ES2275513T3 - Propiedades neuroprotectoras de gdf-15, un miembro de la superfamilia de tgf-beta. - Google Patents
Propiedades neuroprotectoras de gdf-15, un miembro de la superfamilia de tgf-beta. Download PDFInfo
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Abstract
Uso de un ácido nucleico que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de aminoácidos primaria de una proteína que comprende al menos la secuencia de aminoácidos primaria mostrada en la figura 7B, la secuencia de aminoácidos primaria mostrada en la figura 8B, o los residuos de aminoácidos 14 a 111 de la secuencia mostrada en la figura 8B o un fragmento de las mismas funcionalmente activo que tiene al menos un efecto neurotrófico sobre las neuronas dopaminérgicas o un homólogo de las mismas funcionalmente activo que tiene sustituciones de aminoácidos conservativas y que tiene al menos un efecto neurotrófico sobre las neuronas dopaminérgicas o un vector que contiene al menos el ácido nucleico o una proteína codificada por el ácido nucleico, opcionalmente en combinación con un vehículo y/o diluyente farmacéuticamente aceptable, en la fabricación de una composición farmacéutica para la prevención y/o el tratamiento de trastornos neurodegenerativos en mamíferos.
Description
Propiedades neuroprotectoras de
GDF-15, un miembro de la superfamilia de
TGF-\beta.
La presente invención se refiere al uso de un
ácido nucleico que contiene una secuencia de nucleótidos que
codifica para la secuencia de aminoácidos primaria de una proteína,
por ejemplo una proteína similar al TGF-\beta
(factor de crecimiento transformante de tipo beta), que se deriva
por ejemplo de neuronas y células gliales, o un fragmento
funcionalmente activo de las mismas que tiene al menos un efecto
neurotrófico sobre las neuronas dopaminérgicas o un homólogo
funcionalmente activo de las mismas que tienen sustituciones de
aminoácidos conservativas y que tienen al menos un efecto
neurotrófico sobre las neuronas dopaminérgicas, opcionalmente en
combinación con un vehículo y/o diluyente farmacéuticamente
aceptable, en la fabricación de una composición farmacéutica para
la prevención y/o el tratamiento de trastornos neurodegenerativos en
mamíferos o de un kit de diagnóstico para la detección de dichos
trastornos.
Los miembros de la superfamilia de
TGF-\beta se conocen por sus importantes
implicaciones multifuncionales en el desarrollo y el mantenimiento,
tales como la organización del plan corporal, la regulación de la
proliferación celular, la diferenciación y la supervivencia
celular. La superfamilia de TGF-\beta todavía en
expansión, incluye las isoformas 1 a 5 de
TGF-\beta, activinas, inhibinas, proteínas
morfogenéticas óseas (BMP), factores de crecimiento/diferenciación
(GDF), sustancia inhibidora mülleriana, complejo del gen
decapentaplégico de Drosophila, el gen Vg-1
de Xenopus, y una subfamilia creciente de factores de
crecimiento derivados de una línea celular glial (GDNF), y
proteínas relacionadas. Todos los miembros de las superfamilia de
TGF-\beta comparten varias estructuras homólogas.
Se sintetizan como moléculas precursoras grandes que contienen un
pro-dominio biológicamente inactivo que puede
secretarse como un complejo con la parte
carboxi-terminal madura. Además, las proteínas
bioactivas maduras se generan por proteolisis usando un sitio de
escisión característico. De forma más notable, los segmentos
carboxi-terminal maduros contienen un nudo de
cisteínas ("cysteine knot") altamente conservado.
Bootcov et al. (Bootcov MR. et
al., MIC-1, a novel macrophage inhibitory
cytokine, is a divergent member of the TGF-\beta
superfamily, Proc., Natl., Acad. Sci. USA, Vol. 94, págs.
11514-11519, Oct. de 1997) describe la
identificación y expresión de una citocina-1
inhibidora de macrófagos (MIC-1) novedosa designada
como citocina de la superfamilia del factor de crecimiento
transformante \beta (TGF-\beta). Además, el
documento WO 97/00958 se refiere a una citocina similar a
TGF-\beta novedosa y a moléculas de polinucleótido
aisladas que codifican para esta proteína. Además el documento WO
98/11224 se refiere a una proteína recombinante que comprende la
secuencia de aminoácidos de GF-2H maduro que inhibe
de forma selectiva la proliferación de células de cáncer de próstata
independientes de andrógenos cuando se ponen en contacto con
ellas.
Como las proteínas similares a
TGF-\beta están también implicadas en la
regulación de la proliferación de células madre neuronales, y el
mantenimiento de las neuronas, hay una gran demanda de miembros
novedosos de esta familia de proteínas.
En consecuencia, el problema técnico que subyace
a la presente invención es proporcionar compuestos novedosos
relacionados con las proteínas similares a
TGF-\beta que tienen actividades neurotróficas que
son adecuadas para el tratamiento y el diagnóstico de trastornos
neurodegenerativos.
La solución del problema técnico antes
mencionado se logra proporcionando las realizaciones según se
caracterizan en las reivindicaciones.
En particular, la presente invención se refiere
al uso de un ácido nucleico que contiene una secuencia de
nucleótidos que codifica para la secuencia de aminoácidos primaria
de una proteína que comprende al menos la secuencia de aminoácidos
primaria mostrada en la figura 7B,la secuencia de aminoácidos
primaria mostrada en la figura 8B, o los residuos de aminoácido 14
a 111 de la secuencia mostrada en la figura 8B, por ejemplo una
proteína similar a TGF-\beta, que se deriva por
ejemplo de neuronas y células gliales, o un fragmento funcionalmente
activo de las mismas que tiene al menos un efecto neurotrófico
sobre las neuronas dopaminérgicas o un homólogo funcionalmente
activo de las mismas que tiene sustituciones de aminoácidos
conservativas y que tiene al menos un efecto neurotrófico sobre las
neuronas dopaminérgicas o un vector que contiene al menos el ácido
nucleico o una proteína codificada por el ácido nucleico,
opcionalmente en combinación con un vehículo y/o diluyente
farmacéuticamente aceptable, en la fabricación de una composición
farmacéutica para la prevención y/o el tratamiento de trastornos
neurodegenerativos en mamíferos.
Los términos "ácido nucleico" y
"secuencia de nucleótidos" se refieren a las moléculas de
ácidos nucleicos expresadas de forma endógena, semisintéticas,
sintéticas o modificadas químicamente, que consisten preferiblemente
de forma sustancial en desoxirribonucleótidos y/o ribonucleótidos
y/o nucleótidos modificados. Además, el término "secuencia de
nucleótidos" puede comprender exones, en los que la secuencia de
nucleótidos codifica para la secuencia de aminoácidos primaria y
puede ser degenerada basado en el código genético. El término
"secuencia de aminoácidos primaria" se refiere a la secuencia
de aminoácidos independientemente de la estructura terciaria y
cuaternaria de la proteína.
El término "proteína similar a
TGF-\beta" se refiere a proteínas que muestran
las características de la superfamilia de
TGF-\beta, especialmente un motivo conservado rico
en cisteínas, y comprende tanto moléculas precursoras grandes que
contienen el pro-dominio así como las proteínas
bioactivas maduras que se generan por la proteolisis usando un
sitio de escisión característico.
Los términos "derivado funcionalmente
activo" y "parte funcionalmente activa" se refieren a un
compuesto proteico que muestra al menos un efecto neurotrófico
sobre las neuronas dopaminérgicas. La forma funcionalmente activa
de la proteína anteriormente definida puede ser una forma
monomérica, dimérica y/u oligomérica, así como una forma
heterooligomérica, por ejemplo un heterodímero, que comprende al
menos dos monómeros diferentes de las proteínas similares a
TGF-\beta que tienen actividad neurotrófica.
La expresión "derivados de neuronas y células
gliales" significa que el gen que codifica para la proteína se
transcribe y/o se traduce en neuronas y células gliales tales como
células de Purkinje y astrositos de manera que el ARNm y/o la
proteína puede detectarse por métodos conocidos en la técnica tal
como la hibridación in situ, PCR-RT, o las
inmunotransferencias de tipo Northern o Western.
La expresión "efecto neurotrófico sobre las
neuronas dopaminérgicas" se refiere a una actividad proteica que
puede conferir, por sí misma o en combinación con otros factores, la
supervivencia y diferenciación en las neuronas dopaminérgicas
dentro del intervalo nanomolar o inferior.
En una realización preferida del uso
anteriormente definido, las neuronas y células gliales son de origen
mamífero, por ejemplo humano, de ratón o rata.
En una realización preferida adicional, la
proteína protege frente a acontecimientos neurodegenerativos. Tales
acontecimientos neurodegenerativos pueden estar mediados, por
ejemplo, por daño oxidativo, daño por radicales libres, mediadores
o ejecutores de programas de muerte neuronal tales como caspasas,
miembros pro y anti-apoptóticos de la familia de
bcl-2. Un daño por radicales tóxicos puede estar
mediado por el hierro, por ejemplo por los iones Fe, NO y otros
donadores de radicales. Por lo tanto, el ácido nucleico según se ha
definido anteriormente codifica para una proteína similar a
TGF-\beta que puede proteger las neuronas
dopaminérgicas frente a la intoxicación por hierro, que se ha
sugerido que produce la enfermedad de Parkinson (EP).
En una realización preferida adicional, el ácido
nucleico usado según la presente invención comprende al menos la
secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 7A o la secuencia de
nucleótidos mostrada en la figura 8A o los nucleótidos 40 a 333 de
la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 8A o los mutantes
de tales ácidos nucleicos que conducen a la expresión de
polipéptidos funcionalmente activos. Ejemplos de tales mutaciones
incluyen deleciones, inserciones y sustituciones de uno o más
nucleótidos tales como mutaciones que conducen a sustituciones de
aminoácidos conservativas, por ejemplo mutaciones en el intervalo de
nucleótidos 40 a 333 de la secuencia de nucleótidos mostrada en la
figura 8A, es decir la región de la secuencia de nucleótidos que
codifica para la región del nudo de 7 cisteínas que está altamente
conservado en las proteínas similares a
TGF-\beta.
Un objeto adicional de la presente invención se
refiere a un vector que contiene al menos el ácido nucleico según
se ha definido anteriormente. El término "vector" se refiere a
un replicón de ADN y/o ARN que puede usarse para la amplificación
y/o expresión de la secuencia de nucleótidos definida anteriormente.
El vector puede contener cualquier unidad de control útil tal como
promotores, potenciadores u otros tramos de secuencia dentro de las
regiones en 5' de la secuencia que sirven para el control de su
expresión. El vector puede contener adicionalmente secuencias
dentro de la región en 5' y/o 3' de la secuencia de nucleótidos, que
codifican para secuencias de aminoácidos tales como una cola de His
que son útiles para la detección y/o el aislamiento de la proteína
codificada por la secuencia de nucleótidos. Además, el vector puede
contener elementos de secuencia dentro de la región en 5' y/o 3' de
la secuencia de nucleótidos que codifica para las secuencias de
aminoácidos que sirven para dirigir la proteína codificada por la
secuencia de nucleótidos hacia los tejidos nerviosos y/o para la
penetración en la barrera hemato-encefálica. Los
ejemplos de vectores adecuados son los vectores de baculovirus.
El ácido nucleico o el vector usado según la
presente invención pueden estar alojados en un organismo huésped.
El término "organismo huésped" comprende un virus, una bacteria
tal como Escherichia coli, un hongo, una planta, un mamífero
no humano o un insecto, o partes de los mismos tales como células,
por ejemplo células sf9.
Puede también lograrse una modulación de la
actividad funcional de la proteína usada según la presente invención
alternado la expresión de la secuencia de nucleótidos del ácido
nucleico definido anteriormente si se compara con el nivel de
expresión en una célula normal. Por ejemplo, puede usarse para
inhibir la expresión un ácido nucleico antisentido que enmascare al
ARNm o una ribozima que escinda el ARNm. De forma alternativa, puede
influirse en la eficacia del promotor que regula la expresión de la
secuencia de nucleótidos del ácido nucleico definido
anteriormente.
anteriormente.
Pueden producirse el ácido nucleico, el vector,
o la proteína usada según se ha definido anteriormente, mediante un
método, por ejemplo, que comprende las etapas de:
(a) cultivar un organismo huésped en un medio
adecuado en condiciones adecuadas; y
(b) aislar el producto deseado del medio y/o los
organismos huéspedes.
Una realización preferida del método para la
producción de la proteína usada según la presente invención, usa
bacterias tales como E. coli como el organismo huésped. La
expresión de la proteína puede conducir entonces a una forma
funcionalmente inactiva, por ejemplo de agregados amorfos dentro de
la bacteria conocida en la técnica como "cuerpos de
inclusión". Por lo tanto, el método puede comprender de forma
adicional etapas que sirvan para el replegamiento y/o la
modificación de la proteína aislada en una forma funcionalmente
activa que puede ser una forma monomérica, dimérica u oligomérica.
En particular, éste puede ser un método para la producción de la
forma dimérica biológicamente activa de la proteína según se ha
definido anteriormente, GDF-15 preferiblemente, a
partir de su forma desnaturalizada o no nativa de otra manera. Este
resultado se logra mediante el hallazgo inesperado de que se
obtienen cantidades considerables de los productos diméricos
deseados sometiendo a la forma monomérica de la proteína usada
según la presente invención a condiciones de replegamiento. Por lo
tanto, la presente invención se refiere también al uso de
GDF-15 dimérico biológicamente activo que se ha
producido mediante el método anteriormente definido.
Una realización preferida de la presente
invención se refiere al uso del ácido nucleico o del vector o de la
proteína, o del anticuerpo, o del antagonista o del agonista según
se ha definido anteriormente, opcionalmente en combinación con un
vehículo y/o diluyente farmacéuticamente activo en la fabricación de
una composición farmacéutica. Puede usarse la composición
farmacéutica para la prevención y/o el tratamiento de trastornos
neurodegenerativos en mamíferos, preferiblemente en seres humanos.
Además pueden diseñarse técnicas terapéuticas para el tratamiento
de trastornos que se asocian con la expresión de la secuencia de
nucleótidos del ácido nucleico según la presente invención usando
los agentes antes mencionados que pueden regular la expresión de la
secuencia de nucleótidos del ácido nucleico anteriormente definido,
por ejemplo ácidos nucleicos antisentido, ribozimas y agentes para
influir en la actividad promotora. Los trastornos neurodegenerativos
son preferiblemente trastornos neurológicos y psicológicos agudos
y/o crónicos, y pueden estar producidos por accidente
cerebrovascular, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer u
otras demencias, infecciones del SNC y trastornos psiquiátricos
asociados con las alteraciones en los sistemas transmisores del SNC
tales como la depresión y la esquizofrenia.
En una realización preferida adicional, la
composición farmacéutica según la presente invención comprende de
forma adicional, además del ácido nucleico o del vector o de la
proteína o del anticuerpo o del antagonista o del agonista según se
ha definido anteriormente, uno o más agentes que tienen actividad
neurotrófica. Agentes preferidos son, por ejemplo citocinas, o
derivados funcionalmente activos o partes de los mismos. Las
citocinas preferidas usadas en la composición farmacéutica según la
presente invención pueden seleccionarse del grupo que consiste en
GDF tal como GDF-5, GDF-6,
GDF-7, GDF-8 y
GDF-9, GDNF, TGF tal como
TGF-\alpha o TGF-\beta, por
ejemplo TGF-\beta1, TGF-\beta2
o TGF-\beta3, activina A, BMP tal como
BMP-2, BMP-4, BMP-6,
o BMP-7, BMP-11,
BMP-12, BDNF, NGF, neurotrofinas tales como
NT-3 o NT-4, EGF, CNTF y FGF tal
como FGF-2. El término "GDNF" incluye GDNF,
neurturina y persefina.
Un objeto adicional de la presente invención se
refiere al uso del ácido nucleico, el vector, la proteína y/o el
anticuerpo según se ha definido anteriormente, en la fabricación de
un kit de diagnóstico para la detección de trastornos
neurodegenerativos y/o infecciones del SNC tales como meningitis,
por ejemplo una meningitis bacteriana, en mamíferos,
preferiblemente seres humanos. Ejemplos de otros trastornos
neurodegenerativos son según se ha definido anteriormente.
Las figuras muestran:
Figura 1 Localización de GDF-15
en el SNC. (A) Imagen fotográfica de una hibridación in situ
de un plexo coroideo de rata adulta realizada con sondas de ARN
antisentido 5 específicas de GDF15. (B) Imagen fotográfica de un
análisis de inmunotransferencia de líquido cefalorraquídeo humano
(LCR) en condiciones reductoras con un antisuero de
GDF-15 purificado. (C) RT-PCR de
diferentes regiones de cerebro de rata PO (protuberancia, bulbo
raquídeo, corteza, hipocampo, cuerpo estriado) ganglios de la raíz
dorsal (GRD), astrocitos primarios cultivados (astr.), línea
celular oligodendroglial OLI-neu (OLI), y
progenitores oligodendrogliales (O-2A). (D) Análisis
de inmunotransferencia en condiciones nativas de las zonas del
cerebro y células correspondientes de (c) con antisuero de
GDF-15 purificado.
Figura 2 Imagen de un análisis de
inmunotransferencia de tipo Western de GDF-15 en LCR
humano en condiciones reductoras. Marcadores de peso molecular
(St). Muestra de LCR de un paciente con meningitis bacteriana
(carril 1). Muestra de LCR de un paciente control (carril 2).
Figura 3 Representación gráfica de experimentos
que muestran el efecto de supervivencia de GDF-15 en
cultivos de neuronas mesencefálicas. Número de neuronas
inmunorreactivas a tirosina hidroxilasa (TH) supervivientes de
cultivos mesencefálicos (E15/DIV7) tratados sólo con medio
(control), lisado purificado de células Sf9 no infectadas (control
de baculovirus), GDF-15 (0,01 a 1 ng/ml) purificado
a partir de de lisado de células sf9 infectadas y GDNF (10 ng/ml).
Los datos se facilitan como la media \pm EEM (n = 3). Los valores
de P derivados de la prueba de la t de Student son ***P < 0,001,
**P < 0,01 para un aumento de la supervivencia en comparación
con cultivos control.
Figura 4 Efecto protector de
GDF-15 en cultivos tratados con Fe^{2+} (100
\muM). (A) Representación gráfica del número de neuronas
inmunorreactivas a TH supervivientes de cultivos mesencefálicos
(E15/DIV7) tratados con o sin Fe^{2+} en medio sólo (control), en
presencia de NT-4 (10 ng/ml), y en presencia de
GDF-15 (10 ng/ml). (B) Representación gráfica del
porcentaje de neuronas inmunorreactivas a TH supervivientes de
cultivos mesencefálicos (E15/DIV7) tratados con Fe^{2+} en medio
sólo (control), en presencia de NT-4 (10 ng/ml), y
en presencia de GDF-15 (10 ng/ml). Los valores de
los cultivos sin adición de hierro se fijan como el 100%. Los datos
se facilitan como la media \pm EEM (n = 3), los valores de P
derivados de la prueba de la t de Student son * P < 0.05 para un
aumento de la supervivencia en comparación con cultivos control.
Figura 5 Efectos neurotróficos in vivo de
GDF-15. (A) Representación gráfica de los datos de
rotación inducida por anfetaminas de ratas con lesiones por
6-OHDA (6-hidroxidopamina)
unilaterales. Se monitorizaron las rotaciones por minuto durante 60
min. comenzando 5 min. tras la administración de anfetaminas (5
mg/kg i.p.). (B) Representación gráfica de los recuentos de
neuronas positivas para TH en SNpc. Los valores se facilitan cono el
porcentaje de neuronas positivas para TH del lado lesionado en
comparación con el lado no lesionado. Los datos se facilitan como
la media +/- EEM (n = 4). Los valores de P derivados de la prueba de
la t de Student son *P < 0,05, **P < 0,01, ***P
< 0,001.
< 0,001.
Figura 6 Señalización de GDF-15
a través de proteínas Smad. (A) Representación gráfica de
experimentos que demuestran la activación del elemento de unión a
Smad (SBE, "Smad Binding Element") por
TGF-\beta1 y GDF-15 en células
hFob transfectadas de manera transitoria. (B)Representación
gráfica de experimentos que muestran que el promotor
PAI-1 que se activa exclusivamente por
TGF-\beta1 a \beta3 en células MLEC
transfectadas estables no responde a GDF-15.
Figura 7 (A) ADNc y (B) secuencia de aminoácidos
correspondiente de
pre-pro-GDF-15
maduro humano. Los nucleótidos y los aminoácidos se abrevian según
los códigos internacionales de una letra.
Figura 8 (A) ADNc y (B) secuencia de aminoácidos
correspondiente de GDF-15 maduro humano.
El siguiente ejemplo no limitante ilustra la
invención:
Ejemplo
Usando el motivo de nudo de cisteínas conservado
de las proteínas similares a TGF-\beta, un enfoque
combinado que empleaba RT-PCR y selección de una
biblioteca reveló la secuencia de ADNc de longitud completa de un
miembro novedoso de la superfamilia de TGF-\beta
derivado de neuronas. El ADNc tiene la secuencia mostrada en la
figura 7A correspondiente a la secuencia de aminoácidos mostrada en
la figura 7B.
Según un posible codón de iniciación de la
traducción alternativo que está situado a 39 nucleótidos en sentido
5' desde el primer nucleótido de la secuencia mostrada en la figura
7A, la proteína correspondiente también puede comprender 13
aminoácidos adicionales (MPGQELRTLNGSQ) N-terminales
con respecto a la secuencia mostrada en la figura 7B.
La proteína, que se denomina
GDF-15, se expresó de manera recombinante usando el
sistema de baculovirus. Además, se ha desarrollado un anticuerpo
contra un péptido específico derivado de la secuencia
C-terminal murina y de rata (HRTDSGVSLQTYDDL).
Debido a la alta homología de la región correspondiente de la
secuencia humana (QKTDTGVSLQTYDDL), este anticuerpo reconoce además
GDF-15 humano.
Se realizaron la hibridación in situ con
sondas de ARN antisentido de GDF-15,
RT-PCR así como análisis de inmunotransferencia de
tipo Western para estudiar la distribución de GDF-15
en el SNC (figura 1). La hibridación in situ reveló señales
en las neuronas, especialmente células de Purkinje, in el cerebelo,
y una fuerte expresión en el plexo coroideo (figura 1 A) de ratas
recién nacidas y adultas. La RT-PCR e
inmunotransferencia de tipo Western de muestras tomadas de
diferentes regiones de cerebros y sistema nervioso periférico de
ratas recién nacidas y adultas extendieron estos resultados
detectando ARNm y proteína en la protuberancia, bulbo raquídeo,
mesencéfalo, cuerpo estriado, hipocampo, corteza, y ganglios de la
raíz dorsal (figura 1C, D). Los niveles superiores de expresión de
ARNm se encontraron en el plexo coroideo (figura 1 A). Se usaron
anticuerpos que se prepararon contra el péptido
C-terminal anterior para inmunotransferencias de
tipo Western. El análisis de muestras de diferentes zonas del
cerebro de ratas recién nacidas reveló una banda diferenciada a 31
kDa (figura 1D). La masa relativa de GDF-15 celular
corresponde bien con el peso molecular teórico de 31 kDa de la
pro-proteína.
Ya que GDF-15 es abundante en el
plexo coroideo, también se sometió a prueba la presencia de la
proteína en LCR de sujetos humanos sanos así como pacientes con
diferentes trastornos neurológicos. Al contrario que la proteína
intracelular detectada en muestras de cerebro, las muestras de LCR
revelaron una única banda a aproximadamente 12 kDa en condiciones
reductoras, lo que representa la parte madura secretada de
GDF-15. Se observaron cantidades superiores de
proteína en LCR en pacientes con meningitis bacteriana (figura 2).
Tomados juntos, estos datos proporcionan evidencias de que
GDF-15, un miembro novedoso de la superfamilia de
TGF-\beta, se expresa ampliamente en diversas
regiones del SNC incluyendo el LCR y sistema nervioso periférico.
Además, GDF-15 aumenta significativamente en el LCR
de pacientes con enfermedad neurológica inflamatoria, lo que
proporciona la oportunidad de emplear anticuerpos contra
GDF-15 como herramientas de diagnóstico en la
enfermedad neurológica.
Se disuelven 2 \mug de proteína
GDF-15 monomérica (por ejemplo, producida en
bacterias tales como E. coli) en 2917,7 \mul de tampón de
solubilización (NaCl 1 M, Tris-HCl 50 mM, EDTA 50
mM, pH 9,5). A la proteína así disuelta, se le añade lo siguiente
(dando como resultado un volumen total de 3580 \mul):
35,8 \mul de glutatión oxidado (GSSG) 100
mM
35,8 \mul de glutatión reducido (GSH) 200
mM
590,7 \mul de CHAPS
(1-propanosulfonato de
3-[(colamidopropil)-dimetilamino])
Tras la incubación a de 20 a 22ºC durante 48 h,
más del 80%, normalmente el 90%, de la proteína monomérica se
repliega para dar el producto dimérico deseado. La separación del
dímero se realiza mediante métodos cromatográficos habituales tales
como HPLC en fase inversa.
\vskip1.000000\baselineskip
Usando el sistema de baculovirus, se expresó la
parte madura de la proteína GDF-15 recombinante
humana en células Sf9. Sin embargo, se obtienen los mismos
resultados en todos los estudios funcionales cuando se usa
GDF-15 recombinante humano expresado en bacterias
que se ha renaturalizado mediante el método de replegamiento
descrito anteriormente. La inmunotransferencia de tipo Western
mostró la forma monomérica o dimérica de la proteína recombinante
en condiciones reductoras y no reductoras, respectivamente. Tras la
purificación, se sometió la proteína a prueba para determinar sus
efectos de supervivencia sobre neuronas dopaminérgicas del
mesencéfalo embrionario de ratas. La adición de
GDF-15 recombinante a cultivos de células de
mesencéfalo E14 aumentó el número de neuronas positivas para
tirosina hidroxilasa (TH) supervivientes tras 7 días in vitro
comparado con cultivos control (figura 3). El efecto
dopaminotrófico de GDF-15 es comparable a la
actividad promotora de la supervivencia documentada de otros
miembros de la superfamilia de TGF-\beta y la
familia de la neutrofina (por ejemplo, TGF-\beta,
miembros de la subfamilia de GDNF, o BDNF). El análisis de cultivos
de mesencéfalo usando inmunocitoquímica y anticuerpos contra la
proteína de los filamentos intermedios específicos de astrocitos
GFAP y ensayos para determinar la proliferación celular
proporcionaron evidencias de que la aplicación de
GDF-15 no ejerció su efecto promotor de la
supervivencia mediante el aumento de manera numérica de las células
y la estimulación de la maduración de astrocitos, una fuente bien
establecida de factores neurotróficos. Esto proporciona evidencias
de que GDF-15 afecta a las neuronas dopaminérgicas
directamente en vez de indirectamente, tal como se muestra para
FGF-2 o las
BMP.
BMP.
Con el fin de investigar si
GDF-15 también puede proteger a las neuronas
dopaminérgicas frente a una posible causa de EP, es decir,
intoxicación por hierro, se examinaron sus efectos sobre neuronas
mesencefálicas intoxicadas por hierro (figura 4A, B). La exposición
de cultivos a hierro (Fe^{2+}) provocó una reducción del 80% en
la supervivencia neuronal comparado con cultivos control sin tratar.
Las pérdidas celulares se redujeron hasta el 50% cuando se trataron
conjuntamente los cultivos con Fe^{2+} y GDF-15.
Estos datos sugieren fuertemente que GDF-15 protege
a las neuronas dopaminérgicas frente al daño mediado por hierro
(oxidativo). Los datos también apoyan el uso de
GDF-15 como agente para prevenir o ralentizar los
acontecimientos neurodegenerativos medados por radicales libres,
estrés oxidativo, mediadores y ejecutores de programas de muerte
neuronal.
Además, se estableció que GDF-15
también protege a las neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo
lesionadas in vivo. Se lesionó el sistema nigroestriado de
ratas adultas mediante una inyección unilateral de
6-hidroxidopamina (6-OHDA) justo
por encima de la sustancia negra (SN) izquierda. Los resultados de
estos experimentos se muestran en las tablas 1A y B,
respectivamente. Los datos mostrados en la tabla 1B también se
representan gráficamente en la figura 5A.
\newpage
A: Rotaciones por minuto durante 60 min.
comenzando 5 min. tras la administración de anfetaminas (5 mg/kg
i.p.)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
B: Valores medios
Todas las ratas presentaron las características
típicas de la exposición a anfetaminas, tales como estereotipia y
piloerección. Las ratas que se habían tratado con
6-OHDA sólo mostraron tasas de rotación de 11,0
\pm 1,41 (media \pm DE), lo que indica al menos un 95% de
depleción de la ruta nigroestriada (Ungerstedt et al. (1970),
Brain. Res., 24, 485-493). En cambio, las ratas que
también se trataron con GDF-15 rotaron a tasas muy
bajas (0,75 \pm 0,83), lo que muestra que esta proteína previno
eficazmente la depleción inducida por 6-OHDA de la
dopamina en el cuerpo estriado izquierdo; véase también la figura
5A.
Además, con el fin de confirmar que la
prevención anterior de la depleción de la dopamina inducida por
6-OHDA en el cuerpo estriado izquierdo se debe al
efecto neuroprotector de GDF-15 sobre las neuronas
en la SN, se analizó inmunocitoquímicamente la parte compacta de la
SN (SNpc). Los recuentos de neuronas positivas para TH en la SNpc
medidos en tres niveles individuales se muestran en la tabla 2A y
los valores medios para cada rata se facilitan en la tabla 2B,
respectivamente. Los valores medios globales para las ratas tratadas
con 6-OHDA (n = 4) y para las que se trataron
conjuntamente con 6-OHDA y GDF-15 (n
= 4) se muestran en la tabla 2C. Los datos mostrados en la tabla 2C
también se representan gráficamente en la figura 5B. Los resultados
muestran que el tratamiento conjunto de las ratas con
6-OHDA y GDF-15 conduce a un aumento
de 10 veces en el recuento de neuronas positivas para TH en el
cuerpo estriado izquierdo comparado con el tratamiento con
6-OHDA solo. Por tanto, GDF-15
previene la depleción inducida por 6-OHDA de la
dopamina en el cuerpo estriado izquierdo debido a su fuerte efecto
neuroprotector sobre neuronas inmunorreactivas a TH.
\newpage
A: Recuentos de neuronas positivas a TH en la
parte compacta de la sustancia negra en tres niveles; -2,8, -3,0 y
-3,2, con respecto al bregma (según Pellegrino et al., A
stereotaxic atlas of the rat brain. Plenum Press, Nueva York,
1979)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
B: Valores medios de ratas individuales
\newpage
C: Valores medios de ratas tratadas con
6-OHDA y valores medios tras el tratamiento conjunto
con 6-OHDA más GDF-15
En resumen, los estudios in vivo
anteriores demuestran que las inyecciones de GDF-15
inmediatamente antes de 6-OHDA por encima de la SN
izquierda y dentro del ventrículo lateral izquierdo previenen el
comportamiento de rotación patológica inducido por
6-OHDA (figura 5A) y reducen significativamente las
pérdidas de neuronas de SN dopaminérgicas (figura 5B). Juntos,
estos datos muestran que GDF-15 puede emplearse
provechosamente para mejorar las consecuencias de la degeneración
nigroestriada en la enfermedad de Parkinson.
Usando el plásmido de elemento de unión a Smad
(pSBE) que se activa por TGF-\beta1,
OP-1 (también denominado BMP-7),
activina, BMP-2 y GDF-5, se trató la
siguiente cuestión en cuanto a si GDF-15 puede
inducir la transducción de señales intracelulares mediante las
proteínas Smad. La transfección transitoria de la línea celular de
osteoblastos humanos (hFob) con SBE mostró que la administración de
GDF-15 aumentó la señal de luciferasa (figura 6A).
Estos resultados demuestran que GDF-15 activa el
elemento promotor que responde a Smad del constructo de gen
indicador. En un experimento adicional, se sometió a prueba la
inducibilidad del promotor del inhibidor del activador de
plasminógeno (PAI) en células epiteliales de pulmón de visón (MLEC,
"Mink Lung Epithelial Cells") transfectadas mediante
GDF-15. El ensayo de MLEC, que es exclusivamente
sensible para TGF-\beta1, \beta2, y \beta3,
no reveló ningún efecto de GDF-15 (figura 6B). Ya
que la fosforilación de Smad2 y Smad3 está específicamente asociada
con la activación mediada por TGF-\beta de los
receptores de TGF-\beta, se concluye que
GDF-15 parece no tener señal a través de la ruta
Smad2/3. con respecto a la activación dependiente de
GDF-15 de SBE, que es un elemento de respuesta
tanto para la ruta Smad2/3, como para Smad1/5 mediada por BMP,
parece que GDF-15 ejerce sus efectos celulares
uniéndose a receptores similares a BMP.
En conclusión, se descubrió, se clonó, se
expresó y se caracterizó funcionalmente una molécula neurotrófica
novedosa derivada de células neuronales que pertenece a la
superfamilia de TGF-\beta,
GDF-15.
En el sistema nervioso, puede detectarse la
proteína y el ARNm de GDF-15, por ejemplo en el
mesencéfalo, cuerpo estriado y en la corteza, pero los niveles
superiores del ARNm y la proteína se encuentran en el plexo coroideo
y el líquido cefalorraquídeo (LCR), respectivamente. De manera
interesante, los niveles de proteína en el LCR aumentan en ciertos
trastornos neurológicos, por ejemplo en pacientes con meningitis
bacteriana. Con el fin de aclarar sus funciones, se expresó de
manera recombinante la forma madura de GDF-15 humano
usando un sistema de expresión de baculovirus. La expresión dio
como resultado la síntesis de la forma dimérica biológicamente
activa de la proteína. Los experimentos in vitro que usan
cultivos celulares disociados de neuronas del mesencéfalo de rata
embrionaria revelaron que GDF-15 puede actuar como
un factor neurotrófico para neuronas del mesencéfalo dopaminérgicas
que se degeneran en la enfermedad de Parkinson (EP).
GDF-15 también puede proteger a estas neuronas
frente a la intoxicación por hierro, lo que puede provocar la EP.
Además, pudo demostrarse que GDF-15 también muestra
su efecto neuroprotector in vivo. Con respecto a la ruta de
señalización sobre la que actúa GDF-15, se
estableció que GDF-15 puede inducir la transducción
de señales intracelulares mediante las proteínas Smad.
Por tanto, puede concluirse que
GDF-15 tiene funciones importantes en el cerebro en
desarrollo, maduro y lesionado lo que implica opciones para usar
GDF-15 para el tratamiento y el diagnóstico de
trastornos neurológicos y psicológicos agudos y crónicos, tales
como accidente cerebrovascular, enfermedad de Alzheimer y otras
demencias, y trastornos psiquiátricos asociados con alteraciones en
los sistemas transmisores del SNC.
Se anestesiaron ratas Wistar hembra adultas
usando ketamina (75 mg/kg i.p.) y xilazina (15 mg/kg i.p.) y se
colocaron en un marco estereotáxico de Kopf. Se usó
GDF-15 a una concentración final de 2 \mug/\mul
en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 10 mM, pH 7,4.
Cuatro ratas recibieron inyecciones de 20 \mug de
GDF-15 justo por encima de la sustancia negra (SN)
izquierda y 20 \mug de GDF-15 dentro del
ventrículo lateral (VL) izquierdo. Esto estuvo seguido
inmediatamente por una inyección de bromhidrato de
6-hidroxidopamina (8 \mug como base libre en 4
\mul de solución salina al 0,9% con ácido ascórbico al 0,1%)
dentro del haz prosencefálico medial (MFB) izquierdo. Cuatro ratas
adicionales sólo recibieron 6-OHDA. Las coordenadas
estereotáxicas (Pellegrino et al. A stereotaxic atlas of the
rat brain. Plenum Press, Nueva York, 1979) fueron las siguientes: AP
-3,0, LV + 2,5, DV -8,5 para la SN; AP + 1,0, LV + 1,2, DV -3,5
para el VL; AP -2,2, LV + 1,5, DV -7,9 para el MFB. Se sometieron
todas las ratas a prueba en relación al comportamiento a los siete
días tras la cirugía. Se contaron las rotaciones ipsolaterales a lo
largo de un periodo de 60 min. comenzando 5 min. tras la
administración de sulfato de (+)-anfetamina (5
mg/kg, i.p.). A los diez días tras la cirugía, se anestesiaron de
manera terminal las ratas con cloroformo/éter y se les perfundió
por vía intracardiaca 200 ml de solución salina tamponada con
fosfato (PBS) 0,1 M fría, pH 7,4, que contiene 500 unidades de
heparina, seguido de 300 ml de paraformaldehído al 4% en PBS recién
preparado. Se extrajeron los cerebros y se colocaron en
paraformaldehído al 4% en PBS durante la noche, se crioprotegieron
en sacarosa al 30% en PBS y luego se congelaron. Se cortaron
criosecciones coronarias de 30 \mum en serie a través de la parte
compacta de la SN (SNpc) y se tiñeron inmunocitoquímicamente para
determinar la tirosina hidroxilasa (TH). Se incubaron secciones en
disolución de bloqueo (suero de cabra normal al 3%, Triton
X-100 al 0,2% en PBS) durante la noche a 4ºC, luego
en una disolución 1:2000 de antisuero de conejo contra TH (Affiniti
Labs, RU) en disolución de bloqueo durante la noche a 4ºC. Se
lavaron las secciones cinco veces con PBS que contiene Triton
X-100 al 0,02%, luego se incubaron en una disolución
de peroxidasa del rábano unida a IgG anti-conejo
1:1000 (Vector Labs) durante la noche a 4ºC. Tras lavarlas tal como
anteriormente, se visualizó la inmunotinción de TH usando
3,3'-diaminobencidina como cromógeno. Se montaron
las secciones sobre portaobjetos gelatinizados, se deshidrataron en
alcohol, se aclararon en xileno y se montaron en DePeX®
(Bioproducts, Heidelberg, Alemania). Se contaron las neuronas
inmunorreactivas a TH en la SNpc en ambos lados del cerebro en cada
uno de los tres niveles; -2,8, -3,0, -3,2, con respecto al bregma
(Pellegrino et al., 1979).
<110> Biopharm Gesellschaft zur
biotechnologischen ...
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Propiedades neuroprotectoras de
GDF-15, un miembro novedoso de la superfamilia de
TGF-\beta
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> B 1991
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> Documento PCT/EP00/04445
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
16-05-2000
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> Documento EP 99 109 714.8
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
17-05-1999
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> Documento EP 99 114 853.7
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
29-07-1999
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 888
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 339
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 295
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 112
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Pro Gly Gln Glu Leu Arg Thr Leu Asn Gly
Ser Gln}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido derivado de la secuencia
C-terminal murina y de rata de
GDF-15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Arg Thr Asp Ser Gly Val Ser Leu Gln Thr
Tyr Asp Asp Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El péptido corresponde a los
aminoácidos 273 a 287 de
pre-pro-GDF-15
maduro humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr
Tyr Asp Asp Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (22)
1. Uso de un ácido nucleico que contiene una
secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de
aminoácidos primaria de una proteína que comprende al menos la
secuencia de aminoácidos primaria mostrada en la figura 7B, la
secuencia de aminoácidos primaria mostrada en la figura 8B, o los
residuos de aminoácidos 14 a 111 de la secuencia mostrada en la
figura 8B o un fragmento de las mismas funcionalmente activo que
tiene al menos un efecto neurotrófico sobre las neuronas
dopaminérgicas o un homólogo de las mismas funcionalmente activo
que tiene sustituciones de aminoácidos conservativas y que tiene al
menos un efecto neurotrófico sobre las neuronas dopaminérgicas o un
vector que contiene al menos el ácido nucleico o una proteína
codificada por el ácido nucleico, opcionalmente en combinación con
un vehículo y/o diluyente farmacéuticamente aceptable, en la
fabricación de una composición farmacéutica para la prevención y/o
el tratamiento de trastornos neurodegenerativos en mamíferos.
2. Uso según la reivindicación 1, en el que la
proteína o derivado funcionalmente activo o parte de los mismos
según la reivindicación 1, es un monómero, dímero, oligómero o
heterooligómero.
3. Uso según la reivindicación 1 ó 2, en el que
la proteína según la reivindicación 1, protege frente a
acontecimientos neurodegenerativos.
4. Uso según la reivindicación 3, en el que el
acontecimiento neurodegenerativo está mediado por daño oxidativo
y/o daño por radicales libres y/o mediadores y/o ejecutores de
programas de muerte neuronal.
5. Uso según la reivindicación 4, en el que los
mediadores del daño por radicales libres se seleccionan del grupo
que consiste en hierro, donadores de NO, y otros donadores de
radicales libres, y los mediadores y ejecutores de programas de
muerte neuronal se seleccionan del grupo que consiste en caspasas y
miembros pro y anti-apoptóticos de la familia de
bcl-2.
6. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que el ácido nucleico comprende al
menos la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 7A o la
secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 8A o los nucleótidos
40 a 333 de la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 8A o
mutantes de las mismas que tienen una deleción, inserción y/o
sustitución de un nucleótido, conduciendo dichos mutantes a la
expresión de un polipéptido funcional que tiene al menos un efecto
neurotrófico sobre las neuronas dopaminérgicas.
7. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que la proteína codificada por el
ácido nucleico comprende al menos la secuencia de aminoácidos
primaria mostrada en la figura 7B o la secuencia de aminoácidos
primaria mostrada en la figura 8B o los residuos de aminoácidos 14 a
111 de la secuencia mostrada en la figura 8B así como homólogos de
las mismas que tiene sustituciones de aminoácidos conservativas.
8. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que el mamífero es un ser humano.
9. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que los trastornos neurodegenerativos
se seleccionan del grupo de trastornos neurológicos y psicológicos
agudos y/o crónicos.
10. Uso según la reivindicación 9, en el que los
trastornos neurológicos y psicológicos están producidos por
accidente cerebrovascular, enfermedad de Parkinson, enfermedad de
Alzheimer u otras demencias, infecciones del SNC y trastornos
psiquiátricos asociados con alteraciones en los sistemas
transmisores del SNC.
11. Uso según la reivindicación 10, en el que
los trastornos psiquiátricos se seleccionan del grupo que consiste
en depresión y esquizofrenia.
12. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, que comprende además uno o más agentes que
tienen actividad neurotrófica o derivados funcionalmente activos o
partes de los mismos.
13. Uso según la reivindicación 12, en el que el
agente es una citocina.
14. Uso según la reivindicación 13, en el que la
citocina se selecciona del grupo que consiste en GDF, GDNF, TGF,
activinas, BMP, BDNF, NGF, EGF, CNTF y FGF.
15. Uso de un ácido nucleico que contiene una
secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de
aminoácidos primaria de una proteína que comprende al menos la
secuencia de aminoácidos primaria mostrada en la figura 7B, la
secuencia de aminoácidos primaria mostrada en la figura 8B, o los
residuos de aminoácidos 14 a 111 de la secuencia mostrada en la
figura 8B o un fragmento de las mismas funcionalmente activo que
tiene al menos un efecto neurotrófico sobre las neuronas
dopaminérgicas o un homólogo de las mismas funcionalmente activo
que tiene sustituciones de aminoácidos conservativas y que tiene al
menos un efecto neurotrófico sobre las neuronas dopaminérgicas y/o
un vector que contiene al menos el ácido nucleico y/o una proteína
codificada por el ácido nucleico y/o un anticuerpo o un fragmento
funcional del mismo dirigido contra la proteína, para la
fabricación de un kit de diagnóstico para la detección de trastornos
neurodegenerativos en mamíferos.
16. Uso según la reivindicación 15, en el que la
proteína o un derivado funcionalmente activo o parte de la misma
según la reivindicación 15, es un monómero, dímero, oligómero o
heterooligómero.
17. Uso según la reivindicación 15 ó 16, en el
que la proteína según la reivindicación 15, protege frente a
acontecimientos neurodegenerativos.
18. Uso según la reivindicación 17, en el que el
acontecimiento neurodegenerativo está mediado por daño oxidativo
y/o daño por daño por radicales libres y/o mediadores y/o ejecutores
de programas de muerte neuronal.
19. Uso según la reivindicación 18, en el que
los mediadores del daño por radicales libres se seleccionan del
grupo que consiste en hierro, donadores de NO, y otros donadores de
radicales libres, y los mediadores y ejecutores de programas de
muerte neuronal se seleccionan del grupo que consiste en caspasas y
miembros pro y anti-apoptóticos de la familia de
bcl-2.
20. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 15 a 19, en el que el ácido nucleico comprende al
menos la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 7A o la
secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 8A o los nucleótidos
40 a 333 de la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 8A o
mutantes de las mismas que tienen una deleción, inserción y/o
sustitución de un nucleótido, conduciendo dichos mutantes a la
expresión de un polipéptido funcional que tiene al menos un efecto
neurotrófico sobre las neuronas dopaminérgicas.
21. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 15 a 20, en el que la proteína codificada por el
ácido nucleico comprende al menos la secuencia de aminoácidos
primaria mostrada en la figura 7B o la secuencia de aminoácidos
primaria mostrada en la figura 8B o los residuos de aminoácidos 14 a
111 de la secuencia mostrada en la figura 8B así como homólogos de
las mismas que tienen sustituciones de aminoácidos
conservativas.
22. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 19 a 21, en el que el mamífero es un ser
humano.
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