CN101517415B

CN101517415B - 根据gdf-15评价心脏介入风险的工具与方法

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Publication number: CN101517415B
Application number: CN200780028658.1A
Authority: CN
Inventors: K·C·沃勒特; T·坎普夫; L·沃伦廷; H·德雷克斯勒
Original assignee: Medizinische Hochschule Hannover
Current assignee: Medizinische Hochschule Hannover
Priority date: 2006-08-04
Filing date: 2007-08-02
Publication date: 2016-04-20
Anticipated expiration: 2027-08-02
Also published as: CN101517415A; ES2365176T3; EP1884777A1

Abstract

本发明涉及基于对需要心脏介入的受治疗者样品中GDF-15的测定从而鉴定对心脏介入敏感的受治疗者的方法。此外，本发明涉及基于对患有心血管并发症的受治疗者样品中GDF-15和利尿钠肽和/或心肌钙蛋白的测定从而预测所述受治疗者死亡或再发急性心血管事件风险的方法。本发明还包括用于实施上述方法的装置和工具箱。

Description

根据GDF-15评价心脏介入风险的工具与方法

本发明涉及基于对需要心脏介入的受治疗者样品中生长分化因子-15(GDF-15)的测定，从而鉴定对心脏介入敏感的受治疗者的方法。此外，本发明涉及基于对患有心血管并发症的受治疗者样品中的GDF-15和利尿钠肽(natriureticpeptide)和/或心肌钙蛋白(cardiacTroponin)的测定，从而预测所述受治疗者的死亡或急性心血管事件风险的方法。本发明还包括用于实施上述方法的装置和试剂盒。

现代医学的目的是提供个性化或个体化的治疗方案。这是考虑患者个人需求或风险的治疗方案。个性化或个体化治疗方案还应当考虑紧急措施。尤其是在急性心血管事件的情况下，常常要在短时间内确定某种治疗方案。在西半球，心血管并发症，特别是心脏病，是发病率和死亡率的主要原因。心血管并发症可长时间保持无症状状态。然而，急性心血管事件，例如作为心血管并发症病因的心肌梗死一旦发生，就可能带来严重后果。

心血管并发症的常规诊断技术包括心电描记法测量和超声心动描记法测量、症状分析和患者之前的病史(例如胸痛)和一些临床参数分析。近来，这些常规技术通过生物标记分析，特别是通过急诊患者血样中心肌钙蛋白的水平分析而被进一步加强。此外，利尿钠肽还被描述为诊断心血管并发症的合适的生物标记。最近，有研究提出GDF-15也是心血管并发症的标志(US2003/0232385；Kempf2006，CircRes98：351-360)。生长分化因子-15(GDF-15)是转化生长因子-β细胞因子超家族的一个成员。GDF-15最初被鉴定为巨噬细胞抑制性细胞因子-1(macrophage-inhibitorycytokine-1，MIC-1)，稍后还被命名为胎盘转化生长因子-β(Bootcov1997，ProcNatlAcadSci94：11514-11519；Tan2000，ProcNatlAcadSci97：109-114)。最近的研究表明，当经历模拟缺血和再灌注时，培养的心肌细胞通过一氧化氮和亚硝化应激依赖性信号转导途径表达和分泌GDF-15。此外，在心肌缺血和再灌注损伤的小鼠模型中，还观察到在冠状动脉结扎后的缺血区域GDF-15表达水平快速升高，并在再灌注的心肌中保持升高达数天(Kempf，出处同上)。

常规诊断技术，尤其对于急诊情况，常常不能提供可靠的诊断和/或风险评价。因此，基于所述诊断技术，无法以足够的精确性来确定个性化治疗方案。结果，许多患者将接受不适当或者可能具有毒副作用的治疗方案。在许多情况下，急性心血管事件一旦经上述提及的常规诊断技术和/或通过患者的肌钙蛋白水平确定后，目前都通过心脏介入进行治疗。这些心脏介入包括为了恢复例如冠状动脉血管内适当血流量而实施的不同类型的基于血管成形术的介入和/或冠状动脉分流术。然而，这些介入不总是成功的，甚至还可能对患者有害。另外，所述介入耗费时间且成本昂贵。至于对心力衰竭患者的介入，例如药物疗法(例如用血管紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素受体阻滞药、β-阻滞药或醛甾酮拮抗药治疗)和介入疗法(例如心脏再同步疗法(cardiacresynchronisationtherapy，CRT)或植入型心律转复除颤器(implantablecardioverter-defibrillator，ICD)法)，现有风险评价技术也产生同样的困难和不足。

因此，对于被认为需要某些治疗方案(例如心脏介入)的患者而言，需要可供个体风险分层(individualriskstratification)的诊断或预后方法。此外，还需要可靠的综合风险分层(generalriskstratification)，其中包括患有心血管并发症的患者、尤其是出现急性心血管事件或心力衰竭的患者的死亡或复发性不良心血管事件风险。

作为本发明基础的技术问题可被视为提供用于顺应上述需求的工具(means)和方法。

该技术问题通过所附权利要求书和下文中所表征的实施方案而得到解决。

因此，本发明涉及鉴定对心脏介入敏感的受治疗者的方法，该方法包括：

a)测定需要心脏介入的受治疗者样品中GDF-15的量；和

b)将步骤a)测定的GDF-15的量与参比量进行比较，从而鉴定出对心脏介入敏感的受治疗者。

优选本发明的方法为体外方法。此外，除了上述明确提及的步骤外，它还可包括其它步骤。例如，其它步骤可涉及样品预处理或对通过该方法得到的结果的评价。本发明的方法还可用于对需要心脏介入的受治疗者进行监测、确诊和细分。该方法可手工进行或辅以自动操作。优选步骤(a)和/或步骤(b)可以整个或部分辅以自动操作，例如，通过合适的自动化设备和传感设备在步骤(a)中进行测定，或者在步骤(b)中计算机执行的比较。

本文所用术语“鉴定”是指评价受治疗者是否对心脏介入敏感。正如本领域技术人员所了解的一样，这种评价通常不是对于所有(即100％)待鉴定的受治疗者都是正确的。然而，该术语要求，可以鉴定出有统计显著性的部分受治疗者(例如群组研究中的群组)。本领域技术人员可以应用各种众所周知的统计评价工具而无需再费周折，便可确定某一部分是否是有统计显著性，统计评价工具例如测定置信区间、P值测定、斯图登t检验(Student′st-test)、曼恩-惠特尼检验(Mann-Whitneytest)等。有关细节参见Dowdy和Wearden，StatisticsforResearch，JohnWiley&Sons，NewYork1983。优选的置信区间为至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％。P值优选为0.1、0.05、0.01、0.005或0.0001。更优选可通过本发明的方法正确地鉴定出群体中受治疗者的至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。

本文所用术语“受治疗者”是指动物，优选哺乳动物，更优选人。

然而，根据本发明上述方法预期，受治疗者应为“需要心脏介入”，即表现出已知与胸部不适、呼吸困难、ECG改变和上述其它症状等急性心血管事件有关的症状和/或体征。更优选受治疗者在之前24小时内出现一次或多次持续至少5分钟的心绞痛发作，并且心肌钙蛋白T或I检测呈阳性，或者已知不是以前存在的且不归咎于共存疾病的至少0-5mm短暂性或持续性ST段压低。任选但尽管如此仍优选受治疗者应表现出静止时缺血症状加重或发生，或者最后一次发作在之前48小时内的疑似急性心肌梗死得到证实。通过心电描记法(ST压低＝0·1mV或T波倒置＝0·1mV)或者通过生化标记(肌酸激酶[CK]-MB＞6μg/L、肌钙蛋白T＞0.01ng/ml、肌钙蛋白T定性检测阳性或CK、CK-B或CKMB的催化活性比心肌梗死当地诊断局限值高)升高来证实心肌缺血。

急性心血管事件优选为急性冠状动脉综合征(ACS)。ACS患者可出现不稳定型心绞痛(UAP)或心肌梗死(MI)。MI可以是ST抬高MI(STEMI)或非ST抬高MI(NSTEMI)。ACS发生后可能发生左心室功能障碍(LVD)和心力衰竭症状。

术语“心脏介入”包括了那些包括通过手术、显微手术或影响心血管系统、优选心脏的其它侵入疗法介入的治疗方案。优选本文所用的心脏介入是目的在于恢复心脏适当供氧的治疗方案。优选通过恢复支持心脏的整个血管(即冠状血管)的血流量来实现。这些血管可能由于例如血栓形成或动脉粥样硬化斑而受损。因此，心脏介入优选应包括破坏和/或去除这类斑块，必要时修复血管。优选的本发明的心脏介入选自经皮冠状血管成形术、经皮经腔冠状球囊血管成形术(percutaneoustransluminalcoronaryballoonangioplasty)、激光血管成形术、冠状动脉支架植入术、旁路植入术(bypassimplantation)或管腔内技术，目的在于恢复血流量、血管开通(vesselpatency)、稳定斑块和/或减少冠状动脉内血栓负载(thrombusload)。

术语“样品”是指体液样品、分离细胞样品或者组织或器官样品。体液样品可通过众所周知的技术获得，优选包括血液、血浆、血清或尿液样品，更优选血液、血浆或血清样品。组织或器官样品可通过例如活组织检查由任何组织或器官获得。分离细胞可通过离心或细胞分选等分离技术由体液或者组织或器官获得。优选细胞样品、组织样品或器官样品得自表达或产生本文所述肽的细胞、组织或器官。

术语“生长分化因子-15”或“GDF-15”是指作为转化生长因子(TGF)-β细胞因子超家族成员的多肽。术语多肽、肽和蛋白质在整个说明书中可互换使用。GDF-15最初作为巨噬细胞抑制性细胞因子-1被克隆出来，稍后还被鉴定为胎盘转化生长因子-β、胎盘骨形态发生蛋白、非类固醇抗炎药活化基因-1和前列腺衍生因子(Bootcov，出处同上；Hromas，1997BiochimBiophysActa1354：40-44；Lawton1997，Gene203：17-26；Yokoyama-Kobayashi1997，JBiochem(Tokyo)，122：622-626；Paralkar1998，JBiolChem273：13760-13767)。与其它TGF-β相关细胞因子类似，GDF-15合成成为经历二硫键连接的同二聚化的无活性的前体蛋白。当N端肽原(pro-peptide)被蛋白酶剪切时，GDF-15分泌为～28kDa的二聚蛋白(Bauskin2000，EmboJ19：2212-2220)。GDF-15的氨基酸序列公开于WO99/06445；WO00/70051；WO2005/113585；Bottner1999，Gene237：105-111；Bootcov，出处同上；Tan，出处同上；Baek2001，MolPharmacol59：901-908；Hromas，出处同上；Paralkar，出处同上，Morrish1996，Placenta17：431-441或Yokoyama-Kobayashi，出处同上。本文所用的GDF-15还包括上述特异性GDF-15多肽的变体。这类变体具有至少与特异性GDF-15多肽相同的重要生物学和免疫学性质。特别是如果它们通过说明书中所述相同的特异性测定法可检出时，则它们共享相同的重要生物学和免疫学性质，所述方法例如ELISA测定法，采用特异性识别所述GDF-15多肽的多克隆抗体或单克隆抗体。优选的测定法参见随附的实施例。此外，需要了解的是，本发明中所述变体具有由于至少一个氨基酸取代、缺失和/或添加而有所不同的氨基酸序列，其中变体的氨基酸序列与特异性GDF-15多肽的氨基酸序列优选仍有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％同一性。两个氨基酸序列之间的同一性程度可以通过本领域众所周知的算法确定。优选同一性程度通过比较窗(comparisonwindow)内的两个最佳比对序列的比较来确定，其中对于最佳比对，与参比序列(其不包括添加或缺失)相比时，比较窗内氨基酸序列的片段可包括添加或缺失(例如空位或突出端)。其百分比的计算如下：通过测定两条序列上出现相同氨基酸残基的位置数以得到匹配的位置数，将匹配的位置数除以比较窗内总的位置数，所得结果再乘以100，得到序列同一性的百分比。用于比较的序列可应用以下方法进行最佳比对：局部同源性算法(Smith和WatermanAdd.APL.Math.2：482(1981))、同源性比对算法(Needleman和WunschJ.Mol.Biol.48：443(1970))、检索相似性方法(Pearson和LipmanProc.Natl.AcadSci.(USA)85：2444(1988))、这些算法的计算机化执行(GAP、BESTFIT、BLAST、PASTA以及TFASTA(WisconsinGeneticsSoftwarePackage，GeneticsComputerGroup(GCG)，575ScienceDr.，Madison，WI)或通过目测。假如已鉴定出两个序列用于比较，则优选采用GAP和BESTFIT以确定其最佳比对，进而确定同一性程度。优选使用空位权重(gapweight)默认值5.00和空位权重长度(gapweightlength)默认值0.30。上述变体可以是等位基因变体或任何其它物种特定的同源物(homolog)，即共生同源物(paralog)或直向同源物(ortholog)。此外，本文所述的变体包括特异性GDF-15多肽的片段或上述类型的变体，只要这些片段具有上述重要的免疫学和生物学性质。这类片段可为例如GDF-15多肽的降解产物。还包括由于翻译后修饰(例如磷酸化或十四烷基化)而有所不同的变体。

测定GDF-15或任何其它本说明书所述的肽或多肽的量是指测定量或浓度，优选半定量或定量测定。测定可以直接或间接进行。直接测定是指基于从肽或多肽本身获得的信号及与样品中存在的肽的分子数直接相关的强度来测定肽或多肽的量或浓度。这种信号-有时本文称为强度信号-可以通过例如测定肽或多肽具体的物理或化学性质的强度值而获得。间接测定包括测定获自第二成分(即不是肽或多肽本身的成分)或生物读出系统(例如可测量的细胞反应、配体、标记或酶促反应产物)的信号。

根据本发明，测定肽或多肽的量可通过测定样品中肽的量的所有已知手段实现。所述手段包括以各种夹心、竞争或其它测定方式利用已标记分子的免疫测定装置和方法。所述测定法将放大表示肽或多肽存在与否的信号。此外，优选信号强度可直接或间接地与样品中存在的多肽的量相关(例如成反比)。其它合适的方法包括测定对肽或多肽是特异性的物理或化学性质，例如其精确的分子量或NMR谱。所述方法优选包括生物传感器，即与免疫测定法、生物芯片、分析装置(例如质谱仪、NMR分析仪或色谱仪)连接的光学仪器。此外，所述方法还包括基于微量培养板的ELISA法、全自动或机器人免疫测定法(可用例如Elecsys^TM分析仪)、CBA(酶促钴结合测定法(enzymaticCobaltBindingAssay)，可用例如Roche-Hitachi^TM分析仪)和乳胶凝聚测定法(可用例如Roche-Hitachi^TM分析仪)。

优选测定肽或多肽的量包括以下步骤：(a)使能够引起细胞反应且其强度表示肽或多肽的量的细胞与所述肽或多肽接触足够的一段时间，(b)测定细胞反应。对于测定细胞反应，优选将样品或处理样品加到细胞培养物中后，测定内部或外部细胞反应。细胞反应可包括可测量的报道基因的表达或分泌的肽、多肽或小分子等物质。所述表达或物质将产生与肽或多肽的量相关的强度信号。

同样优选测定肽或多肽的量包括测定从样品的肽或多肽中获得的特异性强度信号的步骤。如上所述，这类信号可以是在质谱或NMR谱中观察到的，对于肽或多肽是特异性的，以m/z变量表示的信号强度。

优选测定肽或多肽的量可包括以下步骤：(a)使肽与特异性配体接触，(b)(任选)除去未结合的配体，(c)测定结合配体的量。结合配体将产生强度信号。本发明的结合包括共价结合和非共价结合两者。本发明的配体可以是与本文所述肽或多肽结合的任何化合物，例如肽、多肽、核酸或小分子。优选的配体包括抗体、核酸、肽或多肽，例如肽或多肽及其含有肽结合域的片段的受体或结合配偶体(bindingpartner)以及适体，例如核酸适体或肽适体。这类配体的制备方法是本领域众所周知的。例如，合适抗体或适体的鉴定和生产也可以由供应商提供。本领域技术人员熟悉开发具有较高亲和力或特异性的这类配体的衍生物的方法。例如，可将随机突变引入到核酸、肽或多肽中。然后按照本领域已知筛选方法(例如噬菌体展示)，测定这些衍生物的结合。本文所述抗体包括多克隆抗体和单克隆抗体及其片段，例如能够结合抗原或半抗原的Fv、Fab和F(ab)₂片段。本发明还包括单链抗体和人源化杂合抗体，该人源化杂合抗体中具有所需抗原特异性的非人供体抗体的氨基酸序列与人接纳体抗体的序列结合。供体序列通常可包括至少供体的结合抗原的氨基酸残基，但也可包括供体抗体的其它结构上和/或功能上有关的氨基酸残基。可通过本领域众所周知的若干方法制备这种杂合抗体。优选配体或结合剂(agent)与肽或多肽特异性结合。本发明的特异性结合是指配体或结合剂基本上不会与待分析样品中存在的其它肽、多肽或物质结合(与之发生“交叉反应”)。优选特异性结合的肽或多肽比起其它任何相关的肽或多肽，其亲和力高至少3倍，更优选高至少10倍，甚至更优选高至少50倍。非特异性结合如果根据例如其在蛋白质印迹中的大小或通过其在样品中的相对丰度，仍然能够被明确地区分开并且测定出来，则也是可接受的。可通过本领域已知的任何方法测定配体的结合。优选所述方法是半定量的或是定量的。合适的方法如下。

首先，可以直接测定配体的结合，例如通过NMR或表面等离子共振。

其次，如果配体还用作目标肽或目标多肽的酶活性的底物，则可以测定酶促反应产物(例如可以通过测定例如蛋白质印迹中裂解底物的量来测定蛋白酶的量)。或者，配体本身可具有酶的性质，可使“配体/肽或多肽”复合物或分别结合了肽或多肽的配体与通过产生强度信号供检测的合适底物接触。至于测定酶促反应产物，优选底物的量是饱和的。还可以在反应之前用可检测标记对底物进行标记。优选使样品与底物接触足够的一段时间。足够的一段时间是指待产生的产物的量可检出、优选可测量出的所必需的时间。除了测定产物的量以外，还可测量产物的指定(例如可检出)量出现时所必需的时间。

第三，配体可与供检测和测量配体的标记共价或非共价偶联。可通过直接法或间接法进行标记。直接标记法包括将标记与配体直接偶联(共价或非共价偶联)。间接标记法包括第二配体与第一配体结合(共价或非共价结合)。第二配体应当与第一配体特异性结合。所述第二配体可与合适的标记和/或可以为与第二配体结合的第三配体的靶标(受体)偶联。采用第二、第三或甚至更高等级的配体通常用来增强信号。合适的第二和更高等级的配体可包括抗体、第二抗体和众所周知的链霉抗生物素-生物素系统(VectorLaboratories，Inc.)。配体或底物还可用本领域已知的一个或多个标签(tag)“加上标签”。然后这类标签可为更高等级配体的靶标。合适的标签包括生物素、洋地黄毒苷、His标签、谷胱甘肽-S-转移酶、FLAG、GFP、myc标签、A型流感病毒血凝素(HA)、麦芽糖结合蛋白等。就肽或多肽而言，标签优选在N端和/或C端。合适的标记(label)是通过适当检测方法可检出的任何标记。典型的标记包括金颗粒、乳胶珠、二氢吖啶酯(acridanester)、鲁米诺(luminol)、钌、酶活性标记、放射性标记、磁性标记(“例如磁性珠”，包括顺磁性标记和超顺磁性标记)和荧光标记。酶活性标记包括例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶及其衍生物。用于检测的合适底物包括二氨基联苯胺(DAB)、3，3′，5，5′-四甲基联苯胺、NBT-BCIP(氯化4-硝基蓝四唑鎓和5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐，可获自RocheDiagnostics已制好的储备液)、CDP-Star^TM(AmershamBiosciences)、ECF^TM(AmershamBiosciences)。合适的酶-底物组合可以产生可按照本领域已知方法(例如使用感光胶片或合适的照相系统)测定出来的有色反应产物、荧光或化学发光。至于测定酶反应，可按类似方法应用上述标准。典型的荧光标记包括荧光蛋白(例如GFP及其衍生物)、Cy3、Cy5、德克萨斯红、荧光素和Alexa染料(例如Alexa568)。更多的荧光标记可得自例如MolecularProbes(Oregon)。还包括使用量子点(quantumdot)作为荧光标记。典型的放射性标记包括³⁵S、¹²⁵I、³²P、³³P等。可以通过任何已知的适当方法检测放射性标记，例如感光胶片或磷光成像仪(phosphorimager)。本发明合适的测定方法还包括沉淀法(特别是免疫沉淀法)、电化学发光法(电致化学发光法)、RIA(放射免疫测定法)、ELISA(酶联免疫吸附测定法)、夹心酶免疫测试法(sandwichenzymeimmunetest)、电化学发光夹心免疫测定法(ECLIA)、解离增强镧系荧光免疫测定法(DELFIA)、闪烁亲近测定法(SPA)、浊度测定法(turbidimetry)、比浊法(nephelometry)、乳胶增强浊度测定法或比浊法或者固相免疫测试法(solidphaseimmunetest)。本领域已知的更多方法(例如凝胶电泳、2D凝胶电泳、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白质印迹法和质谱法)可以单独使用或者结合如上所述的标记法或其它检测方法使用。

肽或多肽的量还优选如下测定：(a)使包含上述规定的肽或多肽的配体的固相支持体与包含肽或多肽的样品接触，和(b)测定与固相支持体结合的肽或多肽的量。该配体优选选自核酸、肽、多肽、抗体和适体，优选以固定化形式存在于固相支持体上。用于制造固相支持体的材料是本领域众所周知的，尤其包括市售的柱材料、聚苯乙烯珠、乳胶珠、磁性珠、胶体金属微粒、玻璃和/或硅芯片和表面、硝酸纤维素条、膜、薄片、duracyte、孔和反应盘壁、塑胶管，等等。配体或结合剂可与多种不同的载体结合。熟知的载体实例包括玻璃、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、萄聚糖、尼龙、直链淀粉、天然纤维素、改性纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁体。对于本发明的目的，载体的性质可以是可溶解的或不能溶解的。固定/固化所述配体合适的方法是众所周知的，包括但不限于离子相互作用、疏水相互作用、共价相互作用等。还包括使用“悬浮阵列(suspensionarray)”作为本发明的阵列(Nolan2002，TrendsBiotechnol.20(1)：9-12)。在这类悬浮阵列中，载体(例如微珠或微球)存在于悬浮液中。阵列由可能是被标记的、携带不同配体的不同微珠或微球组成。产生这类阵列的方法广为人知(US5,744,305)，例如基于固相化学法和对光不稳定的保护基的方法。

本文所用术语“量”包括多肽或肽的绝对量、所述多肽或肽的相对量或浓度以及与之相关或由其得到的任何数值或参数。这些数值或参数包括得自通过直接测定法由所述肽得到的所有具体的物理性质或化学性质的强度信号值，例如质谱或NMR谱中的强度值。此外，还包括通过在本发明其它部分具体描述的间接测定法得到的所有数值或参数，例如由响应肽或从特异性结合配体得到的强度信号的生物读出系统测定出来的反应水平。需要了解的是，还可以通过所有标准数学运算得到与上述量或参数相关的值。

本文所用术语“比较”包括将待分析样品所包含的肽或多肽的量与在本发明其它部分具体描述的合适的参比源相比较。需要了解的是，本文所用的比较是指相应参数或数值的比较，例如，将绝对量与绝对参比量相比较，而将浓度与参比浓度相比较，或者将从试验样品得到的强度信号与参比样品的同一类型的强度信号相比较。本发明方法步骤(b)中所述比较可以手工进行或者用计算机辅助进行。对于计算机辅助比较，可将测定量的值与通过计算机程序储存在数据库中的相应的合适参比值进行比较。计算机程序可进一步评价比较结果，即以合适的输出格式自动提供所需要的评价。根据步骤a)测定的量与参比量的比较，可以评价受治疗者是否是对心脏介入敏感，即是否属于可以通过心脏介入得到成功治疗的受治疗者的组别。因此，要选择这样的参比量，以便在量比较中的差异或相似性可供鉴定出接受测试的受治疗者属于对心脏介入敏感的受治疗者组，或者鉴定出接受测试的受治疗者属于对心脏介入不敏感的受治疗者组。

因此，本文所用术语“参比量”是指可供评价有需要的受治疗者对如上所述的心脏介入是否敏感的量。因此，该参比量可得自：(i)已知已得到成功治疗的受治疗者，即没有发生由治疗方案引起的不良反应，例如再梗死或死亡或副作用，或(ii)已知没有得到成功治疗的受治疗者，即在心脏介入之后发生再梗死或由心血管并发症致死或者没有从治疗方案获益的受治疗者。此外，参比量可限定临界量，量大于临界值的表示受治疗者对心脏介入敏感，而量小于临界量则可以是无法通过心脏介入得到成功治疗的受治疗者的标志。对于各个受治疗者可适用的参比量将随年龄、性别或亚种群(subpopulation)等各种生理参数以及用于测定本文所述多肽或肽的工具而改变。合适的参比量可通过本发明的方法由待分析参比样品连同试验样品一起(即同时或序贯)确定。可由正常上限值(ULN)，即在显然是健康的受治疗者群体中测得的生理量值的上限值，推导出优选的用作阈值的参比量。指定的受治疗者群体的ULN可通过各种众所周知的技术确定。合适的技术可以是测定本发明方法中待测定肽或多肽量的群体的中位值。优选的GDF-15的阈值(即参比量)至少是ULN的1-2倍。优选本文所述ULN为1200pg/ml。

因此，限定测定本发明所述GDF-15的临界量的参比量为1800pg/ml或2400pg/ml，更优选1200pg/ml。

更优选GDF-15的量大于参比量表示受治疗者对心脏介入敏感。

最有利的是，我们在以本发明为基础的研究中发现，对于有需要的受治疗者，即患有心血管并发症的受治疗者，特别是受累于急性心血管事件或心力衰竭的受治疗者，GDF-15是评价心脏介入成功的可靠的预后生物标记。由于本发明，在对患者实施心脏介入前便可容易地进行风险/成功分层。在确认患者对心脏介入不敏感的情况下，可以避免这种危险性大、耗时长和/或成本高的疗法。因此，除了防止受治疗者免受伴随心脏介入的不利的严重副作用外，本发明的方法由于可节约资源而有益于健康系统。需要了解的是，按照上下文所述本发明方法，GDF-15的量或其测定工具可用于制备用于鉴定对心脏介入敏感的受治疗者的诊断组合物(diagnosticcomposition)。

另外或者，本发明的上述方法可用来鉴定对心脏疗法(cardiactherapy)敏感的受治疗者，优选如下具体描述的基于药物的疗法或抗血小板疗法。

在本发明方法的一个优选的实施方案中，所述方法还包括测定所述受治疗者样品中心肌钙蛋白的量，并且将心肌钙蛋白的量与参比量相比较。

术语“心肌钙蛋白”是指在心脏细胞、优选在心内膜下细胞中表达的所有肌钙蛋白同等型(isoform)。本领域已对这些同等型进行了充分的表征，参见例如Anderson1995，CirculationResearch，第76卷，第4期：681-686和Ferrieres1998，ClinicalChemistry，44：487-493。优选心肌钙蛋白是指肌钙蛋白T和/或肌钙蛋白I，最优选是指肌钙蛋白T。需要了解的是，可用本发明的方法一起测定(即同时或序贯)肌钙蛋白的同等型或者个别测定，即完全无需测定其它同等型。人肌钙蛋白T和人肌钙蛋白I的氨基酸序列可参见Anderson，出处同上和Ferrieres1998，ClinicalChemistry，44：487-493。

术语“心肌钙蛋白”还包括上述特异性肌钙蛋白的变体，即优选肌钙蛋白T或肌钙蛋白I的变体。这类变体具有至少与特异性心肌钙蛋白相同的重要生物学和免疫学性质。特别是如果通过本说明书中所述的相同的特异性测定法，例如通过用特异性识别所述心肌钙蛋白的多克隆抗体或单克隆抗体的ELISA测定法可检出的话，则它们共享相同的重要生物学和免疫学性质。此外，需要了解的是，本发明所述变体具有由于至少一个氨基酸取代、缺失和/或添加而有所不同的氨基酸序列，其中优选变体的氨基酸序列与特异性肌钙蛋白的氨基酸序列的同一性仍然至少有50％、60％、70％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％。变体可为等位基因变体或任何其它物种特异性同源物，即共生同源物或直向同源物。此外，本文所述变体包括特异性心肌钙蛋白或上述变体类型的片段，只要这些片段具有如上所述的重要免疫学和生物学性质。这类片段可以为例如肌钙蛋白的降解产物。还包括由翻译后修饰(例如磷酸化或十四烷基化)而有所不同的变体。

正如上面已论述的一样，优选的用作阈值的参比量可以由ULN得出。指定受治疗者群体的ULN可以按照本发明中其它部分具体描述的方法测定。对于心肌钙蛋白，特别是对于肌钙蛋白T或肌钙蛋白I，优选的阈值(即参比量)是ULN的至少一倍，更优选2-5倍。优选本文所述肌钙蛋白T的ULN为0.01ng/ml，肌钙蛋白I的为0.1ng/ml。

因此，限定本发明所述的肌钙蛋白T的阈值的参比量优选为0.01ng/ml、0.02ng/ml或0.05ng/ml。

更优选大于参比量的心肌钙蛋白的量表示受治疗者对心脏介入敏感。

在本发明方法的又一个优选的实施方案中，该方法还(即除了测定GDF-15和/或心肌钙蛋白外)包括测定所述受治疗者样品中利尿钠肽的量，并且将利尿钠肽的量与参比量相比较。

术语“利尿钠肽(natriureticpeptide)”包括心房利尿钠肽(AtrialNatriureticPeptide，ANP)型和脑利尿钠肽(BrainNatriureticPeptide，BNP)型肽及其具有相同预测潜力的变体。本发明的利尿钠肽包括ANP型肽和BNP型肽及其变体(参见例如Bonow，1996，Circulation93：1946-1950)。ANP型肽包括pre-proANP、proANP、NT-proANP和ANP。BNP型肽包括pre-proBNP、proBNP、NT-proBNP和BNP。前肽原(pre-propeptide)(在pre-proBNP的情况下为134个氨基酸)包括一条短的信号肽，被酶切割释放出肽原(在proBNP的情况下为108个氨基酸)。肽原被进一步切割成N端肽原(NT-肽原，在NT-proBNP的情况下为76个氨基酸)和活性激素(在BNP的情况下为32个氨基酸，在ANP的情况下为28个氨基酸)。

优选的本发明的利尿钠肽为NT-proANP、ANP、NT-proBNP、BNP及其变体。ANP和BNP是活性激素，半寿期比其相应的无活性对应物NT-proANP和NT-proBNP的短。BNP在血液中代谢，而NT-proBNP则作为完整分子在血液中循环并且照原样经肾脏排出。NTproBNP的体内半寿期比BNP的长120分钟，BNP的体内半寿期为20分钟(Smith2000，JEndocrinol.167：239-46)。用NT-proBNP的预分析更为全面，使得容易将样品转移到中心实验室(Mueller2004，ClinChemLabMed42：942-4)。血样可在室温下保存数天，或者可以邮寄或航运而无回收损失。相比之下，BNP保存在室温或摄氏4°下达48小时会导致浓度损失至少20％(Mueller，出处同上；Wu2004，ClinChem50：867-73)。因此，根据目标时程或性质，测定活性或无活性形式的利尿钠肽可能是有利的。

本发明最优选的利尿钠肽是NT-proBNP或其变体。正如上面的简述一样，本发明所述的人NT-proBNP是优选包含长度为76个氨基酸的对应于人NT-proBNP分子N端部分的多肽。现有技术已有人BNP和NT-proBNP结构的详细记载，例如WO02/089657、WO02/083913或Bonow，出处同上。优选本文所用的人NT-proBNP是公开于EP0648228B1中的人NT-proBNP。这些现有技术文献通过引用有关其中所公开的NT-proBNP及其变体的特异性序列而结合到本文中。本发明所述的NT-proBNP还包括上述人NT-proBNP的所述特异性序列的等位基因变体和其它变体。尤其包括其氨基酸水平与人NT-proBNP有至少60％同一性、更优选至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的变体多肽。基本相似的以及还包括的有蛋白水解的降解产物，其通过诊断工具或通过针对相应的全长肽的配体仍可被识别。还包括的有与人NT-proBNP的氨基酸序列相比，具有氨基酸缺失、取代和/或添加的变体多肽，只要所述多肽具有NT-proBNP性质。本文所述的NT-proBNP性质具有免疫学和/或生物学性质。优选NT-proBNP变体具有与NT-proBNP免疫学性质相当的免疫学性质(即表位组成)。因此，变体可通过用于测定利尿钠肽的量的上述方法或配体来识别。可通过记载于以下文献中的测定法来测定NT-proBNP的生物学和/或免疫学性质：Karl等，1999，ScandJClinInvest59：177-181；Yeo等，2003，ClinicaChimicaActa338：107-115。变体还包括糖基化肽等翻译后修饰肽。此外，本发明的变体还是样品收集后被修饰过的肽或多肽，例如标记、特别是放射性或荧光标记与肽的共价或非共价连接。

如上所述，优选的用作阈值的参比量可由UNL得出。用于指定受治疗者群体的ULN可通过本说明书其它部分具体描述的方法测定。对于利尿钠肽，特别是NT-proBNP，优选的阈值(即参比量)是ULN的至少一倍，更优选2-4倍。优选上下文所述本发明NT-proBNP的ULN为300pg/ml。其它利尿钠肽的ULN为本领域所知，优选对于ANP为40pg/ml，对于BNP为100pg/ml，对于NT-proANP为500pmol/l。

因此，限定本发明所述的NT-proBNP的阈值的参比量优选为600pg/ml或1200pg/ml，更优选1000pg/ml。

更优选大于参比量的利尿钠肽的量表示受治疗者对心脏介入敏感。

需要了解的是，本说明书上下文中对术语所做定义和解释进而可适用于说明书和随附权利要求书中所述的所有实施方案。

本发明还涉及鉴定对心力衰竭疗法敏感的受治疗者的方法，该方法包括：

a)测定需要心力衰竭疗法的受治疗者样品中生长分化因子15(GDF-15)的量；和

b)将在步骤a)中测定的GDF-15的量与参比量相比较，从而鉴定出对心力衰竭疗法敏感的受治疗者。

本文所用术语“心力衰竭(HF)”是指收缩期和/或舒张期心脏功能受损。优选该术语是指可能是由各种潜在疾病或病症引起的充血性心力衰竭。优选本文所述心力衰竭还是慢性心力衰竭。按照纽约心脏协会(NewYorkHeartAssociation，NYHA)，心力衰竭可归类到功能分类系统。NYHI级的患者没有明显的心血管疾病症状，但却已具有功能受损的客观证据。身体活动不受限制，平常的身体活动不会引起过度疲劳、心悸或呼吸困难(呼吸短促)。NYHAII级的患者，身体活动受到轻度限制。在静止时感觉舒适，但是平常的身体活动引起疲劳、心悸或呼吸困难。NYHAIII级的患者，身体活动受到明显限制。他们在静止时感觉舒适，但是低于平常的活动也会引起疲劳、心悸或呼吸困难。NYHAIV级的患者不能够舒适地进行任何身体活动。他们在静止时表现出心机能不全的症状。

需要了解的是，通过上述方法鉴定的受治疗者，优选具有收缩期和/或舒张期心脏功能受损的客观证据，如例如通过超声心动描记术、血管造影术、闪烁法(szintigraphy)或磁共振成像所示。这种功能受损可伴发如上所述的心力衰竭症状(NYHAII-IV级)，尽管一些患者可能不表现出明显症状(NYHAI)。

优选通过本发明所述疗法选出的用于受治疗者的所述疗法是基于药物的疗法。更优选所述药物是ACE抑制剂，优选卡托普利(captopril)、依那普利(enalapril)、福辛普利(fosinopril)、赖诺普利(lisinopril)、培哚普利(perindopril)、喹那普利(quinapril)、雷米普利(ramipril)或群多普利(trandolapril)；AT-1受体阻滞药，优选坎地沙坦(candesartan)、氯沙坦(losartan)或缬沙坦(valsartan)；β-受体阻滞药，优选比索洛尔(bisoprolol)、卡维地洛(carvedilol)、美托洛尔(metoprolol)或琥珀酸盐或者醛甾酮拮抗药，优选螺内酯(spironolacton)或依普利酮(eplerenone)。

按照本发明选出的用于受治疗者的另一种优选疗法是介入疗法。本文所述的介入疗法是基于受治疗者躯体介入的疗法，例如通过手术和/或电生理介入疗法。更优选所述介入疗法是心脏再同步疗法(CRT)或以植入型心律转复除颤器(ICD)为基础。

最好通过测定患有心力衰竭的受治疗者样品中的GDF-15的量，来确定受治疗者是否对上述疗法敏感。准确地讲，预期GDF-15的量大于参比量的受治疗者可适于通过上述疗法进行治疗，而GDF-15少的受治疗者不能从该疗法中受益。

此外，本发明涉及用于预测患有心血管并发症的受治疗者的死亡或再发急性心血管事件(furtheracutecardiovascularevent)风险的方法，该方法包括：

a)测定受治疗者样品中GDF-15和利尿钠肽和/或心肌钙蛋白的量；和

b)将步骤a)中测定的GDF-15和利尿钠肽和/或心肌钙蛋白的量与参比量相比较，从而预测死亡或再发心血管事件的风险。

本文所用术语“预测”是指评价在未来某一规定的时间窗(预测窗(predictivewindow))内，患有心血管并发症的受治疗者可能死亡的概率(即由心血管并发症引起的死亡率)或发生急性心血管事件(例如心肌(再)梗死)的概率。预测窗是其中受治疗者依照预测概率会发生急性心血管事件或会死亡的时间间隔。预测窗可以是受治疗者在从本发明方法分析时起的整个剩余寿命。然而，优选预测窗是心血管并发症发生后(更优选和正好获得待本发明方法分析的样品后)1个月、6个月或1年、2年、3年、4年、5年或10年的时间间隔。正如本领域技术人员所了解的一样，这种评价通常不是对100％待分析受治疗者都是正确的。然而，该术语要求评价对于有统计显著性部分的待分析受治疗者是有效的。通过本领域技术人员应用各种众所周知的统计评价工具而无需再费周折便可确定某一部分是否有统计显著性，统计评价工具例如测定置信区间、P值测定、斯图登t检验、曼恩-惠特尼检验等。有关细节参见Dowdy和Wearden，StatisticsforResearch，JohnWiley&Sons，NewYork1983。优选的置信区间为至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％。P值优选为0.1、0.05、0.01、0.005或0.0001。优选本发明所预期的概率使得预测对于指定群组的受治疗者的至少60％、至少70％、至少80％或至少90％是正确的。

本文所用术语“死亡率”是指由所述心血管并发症(例如由于心肌(再)梗死)引起的死亡率。

本文所用术语“心血管并发症”是指心血管系统或任何急性心血管事件的任何慢性病症。优选本文所用心血管系统的慢性病症包括冠心病、稳定型心绞痛(SAP)或心力衰竭，优选慢性心力衰竭。优选急性心血管事件为急性冠状动脉综合征(ACS)。ACS患者可表现出不稳定型心绞痛(UAP)或心肌梗死(MI)。MI可以是ST抬高MI(STEMI)或非ST抬高MI(NSTEMI)。本文所用NSTE-ACS包括UAP和NSTEMI。MI发生后可能出现左心室功能障碍(LVD)或发生心力衰竭。其它优选的心血管并发症包括心脏缓慢心律失常或心脏快速心律失常，包括心脏性猝死和中风(脑血管事件或意外)。最优选所述心血管并发症是ACS或心力衰竭。

本文所用术语“预测死亡风险或再发(即复发性)急性心血管事件”是指通过本发明的方法，将待分析的受治疗者分配到心血管并发症后发生急性心血管事件或死亡风险正常(即非增加)的群体的受治疗者组，或者分配到风险显著增加的受治疗者组。本发明所述的风险增加是指相对于受治疗者群体中急性心血管事件或心脏性死亡率的平均风险，对于受治疗者预先确定的预测窗内发生再发急性心血管事件或死亡的风险显著增加。优选对于一年预测窗，平均风险在0.5％和3.0％的范围内，优选1.5％。至于一年预测窗，优选本文所用风险增加是指3.0％以上的风险，优选5.0％以上，最优选在3.0％和8.0％以内。

有利的是，在本发明基础上进行的研究表明，测定(i)GDF-15和利尿钠肽的量，或(ii)GDF-15和心肌钙蛋白的量，或优选(iii)GDF-15、利尿钠肽和心肌钙蛋白的量，是在已患有心血管疾病的受治疗者中对死亡风险或更多不良的急性心血管事件进行可靠评价所必需的。上述方法比现有技术的方法更可靠，因为研究已表明，GDF-15和利尿钠肽(例如NT-proBNP)是统计学上独立的预测因子。尤其是GDF-15水平(即GDF-15的量)在明显健康的老年受治疗者中，在450pg/ml(大约第10百分位数(rounded10thpercentile))和1200pg/ml(大约第90百分位数，定义为正常上限值)之间变化，中位值762pg/ml。与健康个体相比，约2/3的NSTE-ACS患者的水平在正常上限值以上，1/3的水平在1800pg/ml以上。在GDF-15正常范围内的患者中，一年死亡率低至1.5％。在GDF-15中等升高(1200-1800pg/ml)的患者中，一年死亡率升高到5.0％，而在明显升高(＞1800pg/ml)的患者中，一年死亡率非常高，为14.1％。早在指数事件后就观察到死亡率的差异，且在1个月后已十分显著。接收者工作特征(Receiveroperatingcharacteristic，ROC)曲线分析进一步表明GDF-15是一年死亡率的强生化标记，曲线下面积为0.757。用多重回归分析，NSTE-ACS中入院时GDF-15水平与从症状出现到入院的时间(延迟时间(delaytime))成负相关。这一发现可能与GDF-15水平和疾病/症状的严重程度的关联性有关，导致在具有较高GDF-15水平的患者中延迟时间较短。尽管在入院后，中位值GDF-15水平略微升高，但是它在72小时观察期间，在每个患者体内都保持得相当稳定。NSTE-ACS患者中，每位患者在不同情况下所测得的GDF-15水平密切相关，并且得到相似的有关死亡率的预后信息，这就表明，入院后得到的一次GDF-15测定结果可提供相当好的预后信息。在NSTE-ACS患者中，在所有4个时间点上GDF-15水平预后信息得到验证，支持这些结果的可靠性。NSTE-ACS患者中，GDF-15水平分别独立地与年龄、近期吸烟、糖尿病、心力衰竭史、心功能不全(NT-proBNP)、炎症活性(CRP)和肾功能障碍(肌酸酐清除率)强相关，这就表明在NSTE-ACS患者中，GDF-15水平升高使较严重的心血管疾病和预后不良的若干重要临床和生化指标整合在一起。所有这些相关变量中，GDF-15表现为最强的一年死亡率上升的预测因子。GDF-15以外，仅年龄、以前的心肌梗死和NT-proBNP水平附加了有关死亡率的独立的预后信息。同样地，研究发现，GDF-15水平为复发性MI提供了可靠的预后信息；参见图1和下表1。由于本发明这一方面，可以容易地对已患有心血管并发症的患者进行风险分层。需要了解的是，按照上下文所述本发明方法，GDF-15与利尿钠肽的量、GDF-15与心肌钙蛋白的量或GDF-15与利尿钠肽和心肌钙蛋白组合的量或者其测定工具可用于制备用于预测患有心血管并发症的受治疗者的死亡或再发急性心血管事件风险的诊断组合物。

此外，研究表明，包括测定GDF-15和利尿钠肽的本发明方法优选可用于测定死亡风险，而GDF-15和心肌钙蛋白的组合优选可用于预测再发急性心血管事件的风险。因此，本发明还包括预测患有心血管并发症的受治疗者的死亡风险的方法，该方法包括测定受治疗者样品中GDF-15和利尿钠肽的量；并将上述步骤所测的GDF-15和利尿钠肽的量与参比量相比较。此外，本发明涉及用于预测患有心血管并发症的受治疗者的再发急性心血管事件风险的方法，该方法包括测定受治疗者的样品中GDF-15和心肌钙蛋白的量，并将上述步骤测得的GDF-15和心肌钙蛋白的量与参比量相比较。

在本发明方法的一个优选的实施方案中，所述GDF-15的参比量(即临界量)为1200pg/ml。更优选GDF-15的量大于参比量可表示死亡或再发急性心血管事件的风险增加。

在本发明方法的又一个优选的实施方案中，所述肌钙蛋白T的参比量(即临界量)为0.01ng/ml。

更优选心肌钙蛋白的量大于参比量可表示死亡或再发急性心血管事件的风险增加。

在本发明方法的另一个优选的实施方案中，所述NT-proBNP的参比量(即临界量)为1000pg/ml。

更优选利尿钠肽的量大于参比量可表示死亡或再发急性心血管事件风险增加。

此外，本发明还包括预测患有心力衰竭的受治疗者的有害心血管并发症(adversecardiovascularcomplication)的风险的方法，该方法包括：(a)测定受治疗者样品中GDF-15的量，和(b)将步骤a)中所测的GDF的量与参比量相比较。

在本发明基础上进行的研究表明，表现出心力衰竭症状、优选患有慢性心力衰竭的受治疗者，其有害心血管并发症、优选再发急性心血管事件或者更优选死亡的风险增加。在所述研究中，在已进行了研究的各种生物标记中，GDF-15证明是如上所述的有害心血管并发症风险、特别是死亡风险增加的独立预测因子。

此外，本发明还涉及预测患有肺栓塞的受治疗者死亡或随后的肺栓塞相关并发症风险的方法，该方法包括：

a)测定受治疗者样品中GDF-15的量；和

b)将在步骤a)中测定的GDF-15的量与参比量相比较，从而预测死亡或随后的肺栓塞相关并发症的风险。

本文所用术语“肺栓塞”是指由肺血管闭塞或狭窄引起的病症。所述闭塞或狭窄的结果，将会使肺组织的气体交换和供血受到损害。因此，肺的生理功能受到损害。本文所用肺栓塞可以是慢性或急性肺栓塞。然而，优选该术语是指急性肺栓塞。肺栓塞可以通过众所周知的诊断技术进行诊断，并且伴随发生如标准医学教科书中所描述的症状。

本发明所述的“随后的肺栓塞相关并发症”是不良事件，优选心肺事件，包括再次肺栓塞或需要介入(例如插管法、给予儿茶酚胺或心肺复苏)的肺或心血管系统生理功能的任何其它损伤。随后的肺栓塞相关并发症可能发生在受治疗者正患有的初次肺栓塞后的可预测时间窗内。

本文所用术语“预测死亡风险”是指通过本发明的方法将待分析的受治疗者分配到肺栓塞之后具有正常(即非增加)死亡风险的群体的受治疗者组，或者分配到风险显著增加的受治疗者组。本发明所述的风险增加是指相对于受治疗者群体的平均死亡风险，对于受治疗者预先确定的预测窗内的死亡风险显著增加。优选对于30天的预测窗，平均风险约为5.0％。本文所用的风险增加，优选是指风险增加至少5倍，或者优选风险增加至少10倍，即风险50.0％以上。此外，该术语还指6个月预测窗内显著增加的风险。在面临本文所述死亡风险的受治疗者中，所述预测窗内死亡的正常风险优选增加至少5倍，更优选增加7倍。

在预测受治疗者是否面临死亡或随后的肺栓塞相关并发症风险方面，优选限定阈值的参比量为4,600pg/ml。量超过4,600pg/ml的样品表示提供样品的受治疗者面临死亡或如上所述的随后的肺栓塞相关并发症的风险，而量不超过4,600pg/ml则表示受治疗者没有面临风险。

研究表明，GDF-15或测定GDF-15的量的方法大体上可用于制备用于预测患有肺栓塞的受治疗者是否面临死亡或随后的肺栓塞相关并发症风险的诊断组合物。

有利的是，在本发明基础上进行的研究表明，在作为生物标记的GDF-15的基础上，可以可靠地为患有肺栓塞的受治疗者进行风险分层。根据所述风险分层，可确定将需要哪些进一步的方法(例如给予受治疗者的具体疗法)以及哪种程度的临床监测。

在本发明上述方法的一个优选的实施方案中，GDF-15可与其它栓塞标记、优选本说明书其它部分所述的心肌钙蛋白和/或利尿钠肽一起进行测定。

此外，本发明包括的还有用于鉴定对适于实施本发明方法的心脏介入或心力衰竭疗法敏感的受治疗者的装置，该方法包括测定受治疗者样品中GDF-15的量的方法，并且将所述量与参比量相比较的方法，从而鉴定出对心脏介入或心力衰竭疗法敏感的受治疗者。

本文所用术语“装置”是指工具系统，即包括至少上述彼此有效连接供预测之用的工具的系统。在本发明方法上述有关方面，公开了测定GDF-15的量、优选结合测定心肌钙蛋白和/或利尿钠肽的量的优选工具以及进行比较的工具。如何以操作的方式将所述工具连接起来将取决于包括装置内的工具类型。例如，如果采用自动测定肽的量的工具，则可通过例如计算机程序处理由所述自动操作工具获得的数据，从而获得所需要的结果。在这种情况下，优选工具包括在一个装置中。因此，所述装置可包括用于测定所用样品的肽或多肽的量的分析单元和处理用于评价的所得数据的计算机单元。或者，如果使用测试条(teststripe)等工具测定肽或多肽的量，则用于比较的工具还包括对照条(controlstripe)或供所测定的量与参比量对照的表格。优选测试条与特异性结合本文所述肽或多肽的配体偶联。优选测试条或装置包括用于检测所述肽或多肽与所述配体结合的工具。在与上述本发明方法有关的实施方案方面，公开了优选的检测工具。在这种情况下，工具被有效地连接起来，因为系统的使用人员按照说明书中给出的说明和解释将测定的量的结果与其诊断或预后评价结合在一起。在这种实施方案中，工具可呈单独的装置，并且优选包装在一起成为工具箱(kit)。本领域技术人员应当了解如何不用再费周折便可将工具连接起来。优选的装置是无需专业临床工作人员的专门知识便可应用的装置，例如测试条或者只需要加载样品的电子装置。结果可按原始数据输出，需要临床医生予以解读。然而，优选装置的输出是原始数据经过处理，即已经过评价，不再需要临床医生解读。此外优选的装置包括分析单元/装置(例如生物传感器、阵列、与特异性识别利尿钠肽的配体偶联的固相支持体、表面等离振子共振装置、核磁共振波谱仪、质谱仪等)或上述本发明方法的评价单元/装置。

此外，本发明还涉及用于预测适于实施本发明的方法的受治疗者的死亡或再发急性心血管事件风险的装置，该装置包括用于测定受治疗者样品中GDF-15和利尿钠肽和/或心肌钙蛋白的量的工具及将所述量与参比量相比较的工具，从而预测受治疗者是否面临死亡或再发急性心血管事件的风险。

此外还包括的有用于预测适于实施本发明方法的患有心力衰竭的受治疗者的有害心血管并发症风险的装置，该装置包括用于测定所述受治疗者样品中GDF-15的量的工具及将所述量与参比量相比较的工具，从而预测受治疗者是否面临有害心血管并发症的风险。

本发明还涉及用于预测适于实施本发明方法的患有肺栓塞的受治疗者是否有死亡或有随后的肺栓塞相关并发症风险的装置，该装置包括用于测定患有肺栓塞的受治疗者样品中GDF-15的量、优选与利尿钠肽和/或心肌钙蛋白组合的量的工具及将所述量与参比量相比较的工具，从而预测受治疗者是否面临死亡或随后的肺栓塞相关并发症的风险。

此外，本发明还包括用于实施鉴定对心脏介入或心力衰竭疗法敏感的受治疗者的本发明方法的工具箱。所述工具箱包括用于测定受治疗者样品中GDF-15的量的工具及将所述量与参比量相比较的工具，从而鉴定出对心脏介入或心力衰竭疗法敏感的受治疗者。

本文所用术语“工具箱(kit)”是指上述工具(means)的集合，优选各工具在独立的容器中或者在一个容器中提供。优选容器还包括实施本发明方法的说明书。

本发明涉及用于实施本发明方法以预测死亡或再发急性心血管事件风险的工具箱，该工具箱包括用于测定受治疗者样品中GDF-15和利尿钠肽和/或心肌钙蛋白的量的工具及将所述量与参比量相比较的工具，从而预测受治疗者是否面临死亡或再发急性心血管事件的风险。

本发明还涉及用于实施本发明方法以预测有害心血管并发症的风险的工具箱，该工具箱包括用于测定患有心力衰竭的受治疗者样品中GDF-15的量的工具，以及将所述量与参比量相比较的工具，从而预测受治疗者是否面临有害心血管并发症的风险。

最后，本发明涉及用于预测适于实施本发明方法的患有肺栓塞的受治疗者是否有死亡或有随后的肺栓塞相关并发症风险的工具箱，该工具箱包括用于测定患有肺栓塞的受治疗者样品中GDF-15的量、优选与利尿钠肽和/或心肌钙蛋白组合的量的工具及将所述量与参比量相比较的工具，从而预测受治疗者是否面临死亡或随后的肺栓塞相关并发症的风险。

本说明书中所有参考资料都通过引用其完整的公开内容、尤其是本说明书中所提及的公开内容而结合到本文中。

附图简述如下：

图1：(A)在FRISCII临床试验招募的1034名非侵入性NSTE-ACS患者中，按照入院时GDF-15水平的三分位数(tertile)(＜1200n＝400，1200-1800n＝394，＞1800n＝240)，在两年内急性心肌梗死的累积概率(log-rank检验(log-ranktest)P＜0.0001)。(B)在FRISCII临床试验招募的1045名侵入性NSTE-ACS患者中，按照入院时GDF-15水平的三分位数(＜1200n＝416，1200-1800n＝376，＞1800n＝253)，在两年内急性心肌梗死的累积概率(log-rank检验(log-ranktest)P＝0.6915)。

图2：在GUSTO-IV临床试验招募的2081名NSTE-ACS患者中，按照入院时GDF-15水平的三分位数，在一年内死亡的累积概率(log-rank检验P＜0.001)。

图3：在GUSTO-IV临床试验招募的2081名NSTE-ACS患者中，将生物标记水平与一年死亡率相关联的接收者工作特征(ROC)曲线分析。计算出曲线下面积，GDF-15为0.757，NT-proBNP为0.735，肌酸酐清除率为0.728，CRP为0.629，肌钙蛋白T为0.620。

图4：在GUSTO-IV临床试验招募之前无心肌梗死史(图A)和之前有心肌梗死史(图B)的NSTE-ACS患者中，按照入院时GDF-15水平和NT-proBNP水平的三分位数，分层后的NSTE-ACS患者中一年随访期的死亡率。每条柱表示死亡数/患者数。

图5：(A)按照GDF-15的四分位数，推导群组(derivationcohort)慢性心力衰竭患者的累积存活率(log-rank检验P＜0.001)。(B)验证群组(validationcohort)慢性心力衰竭患者的累积存活率；按照推导群组所规定的分界水平(cut-offlevel)对患者进行分层(log-rank检验P＜0.001)。图下部分表示面临风险的患者数。

图6：在推导群组(A)和验证群组(B)的慢性心力衰竭患者随访期间死亡率的单变量预测因子。图中显示了置信区间95％的危险比(Hazardratio)、χ²和P值。肌酸酐、尿酸、NT-proBNP和GDF-15不是正态分布的，因此在分析前被转换成其自然对数；危险比是指在这些变量中按自然对数尺度增加一个单位。

图7：(A)30天时间窗内无不良事件的患者的存活率。按照患者的GDF-15水平(4,600ng/L以上或以下)对患者进行了分类；(B)180天时间窗的存活率。

下面的实施例仅用来说明本发明。无论如何也不应理解为是对本发明范围的限制。

实施例1：测定血清和血浆样品中的GDF-15、NT-proBNP和肌钙蛋白

为了测定血清和血浆样品中GDF-15的浓度，使用GDF-15亲和层析法纯化的多克隆山羊抗人GDF-15IgG抗体(得自R&DSystems)(AF957)，开发出免疫放射分析法(IRMA)。将MaxisorpStartubes(Nunc)用0.5μg抗GDF-15IgG的0.1M碳酸钠缓冲液(pH9.0)在4℃下包被过夜，然后用磷酸缓冲盐溶液与0.1％吐温20(Tween20)洗涤两次。将血清或血浆样品(100μl)用分析缓冲液(30g/LBSA、10g/L牛IgG、1％山羊血清、0.1％叠氮化钠、1MNaCl、40mM磷酸钠缓冲液，pH7.4)按1∶1稀释后，加到各管中，在4℃下孵育16小时。在两次洗涤步骤后，将10ng[¹²⁵I]-碘化的抗GDF-15IgG(比活0.74MBq/μg)稀释于200μl分析缓冲液中后，加到各管中，在室温下孵育4小时。在三次最后的洗涤步骤后，用γ计数器(LKBWallac1261)定量测定结合的放射性。在每项实验中，用重组人GDF-15(得自R&DSystems)(957-GD/CF)绘制标准曲线。在标准血浆样品中测出新批次的重组GDF-15蛋白的结果，在本项测定中任何10％以上的偏差都通过引入调整因子来校正。在最终的稀释倍数校正后，得自同一患者血清和血浆样品中的GDF-15的测定结果基本相同。本测定法的检出限为20pg/ml。对于平均GDF-15水平为744pg/ml、1518pg/ml和8618pg/ml时，所测得的测定批次内变异系数分别为5.6％、5.9％和6.5％。对于平均GDF-15水平为832pg/ml、4739pg/ml和9230pg/ml时，所测得的测定批次间变异系数分别为8.6％、5.7％和4.4％。

通过第三代测定法，用检出限为0.01ng/ml的Elecsys2010分析仪(RocheDiagnostics)测定了肌钙蛋白T水平。

用免疫测定法在检出限为20pg/ml的Elecsys2010中测定了NT-proBNP水平。

实施例2：FRISCII研究中NSTE-ACS患者侵入性和非侵入性治疗方案之间差异的分析

在1996年6月和1998年5月之间，在58家斯堪的纳维亚医院招募患者进行FRISCII研究，其中16家医院为介入中心。如果患者在静止时显示缺血症状加重或发生，或者已证实疑似急性心肌梗死，最后发作在开始达肝素(dalteparin)或标准肝素治疗之前48小时内，则他们符合招募条件。通过心电描记法(ST压低≥0·1mV或T波倒置≥0·1mV)或者通过生化标记升高(肌酸激酶[CK]-MB＞6μg/L、肌钙蛋白T＞0.10μg/L、肌钙蛋白T定性检测阳性或CK、CK-B或CKMB的催化活性大于心肌梗死的当地诊断局限值)，证实了心肌缺血。排除标准排除了出血事件风险、贫血或者过去24小时有血栓溶解迹象或治疗、过去6个月经历血管成形术、冠状血管重建术候诊、其它急性或严重心脏病、肾功能不全、肝功能不全、已知临床上相关的骨质疏松症、其它严重疾病、对任意药物的超敏反应、预期对本项或其它临床试验的配合或参与有困难、之前经过心脏直视手术、高龄(例如＞75岁)或使得发生随机早期血管重建不良的其它疾病的患者。FRISCII研究是具有平行组的前瞻性多中心随机性临床试验。我们通过因子设计对侵入性和非侵入性治疗进行了比较。将各组中半数的患者随机分配为经皮下用达肝素或安慰剂长期治疗3个月。侵入性和非侵入性策略的比较是开放的，长期达肝素治疗与安慰剂的比较是双盲的。

在侵入组中，目的是在开始标签公开达肝素(open-labeldalteparin)7天内进行所有侵入性手术。招募几天内，直接侵入性治疗为冠状血管造影术，目的在于在开始标签公开治疗的7天内进行血管重建。我们推荐任何动脉直径阻塞至少70％的所有患者进行血管重建以提供足够比例的心肌。如果有一个或两个目标病变，则推荐经皮冠状血管介入，有三条血管或左主动脉疾病的患者优选进行冠状动脉分流术。

不论疗法是否最大或者出院前症状限制性运动试验(symptom-limitedexercisetest)中缺血是否严重，在具有难治性或复发性症状的患者中，非侵入性治疗都包括了冠状血管造影术。用于进行血管造影术和血管重建的运动试验标准是：ST压低≥0·3mV；与最大工作负荷低(＜90W(男)或＜70W(女))或血压降低相关的局限性胸痛(limitingchestpain)；或运动试验时无之前伴发Q波或T波倒置的ST抬高。在长期随访期间，不考虑随机性策略，对于有不符合条件的症状、不稳定复发或心肌梗死的所有患者，都会考虑侵入性手术。

入院时，患者最初用调整活化部分促凝血酶原激酶时间的标签公开皮下达肝素或标准肝素输注进行治疗。进行随机分组，所有患者都接受达肝素120IU/kg，每12小时皮下(最大剂量10000IU)注射，非侵入组至少5天，侵入组直到进行手术。此后，患者接受达肝素或安慰剂皮下注射一天两次。体重80kg以下的女性和体重70kg以下的男性接受5000IU达肝素或安慰剂，体重超过这些体重值的则接受7500IU。这个方案持续3个月，在出院后，患者用预先装入单剂量的注射器自行注射。冠状动脉手术前不迟于12小时给予最后一次标签公开或双盲达肝素注射治疗。血管成形术之后，在除掉护套(sheath)后2-6小时重新开始达肝素或安慰剂注射。在给予糖蛋白IIb/IIIa抑制剂阿昔单抗(abciximab)输注后，直到输注后24小时才重新开始达肝素或安慰剂注射。冠状动脉分流术后，所有患者都接受标签公开达肝素5000IU，一天两次直到可以活动，在出院前几天开始双盲治疗。要求患者在日记中记录所有注射，在患者就诊时清点交回或未使用的注射器，以检查遵守情况。入院时以初始剂量300-600mg给予所有患者阿司匹林，随后给予维持剂量75-320mg，一天一次。给予β-阻滞药，除非有禁忌。需要时，可以加入有机硝酸盐和钙拮抗药。根据现代治疗方针，推荐降低胆固醇的他汀类、用于左心室功能障碍的血管紧张素转化酶抑制剂和积极的抗糖尿病药物治疗。在经皮冠状血管介入期间，鼓励使用阿昔单抗。支架放置后3-4周推荐噻氯匹定(Ticlopidine)。入院时或者最迟随机就地分析血样的血红蛋白浓度、白细胞计数、血小板计数、凝血酶原时间、肌酸酐、葡萄糖、血红蛋白A10，必要时分析甘油三酯、胆固醇、HDL胆固醇和LDL胆固醇。入院时，严重胸痛新发作后以及血管重建前、血管重建后4-24小时，分析心肌损伤的生化标记。最常用的心肌损伤标记是CK-MB物质(CK-MBmass)，但是一些中心使用总CK、CK-B或两者的催化活性。在大多数医院，可以定量测定肌钙蛋白T。对于筛选目的，我们提供的所有中心都具备第二代强心药(Cardiac-T)(Roche-BoehringerMannheim，Mannheim，Germany)肌钙蛋白T定性测试。从所有患者中随机采集血样并保存在-70℃下用于中心分析肌钙蛋白T和其它标记。入院时、在侵入性手术前24小时内、出院时、在3个月和6个月的患者就诊时及在任何怀疑复发性不稳定型心绞痛或心肌梗死时，随机进行了常规12导联心电描记法。在出院前，对非侵入组中没有禁忌的患者进行了症状限制性自行车运动试验16。在出院前和总在侵入性手术前，对1951名患者进行了超声心动描记术与左心室功能标准评价。将所有运动试验结果和超声心动图送往中心实验室用于评价。

主要目的是比较6个月后侵入性和非侵入性策略对死亡和心肌梗死复合终点的影响。其它预先确定的终点为总死亡、心肌梗死、心绞痛症状、冠状血管造影术和血管重建的近期需要、出血事件和中风。通过三项常规标准--典型胸痛、诊断心电描记法记录(主要是新的Q波)或按照以下定义的心肌损伤生化标记升高--发生两项来限定心肌梗死。对于非手术相关性心肌梗死：一次测定中，超过当地医院心肌梗死诊断极限值的CK-MB物质的浓度；在两次连续测定中，超出当地极限值的CK、CK-B或CK-MB的催化活性；在一次测定中，超过当地极限值两倍的CK、CK-B或CK-MB的催化活性。对于与经皮冠状血管介入有关的心肌梗死：在一次测定中，CK-MB物质为当地医院心肌梗死诊断极限值的1.5倍；在一次测定中，超过当地极限值3倍的CK、CK-B或CK-MB的催化活性；或者在两次测定中超过当地极限值1.5倍的催化活性。仅新Q波被用来诊断与冠状动脉分流术有关的心肌梗死。死亡原因应通过尸体解剖确定。所有报告的死亡、心肌梗死、与经皮冠状血管介入有关的生化标记升高和由中心实验室报告的心电描记法中的新Q波都由独立的临床事件委员会(clinical-eventcommittee)判定。通过制药公司发起人聘用的外部监管人员对所有病例记录形式的原始数进行不间断地验证以确保数据质量。所有心脏事件(有效终点)和不良事件数据不断由中心直接送往数据和安全监测理事会。本研究遵守赫尔辛基宣言(DeclarationofHelsinki)，所有地方伦理委员会均批准了该方案。

入院时，采用在GUSTOIV研究(参见实施例1，见上文)中所述的相同免疫放射分析(IRMA)测定了血清或血浆GDF-15浓度。在所分配的侵入性治疗策略组中以及在所分配的非侵入性治疗策略组中，以GDF-15水平的三分位数(＜1200pg/ml；1200-1800pg/ml；＞1800pg/ml)记录了结果事件(两年心肌梗死、两年死亡、两年心肌梗死和死亡)比例的差异。运用Kaplan-Meier方法来说明在随访期间两组中与GDF-15三分位数有关的事件的时间选择(图1)。

下表1表示死亡和/或再发急性心肌梗死(AMI)的风险。

表1：在FRISCII临床试验招募的1045名侵入性NSTE-ACS患者和1034名非侵入性NSTE-ACS患者中与侵入性相对于非侵入性策略有关的两年期结果

		非侵入性	侵入性
							GDF-15的三分位数	事件％(总N)	事件％(总N)	优势比估计值(95％CI)	p值
死亡/AMI	＜12001200-1800＞1800	9.3(400)16.5(394)27.9(240)	9.6(416)11.2(376)14.6(253)	1.044(0.652-1.669)0.637(0.420-0.966)0.442(0.282-0.693)	0.85840.03370.0004
						AMI	＜12001200-1800＞1800	8.0(400)12.9(394)21.7(240)	8.2(416)9.8(376)9.5(253)	1.024(0.619-1.693)0.734(0.468-1.150)0.379(0.225-0.638)	0.92780.17720.0003
死亡	＜12001200-1800＞1800	1.8(400)4.1(394)13.3(240)	1.4(416)2.1(376)6.3(253)	0.822(0.274-2.466)0.514(0.217-1.215)0.439(0.234-0.823)	0.72610.12920.0102

实施例3：对GUSTO-IV研究的NSTE-ACS患者的短期和长期死亡率和心肌再梗死的分析

研究样品来自1999年和2000年之间在NSTE-ACS患者中进行GUSTO-IV临床试验的患者。已经公开了临床试验的详细设计和主要结果(Simoons2001，Lancet98：351-360；Ottervanger2003，Circulation，107：437-442)。符合条件的患者至少21岁，入院24小时内有一次或多次持续至少5分钟的心绞痛发作，以及心肌钙蛋白试验阳性或至少0.5mmST段压低。除了标准治疗外，患者被随机分配输注阿昔单抗或安慰剂达24小时或48小时。在30天的随访期间，记录了全因死亡率(all-causemortality)和确诊的心肌梗死比率。在一年随访内，只收集了全因死亡率信息。在对瑞典站点招募的399名连续患者进行的小组研究中，在入院时(即在基线)和24小时、48小时和72小时采集了系列血浆样品，这些是首次在本研究中进行的分析。基于这个群组的重要结果，才决定对临床试验的其它1682名随机患者入院时采集的血清样品进行GDF-15水平分析，以达到至少2000名患者，并且能够研究与其它预后生物标记，即肌钙蛋白T、NT-proBNP、CRP和肌酐清除率的相互作用。

血浆样品还得自包括在瑞典男女性及缺血性心脏病(SWediwomenandmenandISCHemicheartdisease，SWISCH)研究中明显健康的受治疗者。这一群体由429名老年人组成，其年龄和性别与法安明(FRagmin)和冠状动脉疾病不稳定期快速血管重建(FRagminandfastrevascularizationduringInStabilityinCoronaryarterydisease，FRISC)II临床试验中所包括的其它同龄的NSTE-ACS群体相当。已经公开了SWISCH临床试验的详细设计和一些生物标记结果。异常静止12导联ECG、心血管药物治疗、已确诊的心血管疾病、其它慢性疾病或急性疾病的受治疗者被排除在对照群体之外。要求所有SWISCH参与者表现出肌酸酐、血糖和血红蛋白水平正常以及白细胞和血小板计数正常。

基线特征用数值和比例表示。连续数据以中位值和四分位数间距给出。通过非参数曼恩-惠特尼U检验评价了病例和对照之间连续变量的比较。为了评价GDF-15水平和基线特征之间的关系，以及肌钙蛋白T、NT-proBNP、CRP和肌酸酐清除率的水平在GDF-15的三分位数内，采用了GDF-15水平和这些因子之间的斯皮尔曼(Spearman)秩相关系数以及若干组中比例间关联的Cochran-Armitage趋势检验两者。采用斯皮尔曼相关系数和威尔科克森(Wilcoxon)符号秩检验对患者组内GDF-15随时间的变化进行了比较。按GDF-15水平的三分位数，对结果事件(30天心肌梗死、30天死亡、30天心肌梗死和死亡、一年死亡)比例上的差异用Cochran-Armitage趋势检验作判断。Kaplan-Meier方法用来说明随访期间与GDF-15的三分位数有关的事件的时间选择，采用log-rank检验进行统计学评价(图2)。采用单因素逻辑斯谛(logistic)回归分析来鉴定一年死亡的预测因子。然后所有变量用多因素逻辑斯谛回归分析检验。有关一年死亡的GDF-15、肌钙蛋白T、NT-proBNP、CRP和肌酸酐清除率的预后值的额外比较，绘制了接收者工作特征(ROC)曲线，并计算出曲线下面积(图3)。所有数据分析采用SAS9.0统计程序进行。

明显健康的对照受治疗者的GDF-15水平

对照由男288名(67.1％)和女141名(32.9％)组成，年龄中位值65岁(四分位数间距59-71岁)，其中14.5％为近期吸烟者。这个群体中GDF-15水平中位值为762pg/ml，460762pg/ml和1191pg/ml，分别为第10和第90百分位数。因此，将正常上限值(ULN)化成整数1200pg/ml。NT-proBNP、CRP和肌酸酐清除率水平的中位值(四分位数间距)分别为74(46-113)pg/ml、1.40(0.79-2.40)μg/ml和73(62-86)ml/分钟。GDF-15水平与年龄(斯皮尔曼(Spearman)ρ＝0.21；P＜0.001)和炎症活性(CRP，ρ＝0.18；P＜0.001)呈正相关，与肌酸酐清除率呈负相关(ρ＝-0.14；P＝0.002)。在这个组中，与性别、近期吸烟或NT-proBNP无显著相关性。

NSTE-ACS患者入院时的GDF-15水平

NSTE-ACS患者由男1315名(63.2％)和女766名(36.8％)组成，年龄中位值66岁(四分位数间距57-74岁)。尽管患者比健康对照(P＝0.014)年纪稍大，但是两个群组就年龄和性别而言极为相当。随机化阿昔单抗治疗对在任何时间点测得的GDF-15水平都没有影响，因此，将随机分组的各组合并。表2表示这个患者群体中从症状出现到入院的时间、心血管风险因素现状、之前心血管疾病的表现和治疗、正在发生的缺血的ECG症状以及肌钙蛋白T、NT-proBNP、CRP和肌酸酐清除率的基线水平。与健康对照相比，NSTE-ACS患者显示GDF-15水平显著(P＜0.001)较高；中位值为1445pg/ml，850pg/ml、1187pg/ml、1817pg/ml和3314pg/ml分别标为第10、第33、第66和第90百分位数。因此，在健康对照中，大约2/3的NSTE-ACS患者具有超过ULN的GDF-15水平(第90百分位数)。因为该ULN对应于患者的较低三分位数，当涉及结果时，将患者资料按三分位数进行分层(截止限(cutofflimit)1200pg/ml和1800pg/ml)。

NSTE-ACS患者中GDF-15水平与临床和生化因子之间的关系

入院时，GDF-15的三分位数递增与年龄、女性、高血压史、糖尿病史、之前心脏病的表现(即心绞痛、心肌梗死)、冠状血管重建和心力衰竭、ACE抑制剂疗法呈正相关，还与正在发生的缺血和坏死的标记、心肌功能障碍、炎症(如ST段压低所表明的一样)以及肌钙蛋白T、NT-proBNP和CRP的水平呈正相关(表2)；GDF-15水平与近期吸烟和肌酸酐清除率呈负相关(表2)。在多重回归分析中，采用GDF-15的自然对数作为因变量，下列因素与GDF-15显著相关：年龄(P＜0.001)、男性(P＜0.001)、由症状出现到入院的时间(P＝0.006；反比关系)、近期吸烟(P＜0.001)、糖尿病(P＜0.001)、心力衰竭史(P＜0.001)、ST段压低(P＝0.050)、NT-proBNP(P＜0.001)、CRP(P＜0.001)和肌酸酐清除率(P＜0.001；反比关系)。没有与肌钙蛋白T水平成独立关系的因素(P＝0.436)。

表2：入院时NSTE-ACS患者按照GDF-15水平的三分位数的特征

数值为n(％)，中位值(第25和第75百分位数)或平均值±SD。^a数据得自推导群组中的216名患者和验证群组中的198名患者；^b数据得自验证群组中的207名患者；^c数据得自验证群组中的214名患者。BMI表示体重指数；LVEF，左心室射血分数；ARB，血管紧张素受体阻滞药。

NSTE-ACS患者中GDF-15水平的时间评价

在入院时以及24小时、48小时和72小时后已获得样品的NSTE-ACS群体的399名患者群组中，对不稳定冠状动脉疾病发作期间GDF-15血清水平的时间评价进行了研究。GDF-15自然对数对时间的线性回归分析揭示出低但是有统计显著性(P＝0.010)的斜率，这就表明在这一时间间隔内呈逐步增加。然而，如表3所示，这四个时间点上，GDF-15水平保持在同一范围内。个体内随时间的变化非常有限，正如入院与稍后时间点上GDF-15水平之间的密切关系所示(表3)。因此，67.4％、69.7％和70.4％患者分别在24小时、48小时和72小时具有超出ULN的GDF-15水平

表3：NSTE-ACS患者中GDF-15水平的时间评价

在399名患者的群组，测定了入院时(基线)和24小时、48小时和72小时后的GDF-15水平。计算出斯皮尔曼相关系数和P值以说明随访GDF-15水平与基线GDF-15水平的关系。通过威尔科克森符号秩检验对随访GDF-15水平与基线相比的变化进行了评价。

NSTE-ACS患者中GDF-15水平与死亡率

在随访期间，NSTE-ACS患者中死亡风险随入院时GDF-15水平的升高而显著增加(图2)。对于不同三分位数的Kaplan-Meier死亡率曲线显示早期分离，30天死亡率分别为0.6％、2.0％和4.3％(P＜0.001)。曲线分离延续到指数事件后整整一年内，在一年随访后，相应三分位数的死亡率为1.5％、5.0％和14.1％(P＜0.001)。ROC分析进一步表明比起NT-proBNP(AUC＝0.735)、肌酸酐清除率(AUC＝0.728)、CRP(AUC＝0.629)和肌钙蛋白T(AUC＝0.620)，GDF-15是死亡率的强生化指标，曲线下面积(AUC)为0.757(图3)。根据单因素逻辑斯谛回归分析，年龄、高血压史、糖尿病、之前有心绞痛或心肌梗死、充血性心力衰竭史以及肌钙蛋白T、NT-proBNP、CRP、肌酸酐清除率和GDF-15的水平全都与一年死亡率有关(表4)。采用多因素逻辑斯谛回归法，年龄、之前有心肌梗死以及NT-proBNP和GDF-15水平升高表现为仅有的独立预测因子(表4)。在这些独立的风险指标中，GDF-15水平表现为最强的死亡预测因子(表4)。当采用向后逐步法(backwardstepwiseapproach)或GDF-15水平分层和三分位数的其它生物标记时，结果都不会发生改变。同样当在逐步筛选中一次加1(单位)时，保留显著性的仅有的变量是年龄、之前有心肌梗死、NT-proBNP和GDF-15。值得注意的是，在399名患者的群组中，入院时或在稍后时间点测得的GDF-15水平在一年死亡率方面提供类似的预后信息，尽管似乎最初24小时内的GDF-15水平具有最高的可预测价值(表5)。

表4：2081名NSTE-ACS患者中有关基线特征、病史和入院时测定值的一年死亡率的逻辑斯谛回归分析

¹是；²为自然对数值中的一个单位，因为在分析前变量肌钙蛋白T、NT-proBNP、CRP和GDF-15被转换成其自然对数；³为1ml/分钟变化。

表5：基线和随访时GDF三分位数作为一年死亡率的预测因子

在399名患者群组中，入院时(基线)和24小时、48小时和72小时后测得的GDF-15水平。在每个时间点上，按照GDF-15水平的三分位数对患者进行分层。提供了按照GDF-15三分位数的一年死亡数(％)。^*Cochran-Armit年龄趋势检验。

NSTE-ACS患者中GDF-15水平与复发性心肌梗死风险

入院时GDF-15水平与30天死亡或复发性心肌梗死的复合终点风险高度相关。随着GDF-15的三分位数升高，30天死亡或心肌梗死的风险分别为5.0％、6.9％和10.8％(P＜0.001)。这一关联性主要是由GDF-15与死亡率的相关性驱动的。虽然，在指数事件后30天内再发心肌梗死的风险与GDF-15的三分位数升高显著相关，比率分别为4.8％、5.6％和7.2％(P＝0.048)，但是根据多因素逻辑斯谛回归分析，GDF-15与30天复发性心肌梗死率之间不存在独立关系。

NSTE-ACS患者中GDF-15与预后标记的组合

多因素逻辑斯谛回归分析表明，GDF-15和NT-proBNP是仅有的对于死亡率具有独立预后重要性的生物标记。因此，将这些标记的三分位数结合起来，并且另外使用死亡率、之前有心肌梗死的独立临床预测因子。结果表明，GDF-15的三分位数递增与NT-proBNP水平的组合提供了额外的预后信息，并鉴定出一年死亡率的患者层，其中在之前无心肌梗死史的患者中范围为0.3％至13.7％，在之前有心肌梗死的患者中范围为4.7％至23.6％(图4)。这些关系仅仅通过患者年龄而得到进一步修正，对于年龄每长一岁死亡风险便有4.4％的相对变化(表4)。

实施例3：慢性心力衰竭患者中GDF-15的预后效用

在4个欧洲中心即雅典(希腊，n＝51)、伦敦(英国，n＝89)和弗罗茨瓦夫/扎布热(波兰，n＝95)招募的235名CHF患者的群组(推导群组)中，对GDF-15水平与临床和生化基线参数及存活进行了初步研究。在验证群组中，我们前瞻性评价了得自推导群组(即为CHF患者提供独立的预后信息的GDF-15循环水平升高)的原则性假设。验证群组包括在维罗纳(意大利)招募的220名CHF患者。所有患者都参与了设计用来研究慢性心力衰竭中新的神经激素和炎症预后生物标记的计划，并且提交了书面知情同意书。在所有患者中，CHF的诊断是基于症状和临床表现以及经放射性核素或侵入性心室造影术或超声心动描记术获得的左心室增大或收缩期功能受损的证据。所有患者的CHF史都至少有6个月，在研究前至少4周内经药物治疗后达到稳定。排除了过去12周内的心肌梗死、已知炎症性疾病或恶性疾病、或者肌酸酐水平＞400μmol/L的患者。所有参与研究地方的机构伦理委员会都批准了该方案。

通过门诊评价和电话联系对患者进行了随访。在2005年5月25日检查了推导群组的存活状态，在2006年5月31日检查了验证群组的存活状态。无患者失访。研究的最初终点为全因死亡率。在验证群组中，也可获得有关死亡原因的信息。经检查，进行心脏移植的9名患者在事件时间点上存活。

以半卧位休息≥10分钟后，抽出静脉血样用于评价GDF-15和其它参数。正如最近所公开一样，采用GDF-15亲和层析法纯化的多克隆山羊抗人GDF-15IgG抗体(得自R&DSystems)(AF957)，通过免疫放射分析(IRMA)测定了GDF-15浓度。所有GDF-15测定值由汉诺威医学院(HannoverMedicalSchool)的研究人员进行，研究人员不了解患者特征和结果。通过化学发光免疫测定法(ELICIA，RocheDiagnostics)测定了NT-proBNP水平。在参与该研究的研究中心进行了肌酸酐、尿酸和血红蛋白的测定。根据Cockcroft和Gault公式计算出肌酸酐清除率。

合适的话，基线特征用中位值(第25和第75百分位数)、平均值±标准偏差或绝对数和百分比表示。科尔莫戈罗夫-斯米尔诺夫(Kolmogorov-Smirnov)检验用来检验各连续变量的正态分布。通过曼恩-惠特尼(Mann-Withney)检验或不配对斯图登t检验对各连续变量进行了比较。患者层之间的比较通过Kruskal-Wallis检验或ANOVA进行。比例用卡方(χ²)检验进行比较。多重回归分析用来鉴定与GDF-15水平独立相关的因子。单变量和多变量Cox比例风险分析用来评价预后相关性。Kaplan-Meier曲线用来说明在随访期间GDF-15水平有关事件的时间选择，用Cox回归分析进行了统计学评价。对于GDF-15、肌酸酐、尿酸、血红蛋白和NT-proBNP的预后值的其它比较，绘制了接收者工作特征(ROC)曲线，计算出曲线下面积(AUC)。运用StatView5.0.1或MedCalc8.2.0.3(ROC分析)统计程序之一进行了所有数据的分析。

推导群组由235名患者组成，中位值年龄66岁(第25和第75百分位数，56-72)。患者的临床和生化特征概括于表6中。中位值GDF-15水平为2240(1232-4010)ng/L。大约3/4的患者(75.3％)的GDF-15水平超过明显健康的老年受治疗者的正常上限值(ULN)1200ng/L。GDF-15水平与NYHA功能级别密切相关：NYHAI：850(646-1747)ng/L、NYHAII：1621(1025-2563)ng/L、NYHAIII：2510(1385-3686)ng/L、NYHAIV：4869(2722-8807)ng/L(趋势P＜0.001)。因为推导群组中ULN相当于较低的四分位数边界，所以将患者按四分位数(截止限1200ng/L、2200ng/L和4000ng/L)分层以进行进一步分析。推导群组中235名患者有68(28.9％)在随访期间死亡。12个月死亡率和18个月死亡率分别为15.0％(95％CI，10.3-19.7)和22.9％(95％CI，16.5-29.3)。随访期间死亡风险随GDF-15的四分位数升高而显著增加(图5A)。按相应的四分位数，12个月死亡率为2.0％、8.7％、10.5％和37.5％，18个月死亡率为2.0％、23.8％、19.1％和45.6％(P＜0.001)。

验证群组由220名患者组成，中位值年龄63岁(58-69)。验证群组中患者症状较轻(NYHA级别)，表现出较低的NT-proBNP水平，更常用ACE抑制剂或血管紧张素受体阻滞药、β-阻滞药或利尿药治疗，但是与推导群组相比，具有相似的年龄、性别分布、体重指数、心力衰竭病因、LVEF、肾功能、尿酸和血红蛋白水平(表6)。中位值GDF-15水平为1465(1004-2194)ng/L，这显著低于推导群组(表6)；验证群组中60.5％的患者表现出GDF-15水平超过ULN。在验证群组中，GDF-15水平与NYHA功能级别密切相关：NYHAI：1106(849-1682)ng/L，NYHAII：1294(1007-1945)ng/L，NYHAIII：1903(1122-2650)ng/L，NYHAIV：4147(1971-5905)ng/L(趋势P＜0.001)。

表6：患者特征

数值为n(％)、中位值(第25和第75百分位数)或平均值±SD。^a推导群组中的数据得自216名患者，验证群组中的得自198名患者；^b验证群组中的数据得自207名患者；^c验证群组中的数据得自214名患者。BMI表示体重指数；LVEF，左心室射血分数；ARB，血管紧张素受体阻滞药。

验证群组中，220名患者中有49名(22.3％)在随访期间死亡。12个月死亡率、18个月死亡率和60个月死亡率分别为4.6％(95％CI，1.9-7.3)、6.9％(95％CI，3.6-10.2)和18.6％(95％CI，13.3-23.9)。采用在推导群组确立的截止限，GDF-15水平的升高与全因死亡率密切相关(图5B)。在GDF-15水平≤1200ng/L、介于1201ng/L和2200ng/L之间、介于2201ng/L和4000ng/L之间和＞4000ng/L的患者中，12个月死亡率分别为3.5％、3.8％、8.0％和6.3％，18个月为5.9％、3.8％、10.7％和26.3％，60个月10.7％、16.2％、27.2％和53.1％(P＜0.001)。与生存者相比，因进行性心力衰竭死亡的患者以及猝死患者两者的GDF-15水平显著较高(表7)。

表7：全因死亡率的多变量Cox回归分析

表中显示了95％置信区间(CI)的危险比(HR)和P值。肌酸酐、尿酸、NT-proBNP和GDF-15不是正态分布的，因此在分析前被转换成其自然对数；危险比是指这些变量的自然对数尺度增加的一个单位。Hb表示血红蛋白。

CHF患者中，若干临床特征和生化参数表示预后不良，单变量Cox回归分析证实了在两个患者群组确定的这些标记的效用(图6，A和B)。在两个群组中，高龄、NYHA级别较高、LVEF降低、肌酸酐清除率较低以及肌酸酐和NT-proBNP水平升高全都与死亡风险增加相关。尿酸水平升高、体重指数降低和血红蛋白浓度降低仅仅在推导群组中预测了全因死亡率。与图5中所示数据一致，在两个群组中，较高的GDF-15水平与死亡率显著增加有关。通过多变量Cox回归分析，在推导群组和验证群组中，GDF-15和LVEF表现为全因死亡率的仅有的独立预测因子(表7)。对于GDF-15作为连续变量，所获得的结果没有发生改变。在合并的资料中，GDF-15(P＜0.001)连同LVEF(P＜0.001)和年龄(P＝0.003)一起表现为独立预测因子。当模型中包括体重指数和肌酸酐清除率(数据得自408名患者)时，GDF-15(P＜0.001)连同LVEF(P＜0.001)和肌酸酐清除率(P＝0.045)一起独立预测出全因死亡率。ROC曲线分析进一步表明，GDF-15是死亡率的强生化指标，曲线下面积(AUC)为0.830(95％CI，0.783-0.870)，这与NT-proBNP的AUC(0.852；95％CI，0.806-0.890)没有显著不同(P＝0.523)，但是即显著(P＜0.001)大于以下指标的AUC：肌酸酐(0.646；95％CI，0.589-0.700)、尿酸(0.657；95％CI，0.598-0.708)和血红蛋白(0.655；95％CI，0.598-0.708)。在合并的患者群体中，预测18个月死亡率的最佳GDF-15水平为2729ng/L(灵敏度81.1％；特异性71.2％；阳性概率比2.81)。另外的ROC曲线分析表明，2729ng/L也是预测12个月后死亡率的最佳截止值(数据未显示)。

实施例4：肺栓塞患者中GDF-15的预后效用

按照上述实施例中所述方法，在123名患有急性肺栓塞的患者群组中，对血清样品中GDF-15的量进行了测定。与健康个体比较，患有肺栓塞的患者表现出GDF-15的中位值水平显著升高(2,196pg/ml；百分位25.-75.：1,333-3,457pg/ml)(p＜0.001)。准确地讲，82％(n＝101)的GDF-15水平超出正常上限值1,200pg/ml。发生严重并发症(需要插管法、给予儿茶酚胺或心肺复苏)或取样后30天内死亡的患者(n＝17)显示出血清水平中位值高达6,039pg/ml，百分位25.-75.为2,778-19,722pg/ml，而无并发症的患者的血清水平中位值为2,036pg/ml，百分位25.-75.为1,279pg/ml至3,176pg/ml(p＜0.001)。数据评价表明，超出4,600pg/ml的GDF-15水平表示发生并发症或死亡的风险增加10倍(即风险从5.0％增加至52.2％；p＜0.001)；参见图7(A)。6个月内，死亡风险继续增加高达7.7倍(n＝22)；参见图7(B)。

Claims

1.生长分化因子15(GDF-15)或用于测定GDF-15的量的工具在制备用于鉴定对侵入性心脏介入敏感的患有心血管并发症的受治疗者的诊断组合物中的用途，所述患有心血管并发症的受治疗者是患有急性心血管事件的受治疗者。