JP2011530705A - 肺塞栓症のためのＤダイマー、トロポニン、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ - Google Patents

肺塞栓症のためのＤダイマー、トロポニン、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ Download PDF

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Abstract

本発明は、急性PEへの罹患の疑いのある被験体における急性PEの診断方法であって、（a）被験体のサンプルにおけるフィブリン-フィブリノーゲン分解産物（特にDダイマー）の量を測定するステップ、（b）被験体のサンプルにおけるナトリウム利尿ペプチドの量を測定するステップ、（c）被験体のサンプルにおける心筋トロポニンの量を測定するステップ、及び（d）ステップ（a）〜（c）における測定量と参照量とを比較するステップであって、それにより前記診断を確立する上記ステップを含む方法に関する。また、PEと診断された被験体の治療について決定する方法、及び治療をモニターする方法も含む。本発明はまた、上記方法を実施するためのデバイス及びキットを含む。
【選択図】なし

Description

本発明は、診断方法、特に被験体における急性肺塞栓症（PE）の診断方法であって、被験体のサンプルにおけるフィブリン-フィブリノーゲン由来分解産物（特にDダイマー）、ナトリウム利尿ペプチド（特にNT-proBNP）及び心筋トロポニンの量を測定するステップ、及びその量を参照量と比較するステップを含む方法に関する。さらに本発明は、被験体における様々な程度の急性PEを鑑別する方法であって、被験体のサンプルにおけるフィブリン-フィブリノーゲン由来分解産物（特にDダイマー）、ナトリウム利尿ペプチド（特にNT-proBNP）及び心筋トロポニンの量を測定するステップ、及びその量を参照量と比較するステップを含む方法にも関する。本発明はまた、上記方法を実施するためのデバイス及びキットを含む。
PEは、入院を必要とする、生死にかかわる医療事象である。PEの特徴的な臨床症候としては、急性の息切れ、虚脱様症状及び胸痛がある。PEは、大腿静脈に生じることの多い血栓症によって引き起こされる。さらに血栓症は、血液凝固カスケードにおける遺伝的に生じた異常又は癌などの他の症状に伴う可能性がある。
血栓症の結果として、浮遊血栓が肺動脈に入り、そこを閉塞させる可能性がある。塞栓の大きさが、動脈閉塞の位置を決定する。肺動脈の閉塞は右側の心臓の心室内圧の上昇と容量負荷をもたらし、その結果として、不十分な左心機能と循環障害をもたらす。
PEは、上記の急性の臨床症候を伴う単一の事象として生じる可能性があり、この症候は、特に救急患者の場合は入院につながり、あるいは複数の小規模なPEの結果、最新のPEのみが前記臨床症候を伴う。後者の状態は、本明細書において、以下「多発性PE」と呼ぶ。
肺塞栓症（PE）は誰にでも起こり、重篤性のしばしば致死性の健康問題である。西側先進国の一般集団における深部静脈血栓症（DVT）及びPEの年間発症率はそれぞれ1000人当たり0.5〜1.0と推定されている（van Beek EJR, ten Cate JW. The diagnosis of venous thromboembolism: an overview. Hull RD, Raskob GE, pineo GF編 Venous Thromboembolism: an evidence-based atlas. Armonkl: Futura Publishing Co, 1996: 93-9）。しかしながら、剖検調査により示されるように、認識されず処置されていない事例が数多くある。PEは広範な臨床所見を有するため、診断は難しく実施するのが困難である。急性PEの最も一般的な臨床兆候は、呼吸困難、胸痛及び失神である。これらの兆候は急性冠症候群のものと類似している。内部救急科の約30％の患者は胸痛及び呼吸器症状を示し、これは一見して、急性冠症候群を示すように見える。しかし、これらの患者の50％超が急性冠症候群に罹患していない。これらの患者が示す症候は、PE及び他の肺疾患が多数を占める心臓以外の原因と関連している。PEの合理的な臨床的証拠を示す患者において、最初に行われる診断検査、例えばECG、胸部X線及び血液ガス分析は、患者のPEの臨床的可能性及び全身状態の評価を示す。PEを除外する診断は、Dダイマーの濃度（低レベルがPEの除外を示唆する）を測定することにより行うことができる。しかし、Dダイマーレベルの上昇は非特異的であり、炎症反応などの止血、例えば感染症、又は敗血症、又は悪性腫瘍などの血管内播種性活性化プロセスと関連する症状においてみられる。PEの診断の確認は、胸部X線、肺シンチグラフィ、肺血管造影、造影、スパイラルコンピュータ断層撮影及び心エコー検査により確立される。
治療をできる限り早く開始することが重要である。初期致死率は高く、疾患の重度及び随伴疾患（特に心血管系疾患）の存在に応じて異なる。症候の開始後2時間以内におよそ90％の死亡が生じる。入院中の処置されないPEの死亡率は30％であり、これは適当な治療を行うことにより約2〜8％低下しうる。
治療の成功は、疾患の重度に応じた初期の治療手段の開始によって実質的に決まる。従って、PEの臨床的疑いの全ての事例において、この疑いを診断手段及び予後判定手段により明らかにすべきである。一方でこの基礎となるのは、診断及び予後判定の評価を可能とし、救急の場合でも適当な診断検査パラメータ及び検査方法の存在である。
これらの診断／予後判定値について不確定であることに起因して、心臓バイオマーカーであるトロポニン及びナトリウム利尿ペプチドは治療ガイドラインに含められていなかった（抗凝血、血栓溶解、塞栓除去）。
個々の患者に適当な治療の決定には、臨床的救急状態では、診断に加えて、リスク層化及び予後判定評価も必要である。診断が確定である場合には、必須の治療課題は、ヘパリンを用いた抗凝血が十分であるかどうか、又は追加的な手段、例えば血栓溶解若しくは塞栓除去が必要であるかどうかである。血栓溶解及び塞栓除去は、合併症及び副作用のリスクのため、禁忌が存在しない場合でも、重度のPEの場合にのみ使用すべきである。
実際のガイドラインに従って、患者の血行動態状況はリスク群I〜IV（血行動態安定から蘇生まで）への分類に極めて重要である。DダイマーはPEの除外のための一次診断としてすでに確立されているが、さらなるマーカーを用いることによるさらなる分類は差しあたって可能ではない。
従って、本発明の根底にある技術的課題は、上述のニーズを満たす手段及び方法の提供とみなされる。
上記技術的課題は、特許請求の範囲及び本明細書中の以下で特徴付けられる実施形態により解決される。
従って、本発明は、急性PEへの罹患が疑われる被験体における急性PEを診断する方法であって、以下のステップ：
（a）被験体のサンプルにおけるフィブリン-フィブリノーゲン分解産物の群から選択される凝血及び線維素溶解の血管内活性化のマーカーの量、好ましくはDダイマーの量を測定するステップ、
（b）被験体のサンプルにおけるナトリウム利尿ペプチド、好ましくはNT-proBNPの量を測定するステップ、
（c）被験体のサンプルにおける心筋トロポニン、好ましくはトロポニンT又はトロポニンI、特にトロポニンTの量を測定するステップ、
（d）ステップ（a）〜（c）における測定量と参照量とを比較するステップであって、それにより前記診断を確立する上記ステップ
を含む方法に関する。
本明細書において用いられる「診断」は、被験体が本明細書中で言及している疾患に罹患する確率を評価することを指す。当業者であれば理解されるように、そのような評価は通常、診断対象の被験体の100％について正確であることは意図していない。しかし、この用語は、被験体の統計学的に有意な一部が、上記の疾患に罹患していると診断できることを要する（例えば、コホート又は症例対照研究における1コホート）。当業者であれば、他に苦労なく種々の周知の統計学的評価ツールを用いて、例えば、信頼区間の決定、p値の決定、スチューデントのt検定、マン・ホイットニー検定などを行って、一部が統計学的に有意であるかどうかを決定することが可能である。詳細な内容は、Dowdy and Wearden、Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983に見い出される。好ましい信頼区間は、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも97％、少なくとも98％、又は少なくとも99％である。p値は、好ましくは、0.1、0.05、0.01、0.005、又は0.0001である。
本発明において「診断」はまた、関連の疾患、症候又はそのリスクのモニター、確認、細分類及び予測も含む。モニターは、既に診断された疾患又は合併症の経過追跡、例えば、疾患の進行、又は疾患若しくは合併症の進行に対する特定の治療の影響を分析することに関する。確認は、他の指標又はマーカーを用いて既に実施された診断の強化又は実証に関する。細分類は、診断された疾患の様々なサブクラスに従って、診断をさらに明確化することに関し、例えば、疾患の軽度の形態及び重度の形態に応じて明確にすることに関する。予測は、他の症候又はマーカーが顕在化し、又は有意に変化するようになる前に疾患又は合併症を予知することに関する。
本明細書において用いられる「肺塞栓症（PE）」という用語は、上記のPEの臨床症候に伴う疾患又は症状、すなわち、急性の息切れ、虚脱様症状及び／又は胸痛、また場合により、不十分な左心補助を伴い得る心臓の右心室の容量負荷を指す。
本明細書で用いられる「被験体」という用語は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトに関する。しかし、本発明において、被験体は、好ましくは、PEの上記の明らかな臨床症候を示すことが想定される。
本発明の方法は、少なくとも3つのマーカーを測定することを含み、ステップ（a）では凝血及び線維素溶解の血管内活性化の少なくとも1つのマーカーを、ステップ（b）では心虚血及び壊死の少なくとも1つのマーカーを、ステップ（c）では心室容量及び圧負荷の少なくとも1つの神経液性マーカーを測定する。
心筋トロポニンI及びTは、PEにおける肺動脈圧の上昇に起因する右室圧負荷及び低酸素症により生じる、右室虚血、右室損傷及び心筋細胞壊死の程度に応じて放出される。PEに罹患している患者の11〜50％に心筋トロポニンI及びTの血清濃度の上昇が観察されている。従って、PEに罹患している患者の大部分（50％を超える）はトロポニンレベルの上昇を示さないため、トロポニンの測定は、限定された情報を提供するのみである。さらに、トロポニンレベルは、急性冠症候群（ACE）と比較してPE患者において中程度に上昇するのみであり、その上昇も短期間である。しかし、さらなる制約は、トロポニンの放出がPEの発症後6〜12時間にのみ開始するという事実にある。
ナトリウム利尿ペプチドは、心室壁ストレス及び容量負荷の結果として放出される。従って、これらは心室機能不全（心不全）に罹患している患者における診断及び予後判定マーカーとして確立されている。プロホルモンであるproBNPは心室筋細胞において合成され、そのため、心筋壁ストレス及び容量負荷の発生後に合成速度が上昇する結果として血清中で上昇し、これは数時間後にのみ生じる。ナトリウム利尿ペプチドBNP及びNT-proBNPの血清又は血漿濃度の上昇は、PEにおける肺動脈圧の増大により引き起こされる右心室容量負荷及び機能不全と関連している。従って、さらなる制約は、ナトリウム利尿ペプチドもまた右心室容量負荷と関連した他の心臓以外の疾患（例えば慢性肺疾患、COPDなど、又は原発性肺高血圧症）でも上昇するという事実である。従って、ナトリウム利尿ペプチドは、トロポニンと同様に、単独で解釈する場合には、特異度がないことに起因して限られた予後判定及びPEしか許容しない。
PEに罹患している患者のリスク層化のために心筋トロポニン又はナトリウム利尿ペプチドを単独で用いる場合、リスクが低い患者群のみを同定することができる。それは、心筋マーカーが入院中の死亡率に関して高い陰性予測値を有するためである。制約はカットオフ値である。PEリスクの上昇を除外するためのBNPのカットオフ値は、心不全を除外するためのカットオフ値（100 pg/ml）以下である。トロポニン又はNT-proBNPレベルの上昇を示す血行動態が安定したPE患者においてさえも、予後を判定し、治療を選択するためには心エコー検査が依然として必要である。しかし、ナトリウム利尿ペプチド又はトロポニンを単独で用いる診断手順の欠点は、全ての高リスク患者を十分に同定することはできないという事実である。
本発明において、Dダイマー、ナトリウム利尿ペプチド（特にNT-proBNP）、心筋トロポニン、又は本明細書に記載の任意の他のポリペプチドの量の測定は、その量又は濃度の測定、好ましくは半定量的又は定量的測定に関する。測定は、直接的又は間接的に実施可能である。直接的測定とは、ポリペプチド自体から得られるシグナル及びサンプル中に存在するペプチドの分子数と直接的に相関する強度に基づいてポリペプチドの量又は濃度を測定することを意味する。そのようなシグナル（本明細書中では強度シグナルと称することもある）は、例えば、ポリペプチドの特定の物理的性質又は化学的性質の強度値を測定することにより取得可能である。間接的測定としては、二次成分（すなわち、ポリペプチド自体ではない成分）、又は生物学的読取り系、例えば、測定可能な細胞応答、リガンド、標識、若しくは酵素反応生成物から得られるシグナルを測定することが挙げられる。
本発明において、ポリペプチドの量の測定は、サンプル中のペプチドの量を測定するためのすべての公知の手段により達成可能である。該手段は、種々のサンドイッチアッセイ方式、競合アッセイ方式、又は他のアッセイ方式で標識分子を利用しうるイムノアッセイのデバイス及び方法を含む。該アッセイでは、ポリペプチドの存在又は不在の指標となるシグナルが発生するであろう。さらに、シグナル強度は、好ましくは、サンプル中に存在するポリペプチドの量に直接的又は間接的に相関する（例えば反比例する）ものもある。さらなる好適な方法は、ポリペプチドに特異的な物理的性質又は化学的性質、例えば、その正確な分子質量又はNMRスペクトルを測定することを含む。該方法としては、好ましくは、バイオセンサー、イムノアッセイに連結された光学デバイス、バイオチップ、分析装置、例えば、質量分析計、NMR分析器、又はクロマトグラフィー装置が含まれる。さらに、方法としては、マイクロプレートELISAに基づく方法、完全自動化若しくはロボット化イムノアッセイ（例えば、ElecsysTM分析器を用いて実施可能）、CBA（酵素的コバルト結合アッセイ、例えば、Roche-HitachiTM分析器を用いて実施可能）、及びラテックス凝集アッセイ（例えば、Roche-HitachiTM分析器を用いて実施可能）が挙げられる。
好ましくは、ポリペプチドの量の測定は、（a）その強度がペプチドの量の指標となる細胞応答を引き起こすことができる細胞を、適切な時間にわたり、該ペプチドと接触させるステップ、及び（b）細胞応答を測定するステップを含む。
細胞応答を測定するために、好ましくは、サンプル又は処理済サンプルを細胞培養物に添加して、内部又は外部の細胞応答を測定する。細胞応答としては、レポーター遺伝子の測定可能な発現、又はペプチド、ポリペプチド若しくは小分子などの物質の分泌が挙げられる。発現又は物質は、ペプチドの量と相関する強度シグナルを生成するものとする。
さらに好ましくは、ポリペプチド量の測定は、サンプル中のポリペプチド又は肺サーファクタントタンパク質から得られる特異的な強度シグナルを測定するステップを含む。
以上に記載したように、そのようなシグナルは、質量スペクトルで観測されるポリペプチドに特異的なm/z変量又はポリペプチドに特異的なNMRスペクトル、で観察されるシグナル強度でありうる。
さらに、ポリペプチドの量の測定は、好ましくは、（a）ペプチドを特異的リガンドに接触させるステップ、（b）（場合により）非結合リガンドを除去するステップ、及び（c）結合したリガンドの量を測定するステップを含む。
結合したリガンドは、強度シグナルを生成するであろう。本発明において、結合は、共有結合及び非共有結合の両方を包含する。本発明において、リガンドは、本明細書に記載のポリペプチドに結合する任意の化合物、例えば、ペプチド、ポリペプチド、核酸又は小分子でありうる。好ましいリガンドとしては、抗体、核酸、ペプチド又はポリペプチド、例えば、ポリペプチドに対するレセプター、及びペプチドに対する結合ドメインを含むそれらの断片、並びにアプタマー、例えば、核酸アプタマー又はペプチドアプタマーが挙げられる。そのようなリガンドの調製方法は、当技術分野で周知である。例えば、好適な抗体又はアプタマーの同定及び作製もまた、供給業者により提供される。当業者は、より高いアフィニティ又は特異性を有するそのようなリガンドの誘導体の開発方法に精通している。例えば、ランダム突然変異を核酸、ペプチド又はポリペプチドに導入することが可能である。次に、当技術分野で公知のスクリーニング手順、例えば、ファージディスプレイにより、これらの誘導体を結合に関して試験することが可能である。本明細書において記載する抗体には、ポリクロナール抗体及びモノクロナール抗体の両方、並びにそれらのフラグメント、例えば、抗原又はハプテンに結合可能なFv、Fab、及びF(ab)2フラグメントが含まれる。本発明はまた、所望の抗原特異性を呈する非ヒトドナー抗体のアミノ酸配列とヒトアクセプター抗体の配列とが組み合わされたヒト化ハイブリッド抗体を包含する。ドナー配列は、通常、ドナーの少なくとも抗原結合性アミノ酸残基を含むであろうが、ドナー抗体の他の構造上及び／又は機能上関連するアミノ酸残基を含んでもよい。そのようなハイブリッドは、当技術分野で周知のいくつかの方法により調製可能である。好ましくは、リガンド又は作用剤はポリペプチドに特異的に結合する。本発明において、特異的結合は、リガンド又は作用剤が分析対象のサンプル中に存在する他のペプチド、ポリペプチド又は物質に実質的に結合する（それらと「交差反応する」）ものであってはならないことを意味する。特異的に結合するポリペプチドは、任意の他の関連するペプチド又はポリペプチドのアフィニティの好ましくは少なくとも3倍、より好ましくは少なくとも10倍、さらにより好ましくは少なくとも50倍高いアフィニティで結合する必要がある。非特異的結合は、それが、例えば、ウェスタンブロット上のサイズにより又はサンプル中の比較的高い存在量により、依然として識別可能でありかつ明確に測定可能である場合には、許容できる。リガンドの結合は、当技術分野で公知の任意の方法により測定可能である。好ましくは、該方法は、半定量的又は定量的である。好適な方法について、以下で説明する。
第1に、リガンドの結合は、例えば、NMR、質量分析、又は表面プラズモン共鳴により、直接測定することができる。
第2に、リガンドが対象ペプチド又は対象ポリペプチドの酵素活性の基質としても機能する場合には、酵素反応生成物を測定することが可能である（例えば、切断された基質の量を、例えばウェスタンブロットにおいて、測定することにより、プロテアーゼの量を測定することが可能である）。あるいは、リガンドが酵素の性質自体を呈するものであれば、リガンド／ポリペプチド複合体又はポリペプチドと結合したリガンドのそれぞれを好適な基質と接触させて、強度シグナルの生成により検出を行うことが可能である。酵素反応生成物の測定では、好ましくは、基質の量は飽和状態である。また、反応前に、検出可能な標識で基質を標識することも可能である。好ましくは、サンプルを適切な時間にわたり基質と接触させる。適切な時間とは、検出可能な（好ましくは測定可能な）量の生成物が生成するのに必要な時間を意味する。生成物の量を測定する代わりに、所与の（例えば検出可能な）量の生成物が出現するのに必要な時間を測定することも可能である。
第3に、リガンドを共有結合又は非共有結合で標識に結合させることにより、リガンドの検出及び測定を行うことが可能である。標識は、直接的又は間接的な方法により実施可能である。直接的標識は、標識をリガンドに（共有結合又は非共有結合で）直接結合させることを含む。間接的標識は、一次リガンドに二次リガンドを（共有結合又は非共有結合で）結合させることを含む。二次リガンドは、一次リガンドに特異的に結合するものでなければならない。該二次リガンドは、好適な標識に結合させてもよいし、かつ／又は二次リガンドに結合する三次リガンドの標的（レセプター）であってもよい。シグナルを増大させるために、二次、三次又はより高次のリガンドが用いられることもある。好適な二次及びより高次のリガンドとしては、抗体、二次抗体、及び周知のストレプトアビジン-ビオチン系（Vector Laboratories, Inc.）が挙げられる。当技術分野で公知のように、リガンド又は基質を1種以上のタグで「タグ標識」することも可能である。その場合、そのようなタグは、より高次のリガンドの標的でありうる。好適なタグとしては、ビオチン、ジゴキシゲニン、Hisタグ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、FLAG、GFP、mycタグ、A型インフルエンザウイルスヘマグルチニン（HA）、マルトース結合タンパク質などが挙げられる。ペプチド又はポリペプチドの場合、タグは、好ましくはN末端及び／又はC末端に存在する。好適な標識は、適切な検出方法により検出可能な任意の標識である。典型的な標識としては、金粒子、ラテックスビーズ、アクリダンエステル、ルミノール、ルテニウム、酵素活性標識、放射性標識、磁性標識（例えば「磁性ビーズ」、常磁性標識及び超常磁性標識など）、及び蛍光標識が挙げられる。酵素活性標識としては、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、及びそれらの誘導体が挙げられる。検出に好適な基質としては、ジ-アミノ-ベンジジン（DAB）、3,3'-5,5'-テトラメチルベンジジン、NBT-BCIP（4-ニトロブルーテトラゾリウムクロリド及び5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-ホスフェート、Roche Diagnosticsから既製のストック溶液として入手可能）、CDP-StarTM（Amersham Biosciences）、ECFTM（Amersham Biosciences）が挙げられる。好適な酵素-基質の組み合わせを用いれば、当技術分野で公知の方法（例えば、感光性フィルム又は好適なカメラシステムを用いる方法）により測定できる呈色反応生成物、蛍光又は化学発光を生成させることが可能である。酵素反応の測定に関しては、上に示した判定基準が同じように適用される。典型的な蛍光標識としては、蛍光タンパク質（例えば、GFP及びその誘導体）、Cy3、Cy5、テキサスレッド、フルオレセイン、及びAlexa色素（例えば、Alexa 568）が挙げられる。さらなる蛍光標識は、例えば、Molecular Probes（Oregon）から入手可能である。さらに、蛍光標識として量子ドットの使用も想定される。典型的な放射性標識としては、35S、125I、32P、33Pなどが挙げられる。放射性標識は、任意の公知の適切な方法、例えば、感光性フィルム又はホスファーイメージャーにより、検出可能である。本発明において好適な測定方法としては、この他に、沈降（特に免疫沈降）、電気化学発光（電解発生化学発光）、RIA（ラジオイムノアッセイ）、ELISA（酵素結合免疫吸着アッセイ）、サンドイッチ酵素免疫試験、電気化学発光サンドイッチイムノアッセイ（ECLIA）、解離増強ランタニド蛍光イムノアッセイ（DELFIA）、シンチレーション近接アッセイ（SPA）、比濁法、比朧法、ラテックス増強比濁法若しくはラテックス増強比朧法、又は固相免疫試験が挙げられる。当技術分野で公知のさらなる方法（例えば、ゲル電気泳動、2次元ゲル電気泳動、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）、ウェスタンブロッティング、及び質量分析）を、単独で、又は標識化若しくは上に記載の他の検出方法と組み合わせて、使用することが可能である。
さらに好ましくは、ポリペプチドの量の測定は、（a）上で特定されたポリペプチドに対するリガンドを含む固体支持体を、ポリペプチドを含むサンプルと接触させて、（b）支持体に結合したポリペプチドの量を測定する、ことを含む。
リガンド（好ましくは、核酸、ペプチド、ポリペプチド、抗体、及びアプタマーからなる群より選択される）は、好ましくは、固相化形態で固体支持体上に存在する。固体支持体を製造するための材料は、当技術分野で周知であり、特に、市販のカラム材料、ポリスチレンビーズ、ラテックスビーズ、磁性ビーズ、コロイド金属粒子、ガラス及び／又はシリコンのチップ及び表面、ニトロセルロースストリップ、膜、シート、デュラサイト（duracyte）、反応トレーのウェル及び壁、プラスチックチューブなどが挙げられる。リガンド又は作用剤は、多種多様な担体に結合可能である。周知の担体の例としては、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、デキストラン、ナイロン、アミロース、天然セルロース及び変性セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、並びにマグネタイトが挙げられる。担体の性質は、本発明の目的では、可溶性又は不溶性のいずれも可能である。該リガンドの固定化／固相化に好適な方法は、周知であり、例えば限定されるものではないが、イオン性相互作用、疎水性相互作用、共有結合相互作用などが挙げられる。本発明では、「懸濁アレイ」をアレイとして使用することも想定される（Nolan JP, Sklar LA. (2002). Suspension array technology: evolution of the flat-array paradigm. Trends Biotechnol. 20(1):9-12）。そのような懸濁アレイでは、マイクロビーズやマイクロスフェアなどの担体は、懸濁状態で存在する。アレイは、標識化されていてもよい、さまざまなリガンドを担持するさまざまなマイクロビーズ又はマイクロスフェアで構成される。そのようなアレイ、例えば、固相化学及び光感受性保護基に基づくアレイの製造方法は、広く知られている（米国特許第5,744,305号）。
本明細書において用いられる「量」という用語は、Dダイマー、ナトリウム利尿ペプチド（特にNT-proBNP）、心筋トロポニン（好ましくはトロポニンT若しくはトロポニンI）、又は本明細書に記載の任意の他のポリペプチドの絶対量、Dダイマー、ナトリウム利尿ペプチド（特にNT-proBNP）、心筋トロポニン（好ましくはトロポニンT若しくはトロポニンI）、又は本明細書に記載の任意の他のポリペプチドの相対量又は相対濃度、並びにこれらと相関する任意の値又はパラメーターを包含する。そのような値又はパラメータは、直接的測定により本明細書に記載のポリペプチドから得られるいずれも特異的な物理的性質又は化学的性質に由来する強度シグナル値、例えば、質量スペクトル又はNMRスペクトルの強度値を含む。さらに、本明細書中の他の箇所に記載された間接的測定により得られるすべての値又はパラメータ、例えば、ポリペプチドに応答する生物学的読取り系から決定される応答レベル、又は特異的に結合したリガンドから得られる強度シグナルが含まれる。上述の量又はパラメータと相関する値もまた、いずれも標準的な数学演算により取得可能であることが理解されよう。
Dダイマーは、およそ200kDaの分子量を有する架橋フィブリン分解産物である。血液凝固の過程で凝血及び線維素溶解の両方が活性化され、活性セリンプロテアーゼであるトロンビン及びプラスミンを生じる。トロンビンはフィブリノーゲンから2つのフィブリノペプチドA分子を分割する。残りのdesAAフィブリンモノマーは多量体化により可溶性フィブリンを形成する。最終産物は、第XIIIa因子の活性による架橋によりフィブリン分子から形成される不溶性フィブリン塊である。フィブリン及びフィブリノーゲンは両方ともプラスミンの基質であり、これは複数の部位でアルギニン及びリシンの結合を加水分解して、フィブリン-フィブリノーゲン分解産物として知られる種々の切断産物を生じる。その最も小さいものがDダイマーである。Dダイマーは架橋フィブリンに由来するものであり、凝血及び線維素溶解の血管内活性化の存在を示す。フィブリン-フィブリノーゲン分解産物、特にDダイマーの血漿濃度は、凝血及び線維素溶解と関連する状態の過程で上昇し、従って、DVT及びPEにおいても上昇する。フィブリン-フィブリノーゲン分解産物（Dダイマーなど）の血漿濃度の上昇はまた、悪性疾患、妊娠、術後患者、感染性疾患、敗血症などの状態（これらは全て凝血の血管内活性化と関連している）においても見られる。Dダイマーは、高い陰性予測値で深部静脈血栓症及びPEを除外するために有用な高感度マーカーである（概説については、Stein et al. (2004), Annals of Internal Medicine, 140(8), 589-602参照）。「Dダイマー」という用語は、好ましくは、2つのD成分の間の架橋結合を含むフィブリン分解産物に関する。該分解産物は、この分子が多種多様な分子量で存在し、種々の数のモチーフを含む可能性があることから、架橋Dダイマーを含む不均質なクラスの分子であることが理解されよう（例えばLippi and Guidi, 2004, Clin Chem 50: 2150-2152参照）。従って、Dダイマーの濃度を測定する場合、2つの架橋D成分からなる分子の量を測定するだけではなく、1以上のDダイマードメインを含むより大きな分子も測定する。Dダイマーの濃度は、好ましくは、Dダイマードメインに対して特異的なモノクローナル抗体を用いて測定する。そのような抗体は当技術分野で周知である。例えばGaffney PJ, Brasher M. Subunit structure of the plasmin-induced degradation products of cross-linked fibrin. Biochim. Biophys. Acta 1973; 295: 308；Stoetzer KE, Amiral J, Spanuth E. Assays of fibrin degradation products (D-dimer) and their clinical relevance. Haemostasis 1988; 18: 121-122；Knecht MF, Heinrich F, Spanuth E. Evaluation of plasma D-dimer in the course of fibrinotytic therapy of deep vein thrombosis and pulmonary embolism. Thrombosis Research 1992; 67: 213-220；Brill-Edwards P, Lee A. D-dimer testing in the diagnosis of acute venous thromboembolism. Thromb Haemost 1999; 688-94；Kulstad EB, Kulstad CE, Lovell EO. A rapid turbimetric D-dimer assay has high sensitivity for detection of pulmonary embolism in the ED. AmJ Emerg Med 2004; 22: 111-114；Ghanima W, Abdelnoor M, Holmen LO et al. D-dimer level is associated with the extent of pulmonary embolism. Thromb Res 2007; 120: 281-88を参照のこと。
フィブリン-フィブリノーゲン分解産物（FDP）という用語は、プラスミンとフィブリノーゲン及び種々の形態のフィブリンとの相互作用による線維素溶解の活性化の過程で形成される産物を含む。この過程において、不活性前駆体タンパク質であるプラスミノーゲンは、最も重要な線維素溶解酵素であるプラスミンに変換されるが、これはフィブリン特異的ではない。またこれは他の血漿タンパク質、例えば凝血因子及びフィブリノーゲンも分解しうる。プラスミンとフィブリノーゲンとの反応で形成される最初の産物はフラグメントXと称されている。フラグメントXは凝固性誘導体（MW＝240,000〜260,000 Da）であり、これは続いて非対称的にフラグメントY（MW＝150,000 Da）及びフラグメントD（MW＝100,000 Da）に分割される。次にフラグメントYは第2のフラグメントD及びフラグメントE（MW＝50,000 Da）へと分割される。プラスミンと種々の形態のフィブリン（可溶性フィブリン、非架橋フィブリン、架橋フィブリン）との相互作用は、フィブリノーゲンについて記載したものに類似した中間体産物を介して進行する。それは、プラスミンがフィブリノーゲンと同じようにフィブリンに同じドメイン間切断パターンを行うためである。非架橋フィブリン（desAAフィブリン、フィブリンI；desAABBフィブリン、フィブリンII）は続いてフラグメントX、Y、D、Eを生じる。架橋フィブリンI及びIIは、サブユニットがイソペプチド結合により共有結合している非常に長い多量体からなる。プラスミンは、ランダムな順序でこれらの多量体構造におけるフィブリンサブユニットを攻撃し、ある範囲の分子量の元々の多量体の小さな可溶性フラグメントを生じる。これらの構造はDダイマーフラグメント、すなわち2つの共有結合したDドメインと、フラグメントEに分解される。
「ナトリウム利尿ペプチド」という用語は、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ANP）型及び脳性ナトリウム利尿ペプチド（BNP）型のペプチド、並びに同じ予想能力を有するそれらの変異体を含む。本発明において、ナトリウム利尿ペプチドはANP型及びBNP型のペプチドとそれらの変異体を含む（例えば、Bonow, 1996, Circulation 93: 1946-1950を参照）。ANP型ペプチドはプレ-プロANP、プロANP、NT-proANP（NT-プロANP）、及びANPを含む。BNP型ペプチドはプレ-プロBNP、プロBNP、NT-proBNP（NT-プロBNP）、及びBNPを含む。プレ-プロペプチド（プレ-プロBNPの場合、134アミノ酸）は、短いシグナルペプチドを含んでおり、これは酵素的に切断されてプロペプチドを放出する（プロBNPの場合、108アミノ酸）。このプロペプチドはさらにN末端プロペプチド（NT-プロペプチド、NT-proBNPの場合、76アミノ酸）及び活性ホルモン（BNPの場合、32アミノ酸、ANPの場合、28アミノ酸）に切断される。本発明において、ナトリウム利尿ペプチドは、好ましくはNT-proANP、ANP、より好ましくはNT-proBNP、BNP、及びそれらの変異体である。ANP及びBNPは活性ホルモンでありかつそれぞれの不活性対応物であるNT-proANP及びNT-proBNPより短い半減期を有する。BNPは血液中で迅速に分解されるが、NT-proBNPは血液中で無傷分子として循環し、それ自体は腎で排出される。NT-proBNPのin-vivo半減期は、20分であるBNPの半減期より120分長い（Smith 2000, J Endocrinol. 167: 239-46）。NT-proBNPの分析前状態はより頑強で、サンプルの中央実験室への輸送が容易である（Mueller 2004, Clin Chem Lab Med 42: 942-4）。血液サンプルは室温にて数日間貯蔵することができ、又は郵送若しくは配送しても回収ロスはない。対照的に、BNPの室温又は4℃における48時間貯蔵は、少なくとも20％の濃度低下をもたらす（Mueller 前掲、Wu 2004, Clin Chem 50: 867-73）。それ故に、時間経過又は目的の性質に応じて、ナトリウム利尿ペプチドの活性型又は不活性型のいずれかの測定が有利でありうる。本発明において、最も好ましいナトリウム利尿ペプチドは、NT-proBNP又はそれらの変異体である。
「NT-proBNP」という用語は、好ましくは、ヒトNT-proBNP分子のN末端部分に対応する76アミノ酸長を含むポリペプチドに関する。ヒトBNP及びヒトNT-proBNPの構造は、先行技術、例えばWO 02/089657号、WO 02/083913号、Bonow 1996, New Insights into the cardiac natriuretic peptides. Circulation 93: 1946-1950に既に詳細に記載されている。好ましくは、本明細書において用いられるヒトNT-proBNPは、EP 0 648 228 B1に開示されているとおりの、又はGenBankアクセッション番号NP-002512.1；GI:4505433のヒトNT-proBNPである。これらの先行技術の文献は、そこに開示されたNT-proBNP及びその変異体の特定の配列について参照により本明細書に組み入れるものとする。
本発明において記載するNT-proBNPはさらに、上述したヒトNT-proBNPの上記特定の配列のアレル変異体及び他の変異体を包含する。具体的には、アミノ酸レベルで、ヒトNT-proBNPに対して少なくとも60％の同一性、さらに好ましくは少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％又は少なくとも99％の同一性を有する変異ポリペプチドが想定される。さらに、診断手段により又はそれぞれの全長ペプチドに対するリガンドにより認識されるタンパク質分解生成物もまた実質的に類似し、また想定される。また、ヒトNT-proBNPのアミノ酸配列と比較してアミノ酸欠失、置換及び／又は付加を有する変異体ポリペプチドは、上記ポリペプチドがNT-proBNPの性質を有する限りにおいて、包含される。本明細書において記載するNT-proBNPの性質は免疫学的及び／又は生物学的性質である。好ましくは、上記NT-proBNP変異体は、NT-proBNPの免疫学的性質と同等の免疫学的性質（すなわちエピトープ組成）を有する。従って、上記変異体は上に記載した特定のヒトNT-proBNP配列の量の測定に用いられる上記の手段又はリガンドにより認識可能である必要がある。NT-proBNPの免疫学的及び／又は生物学的性質は、Karl et al.（Karl 1999. Development of a novel, N-Terminal-proBNP (NT-proBNP) assay with a low detection limit. Scand J Clin Invest 59:177-181）、Yeo et al（Yeo 2003. Multicenter evaluation of the Roche NT-proBNP assay and comparison to the Biosite Triage assay. Clinica Chimica Acta 338:107-115）に記載されているアッセイにより検出することができる。変異体には、翻訳後修飾されたNT-proBNP、例えばグリコシル化、ミリスチル化、リン酸化変異体も含まれる。
「心筋トロポニン」という用語は、心臓の細胞、好ましくは心内膜下の細胞で発現されるすべてのトロポニンアイソフォームを意味する。これらのアイソフォームは、例えば、Anderson 1995, Circulation Research, vol. 76, no. 4: 681-686 及び Ferrieres 1998, Clinical Chemistry, 44: 487-493に記載されるように、当技術分野で十分に特性決定されている。好ましくは、心筋トロポニンは、トロポニンT及び／又はトロポニンI、最も好ましくはトロポニンTを意味する。トロポニンのアイソフォームは、一緒に（すなわち同時に若しくは逐次的に）、又は個別に（すなわち他のアイソフォームをまったく測定せずに）、本発明の方法で測定可能であることが理解されるだろう。ヒトトロポニンT及びヒトトロポニンIのアミノ酸配列は、Anderson, 前掲及び Ferrieres 1998, Clinical Chemistry, 44: 487-493に開示されている。
「心筋トロポニン」という用語はまた、上述の特定のトロポニンの変異体、すなわち、好ましくはトロポニンI、より好ましくはトロポニンTの変異体を包含する。そのような変異体は、特定の心筋トロポニンと少なくとも同一の本質的な生物学的性質及び免疫学的性質を有する。具体的には、上記変異体が、本明細書において記載する同一の特定のアッセイにより、例えば、該心筋トロポニンを特異的に認識するポリクロナール抗体又はモノクローナル抗体を用いたELISAにより、検出可能な場合には、それらは、同一の本質的な生物学的性質及び免疫学的性質を有する。さらに、本発明に関して記載する変異体は、少なくとも1つのアミノ酸の置換、欠失、及び／又は付加に起因して異なるアミノ酸配列を有し、この場合、変異体のアミノ酸配列は、依然として、好ましくは、特定のトロポニンのアミノ酸配列と少なくとも50％、60％、70％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、又は99％の同一性を有することが理解されるだろう。変異体は、アレル変異体、又は任意の他の生物種特異的なホモログ、パラログ若しくはオルソログであってよい。さらに、本明細書において記載する変異体としては、特定の心筋トロポニン又は上述のタイプの変異体の断片が、上に記載した本質的な免疫学的性質及び生物学的性質を有するものである限り、含まれる。そのような断片は、例えば、トロポニンの分解産物でありうる。さらには、リン酸化又はミリスチル化のような翻訳後修飾に起因して異なる変異体が挙げられる。
本発明において、特に好ましいトロポニンTアッセイは、Elecsys(登録商標)2010アナライザ（Roche Diagnostics）であり、この検出限界は0.001ng/ml〜0.0015ng/mlである。
本発明において、変異体はまた、サンプルの採取後に修飾された、例えば、標識（特に放射性又は蛍光標識）とペプチドとの共有結合又は非共有結合により修飾されたペプチド又はポリペプチドである。
「サンプル」という用語は、体液のサンプル、分離された細胞のサンプル、又は組織若しくは器官に由来するサンプルを意味する。体液のサンプルは、周知の技術により取得可能であり、好ましくは、血液、血漿、血清、又は尿のサンプルが挙げられる。組織又は器官サンプルは、例えば生検によって、任意の組織又は器官から得ることができる。分離細胞は、遠心又はセルソーティング等の分離技術によって、体液又は組織若しくは器官から得ることができる。
本明細書において用いられる「比較」は、分析対象のサンプルに含まれる、Dダイマー、ナトリウム利尿ペプチド（特にNT-proBNP）及び心筋トロポニン（好ましくはトロポニンT若しくはトロポニンI）、又は本明細書に記載の任意の他のポリペプチドの量と、本明細書において以下に規定される好適な参照源の量との比較を包含する。本明細書で用いられる比較は、対応するパラメータ又は値の比較を意味する。例えば、絶対量は絶対参照量と比較され、濃度は参照濃度と比較され、又は被験サンプルから得られた強度シグナルは、参照サンプルの同一タイプの強度シグナルと比較される。本発明の方法のステップ（d）で参照される比較は、手動で実施してもよいし又はコンピュータにより支援してもよい。コンピュータにより支援される比較では、測定量の値をデータベース中に格納された好適な参照に対応する値とコンピュータプログラムにより比較することが可能である。このコンピュータプログラムは、比較の結果をさらに評価することができる。すなわち、本明細書に記載の疾患の鑑別診断を、好適な出力形式で自動的に提供することができる。
本明細書において用いられる「参照量」という用語は、上記の比較により、被験体がPEに罹患しているか否かの評価を可能とする量を指す。従って、この参照は、PEに罹患していることがわかっている被験体に由来するものであってよい。PEに罹患している被験体から得られた参照を使用する場合、試験被験体のサンプルにおける上記の参照量と実質的に同一のNT-proBNP量は、PEを示すであろうと理解される。同様に、PEに罹患していないことがわかっている被験体から得られた参照を使用する場合は、試験被験体のサンプルにおける上記の参照量と実質的に同一のNT-proBNP量は、PEが発症していないことを示すであろう。個々の被験体に適用し得る参照量は、様々な生理的パラメーター、例えば年齢、性別、又は亜集団に応じて異なる。従って、好適な参照量は、試験サンプルと共に（すなわち同時に又は順次的に）分析しようとする参照サンプルから本発明の方法により決定することができる。
フィブリン-フィブリノーゲン分解産物のレベルは、種々のイムノアッセイ技法を用いて測定することができる。フィブリン-フィブリノーゲン分解産物を測定するために一般的に使用されている方法は、プラスミン由来のフィブリン-フィブリノーゲンフラグメントX、Y、D及びEについての新抗原性決定基に対するモノクローナル抗体を被覆したラテックス粒子を用いた技法である。
疾患が疑われる患者におけるPEの有病率は低い。肺血管造影はPEの診断のための確定基準標準であるが、この方法は侵襲的であり、費用がかかり、解釈が難しいこともある。Dダイマーは、定量的ELISA又はELISAに基づく方法によりアッセイした場合に、カットオフ値500μg/Lで急性PEにおいて高感度（＞ 99％）であることがわかっている。従って、この値以下のDダイマーレベルはPEを除外する。一方、Dダイマーの特異度は低い。Dダイマーは多様な臨床症候（例えば癌、炎症、感染症、敗血症、壊死）において凝血及び線維素溶解の血管内活性化の存在下で産生されるため、500μg/Lを超えるDダイマーレベルはPEについての陽性予測値として良好ではなく、この疾患を確定（rule in）することはできない。従って、PEを確定する診断アルゴリズムとしては、肺血管造影、スパイラルコンピュータ断層撮影、下肢静脈圧迫超音波検査、肺血流及び換気シンチグラフィが含まれる。PEのリスク層化のため、心エコー検査により、右室負荷及び機能不全を評価することが可能となる。血行動態として有意なPEの心エコー知見としては、拡張型運動低下性右室、拡張型近位肺動脈、流速の障害、及び他の血行動態異常がある。一方、血行動態において重要なPEは、正常な心エコー図を有する患者では起こる可能性がない（Wolfe MW, Feldstein MI, Parker JA et al.: Prognostic significance of right ventricular hypokinesis and perfusion lung scan defects in PE）。
しかし、心エコー検査はいくつかの技術的制約があり、常に容易に利用可能なものではない。これは右室損傷及び機能不全の重度の定量的評価に用いることはできない。さらに心エコー検査は、時間がかかり、解釈が難しい。従って、PEの診断及びリスク層化のために非侵襲性で迅速な診断手法が必要とされている。
本発明に係る方法は、少なくとも3つのマーカーの測定を含み、凝血及び線維素溶解の血管内活性化の少なくとも1つのマーカーと、心虚血及び壊死の少なくとも1つのマーカーと、心室機能障害の少なくとも1つのマーカーを測定する。凝血及び線維素溶解の血管内活性化のマーカーは、例えばフィブリン-フィブリノーゲン分解産物、特にDダイマーから選択することができる。虚血及び壊死マーカーとしてトロポニンT又はトロポニンIを測定することができる。心室機能障害のマーカーは、神経ホルモンマーカー、例えば心房性ナトリウム利尿ペプチド（ANP）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（BNP）、又は各プロペプチドのN末端断片であるNT-proANP及びNT-proBNPから選択することができる。
個体が病態生理学的状態を患っているか又は健常個体であるかを示す本発明のマーカー（フィブリン-フィブリノーゲン分解産物、特にDダイマー、ナトリウム利尿ペプチド、特にNT-proBNP、及び心筋トロポニン、特にトロポニンT又はトロポニンI）の量／レベルは、当業者に公知の方法により決定される。
一般的に、個体が病態生理学的状態を患っているか又は健常個体であるかを示す量／レベル（「閾値」、「参照量」）を決定するために、それぞれのペプチド又は複数のペプチドの量／レベルは、有効な分析方法を用いて各マーカーにより決定しようとする病態生理学的状態を患う個体及び健常個体を含む適当な患者群において測定する。結果を回収し、当技術分野で公知の統計学的方法により分析する。続いて、得られる閾値は、特定の閾値と関連がある疾患に罹患する所望の確率に従って確定する。例えば、閾値を確定するために、健常及び／又は非健常患者の集合の中央値、60、70、80、90、95又はさらには99パーセンタイルを選択するために有用である。
個体が健常であるか又は特定の病態生理学的状態を患っているかの診断は、当業者に公知の確立された方法により行う。この方法は個々の病態生理学的状態に関して異なる。
例えば、PEを確定するための診断アルゴリズム（既に上で述べたとおり）には、肺血管造影、スパイラルコンピュータ断層撮影、下肢静脈圧迫超音波検査、肺血流及び換気シンチグラフィ、並びに右室負荷及び機能不全と血行動態異常を評価することができる心エコー検査が含まれる。心エコー検査は、種々の心臓機能障害、例えば心不全、心筋梗塞及び／又は心筋症を評価するために用いられる。
従って、本発明はまた、個体がPEに罹患しているかどうかを示す及び／又は該疾患の重度（クラス）を示す閾値レベルを決定する方法であって、適当な患者群において、適当なマーカー、一般的にはフィブリン-フィブリノーゲン分解産物、特にDダイマー、ナトリウム利尿ペプチド、特にNT-proBNP、及び心筋トロポニン、特にトロポニンT又はトロポニンIのレベルを測定するステップ、データを回収し、統計学的方法によりデータを分析するステップ、並びに閾値を確立するステップを含む方法を含む。
閾値よりも多い量のフィブリン-フィブリノーゲン分解産物（特にDダイマー）と、それと組み合わせた閾値よりも多い量の心筋トロポニン（好ましくはトロポニンT又はトロポニンI）と、それと組み合わせた閾値（すなわち参照量）よりも多い量のナトリウム利尿ペプチド（好ましくはNT-proBNP）は、PEの重度の指標となることがわかった。Dダイマーに関して好ましい閾値は、0.5 mg/Lである。心筋トロポニン、特に心筋トロポニンTに関して好ましい閾値は、0.03 ng/mLである。ナトリウム利尿ペプチド、特にNT-proBNPに関して好ましい閾値は、500 pg/mLである。従って、上で記載した量に等しい又はそれより多い量の上記ペプチドを示す被験体は、PEに罹患している。上述した量は統計学及び測定の誤差により変動しうることが理解されよう。
本発明の一実施形態では、Dダイマーの量を測定し、このステップの結果に従って、ナトリウム利尿ペプチド及び心筋トロポニンの量を測定する必要がないことが明らかとなるだろう。これは、被験体がPEに罹患していることを除外する低量のDダイマーが測定された場合である。PEを除外する各量は、上に記載した閾値を下回る値、すなわち500μg/L以下であり、500μg/Lよりも好ましくは10％、より好ましくは20％、よりさらに好ましくは30、特に50％低い。
本発明によって、専門的又は侵襲的な診断検査（血管造影、心エコー検査など）を用いることなく、PEに罹患している個体の信頼性がありかつ簡便な診断を確立し、PEであると確認された患者のリスクを評価することが可能となる。
本発明の別の好ましい実施形態において、PEの重度を確立することも可能である。疾患の重度に従って、PEを以下のリスク群／重度クラスに分類する：
リスク群I：症候性の非重篤PE、右室機能不全なしの血行動態安定（収縮期血圧 ＞ 100 mmHg）
リスク群II：低重篤（submassive）PE、右室機能不全ありの血行動態安定
リスク群III：重篤PE、ショック及び低血圧（収縮期血圧 ＜ 100 mmHg）、心拍数 ＞ 100/分
リスク群IV：蘇生が必要
（文献：Interdisziplinare S2-Leitlinie: Diagnostik und Therapie der Bein- und Beckenvenen- Thrombose und der Lungenembolie. Phlebologie 2005; 34: 47-64を参照）。
本出願において、「リスク群」及び「重度クラス」という用語は、これらの用語がPEの重度及びそれに関連するリスクを意味するものとして、互換的に用いられる。
以下のDダイマー、トロポニンT及びNT-proBNPの参照量が、それぞれのリスク群に特徴的であることがわかっている。PEが確認された患者は、以下のアルゴリズムに従ってそれぞれの群に割り当てられる：
1）ある群の基準を3つのパラメータが満たす場合には、患者はその群に割り当てられる
（例：Dダイマー：800μg/L；トロポニンT：0.01 ng/ml；NT-proBNP：300 pg/ml）。
2）ある群の基準を3つのうち2つのパラメータが満たす場合には、患者はその群に割り当てられる
（例1：Dダイマー：2500μg/L；トロポニンT：0.08 ng/ml；NT-proBNP：3000 pg/ml、リスク群IIに割り当てられる）
（例2：Dダイマー：2500μg/L；トロポニンT：0.4 ng/ml；NT-proBNP：3000 pg/ml、リスク群IIIに割り当てられる）
3）3つの異なる群の基準を3つ全てのパラメータが満たす場合には、患者は最も高い値のパラメータを有する群に割り当てられる
（例1：Dダイマー：700μg/L；トロポニンT：0.2 ng/ml；NT-proBNP：6000 pg/ml、リスク群IVに割り当てられる）
（例2：Dダイマー：17000μg/L；トロポニンT：0.02 ng/ml；NT-proBNP：3000 pg/ml、リスク群IVに割り当てられる）。
リスク群I：
Dダイマー：500〜＜2000μg/L
トロポニンT：＜ 0.03 ng/ml
NT-proBNP：＜ 500 pg/ml
リスク群II：
Dダイマー：2000〜＜6000μg/L
トロポニンT：≧0.03 ng/ml
NT-proBNP：≧500 pg/ml
リスク群III：
Dダイマー：6000〜12000μg/L
トロポニンT：＞ 0.1 ng/ml
NT-proBNP：≧500 pg/ml
リスク群IV：
Dダイマー： ＞ 12000μg/L
トロポニンT：＞ 0.1 ng/ml
NT-proBNP：＞ 5000 pg/ml
従って、本発明のこの変形において、本発明の方法は、異なるリスク群／異なる重度クラスに個体を分類する方法であって、PEを診断する方法のようなステップ（a）、（b）、（c）及び（d）を含み、ステップ（d）は（診断を確立する代わりに）個体を分類するステップを含む。この方法はまた、PEの重度の診断とも称することができる。
従って、本発明は、異なるリスク群のPEに罹患している個体を分類する方法であって、該個体が好ましくはDダイマーのレベル（量）500μg/L以上を示すものであり、以下のステップ：
（bi）被験体のサンプルにおけるナトリウム利尿ペプチドの量を測定するステップ、
（ci）被験体のサンプルにおける心筋トロポニンの量を測定するステップ、
（di）ステップ（bi）〜（di）における測定量と参照量とを比較し、個体を分類するステップ
を含む方法を含む。
上述した量は、統計学及び測定の誤差、並びに症候発症の経過時間によって異なることが理解されるだろう（クリアランス機構により測定される濃度の生物学的時間経過）。
有利なことには、被験体のサンプル中に存在する上記ペプチドの量は、この症候の原因に関する鑑別診断を可能とし、すなわち、PEの重度がクラスI、II、III又はIVに属するかを診断することができることが見出されている。本発明によって、被験体、特に救急患者をより容易に且つ確実に診断し、その後、上記鑑別診断の結果に従って治療することができる。
本明細書における上記のそして以下の用語の説明及び定義は、本明細書及び特許請求の範囲において特徴付けられる全ての実施形態について適用される。
本発明の範囲内にあるポリペプチドの量は、同時に又は順次的に、好ましくは同時に、測定することができる。
本明細書において用いられる「同時に」の下では、全てのマーカーの量が本質的に同時に又は正確に同時に測定されるものであると理解される。全てのマーカーは同じサンプルについて測定することができる。あるいは、これらを異なるサンプル中で測定することができる。しかし、上記の異なるサンプルは、同一の被験体から同時に取得されたものであるべきである。
別の実施形態において、本発明はまた、PEに罹患している被験体の治療について決定する方法であって、以下のステップ：
（a）被験体のサンプルにおけるフィブリン-フィブリノーゲン分解産物、特にDダイマーの量を測定するステップ、
（b）被験体のサンプルにおけるナトリウム利尿ペプチドの量を測定するステップ、
（c）被験体のサンプルにおける心筋トロポニンの量を測定するステップ;
（d）ステップ（a）〜（c）における測定量と参照量とを比較するステップであって、それにより、前記決定を確立する上記ステップ
を含む方法を包含する。
ステップ（d）において行う決定は、好ましくは測定したペプチドの値に従って個体を種々の重度クラスに分類した後に確立する。
本発明において治療には、好ましくは、PEの重度に従って以下の治療手段が含まれる：
リスク群I：ヘパリンを用いた抗凝血、血栓溶解、特にウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ及び組換え組織プラスミノーゲン活性化因子（rTPA）を用いた血栓溶解
リスク群II：禁忌が存在しな場合には、ヘパリンを用いた抗凝血、血栓溶解、特にウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ及び組換え組織プラスミノーゲン活性化因子（rTPA）を用いた血栓溶解
リスク群III：ヘパリンを用いた抗凝血、血栓溶解、特にウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ及び組換え組織プラスミノーゲン活性化因子（rTPA）を用いた血栓溶解
リスク群IV：ヘパリンを用いた抗凝血、血栓溶解、特にウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ及び組換え組織プラスミノーゲン活性化因子（rTPA）を用いた血栓溶解、又は塞栓除去
従って、「線維素溶解」は、好ましくはウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ及び組換え組織プラスミノーゲン活性化因子（rTPA）、並びに同じ生理学的機能を有するそれらの変異体を含むものが使用される。本発明において、ヘパリンは、非分画ヘパリン（UFH）、低分子量ヘパリン（LMWH）、ヘパリノイド、及びそれらの変異体を含む。
本発明のこの変形の一実施形態において、Dダイマーの量を測定し、このステップの結果に従って、ナトリウム利尿ペプチド及び心筋トロポニンの量を測定する必要がないことが明らかとなる。これは、カットオフ値500μg/L以下のDダイマーの量が測定された場合に、被験体がPEに罹患しており、そのため心臓治療の必要がないことを除外する場合である。PEを除外するそれぞれの量は、上で記載した閾値を下回る値、すなわち500μg/L以下である。
さらなる実施形態において、本発明はまた、PEに罹患している被験体の治療をモニターする方法であって、上に記載したように治療について決定する方法のステップと、
（e）先行する決定方法において測定したペプチドの量を再度測定する付加的ステップ
を含む方法を包含する。
この方法は、測定した値に応じた治療の適応を含む。例えば、クラスI〜IVの1つのPE重度を有する被験体を、上で説明したようにそれぞれの治療の適応など、異なるクラスへ細分類することができる。
本発明はまた、
（a）Dダイマーの量を測定する手段、
（b）ナトリウム利尿ペプチド、特にNT-proBNPの量を測定する手段、及び
（c）心筋トロポニンの量を測定する手段
を備える、本発明の方法の実施に適したデバイスにも関する。
本明細書で用いられる「デバイス」という用語は、予測が可能となるように互いに動作可能なように連結された少なくとも上述の手段を含む手段のシステムを意味する。前記ポリペプチドの量を測定する好ましい手段、及び参照量との比較を実施する好ましい手段は、本発明の方法と関連して上述している。手段を動作可能に連結する方法は、デバイスに組み込まれる手段の種類に応じて異なる。例えば、ペプチドの量を自動的に測定する手段を適用する場合、本明細書において記載する疾患を診断又は区別するために、該自動作動手段により得られたデータを例えばコンピュータプログラムにより処理することが可能である。好ましくは、そのような場合、手段は、単一のデバイス内に含まれる。従って、該デバイスは、サンプル中のペプチドの量を測定するための分析ユニット、及び鑑別診断のために得られたデータを処理するためのコンピュータユニットを備えることができる。他の選択肢として、ペプチドの量を測定するために検査ストリップのような手段を使用する場合、診断のための手段は、以下に付随することが知られている量に測定量を割り当てる対照ストリップ又は対照表を含んでもよい：（i）急性肺塞栓症又は慢性肺塞栓症、及び（ii）単一性肺塞栓症又は多発性肺塞栓症。検査ストリップは、好ましくは、ナトリウム利尿ペプチド又は肺サーファクタントプロテインに特異的に結合するリガンドと結合されている。ストリップ又はデバイスは、好ましくは、該リガンドへの該ペプチドの結合を検出する手段を含む。検出のための好ましい手段については、本発明の方法に関する実施形態に関連して上に開示されている。そのような場合、マニュアルに定められる指示及び解釈に基づいてシステムの利用者がその量の測定結果とその診断値とを結びつけるという意味で、手段は動作可能に連結されている。手段は、そのような実施形態では、別個のデバイスとして存在してもよいが、好ましくは、キットとして一緒にパッケージングされる。当業者は、さらなる苦労なく手段を連結する方法を理解している。好ましいデバイスは、専門臨床医の特別な知識がなくても適用可能なものであり、例えば、単にサンプルを充填すればよい検査ストリップ又は電子デバイスである。その結果は、好ましくは、絶対量又は相対量として、パラメトリック診断用生データの出力として与えられうる。これらのデータは、臨床医の解釈を要するであろうと理解される。しかし、当該出力が、その解釈に専門の臨床医を要しない加工済の診断用生データを包含するような、専門のシステムデバイスも意図される。さらなる好ましいデバイスは、分析ユニット／デバイス（例えば、バイオセンサー、アレイ、ポリペプチドを特異的に認識するリガンドに結合された固体支持体、表面プラズモン共鳴デバイス、NMR分光計、質量分析計など）、又は本発明の方法に従って上で記載した評価ユニット／デバイスを備える。
「実施に適した」の下では、上記デバイスは、上記の方法を自動的に実施することができると理解されるだろう。このような適合のため、デバイスは、ポリペプチドの測定量と、該デバイスにより参照サンプルから測定し得るか又は保存値として実質的に存在し得る参照量と、の比較を行うための実装ルールを含むことが考えられる。さらに、デバイスは、少なくとも2種類の異なるサンプル間（すなわち、第1時点のサンプルと第2時点のサンプル）のポリペプチドの量の有意な減少を測定するための実装ルールを含み得る。デバイスにおけるこのようなルールの実装は、好ましくは、コンピュータ、すなわちデータ処理ユニット上で実行される保存可能なプログラムコードの形式で提供されるアルゴリズムを伴う。
最後に、本発明は、
（a）フィブリン-フィブリノーゲン分解産物、特にDダイマーの量を測定する手段、
（b）ナトリウム利尿ペプチド、特にNT-proBNPの量を測定する手段、及び
（c）心筋トロポニンの量を測定する手段、
（d）上記方法を実施するための説明書
を含む、本発明の方法を実施するためのキットに関する。
本明細書において用いられる「キット」という用語は、前述の手段の集合を指し、別々に又は単一容器内で提供されることが好ましい。また好ましくは、容器は本発明の方法を実施するための説明書も含む。このように、本発明は、各ポリペプチドを測定するための手段又は作用剤を含むキットに関する。このような手段又は作用剤は、当業者に公知の任意の好適な手段又は作用剤であってよい。このような手段又は作用剤並びにそれらの使用方法の例は、本明細書に提供されている。例えば、好適な作用剤は、上記のポリペプチドに特異的に結合することができる任意の種類のリガンド又は抗体であってよい。このキットは、各バイオマーカーの量の測定に関して適切と考えられる任意の他の構成成分、例えば、好適なバッファー、フィルター等を含んでもよい。好ましくは、キットは、説明書（例えば、本発明の方法により提供される任意の測定の結果を、診断に関して解釈するためのユーザー用マニュアル）を追加的に含み得る。特に、このようなマニュアルには、測定したポリペプチド量を診断の種類、すなわち、単一性肺塞栓症若しくは多発性肺塞栓症、又は急性肺塞栓症若しくは慢性肺塞栓症、に割り当てるための情報を含めることができる。詳細は、本明細書の他の箇所に見出される。さらに、このようなユーザー用マニュアルは、各バイオマーカーの量を測定するための、キットの構成成分の正しい使用に関する説明を提供することができる。ユーザー用マニュアルは、紙形式又は電子形式（例えば、CD若しくはCD ROMに保存して）で提供し得る。本発明はまた、本発明に係る方法のいずれかにおける上記キットの使用にも関する。
本明細書中で引用された参考文献はすべて、それらの全開示内容に関して参照により本明細書に援用されるものとし、かつ該開示内容は本明細書中に具体的に述べられているものとする。
以下の実施例は、本発明を説明するものにすぎず、本発明の範囲を限定するものであると解釈されるべきではない。本試験では、各ポリペプチドの量を血液サンプル中で測定する。NT-proBNP及びトロポニンTの測定に関しては、ElecsysTM試験（Roche Diagnostics, Germany）を用いた。Dダイマーレベルは、STA LIATEST D-Di（STAGO, France）及びTina-quant (a) Dダイマー（Roche Diagnostics, Germany）を用いてクエン酸血漿サンプル中で測定した。
［実施例１］PEが確認された患者におけるマルチマーカー手法
PEが疑われる合計12人の患者を本研究に含める。
患者は、カットオフ値500μg/Lを超えるDダイマー濃度の上昇を示した。PEの診断は肺血管造影により確認した。Dダイマー、ナトリウム利尿ペプチドNT-proANP及びNT-proBNP、並びにトロポニンT及び高感度トロポニンTをリスク層化のために測定した。結果を表１に示す。患者は、Dダイマー、トロポニンT及びNT-proBNPの濃度に従って、これらの3つの値のうち2つが以下の基準を満たすかどうかでリスク群I〜IVに分類した。
リスク群Iの患者：
Dダイマー：500〜＜2000μg/L
トロポニンT：＜ 0.03 ng/ml
NT-proBNP：＜ 500 pg/ml

リスク群IIの患者：
Dダイマー：2000〜＜6000μg/L
トロポニンT：≧0.03 ng/ml
NT-proBNP：≧500 pg/ml

リスク群IIIの患者：
Dダイマー：6000〜12000μg/L
トロポニンT：＞ 0.1 ng/ml
NT-proBNP：≧500 pg/ml

リスク群IVの患者：
Dダイマー：＞ 12000μg/L
トロポニンT：＞ 1.0 ng/ml
NT-proBNP：＞ 5000 pg/ml。
Figure 2011530705
［実施例２］様々な程度のPEに罹患している患者における治療決定
上述のように診断した患者を以下の通り治療する：
群I：ヘパリンを用いた抗凝固療法
群II：ヘパリンを用いた抗凝固療法、又は禁忌がない場合には血栓溶解
群III：血栓溶解（ウロキナーゼ又はストレプトキナーゼ）
群IV：血栓溶解（アクチリーゼ）又は塞栓除去。
［実施例３］
呼吸困難を患うPEの臨床兆候を有する52歳男性が10日間入院した。患者は5年前に術後DVTの病歴があるが、血栓性素因の兆候はない。PEの診断は肺血管造影により確認した。以下のマーカーレベルが測定された：
Dダイマー：2130μg/L
トロポニンT：0.08 ng/ml
NT-proBNP：465 pg/ml
分類
リスク群I 結果
Dダイマー 500〜＜2000μg/L
トロポニンT ＜ 0.03 ng/ml
NT-proBNP ＜ 500 pg/ml NT-proBNP：465 pg/ml
リスク群II
Dダイマー 2000〜＜6000μg/L Dダイマー：2130μg/L
トロポニンT ≧0.03 ng/ml トロポニンT：0.08 ng/ml
NT-proBNP ≧500 pg/ml
リスク群III
Dダイマー 6000〜12000μg/L
トロポニンT ＞ 0.1 ng/ml
NT-proBNP ≧500 pg/ml
リスク群IV
Dダイマー ＞12000μg/L
トロポニンT ＞ 1.0 ng/ml
NT-proBNP ＞ 5000 pg/ml
患者をリスク群IIに割り当て、ヘパリンを用いて処置したところ、出血性合併症はなかった。8日後に患者は退院した。
［実施例４］
75歳の女性が胸痛及び安静時の呼吸困難で救急科に入院した。患者に肺疾患又はPEの病歴はなかった。ECGは急性冠症候群の兆候を示さなかった。PEの診断は入院直後に実施した肺血管造影及びスパイラルCTにより確認した。以下のマーカーレベルが測定された：
Dダイマー：3200μg/L
トロポニンT：0.04 ng/ml
NT-proBNP：11550 pg/ml
分類
リスク群I 結果
Dダイマー 500〜＜2000μg/L
トロポニンT ＜ 0.03 ng/ml
NT-proBNP ＜ 500 pg/ml
リスク群II
Dダイマー 2000〜＜6000μg/L Dダイマー：3200μg/L
トロポニンT ＞ 0.03 ng/ml トロポニンT：0.04 ng/ml
NT-proBNP ≧500 pg/ml
リスク群III
Dダイマー 6000〜12000μg/L
トロポニンT ＞ 0.1 ng/ml
NT-proBNP ≧500 pg/ml
リスク群IV
Dダイマー ＞12000μg/L
トロポニンT ＞ 1.0 ng/ml
NT-proBNP ＞ 5000 pg/ml NT-proBNP：11550 pg/ml
患者をリスク群IIに割り当て、ヘパリンを用いて処置した。
［実施例５］
呼吸困難を患いPEの臨床兆候が疑わしい37歳の男性が関節鏡検査の10日後に入院した。PEの診断は肺血管造影により確認した。以下のマーカーレベルが測定された：
Dダイマー：2130μg/L
トロポニンT：0.23 ng/ml
NT-proBNP：465 pg/ml
分類
リスク群I 結果
Dダイマー 500〜＜2000μg/L
トロポニンT ＜ 0.03 ng/ml
NT-proBNP ＜ 500 pg/ml NT-proBNP：465 pg/ml
リスク群II
Dダイマー 2000〜＜6000μg/L Dダイマー：2130μg/L
トロポニンT ≧0.03 ng/ml
NT-proBNP ≧500 pg/ml
リスク群III
Dダイマー 6000〜12000μg/L
トロポニンT ＞ 0.1 ng/ml トロポニンT：0.23 ng/ml
NT-proBNP ≧500 pg/ml
リスク群IV
Dダイマー ＞12000μg/L
トロポニンT ＞ 1.0 ng/ml
NT-proBNP ＞ 5000 pg/ml
患者をリスク群IIに割り当て、集中治療室に入院させ、ヘパリンを用いて処置したところ、出血性合併症はなかった。4日後に患者は集中治療室から退院した。
［実施例６］
80歳男性が前立腺手術後にPEの疑わしい臨床兆候を発症した。PEの診断は肺血管造影により確認した。以下のマーカーレベルが測定された：
Dダイマー：2130μg/L
トロポニンT：0.018 ng/ml
NT-proBNP：3719 pg/ml
分類
リスク群I 結果
Dダイマー 500〜＜2000μg/L Dダイマー：1100μg/L
トロポニンT ＜ 0.03 ng/ml トロポニンT：0.018 ng/ml
NT-proBNP ＜ 500 pg/ml
リスク群II
Dダイマー 2000〜＜6000μg/L
トロポニンT ≧0.03 ng/ml
NT-proBNP ≧500 pg/ml
リスク群III
Dダイマー 6000〜12000μg/L
トロポニンT ＞ 0.1 ng/ml
NT-proBNP ≧500 pg/ml NT-proBNP：3719 pg/ml
リスク群IV
Dダイマー ＞12000μg/L
トロポニンT ＞ 1.0 ng/ml
NT-proBNP ＞ 5000 pg/ml
患者をリスク群Iに割り当て、集中治療室に入院させ、ヘパリンを用いて処置したところ、出血性合併症はなかった。2日後に患者は集中治療室から退院した。
［実施例７］
55歳女性が救急科を受診した。患者は意識を失っており、危篤状態であった（収縮期血圧 85 mmHg、心拍数 142 bpm）。PEの診断は肺血管造影により確認した。以下のマーカーレベルが測定された：
Dダイマー：8109μg/L
トロポニンT：1.86 ng/ml
NT-proBNP：11779 pg/ml
分類
リスク群I 結果
Dダイマー 500〜＜2000μg/L
トロポニンT ＜ 0.03 ng/ml
NT-proBNP ＜ 500 pg/ml
リスク群II
Dダイマー 2000〜＜6000μg/L
トロポニンT ≧0.03 ng/ml
NT-proBNP ≧500 pg/ml
リスク群III
Dダイマー 6000〜12000μg/L Dダイマー：8109μg/L
トロポニンT ＞ 0.1 ng/ml
NT-proBNP ≧500 pg/ml
リスク群IV
Dダイマー ＞12000μg/L
トロポニンT ＞ 1.0 ng/ml トロポニンT：1.86 ng/ml
NT-proBNP ＞ 5000 pg/ml NT-proBNP：11779 pg/ml
患者をリスク群IVに割り当て、集中治療室に入院させた。ウロキナーゼを用いた血栓溶解を行ったが、患者は入院の翌日に死亡した。

Claims (13)

  1. 被験体における急性肺塞栓症（PE）を診断する方法であって、以下のステップ：
    （a）被験体のサンプルにおけるフィブリン-フィブリノーゲン分解産物、特にDダイマーの量を測定するステップ、
    （b）被験体のサンプルにおけるナトリウム利尿ペプチドの量を測定するステップ、
    （c）被験体のサンプルにおける心筋トロポニンの量を測定するステップ、
    （d）ステップ（a）〜（c）における測定量と参照量とを比較するステップであって、それにより前記診断を確立する上記ステップ
    を含む方法。
  2. 参照量が、Dダイマー 500μg/L、トロポニンT 0.03 ng/ml、NT-proBNP 125 pg/mlである、請求項１に記載の方法。
  3. 異なるリスク群のPEに罹患している個体を分類する方法であって、該個体が好ましくはDダイマーの量500μg/L以上を示すものであり、以下のステップ：
    （bi）被験体のサンプルにおけるナトリウム利尿ペプチドの量を測定するステップ、
    （ci）被験体のサンプルにおける心筋トロポニンの量を測定するステップ、
    （di）ステップ（bi）〜（di）における測定量と参照量とを比較し、個体を分類するステップ
    を含む方法。
  4. 以下のペプチド量がPEのそれぞれの重度の指標となる、請求項３に記載の方法。
    リスク群I：
    Dダイマー 500〜＜2000μg/L、トロポニンT ＜ 0.03 ng/ml、NT-proBNP ＜ 500 pg/ml
    リスク群II：
    Dダイマー 2000〜＜6000μg/L、トロポニンT ≧0.03 ng/ml、NT-proBNP ≧500 pg/ml
    リスク群III：
    Dダイマー 6000〜12000μg/L、トロポニンT ＞ 0.1 ng/ml、NT-proBNP ≧500 pg/ml
    リスク群IV：
    Dダイマー ＞ 12000μg/L、トロポニンT ＞ 1.0 ng/ml、NT-proBNP ＞ 5000 pg/ml
  5. サンプルが血液、血清又は血漿である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 被験体がヒトである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
  7. ナトリウム利尿ペプチドがNT-proBNPである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 心筋トロポニンがトロポニンT又はトロポニンIである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
  9. PEに罹患している被験体の治療について決定する方法であって、以下のステップ：
    （a）被験体のサンプルにおけるフィブリン-フィブリノーゲン分解産物、特にDダイマーの量を測定するステップ、
    場合によりステップ（a）の結果に応じて、
    （b）被験体のサンプルにおけるナトリウム利尿ペプチドの量を測定するステップ、
    （c）被験体のサンプルにおける心筋トロポニンの量を測定するステップ、
    （d）ステップ（a）〜（c）における測定量と参照量とを比較するステップであって、それにより、好ましくは測定したペプチドの値に従って異なるリスク群に個体を分類した後に、前記決定を確立する上記ステップ
    を含む方法。
  10. 治療が、ヘパリン、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、組換え組織プラスミノーゲン活性化因子を用いた薬物療法、及び／又は塞栓除去を含む、請求項９に記載の方法。
  11. PEに罹患している被験体の治療をモニターする方法であって、請求項９〜１０のいずれか１項に記載の方法のステップと、（e）前記ペプチドの量を再度測定する付加的ステップとを含む方法。
  12. 本発明の方法の実施に適したデバイスであって、
    （a）フィブリン-フィブリノーゲン分解産物、特にDダイマーの量を測定する手段、
    （b）ナトリウム利尿ペプチド、特にNT-proBNPの量を測定する手段、及び
    （c）心筋トロポニンの量を測定する手段
    を備えるデバイス。
  13. 本発明の方法の実施に適したキットであって、
    （a）フィブリン-フィブリノーゲン分解産物、特にDダイマーの量を測定する手段、
    （b）ナトリウム利尿ペプチド、特にNT-proBNPの量を測定する手段、
    （c）心筋トロポニンの量を測定する手段、
    （d）上記方法を実施するための説明書
    を含むキット。
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