemocytometer that measures platelet counts.
- This calculation is preferably automatically calculated on a system such as a hospital inspection system, a hospital system, or an electronic medical chart connected to both measuring instruments in daily practice.
- a connecting system may be constructed, or a machine capable of simultaneously measuring sCLEC2 concentration and platelet count may be constructed.
- you may calculate manually using both data.
- those that show the correlation between the sCLEC2 concentration in plasma, the degree of platelet activation, and various diseases are used, for example, as the threshold for judgment, or the original data or statistically processed data for calculating the threshold for judgment.
- the plasma sCLEC2 concentration is divided by the blood platelet count to calculate the amount of sCLEC2 released per platelet, and this is used as an index for diagnosing thrombotic diseases, the platelet activity is not dependent on the blood platelet count. It is preferable because it makes it possible to evaluate the degree of conversion.
- the plasma sCLEC2 concentration is expressed as pg/mL (A)
- the blood platelet count is expressed as 1,000/mm 3 (B)
- the number obtained by dividing A by B is the number of platelet activation. It can be used as an index.
- the present invention does not exclude use in diagnosing cerebral infarction.
- Diagnosis of cerebral infarction includes, for example, unilateral limb paralysis (motor disorder), unilateral numbness (sensory disturbance), inability to speak, slurred speech (speech disorder), and unilateral visual impairment.
- Comprehensive judgment is made based on symptoms such as visual impairment (impaired vision), difficulty seeing objects on one side (visual field impairment), and the possibility of infarction being confirmed by imaging tests such as MRI.
- measuring the sCLEC2 concentration in blood according to the present invention is preferable because it can assist rapid and simple diagnosis of cerebral infarction.
- the present invention can meet this demand.
- blood sCLEC2 concentration is measured in patients diagnosed with acute cerebrovascular accident. At this time, it was confirmed that the sCLEC2 concentration was significantly elevated. If it is higher than the preset threshold, the probability of non-cardiogenic cerebral infarction is high, and if it is lower, it is judged that the probability of cardiogenic cerebral infarction is high. can do.
- the sCLEC2 concentration and other thrombostatic markers can be combined and used for differential diagnosis of cardiogenic cerebral infarction or non-cardiogenic cerebral infarction.
- blood sCLEC2 concentration and D-dimer concentration are measured in patients diagnosed with acute cerebrovascular accident. It is preferable to use samples drawn at the same time for the measurement, but the measurement may be performed using samples drawn separately. A person skilled in the art can appropriately determine the degree of influence even if there is a time difference in collecting blood for each concentration measurement.
- the concentration of sCLEC2 is divided by the concentration of D-dimer and used to calculate the sCLEC2/D-dimer ratio. In doing so, uniform concentration units should be used. It is preferably expressed in ⁇ g/mL, which is a general notation, but is not limited to this.
- Body (TAT) and prothrombin fragment F1+2 can also be used for determination of cardiogenicity/non-cardiogenicity in proportion to sCLEC2.
- thrombologic information such as whether the infarcted thrombus is fibrin-dominant or platelet-dominant, is very useful diagnostically.
- starting treatment is a matter of seconds, but in many cases it is unclear how long it will take to see an outpatient such as an emergency room.
- the differential diagnosis of cardiogenic cerebral infarction or non-cardiogenic cerebral infarction can be performed by a simple method such as the present invention, it will be possible to quickly select an appropriate treatment method. The use of evaluation methods is preferred.
- Anticoagulants and antiplatelet drugs are known as infusion therapeutic agents for the treatment of acute cerebral infarction, but the indications may differ even for the same anticoagulant.
- argatroban and heparin which are anticoagulants, are indicated for non-cardiogenic cerebral infarction, while heparin is indicated for cardiogenic cerebral infarction.
- anticoagulants argatroban
- argatroban if the infarct image is 1.5 cm or more within 2 days of onset, argatroban is indicated, but if it is not large or if it has been more than 3 days, it is not indicated. .
- the practice of the present invention is preferable because it not only enables cerebral infarction to be diagnosed, but also enables rapid differentiation between cardiogenic and non-cardiogenic stroke.
- drugs such as edaravone, which has a completely different mechanism of action from anticoagulants and antiplatelet drugs and are indicated for both cardiogenic and noncardiogenic drugs, are thought to reduce exacerbation of cerebral infarction by scavenging free radicals.
- treatment policies differ from country to country, such as the recent US treatment guidelines not mentioning them.
- the implementation of the present invention not only makes it possible to diagnose cerebral infarction, but also to rapidly distinguish between cardiogenic and non-cardiogenic infarction. preferred because it can be done.
- anticoagulants and antiplatelet drugs are first used in combination, and the next treatment strategy is determined while observing the effects in about 1 to 2 weeks.
- aspirin or warfarin is often selected as an oral drug.
- imaging tests can determine whether it is lacunar cerebral infarction, atherosclerotic cerebral infarction, or cardiogenic cerebral infarction, there is no difference in judgment, but even specialists can make judgments. It is said to be difficult.
- differential diagnosis of whether stroke is cardiogenic or noncardiogenic has been described, the use in the differential diagnosis of whether TIA is cardiogenic or noncardiogenic is described. is also possible.
- differential diagnosis of cardiogenic TIA and non-cardiogenic TIA it can be used in the same manner as in the differential diagnosis of cardiogenic cerebral infarction or non-cardiogenic cerebral infarction.
- TIA since no infarct image is observed in images such as MRI, such differential diagnosis can be made, which is more preferable.
- sCLEC2 concentration in plasma was measured according to the procedure shown below. (Preparation of measurement reagent and preparation of test sample) ⁇ Specimen diluent: 2% sodium octanoate and 0.5% n-octyl- ⁇ -D-glucoside (OG) using 0.1 mol/L HEPES buffer (pH 7.5) containing preservatives They were combined to obtain a specimen diluent.
- the antibody contained in the reagent was prepared as follows using the antibody described in Examples of Japanese Patent No. 6078845.
- ⁇ First antibody solution A mouse monoclonal antibody (11D5) that recognizes sCLEC2 was bound to magnetic latex particles (JSR) and dispersed in a 0.01 mol/L MES buffer solution (pH 6.0) containing a preservative. . -Second antibody solution: Another mouse monoclonal antibody (11E6) that recognizes sCLEC2 is labeled with alkaline phosphatase (ALP) by the maleimide method and dispersed in 0.01 mol/L MES buffer (pH 6.5) containing a preservative.
- ALP alkaline phosphatase
- Luminescent substrate solution 2-chloro-5-(4-methoxyspiro ⁇ 1,2-dioxetane-3,2′-(5′-chloro)-tricyclo[3.3.1.13,7]decane ⁇ - 4-yl)-1-phenylphosphate disodium (CDP-Star®: Applied Biosystems) was used.
- - B/F wash solution A buffer solution containing 0.1 mol/L citric acid (pH 6.5), 0.15 mol/L NaCl, and 0.1% Triton X-100 was used.
- Test sample 1 Recombinant hCLEC-2 protein diluted with buffer (0.025 mol/L HEPES, 0.14 mol/L NaCl, 0.1% sodium octanoate, 0.3% BSA) Test sample 1 was diluted with citrated plasma and used as test sample 2.
- a fully automatic clinical examination system STACIA registered trademark, manufactured by LSI stipulatece
- the sample diluent, the first antibody solution (magnetic latex reagent), and the second antibody solution (enzyme-labeled antibody reagent) were filled in STACIA-dedicated bottles and set in the apparatus. Measurements were carried out according to the operating method of the apparatus described below. Specifically, 40 ⁇ L of the specimen diluent was added to 10 ⁇ L of the sample and heated at 37° C. for several minutes, then 25 ⁇ L of the first antibody solution (magnetic latex reagent) was added and heated at 37° C. for several minutes.
- FIG. 1 shows a standard curve prepared using the hsCLEC2 protein as a standard.
- Example 2 Measurement of sCLEC2 in plasma specimens of TIA patients and healthy subjects>>> Using citrated plasma obtained from patients diagnosed with TIA with no new infarcts seen in interviews about clinical symptoms and MRI, and from healthy subjects, sCLEC2 concentration in plasma, platelet level, The sCLEC2/platelet ratio (C2PAC index) was measured (Table 1, Table 2).
- Example 3 Sensitivity and specificity of diagnosis of TIA by sCLEC2>>
- a ROC curve Receiveiver Operating Characteristic Curve
- Table 4 shows the diagnostic sensitivity and specificity when the cutoff value was varied from 60 pg/mL to 150 pg/mL in this analysis.
- the cut-off values showing both sensitivity and specificity of 80% or more ranged from 66 pg/mL to 148 pg/mL.
- Example 4 sCLEC2, D-dimer, sCLEC2/D-dimer ratio in cerebral infarction and TIA of each disease type>>>
- blood sCLEC2 in cardiogenic cerebral infarction, atherosclerotic cerebral infarction, and lacunar infarction was measured by the method of Example 1 (Fig. 4).
- a significant difference was confirmed by the Mann-Whitney U test between the sCLEC2 concentration in patients with cardiogenic cerebral infarction and the sCLEC2 concentration in patients with non-cardiogenic cerebral infarction, and the p-value was 0.002720 ( ⁇ 0.05).
- sCLEC2 was confirmed to be useful in distinguishing between cardiogenic and non-cardiogenic cerebral infarction. Furthermore, in order to distinguish between cardiogenic cerebral infarction and non-cardiogenic cerebral infarction with higher accuracy, the D-dimer contained in the sample collected from the cerebral infarction patient was subjected to LPIA-Genesis D-Dimer ( (manufactured by LSI Rulece). A fully automatic clinical laboratory analyzer STACIA (manufactured by LSI Rulece) was used for the measurement.
- D-dimer, sCLEC2, and the sCLEC2/D-dimer ratio the ability to differentiate between noncardiogenic cerebral infarction (atheromatous cerebral infarction and lacunar infarction) and cardiogenic cerebral infarction was analyzed with the ROC curve ( 5 to 7).
- the areas under the curve for D-dimer, sCLEC2 and sCLEC2/D-dimer ratio were 0.67, 0.73 and 0.79, respectively, and the sCLEC2/D-dimer ratio showed the best diagnostic ability.
- a representative example of TIA patients suspected of having cardiogenic origin was similarly confirmed using sCLEC2 and the sCLEC2/D-dimer ratio. A trend toward lower values was confirmed.
- the measurement of blood sCLEC2 and sCLEC2/platelet ratio of the present invention can be a clinical test that can be used for TIA diagnosis, and the sCLEC2 measurement reagent can be a TIA clinical test diagnostic agent.
- sCLEC2 in blood and the sCLEC2/D-dimer ratio can be clinical tests that can be used to diagnose cardiogenic/non-cardiogenic cerebral infarction and TIA. It becomes a non-cardiogenic laboratory diagnostic reagent.
Abstract
ＴＩＡの診断について、臨床症状の問診を補強しうる簡便、迅速且つ客観的な血液検査によるリスク評価方法を提供すること、及び脳梗塞、ＴＩＡといった急性脳血管障害の心原性、非心原性の鑑別診断について、画像、心電図、従来の血液検査を補強しうる簡便、迅速且つ客観的な血液検査によるリスク評価方法を提供する。患者から採取した血液中に存在する、可溶型ＣＬＥＣ２濃度を測定する。
Description
本発明は、可溶型ＣＬＥＣ２を用いた急性脳血管障害のリスク評価方法に関する。
脳卒中は、脳の血管が詰まる事によって発症する虚血性脳卒中、即ち脳梗塞と、脳の血管が切れることにより発症する出血性脳卒中、即ち脳出血、クモ膜下出血とを含む疾患群であり、世界の死亡原因では虚血性心疾患についで第２位をしめる。脳卒中は、死亡原因の多くを占めるだけでなく、命を取り留めた後でも重度の後遺症を残すことも多く、介護が必要となる大きな要因となっていて、患者の負担、また社会的負担も大きいことから、予防、早期診断、診断後の迅速な対応、と幅広い多くの医療関係者によるケアやリスク管理ができる体制が必要である。
虚血性脳卒中の中で、脳梗塞は脳内の血管が狭窄するか、別の場所でできた血栓が脳の血管が詰まることによって脳に酸素や栄養が行き渡らなくなることにより発症し、その結果、脳の神経細胞が壊死してしまい、さまざまな障害が生じる。
脳梗塞において原因となる血栓は心臓でできる血栓が血管中を移動して脳の動脈に詰まる心原性脳塞栓症と、心臓以外の場所でできる血栓を原因とする非心原性脳梗塞に大別される。心原性塞栓症の場合は血栓の主体がフィブリンであるとされ、治療、二次予防にはフィブリンの形成を抑制する抗凝固薬（ワルファリンやＤＯＡＣ）が用いられる。一方、非心原性の脳梗塞の場合は血栓の主体は血小板であるとされ、治療、二次予防には血小板の活性化を抑制する抗血小板薬（アスピリン、クロピドグレル等）が用いられる。即ち、心原性脳虚血脳卒中と非心原性脳卒中とは明確に治療が異なるので、心原性なのか非心原性なのかを正しく診断することが重要である。
心原性脳梗塞は心房細動により心房中の血流のうっ滞等によって形成された血栓が血流に乗って脳に至り梗塞を起こすもので比較的大きな梗塞を形成する。その診断はＭＲＩ画像で大きな梗塞が観察されることや、心房細動や不整脈、心疾患等の既往症等の情報により行われる。一方、非心原性脳梗塞は、アテローム性とラクナ等に大別される。アテローム性脳梗塞は比較的大きな動脈が詰まり、ラクナは細い血管が詰まるのでＭＲＩ画像による梗塞の大きさ、動脈硬化の状態や血液検査による代謝異常等の情報から診断する。
心房細動は心電図により検出するが、持続性のものと突発性のものがあり、突発性の場合は簡単に発見することが困難である。またアテローム性脳梗塞と心原性脳梗塞の画像は明確に区別できない場合も多い。
一方、脳梗塞様の症状を呈するものとして、一過性脳虚血発作（transient ischemic attack:ＴＩＡ）が知られている。ＴＩＡは脳梗塞と同様に血管が狭窄するか、血栓で詰まるがその事象は一過性であり、脳梗塞と同様の症状が一過性に生じる状態を言う。
ＴＩＡは、かつては２４時間以内に脳の虚血症状が消えるものとされてきた。現在では画像検査技術の進歩により、症状が消えても脳梗塞が画像によって発見される例が増えてきたため、２００９年の米国心臓協会、脳卒中協会（ＡＨＡ／ＡＳＡ）の論文では、「ＴＩＡとは脳、脊髄又は網膜の局所的虚血による一時的な神経学的機能障害で急性梗塞を伴わないもの」と定義し、症状の持続時間とは関係なく、梗塞とＴＩＡを別のものとして区別している。即ち、症状が消失していても画像により梗塞が見られるものは脳梗塞とし、ＴＩＡは症状が消失し画像でも脳梗塞が認められないものとしている。ＷＨＯ（世界保健機関）の国際疾病分類（ＩＣＤ―１１、２０１８年）においてもＴＩＡは梗塞巣を有してはならないとしており、画像によって判断する考え方が世界のコンセンサスとなっている。
日本においても、日本脳卒中学会により、２０１９年に「局所脳又は網膜の虚血に起因する神経機能障害の一過性のエピソードであり、急性梗塞の所見がないもの。神経機能障害のエピソードは、長くとも２４時間以内に消失すること」と定義された。また、ＴＩＡは脳血管障害（cerebrovascular diseases）の一型ではあるが、脳梗塞巣を呈さないものと定義されるため、脳梗塞、脳出血、くも膜下出血の３疾患からなる脳卒中（stroke）には含まれないことも明確にされている。
このようにＴＩＡは脳梗塞とは別の疾患であることが明確に区別されている。ＴＩＡは、症状は消えている状態であっても、その診断は極めて重要である。それは、ＴＩＡ患者がしばしば早い時期に脳梗塞を発症するからである。複数の臨床研究の結果、ＴＩＡを起こした症例の１０～１５％が３カ月以内に脳梗塞を発症しており、その半数は４８時間以内に発症していることが報告され、従来考えられていたよりも、はるかに早い時期に脳梗塞を発症することがしばしばあることが判明した。そのようなデータをふまえて、日本脳卒中学会では２００９年発行の「脳卒中治療ガイドライン」で「ＴＩＡが疑われた場合にはただちに予防的治療を開始すること」を推奨している。即ち、ＴＩＡは、重篤な疾患である脳梗塞の前触れ、前兆であると言われている。
上述の通り、ＴＩＡの診断には病巣の有無が必要とされるが、ＴＩＡ発症からＭＲＩの拡散強調画像（diffusion weighted image：ＤＷＩ）による画像検査施行までの時間が長いほどＤＷＩ陽性率が高くなり（６時間以内では１７％、２４時間以降では３７％）、また、初回ＤＷＩで病変がなかった症例の多くは２回目のＤＷＩで病変が見られると言われている。すなわち、画像上病巣を認める例を脳梗塞、認めない例をＴＩＡとする定義では、ＤＷＩの施行時期が診断に大きく影響する。
しかし、専門病院のみならず画像検査のできない一般開業医においてもＴＩＡの診断を可能とする方法が必要であることや、脳卒中専門医や神経内科医のような専門医ではない医師が、総合病院の救急外来において迅速に判断をしなければならない状況にも応える必要がある。
また、初診時において、ＴＩＡは、患者来院時には症候が消失していることが多く、この場合ＴＩＡの診断は、既往歴や合併症を含めた正確な病態聴取に依存しているため、診断を明確にすることが難しいことが多い。また、ＴＩＡと鑑別すべき疾患には、神経症候を伴う片頭痛、痙攣発作、特発性の一過性全健忘、メニエール症候群、過換気症候群、失神、低血糖、ナルコレプシー、周期性四肢麻痺などが挙げられ、その判断には困難を要する場合も少なくない。
このような状況を改善しＴＩＡの正診率を向上させるために、バイオマーカーを使用して客観的に判断することができる指標が求められている。
近年のＭＲＩ画像や超音波検査などの診断技術の進歩に伴い、機序の詳細な検討が可能となり、ＴＩＡでも脳梗塞のように心原性、アテローム血栓性、ラクナ、その他の原因というようにその機序が明らかにしようとしつつあるが、梗塞画像が見られないＴＩＡではその原因を明確に鑑別診断するのは、脳梗塞よりもさらに困難である。
Ｃ－ｔｙｐｅ ｌｅｃｔｉｎ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２（ＣＬＥＣ２）は血小板活性化蛇毒ロドサイチンの受容体として、血小板上に同定された。ＣＬＥＣ２はヒトではほぼ血小板・巨核球特異的に発現しており、血小板に特異的な分子と言える。このＣＬＥＣ２は血小板が活性化される際に、可溶型ＣＬＥＣ２（soluble CLEC-2，以下ｓＣＬＥＣ２と略記）として血液中に放出されることが報告された。（特許文献１、非特許文献１）
血管が破綻した場合の血栓形成では、まず血小板が活性化して凝集し一次血栓が形成され、そこに凝固系が活性化されて水溶性のフィブリノゲンが不溶性のフィブリン網となっておおいかぶさり強固な二次血栓が形成されるとされる。実際の止血血栓では血小板系と凝固系はお互いに活性化しあい、血小板とフィブリンとそれに巻き込まれた赤血球等で形成された止血血栓が観察される。
血中ｓＣＬＥＣ２濃度は血小板の活性化に伴って上昇するので、血中ｓＣＬＥＣ２濃度は血栓症の形成と関連することが示され、血中ｓＣＬＥＣ２が高値であることは体のどこかに血栓が形成されていることを示唆すると言える（特許文献１～３）。
F. Kazama et al., Platelets 2015; 26(8):711-719
Y. Yamashita et al., Thrombosis Research 178(2019) 54-58
X. Zhang et al., Stroke.2019;50:45-52.
脳梗塞は死亡率も高く、また死亡を免れたとしても後遺症が残ることが多い重篤な疾患である。上述の通り、ＴＩＡを起こした症例の１５％程度は脳梗塞を起こす事が知られているので、早期に診断して予防的な治療を行うことが極めて重要である。ＴＩＡと診断できれば適切な抗血栓療法を行うことで、その後の脳梗塞を起こす確率を大幅に減少させることができるためである。また、ＴＩＡと診断された患者は、例えば発症後１週間は医師の監視下におくことで、もし脳梗塞を発症してしまってもすぐに血栓溶解療法等により脳梗塞治療を行うことでその後遺症を大幅に改善することも可能となる。脳梗塞の治療は早ければ早い程よく、時間との勝負であるからである。
ＴＩＡの診断は、臨床症状の問診と患者のリスク評価で行われる。即ち、片側の手足の麻痺（運動障害）、片側のしびれ（感覚障害）、言葉が出て来ない、ろれつが回らない（言語障害）、片側の目が見えにくくなる（視力障碍）、片側にあるものが見えにくくなる（視野障害）等が主な症状であるが、こうした症状は数分から長くて１時間程度で消えて行く。この症状を問診により聞き取って診断する以外には方法がないが、症状には強いものから弱いものまであり、患者が正確に症状を医師に伝えられるとは限らない。
このような問診の難しさを補うものとして患者のリスク評価も広く行われている。ＡＢＣＤ２スコアが代表的なものであるが、これはＡｇｅ（年齢）、Ｂｌｏｏｄ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ（血圧）、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｆｅａｔｕｒｅ（臨床症状）、Ｄｉａｂｅｔｅｓ（糖尿病）、Ｄｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｙｍｐｔｏｍｓ（症状の持続時間）を点数化して評価するものである。これはあくまでもその後の脳梗塞発症リスクの評価であって、ＴＩＡそのものを診断している訳ではない。以上のように、ＴＩＡを診断する際に臨床症状の問診を補強できる客観的な画像検査も血液検査も存在しない。
また、上述の通り、脳梗塞やＴＩＡのような急性脳血管障害において、その原因が心原性か非心原性かを鑑別して診断することは非常に重要であるが、その判断は必ずしも簡単ではない。現在、脳梗塞が心原性か非心原性かを鑑別する診断は、画像検査、心電図、心エコー、脂質や血糖、心不全マーカーなどの血液検査の結果から総合的に判断されている。血栓学的に診断をサポートするバイオマーカーはＤ－ダイマー、可溶性フィブリンなどが提唱されているが、心原性かどうかを鑑別できるほどの精度を有しているとは言えず、実際に臨床現場で使用されるには至っていない。ＴＩＡにおいては、画像検査で梗塞が認められないものが対象となるため、心原性か非心原性かの診断はさらに難しい。
従って、本発明の課題は、ＴＩＡの診断について、臨床症状の問診を補強しうる簡便、迅速且つ客観的な血液検査によるリスク評価方法を提供すること、及び脳梗塞、ＴＩＡといった急性脳血管障害の心原性、非心原性の鑑別診断について、画像、心電図、従来の血液検査を補強しうる簡便、迅速且つ客観的な血液検査によるリスク評価方法を提供することである。
本発明者らは前記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、ＴＩＡ患者の血液中ｓＣＬＥＣ２濃度は、健常者と比べ有意に上昇していることを見出した。脳梗塞のように梗塞があり血栓が存在している状態ではなく、ＴＩＡのように梗塞が無く血栓も確認できない状態であっても、ｓＣＬＥＣ２が高値を取り得る状態であるということを見出した。このことは、ＴＩＡ患者は近い将来に脳梗塞を起こす確率が高いということと合致する。即ち、現在梗塞がなく血栓も確認できない状態であるにもかかわらず、ｓＣＬＥＣ２が高値であることは、血小板は活性化していて近い将来にある程度の大きさの血栓が形成され血管が詰まって梗塞を起こす可能性が高いことを予測できることを示した。
また、ＴＩＡ患者について、ｓＣＬＥＣ２濃度を使用してリスクの判定を行うには、適切な閾値、即ちカットオフ値が必要となる。本発明では、血中ｓＣＬＥＣ２濃度のＴＩＡのカットオフ値は６６ｐｇ／ｍＬ以上１４８ｐｇ／ｍＬ以下であることが好ましいことを見いだした。
ＴＩＡ患者では、梗塞画像による判定ができないので、血液検査による心原性、非心原性の判定の補助は極めて有用である。
さらに、脳梗塞患者の血液中のｓＣＬＥＣ２を測定したところ、ｓＣＬＥＣ２測定値は非心原性患者が心原性患者に比べて有意に高値を示すことを見出した。この知見をもとに、フィブリン血栓の存在を示すバイオマーカーであるＤ－ダイマーを同時に測定し、ｓＣＬＥＣ２とＤ－ダイマーの比（ｓＣＬＥＣ２／Ｄ－ダイマー比）を計算したところ、非心原性患者のｓＣＬＥＣ２／Ｄ－ダイマー比は心原性患者よりさらに大きな有意差を以て高値を示すことを見出した。すなわち、ｓＣＬＥＣ２が血小板の活性を表し、Ｄ－ダイマーはフィブリン血栓の存在を表すのであるから、血小板が優位で抗血小板薬を治療に用いる非心原性と、フィブリンが優位で抗凝固薬を治療に用いる心原性の判別に、ｓＣＬＥＣ２とＤ－ダイマーの比を用いることにより、従来の方法に加えてより正確な診断を補助する方法を提供できる。
これらをもとに、可溶型ＣＬＥＣ２を用いた急性脳血管障害のリスク評価方法として、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、以下を提供する：
［１］急性脳血管障害の罹患が疑われる患者又は急性脳血管障害と診断された患者から採取した血液中に存在する、可溶型ＣＬＥＣ２濃度を測定する工程を含む、急性脳血管障害のリスク評価を行う方法。
［２］急性脳血管障害の罹患が疑われる患者又は急性脳血管障害と診断された患者のリスク評価を行う方法であって、
（１）前記患者に由来する血液試料を提供する工程、
（２）前記試料中の可溶型ＣＬＥＣ２濃度を決定する工程、
（３）前記可溶型ＣＬＥＣ２濃度と、前記患者における急性脳血管障害の存在若しくは非存在、転帰の可能性、又は心原性若しくは非心原性かどうかを相関させる工程、
を含む、［１］の方法。
［３］急性脳血管障害の罹患が疑われる患者又は急性脳血管障害と診断された患者のリスク評価を行う方法であって、前記可溶型ＣＬＥＣ２濃度と、前記患者における急性脳血管障害の存在若しくは非存在、転帰の可能性、又は心原性又は非心原性かどうかを相関させる工程が、前記可溶型ＣＬＥＣ２濃度の変化に基づいて、リスクを前記患者が有するかどうかを評価することを含む、［２］の方法。
［４］急性脳血管障害の罹患が疑われる患者又は急性脳血管障害と診断された患者における急性脳血管障害のリスク評価を行う方法であって、前記急性脳血管障害が一過性脳虚血発作であり、可溶型ＣＬＥＣ２濃度と一過性脳虚血発作を相関させる工程で、前記可溶型ｓＣＬＥＣ２濃度のカットオフ値が６６～１４８ｐｇ／ｍＬである、［２］又は［３］の方法。
［５］急性脳血管障害の罹患が疑われる患者又は急性脳血管障害と診断された患者のリスク評価を行う方法であって、
（１）前記患者に由来する血液試料を提供する工程、
（２）前記試料中の可溶型ＣＬＥＣ２濃度を決定する工程、
（３）前記試料中の血小板数を測定する工程、
（４）前記可溶型ＣＬＥＣ－２濃度を血小板数で除する工程、
（５）前記可溶型ＣＬＥＣ２濃度を血小板数で除した値と、前記患者における急性脳血管障害の存在若しくは非存在、転帰の可能性、又は心原性若しくは非心原性かどうかを相関させる工程、
を含む、［１］の方法。
［６］急性脳血管障害の罹患が疑われる患者又は急性脳血管障害と診断された患者における急性脳血管障害のリスク評価を行う方法であって、前記急性脳血管障害が一過性脳虚血発作であり、可溶型ＣＬＥＣ２濃度を血小板数で除した値と一過性脳虚血発作を相関させる工程で、前記可溶型ｓＣＬＥＣ２濃度を血小板数で除した値のカットオフ値が０．５５～０．７である、［５］の方法。
［７］急性脳血管障害の罹患が疑われる患者又は急性脳血管障害と診断された患者における急性脳血管障害のリスク評価を行う方法であって、前記急性脳血管障害が心原性か非心原性かを判定する材料を提供するものである、［１］～［４］のいずれの方法。
［８］急性脳血管障害の罹患が疑われる患者又は急性脳血管障害と診断された患者における急性脳血管障害のリスク評価を行う方法であって、
（１）前記患者に由来する血液試料を提供する工程、
（２）前記試料中の可溶型ＣＬＥＣ２濃度を決定する工程、
（３）前記試料中の血小板数を測定する工程、
（４）前記可溶型ＣＬＥＣ－２濃度を凝固線溶マーカーで除する工程、
（５）前記可溶型ＣＬＥＣ２濃度を凝固線溶マーカーで除した値と、前記患者における急性脳血管障害の存在若しくは非存在、転帰の可能性、又は心原性若しくは非心原性かどうかを相関させる工程、
を含む、［１］の方法。
［９］急性脳血管障害の罹患が疑われる患者又は急性脳血管障害と診断された患者における急性脳血管障害のリスク評価を行う方法であって、前記凝固線溶マーカーがＤ－ダイマーである、［８］の方法。
［１０］急性脳血管障害の罹患が疑われる患者又は急性脳血管障害と診断された患者における急性脳血管障害のリスク評価を行う方法であって、前記患者に由来する試料の提供が、急性脳血管障害の症状の発生後４８時間以内に、前記患者から採取された、［１］～［９］のいずれかの方法。
［１１］可溶型ＣＬＥＣ２濃度を決定する工程が、高感度免疫測定法、例えば、化学発光免疫測定法、電気化学発光免疫測定法、蛍光免疫測定法である、［１］～［１０］のいずれかの方法。
［１］急性脳血管障害の罹患が疑われる患者又は急性脳血管障害と診断された患者から採取した血液中に存在する、可溶型ＣＬＥＣ２濃度を測定する工程を含む、急性脳血管障害のリスク評価を行う方法。
［２］急性脳血管障害の罹患が疑われる患者又は急性脳血管障害と診断された患者のリスク評価を行う方法であって、
（１）前記患者に由来する血液試料を提供する工程、
（２）前記試料中の可溶型ＣＬＥＣ２濃度を決定する工程、
（３）前記可溶型ＣＬＥＣ２濃度と、前記患者における急性脳血管障害の存在若しくは非存在、転帰の可能性、又は心原性若しくは非心原性かどうかを相関させる工程、
を含む、［１］の方法。
［３］急性脳血管障害の罹患が疑われる患者又は急性脳血管障害と診断された患者のリスク評価を行う方法であって、前記可溶型ＣＬＥＣ２濃度と、前記患者における急性脳血管障害の存在若しくは非存在、転帰の可能性、又は心原性又は非心原性かどうかを相関させる工程が、前記可溶型ＣＬＥＣ２濃度の変化に基づいて、リスクを前記患者が有するかどうかを評価することを含む、［２］の方法。
［４］急性脳血管障害の罹患が疑われる患者又は急性脳血管障害と診断された患者における急性脳血管障害のリスク評価を行う方法であって、前記急性脳血管障害が一過性脳虚血発作であり、可溶型ＣＬＥＣ２濃度と一過性脳虚血発作を相関させる工程で、前記可溶型ｓＣＬＥＣ２濃度のカットオフ値が６６～１４８ｐｇ／ｍＬである、［２］又は［３］の方法。
［５］急性脳血管障害の罹患が疑われる患者又は急性脳血管障害と診断された患者のリスク評価を行う方法であって、
（１）前記患者に由来する血液試料を提供する工程、
（２）前記試料中の可溶型ＣＬＥＣ２濃度を決定する工程、
（３）前記試料中の血小板数を測定する工程、
（４）前記可溶型ＣＬＥＣ－２濃度を血小板数で除する工程、
（５）前記可溶型ＣＬＥＣ２濃度を血小板数で除した値と、前記患者における急性脳血管障害の存在若しくは非存在、転帰の可能性、又は心原性若しくは非心原性かどうかを相関させる工程、
を含む、［１］の方法。
［６］急性脳血管障害の罹患が疑われる患者又は急性脳血管障害と診断された患者における急性脳血管障害のリスク評価を行う方法であって、前記急性脳血管障害が一過性脳虚血発作であり、可溶型ＣＬＥＣ２濃度を血小板数で除した値と一過性脳虚血発作を相関させる工程で、前記可溶型ｓＣＬＥＣ２濃度を血小板数で除した値のカットオフ値が０．５５～０．７である、［５］の方法。
［７］急性脳血管障害の罹患が疑われる患者又は急性脳血管障害と診断された患者における急性脳血管障害のリスク評価を行う方法であって、前記急性脳血管障害が心原性か非心原性かを判定する材料を提供するものである、［１］～［４］のいずれの方法。
［８］急性脳血管障害の罹患が疑われる患者又は急性脳血管障害と診断された患者における急性脳血管障害のリスク評価を行う方法であって、
（１）前記患者に由来する血液試料を提供する工程、
（２）前記試料中の可溶型ＣＬＥＣ２濃度を決定する工程、
（３）前記試料中の血小板数を測定する工程、
（４）前記可溶型ＣＬＥＣ－２濃度を凝固線溶マーカーで除する工程、
（５）前記可溶型ＣＬＥＣ２濃度を凝固線溶マーカーで除した値と、前記患者における急性脳血管障害の存在若しくは非存在、転帰の可能性、又は心原性若しくは非心原性かどうかを相関させる工程、
を含む、［１］の方法。
［９］急性脳血管障害の罹患が疑われる患者又は急性脳血管障害と診断された患者における急性脳血管障害のリスク評価を行う方法であって、前記凝固線溶マーカーがＤ－ダイマーである、［８］の方法。
［１０］急性脳血管障害の罹患が疑われる患者又は急性脳血管障害と診断された患者における急性脳血管障害のリスク評価を行う方法であって、前記患者に由来する試料の提供が、急性脳血管障害の症状の発生後４８時間以内に、前記患者から採取された、［１］～［９］のいずれかの方法。
［１１］可溶型ＣＬＥＣ２濃度を決定する工程が、高感度免疫測定法、例えば、化学発光免疫測定法、電気化学発光免疫測定法、蛍光免疫測定法である、［１］～［１０］のいずれかの方法。
また、本発明には、
試料中の可溶型ＣＬＥＣ２濃度（又は可溶型ＣＬＥＣ－２濃度を血小板数で除した値、若しくは可溶型ＣＬＥＣ－２濃度を凝固線溶マーカーで除した値）を測定（又は決定）する、急性脳血管障害のリスク評価を行う方法、
試料中の可溶型ＣＬＥＣ２濃度（又は可溶型ＣＬＥＣ－２濃度を血小板数で除した値、若しくは可溶型ＣＬＥＣ－２濃度を凝固線溶マーカーで除した値）を測定（又は決定）する、急性脳血管障害のリスク評価を補助する方法、
急性脳血管障害のリスク評価のために、試料中の可溶型ＣＬＥＣ２濃度（又は可溶型ＣＬＥＣ－２濃度を血小板数で除した値、若しくは可溶型ＣＬＥＣ－２濃度を凝固線溶マーカーで除した値）を測定（又は決定）する方法、
試料中の可溶型ＣＬＥＣ２濃度（又は可溶型ＣＬＥＣ－２濃度を血小板数で除した値、若しくは可溶型ＣＬＥＣ－２濃度を凝固線溶マーカーで除した値）を測定（又は決定）することを特徴とする、急性脳血管障害のｉｎ ｖｉｔｒｏリスク評価方法、
可溶型ＣＬＥＣ２濃度を検出できる抗体の、急性脳血管障害のリスク評価用キットの製造における使用、
急性脳血管障害のリスク評価に必要な情報を提供するために、試料中の可溶型ＣＬＥＣ２濃度（又は可溶型ＣＬＥＣ－２濃度を血小板数で除した値、若しくは可溶型ＣＬＥＣ－２濃度を凝固線溶マーカーで除した値）を測定（又は決定）する方法
が含まれる。
試料中の可溶型ＣＬＥＣ２濃度（又は可溶型ＣＬＥＣ－２濃度を血小板数で除した値、若しくは可溶型ＣＬＥＣ－２濃度を凝固線溶マーカーで除した値）を測定（又は決定）する、急性脳血管障害のリスク評価を行う方法、
試料中の可溶型ＣＬＥＣ２濃度（又は可溶型ＣＬＥＣ－２濃度を血小板数で除した値、若しくは可溶型ＣＬＥＣ－２濃度を凝固線溶マーカーで除した値）を測定（又は決定）する、急性脳血管障害のリスク評価を補助する方法、
急性脳血管障害のリスク評価のために、試料中の可溶型ＣＬＥＣ２濃度（又は可溶型ＣＬＥＣ－２濃度を血小板数で除した値、若しくは可溶型ＣＬＥＣ－２濃度を凝固線溶マーカーで除した値）を測定（又は決定）する方法、
試料中の可溶型ＣＬＥＣ２濃度（又は可溶型ＣＬＥＣ－２濃度を血小板数で除した値、若しくは可溶型ＣＬＥＣ－２濃度を凝固線溶マーカーで除した値）を測定（又は決定）することを特徴とする、急性脳血管障害のｉｎ ｖｉｔｒｏリスク評価方法、
可溶型ＣＬＥＣ２濃度を検出できる抗体の、急性脳血管障害のリスク評価用キットの製造における使用、
急性脳血管障害のリスク評価に必要な情報を提供するために、試料中の可溶型ＣＬＥＣ２濃度（又は可溶型ＣＬＥＣ－２濃度を血小板数で除した値、若しくは可溶型ＣＬＥＣ－２濃度を凝固線溶マーカーで除した値）を測定（又は決定）する方法
が含まれる。
本発明の方法である、ＴＩＡ患者血液中に存在するｓＣＬＥＣ２濃度を測定すること、又はｓＣＬＥＣ２／Ｄ－ダイマー比を使用することで、簡便かつ迅速で客観的な急性脳血管障害のリスク評価を行うことが可能となる。またＴＩＡと診断された後、脳梗塞やＴＩＡの予防的治療のモニタリングにおいても、治療効果の判定精度の向上に資することが期待される。
以下において、本発明の実施形態について詳細に説明するが、利用方法の態様についてはこれに限定されるものではない。
また、本明細書において「ＣＬＥＣ２」とは、Ｃ型レクチンファミリーに属する血小板活性化受容体であり、通常、血小板の膜に存在するが、血小板の活性化に伴って、血液中に放出される。本明細書において用語「可溶型ＣＬＥＣ２（ｓＣＬＥＣ２）」とは、このような血小板から遊離し、血液中（バッファー中でインキュベートする場合はバッファー中）に検出されるＣＬＥＣ２又はＣＬＥＣ２由来の分子のことを意味する。
ｓＣＬＥＣ２には、還元条件下ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）における分子量約４０ｋＤａのタンパク質、分子量約３２ｋＤａのタンパク質、分子量約２５ｋＤａのタンパク質などが含まれるとされる（非特許文献１）。分子量約４０ｋＤａのタンパク質、分子量約３２ｋＤａのタンパク質は血小板膜表面に存在し、血小板活性化に伴って産生されるマイクロパーティクルに含まれた状態で放出されると推定される。これらには糖鎖が付加されていると考えられる。一方、分子量約２５ｋＤａのタンパク質は血小板の活性化に伴ってプロテアーゼによって切断を受けて血小板から遊離すると考えられる。本発明においては、前記のようなｓＣＬＥＣ２の量を測定する。ｓＣＬＥＣ２は分子量約４０ｋＤａのタンパク質、分子量約３２ｋＤａのタンパク質及び分子量約２５ｋＤａのタンパク質をまとめて検出してもよいし、分子量約２５ｋＤａのタンパク質のみを検出してもよい。
本発明において使用するｓＣＬＥＣ２濃度は、ｓＣＬＥＣ２濃度単独で使用してよく、他のバイオマーカーと組み合わせて使用してもよい。好ましくは、例えば、ＴＩＡの診断においては、ｓＣＬＥＣ２濃度を血小板数で除して得られた値（以下、Ｃ２ＰＡＣインデックスと称することがある。）を使用してもよい。本明細書においては、特に断りが無い限り、ｓＣＬＥＣ２濃度とは、ｓＣＬＥＣ２濃度を使用した場合、ｓＣＬＥＣ２濃度を血小板数で除した場合のいずれも含むものと解釈される。また、心原性脳梗塞又は非心原性脳梗塞の鑑別診断においては、ｓＣＬＥＣ２濃度だけでなく、ｓＣＬＥＣ濃度をＤ－ダイマーで除したｓＣＬＥＣ２／Ｄ－ダイマー比を使用することができる。
測定に用いる試料はヒト由来であることが好ましいが、実験動物の病態把握等のために、ヒト以外の動物由来の試料を用いてもよい。実験動物としては特に制限されないが、例えば、モルモット、ラット、マウス、イヌ等が挙げられる。
ｓＣＬＥＣ２の存在を検出するための方法は、特に制限されないが、ｓＣＬＥＣ２を認識する抗体（以下、これを「抗ｓＣＬＥＣ２抗体」と称することがある）を用いた免疫学的方法が好ましい。免疫学的にタンパク質の検出を行う方法としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）、化学発光免疫測定法、電気化学発光免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法、免疫クロマトグラフィー等の標識抗体を用いた免疫測定法、あるいは、ウェスタンブロッティング法、ラテックス凝集法、免疫比濁法等のそれ自体公知の通常用いられる方法であればいかなる方法でも用い得る。しかしながら、単純な免疫測定法では健常者のｓＣＬＥＣ２濃度を測定するのに測定感度が十分でないことあるので、健常者の血中ｓＣＬＥＣ２を測定するのに十分な感度を有する測定法を持ちるべきである。そのためには高感度測定法が望ましく、化学発光免疫測定法や電気化学発光免疫測定法、蛍光免疫測定法等が特に好ましく用いられる。
対象の被験者（特には患者）から、例えば、血漿採血用の採血管で検体を採取する。通常は残存血小板の少ないクエン酸入りの採血管が好適であるが、ヘパリン、ＥＤＴＡ入りのものでも可能である。血中血小板数測定用にはＥＤＴＡ入り採血管が用いられるが、同時採血であれば、各々別の採血管でもよい。血漿中ｓＣＬＥＣ２濃度は例えば２０００ｇで２０分程度遠心分離した血漿を用いて測定するが、遠心の条件はこれに限るものではなくまた全血を使用した測定系であってもよい。以下、血漿中ｓＣＬＥＣ２濃度の測定を例にとって説明するが、これに限定されるものではない。患者から採血をする時期は、症状を呈してから４８時間を経過していないことが好ましいが、４８時間を経過していても本発明において使用することが可能である。より好ましくは、２４時間以内、更に好ましくは１８時間以内、最も好ましくは１２時間以内である。
本明細書において、急性脳血管障害とは、脳梗塞などの虚血性脳卒中及びＴＩＡを含むものとするが、これに限定されるものではない。
ＴＩＡとは脳梗塞様の症状を一過性に呈するが画像検査で梗塞を確認できないものを意味する。脳梗塞様の症状とは、例えば、片側の手足の麻痺（運動障害）、片側のしびれ（感覚障害）、言葉が出て来ない、ろれつが回らない（言語障害）、片側の目が見えにくくなる（視力障碍）、片側にあるものが見えにくくなる（視野障害）等が挙げられるが、これに限定されるものではない。これらの症状は数分から長くて１時間程度で消失するため、問診により聞き取って診断する以外には方法がないが、症状の程度としては強いものから弱いものまでがあるが、その重篤度は問わない。脳梗塞患者は、上記の臨床症状に加えてＭＲＩ、ＣＴ等によって脳に梗塞像が確認された患者である。
ＴＩＡとは脳梗塞様の症状を一過性に呈するが画像検査で梗塞を確認できないものを意味する。脳梗塞様の症状とは、例えば、片側の手足の麻痺（運動障害）、片側のしびれ（感覚障害）、言葉が出て来ない、ろれつが回らない（言語障害）、片側の目が見えにくくなる（視力障碍）、片側にあるものが見えにくくなる（視野障害）等が挙げられるが、これに限定されるものではない。これらの症状は数分から長くて１時間程度で消失するため、問診により聞き取って診断する以外には方法がないが、症状の程度としては強いものから弱いものまでがあるが、その重篤度は問わない。脳梗塞患者は、上記の臨床症状に加えてＭＲＩ、ＣＴ等によって脳に梗塞像が確認された患者である。
脳梗塞は脳の動脈が閉塞している状態（梗塞）であり、この場合血栓があることが明らかであるから、血小板の活性化マーカーである血中ｓＣＬＥＣ２の値が上昇することは妥当なことであると考えられる。また、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、血栓性微小血管症（ＴＭＡ）、深部静脈血栓症も病理学的に明らかに血栓が見られる病態であるからｓＣＬＥＣ２が上昇するのも当然であると考えられる。しかしながら、ＴＩＡのように梗塞が確認できない状態では血栓の存在も確認できず、血栓に関連したマーカー（例えばＤ－ダイマーが有名である）はさほど上昇しないと考えられていたところ、血栓症のマーカーとしての利用が示唆されるｓＣＬＥＣ２の濃度が上昇しており、ＴＩＡのリスク評価用血中バイオマーカーとして使用できることは意外であった。
リスク評価の実施方法としては、ＴＩＡが疑われる患者のｓＣＬＥＣ２濃度の値が、健常人あるいは非血栓性疾患群と比較して多い場合はＴＩＡである可能性が高いと判定することができる。このような比較をもとに、ｓＣＬＥＣ２濃度をＴＩＡ患者に対する脳梗塞の予防的治療の前と後で比較をして、脳梗塞発症のリスク予測として使用することもできる。
測定された患者由来試料中のｓＣＬＥＣ２濃度と、ＴＩＡの可能性との相関については、患者由来試料中のｓＣＬＥＣ２濃度と、健常人由来試料中のｓＣＬＥＣ２濃度との比較から閾値を適宜設定して使用することができる。また、脳梗塞発症のリスク予測としては、同一患者において発症前に測定したｓＣＬＥＣ２濃度の経時的記録から、ｓＣＬＥＣ２濃度の顕著な変動が検出された場合にＴＩＡの評価を行うことができる。
具体的な例を挙げると、ＴＩＡを疑いうる症状を述べている患者に対して血中ｓＣＬＥＣ２濃度の測定を行い、その値が健常者等に比べ高値であれば、ＴＩＡである可能性が高いと判断でき、さらに検査を行ってリスク判断によりアスピリンなどの抗血小板薬又はワルファリン等の抗凝固薬を予防的に投与する、といった使用法が可能となる。さらに、ＴＩＡと診断された後の治療により抗血小板薬又は抗凝固薬を服用後にｓＣＬＥＣ２濃度測定を実施し、高値であれば異なる種類の薬への変更あるいは追加投与するなど、治療方針の決定するための検討に資するものである。
判定用閾値（カットオフ値）を算出するためのオリジナルデータ又は統計処理データなどとしては、血漿中のｓＣＬＥＣ２濃度と血小板活性化の程度や各種疾患との相関を示すものを使用してもよい。
例えば、カットオフ値を算出するための方法としては、測定した血漿中のｓＣＬＥＣ２の値からＲＯＣ曲線（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ Ｃｕｒｖｅ）を作成する解析を行って、診断の感度と特異度が共に８０％以上を示す濃度をカットオフ値として使用することができる。
本発明の方法において、ｓＣＬＥＣ２によるＴＩＡのカットオフ値は６６ｐｇ／ｍＬ～１４８ｐｇ／ｍＬ間の任意の値を選ぶことが好適である。また、更に好適な態様として、ｓＣＬＥＣ２濃度を血小板数で除した値であるＣ２ＰＡＣインデックスを使用した場合にも同様の解析を行って、カットオフ値を算出することができる。Ｃ２ＰＡＣインデックスを使用した場合のカットオフ値は、０．７とすることができる。
例えば、カットオフ値を算出するための方法としては、測定した血漿中のｓＣＬＥＣ２の値からＲＯＣ曲線（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ Ｃｕｒｖｅ）を作成する解析を行って、診断の感度と特異度が共に８０％以上を示す濃度をカットオフ値として使用することができる。
本発明の方法において、ｓＣＬＥＣ２によるＴＩＡのカットオフ値は６６ｐｇ／ｍＬ～１４８ｐｇ／ｍＬ間の任意の値を選ぶことが好適である。また、更に好適な態様として、ｓＣＬＥＣ２濃度を血小板数で除した値であるＣ２ＰＡＣインデックスを使用した場合にも同様の解析を行って、カットオフ値を算出することができる。Ｃ２ＰＡＣインデックスを使用した場合のカットオフ値は、０．７とすることができる。
ｓＣＬＥＣ２は、血小板の活性化に伴い血中に放出される。既存の血小板活性化マーカー、例えば、血小板第４因子（ＰＦ４）、βトロンボグロブリン（βＴＧ）は、採血による物理的な刺激により、非特異的な放出を起こすことが問題とされているが、ｓＣＬＥＣ２は、血小板活性化を惹起するシグナル伝達依存的な放出機序であり、生体内の血小板の活性化をより正確に反映するマーカーになりうる。また、ＣＬＥＣ２はヒトでは血小板・巨核球系に発現がほぼ限られるため、偽陽性が少ない血小板特異的なマーカーになる。従って、ｓＣＬＥＣ２を測定することにより血小板の活性化状態を早期に診断することが可能となり、ＴＩＡの診断に利用可能となる。
また、測定されたｓＣＬＥＣ２濃度を血小板で除してリスク評価に使用してもよい。治療により、ｓＣＬＥＣ２濃度が減少すれば血小板の活性化が抑えられる方向であるが、ｓＣＬＥＣ２濃度が高値を持続する又は増加するような場合は、抗血栓薬の見直し、追加、増量等も考慮することができる。本明細書において、ｓＣＬＥＣ２濃度を血小板数で除したものをＣ２ＰＡＣインデックスと称し、ＴＩＡの診断においてｓＣＬＥＣ２濃度と記載しているものは、明示的にＣ２ＰＡＣインデックスと記載していない場合であっても、全てｓＣＬＥＣ２濃度をＣ２ＰＡＣインデックスに置き換えて実施することが可能である。
ｓＣＬＥＣ２濃度を血小板数で除してＴＩＡの診断に使用する場合には、血小板数の測定は、通常は自動血球計数機（血算計）を用いて測定が行われるが、血球計数板と顕微鏡を用いて計数することも可能である。
血漿中のｓＣＬＥＣ２濃度を例えばｐｇ／ｍＬで表し、血中血小板数を例えば１，０００個／ｍｍ３で表現し、ｓＣＬＥＣ２濃度／血小板数を計算するＣ２ＰＡＣインデックスを用いることが好適であるが、ここで用いるｓＣＬＥＣ２の濃度はｎｇ／ｍＬ、ｎｇ／Ｌなどどの任意の単位を用いてもよく、血小板数も１０，０００個／ｍｍ３など任意の単位を用いることができるが、比較には統一した単位を用いるべきである。様々な単位を用いることにより、ｓＣＬＥＣ２濃度／インデックスは様々な値を取ることができるが、本質的には同じ概念のものである。
比率の計算は、ｓＣＬＥＣ２濃度を測定する臨床検査機器から出てきた測定値と血小板数を測定する血算計から出てきた測定値を使って行うことが多いと予想できる。この計算は、両方の測定器と繋がった病院の検査システム、病院のシステム、あるいは電子カルテなどのシステム上で自動的に計算することが日常診療上好適であるが、二つの測定器のデータをつなぐシステムを構築してもよいし、ｓＣＬＥＣ２濃度と血小板数を同時計測できる機械を構築することも可能である。また、両データを用いて手計算してもよい。
また、血漿中のｓＣＬＥＣ２濃度と血小板活性化の程度や各種疾患との相関を示すものを、例えば、判定用閾値、あるいは、判定用閾値を算出するためのオリジナルデータ又は統計処理データなどとして使用してもよい。
血漿中ｓＣＬＥＣ２濃度を血中血小板数で除して、血小板当たりのｓＣＬＥＣ２放出量を計算してこれを指標として血栓性疾患の診断を行うと、血中血小板数に依存すること無く、血小板の活性化度合いを評価することが可能となるため、好ましい。具体的には、例えば血漿中ｓＣＬＥＣ２濃度をｐｇ／ｍＬで表し（Ａ）、血中血小板数を１，０００個／ｍｍ３で表し（Ｂ）、ＡをＢで除した数字を血小板活性化の指標とすることができる。
また、血漿中のｓＣＬＥＣ２濃度と血小板活性化の程度や各種疾患との相関を示すものを、例えば、判定用閾値、あるいは、判定用閾値を算出するためのオリジナルデータ又は統計処理データなどとして使用してもよい。
血漿中ｓＣＬＥＣ２濃度を血中血小板数で除して、血小板当たりのｓＣＬＥＣ２放出量を計算してこれを指標として血栓性疾患の診断を行うと、血中血小板数に依存すること無く、血小板の活性化度合いを評価することが可能となるため、好ましい。具体的には、例えば血漿中ｓＣＬＥＣ２濃度をｐｇ／ｍＬで表し（Ａ）、血中血小板数を１，０００個／ｍｍ３で表し（Ｂ）、ＡをＢで除した数字を血小板活性化の指標とすることができる。
また、本発明は脳梗塞の診断における使用を排除するものではない。脳梗塞の診断には、例えば、片側の手足の麻痺（運動障害）、片側のしびれ（感覚障害）、言葉が出て来ない、ろれつが回らない（言語障害）、片側の目が見えにくくなる（視力障碍）、片側にあるものが見えにくくなる（視野障害）等の症状からの判断と、ＭＲＩなどの画像検査で梗塞が確認されることを考慮した上で総合的な判断が行われる。脳梗塞が疑われる患者において、本発明による血液中のｓＣＬＥＣ２濃度を測定することによって、迅速かつ簡便な脳梗塞の診断の補助に資することができるため、好ましい。加えて、臨床現場においては、脳梗塞を含む脳血管障害の診断だけでなく、心原性か非心原性であるかを迅速かつ簡便な手法によって、客観的に判断できることが重要とされており、本発明はこの要望に応えることができるものである。
心原性脳梗塞、又は非心原性脳梗塞の鑑別診断をするには、例えば、急性脳血管障害と診断された患者に対して血中のｓＣＬＥＣ２濃度を測定する。このとき、ｓＣＬＥＣ２濃度が有意に上昇していることが確認され、予め設定した閾値より高ければ非心原性脳梗塞である確率が高く、低ければ心原性脳梗塞である確率が高いと判断することができる。
その他には、ｓＣＬＥＣ２濃度と他の血栓止血マーカーとを組み合わせて心原性脳梗塞、又は非心原性脳梗塞の鑑別診断に使用することもできる。例えば、急性脳血管障害と診断された患者に対して血中のｓＣＬＥＣ２濃度とＤ－ダイマー濃度を測定する。測定は同時に採血された試料を用いるのが好ましいが、別々に採血をされた試料を使用して測定を実施してもよい。当業者であれば、それぞれの濃度測定をする採血時に時間差があるものであっても、影響の程度を適宜判断して実施することができる。
その他には、ｓＣＬＥＣ２濃度と他の血栓止血マーカーとを組み合わせて心原性脳梗塞、又は非心原性脳梗塞の鑑別診断に使用することもできる。例えば、急性脳血管障害と診断された患者に対して血中のｓＣＬＥＣ２濃度とＤ－ダイマー濃度を測定する。測定は同時に採血された試料を用いるのが好ましいが、別々に採血をされた試料を使用して測定を実施してもよい。当業者であれば、それぞれの濃度測定をする採血時に時間差があるものであっても、影響の程度を適宜判断して実施することができる。
ｓＣＬＥＣ２濃度をＤ－ダイマーの濃度で除したｓＣＬＥＣ２／Ｄ－ダイマー比がある閾値より高ければ非心原性である確率が高く、低ければ心原性である可能性が高いと判断することができる。ｓＣＬＥＣ２の濃度をＤ－ダイマーの濃度で除して、ｓＣＬＥＣ２／Ｄ－ダイマー比の計算に使用するが、Ｄ－ダイマーはμｇ／ｍＬ、ｎｇ／Ｌなど様々な濃度で表現可能であるが、比較に際しては、統一された濃度単位を用いるべきである。一般的な表記であるμｇ／ｍＬで表されることが好ましいが、これに限定されない。
また、Ｄ－ダイマー以外にフィブリン血栓の存在やフィブリン形成を表現できる凝固線溶マーカーとして、フィブリン・フィブリノゲン分解産物であるＦＤＰ、トロンビンの活性化マーカーである可用性フィブリン、フィブリンモノマー、トロンビン・アンチトロンビン複合体（ＴＡＴ）、プロトロンビンフラグメントＦ１＋２もｓＣＬＥＣ２と比を取って心原性・非心原性の判定に使用することも可能である。
ＭＲＩ等の画像により比較的大きな梗塞が見られ、心房細動や不整脈があるなどした場合には心原性脳梗塞と診断することは容易である。また、梗塞像が中程度で頸動脈にアテローム性の狭窄がある、あるいは脳梗塞の近傍の動脈に狭窄が見られるなど典型的なアテローム性脳梗塞が容易に推定できるケースもあるが、どちらも典型的でないケースでは判定に悩むことも多い。しかしながら、その判定により治療法は決定的に異なるため、実際の臨床では、ＭＲＩ、ＭＲＡ、ＣＴ、エコー等の画像検査に加えて、臨床症状、病歴、心電図、血液検査等で総合的に判定するが、梗塞を起こした血栓は、フィブリンが優位なのか血小板優位なのかといった、血栓学的情報は診断上非常に有用である。脳梗塞の場合、治療開始は一刻を争うものであるが、救命救急などの外来で診察受けるまでの経過時間が不明な場合も少なくない。本発明のような簡便な方法によって心原性脳梗塞、又は非心原性脳梗塞かの鑑別診断が行えると、適切な治療法を迅速に選択することが可能となるため、このようなリスク評価方法の使用は、好ましい。
急性期脳梗塞の治療法として、点滴治療薬としては、抗凝固薬や抗血小板薬が知られているが、同じ抗凝固薬であっても、適応が異なる場合がある。例えば抗凝固薬であるアルガトロバンとヘパリンとでは、アルガトロバンは非心原性脳梗塞で適応となるのに対し、ヘパリンは心原性脳梗塞において適応になる、というものである。更に、脳梗塞を発症してから経過した時間によっても適応できる治療薬が異なる場合がある。抗凝固薬（アルガトロバン）は、発症２日以内で梗塞像が１．５ｃｍ以上あればアルガトロバンの適応があるが、大きくない場合や３日以上経過している場合は適応外となる、などである。このように、治療方針を決定する上で、本発明の実施により脳梗塞の診断を実施するだけでなく迅速に心原性か非心原性かの鑑別ができるため、好ましい。
以前は抗凝固薬や抗血小板薬とはまったく作用機序が違い、心原性・非心原性ともに適応となる、フリーラジカルを取り除くことで脳梗塞の増悪を減らすと考えられるエダラボンのような治療薬の提唱もあったが、近年の米国の治療ガイドラインにおいて言及がされていないなど、治療方針が国ごとに考え方が異なるケースもある。上記のような状況からも、日々進化する治療方針の決定に対応するために、本発明の実施により脳梗塞の診断を実施するだけでなく迅速に心原性か非心原性かの鑑別ができるため、好ましい。
急性期における脳梗塞の治療の例としては、まず抗凝固薬と抗血小板薬を併用し、１週間から２週間程度を目安にその効果を見ながら次の治療方針決めることがある。この場合、次の段階としては、経口薬としてアスピリンやワーファリンが選択されることが多い。しかし、どの薬剤を選択するかについて画像検査でラクナ性脳梗塞、アテローム性脳梗塞や心原性脳梗塞であると判断できれば判断が分かれることはないが、専門医であっても判断が分かれることがあり難しいとされる。画像検査だけで判断できない場合には２４時間心電図、埋め込み型心電図、頸動脈エコー、経胸的心エコー、経食道心エコーといった検査によって得られた結果から総合的に判断されることになる。このような検査を経てもなお、心原性であるか非心原性であるかを判断し難い症例は少なくないため、そのような場合に、本発明を使用して心原性脳梗塞であるか非心原性脳梗塞であるかをバイオマーカーを使用した検査によって簡便に高精度で判断できることの効果は極めて大きいと言える。
脳梗塞が心原性であるか、又は非心原性であるかの鑑別診断における使用について記載したが、ＴＩＡが心原性であるか非心原性であるかの鑑別診断において使用することも可能である。心原性ＴＩＡ、非心原性ＴＩＡの鑑別診断においても、心原性脳梗塞、又は非心原性脳梗塞の鑑別診断と同様の方法によって使用することができる。ＴＩＡでは、ＭＲＩなどの画像による梗塞像が認められないため、このような鑑別診断をすることができ、さらに好ましい。
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
《実施例１：ヒト血漿中ｓＣＬＥＣ２の測定》
本実施例では、以下に示す手順に従って、血漿中のｓＣＬＥＣ２濃度を測定した。
（測定用試薬の作製と被検試料の調製）
・検体希釈液：防腐剤を含む０．１ｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）を用いて、オクタン酸ナトリウム２％、ｎ－オクチル－β－Ｄ－グルコシド（ＯＧ）０．５％になるように組み合わせて検体希釈液とした。
試薬に含まれる抗体は、特許第６０７８８４５号公報の実施例に記載の抗体を使用し、以下のように調製した。
・第１抗体溶液：磁性ラテックス粒子（ＪＳＲ社）にｓＣＬＥＣ２を認識するマウスモノクローナル抗体（１１Ｄ５）を結合させ、防腐剤を含む０．０１ｍｏｌ／ＬのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）に分散させた。
・第２抗体溶液：ｓＣＬＥＣ２を認識する別のマウスモノクローナル抗体（１１Ｅ６）をマレイミド法によりアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）標識し、防腐剤を含む０．０１ｍｏｌ／ＬのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）に分散させた。
・発光基質溶液：２－クロロ－５－（４－メトキシスピロ｛１，２－ジオキセタン－３，２´－（５´－クロロ）－トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン｝－４－イル）－１－フェニルホスフェート・二ナトリウム（ＣＤＰ－Ｓｔａｒ（登録商標）：アプライドバイオシステム社）を使用した。
・Ｂ／Ｆ洗浄液：０．１ｍｏｌ／Ｌクエン酸（ｐＨ６．５）、０．１５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、を含む緩衝液を使用した。
・被検試料：組換えｈＣＬＥＣ－２蛋白質を緩衝液（０．０２５ｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ、０．１４ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、０．１％オクタン酸ナトリウム、０．３％ＢＳＡ）を用いて希釈したものを被検試料１、クエン酸血漿を用いて希釈したものを被検試料２として使用した。
本実施例では、以下に示す手順に従って、血漿中のｓＣＬＥＣ２濃度を測定した。
（測定用試薬の作製と被検試料の調製）
・検体希釈液：防腐剤を含む０．１ｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）を用いて、オクタン酸ナトリウム２％、ｎ－オクチル－β－Ｄ－グルコシド（ＯＧ）０．５％になるように組み合わせて検体希釈液とした。
試薬に含まれる抗体は、特許第６０７８８４５号公報の実施例に記載の抗体を使用し、以下のように調製した。
・第１抗体溶液：磁性ラテックス粒子（ＪＳＲ社）にｓＣＬＥＣ２を認識するマウスモノクローナル抗体（１１Ｄ５）を結合させ、防腐剤を含む０．０１ｍｏｌ／ＬのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）に分散させた。
・第２抗体溶液：ｓＣＬＥＣ２を認識する別のマウスモノクローナル抗体（１１Ｅ６）をマレイミド法によりアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）標識し、防腐剤を含む０．０１ｍｏｌ／ＬのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）に分散させた。
・発光基質溶液：２－クロロ－５－（４－メトキシスピロ｛１，２－ジオキセタン－３，２´－（５´－クロロ）－トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン｝－４－イル）－１－フェニルホスフェート・二ナトリウム（ＣＤＰ－Ｓｔａｒ（登録商標）：アプライドバイオシステム社）を使用した。
・Ｂ／Ｆ洗浄液：０．１ｍｏｌ／Ｌクエン酸（ｐＨ６．５）、０．１５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、を含む緩衝液を使用した。
・被検試料：組換えｈＣＬＥＣ－２蛋白質を緩衝液（０．０２５ｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ、０．１４ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、０．１％オクタン酸ナトリウム、０．３％ＢＳＡ）を用いて希釈したものを被検試料１、クエン酸血漿を用いて希釈したものを被検試料２として使用した。
（測定試薬による測定）
測定には、全自動臨床検査システムＳＴＡＣＩＡ（登録商標、ＬＳＩメディエンス社製）を使用した。
ＳＴＡＣＩＡ専用ボトルに、調製した検体希釈液、第１抗体溶液（磁性ラテックス試薬）、第２抗体溶液（酵素標識抗体試薬）をそれぞれ充填し、装置にセットした。以下前記装置の運転方法に従い測定した。
具体的には、試料１０μＬに検体希釈液４０μＬを加え、３７℃で数分間加温した後、第１抗体溶液（磁性ラテックス試薬）２５μＬを加え、３７℃で数分間加温した。次いで、Ｂ／Ｆ分離を行い、５０μＬの第２抗体溶液（酵素標識抗体試薬）を加え、３７℃で数分間加温し、再度Ｂ／Ｆ分離を行った後、１００μＬの発光基質溶液を加え、３７℃で数分反応後にシグナル強度（カウント）を測定した。
図１にｈｓＣＬＥＣ２蛋白質を標準品として用いて作成した標準曲線を示した。
測定には、全自動臨床検査システムＳＴＡＣＩＡ（登録商標、ＬＳＩメディエンス社製）を使用した。
ＳＴＡＣＩＡ専用ボトルに、調製した検体希釈液、第１抗体溶液（磁性ラテックス試薬）、第２抗体溶液（酵素標識抗体試薬）をそれぞれ充填し、装置にセットした。以下前記装置の運転方法に従い測定した。
具体的には、試料１０μＬに検体希釈液４０μＬを加え、３７℃で数分間加温した後、第１抗体溶液（磁性ラテックス試薬）２５μＬを加え、３７℃で数分間加温した。次いで、Ｂ／Ｆ分離を行い、５０μＬの第２抗体溶液（酵素標識抗体試薬）を加え、３７℃で数分間加温し、再度Ｂ／Ｆ分離を行った後、１００μＬの発光基質溶液を加え、３７℃で数分反応後にシグナル強度（カウント）を測定した。
図１にｈｓＣＬＥＣ２蛋白質を標準品として用いて作成した標準曲線を示した。
《実施例２：ＴＩＡ患者及び健常者の血漿検体中のｓＣＬＥＣ２の測定》
臨床症状の問診及びＭＲＩで新規の梗塞像が見られずＴＩＡと診断された患者、及び健常者から得られたクエン酸血漿を用いて、実施例１の方法で血漿中ｓＣＬＥＣ２濃度、血小板値、ｓＣＬＥＣ２／血小板比（Ｃ２ＰＡＣインデックス）を測定した（表１、表２）。
臨床症状の問診及びＭＲＩで新規の梗塞像が見られずＴＩＡと診断された患者、及び健常者から得られたクエン酸血漿を用いて、実施例１の方法で血漿中ｓＣＬＥＣ２濃度、血小板値、ｓＣＬＥＣ２／血小板比（Ｃ２ＰＡＣインデックス）を測定した（表１、表２）。
これらの測定値を使用して、健常者とＴＩＡ患者のｓＣＬＥＣ２値の統計データを作成した（表３）。ｓＣＬＥＣ２測定値（ｐｇ／ｍＬ）の平均、標準偏差、中央値は、ＴＩＡ症例では１９８．３、９４．９、１６６．０であり、別途測定した健常者で５１．９、１６．７、５４．６であったので、ＴＩＡ患者のｓＣＬＥＣ２値は健常者に比べ有意に高値であった（Ｐ＜０．０００１）。各々の測定値は図２に示した。
また、別途測定したＣ２ＰＡＣインデックスの健常者の上限値は０．７であった。
また、別途測定したＣ２ＰＡＣインデックスの健常者の上限値は０．７であった。
《実施例３：ｓＣＬＥＣ２によるＴＩＡの診断の感度・特異度》
実施例２の測定値を、ｓＣＬＥＣ２のカットオフ値を変化させて解析すると、図３のようなＲＯＣ曲線（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ Ｃｕｒｖｅ）が得られ、その曲線下面積は０．９９４と非常に良好であった。
この解析でカットオフ値を６０ｐｇ／ｍＬから１５０ｐｇ／ｍＬに変化させた時の診断の感度と特異度を表４に示す。感度、特異度共に８０％以上を示すカットオフ値は６６ｐｇ／ｍＬから１４８ｐｇ／ｍＬであった。
実施例２の測定値を、ｓＣＬＥＣ２のカットオフ値を変化させて解析すると、図３のようなＲＯＣ曲線（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ Ｃｕｒｖｅ）が得られ、その曲線下面積は０．９９４と非常に良好であった。
この解析でカットオフ値を６０ｐｇ／ｍＬから１５０ｐｇ／ｍＬに変化させた時の診断の感度と特異度を表４に示す。感度、特異度共に８０％以上を示すカットオフ値は６６ｐｇ／ｍＬから１４８ｐｇ／ｍＬであった。
仮にｓＣＬＥＣ２濃度を使用した場合のカットオフ値を１００ｐｇ／ｍＬに設定とすると、ｓＣＬＥＣ２のＴＩＡ診断能は、感度（１１／１２）＝９１．６％、特異度（７０／７１）＝９８．６％、正診率（８１／８３）＝９７．６％、となる（表５）。また、Ｃ２ＰＡＣインデックスを使用した場合のカットオフ値を０．５５とすると、ＴＩＡ患者でのＣ２ＰＡＣインデックス．７以上は１０例であり、感度は８３．３％であった。
以上のことより、ｓＣＬＥＣ２の測定、並びにｓＣＬＥＣ２／血小板比（Ｃ２ＰＡＣインデックス）は、ＴＩＡの診断に対して簡便、且つ正確に客観的なデータを提供する手段となる。
以上のことより、ｓＣＬＥＣ２の測定、並びにｓＣＬＥＣ２／血小板比（Ｃ２ＰＡＣインデックス）は、ＴＩＡの診断に対して簡便、且つ正確に客観的なデータを提供する手段となる。
《実施例４：各病型の脳梗塞及びＴＩＡにおけるｓＣＬＥＣ２、Ｄ－ダイマー、ｓＣＬＥＣ２／Ｄ－ダイマー比》
脳梗塞と診断された患者の内、心原性脳梗塞、アテローム性脳梗塞、ラクナ梗塞の血中ｓＣＬＥＣ２を実施例１の方法で測定した（図４）。心原性脳梗塞患者のｓＣＬＥＣ２濃度と非心原性脳梗塞患者のｓＣＬＥＣ２濃度とで、マン・ホイットニーＵ検定により有意差を確認したところ、ｐ値は、０．００２７２０（＜０．０５）となり、ｓＣＬＥＣ２が心原性脳梗塞か非心原性脳梗塞かの鑑別に有用であることが確認された。
更に、より高精度に心原性脳梗塞と非心原性脳梗塞との鑑別を実施するため、上記脳梗塞患者から採取された試料中に含まれるＤ－ダイマーをＬＰＩＡ－Ｇｅｎｅｓｉｓ Ｄ－Ｄｉｍｅｒ（ＬＳＩメディエンス社製）にて測定した。測定には全自動臨床検査分析器ＳＴＡＣＩＡ（ＬＳＩメディエンス社製）を用いた。Ｄ－ダイマー、ｓＣＬＥＣ２並びにｓＣＬＥＣ２／Ｄ－ダイマー比を用いた時の、非心原性脳梗塞（アテローム性脳梗塞とラクナ梗塞）と心原性脳梗塞の鑑別診断能をＲＯＣ曲線で解析した（図５～図７）。Ｄ－ダイマー、ｓＣＬＥＣ２、ｓＣＬＥＣ２／Ｄ－ダイマー比の曲線下面積は各々０．６７、０．７３、０．７９であり、ｓＣＬＥＣ２／Ｄ－ダイマー比が最も良い診断能を示した。
心原性であることが疑われるＴＩＡ患者の代表例についても同様にｓＣＬＥＣ２並びにｓＣＬＥＣ２／Ｄ－ダイマー比を用いて確認をしたところ、脳梗塞の場合と同様に、非心原性ＴＩＡ患者よりも低値となる傾向が確認された。
脳梗塞と診断された患者の内、心原性脳梗塞、アテローム性脳梗塞、ラクナ梗塞の血中ｓＣＬＥＣ２を実施例１の方法で測定した（図４）。心原性脳梗塞患者のｓＣＬＥＣ２濃度と非心原性脳梗塞患者のｓＣＬＥＣ２濃度とで、マン・ホイットニーＵ検定により有意差を確認したところ、ｐ値は、０．００２７２０（＜０．０５）となり、ｓＣＬＥＣ２が心原性脳梗塞か非心原性脳梗塞かの鑑別に有用であることが確認された。
更に、より高精度に心原性脳梗塞と非心原性脳梗塞との鑑別を実施するため、上記脳梗塞患者から採取された試料中に含まれるＤ－ダイマーをＬＰＩＡ－Ｇｅｎｅｓｉｓ Ｄ－Ｄｉｍｅｒ（ＬＳＩメディエンス社製）にて測定した。測定には全自動臨床検査分析器ＳＴＡＣＩＡ（ＬＳＩメディエンス社製）を用いた。Ｄ－ダイマー、ｓＣＬＥＣ２並びにｓＣＬＥＣ２／Ｄ－ダイマー比を用いた時の、非心原性脳梗塞（アテローム性脳梗塞とラクナ梗塞）と心原性脳梗塞の鑑別診断能をＲＯＣ曲線で解析した（図５～図７）。Ｄ－ダイマー、ｓＣＬＥＣ２、ｓＣＬＥＣ２／Ｄ－ダイマー比の曲線下面積は各々０．６７、０．７３、０．７９であり、ｓＣＬＥＣ２／Ｄ－ダイマー比が最も良い診断能を示した。
心原性であることが疑われるＴＩＡ患者の代表例についても同様にｓＣＬＥＣ２並びにｓＣＬＥＣ２／Ｄ－ダイマー比を用いて確認をしたところ、脳梗塞の場合と同様に、非心原性ＴＩＡ患者よりも低値となる傾向が確認された。
以上のように、本発明の血中ｓＣＬＥＣ２、ｓＣＬＥＣ２／血小板比の測定は、ＴＩＡの診断に使用できる臨床検査となり得、ｓＣＬＥＣ２測定試薬はＴＩＡの臨床検査診断薬になる。また、血中ｓＣＬＥＣ２、ｓＣＬＥＣ２／Ｄ－ダイマー比は脳梗塞、ＴＩＡの心原性／非心原性の診断に使用できる臨床検査になり得、ｓＣＬＥＣ２測定試薬は脳梗塞、ＴＩＡの心原性／非心原性の臨床検査診断試薬になる。
Claims (11)
- 急性脳血管障害の罹患が疑われる患者又は急性脳血管障害と診断された患者から採取した血液中に存在する、可溶型ＣＬＥＣ２濃度を測定する工程を含む、急性脳血管障害のリスク評価を行う方法。
- 急性脳血管障害の罹患が疑われる患者又は急性脳血管障害と診断された患者のリスク評価を行う方法であって、
（１）前記患者に由来する血液試料を提供する工程、
（２）前記試料中の可溶型ＣＬＥＣ２濃度を決定する工程、
（３）前記可溶型ＣＬＥＣ２濃度と、前記患者における急性脳血管障害の存在若しくは非存在、転帰の可能性、又は心原性若しくは非心原性かどうかを相関させる工程、
を含む、請求項１に記載の方法。 - 急性脳血管障害の罹患が疑われる患者又は急性脳血管障害と診断された患者のリスク評価を行う方法であって、前記可溶型ＣＬＥＣ２濃度と、前記患者における急性脳血管障害の存在若しくは非存在、転帰の可能性、又は心原性又は非心原性かどうかを相関させる工程が、前記可溶型ＣＬＥＣ２濃度の変化に基づいて、リスクを前記患者が有するかどうかを評価することを含む、請求項２に記載の方法。
- 急性脳血管障害の罹患が疑われる患者又は急性脳血管障害と診断された患者における急性脳血管障害のリスク評価を行う方法であって、前記急性脳血管障害が一過性脳虚血発作であり、可溶型ＣＬＥＣ２濃度と一過性脳虚血発作を相関させる工程で、前記可溶型ｓＣＬＥＣ２濃度のカットオフ値が６６～１４８ｐｇ／ｍＬである、請求項２又は３に記載の方法。
- 急性脳血管障害の罹患が疑われる患者又は急性脳血管障害と診断された患者のリスク評価を行う方法であって、
（１）前記患者に由来する血液試料を提供する工程、
（２）前記試料中の可溶型ＣＬＥＣ２濃度を決定する工程、
（３）前記試料中の血小板数を測定する工程、
（４）前記可溶型ＣＬＥＣ－２濃度を血小板数で除する工程、
（５）前記可溶型ＣＬＥＣ２濃度を血小板数で除した値と、前記患者における急性脳血管障害の存在若しくは非存在、転帰の可能性、又は心原性若しくは非心原性かどうかを相関させる工程、
を含む、請求項１に記載の方法。 - 急性脳血管障害の罹患が疑われる患者又は急性脳血管障害と診断された患者における急性脳血管障害のリスク評価を行う方法であって、前記急性脳血管障害が一過性脳虚血発作であり、可溶型ＣＬＥＣ２濃度を血小板数で除した値と一過性脳虚血発作を相関させる工程で、前記可溶型ｓＣＬＥＣ２濃度を血小板数で除した値のカットオフ値が０．５５～０．７である、請求項５に記載の方法。
- 急性脳血管障害の罹患が疑われる患者又は急性脳血管障害と診断された患者における急性脳血管障害のリスク評価を行う方法であって、前記急性脳血管障害が心原性か非心原性かを判定する材料を提供するものである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
- 急性脳血管障害の罹患が疑われる患者又は急性脳血管障害と診断された患者における急性脳血管障害のリスク評価を行う方法であって、
（１）前記患者に由来する血液試料を提供する工程、
（２）前記試料中の可溶型ＣＬＥＣ２濃度を決定する工程、
（３）前記試料中の血小板数を測定する工程、
（４）前記可溶型ＣＬＥＣ－２濃度を凝固線溶マーカーで除する工程、
（５）前記可溶型ＣＬＥＣ２濃度を凝固線溶マーカーで除した値と、前記患者における急性脳血管障害の存在若しくは非存在、転帰の可能性、又は心原性若しくは非心原性かどうかを相関させる工程、
を含む、請求項１に記載の方法。 - 急性脳血管障害の罹患が疑われる患者又は急性脳血管障害と診断された患者における急性脳血管障害のリスク評価を行う方法であって、前記凝固線溶マーカーがＤ－ダイマーである、請求項８に記載の方法。
- 急性脳血管障害の罹患が疑われる患者又は急性脳血管障害と診断された患者における急性脳血管障害のリスク評価を行う方法であって、前記患者に由来する試料の提供が、急性脳血管障害の症状の発生後４８時間以内に、前記患者から採取された、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
- 可溶型ＣＬＥＣ２濃度を決定する工程が、高感度免疫測定法、例えば、化学発光免疫測定法、電気化学発光免疫測定法、蛍光免疫測定法である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
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