CN114891086B - 一种生物素标记的gdf15的复性方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种生物素标记的GDF15的制备方法，通过使用该方法能够提供了一种具有生物素标记的的GDF15靶点蛋白。
Description
技术领域
本发明提供了一种蛋白。
背景技术
生长分化因子15(growth differentiation factor 15，GDF15)是一种内分泌激素，是转化生长因子β(transforming growth factor β，TGFβ)超家族成员，与胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line derived neurotrophic factor，GDNF)家族受体α样(GDNF-family receptor α-like，GFRAL)-转染重排(rearranged during transfection，RET)异源二聚体受体结合而发挥作用。
GDF15作为肥胖、糖尿病、肿瘤、非酒精性脂肪性肝病、缺血性疾病等的生物标志物已成为新药研发的新靶点。目前，世界各制药企业均开展了以GDF15为全新治疗靶点的药物研究，涉及肥胖、肿瘤及厌食综合征等诸多领域。
在对该靶点进行体外研究时，需要不同标签和标记来进行体外研究，目前，市场上只有HIS和Fc标签的GDF15，但在药物研发过程中需要做blocking等实验，这时便需要除HIS和Fc以外的一个标签蛋白GDF15，或者在做噬菌体展示时，用SA磁珠去抓获生物素标记蛋白，这时便需要生物素标记的GDF15靶点蛋白。但是，目前市场上并无生物素标记的GDF15靶点蛋白。
发明内容
本发明旨在克服上述缺陷，提供了一种生物素标记的GDF15靶点蛋白的制备方法。从而为该靶点蛋白的相关的抗体药研发过程或筛选中提供便利。
本发明提供了一种生物素标记的GDF15的制备方法，其特征在于：通过生物素连接酶在微变性条件下，将生物素连接在含Avi tag的GDF15上，来完成对GDF15的生物素标记；
其中，包含三次变复性过程。
进一步地，本发明提供的一种生物素标记的GDF15的制备方法，其特征还在于：
第一次变性为：His-Avi tag的GDF15的菌体依次经菌体破碎、包涵体洗涤、包涵体变性增溶、包涵体纯化后获得高纯度蛋白；
第一次复性为：采用的是稀释复性工艺；
第二次变性为：用亲和层析回收时，又对蛋白进行了一次变性后，对其进行纯化获得高纯度的二聚体形式的蛋白；
第二次复性为：采用的是透析复性工艺；
第三次变性为：对生物素标记后的蛋白，经变性回收、纯化后获得高纯度的生物素标记好的蛋白；
第三次复性为：采用的是透析复性工艺。
进一步地，本发明提供的一种生物素标记的GDF15的制备方法，其特征还在于：
生物素标记的过程，基于第二次复性实现后进行；
上述生物素标记的方法为：在微变性条件下进行定点生物素标记。
进一步地，本发明提供的一种生物素标记的GDF15的制备方法，其特征还在于：
生物素标记的具体方法为：在1-3M的尿素条件下，向蛋白中加入生物素，ATP，生物素连接酶，在pH4.5±0.5的条件下混合均匀，于0-10℃反应过夜。
进一步地，本发明提供的一种生物素标记的GDF15的制备方法，其特征还在于：
上述生物素与蛋白的摩尔比为8-20：1。
进一步地，本发明提供的一种生物素标记的GDF15的制备方法，其特征还在于：
上述蛋白与生物素连接酶的质量比为10-25：1。
进一步地，本发明提供的一种生物素标记的GDF15的制备方法，其特征还在于：
上述ATP与蛋白的摩尔比为1-3：1。
进一步地，本发明提供的一种生物素标记的GDF15的制备方法，其特征还在于：
上述的三次变复性过程具体如下：
S1.第一次变性：
S1-1.向His-Avi tag的GDF15的菌体种加入破菌液，经溶解、超声裂解、离心后，弃上清；
S1-2.用包涵体洗涤液加入S1-1的沉淀中，经超声、离心后，弃上清；
S1-3.用破菌液加入S1-2的沉淀中，经超声、离心后，弃上清；
S1-4.用变性剂和还原剂对S1-3的沉淀进行重悬，室温搅拌过夜，经离心后，取上清留用；
S1-5.在变性条件下，对蛋白进行分离纯化，纯度在90％以上的蛋白；
S2.第一次复性：为稀释复性；
上述稀释复性的条件如下：
缓冲液的条件：pH在8.2-9.0；
离子强度：10-250mM NaCl；
Sucrose浓度：0-0.44M；
Arginine浓度：250-700mM；
GSH或半胱氨酸：1-3mM；
GSSG或胱氨酸：2-10mM；
EDTA：0.1-2mM；
Tris:20-50mM；
0-10℃预冷后，边搅拌边滴加纯化后的包涵体，将蛋白最终浓度控制在0.01-0.08mg/ml内，滴加完毕后，继续搅拌10-20min后，静置放置于0-10℃，3-7天，让蛋白缓慢折叠；
S3.第二次变性：
S3-1.用亲和层析回收时，又对蛋白进行了一次变性，但不破坏复性时形成的二硫键，只用变性剂(如：尿素、Gua-HCl等，其用量一般为使最终浓度为5-15M)使蛋白质分子内部的疏水残基伸展和溶解性增加，从而减少蛋白在回收时的损失，提高回收率；
S3.2.在变性剂(如：尿素、Gua-HCl等，其用量一般为使最终浓度为5-15M)的条件下，对回收后的复性蛋白，用凝胶过滤层析柱Superdex75等方式将二聚体与单体分离，得到纯度较好的二聚体形式的蛋白；
S4.第二次复性：
梯度去除变性剂的pH为：4.0-5.0；
梯度去除变性剂的浓度依次为：7-5M，5-3M，3-1M，每次浓度差为1-2M；
S5.第三次变性：
向反应混合液中补加变性剂和盐离子(如：氯化钠等)，利用亲和层析分离生物素连接酶和多余的生物素，以得到生物素标记好的蛋白；
S6.第三次复性：
梯度去除变性剂的pH为：3.0±0.5；
梯度去除变性剂的浓度依次为：3-1M，0M直至蛋白的终保存体系(如：50mM HAc,pH2.9等条件)。
进一步地，本发明提供的一种生物素标记的GDF15的制备方法，其特征还在于：
在S1-1中，上述His-Avi tag的GDF15的菌体与破菌液的比例为1：5-20/W:V(g/ml)；
在S1-1中，超声条件为：200-600W超声0.5-4s停1-10S，工作循环1-200次；
在S1-1中，离心条件为：6000-8000r/min，15-30min；
在S1-2中，上述S1-1沉淀与包涵体洗涤液的比例为1：5-20/W:V；
在S1-2中，超声条件为：100-300W超声0.5-4s停1-10S，工作循环1-200次；
在S1-2中，离心条件为：6000-8000r/min，15-30min；
在S1-3中，上述S1-2沉淀与破菌液的比例为1：5-20/W:V；
在S1-3中，超声条件为：100-300W超声0.5-4s停1-10S，工作循环1-200次；
在S1-3中，离心条件为：6000-8000r/min，15-30min；
在S1-4中，上述S1-3沉淀与变性液的比例为1：5-20/W:V；
在S1-4中，离心条件为：12000-18000r/min，0-10℃，15-60min。
关于亲和层析回收，在本发明中可选Ni亲和层析工艺、或膜包浓缩；
关于破菌液，在本发明中可选20-50mM Tris或者PB,50-500mM NaCl,5-10％glycerol,pH7.0-8.0等；
关于包涵体洗涤液，在本发明中可选20-50mM Tris或者PB,10-50mM NaCl,1-5mMEDTA,0.1-1％Triton100,pH7.0-8.0；
关于变性液，一般包含变性剂和还原剂；
其中，变性剂在本发明中可选尿素和盐酸胍等；
关于还原剂，在本发明中可选DTT和巯基乙醇，TCEP等。
本发明的作用和效果：
考虑到，对于HIS标签的GDF15蛋白是E.coli表达系统得到蛋白，且经过蛋白的变性和复性，让蛋白正确折叠才得到的二聚体形式的蛋白，本身就是一难题，本发明在此基础上又进一步对该蛋白进行定点生物素标记，是一种少见的方式，而得到的蛋白即解决了市场对生物素标记的GDF15靶点蛋白的需求，又满足新药研发过程中实验的需求。
本发明中方法的特别之处在于三次变性和三次复性，三次变性中分别进行不同程度的变性，其对应的复性方式也不同，过程中用稀释复性和透析复性方式进行组合。
附图说明
图1.PAGE检测结果；
图2.WB检测结果；
图3.Elisa活性检测结果；
图4.本实施例第一次复性结果。
具体实施方式
经本发明的研究发现，GDF15在E.coli中表达的蛋白以包涵体的形式沉积于细胞内,表现为无活性的不溶性聚集物。包涵体内的蛋白是非折叠状态的聚集体，不具有生物学活性，因此，要获得具有生物学活性的蛋白质必须将包涵体用变形剂变性，将包涵体溶解，释放出其中的蛋白质，然后通过控制缓冲液的pH、温度、变形剂的初始浓度浓度和去除速度、氧化还原电势、离子强度、共溶剂和其他添加剂等使变性蛋白重新折叠完成对蛋白质的复性。
此外，在本发明中，生物素标记是通过生物素连接酶在微变性条件下将生物素连接在含Avi tag的GDF15上，来完成对GDF15的生物素标记。
具体的过程和工艺步骤如下(如下工艺中包含了多种条件的选择)：
S1.第一次变性：
S1-1.向His-Avi tag的GDF15的菌体种加入破菌液，经溶解、超声裂解、离心后，弃上清；
S1-2.用包涵体洗涤液加入S1-1的沉淀中，经超声、离心后，弃上清；
S1-3.用破菌液加入S1-2的沉淀中，经超声、离心后，弃上清；
S1-4.用变性剂和还原剂对S1-3的沉淀进行重悬，室温搅拌过夜，经离心后，取上清留用；
S1-5.在变性条件下，对蛋白进行分离纯化，纯度在90％以上的蛋白；
S2.第一次复性：为稀释复性；
稀释复性的条件如下：
缓冲液的条件：pH在8.2-9.0；
离子强度：10-250mM NaCl；
Sucrose浓度：0-0.44M；
Arginine浓度：250-700mM；
GSH：1-3mM；
GSSG：2-10mM；
EDTA：0.1-2mM；
Tris:20-50mM；
0-10℃预冷后，边搅拌边滴加纯化后的包涵体，将蛋白最终浓度控制在0.01-0.1mg/ml内，滴加完毕后，继续搅拌10-20min后，静置放置于0-10℃，3-7天，让蛋白缓慢折叠；
样品准备：复性样品需要用0.45uM的膜过滤
层析柱处理：用BufferA：20mM Tris,8M Urea,pH8.5平衡NI柱，用量5-10CV
上样：处理好的样品直接上样就行了，上完样，用bufferA进行再平衡5-10CV，
洗脱：用Buffer B:20mM Tris,8M Urea,500mM imidazole，pH8.5直接洗脱约3-5CV。
S3.第二次变性：
S3-1.用亲和层析回收时，又对蛋白进行了一次变性，但不破坏复性时形成的二硫键，只用尿素使之蛋白质分子内部的疏水残基伸展和溶解性增加，从而减少蛋白在回收时的损失，提高回收率；
S3.2.在含有尿素变性剂的条件下，对回收后的复性蛋白，用凝胶过滤层析柱Superdex75将二聚体与单体分离，得到纯度较好的二聚体形式的蛋白；
具体可以为：1：NI柱富集得到的组分，加入0.1Mglycine,150mM NaCl,用HCl将PH调至2.9左右，用浓缩管或者膜包进行浓缩，再用Superdex75进行纯化，运行buffer:0.1Mglycine,150mM NaCl,8M Urea,pH2.9，峰收集二聚体组分。
S4.第二次复性：
梯度去除变性剂的pH为：4.0-5.0；
梯度去除变性剂的浓度依次为：7-5M，5-3M，3-1M，每次浓度差为1-2M；
S5.第三次变性：
向反应混合液中补加变性剂和NaCl，利用亲和层析分离生物素连接酶和多余的生物素，以得到生物素标记好的蛋白；
生物素标记的具体方法为：在1-3M的尿素条件下，向蛋白中加入生物素，ATP，生物素连接酶，在pH4.0-5.0的条件下混合均匀，于0-10℃反应过夜。
生物素与蛋白的摩尔比为8-20：1；
蛋白与生物素连接酶的质量比为10-25：1；
ATP与蛋白的摩尔比为1-3：1。
S6.第三次复性：
梯度去除变性剂的pH为：3.0±1.0；
梯度去除变性剂的浓度依次为：3-1M，0M直至蛋白的终保存体系。
其中，
在S1-1中，His-Avi tag的GDF15的菌体与破菌液的比例为1：5-20/W:V；
在S1-1中，超声条件为：100-800W超声0.5-4s停1-10S，工作循环1-200次；
在S1-1中，离心条件为：6000-8000r/min，15-30min；
在S1-2中，S1-1沉淀与包涵体洗涤液的比例为1：5-20/W:V；
在S1-2中，超声条件为：100-300W超声0.5-4s停1-10S，工作循环1-200次；
在S1-2中，离心条件为：6000-8000r/min，15-30min；
在S1-3中，S1-2沉淀与破菌液的比例为1：5-20/W:V；
在S1-3中，超声条件为：100-300W超声0.5-4s停1-10S，工作循环1-200次；
在S1-3中，离心条件为：6000-8000r/min，15-30min；
在S1-4中，S1-3沉淀与变性剂和还原剂的比例为1：5-20/W:V；
在S1-4中，离心条件为：12000-18000r/min，0-10℃，15-60min。
最优的工艺条件如下：
1变性：
菌体破碎：His-Avi tag的GDF15(Recombinant Biotinylated Human GDF15Protein is expressed from E.coli with His tag and Avi tag at the N-terminal.It contains Ala197-Ile308.[Accession|Q99988-1])的菌体根据按照1：10(W:V)的比例加入破菌液，把菌体溶解均匀，冰浴超声裂解，超声条件：400W超声2S停4S工作循环99次，6000-8000r/min离心15-30min,弃上清；
(1)包涵体洗涤：用包涵体洗涤液按照1：10的比例加入上述沉淀中，吹打均匀，超声条件：200W超声2S停4S工作循环50次，6000-8000r/min离心15-30min,弃上清；再用破菌液按照1：10的比例加入得到沉淀中，吹打均匀，超声条件：200W超声2S停4S工作循环50次，6000-8000r/min离心15-30min,弃上清；
(2)包涵体变性增溶：步骤B得到沉淀用按照1：7比例的变性剂和还原剂进行重悬，室温搅拌过夜；16000r/min4℃30min离心，取上清留用；
(3)包涵体纯化：在变性条件下，用凝胶过滤层析Superdex75根据分子量对蛋白进行分离纯化，得到蛋白的纯度在90％以上；
2.复性：
此为第一次复性，采用的是稀释复性。配制复性缓冲液：缓冲液的条件：pH在8.2-9.0之间，离子强度：10-250mM NaCl，Sucrose浓度：0-0.44M,Arginine浓度：550mM,GSH：2mM,GSSG：5mM，EDTA：1mM；Tris:20-50mM；4℃预冷后，边低速搅拌便滴加纯化后的包涵体，将蛋白最终浓度控制在0.01-0.08mg/ml内，滴加完毕后，继续搅拌10-20min后，静置放置4℃，让蛋白缓慢折叠。大约3-7days后，蛋白至少有50％形成二聚体。
3.复性回收和第二次变性：
(1)用Ni亲和层析回收时，又对蛋白进行了一次变性，但不破坏复性时形成的二硫键，只用尿素使之蛋白质分子内部的疏水残基伸展和溶解性增加，从而减少蛋白在回收时的损失，提高回收率。
(2)变性后纯化：在含有尿素变性剂的条件下，对回收后的复性蛋白，用凝胶过滤层析柱Superdex75将二聚体与单体分离，得到纯度较好的二聚体形式的蛋白；
4.第二次复性：
此步骤的复性选择透析复性，梯度去除尿素的浓度，从而达到复性的过程。具体梯度如下：8M，6M,4M,2M，pH4.0-5.0
具体方案如下：
将二聚体组分，
第一次透析至20mM NaAc,6M Urea,PH5.0，
第二次透析至20mM NaAc,4M Urea,PH5.0，
第三次透析至20mM NaAc，2M Urea,PH5.0。
5.生物素标记：本发明采用的在微变性条件下进行定点生物素标记。在2M的尿素条件下，按照所需的量向蛋白中加入生物素，ATP，生物素连接酶，PH5.0混合均匀，4℃反应过夜；
6.标记后变性回收：向反应混合液中补加至4M的尿素，和150mM的NaCl，利用NI亲和层析分离生物素连接酶和多余的生物素，以得到生物素标记好的蛋白；
7.第三次复性：此步骤的复性选择透析复性，梯度去除尿素的浓度。具体梯度如下：2M，0M,pH3.0直至蛋白的终保存体系。
8.QC检测：
a:PAGE检测纯度；
b:WB检测生物素标记效果；
c:Elisa检测其活性(检测标记后的GDF15与其配体的亲和力)。
9.QC结果：如图1-3所示。
对比方案1：
采用是实验例的变复性条件，进行一次变复性法制备。
结果：未能获得蛋白。
对比方案2：
采用是实验例的实验方法，就生物素标记过程，在中性条件下进行。
结果：未能获得蛋白。
Claims (5)
1.一种生物素标记的GDF15的制备方法，其特征在于：通过生物素连接酶在微变性条件下，将生物素连接在含Avi tag的GDF15上，来完成对GDF15的生物素标记；
其中，包含三次变复性过程；
第一次变性为：His-Avi tag的GDF15的菌体依次经菌体破碎、包涵体洗涤、包涵体变性增溶、包涵体纯化后获得高纯度蛋白；
第一次复性为：采用的是稀释复性工艺；
第二次变性为：用亲和层析回收时，又对蛋白进行了一次变性后，对其进行纯化获得高纯度的二聚体形式的蛋白；
第二次复性为：采用的是透析复性工艺；
第三次变性为：对生物素标记后的蛋白，经变性回收、纯化后获得高纯度的生物素标记好的蛋白；
第三次复性为：采用的是透析复性工艺；
生物素标记的过程，基于第二次复性实现后进行；
所述生物素标记的方法为：在微变性条件下进行定点生物素标记；
生物素标记的具体方法为：在1-3M的尿素条件下，向蛋白中加入生物素，ATP，生物素连接酶，在pH4.5±0.5的条件下混合均匀，于0-10℃反应过夜；
所述的三次变复性过程具体如下：
S1.第一次变性：
S1-1.向His-Avi tag的GDF15的菌体种加入破菌液，经溶解、超声裂解、离心后，弃上清；
S1-2.用包涵体洗涤液加入S1-1的沉淀中，经超声、离心后，弃上清；
S1-3.用破菌液加入S1-2的沉淀中，经超声、离心后，弃上清；S1-4.用变性液对S1-3的沉淀进行重悬，室温搅拌过夜，经离心后，取上清留用；
S1-5.在变性条件下，对蛋白进行分离纯化，纯度在90％以上的蛋白；
S2.第一次复性：为稀释复性；
所述稀释复性的条件如下：
缓冲液的条件：pH在8.2-9.0；
离子强度：10-250mM NaCl；
Sucrose浓度：0-0.44M；
Arginine浓度：250-700mM；
GSH或半胱氨酸：1-3mM；
GSSG或胱氨酸：2-10mM；
EDTA：0.1-2mM；
Tris:20-50mM；
0-10℃预冷后，边搅拌边滴加纯化后的包涵体，将蛋白最终浓度控制在0.01-0.08mg/ml内，滴加完毕后，继续搅拌10-20min后，静置放置于0-10℃，3-7天，让蛋白缓慢折叠；
S3.第二次变性：
S3-1.用亲和层析回收时，又对蛋白进行了一次变性，但不破坏复性时形成的二硫键，只用变性剂使蛋白质分子内部的疏水残基伸展和溶解性增加；
S3.2.在变性剂的条件下，对回收后的复性蛋白，将二聚体与单体分离，得到二聚体形式的蛋白；
S4.第二次复性：
梯度去除变性剂的pH为：4.0-5.0；
梯度去除变性剂的浓度依次为：7-5M，5-3M，3-1M，每次浓度差为1-2M；
S5.第三次变性：
向反应混合液中补加变性剂和盐离子，利用亲和层析分离生物素连接酶和多余的生物素，以得到生物素标记好的蛋白；
S6.第三次复性：
梯度去除变性剂的pH为：3.0±0.5；
梯度去除变性剂的浓度依次为：3-1M，0M直至蛋白的终保存体系。
2.如权利要求1所述的一种生物素标记的GDF15的制备方法，其特征在于：所述生物素与蛋白的摩尔比为8-20：1。
3.如权利要求1所述的一种生物素标记的GDF15的制备方法，其特征在于：所述蛋白与生物素连接酶的质量比为10-25：1。
4.如权利要求1所述的一种生物素标记的GDF15的制备方法，其特征在于：所述ATP与蛋白的摩尔比为1-3：1。
5.如权利要求1所述的一种生物素标记的GDF15的制备方法，其特征在于：在S1-1中，所述His-Avi tag的GDF15的菌体与破菌液的比例为1：5-20/W:V；在S1-1中，超声条件为：100-800W超声0.5-4s停1-10S，工作循环1-200次；在S1-1中，离心条件为：6000-8000r/min，15-30min；
在S1-2中，所述S1-1沉淀与包涵体洗涤液的比例为1：5-20/W:V；
在S1-2中，超声条件为：100-300W超声0.5-4s停1-10S，工作循环1-200次；
在S1-2中，离心条件为：6000-8000r/min，15-30min；
在S1-3中，所述S1-2沉淀与破菌液的比例为1：5-20/W:V；
在S1-3中，超声条件为：100-300W超声0.5-4s停1-10S，工作循环1-200次；
在S1-3中，离心条件为：6000-8000r/min，15-30min；
在S1-4中，所述S1-3沉淀与变性液的比例为1：5-20/W:V；
在S1-4中，离心条件为：12000-18000r/min，0-10℃，15-60min。
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