KR20080040674A

KR20080040674A - 시험관내 단백질 접힘을 위한 방법과 장치

Info

Publication number: KR20080040674A
Application number: KR1020087001587A
Authority: KR
Inventors: 리차드 세인트. 존; 제프리 루크; 투크도안 레
Original assignee: 노파르티스 아게
Priority date: 2005-07-29
Filing date: 2006-07-28
Publication date: 2008-05-08
Also published as: CA2617029A1; RU2008107150A; MX2008001396A; AU2006275800A1; CN101233152A; BRPI0614440A2; US20090054628A1; WO2007016272A1; US20070027305A1; JP2009502173A; EP1910413A1

Abstract

재접힘된 단백질을 회수하는 방법은 재접힘된 단백질을 획득하기 위한 변성된 단백질의 농축된 용액과 재접힘 희석제(refolding diluent)의 정적 혼합을 필요로 한다. 상기 방법은 대규모 용량으로 미생물에 의해 생산되는 재조합 단백질에 특히 적합하다. 상기 변성된 단백질 용액은 미생물 숙주로부터 단백질을 분리하고 이를 변성제(denaturant)에 노출시킴으로써 획득될 수 있다. 이러한 용액은 재접힘된 단백질이 가급적, 높은 수율로 신속하게 획득될 수 있도록 상기 단백질의 적절한 접힘(folding)과 융화하는 정적 혼합(static mixing) 조건 하에, 적절한 재접힘 희석제와 혼합된다. 재접힘된 단백질 회수 방법을 실행하는 장치는 정적 혼합기(static mixer), 정적 혼합기의 상류에서 직렬로 위치하는 도관(conduit), 정적 혼합기의 상류에서 도관에 이르는 입구(inlet) 및 선택적으로, 정적 혼합기의 하류에서 동적, 바람직하게는, 비-난류(non-turbulent) 혼합 용기(mixing vessel)를 보유한다. 본 발명은 단백질, 바람직하게는, 재조합 단백질의 대규모 생산에 특히 유용하다.

단백질 재접힘

Description

시험관내 단백질 접힘을 위한 방법과 장치{Method and System for In Vitro Protein Folding}

본 발명은 포괄적인 단백질 화학 분야에 관계한다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 재조합 기술에 의해 생산된 단백질을 재접힘하는 방법과 장치에 관계한다.

재조합 단백질에 대한 전형적인 상업적 생산 계획은 외래 산물, 바람직하게는, 포유동물 기원의 외래 산물을 생산하기 위한, 세포, 바람직하게는, 대장균(Eschericia coli)(E. coli)과 같은 세균 세포의 형질전환(transformation)을 필요로 한다. 단백질을 인코딩하는 유전자는 숙주 세포 내로 삽입되고, 정상적인 세포 매개된 생산을 통하여 상응하는 단백질로 번역된다. 하지만, 세균 숙주 세포는 이런 재조합 단백질을 정확하게 접힘할 수 없는데, 그 이유는 이들 세균 숙주 세포에는 정확한 접힘을 달성하기 위하여 포유동물 세포 내에 존재하는 환경과 세포소기관(organelle)이 부재하기 때문이다. 결과적으로, 세포는 접힘되지 않거나 부정확하게 접힘된 단백질의 응집체를 생산하게 된다. 높은 농도로 생산된 접힘되지 않은 단백질과 부분적으로 접힘된 단백질은 봉입체(inclusion body)로 알려져 있는 응집된 불용성 실체의 불용성 응집체를 형성하기 시작한다. 이들은 세포내 간격(periplasmic space) 내에 축적되고, 때때로, 세균 세포의 전체 단백질의 50% 이 상을 차지할 수 있다. 이러한 봉입체의 상당 부분은 목적 단백질(때때로, 90% 이상의 정제된 단백질 산출)로 구성되어 이미 상당히 정제되어 있고, 소형 분자, 숙주 세포 단백질과 핵산(nucleic acid)이 봉입체의 나머지 부분을 구성한다.

빈번하게 발생하는 오접힘(misfolding)을 고려할 때, 포유동물 세포에서보다 대장균(E. coli) 세포에서 재조합 단백질을 생산하는 이점은 세균 세포가 입수하기 용이하고, 더욱 빠르게 성장하며, 목적 단백질을 과량생산할 수 있다는 점이다. 이들은 또한, 포유동물 세포 내에서 관찰되는 특정 바이러스를 보유하지 않는다. 이런 이유로, 대장균(E. coli)으로부터 단백질을 정제하고 적절하게 재접힘하여 인간 주입을 위한 더욱 경제적이고 안전한 산물을 생산하려는 시도가 있어 왔다.

예로써, 응집체 또는 봉입체로부터 단백질을 분리한 이후, 이러한 단백질을 정제하기 위한 첫 번째 단계는 강한 염 농축물, 예를 들면, 6M 구아니딘-염산염(GuHCL) 또는 8M 요소에 이를 용해시키는 것이다. 양쪽 염은 봉입체를 결합시키는 수소 결합(hydrogen bonding)과 소수성 상호작용(hydrophobic interaction)을 파괴함으로써 단백질을 분해하고 전개시키는 무질서유발 시약(chaotropic reagen)이다(참조: Ladisch, Michael R, Bioseparations Engineering: Principles, Practice and Economics (2001) John Wiley and Sons, Inc., 118-123). 이에 더하여, 단백질의 생산 동안 부정확하게 연결된 이황화 결합을 파괴하기 위하여 환원제(reducing reagent), 예를 들면, 디티오트레이톨(dithiothreitol), 시스테인(cysteine) 또는 베타-메르캅토에탄올(beta-mecaptoethanol)이 필요할 수도 있다. 이후, 접힘되지 않은 단백질 용액은 변성제 농도를 감소시키는 재접힘 완충 제(refolding buffer)(이황화 결합 형성을 보조하는 옥시도-교체 시약(oxido-shuffling reagent) 포함 가능)로 희석 또는 투석하여, 단백질이 선천적인 화학 구조(innate chemical structure)에 따라 재접힘될 수 있도록 한다.

재접힘 단계 동안 산물 손실(product loss)의 주요 경로는 응집(aggregation)이다. 응집은 개별 단백질 사이에 인력(attractive force)이 단백질과 용질 사이에 인력보다 선호되는 경우에 발생한다. 이후, 단백질을 자연 상태(native state)로 재접힘하는데 도움을 주는 선호적인 분자내 잔기-잔기 상호작용(intramolecular residue-to-residue attraction)이 비-선호적인 분자간 인력(intermolecular attractive force)과 경쟁하여 가용성 응집체를 발생시킨다. 이후, 이들 가용성 응집체는 축적되고 불용성 응집체의 침전을 유발한다. 응집이 때때로, 가역 반응일 수 있긴 하지만, 응집체를 재접힘하는 시도는 바람직하지 않은데, 그 이유는 이런 시도가 생산 시간과 비용을 증가시키기 때문이다. 이런 이유로, 앞서 응집되거나 집적된 단백질은 일단 용해되면, 일반적으로, 추가적인 응집을 피해야 한다.

현재에도, 단백질 재접힘과 응집의 상세한 기전은 복잡하고, 여전히 논쟁되고 있다. 재접힘은 1 단계로 진행되지 않는 것으로 알려져 있다; 대신에, 단백질은 변성제가 제거됨에 따라서, 개별적인 형태 변화(conformational change)를 추종한다. 접힘되지 않은 상태와 접힘된 상태 사이에 중간 형태에서, 재접힘, 응집 또는 오접힘(산물 손실의 다른 경로)의 경로가 경쟁한다. 환경 조건 및 단백질의 선천적인 화학 구조는 재접힘 동안 어떤 경쟁 경로가 우세할 지를 결정하는데 보조적인 역할을 한다.

단백질-용질 혼합물의 단백질 농도, 변성제 농도, 국소 온도(localized temperature)를 비롯한 환경 조건을 변화시킴으로써, 재접힘 동안 응집을 피하려는 시도가 있어 왔다. 가령, 응집 반응의 동역학은 단백질 농도와 관련하여 재접힘 반응보다 높은 순위인 것으로 밝혀졌다(Kiefhaber, T., Rudolph, R., Kohler, H.-H., Buchner, J. “Protein Aggregation in vivo: A Quantitative Model of the Kinetic Competition Between Folding and Aggregation.” Bio/Technology, 1991, 9, 825-829). 이런 이유로, 재접힘은 종종, 용해도 한계(solubility limit)에 비례하는 희석 조건 하에 수행된다. 이런 조건 하에서는 분자가 서로 접촉하게 되는 기회 및 유인(attraction)의 가능성이 감소한다.

실험적으로, 단백질은 중간 변성제 농도에서 재접힘 동안 응집하는 경향을 나타낸다. 중간 형태에서, 단백질은 앞서 기술된 바와 같이, 소수성 잔기(hydrophobic residue)에서 응집하는 잠재력을 가진 부위가 노출될 수도 있다. 이후, 변성제가 너무 느리게 제거되거나 감소되면, 재접힘이 실패할 수도 있다.

부가적으로, 단백질에 대한 열적 스트레스(thermal stress)는 재접힘 동안 단백질 응집의 가능성을 증가시킨다. 여러 단백질에서 이러한 응집 반응이 낮은 온도에서 억제되긴 하지만, 더욱 높은 온도에서 재접힘하는 것으로 보고된 다른 단백질의 경우에는 응집이 중요한 경로가 아닐 수도 있다. 이러한 재접힘/응집 행태의 기전은 아직 결정적으로 확립되지 않았다. 이는 단백질 사이에 비극성 표면(nonpolar surface)의 차폐(shielding)를 수반하는 소수성 힘(hydrophobic force)의 온도 의존(temperature dependence)(참조: Baldwin, R.L. Temperature dependance of the hydrophobic interaction in protein folding. Proc . Natl . Acad . Sci ., 1986, 83, 8069-8072) 또는 응집 성향의 중간물질에 대한 다른 별개의 경로에 기인할 수 있다.

재접힘 동안 응집에 관하여 공지된 것으로부터, 농축된 물질은 높은 단백질 농도, 변성제 농도, 온도의 국소 부위를 예방하기 위하여 희석 완충제와의 신속한 혼합을 필요로 한다. 현재의 실험 절차는 농축된 형태의 용해된 단백질과 희석 완충제를 신속하게 혼합하기 위하여, 조절되지 않는(unbaffled) 탱크 내에서 경사진 칼날 임펠러(pitched blade impeller)의 이용을 필요로 한다. 이러한 유형의 동적 혼합기(dynamic mixer)는 강력한 혼합(vigorous mixing)을 위하여 업계에서 가장 일반적으로 이용되는 장치이다. 상기 혼합기는 초기에, 희석 완충제 내에서 와류(vortex)를 유도하기 위하여 격렬한 속도(turbulent speed)로 교반하도록 설정된다. 이후, 점적기(dropper)가 와류, 또는 직접적으로, 임펠러를 조준하고, 농축된 단백질 용액을 천천히 전달한다.

하지만, 기계적 혼합기의 대형화는 어려운 과제인 것으로 확인되었다. 연구를 통하여, 혼합이 격렬하지 않는 낮은 교반 속도에서는 고립된 혼합 구역(mixing region)이 형성되는 것으로 밝혀졌다(Makino, T., Ohmura, H., Kataoka, K. Observation of Isolated Mixing Regions in a Stirred Vessel. Journal of Chemical Engineering of Japan, 2001, 34 (5), 574-578). 이들 구역 내에서, 단백질은 앞서 기술된 바와 같이, 지나치게 농축되고 응집의 위험이 있다. 이후, 상 기 용액은 재접힘 동안 고립된 혼합 구역을 예방하기 위하여 매우 격렬한 속도로 교반된다. 하지만, 칼날의 뒷날(trailing edge) 주변에 아음속 펄스(subsonic pulse)와 국소적인 캐비테이션(localized cavitation)에 기인한 임펠러로부터 다량의 전단 스트레스(shear stress)를 고려할 때, 단백질은 처리 규모가 확대됨에 따라서 더욱 많은 기계적 변성 스트레스(mechanical denaturing stress)를 받게 된다(참조: Fennema, OR. 1996.Food Chemistry. 3rd Edition.Dekker, Inc., New York. Chapter 6). 더 나아가, 높은 교반 속도는 장치 내로 높은 동력 입력(power input)을 발생시켜, 동력 손실(power dissipation)을 통한 가능한 열적 변성 스트레스(thermal denaturing stress)를 단백질에 유발한다.

단백질, 특히, 재조합 단백질의 대규모 생산을 위한, 향상된 혼합 계획을 비롯한 향상된 단백질 재접힘 공정이 바람직할 것이다.

본 발명의 요약

본 발명에서는 변성된 단백질의 농축된 용액과 재접힘 희석제를 정적으로 혼합하여 재접힘된 단백질을 포함하는 혼합물을 획득하는, 단백질 재접힘 방법을 제시함으로써 이들 요구를 충족한다. 이러한 방법은 대규모 처리 용량, 예를 들면, 30ℓ 또는 그 이상, 가령, 최대 200ℓ 내지 1000ℓ 또는 심지어 10,000ℓ로, 미생물에 의해 생산되는 재조합 단백질에 특히 적합하다. 변성된 단백질 용액은 미생물 숙주로부터 단백질을 분리하고 이들을 변성제에 노출함으로써 획득될 수 있다. 상기 용액은 생물학적 활성을 갖는 재접힘된 단백질이 높은 수율로 신속하게 획득될 수 있도록 상기 단백질의 적절한 접힘(folding)과 융화하는 정적 혼합(static mixing) 조건 하에, 적절한 재접힘 희석제와 혼합된다. 본 발명은 단백질, 바람직하게는, 재조합 단백질의 대규모 생산에 특히 유용하다.

또한, 본 발명에서는 본 발명의 단백질 재접힘 방법을 실행하는데 적합한 장치를 제시한다. 상기 장치는 정적 혼합기(static mixer), 정적 혼합기의 상류에서 직렬로 위치하는 도관(conduit), 정적 혼합기의 상류에서 도관에 이르는 입구(inlet) 및 정적 혼합기의 하류에서 낮은 전단 동적 혼합 용기(dynamic mixing vessel)를 보유한다. 작업 시에, 재접힘 희석제의 공급원은 정적 혼합기의 상류에서 도관으로 전달되고, 농축된 변성된 단백질의 공급원은 정적 혼합기의 상류에서 입구를 통하여 도관으로 전달된다. 정적 혼합이후, 용액은 처리 수율(process yield)을 최적화시키는 기간 동안, 낮은 전단 동적 혼합 용기 내에 유지된다. 정적 혼합기는 도관 내에 일련의 혼합 요소(mixing element)를 보유한다. 이들 혼합 요소는 고정되거나 이동가능하지만, 무동력(즉, 정적)이고 이들 위에서 액체 유동(liquid flow)의 움직임만으로 혼합 작용(mixing action)을 제공한다.

첨부된 도면과 함께 본 발명의 아래의 상세한 설명을 참조하면, 본 발명의 이와 같은 측면과 특징은 더욱 명확해질 것이다.

도 1은 본 발명에 이용되는 정적 혼합기의 주요 특징(feature)을 도시하는 단순화된 개요도(schematic diagram)이다.

도 2는 본 발명에 따른, 변성된 단백질의 용액으로부터 재접힘된 단백질을 회수하는 장치의 주요 특징을 도시하는 블록 다이어그램(block diagram)이다.

도 3은 본 발명에 따른, 변성된 단백질의 용액으로부터 재접힘된 단백질을 회수하는 방법을 도시하는 흐름도(flow diagram)이다.

도 4A는 용액 내에서 변성제 농도 vs. 접힘되지 않은 단백질의 분획(fraction)을 나타내는 도면이다.

도 4B는 동적 혼합(dynamic mixing)과 정적 혼합(static mixing)에서, 시간 vs. 혼성 단백질의 분획(혼성 행태(mixing behavior)와 비율)을 나타내는 도면이다.

도 5는 하기 실시예 2에 기술된 실험의 결과를 도해하는, 시간 vs. 활성%의 도면이다.

본 발명의 방법과 장치는 여러 구체예를 참조하여 기술된다. 이들 기술된 구체예의 중요한 특성과 특징은 본문에서 구조적으로 예시된다. 본 발명은 이들 구체예와 관련하여 기술되긴 하지만, 이들 구체예에 한정되지 않는다. 반대로, 본 발명은 첨부된 특허청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 기술적 사상과 범위 내에 포함되는 대안, 개변, 등가물을 포괄한다. 아래의 상세한 설명에서 다수의 특이적인 상세는 본 발명의 완전한 이해를 제공하기 위하여 열거된다. 본 발명은 이들 특이적인 상세 중에서 일부 또는 전부의 부재에서 실행될 수도 있다. 다른 경우에, 널리 공지된 처리 공정은 본 발명을 불명료하게 하지 않기 위하여 상세하게 기술되지 않는다.

도입

본 발명에서는 변성된 단백질의 농축된 용액과 재접힘 희석제를 정적으로 혼합하여 재접힘된 단백질을 포함하는 혼합물을 획득하는, 재접힘된 단백질을 회수하는 방법을 제시한다. 이러한 방법은 대규모 처리 용량, 예를 들면, 10ℓ, 30ℓ 또는 100 ℓ 또는 그 이상, 가령, 최대 200ℓ 내지 1000ℓ 또는 심지어 10,000ℓ로, 미생물에 의해 생산되는 재조합 단백질, 예를 들면, 인터페론 β-1b에 특히 적합하다. 변성된 단백질 용액은 미생물 숙주로부터 단백질을 분리하고 이들을 변성제에 노출함으로써 획득될 수 있다. 상기 변성된 단백질 용액은 생물학적 활성을 갖는 재접힘된 단백질이 높은 수율로 신속하게 획득될 수 있도록 상기 단백질의 적절한 접힘(folding)과 융화하는 정적 혼합(static mixing) 조건 하에, 적절한 재접힘 희석제와 혼합된다. 본 발명은 재접힘된 단백질, 바람직하게는, 재조합 단백질의 대규모 생산에 특히 유용하다.

또한, 본 발명에서는 본 발명의 재접힘된 단백질 회수 방법을 실행하기 위한 장치를 제시한다. 상기 장치는 정적 혼합기(static mixer), 정적 혼합기의 상류에서 직렬로 위치하는 도관(conduit), 정적 혼합기의 상류에서 도관에 이르는 입구(inlet)를 보유한다. 작업 시에, 재접힘 희석제의 공급원은 정적 혼합기의 상류에서 도관으로 전달되고, 농축된 변성된 단백질의 공급원은 정적 혼합기의 상류에서 입구를 통하여 도관으로 전달된다. 정적 혼합기는 도관 내에 일련의 혼합 요소(mixing element)를 보유한다. 이들 혼합 요소는 고정되거나 이동가능하지만, 무동력(즉, 정적)이고 이들 위에서 액체 유동(liquid flow)의 움직임만으로 혼합 작용(mixing action)을 제공한다.

정적 혼합

단백질 혼합은 2가지 현상: 가능한 응집 성향 환경의 국소 부위의 감소 및 단백질에 대한 기계적 스트레스의 증가의 커플링(coupling)이다. 따라서, 혼합이 낮으면, 단백질에 대한 전단이 낮긴 하지만 단백질은 국소적으로 높은 단백질 농도가 나타나고 응집하게 된다. 혼합이 높으면, 환경으로 인한 응집의 가능성이 낮아지긴 하지만 단백질에 대한 기계적 전단(mechanical shear)이 높고 단백질이 손상된다. 재접힘 동안 전단 및 응집 성향 환경의 국소 부위 사이에 중간점을 찾기 위하여, 기계적 혼합의 최적 수준이 결정되어야 한다.

본 발명에서는 정적 혼합으로 단백질 접힘을 위한 효과적인 혼합의 과제에 대한 혁신적인 접근법을 제시한다. 정적 혼합기는 유체 유동(fluid flow)의 에너지를 이용하여, 혼합기를 통하여 유동하는 2개 이상의 유체 사이에 혼합을 산출하기 위하여 도관(가령, 파이프) 내에 배열된 일련의 기하학적 요소(geometric element)이다. 정적 혼합은 유체 유동의 에너지만을 이용한, 2개 이상의 유동하는 유체의 혼합이다. 이들 기하학적 혼합 요소는 이들 요소 위를 통과하는 유체 흐름(fluid stream)의 혼합을 유도하는, 정적 혼합기 도관 내에 적합된 물질들의 임의의 입체구조일 수 있다. 이들 요소는 종종 고정되지만, 외부 동력 공급원보다는 이들 위에서 혼합되는 유체의 움직임의 결과로서 이동될 수 있다. 바람직한 실례에는 칼날과 나선이 포함된다. 도 1을 참고하면, 전형적인 정적 혼합기(100)는 파이프(102) 및 유체 흐름을 분리하고, 이후 온건한 와류를 통하여 생성 흐름을 혼합하는 일단의 고정된 나선 요소(helical element)(104)의 조합이다. 이러한 일련의 현상은 각 요소에서 계속된다. 혼합되는 유체는 전형적으로 대량의 유체를 위한, 혼합기와 직렬로 위치하는 주요 입구(106) 및 혼합 요소(104)의 직상류에서 도관의 벽을 통과하는 다소 작은 입구(108)를 통하여 혼합기(100)로 공급된다. 혼합은 온건하지만 신속하게 진행하여, 염 농도, 온도, 단백질 농도의 국지화를 예방한다.

본 발명의 장치에 적합한 정적 혼합기는 적어도 부분적으로, 처리 용량에 의존하는 다양한 형상과 배열을 보유할 수 있다. 30-200ℓ 범위의 용량에서, ¼ 이하의 인치에서부터 최대 2 인치, 예를 들면, 3/16 인치, ¾ 인치, 1 인치, 2 인치의 직경을 갖는 도관이 적합한 것으로 밝혀졌다. 적합한 정적 혼합기는 대략 2개 내지 20개의 혼합 요소, 예를 들면, 6개 내지 12개의 혼합 요소, 가령, 6개 또는 12개의 요소를 보유한다. 이들 요소는 고정되거나, 이동가능하거나, 또는 둘 모두 가능하다. 이들 요소는 임의의 적절한 형상과 배열을 보유한다. 특정 구체예에서, 정적 혼합기는 6개 또는 12개의 고정된 나선 요소를 보유한다. 이런 정적 혼합기는 예로써, Koflo Corporation(Cary, IL)으로부터 구입가능하다.

이런 혼합기는 단백질 재접힘 적용을 위하여 아래와 같이 적절하게 작동된다: 최초 농축된 단백질은 원하는 경우에, 낮은 농도로 존재할 수 있지만, 일반적으로, 대략 10 ㎎/㎖, 예를 들면, 용해도가 유지되는 조건에서 최대 20 ㎎/㎖ 또는 그 이상의 변성제의 농도로 존재한다. 변성제는 대략 3-10 M, 예를 들면, 5 M 또는 8 M Gu-HCL 또는 요소이다. 농축되고 변성된 단백질 용액은 정적 혼합기 내에서 재접힘이 발생하는 지점까지 희석된다. 예로써, 10, 20, 30 또는 60 배(fold) 희석이 수행된다.

일반적으로, 재접힘 희석제는 단백질이 용해되고, 상기 단백질의 적절한 접힘을 촉진하는 완충제이다. 이는 단백질 특이적이고, 다수의 단백질에 대한 적절한 재접힘 완충제가 공지되어 있긴 하지만, 특정한 단백질에 대한 재접힘 희석제로서 기능하는 적합한 완충제를 결정하기 위하여, 당업자의 평균적인 지식 내에서 일정한 수준의 실험이 요구된다. 본 발명에서 재접힘 희석제로서 적합한 완충제의 일부 실례는 대략 3의 pH를 갖는 대략 5mM 글리신, 대략 2-3의 pH를 갖는 대략 5mM 인산, 대략 4의 pH를 갖는 대략 2mM 아스파라긴산이다.

이러한 공정에 적합한 온도 범위는 대략 2 내지 30℃, 예를 들면, 대략 2-8℃, 가령, 4℃이다. 단백질 안정성(protein stability)과 조화되는 경우에, 냉장 장치가 요구되지 않는 실온(room temperature)이 바람직하다.

혼합물의 유동 속도(flow rate)는 정적 혼합기가 대략 200 내지 7000의 레이놀즈수(Reynold's Number)를 갖도록 선택된다. 이러한 공정은 1일 이내에, 또는 1시간 이내에, 예를 들면, 30분 이내에 또는 5분 이내에 75% 이상의 단량체(또는 적어도 80, 85, 90, 95, 97, 98 또는 99%)의 수율을 달성할 수 있다. 본 발명을 제한하진 않지만, 단량체 비율(percentage monomer)은 본 명세서에서 생물학적 활성으로 지칭되는, 의학적 질환의 완화와 연관된 생물학적 기능을 수행하는 단백질의 능력과 연관된다.

단백질 재접힘에서 정적 혼합기를 이용하면, 단백질 접힘 동안 2가지 기전에 의해 응집이 감소될 수 있다:

정적 혼합기는 유체 흐름을 신속하고 효율적으로 혼합하여 농축된 변성된 단백질을 재접힘 희석제 내로 신속하게 희석시킨다. 가령, 적합한 정적 혼합기는 일반적으로, 30분 이내에, 예를 들면, 대략 20-30분 이내에 30-200ℓ의 유체를 혼합할 수 있다; 이는 대량의 동적 혼합을 위하여 요구되는 대략 6시간 이상과 비교된다. 결과적으로, 높은 응집 성향의 화학종(가령, 용해된 작은 구체(globule))을 지지하는 변성제의 일시적인 농도가 정적 혼합기의 이용으로 상당히 감소된다. 역치 응집 농도(threshold agglomeration concentration)는 단백질마다 다르다. 가령, 인터페론 β의 경우에, 대략 0.2 ㎎/㎖ 이상의 농도 포켓은 피해야 한다(가령, 0.1 ㎎/㎖가 적합하다). TFPI의 경우에, 대략 2 ㎎/㎖ 이상의 농도는 피해야 한다. 일반적으로, 응집 문제의 위험 없이 가능한 높은 농도가 처리 용량(processing volume)을 최소화하기 위하여 선호된다.

또한, 정적 혼합은 동적 혼합보다 단백질에 대한 더욱 적은 스트레스 환경을 산출한다. 교반된 탱크의 경우에, 단백질이 높은 전단에 노출되는 기간은 규모에 비례하는데, 그 이유는 벌크 재접힘 용액이 희석제에 단백질의 추가 동안, 지속적으로 볼텍싱(vortexing)되기 때문이다. 단백질은 교반된 탱크 내에서 공정 규모가 확대됨에 따라서, 수분내지 수시간의 연장된 스트레스를 받게 될 수도 있다. 하지만, 정적 혼합기 내에서, 단백질은 희석제와 급속하게 혼합되고(전형적으로, 수초 이내에), 이후 낮은 전단 혼합 용기로 배출되어 높은 혼합의 더욱 짧은 체류 시간(residence time) 및 더욱 낮은 스트레스를 산출한다.

정적 혼합기의 다른 중요한 이점은 공정을 구동하는데 필요한 동력에서 효율이다. 앞서 언급된 바와 같이, 동력 증가에 의해 유발되는 부정적인 영향은 동력 손실로 인하여 더욱 많은 양의 열이 장치에 부가된다는 점이다. 교반된 탱크와 정적 혼합기에 대한 에너지 요구량은 200ℓ 공정과 유사하였다. 교반된 탱크에 대한 전형적인 에너지 요구량은 대략 2-5 HP/1000gal인 반면(Rushton, J.H., Costich, E.W. and Everett, H.J. Power Characteristics of Mixing Impeller, Part 1, Chemical Engineering Progress, 1950, 46 , 467), 정적 혼합기에 대한 에너지 요구량은 대략 0.005HP이다.

이후, 온도에서 상응하는 변화는 방정식 3을 이용하여 산정할 수 있다:

여기서, m은 질량이고, Cp는 비열(specific heat)이고, T는 온도이고, t는 시간이다. 20분 처리 시간(processing time)에서, 모든 동력이 열로 전환되고 액체가 분리된다고 가정하면, 아래의 사항을 확인할 수 있다:

ΔT_교반된 _용기 ~ 0.22℃,

ΔT_{정적 혼합기} ~ 0℃\.

이들 잠재적인 가열 효과는 탱크에서 평균하면 매우 작아 보이지만, 임펠러 주변에서 발생하는 국소 가열 효과가 고온을 발생시키는데, 이러한 고온은 처리 동안 상당한 문제점이 될 수 있다.

정적 혼합기를 대형화하기 위하여, 혼합을 위한 수치(numerical value)를 결정하는 것이 필요하고 유익하다. 유체에 대한 혼합은 혼합 존(mixing zone)의 특징적인 길이 스케일(length scale) 및 혼합 종의 특징적인 속도에 좌우된다. 파이프 내에 거대분자 스케일(macromolecular scale)에서, 혼합 존은 파이프의 직경으로서 정의될 수 있고, 속도는 유입 액체(entering fluid)의 유동 속도로서 정의될 수 있다. 따라서, 유동 속도와 파이프의 직경을 비례하도록 유지하면, 대형화(scale up)에서 혼합이 일정하게 유지된다. 속도와 직경을 연관시키는데 통상적으로 이용되는 축적 인자(scaling factor)는 레이놀즈수(Reynold's number)이다. 정적 혼합기의 경우에, 이는 방정식 1에 의해 제공된다:

여기서, Q는 유동 속도(gal/min)이고, S는 비중(specific gravity)이고, μ는 속도(cP)이고, D는 파이프의 내부 직경이다.

장치와 방법

도 2는 본 발명에 따른, 변성된 단백질의 용액으로부터 재접힘된 단백질을 회수하는 장치의 주요 특징을 도시하는 블록 다이어그램(block diagram)이다. 장치(200)는 정적 혼합기(202)를 보유한다. 정적 혼합기(202)는 일반적으로, 이러한 정적 혼합기와 거의 동일한 직경을 갖는 도관(가령, 파이프)(204)과 직렬로 연결된다. 도관(204)은 더욱 많은 양의 두 유체가 정적 혼합기 내에서 혼합되도록 하기 위하여 이러한 정적 혼합기에 입력(inlet), 본 발명의 경우에, 단백질 희석제를 제공한다. 더욱 적은 양의 두 유체가 정적 혼합기 내에서 혼합되도록 하기 위하여 이러한 정적 혼합기에 두 번째 입력(206), 본 발명의 경우에, 변성된 단백질 용액이 제공된다.

본 발명의 장치에 적합한 정적 혼합기는 적어도 부분적으로, 처리 용량에 좌우되는 다양한 형상과 배열을 보유할 수 있다. 30-200ℓ 범위의 용량에서, ¼ 이하의 인치에서부터 최대 2 인치, 예를 들면, 3/16 인치, ¾ 인치, 1 인치, 2 인치의 직경을 갖는 도관이 적합한 것으로 밝혀졌다. 적합한 정적 혼합기는 대략 2개 내지 20개의 혼합 요소, 예를 들면, 6개 내지 12개의 혼합 요소, 가령, 6개 또는 12개의 요소를 보유한다. 이들 요소는 고정되거나, 이동가능하거나, 또는 둘 모두 가능하다. 이들 요소는 임의의 적절한 형상과 배열을 보유한다. 특정 구체예에서, 정적 혼합기는 6개 또는 12개의 고정된 나선 요소를 보유한다.

정적 혼합기(202)는 두 번째 도관(208), 전형적으로, 첫 번째 도관(204)의 연장으로 출력된다. 두 번째 도관(208)은 동적 혼합 용기(210)와 연결되고, 따라서, 정적 혼합기에 의한 혼합된 단백질 산물 출력이 두 번째 도관(208)을 통하여 동적 혼합 용기(210)로 전송되어 접힘 공정(folding process)을 완결할 수 있다. 선택적으로, 정적으로 혼합된 단백질 산물은 동적 혼합 용기로 전송되기 이전에 1회 이상, 다른 도관(파이프)을 통하여 정적 혼합기(202)에서 재-순환될 수도 있다. 동적 혼합 용기는 일반적으로, 단백질에 대한 전단 유도된 손상을 예방하기 위하여 작동된다. 가령, 동적 혼합은 비-난류(non-turbulent)이다. 이후, 높은 수율에서 대량의 재접힘된 단백질은 제약학적 산물로서 보관 또는 포장을 위하여 동적 혼합 용기(210)로부터 수집된다. 이러한 방식으로, 정적 혼합은 최적 단백질 혼합을 달성하고, 궁극적으로, 적절한 접힘이 높은 농도 포켓(concentration pocket), 전단 또는 가열 없이, 동력 소비를 최소로 하면서 신속하게 진행된다.

도 3은 본 발명에 따른, 변성된 단백질의 용액으로부터 재접힘된 단백질을 회수하는 방법을 도시하는 흐름도(flow diagram)이다. 상기 방법은 변성된 단백질(301)의 농축된 용액을 제공하고, 상기 변성된 단백질을 재접힘 희석제와 정적으로 혼합하여 재접힘된 단백질(303)을 획득하는 단계를 수반한다. 본 발명의 장치와 관련하여 앞서 언급된 바와 같이, 바람직한 구체예에서, 단백질 접힘은 낮은 전단 혼합 용기 내에서 정적 혼합 작업이후에 지속된다.

도 4A는 용액 내에서 변성제 농도 vs. 접힘되지 않은 단백질의 분획(fraction)을 나타내는 도면이다. 상기 도면에서는 상대적으로 좁은 범위의 변성제(가령, GuHCl) 농도에서, 변성된 단백질이 접힘된다는 것을 예증한다. 동적 혼합은 동적 혼합되는 용액 내에서 단백질의 접힘된 상태가 상기 도면에서 곡선을 추종하도록 점진적으로 진행되는데, 처리 혼합 조건(process mixture condition)에서 제어가 부정확하다. 또한, 단백질 혼합물이 부분적으로 접힘된 상태로 존재하는 경우에 응집 문제가 발생할 가능성이 더욱 높기 때문에, 단백질 혼합물이 이러한 상태로 존재하는 시간의 양을 감소시키는 것이 바람직하다. 정적 혼합은 훨씬 신속하게 진행되고, 정적으로 혼합된 단백질 용액의 접힘된 상태가 2지점간(point-to-point)(접힘되지 않음에서 접힘으로) 방식으로 상기 곡선을 따라 효율적으로 이동하며, 중간에 발생하는 부분적으로 혼합된 상태에서 소모되는 시간이 극히 적다. 이는 월등히 높은 제어(control), 일관성(consistency) 및 결과로써, 이러한 공정에 대한 견고성(robustness)을 제공하고, 자연 단백질 접힘을 위하여 최적화된 열역학(thermodynamics)을 달성하는 동역학(kinetics)의 정교한 제어를 가능하게 한다.

도 4B는 동적 혼합과 정적 혼합에서, 시간 vs. 혼성 단백질의 분획(혼성 행태(mixing behavior)와 비율)을 나타내는 도면이다. 상기 도면에서는 동적 혼합 vs. 정적 혼합에 의해 달성되는 혼합의 상대적 비율에 관한 도 4A와 관련하여 앞서 언급된 지점을 더욱 예증한다. 곡선(410)으로 대표되는 동적 혼합은 점진적으로만 진행되고 장기적인 중간 상태 혼합을 결과하는 반면, 곡선(420)으로 대표되는 정적 혼합은 신속하게 진행된다.

제제(formulation)

본 발명의 방법과 장치는 단백질 혼합물 내로 부형제를 통합하여 활성 단백질의 치료 제제(therapeutic formulation)를 생산하는 데에도 이용될 수 있다. 가령, 본 발명에 따라, 트레할로스가 혼합되는 유체에 추가된다.

본 발명의 한 가지 특히 유익한 적용은 HA-없는 재조합 단백질, 예를 들면, 인터페론-β1b의 대규모 생산이다. 알부민은 IFN와 복합되면 IFN-IFN 응집을 예방하는 것으로 생각된다. HA-없는 IFN 제제를 산출하기 위한 알부민의 제거는 혼합 동안 응집 문제를 악화시킨다. 본 발명이 이러한 이론에 의해 한정되지는 않지만, 트레할로스는 HA-없는 단백질 제제 내에서 알부민의 제거에 의해 유발되는 응집 문제를 다소간 완화시키는 것으로 생각된다. 한 구체예에서, 혼합되는 단백질 용액은 대략 4의 pH에서 2mM 아스파라긴산 완충제에 담긴 0.25 ㎎/㎖ HA-없는 인터페론 β-1b 및 9% 트레할로스를 함유한다. 이러한 공정의 결과는 완전한 HA-없는 단백질(가령, IFN-β1b) 제제이다.

아래의 실시예는 본 발명의 특정 측면을 예시하기 위하여 제공된다. 이들 실시예는 본 발명을 더욱 예시하는 기능을 하지만, 본 발명의 범위를 결코 한정하지 않는다.

실시예 1: 하나의 이황화 결합을 보유하는 단백질의 재생( renaturation )

상업적 생산을 위한 한 가지 목적 단백질은 인터페론-β(IFN-β), 특히, 인터페론-β1b(IFN-β1b), IFN-β의 18.5 kD 합성 재조합 단백질 유사체이다. IFN-β1b는 17 위치에서 시스테인 잔기(cysteine residue)가 세린 잔기(serine residue)로 대체되는 재접힘된 단백질이다. 미생물에 의해 생산된 단백질로서, IFN-β1b는 당화(glycosylation)되지 않는다. 또한, IFN-β1b는 하나의 N-말단 메티오닌(methionine)이 결실된다. 이는 자연 상태에서 극소수성 표면 및 하나의 이황화 결합으로 특성화되는데, 이러한 이황화 결합은 전체 처리 과정 동안 원래 상태로 유지된다. Betaseron으로 시판되는 IFN-β1b는 다발성 경화증(multiple sclerosis, MS)의 치료와 관리를 위하여 승인된 성공적인 약제로서 제조되었다. 이러한 단백질 유사체, 이의 제조를 위한 재료와 기술, 치료제로서 이의 제제 및 MS 치료에서 이의 용도는 1982년 10월 19일자 제출된 출원 제435,154호; 1986년 5월 13일자 허여된 특허 제4,588,585호; 1988년 4월 12일자 허여된 특허 제4,737,462호; 1990년 9월 25일자 허여된 특허 제4,959,314호를 비롯한 다수의 US 특허와 특허출원에서 기 술되고 청구되는데, 이들 각각은 순전히 참조로서 본 명세서에 편입된다.

이에 더하여, Betaseron을 비롯한 일부 IFN-β 제약학적 제제는 인간 혈청 알부민(HA 또는 HSA), 통상적인 단백질 안정화제(stabilizer)를 함유한다. HA는 인간 혈액 산물이고, 점진적으로 공급이 줄고 있다. 이런 이유로, 더욱 최근에는 HA-없는 약제 제제가 요구되고 있다.

본 실험에서는 HA-없는 IFN을 재접힘하기 위하여 정적 혼합기를 이용하는 가능성(feasibility)을 조사하고, 다양한 변수(상이한 레이놀즈수(Reynold's Number), 티 거리(Tee distance), 온도)에서 단량체 비율(percent monomer), 다시 말하면, 분자간 결합(intermolecular bond)이 없는 적절하게 접힘된 단백질의 비율에 대한 이들 변수의 효과를 검사하였다. 단량체 비율은 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography) HPLC로 결정하였다. 검사된 변수는 유사한 조건 하에 기계적 혼합 공정으로 획득된 단량체 비율과 비교하였다.

0.1 g 규모에서 IFN을 재접힘하기 위하여, 5M 구아니딘 염산염(GuHCl)을 포함하는 10 ㎎/㎖ HA-없는 IFN-β1b 용액은 2-8℃ 냉방(cold room)에서 희석제로 60X 희석하였다. 본 실험에는 혼합 요소의 대략 1㎜ 상류에서 단락 호스 바브 어댑터(reducing hose barb adapter)(tee)를 보유하도록 변형된 Koflo 12-요소 3/16^”일회용 직렬 혼합기가 초기에 이용되었다. 후기 실험은 하기 1g 규모에서 기술된 Koflo 6-요소 3/5” 직렬 혼합기를 이용하여 수행되었다. 검사된 레이놀즈수(Reynold's number)는 300 내지 2000이었다. 대조(control)는 472 ㎖ 재접힘 희 석제에 추가된 8 ㎖ IFN 용액을 교반 플레이트(stir plate) 상에서 활발하게 혼합함으로써 수행하였다. 이 단계에서 결과는 하기 표 I에 제시된다.

0.1g 규모에서 IFN에 대한 결과

	처리 시간	혼합기 유형	Tee 거리	온도	% 단량체
RE = 1815	~3 min	3/16” 플라스틱 w/12-요소	< 1 ㎝	냉방 (2-8℃)	98.35
RE = 331	~ 16 min	3/16” 플라스틱 w/12-요소	< 1 ㎝	냉방 (2-8℃)	99.27
RE = 867	~ 6 min	3/16” 플라스틱 w/12-요소	< 1 ㎝	냉방 (2-8℃)	98.27
동적 혼합	~30 min	N/A	N/A	냉방 (2-8℃)	97.44

1 g 규모에서, 10 ㎎/㎖ IFN은 2-8℃ 냉방에서 재접힘 희석제로 60X 희석하였다. 최초 실험에는 단락 티(reducing tee)가 입구로부터 2.5” 내지 4” 앞에 연결된 Koflo 6-요소 3/5^”일회용 직렬(정적) 혼합기가 이용되었다. 후기 실험에는 하기 5g 규모에서 기술된 ¾” 스테인리스 스틸 정적 혼합기가 이용되었다. 검사된 레이놀즈수(Reynold's number)는 2000-7000이었다. 유동 속도는 플로어 저울(floor scale)로 최종 소요 부피(final desired volume)를 판독한 이후 중단되었다. 이 단계에서 결과는 하기 표 II에 제시된다.

1g 규모에서 IFN에 대한 결과

	혼합기 유형	Tee 거리	온도	% 단량체
RE = 7000	3/5” 플라스틱 w/ 6-요소	2.5”	냉방 (2-8^℃)	99.22
RE = 2000	3/5” 플라스틱 w/ 6-요소	2.5”	냉방 (2-8^℃)	97.30
RE = 2000	3/5” 플라스틱 w/ 6-요소	4”	냉방 (2-8^℃)	98.74
RE = 2000	3/4” 플라스틱 w/ 6-요소	3”	냉방 (2-8^℃)	98.60
RE = 5000	3/4” 플라스틱 w/ 6-요소	3”	냉방 (2-8^℃)	98.77

5g 규모에서, 10 ㎎/㎖ 농축된 IFN은 재접힘 희석제로 60X 희석하였다. ¾” KoFlo 6-요소 스테인리스 스틸 정적 혼합기는 혼합 요소의 직상류에 ½” 단락 티(reducing tee)를 설치하였다. 혼합기는 반대 방향으로 작동하는 벽 임펠러(wall impeller)로 50ℓ 재킷 스테인리스 스틸 탱크(jacketed stainless steel tank)의 기부 포트(bottom port)에 강제로 고정시켰다. 평균 전체 유동 속도를 이용하여, 레이놀즈수(Reynold's number)는 모든 정적 혼합기 작업에서 대략 4000이었다. 농축된 IFN 펌프는 전체 내용물이 농축된 IFN 병으로부터 없어진 이후 정지시키는 반면, 완충제 펌프(재접힘 희석제의 경우)는 최종 소요 부피(이는 완충제 탱크와 재접힘 탱크 사이에 지체 부피(holdup volume)를 포함한다)가 플로어 저울(floor scale)로 판독된 이후 정지시켰다. 재료의 처리는 2-10℃에서 수행하였다. 처리이후, 재접힘 탱크는 혼합을 위하여 적어도 10분 동안 방치하였다. 3/4” 단락 티(reducing tee)가 설치된 2” Koflo 스테인리스 스탤 6-요소 정적 혼합기를 이용하여 추가의 실험을 수행하였다. 레이놀즈수(Reynold’s number)는 4000으로 일정하게 유지되었다. 결과는 하기 표 III에 제시된다.

5g 규모에서 IFN에 대한 결과

	처리 시간	혼합기 유형	Tee 거리	온도	% 단량체
RE = 4000	~10 min	¾” 스테인리스 스틸 w/ 6-요소	3”	~ 10℃	97.81
RE = 4000	~10 min	¾” 스테인리스 스틸 w/ 6-요소	3”	~ 5℃	98.36
RE = 4000	~3 min	2” AL6XN w/12-요소	3”	~ 5℃	99.50
동적 혼합	~30 min	N/A	N/A	~ 4℃	98.02

표 I과 III에 도시된 바와 같이, 각 규모에서 최종 단량체 비율은 대조 비율보다 높았다. 대조는 1g 규모에서 작업되지 않았다; 하지만, 0.1g 규모와 5g 규모의 각 실험에서 대조 비율과 유사하거나 이보다 높은 수율이 산출되었다. 따라서, 본 발명의 정적 혼합-기초된 공정과 장치는 통상적인 공정과 적어도 동등하고, 일반적으로 더욱 높은 수율을 달성한다. 다른 이점은 더욱 큰 규모(즉, 30g 제조 규모)에서 정적 혼합 시간은 일정(3-15분)한 반면, 동적 혼합 시간은 IFN의 응집이 발생할 수도 있는 국소적인 단백질이나 변성제 농축의 우려로 인하여 증가(30분 내지 수시간)한다. 따라서, 정적 혼합은 대규모 생산(large-scale production)으로의 확장이 가능하다. 정적 혼합은 또한, 더욱 일관된 결과를 제공하는 더욱 견고한 공정이다.

실시예 2: 자연 상태에서 3개 이상의 이황화 결합을 보유하는 단백질의 재생

계란 흰자 라이소자임은 4개의 이황화 결합을 보유하는 14 kD 분자이다. 상기 분자는 재접힘 체계(refolding scheme)가 복잡하긴 하지만, 폭넓게 연구되고 상세하게 특성화되었다. 본 실험에서는 정적 혼합기가 IFN보다 더욱 복잡한 접힘 체계(folding scheme)에서 효과적으로 작동한다는 것을 입증한다.

37℃에서 1시간동안 8M GuHCl/, 50 mM Tris, 1 mM EDTA, 32 mM DTT 완충제, pH 8에서 변성된 0.3 g 라이소자임을 1.25M GuHCl, 50 mM Tris, 1 mM EDTA 완충제, pH 8로 5분간 16-배 희석하고, 25℃에서 24시간동안 배양하여 1 ㎎/㎖의 최종 농도를 산출하였다. 본 실험에는 혼합 요소의 직상류에 단락 호스 바브 어댑터(reducing hose barb adapter)가 설치된, 12개의 나선 요소(helical element)를 보유하는 3/16” 일회용 정적 혼합기가 이용되었다. 유동 속도는 대략 1000(즉, 희석 완충제의 경우 60 ㎖/min 및 변성된 라이소자임 용액의 경우 4 ㎖/min)의 레이놀즈수(Reynold's number)를 제공하도록 선택되었다. 샘플을 채취하고 활성 검사로 순도 비율(percent purity)을 측정하여 재접힘 동역학(refolding kinetics)을 평가하였다. 도 5는 시간 vs. 활성%의 도면인데, 이는 3번의 독립된 재접힘에 대한 재접힘 동역학을 예증한다.

라이소자임 동역학의 최종 분석은 Jolles, P. Lysozymes from Rabbit Spleen and Dog Spleen. Methods in Enzymology 1962, 5, 137로부터 변형된 절차를 이용하여 24시간후에 수행하였다. 24시간후 활성 라이소자임의 최종 회수율(recovery)은 3번의 독립된 실험에서 90% 이상이었다. 이는 기존 문헌에서 공개된, 동적 혼합에서 산출되는 대략 95% 라이소자임 활성에 필적한다(De Bernardez-Clark, E., Hevehan, D., Szela, S., Maachupalli, J. Oxidative Renaturation of Hen Egg-White Lysozyme. Folding vs Aggregation. Biotechnology Progress 1998, 14, 47-54). 따라서, 본 실험에서는 복수의 이황화 결합을 보유하는 재조합 단백질의 재접힘에서 정적 혼합기 이용의 효용성을 입증한다.

실험 결과의 고찰

봉입체로부터 재접힘 단백질에서 중요한 문제점은 응집이다. 응집은 재접힘을 유도하는 인력과 경쟁하는, 응집을 유도하는 인력으로 기술될 수 있다. 재접힘 동안 응집을 제어하기 위하여, 활발한 혼합이 이용된다. 하지만, 기계적 혼합기를 이용한 통상적인 혼합 전략은 단백질에 손상을 주거나, 또는 단백질을 비효율적으로 혼합하여 응집을 유발한다. 정적 혼합기의 이용은 이러한 문제점에 대한 혁신적인 해법인데, 그 이유는 이러한 이용이 기계적 혼합에 의해 유발되는 급격한 전단 없이 흐름을 신속하게 혼합하고, 대형화가 용이하여 제조 시설(manufacturing facility)에서 편의하게 이용될 수 있기 때문이다. 2가지 별개의 단백질로부터 결과는 폭넓은 적용가능성(applicability)을 암시한다.

결론

본 발명의 정적 혼합-기초된 공정과 장치는 통상적인 공정과 적어도 동등한 수율을 달성한다. 이에 더하여, 이는 대규모 생산으로 확장가능하고, 더욱 신속하며, 더욱 일관된 결과를 제공하는 더욱 견고한 공정이다.

상기한 발명이 명확한 이해를 위하여 상당히 상세하게 기술되긴 했지만, 첨부된 특허청구범위의 범위 내에서 특정한 개변이 가능하다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명의 공정과 조성물을 실행하는 다수의 대안적 방법이 존재한다. 따라서, 이들 구체예는 설명으로서 간주되고 본 발명을 제한하지 않으며, 따라서, 본 발명은 본 명세서에 제공된 상세에 한정되지 않고, 첨부된 특허청구범위의 범위와 등가물 내에서 변경될 수 있다.

본 명세서에 언급된 모든 문헌은 순전히 참조로서 편입된다.

Claims

단백질을 재접힘(refolding)하는 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:

변성된 단백질의 농축된 용액을 제공하고;

변성된 단백질을 재접힘 희석제(refolding diluent)와 정적으로 혼합하여 재접힘된 단백질을 포함하는 혼합물을 획득한다.
청구항 1에 있어서, 단백질은 미생물에 의해 생산된 재조합 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 2에 있어서, 변성된 단백질 용액은 미생물 숙주(microbial host)로부터 단백질을 분리하고, 이를 변성제(denaturant)에 노출함으로써 획득되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1에 있어서, 재접힘 희석제는 단백질이 용해되는 완충제인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 4에 있어서, 정적 혼합(static mixing)은 도관(conduit) 내에 일련의 혼합 요소(mixing element)를 포함하는 정적 혼합기(static mixer)에서 진행되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 5에 있어서, 단백질 용액은 도관 내에서 재접힘 희석제의 유동(flow)이 정적 혼합기의 혼합 요소에 도달하기 직전에, 상기 유동에 전달되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1에 있어서, 혼합물은 정적 혼합이후 동적 혼합 용기(dynamic mixing vessel)에 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 7에 있어서, 혼합물은 동적 혼합 용기 내에서 동적으로 혼합되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1에 있어서, 재접힘된 단백질은 1시간 이내에 75% 이상의 단량체의 수율로 획득되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 9에 있어서, 재접힘된 단백질은 95% 이상의 수율로 획득되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 10에 있어서, 재접힘된 단백질은 30분 이내에 획득되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 11에 있어서, 재접힘된 단백질은 5분 이내에 획득되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 4에 있어서, 단백질 용액 내에서 변성제의 농도는 적어도 3M인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1에 있어서, 희석은 적어도 10 배(fold)인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 14에 있어서, 희석은 대략 60 배인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1에 있어서, 혼합 동안 온도는 대략 2℃ 내지 30℃인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1에 있어서, 혼합 동안 온도는 대략 4℃인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1에 있어서, 혼합 동안 단백질 농도는 0.2 ㎎/㎖ 이하인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 18에 있어서, 혼합 동안 단백질 농도는 대략 0.1 ㎎/㎖인 것을 특징 으로 하는 방법.
청구항 1에 있어서, 혼합물의 유동 속도(flow rate)는 정적 혼합기가 대략 200 내지 7000의 레이놀즈수(Reynold's Number)를 갖도록 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1에 있어서, 혼합물의 부피는 10ℓ 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1에 있어서, 혼합물의 부피는 100ℓ 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1에 있어서, 혼합물의 부피는 1000ℓ 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1에 있어서, 단백질은 자연 형태로 하나 이상의 분자내 이황화 결합을 보유하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 24에 있어서, 단백질은 자연 형태로 하나의 분자내 이황화 결합을 보유하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 25에 있어서, 단백질은 인터페론 β인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 26에 있어서, 단백질은 인터페론 β-1b인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 27에 있어서, 단백질 용액은 HA-없는 인터페론 β를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1에 있어서, 재접힘된 단백질은 생물학적 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1에 있어서, 혼합물은 활성 단백질의 치료 제제(therapeutic formulation)의 안전한 성분으로서 널리 인정되는 부형제를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 30에 있어서, 부형제는 트레할로스를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 31에 있어서, 단백질 용액은 대략 4의 pH에서 2mM 아스파라긴산(aspartic acid)에 담긴 0.1 ㎎/㎖ HA-없는 인터페론 β-1b를 포함하고, 부형제는 9% 트레할로스를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
용액으로부터 재접힘된 단백질을 회수하는 장치에 있어서,

정적 혼합기(static mixer);

정적 혼합기의 상류에서 직렬로 위치하는 도관(conduit);

정적 혼합기의 상류에서 도관에 이르는 입구(inlet)를 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
청구항 33에 있어서,

정적 혼합기의 상류에서 도관으로의 전달을 위하여 배열된 재접힘 희석제의 공급원;

정적 혼합기의 상류에서 입구를 통한 도관으로의 전달을 위하여 배열된 농축된 변성된 단백질의 공급원을 더욱 포함하는 것을 특징으로 장치.
청구항 34에 있어서, 정적 혼합기는 도관 내에서 일련의 고정된 혼합 요소, 이동가능 혼합 요소, 또는 이들의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
청구항 35에 있어서, 정적 혼합기 도관은 2 인치 이하의 직경을 갖는 것을 특징으로 하는 장치.
청구항 36에 있어서, 정적 혼합기 도관은 대략 ¾ 인치의 직경을 갖는 것을 특징으로 하는 장치.
청구항 35에 있어서, 정적 혼합기는 고정된 요소를 보유하는 것을 특징으로 하는 장치.
청구항 33에 있어서, 정적 혼합기의 하류에서 동적 혼합 용기를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.