WO2022255349A1 - 可溶型ｃｌｅｃ２を用いた出血性脳卒中のリスク評価法 - Google Patents

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concentration
patient
sclec2
soluble
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英夫 和田
雅英 川村
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株式会社Ｌｓｉメディエンス
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present invention relates to methods for diagnosing and monitoring hemorrhagic stroke using soluble CLEC2.
  • Stroke is a group of diseases that includes ischemic stroke, which occurs when a blood vessel in the brain is clogged, that is, cerebral infarction, and hemorrhagic stroke, which occurs when a blood vessel in the brain is cut, that is, cerebral hemorrhage and subarachnoid hemorrhage. It is the second leading cause of death after ischemic heart disease. Stroke is not only a major cause of death, but it often leaves severe aftereffects even after survival, making it a major factor in the need for nursing care. , prevention, early diagnosis, prompt response after diagnosis, and a system that enables care and risk management by a wide range of medical professionals.
  • Hemorrhagic stroke includes subarachnoid hemorrhage caused by rupture of an aneurysm on the surface of the brain, and cerebral hemorrhage caused by rupture of small arteries in the brain.
  • a subarachnoid hemorrhage is bleeding in a blood vessel in the space between the brain and the membrane on the surface of the brain called the arachnoid. Most of the symptoms of subarachnoid hemorrhage are severe headaches, which are described as ⁇ headaches like being hit with a bat'' or ⁇ headaches you have never experienced before.'' Subarachnoid hemorrhage has a mortality rate as high as 30%, is a very serious acute disease that requires immediate treatment, and needs to be diagnosed as soon as possible.
  • CT computed tomography
  • D-dimer measurement was proposed in the past as an attempt to diagnose subarachnoid hemorrhage by blood test.
  • the sensitivity positive rate of patients
  • the sensitivity must be almost 100%, but not only cerebrospinal fluid measurement but also conventional blood test items have achieved such sensitivity. , none of which are currently in actual use.
  • biomarkers for predicting complications of subarachnoid hemorrhage many biomarkers using cerebrospinal fluid samples are known. Many biomarkers in cerebrospinal fluid, such as endothelin, TNF- ⁇ , IL-8, IL-6, thrombin-antithrombin complex, and HMGB1, have been described to be associated with complications in patients with subarachnoid hemorrhage. Since it is necessary to collect cerebrospinal fluid from the lumbar spine, it has not been put to practical use. Even if it were to be carried out, it would be unrealistic to use it to observe changes over time because it would be highly invasive and impose a heavy burden on the patient.
  • cerebral hemorrhage is an acute disease in which blood vessels in the brain rupture for some reason, causing bleeding into the brain. Blood clots from hemorrhage press against the brain, causing swelling in the brain and impairing brain function.
  • the symptoms are said to vary depending on the site and amount of bleeding, but the symptoms vary from sensory symptoms such as headache, nausea, and vomiting to motor symptoms such as motor paralysis, numbness, and gait disturbance in the hands and feet. It is said that it is difficult to distinguish it because it includes symptoms similar to cerebral infarction.
  • the amount of bleeding is large, it may be life-threatening. Like subarachnoid hemorrhage, it is often diagnosed by CT.
  • Cerebral hemorrhage can be stopped by treatment such as lowering blood pressure after diagnosis, but if it does not stop, hematoma in the brain will increase and symptoms will worsen.
  • An increase in hematoma can be confirmed by taking CT images many times, but as described above, it is often difficult to frequently perform CT imaging examinations using a CT examination apparatus having a certain degree of accuracy or higher.
  • biomarkers for monitoring the pathology of cerebral hemorrhage S100 ⁇ , GFAP, etc. are known at the research level, but their clinical usefulness is low and they are not used in actual clinical settings. There is no test that can be easily monitored by tests or the like.
  • C-type lectin-like receptor 2 (CLEC2) was identified on platelets as a receptor for the platelet-activating snake venom rhodocytin.
  • CLEC2 is expressed in a platelet/megakaryocyte-specific manner in humans, and can be said to be a platelet-specific molecule. It has been reported that this sCLEC2 is released into the blood as soluble CLEC2 (hereinafter abbreviated as sCLEC2) when platelets are activated (Patent Document 1, Non-Patent Document 1).
  • Hemorrhagic stroke has a high mortality rate, and since it is a serious acute stage disease that may leave sequelae even if death is avoided, it is extremely important to diagnose and start treatment as soon as possible. If typical symptoms are exhibited, a visit to a medical institution is made shortly after the onset of symptoms, and cerebral hemorrhage is confirmed by imaging tests such as CT and MRI, a diagnosis can be made based on this alone. In some cases, such as when the amount of bleeding is small or the bleeding is mild and arrives at a specialized medical institution after a long time, bleeding cannot be confirmed by CT images. In some countries and regions, medical institutions with highly sensitive CT and MRI are limited.
  • a subarachnoid hemorrhage requires a highly invasive examination of the cerebrospinal fluid by lumbar puncture.
  • Lumbar puncture is not performed for cerebral hemorrhage, but there is a problem that accurate diagnosis is difficult if confirmation cannot be performed with a CT image or the like.
  • the initial treatment is CT, MRI, etc., and then treatment such as lowering blood pressure is started, but there is no biomarker that can monitor whether the treatment is successful and the bleeding is stopped.
  • the present inventors have made intensive studies to solve the above problems. As a result, the inventors found that the blood sCLEC2 concentration in hemorrhagic stroke patients was elevated in almost all patients compared to healthy subjects, leading to the completion of the present invention. That is, the present inventors have found a method of easily diagnosing subarachnoid hemorrhage and cerebral hemorrhage by detecting hemorrhagic stroke patients with a simple blood test, which has excellent sensitivity, which is the positive rate of patients.
  • the blood sCLEC2 concentration threshold for hemorrhagic stroke is preferably 137 pg/mL or less. Based on these findings, the present invention was completed as a method for evaluating the risk of hemorrhagic stroke using sCLEC2.
  • the present invention provides: [1] Assess the risk of hemorrhagic stroke, including the step of measuring the concentration of soluble CLEC2 present in blood collected from patients suspected of having hemorrhagic stroke or diagnosed with hemorrhagic stroke. Method.
  • a method for risk assessment of a patient suspected of having hemorrhagic stroke or a patient diagnosed with hemorrhagic stroke comprising: (1) providing a blood sample from said patient; (2) determining the concentration of soluble CLEC2 in the sample; (3) correlating the soluble CLEC2 concentration with the presence or absence of hemorrhagic stroke or likely outcome in the patient;
  • the method of [1] comprising [3] A method for assessing the risk of a patient suspected of having hemorrhagic stroke or a patient diagnosed with hemorrhagic stroke, wherein the soluble CLEC2 concentration and the presence or absence of hemorrhagic stroke in the patient or wherein the step of correlating likelihood of outcome comprises assessing whether said patient is at risk based on said change in soluble CLEC2 concentration.
  • [4] A method for risk assessment of a patient suspected of having hemorrhagic stroke or a patient diagnosed with hemorrhagic stroke, wherein the step of correlating soluble CLEC2 concentration with hemorrhagic stroke, wherein the threshold is 137 pg /mL, the method of [2] or [3].
  • [5] A method for risk assessment of a patient suspected of having hemorrhagic stroke or a patient diagnosed with hemorrhagic stroke, comprising: (1) providing a blood sample from said patient; (2) determining the concentration of soluble CLEC2 in the sample; (3) measuring the platelet count in the sample; (4) dividing the soluble CLEC-2 concentration by the platelet count; (5) correlating the soluble CLEC2 concentration divided by the platelet count with the presence or absence of hemorrhagic stroke in the patient; The method of [1], comprising [6] A method for assessing the risk of hemorrhagic stroke in patients suspected of having hemorrhagic stroke or diagnosed with hemorrhagic stroke, wherein the value obtained by dividing the soluble CLEC2 concentration by the platelet count and the hemorrhagic The method of [5], wherein in the step of correlating stroke, said value threshold is between 0.7 and 1.0.
  • [7] The method of any one of [1] to [6], wherein the hemorrhagic stroke is either subarachnoid hemorrhage or cerebral hemorrhage. [8] of [1] to [7], wherein the step of determining the soluble CLEC2 concentration is a highly sensitive immunoassay, such as a chemiluminescence immunoassay, an electrochemiluminescence immunoassay, or a fluorescence immunoassay; either way.
  • a highly sensitive immunoassay such as a chemiluminescence immunoassay, an electrochemiluminescence immunoassay, or a fluorescence immunoassay; either way.
  • a method for assessing the risk of hemorrhagic stroke by measuring (or determining) the soluble CLEC2 concentration (or the value obtained by dividing the soluble CLEC-2 concentration by the number of platelets) in a sample, A method of measuring (or determining) the soluble CLEC2 concentration (or the value obtained by dividing the soluble CLEC-2 concentration by the platelet count) in a sample to aid in the risk assessment of hemorrhagic stroke; A method of measuring (or determining) the soluble CLEC2 concentration (or the value obtained by dividing the soluble CLEC-2 concentration by the platelet count) in a sample for risk assessment of hemorrhagic stroke,
  • An in vitro risk assessment method for hemorrhagic stroke which comprises measuring (or determining) the soluble CLEC2 concentration (or the value obtained by dividing the soluble CLEC-2 concentration by the platelet count) in a sample, use of an antibody capable of detecting the concentration of soluble CLEC2 in manufacturing a kit for evaluating the
  • FIG. 4 is a diagram comparing the plasma concentration of sCLEC2 between subarachnoid hemorrhage patients and healthy subjects.
  • FIG. 2 is a diagram comparing the plasma concentration of sCLEC2 between cerebral hemorrhage patients and healthy subjects. This is an example of chronological monitoring of a case of subarachnoid hemorrhage. This is an example of continuous monitoring of a case of cerebral hemorrhage.
  • CLEC2 is a platelet-activating receptor belonging to the C-type lectin family, normally present in the platelet membrane, but is released into the blood following platelet activation.
  • soluble CLEC2 sCLEC2
  • CLEC2 or a CLEC2-derived molecule that is released from such platelets and detected in the blood.
  • sCLEC2 is said to include a protein with a molecular weight of about 40 kDa, a protein with a molecular weight of about 32 kDa, a protein with a molecular weight of about 25 kDa, etc. in SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) under reducing conditions.
  • SDS-PAGE SDS-polyacrylamide gel electrophoresis
  • Non-Patent Document 1 A protein with a molecular weight of about 40 kDa and a protein with a molecular weight of about 32 kDa are present on the platelet membrane surface and are presumed to be released in a state contained in microparticles produced with platelet activation. It is considered that sugar chains are added to these.
  • a protein with a molecular weight of about 25 kDa is considered to be cleaved by protease and released from platelets along with platelet activation.
  • the amount of sCLEC2 as described above is measured.
  • sCLEC2 may detect a protein with a molecular weight of about 40 kDa, a protein with a molecular weight of about 32 kDa, and a protein with a molecular weight of about 25 kDa collectively, or may detect only a protein with a molecular weight of about 25 kDa.
  • the sCLEC2 concentration used in the present invention may be the sCLEC2 concentration alone, but preferably the value obtained by dividing the sCLEC2 concentration by the platelet count (hereinafter sometimes referred to as the C2PAC index) is used. You can In the present specification, unless otherwise specified, the sCLEC2 concentration is interpreted to include both the case of using the sCLEC2 concentration and the case of dividing the sCLEC2 concentration by the platelet count.
  • the platelet count is usually measured using an automatic blood cell counter (hematometer), but a blood cell counter and a microscope are used. It is also possible to count using
  • the C2PAC index which expresses the sCLEC2 concentration in plasma, for example, in pg/mL, expresses the blood platelet count, for example, in 1,000/mm 3 , and calculates the sCLEC2 concentration/platelet count.
  • Any unit such as ng/mL or ng/L may be used for the concentration of sCLEC2 used in , and any unit such as 10,000/ mm3 may be used for the platelet count. Units should be used.
  • sCLEC2 concentration/platelet count can take various values, but essentially the concept is the same.
  • ratio calculations will often be performed using measurements from a clinical laboratory instrument that measures sCLEC2 concentrations and from a hemocytometer that measures platelet counts.
  • This calculation is preferably automatically calculated on a system such as a hospital inspection system, a hospital system, or an electronic medical chart connected to both measuring instruments in daily practice.
  • a connecting system may be constructed, or a machine capable of simultaneously measuring sCLEC2 concentration and platelet count may be constructed.
  • you may calculate manually using both data.
  • the plasma sCLEC2 concentration is divided by the blood platelet count to calculate the amount of sCLEC2 released per platelet, and this is used as an index for diagnosing thrombotic diseases
  • the platelet activity is not dependent on the blood platelet count. It is preferable because it makes it possible to evaluate the degree of conversion.
  • the plasma sCLEC2 concentration is expressed as pg/mL (A)
  • the blood platelet count is expressed as 1,000/mm 3 (B)
  • the number obtained by dividing A by B is the number of platelet activation. It can be used as an index.
  • the samples used for measurement are preferably derived from humans, but samples derived from animals other than humans may be used to understand the pathology of experimental animals.
  • Experimental animals include, but are not limited to, guinea pigs, rats, mice, dogs, and the like.
  • the method for detecting the presence of sCLEC2 is not particularly limited, but an immunological method using an antibody that recognizes sCLEC2 is preferred.
  • methods for immunologically detecting proteins include enzyme immunoassay (ELISA method), chemiluminescence immunoassay, electrochemiluminescence immunoassay, fluorescence immunoassay, radioimmunoassay, and immunochromatography. Any method can be used as long as it is an immunoassay method using a labeled antibody such as, Western blotting method, latex agglutination method, immunoturbidimetric method, or the like.
  • An immunoassay method using a labeled antibody is preferably used in terms of simplicity and measurement accuracy.
  • Chemiluminescence immunoassay, immunochromatography, and the like are particularly preferably used for diagnosis in the emergency area because it is desired to obtain results quickly.
  • a sample is collected from the target subject (especially a patient), for example, using a blood collection tube for plasma blood collection.
  • a collection tube containing citric acid, which leaves little residual platelets, is usually suitable, but a tube containing heparin or EDTA is also possible.
  • a blood collection tube containing EDTA is used for blood platelet count measurement, but separate blood collection tubes may be used for simultaneous blood collection.
  • Plasma sCLEC2 concentration is measured, for example, by using plasma that has been centrifuged at 2000 g for about 20 minutes, but the conditions for centrifugation are not limited to this, and a measurement system using whole blood may also be used.
  • the measurement of plasma sCLEC2 concentration will be described as an example, but the present invention is not limited to this.
  • hemorrhagic stroke which is the target of risk assessment, includes cerebral hemorrhage occurring inside the brain (sometimes referred to as intracerebral hemorrhage) and pia mater, which is the inner layer of the tissue covering the brain, and arachnoid membrane, which is the outer layer. It means subarachnoid hemorrhage, hemorrhage that occurs in between, but does not include cerebral hemorrhage caused by head injury.
  • Known causes of cerebral hemorrhage are those derived from hypertension, cerebral aneurysm rupture, cerebral arteriovenous malformation rupture, venous sinus obstruction, dural arteriovenous fistula, amyloid deposition, moyamoya disease, and the like.
  • the target cerebral hemorrhage is not limited to that caused by a specific cause.
  • the blood sCLEC2 concentration value of patients suspected of having hemorrhagic stroke is compared with healthy subjects or neurological disease groups without intracerebral hemorrhage or infarction. Based on such a comparison, sCLEC2 levels can be used to diagnose hemorrhagic stroke (subarachnoid hemorrhage or intracerebral hemorrhage).
  • the threshold value is set by comparing the sCLEC2 concentration in the patient-derived sample and the sCLEC2 concentration in the non-hemorrhagic stroke patient-derived sample. It may be set as appropriate and used, or may be evaluated when a significant change in sCLEC2 concentration is detected from the chronological record of sCLEC2 concentration before onset in the same patient.
  • a threshold value was appropriately set by comparing the sCLEC2 concentration in the patient-derived sample and the sCLEC2 concentration in the healthy subject-derived sample.
  • a method for calculating the threshold an analysis is performed to create a ROC curve (Receiver Operating Characteristic Curve) from the measured sCLEC2 value in plasma, and the sensitivity and specificity of diagnosis are both 80% or more. Concentration can be used as a threshold.
  • ROC curve Receiveiver Operating Characteristic Curve
  • the threshold for sCLEC2-induced hemorrhagic stroke it is preferable to select an arbitrary value of 137 pg/mL or less as the threshold for sCLEC2-induced hemorrhagic stroke.
  • a similar analysis can be performed to calculate a threshold even when using a C2PAC index, which is a value obtained by dividing the sCLEC2 concentration by the platelet count.
  • the threshold when using the C2PAC index can be arbitrarily set between 0.7 and 1.0.
  • the blood sCLEC2 concentration increases with platelet activation, it is suggested that the blood sCLEC2 concentration is related to the formation of thrombus, and it is reported that it can be used for the diagnosis of cerebral infarction and myocardial infarction.
  • hemorrhagic stroke there is no known association with hemorrhagic stroke, and it was surprising that measurement of sCLEC2 concentration would be useful for risk assessment.
  • lumbar puncture and cerebrospinal fluid examination in which a needle is inserted into the lumbar vertebrae to collect cerebrospinal fluid, are performed, but these are highly invasive.
  • Treatments for the diagnosis of subarachnoid hemorrhage mainly include the following treatments.
  • diuretics such as mannitol and glyceol are used to reduce cerebrospinal fluid.
  • careful judgment is required, such as considering the possibility of increased cerebral ischemia due to a decrease in cerebral perfusion pressure due to hypotension.
  • the patient's condition can be monitored by collecting blood samples over time from a patient diagnosed with subarachnoid hemorrhage and measuring sCLEC2. Since sCLEC2 is said to represent the state of platelet activation, if sCLEC2 maintains a high value, it can be expected that bleeding will continue and the formation of a hemostatic thrombus will continue, and if the sCLEC2 value decreases, hemostatic thrombosis will occur. A decrease in formation can be expected. Cerebral vasospasm, which is a serious complication, is said to be induced by blood leaking from blood vessels, so it is important and useful to understand the state of bleeding using blood sCLEC2.
  • sCLEC2 concentration can be compared before and after treatment for hemorrhagic stroke patients and used as risk prediction. For example, if the sCLEC2 concentration decreases due to treatment, platelet activation tends to be suppressed, but if the sCLEC2 concentration remains high or increases, bleeding may continue. If the treatment with antihypertensive is not effective, it is possible to provide materials for considering the selection of therapeutic methods such as further lowering blood pressure. During the process of monitoring, fluctuations in the blood platelet count may be observed, so monitoring using the C2PAC index is also more suitable for observing the patient's condition.
  • sCLEC2 is said to represent the state of platelet activation, if sCLEC2 maintains a high value, it can be expected that bleeding will continue and the formation of a hemostatic thrombus will continue, and if the sCLEC2 value decreases, hemostatic thrombosis will occur. A decrease in formation can be expected. If the bleeding continues, intracerebral hematoma increases, compressing the brain and exacerbating the symptoms. Therefore, it is important and useful to understand the bleeding status using blood sCLEC2.
  • sCLEC2 concentration before and after treatment for hemorrhagic stroke patients can be compared and used as risk prediction. For example, if the sCLEC2 concentration decreases due to treatment, platelet activation tends to be suppressed, but if the sCLEC2 concentration continues to be high or increases, reassessment of antihypertensive therapy can be considered. During the process of monitoring, fluctuations in the blood platelet count may be observed, so monitoring using the C2PAC index is also more suitable for observing the patient's condition.
  • blood sCLEC2 concentration should be measured in patients who describe symptoms that may be suspected of hemorrhagic stroke (subarachnoid hemorrhage or cerebral hemorrhage), and if the value is in healthy subjects, etc. If the value is higher than , it can be judged that the possibility of hemorrhagic stroke is high.
  • the patient's condition can be monitored by sampling blood over time from a patient diagnosed with hemorrhagic stroke, measuring the sCLEC2 concentration, and comparing the results over time.
  • the correlation between the measured sCLEC2 concentration in the patient-derived sample and the possibility of hemorrhagic stroke can be determined by examining the sCLEC2 concentration in the patient-derived sample and non-hemorrhagic stroke.
  • a threshold value may be appropriately set and used by comparing the sCLEC2 concentration in a human-derived sample, or from the time-lapse recording of the sCLEC2 concentration before onset in the same patient, when a significant change in the sCLEC2 concentration is detected. An evaluation may be performed.
  • sCLEC2 is released into the blood with platelet activation.
  • Existing platelet activation markers such as platelet factor 4 (PF4) and ⁇ -thromboglobulin ( ⁇ TG)
  • PF4 platelet factor 4
  • ⁇ TG ⁇ -thromboglobulin
  • sCLEC2 is a signaling-dependent release mechanism that triggers platelet activation, and can be a marker that more accurately reflects platelet activation in vivo.
  • CLEC2 since CLEC2 is almost exclusively expressed in the platelet/megakaryocyte system in humans, it can be a platelet-specific marker with less false positives. Therefore, by measuring sCLEC2, it becomes possible to estimate the activation state of platelets at an early stage, and it can be used for diagnosing hemorrhagic stroke and monitoring pathology.
  • sCLEC2 concentration in plasma was measured as follows. (Preparation of measurement reagent and preparation of test sample) ⁇ Specimen diluent: 2% sodium octanoate and 0.5% n-octyl- ⁇ -D-glucoside (OG) using 0.1 mol/L HEPES buffer (pH 7.5) containing preservatives They were combined to obtain a specimen diluent.
  • the antibody contained in the reagent was prepared as follows using the antibody described in Examples of Japanese Patent No. 6078845.
  • ⁇ First antibody solution A mouse monoclonal antibody (11D5) that recognizes sCLEC2 was bound to magnetic latex particles (JSR) and dispersed in a 0.01 mol/L MES buffer solution (pH 6.0) containing a preservative. . -Second antibody solution: Another mouse monoclonal antibody (11E6) that recognizes sCLEC2 is labeled with alkaline phosphatase (ALP) by the maleimide method and dispersed in 0.01 mol/L MES buffer (pH 6.5) containing a preservative.
  • ALP alkaline phosphatase
  • Luminescent substrate solution 2-chloro-5-(4-methoxyspiro ⁇ 1,2-dioxetane-3,2′-(5′-chloro)-tricyclo[3.3.1.13,7]decane ⁇ - 4-yl)-1-phenylphosphate disodium (CDP-Star®: Applied Biosystems) was used.
  • - B/F wash solution A buffer solution containing 0.1 mol/L citric acid (pH 6.5), 0.15 mol/L NaCl, and 0.1% Triton X-100 was used.
  • ⁇ Test sample Recombinant hCLEC2 protein diluted with buffer (0.025 mol/L HEPES, 0.14 mol/L NaCl, 0.1% sodium octanoate, 0.3% BSA) Sample 1, diluted with citrated plasma, was used as test sample 2.
  • a fully automatic clinical examination system STACIA registered trademark, manufactured by LSI stipulatece
  • the sample diluent, the first antibody solution (magnetic latex reagent), and the second antibody solution (enzyme-labeled antibody reagent) were filled in STACIA-dedicated bottles and set in the apparatus. Measurements were carried out according to the operating method of the apparatus described below. Specifically, 40 ⁇ L of the specimen diluent was added to 10 ⁇ L of the sample and heated at 37° C. for several minutes, then 25 ⁇ L of the first antibody solution (magnetic latex reagent) was added and heated at 37° C. for several minutes.
  • FIG. 1 shows a standard curve prepared using the hsCLEC2 protein as a standard.
  • Example 2 Measurement of sCLEC2 in plasma specimens of subarachnoid hemorrhage patients, cerebral hemorrhage patients and healthy subjects>>> Plasma sCLEC2 concentration, platelet level, and sCLEC2/platelet ratio (C2PAC index) were measured by the method of Example 1 using citrated plasma obtained from patients diagnosed with subarachnoid hemorrhage or cerebral hemorrhage by outpatient examination. (Tables 1 and 2). In addition, sCLEC concentrations in healthy subjects were also measured (Table 3).
  • the measured sCLEC2 values (pg/mL) of hemorrhagic stroke patients with both subarachnoid hemorrhage and cerebral hemorrhage were significantly higher than those of healthy subjects (P ⁇ 0.0001) (Table 4). Each measured value is shown in FIG. 2 (subarachnoid hemorrhage) and FIG. 3 (cerebral hemorrhage). In addition, the upper limit of the C2PAC index measured separately for healthy subjects was 0.55.
  • ⁇ Example 3 Sensitivity and specificity of diagnosis of hemorrhagic stroke (subarachnoid hemorrhage and cerebral hemorrhage) by sCLEC2>>
  • the threshold is set at 120 pg/mL
  • the measurement of sCLEC2 and the sCLEC2/platelet ratio (C2PAC index) are means for providing simple and accurate data for diagnosing hemorrhagic stroke.
  • Example 4 Monitoring of patients with subarachnoid hemorrhage by sCLEC2>> Various test values on the 1st, 8th, and 10th days of illness in one case diagnosed with subarachnoid hemorrhage are shown (Fig. 4). sCLEC2 slightly increased from day 1 to day 8, but the platelet count also increased greatly, so the C2PAC index showed a slight downward trend.
  • Example 5 Monitoring of cerebral hemorrhage patients with sCLEC2>> Various test values on the 1st, 2nd, 12th, and 14th days of illness in one case diagnosed with cerebral hemorrhage are shown (FIG. 5). sCLEC2, and C2PAC index increased on day 12 and decreased on day 14, whereas D-dimer increased from day 12 to day 14.
  • the measured value of blood sCLEC2 and the sCLEC2/platelet ratio in the present invention are clinical tests that can be used to diagnose hemorrhagic stroke, subarachnoid hemorrhage, and cerebral hemorrhage.
  • sCLEC2 measurement is useful as a risk assessment method for hemorrhagic stroke patients because it can also be used to monitor the condition of patients with cerebral hemorrhage.

Abstract

出血性脳卒中の診療において、血液検査で簡便に診断を補う手段を提供する。前記方法は、出血性脳卒中の罹患が疑われる患者又は出血性脳卒中と診断された患者から採取した血液中に存在する、可溶型ＣＬＥＣ２濃度（又は可溶型ＣＬＥＣ－２濃度を血小板数で除した値）を測定（又は決定）する工程を含む。

Description

可溶型ＣＬＥＣ２を用いた出血性脳卒中のリスク評価法
　本発明は、可溶型ＣＬＥＣ２を用いた出血性脳卒中の診断方法、モニタリング方法に関する。
　脳卒中は、脳の血管が詰まる事によって発症する虚血性脳卒中、即ち脳梗塞と、脳の血管が切れることにより発症する出血性脳卒中、即ち脳出血、くも膜下出血とを含む疾患群であり、世界の死亡原因では虚血性心疾患についで第２位をしめる。脳卒中は死亡原因の多くを占めるだけでなく、命を取り留めた後でも重度の後遺症を残すことが多く介護が必要となる大きな要因となっていて、患者の負担、また社会的負担も大きいことから、予防、早期診断、診断後の迅速な対応、と幅広い多くの医療関係者によるケアやリスク管理ができる体制が必要である。
　出血性脳卒中には脳の表面の動脈にできた動脈瘤が破裂するなどして生じるくも膜下出血と、脳内の細い動脈が破れて発症する脳出血がある。
　くも膜下出血は、くも膜と呼ばれる脳表面に在る膜と脳との間の空間にある血管の出血である。くも膜下出血の症状はほとんどが激しい頭痛であり、「バットで殴られたような頭痛」あるいは「これまで体験したことのない頭痛」などと表現されほどのものである。くも膜下出血の死亡率は３０％にも達し、すぐに対処が必要な非常に重篤な急性期疾患であり、出来るだけ早く診断する必要がある。
　くも膜下出血の診断は、典型的な臨床症状を呈する場合はすぐにＣＴスキャン（以下ＣＴと略す）画像により比較的容易に確定することができる。ＣＴによる画像検査の感度（患者の陽性率）は発症後１２時間では９８～１００％と言われ診断能は非常に良好であり、それだけで診断可能である。しかし、ＣＴ検査装置が無い場合はＣＴ検査装置のある施設への搬送が必要となるし、地域によってはＣＴ検査装置のある病院が少ない場合や感度の悪いＣＴ検査装置しかない場合もある。また、くも膜下出血症例の１０～１５％は徒歩で来院する軽症例であり、これらの症例では、発症から時間が経過している、あるいは出血が軽度であるなどの理由で、ＣＴの画像では出血が確認できないこともある。このような場合、腰椎に針を刺して髄液を採取し、その中の血液の有無を確認することになる。この検査の感度（患者の陽性率）はほぼ１００％であり、ＣＴ画像が陰性の場合を補う非常に良いものであるが、腰椎に針を刺すため侵襲性が高く患者への負担が大きい検査法である。
　血液検査によってくも膜下出血を診断しようとする試みとして、Ｄ－ダイマー測定などが過去に提案された。しかし、髄液測定を補うためには感度（患者の陽性率）がほぼ１００％で無ければならないが、髄液測定だけでなく従来の血液検査項目においてもそのような感度を達成したものは無く、現在実際に使用されているものはない。
　くも膜下出血では発症後初期に救命できたとしても、その後脳血管攣縮を起こすなどの合併症も治療上の大きな問題である。脳血管攣縮は発症４日後くらいから２～３週間後までに起こることが多いので、患者の経過観察は非常に重要となる。くも膜下出血の診療にあたっては、単にくも膜下出血であるかどうかを診断するだけでなく、発症後に脳血管攣縮などの重大な合併症を起こすかどうかの予測も重要な要素となる。
　くも膜下出血の合併症を予測しようするバイオマーカーとしては、髄液をサンプルとするものは数多く知られている。エンドセリン、ＴＮＦ－α、ＩＬ－８、ＩＬ－６、トロンビン－アンチトロンビン複合体、ＨＭＧＢ１等多くの髄液中のバイオマーカーがくも膜下出血患者の合併症と関連するとの記載があるが、これらは腰椎から髄液を採取する必要があるので、実用には至っていない。仮に行ったとしても、侵襲性が高く患者の負担が大きいため検体の採取は１回だけで、経時的変化を見るために使用することは現実的ではない。
　一方、脳出血は何らかの原因により脳の血管が破れて、脳の中に出血を起こす急性疾患である。出血による血の塊が脳を圧迫したり、脳にむくみが起こったりして、脳の機能が障害される。出血した部位や量によって症状は異なるとされているが、症状は頭痛、吐き気、嘔吐、といった感覚の症状である場合や、手や足の運動麻痺、痺れ、歩行障害といった運動の症状などさまざまであり、脳梗塞と似た症状も含まれることから見分けることが難しいとされている。また、出血量が多い場合には生命に危険が及ぶこともある。くも膜下出血と同様ＣＴで診断されることが多い。
　脳出血は診断後血圧を下げるなどの治療等により出血が止まればよいが、止まらない場合は脳での血腫の増大が起き症状は増悪する。血腫の増大はＣＴ画像を何度も撮れば確認できるが、前述の通り、一定以上の精度を備えたＣＴ検査装置によるＣＴ画像検査を頻繁に行うことが困難である場合も少なくない。
　また、脳出血の病態をモニタリングするバイオマーカーとしては、Ｓ１００βやＧＦＡＰ等が研究レベルでは知られているが、その臨床的有用性は低く実際の臨床の場では使用されているものはないため、血液検査等で簡便にモニターできる検査はない。
　Ｃ－ｔｙｐｅ　ｌｅｃｔｉｎ－ｌｉｋｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　２（ＣＬＥＣ２）は血小板活性化蛇毒ロドサイチンの受容体として，血小板上に同定された。ＣＬＥＣ２はヒトではほぼ血小板・巨核球特異的に発現しており、血小板に特異的な分子と言える。このｓＣＬＥＣ２は血小板が活性化される際に、可溶型ＣＬＥＣ２（ｓｏｌｕｂｌｅ　ＣＬＥＣ２、以下ｓＣＬＥＣ２と略記）として血液中に放出されることが報告された（特許文献１、非特許文献１）。
特許第６０７８８４５号公報 特願２０２０－０３２７９７ 特願２０２１－００３６７１
F. Kazama et al., Platelets 2015; 26(8):711-719 Y. Yamashita et al., Thrombosis Research 178 (2019) 54-58
　出血性脳卒中は死亡率も高く、また死亡を免れたとしても後遺症が残る可能性がある重篤な急性期疾患であるため、出来るだけ早く診断し治療を開始することが極めて重要である。典型的な症状を呈し、発症後短時間に医療機関を受診して、ＣＴ、ＭＲＩ等の画像検査を受け脳内の出血が確認された場合はそれだけで診断が可能であるが、軽症で出血量が少なかったり、軽症で時間が経ってから専門的な医療機関にたどり着いた場合等では、ＣＴ画像等では出血が確認できない場合もある。また、国、地域の状況により感度の高いＣＴ、ＭＲＩを持つ医療機関が限られる場合もある。そのような場合、くも膜下出血では腰椎穿刺による髄液検査という侵襲性の高い検査を受けることになる。脳出血では腰椎穿刺は実施されないが、ＣＴ画像等で確認ができなかった場合、的確な診断が困難となってしまうという問題がある。
　くも膜下出血は初期治療により死を免れたとしても、脳血管攣縮という非常に危険な合併症があるため、患者は初期治療後もしばらくは医師の監視下で慎重な療養が必要となる。脳血管攣縮を予測できるバイオマーカーは文献的には髄液を使ったものはあるが、血液検査で簡便に病態をモニタリングできるバイオマーカーで実際の臨床に使用されているものはない。
　脳出血は、初期治療はＣＴ、ＭＲＩ等で診断した後、降圧等の治療に入るが、その治療が奏功して止血ができているかをモニタリングできるバイオマーカーは存在しない。
　従って本発明の課題は、出血性脳卒中の診療において、血液検査で簡便に診断を補う手段を提供することである。さらに、くも膜下出血の治療中の患者の状態を血液検査によって簡便にモニタリングする方法を提供することである。また、脳出血については、血液検査で簡便に治療効果を判定し、病態をモニタリングする手段を提供することである。
　本発明者らは前記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、出血性脳卒中患者の血中ｓＣＬＥＣ２濃度は、健常者と比べほぼ全ての患者において上昇していることを見出し、本発明を完成させるに至った。即ち、血液検査によって簡便に、患者の陽性率である感度に非常に優れ、出血性脳卒中患者を検出することにより、くも膜下出血、脳出血の診断をする方法を見出した。
　更に、くも膜下出血患者、脳出血患者のｓＣＬＥＣ２濃度を経時的に測定してその変動を観察することによって、くも膜下出血患者の状態のモニタリングが可能であることも見出した。これにより、くも膜下出血患者の脳血管攣縮などの重篤な合併症の予測に使用できる可能性もある。
　出血性脳卒中患者と出血性脳卒中ではない患者を、ｓＣＬＥＣ２を使用して判定するには、適切な閾値、即ち閾値が必要となる。本発明では、血中ｓＣＬＥＣ２濃度の出血性脳卒中の閾値は１３７ｐｇ／ｍＬ以下であることが好ましいことを見いだした。
　これらをもとに、ｓＣＬＥＣ２を用いた出血性脳卒中のリスク評価方法として、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明は、以下を提供する：
［１］出血性脳卒中の罹患が疑われる患者又は出血性脳卒中と診断された患者から採取した血液中に存在する、可溶型ＣＬＥＣ２濃度を測定する工程を含む、出血性脳卒中のリスク評価を行う方法。
［２］出血性脳卒中の罹患が疑われる患者又は出血性脳卒中と診断された患者のリスク評価を行う方法であって、
　（１）前記患者に由来する血液試料を提供する工程、
　（２）前記試料中の可溶型ＣＬＥＣ２濃度を決定する工程、
　（３）前記可溶型ＣＬＥＣ２濃度と、前記患者における出血性脳卒中の存在若しくは非存在、又は転帰の可能性を相関させる工程、
を含む、［１］の方法。
［３］出血性脳卒中の罹患が疑われる患者又は出血性脳卒中と診断された患者のリスク評価を行う方法であって、前記可溶型ＣＬＥＣ２濃度と、前記患者における出血性脳卒中の存在若しくは非存在、又は転帰の可能性を相関させる工程が、前記可溶型ＣＬＥＣ２濃度の変化に基づいて、リスクを前記患者が有するかどうかを評価することを含む、［２］の方法。
［４］出血性脳卒中の罹患が疑われる患者又は出血性脳卒中と診断された患者のリスク評価を行う方法であって、可溶型ＣＬＥＣ２濃度と出血性脳卒中を相関させる工程で、その閾値が１３７ｐｇ／ｍＬである、［２］又は［３］の方法。
［５］出血性脳卒中の罹患が疑われる患者又は出血性脳卒中と診断された患者のリスク評価を行う方法であって、
　（１）前記患者に由来する血液試料を提供する工程、
　（２）前記試料中の可溶型ＣＬＥＣ２濃度を決定する工程、
　（３）前記試料中の血小板数を測定する工程、
　（４）前記可溶型ＣＬＥＣ－２濃度を血小板数で除する工程、
　（５）前記可溶型ＣＬＥＣ２濃度を血小板数で除した値と、前記患者における出血性脳卒中の存在又は非存在を相関させる工程、
を含む、［１］の方法。
［６］出血性脳卒中の罹患が疑われる患者又は出血性脳卒中と診断された患者における出血性脳卒中のリスク評価を行う方法であって、可溶型ＣＬＥＣ２濃度を血小板数で除した値と出血性脳卒中を相関させる工程で、前記値の閾値が０．７～１．０である、［５］の方法。
［７］出血性脳卒中が、くも膜下出血又は脳出血のいずれかである、［１］～［６］のいずれかの方法。
［８］可溶型ＣＬＥＣ２濃度を決定する工程が、高感度免疫測定法、例えば、化学発光免疫測定法、電気化学発光免疫測定法、蛍光免疫測定法である、［１］～［７］のいずれかの方法。
　また、本発明には、
試料中の可溶型ＣＬＥＣ２濃度（又は可溶型ＣＬＥＣ－２濃度を血小板数で除した値）を測定（又は決定）する、出血性脳卒中のリスク評価を行う方法、
試料中の可溶型ＣＬＥＣ２濃度（又は可溶型ＣＬＥＣ－２濃度を血小板数で除した値）を測定（又は決定）する、出血性脳卒中のリスク評価を補助する方法、
出血性脳卒中のリスク評価のために、試料中の可溶型ＣＬＥＣ２濃度（又は可溶型ＣＬＥＣ－２濃度を血小板数で除した値）を測定（又は決定）する方法、
試料中の可溶型ＣＬＥＣ２濃度（又は可溶型ＣＬＥＣ－２濃度を血小板数で除した値）を測定（又は決定）することを特徴とする、出血性脳卒中のｉｎ　ｖｉｔｒｏリスク評価方法、
可溶型ＣＬＥＣ２濃度を検出できる抗体の、出血性脳卒中のリスク評価用キットの製造における使用、
出血性脳卒中のリスク評価に必要な情報を提供するために、試料中の可溶型ＣＬＥＣ２濃度（又は可溶型ＣＬＥＣ－２濃度を血小板数で除した値）を測定（又は決定）する方法
が含まれる。
　本発明の方法である、出血性脳卒中を疑われる患者血液中に存在するｓＣＬＥＣ２濃度を測定することで、迅速かつ簡便に出血性脳卒中の診断を行うことが可能となる。また、くも膜下出血の診断後の治療経過のモニタリングにおいても、治療効果の判定や合併症予測の精度の向上が期待される。脳出血患者については、患者血液中に存在するｓＣＬＥＣ２濃度を測定することで、簡便に治療効果の判定が可能となる。
ヒトｓＣＬＥＣ２蛋白質を標準品として用いて作成した標準曲線である。 くも膜下出血患者と健常者とでｓＣＬＥＣ２の血漿中濃度を比較した図である。 脳出血患者と健常者とでｓＣＬＥＣ２の血漿中濃度を比較した図である。 くも膜下出血症例の経時的モニタリング例である。 脳出血症例の経時的モニタリング例である。
　以下において、本発明の実施形態について詳細に説明するが、利用方法の態様についてはこれに限定されるものではない。
　また、本明細書において「ＣＬＥＣ２」とは、Ｃ型レクチンファミリーに属する血小板活性化受容体であり、通常、血小板の膜に存在するが、血小板の活性化に伴って、血液中に放出される。本明細書において用語「可溶型ＣＬＥＣ２（ｓＣＬＥＣ２）」とは、このような血小板から遊離し、血液中に検出されるＣＬＥＣ２またはＣＬＥＣ２由来の分子のことを意味する。
　ｓＣＬＥＣ２には、還元条件下ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）における分子量約４０ｋＤａのタンパク質、分子量約３２ｋＤａのタンパク質、分子量約２５ｋＤａのタンパク質などが含まれるとされる。（非特許文献１）分子量約４０ｋＤａのタンパク質、分子量約３２ｋＤａのタンパク質は血小板膜表面に存在し、血小板活性化に伴って産生されるマイクロパーティクルに含まれた状態で放出されると推定される。これらには糖鎖が付加されていると考えられる。一方、分子量約２５ｋＤａのタンパク質は血小板の活性化に伴ってプロテアーゼによって切断を受けて血小板から遊離すると考えられる。本発明においては、前記のようなｓＣＬＥＣ２の量を測定する。ｓＣＬＥＣ２は分子量約４０ｋＤａのタンパク質、分子量約３２ｋＤａのタンパク質および分子量約２５ｋＤａのタンパク質をまとめて検出してもよいし、分子量約２５ｋＤａのタンパク質のみを検出してもよい。
　本発明において使用するｓＣＬＥＣ２濃度は、ｓＣＬＥＣ２濃度のみで使用してもよいが、好ましくは、ｓＣＬＥＣ２濃度を血小板数で除して得られた値（以下、Ｃ２ＰＡＣインデックスと称することがある。）を使用してよい。本明細書においては、特に断りが無い限り、ｓＣＬＥＣ２濃度とは、ｓＣＬＥＣ２濃度を使用した場合、ｓＣＬＥＣ２濃度を血小板数で除した場合のいずれも含むものと解釈される。
　ｓＣＬＥＣ２濃度を血小板数で除してＴＩＡの診断に使用する場合には、血小板数の測定は、通常は自動血球計数機（血算計）を用いて測定が行われるが、血球計数板と顕微鏡を用いて計数することも可能である。
　血漿中のｓＣＬＥＣ２濃度を例えばｐｇ／ｍＬで表し、血中血小板数を例えば１，０００個／ｍｍ３で表現し、ｓＣＬＥＣ２濃度／血小板数を計算するＣ２ＰＡＣインデックスを用いることが好適であるが、ここで用いるｓＣＬＥＣ２の濃度はｎｇ／ｍＬ、ｎｇ／Ｌなどどの任意の単位を用いてもよく、血小板数も１０，０００個／ｍｍ３など任意の単位を用いることができるが、比較には統一した単位を用いるべきである。様々な単位を用いることにより、ｓＣＬＥＣ２濃度／血小板数は様々な値を取ることができるが、本質的には同じ概念のものである。
　比率の計算は、ｓＣＬＥＣ２濃度を測定する臨床検査機器から出てきた測定値と血小板数を測定する血算計から出てきた測定値を使って行うことが多いと予想できる。この計算は、両方の測定器と繋がった病院の検査システム、病院のシステム、あるいは電子カルテなどのシステム上で自動的に計算することが日常診療上好適であるが、二つの測定器のデータをつなぐシステムを構築してもよいし、ｓＣＬＥＣ２濃度と血小板数を同時計測できる機械を構築することも可能である。また、両データを用いて手計算してもよい。
　また、血漿中のｓＣＬＥＣ２濃度、又はｓＣＬＥＣ２濃度／血小板数と血小板活性化の程度や各種疾患との相関を示すものを、例えば、判定用閾値、あるいは、判定用閾値を算出するためのオリジナルデータ又は統計処理データなどとして使用してもよい。
　血漿中ｓＣＬＥＣ２濃度を血中血小板数で除して、血小板当たりのｓＣＬＥＣ２放出量を計算してこれを指標として血栓性疾患の診断を行うと、血中血小板数に依存すること無く、血小板の活性化度合いを評価することが可能となるため、好ましい。具体的には、例えば血漿中ｓＣＬＥＣ２濃度をｐｇ／ｍＬで表し（Ａ）、血中血小板数を１，０００個／ｍｍ３で表し（Ｂ）、ＡをＢで除した数字を血小板活性化の指標とすることができる。
　測定に用いる試料はヒト由来であることが好ましいが、実験動物の病態把握等のために、ヒト以外の動物由来の試料を用いてもよい。実験動物としては特に制限されないが、例えば、モルモット、ラット、マウス、イヌ等が挙げられる。
　ｓＣＬＥＣ２の存在を検出するための方法は、特に制限されないが、ｓＣＬＥＣ２を認識する抗体を用いた免疫学的方法が好ましい。免疫学的にタンパク質の検出を行う方法としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）、化学発光免疫測定法、電気化学発光免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法、免疫クロマトグラフィー等の標識抗体を用いた免疫測定法、あるいは、ウェスタンブロッティング法、ラテックス凝集法、免疫比濁法等のそれ自体公知の通常用いられる方法であればいかなる方法でも用い得るが、この中でも、操作の簡便性や測定精度の点から、標識抗体を用いた免疫測定法が好ましく用いられる。救急領域での診断のためには、迅速に結果が得られることが望まれているため、化学発光免疫測定法や免疫クロマトグラフィー等が特に好ましく用いられる。
　対象の被験者（特には患者）から、例えば、血漿採血用の採血管で検体を採取する。通常は残存血小板の少ないクエン酸入りの採血管が好適であるが、ヘパリン、ＥＤＴＡ入りのものでも可能である。血中血小板数測定用にはＥＤＴＡ入り採血管が用いられるが、同時採血であれば、各々別の採血管でもよい。血漿中ｓＣＬＥＣ２濃度は例えば２０００ｇで２０分程度遠心分離した血漿を用いて測定するが、遠心の条件はこれに限るものではなくまた全血を使用した測定系であってもよい。以下、血漿中ｓＣＬＥＣ２濃度の測定を例にとって説明するが、これに限定されるものではない。
　本発明においてリスク評価の対象とする出血性脳卒中とは、脳の内部で起こる脳出血（脳内出血と称する場合もある）及び脳を覆う組織の内側の層である軟膜と外側の層であるくも膜の間で起こる出血である、くも膜下出血を意味し、頭部外傷が原因で生じた脳出血は含まない。脳出血の原因としては、高血圧症、脳動脈瘤破裂、脳動静脈奇形破裂、静脈洞閉塞、硬膜動静脈瘻、アミロイド沈着、もやもや病等に由来するものが知られているが、本発明において対象とする脳出血は、特定の原因によって生じるものに限定されない。
　リスク評価の実施方法としては、例えば、出血性脳卒中（くも膜下出血または脳出血）が疑われる患者の血中ｓＣＬＥＣ２濃度の値が、健常者あるいは脳内の出血や梗塞が無い神経性疾患群と比較して高い場合は出血性脳卒中である可能性が高いといえ、このような比較をもとに、ｓＣＬＥＣ２濃度を出血性脳卒中（くも膜下出血または脳出血）の診断に使用することができる。
　測定された患者由来試料中のｓＣＬＥＣ２濃度と、出血性脳卒中の可能性との相関については、患者由来試料中のｓＣＬＥＣ２濃度と、非出血性脳卒中者由来試料中のｓＣＬＥＣ２濃度との比較から閾値を適宜設定して使用してもよいし、同一患者において発症前にｓＣＬＥＣ２濃度の経時的記録から、ｓＣＬＥＣ２濃度の顕著な変動が検出された場合に評価を行うこととしてもよい。
　測定された患者由来試料中のｓＣＬＥＣ２濃度と、出血性脳卒中の可能性との相関については、患者由来試料中のｓＣＬＥＣ２濃度と、健常人由来試料中のｓＣＬＥＣ２濃度との比較から閾値を適宜設定して使用することができる。例えば、閾値を算出するための方法としては、測定した血漿中のｓＣＬＥＣ２の値からＲＯＣ曲線（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ　Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ　Ｃｕｒｖｅ）を作成する解析を行って、診断の感度と特異度が共に８０％以上を示す濃度を閾値として使用することができる。
本発明の方法において、ｓＣＬＥＣ２による出血性脳卒中の閾値は１３７ｐｇ／ｍＬ以下で任意の値を選ぶことが好適である。また、更に好適な態様として、ｓＣＬＥＣ２濃度を血小板数で除した値であるＣ２ＰＡＣインデックスを使用した場合にも同様の解析を行って、閾値を算出することができる。Ｃ２ＰＡＣインデックスを使用した場合の閾値は、０．７～１．０の間で任意に設定して使用することができる。
　このような閾値を設定してリスク評価を行う場合、例えば、出血性脳卒中が疑われる頭痛の患者で、血中ｓＣＬＥＣ２濃度がある閾値以下であれば、出血性脳卒中を否定するという使用法も可能である。
　血中ｓＣＬＥＣ２濃度は血小板の活性化に伴って上昇するので、血中ｓＣＬＥＣ２濃度は血栓の形成と関連するであろうことが示唆され、脳梗塞、心筋梗塞の診断に利用可能であることが報告されているが、出血性脳卒中との関連は知られておらず、ｓＣＬＥＣ２濃度の測定がリスク評価に有用であることは、意外であった。
　従来はくも膜下出血を疑い、画像診断で出血性脳卒中が確認できない場合には、腰椎に注射針を刺して髄液を採取する腰椎穿刺・髄液検査が行われているが、侵襲性の高い検査であり、医療従事者であればだれでもどこでも簡単に行えるものではないので、血液検査でその代替ができれば非常に簡便、有用である。もしくも膜下出血と診断された場合には、発症直後は再出血を予防するため、安静を保ち、侵襲的な検査や処置は避けることが望ましいとされていることからも、本発明の実施により侵襲性の高い検査の代替となり得ることは、好ましい。
　くも膜下出血と診断された場合の治療としては、主に以下の治療が挙げられる。発症直後の再出血を予防する治療として初期段階では、安静を保つ（鎮静）、痛みをできる限り抑える（鎮痛）ことを目的とした痛み止め、吐き気止め、鎮痛剤の使用、再出血リスク低減のために血圧を下げる（降圧）を目的とした降圧剤投与、頭蓋内圧上昇による脳へのダメージを防ぐために、髄液を減らすマンニトールやグリセオールといった利尿剤を使用する治療である。一方で、重症例においては降圧による脳灌流圧の低下から脳虚血が増加する可能性を考慮するなど慎重な判断が求められるケースも少なくない。
　脳出血と診断された場合に推奨される治療法としては、急性期の血圧は、早期に収縮期血圧を降下させ、７日間維持することが検討され、脳出血急性期に用いる降圧剤として、カルシウム拮抗薬、硝酸薬が選択される。また、可能であれば、患者の状態等に応じて、早期にカルシウム拮抗薬、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬、アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬（ＡＲＢ）、利尿薬を用いた経口治療へ切り替えることを考慮してもよいとされている。
　くも膜下出血、脳出血いずれの場合であっても、その治療は高度な経験と知識が必要とされものであり、本発明の実施が治療方針を決定する指標となることが期待される。
　その他の実施態様としては、くも膜下出血と診断された患者から経時的に血液サンプルを採取し、ｓＣＬＥＣ２を測定することによって、患者の状態をモニタリングすることも可能である。ｓＣＬＥＣ２は血小板の活性化の状況を表すとされているので、ｓＣＬＥＣ２は高値を維持するならば出血が続いて止血血栓の形成が続いていることが予想でき、低値化して行けば止血血栓の形成が減少していることが予想できる。重篤な合併症である脳血管攣縮は血管から漏れた血液により惹起されると言われているので、血中ｓＣＬＥＣ２により出血の状況を把握することは重要であり、有用である。
　また、このようなモニタリングによるリスク評価の使用方法としては、ｓＣＬＥＣ２濃度を出血性脳卒中患者に対する治療の前後で比較をしてリスク予測として使用することもできる。例えば、治療により、ｓＣＬＥＣ２濃度が減少すれば血小板の活性化が抑えられる方向であるが、ｓＣＬＥＣ２濃度が高値を持続する又は増加するような場合は出血が続いていることが考えられ、例えば、降圧による治療が奏功していない場合には、さらに降圧を行う等の治療法の選択を考慮する材料を提供できる。モニタリングの過程においては、血中血小板数の変動が見られることもあるので、Ｃ２ＰＡＣインデックスを用いてモニタリングすることも患者の状態を観察するのには更に好適である。
　その他の実施態様としては、脳出血と診断された患者の場合も経時的に血液サンプルを採取し、ｓＣＬＥＣ２を測定することによって、患者の状態をモニタリングすることが可能である。ｓＣＬＥＣ２は血小板の活性化の状況を表すとされているので、ｓＣＬＥＣ２は高値を維持するならば出血が続いて止血血栓の形成が続いていることが予想でき、低値化して行けば止血血栓の形成が減少していることが予想できる。出血が続いている場合は、脳内の血腫が増大して脳を圧迫し症状が増悪するため、血中ｓＣＬＥＣ２により出血の状況を把握することは重要であり、有用である。
　また、このようなモニタリングによるリスク評価の使用方法としては、ｓＣＬＥＣ２濃度を出血性脳卒中患者に対する治療の前後で比較をしてリスク予測として使用することもできる。例えば、治療により、ｓＣＬＥＣ２濃度が減少すれば血小板の活性化が抑えられる方向であるが、ｓＣＬＥＣ２濃度が高値を持続する又は増加するような場合は、降圧療法の見直しも考慮することができる。
　モニタリングの過程においては、血中血小板数の変動が見られることもあるので、Ｃ２ＰＡＣインデックスを用いてモニタリングすることも患者の状態を観察するのには更に好適である。
　モニタリングによってリスク評価を実施する場合であっても、出血性脳卒中（くも膜下出血または脳出血）を疑いうる症状を述べている患者に対して血中ｓＣＬＥＣ２濃度の測定を行い、その値が健常者等に比べ高値であれば、出血性脳卒中の可能性が高いと判断できる。また、出血性脳卒中と診断された患者の血液を経時的に採取して、そのｓＣＬＥＣ２濃度を測定して経時的に比較することにより、患者の状態をモニタリングすることができる。
　モニタリングによってリスク評価を実施する場合であっても、測定された患者由来試料中のｓＣＬＥＣ２濃度と、出血性脳卒中の可能性との相関については、患者由来試料中のｓＣＬＥＣ２濃度と、非出血性脳卒中者由来試料中のｓＣＬＥＣ２濃度との比較から閾値を適宜設定して使用してもよいし、同一患者において発症前にｓＣＬＥＣ２濃度の経時的記録から、ｓＣＬＥＣ２濃度の顕著な変動が検出された場合に評価を行うこととしてもよい。
　ｓＣＬＥＣ２は、血小板の活性化に伴い血中に放出される。既存の血小板活性化マーカー、例えば、血小板第４因子（ＰＦ４）、βトロンボグロブリン（βＴＧ）は、採血による物理的な圧力により血小板が刺激され、疾患に対して非特異的な放出を起こすことが問題とされているが、ｓＣＬＥＣ２は、血小板活性化を惹起するシグナル伝達依存的な放出機序であり、生体内の血小板の活性化をより正確に反映するマーカーになりうる。また、ＣＬＥＣ２はヒトでは血小板・巨核球系に発現がほぼ限られるため、偽陽性が少ない血小板特異的なマーカーになる。従って、ｓＣＬＥＣ２を測定することにより血小板の活性化状態を早期に推定することが可能となり、出血性脳卒中の診断、病態のモニタリングに利用可能となる。
　以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
《実施例１：ヒト血漿中ｓＣＬＥＣ２の測定》
　血漿中のｓＣＬＥＣ２濃度を、以下のようにして測定を実施した。
（測定用試薬の作製と被検試料の調製）
・検体希釈液：防腐剤を含む０．１ｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）を用いて、オクタン酸ナトリウム２％、ｎ－オクチル－β－Ｄ－グルコシド（ＯＧ）０．５％になるように組み合わせて検体希釈液とした。
　試薬に含まれる抗体は、特許第６０７８８４５号公報の実施例に記載の抗体を使用し、以下のように調製した。
・第１抗体溶液：磁性ラテックス粒子（ＪＳＲ社）にｓＣＬＥＣ２を認識するマウスモノクローナル抗体（１１Ｄ５）を結合させ、防腐剤を含む０．０１ｍｏｌ／ＬのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）に分散させた。
・第２抗体溶液：ｓＣＬＥＣ２を認識する別のマウスモノクローナル抗体（１１Ｅ６）をマレイミド法によりアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）標識し、防腐剤を含む０．０１ｍｏｌ／ＬのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）に分散させた。
・発光基質溶液：２－クロロ－５－（４－メトキシスピロ｛１，２－ジオキセタン－３，２´－（５´－クロロ）－トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン｝－４－イル）－１－フェニルホスフェート・二ナトリウム（ＣＤＰ－Ｓｔａｒ（登録商標）：アプライドバイオシステム社）を使用した。
・Ｂ／Ｆ洗浄液：０．１ｍｏｌ／Ｌクエン酸（ｐＨ６．５）、０．１５ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、を含む緩衝液を使用した。
・被検試料：組換えｈＣＬＥＣ２蛋白質を緩衝液（０．０２５ｍｏｌ／Ｌ　ＨＥＰＥＳ、０．１４ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ、０．１％オクタン酸ナトリウム、０．３％ＢＳＡ）を用いて希釈したものを被検試料１、クエン酸血漿を用いて希釈したものを被検試料２として使用した。
（測定試薬による測定）
　測定には、全自動臨床検査システムＳＴＡＣＩＡ（登録商標、ＬＳＩメディエンス社製）を使用した。
　ＳＴＡＣＩＡ専用ボトルに、調製した検体希釈液、第１抗体溶液（磁性ラテックス試薬）、第２抗体溶液（酵素標識抗体試薬）をそれぞれ充填し、装置にセットした。以下前記装置の運転方法に従い測定した。
　具体的には、試料１０μＬに検体希釈液４０μＬを加え、３７℃で数分間加温した後、第１抗体溶液（磁性ラテックス試薬）２５μＬを加え、３７℃で数分間加温した。次いで、Ｂ／Ｆ分離を行い、５０μＬの第２抗体溶液（酵素標識抗体試薬）を加え、３７℃で数分間加温し、再度Ｂ／Ｆ分離を行った後、１００μＬの発光基質溶液を加え、３７℃で数分反応後にシグナル強度（カウント）を測定した。
　図１にｈｓＣＬＥＣ２蛋白質を標準品として用いて作成した標準曲線を示した。
《実施例２：くも膜下出血患者、脳出血患者及び健常者の血漿検体中のｓＣＬＥＣ２の測定》
　外来患者の診察によりくも膜下出血または脳出血と診断された患者から得られたクエン酸血漿を用いて実施例１の方法で血漿中ｓＣＬＥＣ２濃度、血小板値、ｓＣＬＥＣ２／血小板比（Ｃ２ＰＡＣインデックス）を測定した（表１、表２）。また、健常者のｓＣＬＥＣ濃度についても測定を実施した（表３）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
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Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　くも膜下出血、脳出血のいずれも出血性脳卒中患者のｓＣＬＥＣ２測定値（ｐｇ／ｍＬ）は健常者のｓＣＬＥＣ測定値に比べ有意に高値であった（Ｐ＜０．０００１）（表４）。各々の測定値は図２（くも膜下出血）、図３（脳出血）に示した。
　また、別途測定したＣ２ＰＡＣインデックスの健常者の上限値は０．５５であった。
《実施例３：ｓＣＬＥＣ２による出血性脳卒中（くも膜下出血及び脳出血）の診断の感度及び特異度》
　閾値を１２０ｐｇ／ｍＬに設定とすると、ｓＣＬＥＣ２の出血性脳卒中の診断能は、感度（３４／３４）＝１００％、特異度（７１／７１）＝１００％、正診率（１０５／１０５）＝１００％、となる（表５）。
　以上のことより、ｓＣＬＥＣ２の測定、並びにｓＣＬＥＣ２／血小板比（Ｃ２ＰＡＣインデックス）は、出血性脳卒中の診断に対して簡便、且つ正確なデータを提供する手段となる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
《実施例４：ｓＣＬＥＣ２によるくも膜下出血患者のモニタリング》
　くも膜下出血と診断された１症例の第１病日、第８病日、第１０病日の各種検査値を示す（図４）。ｓＣＬＥＣ２は第１病日から第８病日に若干上昇したが、血小板数も大きく上昇しているので、Ｃ２ＰＡＣインデックスは若干の減少傾向を示した。
《実施例５：ｓＣＬＥＣ２による脳出血患者のモニタリング》
　脳出血と診断された１症例の第１病日、第２病日、第１２病日、第１４病日の各種検査値を示す（図５）。ｓＣＬＥＣ２、およびＣ２ＰＡＣインデックスは第１２病日に上昇し第１４病日で下降したが、Ｄ－ダイマーは第１２病日から第１４病日にかけて上昇した。
　以上のように、本発明における血中ｓＣＬＥＣ２の測定値、及びｓＣＬＥＣ２／血小板比は、出血性脳卒中であるくも膜下出血、脳出血の診断に使用できる臨床検査となり、出血性脳卒中であるくも膜下出血患者、脳出血患者の状態のモニタリングとしても使用できるため、ｓＣＬＥＣ２測定は、出血性脳卒中患者のリスク評価法として有用である。

Claims (8)

  1. 　出血性脳卒中の罹患が疑われる患者又は出血性脳卒中と診断された患者から採取した血液中に存在する、可溶型ＣＬＥＣ２濃度を測定する工程を含む、出血性脳卒中のリスク評価を行う方法。
  2. 　出血性脳卒中の罹患が疑われる患者又は出血性脳卒中と診断された患者のリスク評価を行う方法であって、
    　（１）前記患者に由来する血液試料を提供する工程、
    　（２）前記試料中の可溶型ＣＬＥＣ２濃度を決定する工程、
    　（３）前記可溶型ＣＬＥＣ２濃度と、前記患者における出血性脳卒中の存在若しくは非存在、又は転帰の可能性を相関させる工程、
    を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 　出血性脳卒中の罹患が疑われる患者又は出血性脳卒中と診断された患者のリスク評価を行う方法であって、前記可溶型ＣＬＥＣ２濃度と、前記患者における出血性脳卒中の存在若しくは非存在、又は転帰の可能性を相関させる工程が、前記可溶型ＣＬＥＣ２濃度の変化に基づいて、リスクを前記患者が有するかどうかを評価することを含む、請求項２に記載の方法。
  4. 　出血性脳卒中の罹患が疑われる患者又は出血性脳卒中と診断された患者のリスク評価を行う方法であって、可溶型ＣＬＥＣ２濃度と出血性脳卒中を相関させる工程で、その閾値が１３７ｐｇ／ｍＬである、請求項２又は３に記載の方法。
  5. 　出血性脳卒中の罹患が疑われる患者又は出血性脳卒中と診断された患者のリスク評価を行う方法であって、
    　（１）前記患者に由来する血液試料を提供する工程、
    　（２）前記試料中の可溶型ＣＬＥＣ２濃度を決定する工程、
    　（３）前記試料中の血小板数を測定する工程、
    　（４）前記可溶型ＣＬＥＣ－２濃度を血小板数で除する工程、
    　（５）前記可溶型ＣＬＥＣ２濃度を血小板数で除した値と、前記患者における出血性脳卒中の存在又は非存在を相関させる工程、
    を含む、請求項１に記載の方法。
  6. 　出血性脳卒中の罹患が疑われる患者又は出血性脳卒中と診断された患者における出血性脳卒中のリスク評価を行う方法であって、可溶型ＣＬＥＣ２濃度を血小板数で除した値と出血性脳卒中を相関させる工程で、前記可溶型ｓＣＬＥＣ２濃度を血小板数で除した値の閾値が０．７～１．０である、請求項５に記載の方法。
  7. 　出血性脳卒中が、くも膜下出血又は脳出血のいずれかである、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 　可溶型ＣＬＥＣ２濃度を決定する工程が、高感度免疫測定法、例えば、化学発光免疫測定法、電気化学発光免疫測定法、蛍光免疫測定法である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
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