CN112955458A

CN112955458A - 使用流动微反应器的制造重折叠的蛋白质的方法和蛋白质的重折叠装置

Info

Publication number: CN112955458A
Application number: CN201980073108.4A
Authority: CN
Inventors: 江岛大辅; 中原祐一; 加藤启介; 伊达雅代
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2018-11-05
Filing date: 2019-11-05
Publication date: 2021-06-11
Also published as: EP3878856A1; EP3878856A4; WO2020095894A1; US20210253629A1; JPWO2020095894A1

Abstract

本发明提供包含将不溶化的或失去了高阶结构的蛋白质的可溶化溶液与缓冲液在微型混合器内进行混合的工序的、制造重折叠的蛋白质的方法。

Description

使用流动微反应器的制造重折叠的蛋白质的方法和蛋白质的重折叠装置

技术领域

本发明涉及使用流动微反应器(Flow Micro Reactor，FMR)的，制造重折叠的蛋白质的方法和蛋白质的重折叠装置。

背景技术

使用大肠杆菌等的微生物产生的蛋白质，大多数情况下，在微生物体内是不溶性并且失去活性的。因此，要使由此得到的蛋白质在产业上可利用，需要使其恢复活性，故需要进行重折叠以使其具有适当的立体结构。

进行重折叠时，通常，使用适当的变性剂，使不溶性的蛋白质可溶化，接着，除去变性剂至蛋白质恢复立体结构并重获活性的程度。作为除去变性剂的方法，已知有凝胶过滤层析等的柱层析、超滤、透析、这些的组合。通过重折叠，仅想获得具有稳定的化学势的结构并且具有活性的蛋白质，但其中不少在除去变性剂时会发生沉淀，或者取得即使重折叠后溶解于水相中也不具有活性的结构，仍然不能获得令人满意的具有活性的蛋白质的收率。

作为工业水平上进行蛋白质的重折叠的技术，例如日本特表2009-502173(专利文献1)中公开了下述方法作为流式重折叠方法：使可溶化蛋白质溶液和稀释用的缓冲液合流后，通过静态混合器充分混合进行重折叠，从而降低基于间歇式(Batch)重折叠的搅拌叶片的剪切力、热引起的压力。

美国专利第7651848号(专利文献2，以下称为“第848号专利”)中公开了，将可溶化蛋白和稀释液用静态混合器混合后，用罐接收重折叠液，在罐中搅拌重折叠液的方法。据所述，此时的混合时间为1毫秒至10秒，优选为100毫秒至1秒。此外，公开了：用静态混合器混合后使添加剂合流的方法、在接收可溶化蛋白质溶液与稀释用缓冲液的混合液的重折叠罐中，预先填满稀释用缓冲液，使重折叠罐中的混合溶液循环以用于稀释可溶化的蛋白质溶液的方法。

非专利文献1(Process Biochemistry 35(2000)1119-1124)中公开了，在搅拌透析膜管内的可溶化蛋白质溶液的同时，通过泵将可溶化蛋白质输送至透析膜管内，将稀释用缓冲液输送至透析膜管外，同时不断将其抽出以将可溶化物质保持在较低浓度的体系。

非专利文献2(Chemical Engineering Science 140(2016)153-160)公开了，使可溶化的蛋白质溶液和稀释用缓冲液混合后，使液体通过静态混合器，然后，通过反应线圈并使其重折叠的连续式的重折叠体系。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特表2009-502173号公报

专利文献2：美国专利第7651848号

非专利文献

非专利文献1：Process Biochemistry 35(2000)1119-1124

非专利文献2：Chemical Engineering Science 140(2016)153-16

发明内容

发明所解决的技术问题

如上所述，蛋白质的重折叠是通过将处于不具有蛋白质功能的变性状态的蛋白质折叠成本来的结构来恢复蛋白质功能，但是这样的结构变化可通过除去变性剂或无限降低变性剂的浓度而引起。图1添加了Tsumoto等人的文献(K.Tsumoto et al.,ProteinExpression and Purification 28(2003)1-8)的Fi g.4中的各状态的说明，显示了重折叠的过程。如该图所示，通过重折叠，使蛋白质从变性状态(U)经过中间体(I)变成折叠状态(N)。然而，蛋白质的结构被认为不仅取决于变性剂浓度，还在较大程度上依赖pH、温度等周围的环境，并且由于混合不均匀等，容易形成凝聚体或变成错误折叠状态(Y.Katoh etal.,Process Biochemistry 35(2000)1119-1124)。即，可能从变性状态(U)、中间体(I)变成凝聚体。从变性状态(U)到折叠状态(N)或凝聚体的时间较短，被认为非常快(毫秒级)(C.M.Dobson et al.,J.Mol.Biol.(2000)297,193-210)。因此，为了抑制凝聚体的形成，在短时间内实现除去了变性剂的状态或变性剂浓度变低的状态(即，高速混合)被认为是非常重要的。

然而，从可溶化的蛋白质溶液中除去变性剂需要一定时间。例如，在通过透析操作除去变性剂的情况下，通过透析膜的物质的移动速度迟缓，因此直至除去了变性剂的状态的时间比重折叠时间更长。此外，工业化水平上，除了稀释需要的时间外，还存在易于发生局部性地浓度不均匀这样的问题。例如，静态混合器是优异的混合装置，但是在先将稀释液与变性蛋白质的可溶化溶液混合，然后导入静态混合器，直至静态混合器的出口的混合过程中，易于发生时间性地和局部性地不均。

解决问题的技术手段

本发明人对蛋白质的重折叠方法进行了深入研究的结果，发现通过使用具备内径0.1～1.0mm的微型混合器的流动微反应器，使缓冲液和变性蛋白质的可溶化溶液以给定的流速流通，并在微型混合器内连续地混合，能够抑制凝聚体的形成，并提高经过正确重折叠的蛋白质的收率。基于该知识，完成了本发明。即，本发明提供以下的制造方法。

1、一种制造重折叠的蛋白质的方法，其包含：

将不溶化的或失去了高阶结构的蛋白质的可溶化溶液与缓冲液在微型混合器内进行混合的工序。

2、根据所述项1所述的制造方法，其中，

由下述式(I)求得的混合时间小于3毫秒(msec)，

tm＝0.15ε^-0.45 (I)

式中，tm为混合时间，ε为能量耗散率，Q为流量，ΔP为压力损失，ρ为密度，V为混合器体积，ε＝QΔP/ρV。

3、根据所述项1或2所述的制造方法，其中，

缓冲液的流速与变性蛋白质的可溶化溶液的流速的合计为5mL/min以上。

4、根据所述项1～3中的任一项所述的制造方法，其中，

缓冲液的流速与变性蛋白质的可溶化溶液的流速的合计为600mL/min以下。

5、根据所述项1～4中的任一项所述的制造方法，其中，

微型混合器前与后的压力损失为1kPa～10MPa。

6、根据所述项1～5中的任一项所述的制造方法，其中，

微型混合器内的混合时间小于1毫秒。

7、根据所述项1～6中的任一项所述的制造方法，其中，

所述混合工序包含在内径为Ymm的微型混合器内混合可溶化溶液和缓冲液的工序，

混合时，使X1 mL/min的流速的缓冲液与X2 mL/min的流速的可溶化溶液接触，

所述X1和Y的关系由下述式(1)表示，

所述X1和X2的关系由下述式(2)表示，

[数学式1]

式中，10≤X1，

8、根据所述项1～7中任一项所述的制造方法，其中，

缓冲液的流速X1为10～1500mL/min。

9、根据所述项1～8中任一项所述的制造方法，其中，

微型混合器的内径Y为0.1～1.0mm。

10、根据所述项1～9中的任一项所述的制造方法，其中，

所述可溶化溶液包含：

尿素、

盐酸胍、

或三氟乙酸与乙腈的组合中的任一种。

11、根据所述项1～10中的任一项所述的制造方法，其中，所述重折叠方法中，在使可溶化溶液流通之前，用不包含蛋白质但包含变性剂的溶液填满流路。

12、根据所述项1～11中的任一项所述的制造方法，其中，

所述经过重折叠的蛋白质为单体。

13、根据所述项1～12中的任一项所述的制造方法，其中，

重折叠工序之后包含纯化工序。

此外，本发明人等对蛋白质的重折叠装置进行了深入研究的结果，发现使用具备内径0.1～1.0mm的微型混合器的流动微反应器，使缓冲液和变性蛋白质的可溶化溶液在微型混合器内连续地混合，从而能够抑制凝聚体的形成，并得到确实经过重折叠的蛋白质，完成了本发明。即，本发明提高以下的装置。

14、一种蛋白质的重折叠装置，其是重折叠蛋白质的装置，其中，所述装置具备：

第一流路，其供缓冲液流通；

第二流路，其供不溶化的或失去了高阶结构的蛋白质的可溶化溶液流通；以及

用于混合的微型混合器，其内径为0.1～1.0mm，且第一流路和第二流路在该微型混合器中合流。

15、根据所述项14所述的装置，其具备注射泵、柱塞泵或隔膜泵，它们用于输送缓冲液和蛋白质的可溶化溶液。

发明效果

根据本发明，由于可正确地控制重折叠条件(特别是，缓冲液和变性蛋白质的可溶化溶液的流速、混合时间)，因此能够以高收率获得被重折叠并重获活性的蛋白质。通过本发明的装置，提高生产量时仅需增加相同体系，因此扩大规模而不会受到扩大规模造成的影响。

附图说明

[图1]图1是添加了K.Tsumoto et al.,Protein Expression and Purificati on28(2003)1-8的Fig.4(表示重折叠的过程的示意图)中各状态的说明的图。

[图2A]图2A是T字微型混合器的截面图。

[图2B]图2B是V字微型混合器的截面图。

[图3]图3是实施例中使用的FMR装置的概要图。

[图4]图4是实施例中使用的FMR装置的概要图。

[图5]图5是实施例1中测定的，表示各种流路内径中的流量与rfIL-6单体收率的关系的图表。

[图6A]图6A表示，实施例2中测定的、通过本发明进行了重折叠的rhI L-6(单体)和rhIL-6的凝聚物(二聚体)的峰。

[图6B]图6B表示，实施例2中测定的、以间歇式进行了混合时的、经过重折叠的rhIL-6(单体)和rhIL-6的二聚体的峰。

[图6C]图6C表示，实施例2中测定的、以基于凝胶过滤柱的缓冲液交换进行了混合时的、经过重折叠的rhIL-6(单体)和rhIL-6的二聚体的峰。

[图7]图7表示，实施例4中测定的、各种流量中的溶菌酶酶活性。

[图8]图8通过相对于压力损失的混合时间表示实施例6中测定的、第848号专利的方法和本发明的方法的混合时间的比较。

[图9]图9通过相对于流速的352nm中的吸光度表示实施例7中测定的、第848号专利的方法和本发明的方法的混合性能的比较。

[图10]图10表示，实施例8中测定的、第848号专利的方法、本发明的方法和间歇式的、各种流速中的rhIL-6单体收率。

[图11]图11表示，实施例11中测定的、通过本发明的方法或间歇式进行了重折叠的IGF-1的(Ib)与前体(Ic)的总收率和IGF-1(Ia)的收率的比较。

[图12]图12表示，实施例12中测定的、通过本发明的方法或间歇式进行了重折叠的雷珠单抗(Ranibizumab)的收率的比较。

具体实施方式

1.本发明的方法

通常而言，微反应器是在数十至数百微米的空间内进行反应的反应装置。本发明的方法中使用的微反应器是连续流式。

另一方面，不溶化的或失去了高阶结构的蛋白质因变性剂而可溶化，接着，除去变性剂至可溶化的蛋白质恢复立体结构的程度时，蛋白质被重折叠。

本发明的方法使用FMR中具备的微型混合器，使不溶化的或失去了高阶结构的蛋白质的可溶化溶液连续地迅速与缓冲液高速混合并稀释，从而能够从可溶化蛋白质的周围除去变性剂，使蛋白质重折叠。

通过本发明的方法，能够达成由下述式(I)求得的混合时间小于3msec的高速混合。

tm＝0.15ε^-0.45 (I)

式中，ε为能量散逸率，Q为流量，ΔP为压力损失，ρ为密度，V为混合器体积，ε＝QΔP/ρV。

混合时间越快，越能够抑制凝聚体的形成，进而能够以高收率得到作为目标产物的经过重折叠的蛋白质。作为混合时间，优选小于3msec，更优选1.4～0.001msec，进一步优选1～0.001msec，更进一步优选0.87～0.0.001msec。

〔蛋白质〕

作为基于本发明的重折叠的对象的蛋白质是不溶化的或失去高阶结构的，失去功能或活性的蛋白质。本说明书中，也将这样的蛋白质称为变性蛋白质。不能明确区分不溶化的蛋白质和失去高阶结构的蛋白质，但是他们均与其高阶结构为天然状态的蛋白质不同。

就不溶化的蛋白质而言，例如，是将大肠杆菌等的微生物作为生产宿主制备的基因重组蛋白质。由此得到的蛋白质通常对100g的水的溶解度为0.001g以下(25℃)，因此可用于本发明。也可以是由于受到某些压力而从可溶性状态不溶化的蛋白质。

蛋白质的形态没有特别限制，例如可以为颗粒状或粉末状或纤维状或凝聚体。也存在如凝聚体，即使其高阶结构是与天然状态的蛋白质不同的形态，也能在没有变性剂的帮助下而具有可溶性的蛋白质。这样的蛋白质也是基于本发明的重折叠的对象。

本发明可适用于二级结构主要包含α-螺旋的蛋白质(例如IL-6)，包含β-折叠的蛋白质(例如scFv、Fab)或包含双方的蛋白质(例如谷氨酰胺转氨酶)。也可适用于复杂结构的蛋白质，蛋白质的一级结构、二级结构的特征没有特别制限。

此外，本发明可以适用于单体蛋白(IL-6等)，也可适用于多聚体蛋白(Fab等)。但是，由于多聚体和单体蛋白的重折叠中的最佳状态不同，因此与在调整至多聚体蛋白的最佳条件的情况下相比，调整至单体蛋白的最佳条件时得到更高的单体收率。也可使用蛋白质的片段。例如，可将重均分子量(室温条件下，通过超离心分析法、静态光散射分析法测定)为5000道尔顿至150000道尔顿的片段用于本发明。

可适用于分子内或分子间不具有二硫键的蛋白质(例如谷氨酰胺转氨酶)，也可适用于具有该键的蛋白质(例如IL-6、scFv、Fab)。

具体而言，可举出：人白细胞介素-6、IGF这样的细胞因子；生长因子、各种激素(例如，激活素A(Activin A)、TGF-β)、分化诱导因子等通过获得的特定的高阶结构来发挥功能的蛋白质性配体；谷氨酰胺转氨酶、溶菌酶等的酶；蛋白质性酶抑制剂；和具有免疫球蛋白结构的抗体相关分子。

作为抗体相关分子，可举出：抗体可变区(Fv，fragment of variable regi on)、单链抗体可变区(scFv，single chain Fv)、抗原结合部位(Fab，fragment of antigenbinding)、抗原结合部位(Fab’)、2价的抗原结合部位(F(ab’)₂)等的抗体片段；显示双特异性的单链抗体可变区(bispecific single chain Fv)或双特异抗体(Diabody)、使抗体可变区和抗体Fc结构域的一部分融合成二聚体而得到的人工性小型抗体(Minibody)等的人工抗体；包含构成抗原结合部位或抗体可变区的结构域中的轻链来源或重链来源的单独的结构域单域抗体(single-do main antibody)、使蛋白质、肽与抗体Fc结构域融合而得到的Fc融合蛋白(Fc Fusion Protein)等。

更具体而言，可举出：HyHEL-10scFv这样的单链抗体可变区(scFv)，例如Pexelizumab(scFv)、作为抗原结合部位(Fab)的阿昔单抗(商品名，ReoPro)、雷珠单抗(商品名，LUCENTIS)或赛妥珠单抗(商品名，Cimzia)、抗Fluorescei n scFv Fc fusion这样的Fc融合蛋白(Fc Fusion Protein)，例如罗米司亭(商品名，Nplate)、利纳西普(商品名，ARCALYST)、阿巴西普(商品名，ORE NCIA)或alefacept(商品名，AMEVIVE)等不溶化时或失去高阶结构时的分子。这些抗体相关分子的结构在公知论文例如Holliger P.and HudsonPJ.NatureBiotechnology 23(9),1126-1136(2005)中有详细地描述。

以免疫球蛋白结构以外的，例如以锚蛋白重复序列、纤连蛋白类型III结构域、脂质运载白蛋等作为基础结构而制备的人工性亲和性分子也可用于本发明。

本发明中，不溶化的或失去了高阶结构的蛋白质被包含在包含变性剂的溶液中，可溶化之后，使其在微型混合器中流通。可溶化液中的蛋白质的浓度优选设为0.1～20mg/mL，更优选设为0.25～5mg/mL，进一步优选设为0.5～3.5mg/mL。由此，可使可溶化溶液在给定内径的微型混合器内流通，并与缓冲液迅速充分混合。

〔变性剂〕

通常而言，变性剂用于使蛋白质失去其高阶结构，并使其失活，但是在重折叠中，通过拉伸不溶化的或失去了高阶结构的蛋白质，疏松结构或解开纠缠，来实现使蛋白质可溶化的作用。

本发明中，作为可用于变性蛋白质的可溶化的变性剂，可使用该技术领域中公知的变性剂，没有特别制限。例如可使用：尿素、盐酸胍、三氟乙酸(TFA)等的酸、乙腈等的溶剂、表面活性剂。作为表面活性剂，可举出：具有C₈～C₁₆的酰基的二羧酸、癸酰基肌氨酸(月桂酰基肌氨酸，月桂酰基-Sar)、癸酰基丙氨酸(月桂酰基丙氨酸，月桂酰基-Ala)、癸酸或这些的盐(例如钠盐、钾盐)、月桂基三甲基铵氯化物(LTAC)和这些的混合物。其中，具有C₈～C₁₆的酰基的二羧酸、癸酰基肌氨酸、癸酰基丙氨酸或这些的盐为优选的。具有C₈～C₁₆的酰基的二羧酸或其盐为更优选的。所述具有C₈～C₁₆的酰基的二羧酸更优选为月桂酰基谷氨酸(月桂酰基-Glu)、月桂酰基天冬氨酸(月桂酰基-Asp)或月桂酰基亚氨基二乙酸。月桂酰基-Glu、月桂酰基-Asp、月桂酰基-Sar、月桂酰基-Ala可以为D型、L型、DL型中的任一种。作为表面活性剂，月桂酰基-L-Glu或其盐对所有不溶性蛋白质的可溶化能力优异，被稀释时可容易地除去而不继续与蛋白质结合，并且高纯度的月桂酰基-L-Glu试剂可以较低价格入手，因此为特别优选的。作为本发明中使用的变性剂，由于变性效果优异，因此优选尿素、盐酸胍或TFA和乙腈的组合。

就变性剂的浓度而言，只要是可使变性蛋白质在溶液中充分拉伸的浓度即可，变性蛋白质的浓度为如上所述时，优选设为4M以上。由此，能够充分提高可溶化效率。由于变性效果优异，因此更优选5M以上，进一步优选6M以上。上限可以设为适宜地维持稀释倍率的范围，优选为10M。设为6～8M时，可使可溶化效率和稀释倍率最优化。

可溶化溶液的溶剂取决于使用的变性剂的种类，但是优选为水。在使用乙腈等的溶剂作为变性剂的情况下，可以使用或不使用其他溶剂。可溶化溶液中可以添加二硫苏糖醇(DTT)、2-巯基乙醇等的还原剂。

可溶化溶液的25℃中的pH，可配合变性蛋白质的性质，选择pH为2.0～9.0，优选pH为7.0～8.5的缓和的条件。需要说明的是，本发明中，pH可通过安装了pH电极的pH计来测定。pH调整可使用氢氧化钠等的碱基进行。作为该水溶液，可以使用缓冲液。

可溶化溶液的温度，可考虑适用本发明的方法的蛋白质的热特性来适宜决定，但是优选设为约4～40℃。如果在这样的范围内，则化学反应引起的切断、氧化等的修饰被抑制至最小，故为优选的。可溶化溶液的温度可通过下述方式调整：在储槽(reservoir tank)中配备保温器、在流路外部安装预调温线圈或将微型混合器等浸入水浴槽(Water bath)中。

蛋白质是否可溶化，可通过例如基于肉眼观察的浊度判定或280nm的紫外线吸收光谱法等来确认。

〔缓冲液〕

可用于本发明的缓冲液，可使用本领域公知的例如：Tris缓冲液(三盐酸盐、三乙酸盐等)、磷酸缓冲液(PBS)、乙酸钠缓冲液、柠檬酸钠缓冲液等。

缓冲液可包含精氨酸、半胱氨酸、胱氨酸等的氨基酸、氧化型谷胱甘肽、还原型谷胱甘肽等的添加剂。氨基酸可以形成：盐酸盐等与无机酸形成的盐或乙酸盐等与有机酸形成的盐。氨基酸可以是酰化精氨酸，例如N-丁酰基精氨酸等的衍生物。添加剂浓度根据蛋白质的性质选择。精氨酸时，例如为0.1～1.5M，优选为0.2～1.2M，半胱氨酸时，例如为1～10mM，优选为3～6mM，胱氨酸时，例如为0.1～1mM，优选为0.6～1mM，还原型谷胱甘肽时，例如为1～10mM，优选为3～6mM，氧化型谷胱甘肽时，例如为0.1～1mM，优选为0.6～1mM，以上述浓度包含，能够使得天然状态的高阶结构恢复得到促进，故为优选的。

就缓冲液的25℃中的pH而言，只要是在可溶化溶液合流后，与蛋白质的性质适合的pH即可，大概在pH4.0～9.0的范围内。可以与可溶化溶液的pH相同或不同。pH调整可通过例如盐酸、氢氧化钠等进行。

缓冲液的温度可以与可溶化溶液的温度相同或不同，但是优选相同。缓冲液的温度与可溶化溶液的温度相同时，重折叠温度的控制优异。目标蛋白重获活性时的热稳定性不够高的情况下优选为4～10℃。缓冲液的温度可通过下述方式调整：在储槽(reservoirtank)中配备保温器、在流路外部安装预调温线圈或将微型混合器等浸入水浴槽(Waterbath)中。

分别从不同流路供给如上所述准备的缓冲液和变性蛋白质的可溶化溶液。缓冲液和变性蛋白质的可溶化溶液可通过送液泵使其流通。各溶液的流速可通过送液泵的压力进行调整。

缓冲液的流速与变性蛋白质的可溶化溶液的流速的合计(以下，称为“总流速(Total Flow Rate)”或TFR)为5mL/min以上时，重获活性的蛋白质的回收率优异，故为优选的。TFR为1650mL/min以下时，可使用的泵的选择范围扩大，故为优选的，更优选600ml/min以下。TFR更优选为11～600mL/min，进一步优选为11～330mL/min，更进一步优选为20～330mL/min。

各溶液流通的流路可以为一个或两个以上。在微型混合器内混合两种溶液时，优选以使得稀释倍率为数倍至数十倍，例如10～20倍的方式对两种溶液的体积进行调整。

在使可溶化溶液流通之前，可以用不包含变性蛋白质但包含变性剂的溶液填满流路。由此，目标蛋白的收率提高，并且，可稳定地进行连续送液。

到达微型混合器中的两种溶液在微型混合器内进行混合。本发明中使用的微型混合器是流路内径较小(因此，有时称为微细流路)，并且不具备搅拌叶片、障碍板等的混合器。

构成微型混合器的微细流路的内径Y mm可根据与缓冲液的流速X1 mL/min的关系决定。具体而言，X1与Y的关系可通过下述式(1)表示。

[数学式2]

为了使重折叠率达到令人满意的水平，例如，10≤X1。流速取决于混合时间，因此优选10≤X1≤1500，更优选10≤X1≤300，进一步优选20≤X1≤300。

微型混合器的微细流路的内径Y小于0.1mm的情况下，压力损失增大，因此使用困难。因此，优选0.1≤Y，更优选0.1≤Y≤1.0，进一步优选0.1≤Y≤0.5，特别优选0.25≤Y≤0.5。

更优选10≤X1≤1500且0.1≤Y≤1.0，进一步优选0.1≤Y≤0.5，特别优选0.25≤Y≤0.5。当X1和Y在这样的范围内时，可控制压力损失和混合时间，故为优选的。

更优选10≤X1≤545且0.1≤Y≤1.0，进一步优选0.1≤Y≤0.5，特别优选0.25≤Y≤0.5。当X1和Y在这样的范围内时，可控制压力损失和混合时间，故为优选的。

特别优选10≤X1≤300且0.1≤Y≤0.5，尤其优选0.25≤Y≤0.5。当X1和Y在这样的范围内时，可控制混合时间和压力损失，故为优选的。

最优选20≤X1≤300，并且，0.25≤Y≤0.5。当X1和Y在这样的范围内时，能够得到稳定的混合性能，故为优选的。

可溶化溶液的流速可通过与缓冲液的流速的关系决定。即，X1和X2的关系如下述式(2)所示。

[数学式3]

可通过除去变性剂或无限降低变性剂的浓度来引起重折叠，因此优选X2为X1的十分之一以下。X2更优选为X1的五十分之一以上，进一步优选三十分之一以上，特别优选二十分之一以上，进一步特别优选十分之一以下。开始输送缓冲液和可溶化溶液的时机可以是同时或不同，不同的情况下，先输送可溶化溶液。

微型混合器的微细流路截面的形状，没有特别限定，可使用V字形、T字形等。由于可期望更高的混合性能，因此优选V字形。

由于可得到更高的混合性能，因此更优选微型混合器的微细流路截面的形状为V字形、10≤X1≤1500、且0.1≤Y≤1.0，进一步优选0.1≤Y≤0.5，特别优选0.25≤Y≤0.5。

由于可得到更高的混合性能，因此更优选微型混合器的微细流路截面的形状为V字形、10≤X1≤545、且0.1≤Y≤1.0，进一步优选0.1≤Y≤0.5，特别优选0.25≤Y≤0.5。

由于可得到更高的混合性能，因此特别优选微型混合器的微细流路截面的形状为V字形、10≤X1≤300、且0.1≤Y≤0.5，尤其优选0.25≤Y≤0.5。

由于可得到更高的混合性能，因此最优选微型混合器的微细流路截面的形状为V字形、20≤X1≤300、且，0.25≤Y≤0.5。

微型混合器前与后的压力损失优选为1kPa～10MPa。通过将压力损失设定在该范围内，能使微型混合器的混合效率提高，还可容易地实施制造过程中的规模扩大(scale-up)。压力损失主要可通过设定缓冲液和可溶化溶液的各比重、流量和压力来进行控制。

本发明中，通过至多1毫秒的混合，来提高重折叠收率。混合时间可根据两种溶液的流速、密度、微型混合器的体积等而变化，例如可为10微秒～1000微秒，特别是10微秒～500微秒。这样的短时间内的混合也是迅速对变性蛋白质的可溶化溶液进行稀释和迅速除去变性剂。由于通过迅速稀释得到均匀的溶剂相，因此中间体的结构也变为均质的。另一方面，稀释缓慢时，稀释后的溶剂相变得不均匀，除了中间体之外，还存在因变性剂而保持被拉伸的状态的蛋白质等，得到的蛋白质的结构也各种各样。中间体卡在拉伸状态的蛋白质中时，将在缔合状态下结束结构形成。虽然不受任何理论的约束，但如上所述，本发明人认为高速混合有助于凝聚体形成的抑制。

混合时间可通过压力损失进行定量化，通过下述的方法推算。

(计算方法)

Falk等的报告(Chemical Engineering and Processing 50(2011)979-990)中，显示混合时间tm与能量散逸率ε相关，混合时间如下式表示，

tm＝0.15ε^-0.45 (I)

(ε＝QΔP/ρV，Q：流量，ΔP：压力损失，ρ：密度，V：混合器体积)。

两种溶液混合后的温度与变性蛋白质的可溶化溶液同样，优选设为4～40℃，在目标蛋白重获活性时的热稳定性不够高的情况下，可以为4～10℃。如果在这样的范围内，则可将化学反应引起的切断、氧化等的修饰抑制至最小。两种溶液混合后的温度可通过设置在微型混合器中的水浴槽等的恒温槽来进行调整。

通过在微型混合器内进行稀释，变性蛋白质恢复其高阶结构，并重获活性。重获活性的蛋白质与原本就包含其的可溶化溶液和缓冲液一起被送至滞留管。此时的流速没有特别限定，为了获得充分的混合性能，优选为10～1500mL/min。

从微型混合器中排出混合物后，可以用缓冲液取代流路。由此，可抑制流路内的蛋白质的凝聚。

从微型混合器输送至滞留管的溶液中可能包含未完成重折叠的中间体(即，图1中的I)，但是通过使该溶液滞留在滞留管内，变性蛋白质恢复其高阶结构并重获活性。即，与刚通过微型混合器后相比，通过滞留管后的重折叠率提高。滞留管内的溶液可以放置或静置，也可以使其循环，也可以搅拌。滞留时间为数小时至数日，例如2小时至24小时。滞留温度优选为约4～40℃。如后所述，可以使用烧杯等的容器代替滞留管。

将通过滞留管后的、包含经过重折叠的蛋白质的溶液从排出口取出，如果必要，则放入接收容器中。

放入接收容器的蛋白质可通过通常的方法纯化，例如超滤、透析、离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水性相互作用层析、反相层析、亲和层析等。

目标蛋白质可通过基于所述层析的分离来进行回收。

蛋白质是否恢复天然状态的高阶结构，可通过下述方法确认：CD光谱、荧光光谱等的光谱测定或HPLC等观察蛋白质的物理化学特性的方法或酶活性等的高阶结构指标。

2.本发明的装置

如上所述，本发明的方法可使用具备微型混合器的微反应器连续进行。因此，本发明还提供：可使用本发明的方法的、蛋白质的重折叠装置。对于本发明的装置，在下文中进行说明。

通常而言，微反应器是在数十至数百微米的空间内进行反应的反应装置，可实现高速混合。本发明的装置具备：第一流路，其供缓冲液流通；第二流路，其供不溶化的或失去高阶结构的蛋白质的可溶化溶液流通；以及微型混合器，其中缓冲液和可溶化溶液合流。第一流路和第二流路与微型混合器呈连通状态。本发明的装置也是连续流式的。

本发明中使用的微型混合器可使用狭缝型、圆盘型、强制接触型等通常性的微型混合器。狭缝型微型混合器是，将具有与短边平行的波的长方形的隔离壁以与短边平行的形式，以屏风状均等地间隔弯折而形成多个微细流路的混合器。圆盘型微型混合器是将薄箔堆叠而形成微细流路的混合器。强制接触型微型混合器是基于喷嘴的混合器。任一微型混合器均可使缓冲液与可溶化溶液的接触(即合流)和混合同时进行，因此已经通过微型混合器的混合液没有必要使用静态混合器等的其他混合器进一步混合。即，通过本发明，可在一个步骤中进行两种溶液的合流和混合。由于能够在使流路导致的堵塞问题最小化的同时，得到优异的混合性能，因此优选强制接触型。

如果参照图2进行说明，强制接触型微型混合器通过在微空间内强制性地发生对流，使流体的接触面积增加，来促进分子扩散以迅速地进行混合。其中，作为使流体碰撞的类型的微型混合器中最简单的，有图2A表示的T字型的微型混合器和图2B表示的V字型的微型混合器。每种情况中，强制接触型的微型混合器都与第一流路和第二流路连通，从各流路流入缓冲液(图中，“溶液1”)和变性蛋白质的可溶化溶液(图中，“溶液2”)。各个流体发生碰撞时，因流体的动能而发生对流，从而促进混合，混合溶液从第三流路排出。微型混合器内的液体的扩散时间与流体的动能和流路宽度成比例，因此流速5mL/min以上并且内径Y为0.1～1.0mm时，能够高效地进行高速混合·精密混合，因此具有这样的内径Y的微型混合器更优选。进一步优选流速11mL/min以上并且内径Y为0.1～0.5mm。特别优选流速22mL/min以上并且内径Y为0.25～0.5mm。溶液1和溶液2分别通过的微细流路的长度(图2A和图2B中，以“L₁，”“L₂”表示)优选设为10～20000μm，更优选设为100～5000μm，为200～3000μm时，可获得充分的混合性能，故为优选的。需要说明的是，L₁和L₂可以彼此相同或不同，但是优选相同。构成微型混合器的材料的材质可以为金属制、玻璃制、硅制的任一种。微型混合器可使用从例如Fraunhofe r IMM公司、YMC公司、三幸精机工业公司购入的。

微型混合器中，缓冲液与变性蛋白质的可溶化溶液发生接触的同时进行混合，产生被重折叠的蛋白质或其中间体。可在此处使用的缓冲液和变性蛋白质的可溶化溶液如上所述。可使缓冲液和可溶化溶液的各流路与微型混合器直接连接，使缓冲液和可溶化溶液在微型混合器内发生合流，并进行混合。

虽然不受任何理论约束，本发明人等推测，即使在微型混合器内重折叠未完成，由于通过本发明在微型混合器内得到的中间体取得正确的重折叠所需要的结构，因此之后无需进行追加的操作，即可重获具有活性的结构(即，图1中说明时，反应从I进行至N)。

本发明的装置可以具备用于在流通前保存各溶液的储槽。储槽可以具备加热·保温功能。

除了两末端开放以外，第一流路和第二流路构成封闭的空间。第一流路和第二流路的内径优选为例如2mm。作为流路的材质，例如可使用SUS等的无机材料、聚四氟乙烯(PTFE)等的有机材料。第一流路和第二流路的长度例如为0.1～5.0m。由此，可进行温度的控制。

微型混合器可以与微型混合器中合流的两种液体流通的第三流路连接。第三流路的内径和材料与第一和第二流路所述的相同。第三流路的长度例如为0.1～5.0m。由此，可控制混合的溶液的温度。

缓冲液和变性蛋白质的可溶化溶液的流通可通过第一流路和第二流路中设置的送液泵来进行。作为送液泵，可使用注射泵、柱塞泵或隔膜泵等。就送液泵的压力而言，以使得各溶液的流速在上述的范围内的方式进行设定。

为了提高微型混合器中的混合效率，优选通过缓冲液用的泵对缓冲液加压，并且通过可溶化溶液用的泵对可溶化溶液加压，由此将加压了的缓冲液和加压了的可溶化溶液供给至微型混合器。为了防止一种原料流入另一种原料的供给管中并防止混合液的逆流，优选分别在微型混合器上游的缓冲液供给管和可溶化溶液供给管处安装背压阀。背压阀的位置优选设为尽可能地靠近合流点的位置。

在微型混合器内混合缓冲液和可溶化溶液，进行蛋白质的重折叠，如上所述设定流入微型混合器的两种溶液的流速和微型混合器的内径，以在短时间内进行正确的重折叠。

离开微型混合器的混合液被输送至接收罐。接收罐中的蛋白质完成了重折叠，因此可直接使用，也可在使用前保存在罐中。

微型混合器和接收罐之间可以设置滞留管。根据本发明，推测通过微型混合器内的混合产生正确的重折叠所需要的中间体，该中间体如果在之后放置不处理则会自动性地重折叠成具有活性的蛋白质。因此，不必将混合液滞留在滞留管中，但是为了可靠地完成重折叠并提高重折叠率，优选在混合后，放置一定程度的时间。即，滞留管用作放置混合液的位置。因此，滞留管可具有较长的流路，以使得混合液长时间通过。作为其形状，例如可以是线圈状。此外，滞留管也用于接收从微型混合器剧烈排出的混合液而使之不泄露。因此，还可使用烧杯等的任意容器代替滞留管。混合液可以在容器中静置，也可以搅拌。

本发明的装置可以在第一流路和/或第二流路设置用于调整变性蛋白质的可溶化溶液和/或缓冲液的温度的线圈。作为温度调节用部件，还可使用水浴槽。通过将微型混合器、与其连接的第一流路和/或第二流路、根据需要设置的第三流路、滞留管等的容器浸入水浴槽中，来调剂温度。

第一流路和第二流路的长度以使得在两种溶液混合之前，可溶化溶液的温度达到使该溶液中包含的蛋白质进行重折叠的适宜的温度的方式来确定。

本发明的装置还可以具备预温度调整用线圈、水浴槽等的温度调节元件。通过将线圈设置在第一流路和第二流路与微型混合器M1之间，能够在两种溶液到达微型混合器时将两种溶液的温度调整至期望的温度。也可仅将线圈设置在第一流路和第二流路的任意一者中，但是由于在微型混合器内混合时两种溶液的温度相同时混合效率不会降低，因此优选两者均安装。将微型混合器配置在水浴槽中时，可调节混合之前和之后的溶液的温度。水浴槽可以包含与微型混合器连接的第一流路、第二流路和第三流路，并且，也可以包含需要时设置的预温度调整用线圈和滞留管。

参照图3和图4对本发明的重折叠装置的具体例，分别进行说明。

图3中，用于流通缓冲液的第一流路3紧接在保存缓冲液的储槽1的下游，用于流通可溶化的蛋白质的第二流路4紧接在保存变性蛋白质的可溶化溶液的储槽2的下游，第一流路3和第二流路4直接与微型混合器M1连接。微型混合器M1还经由用于流通混合液的第三流路与用于接收混合液的接收罐7连接。第一流路3和第二流路4分别设置有缓冲液和可溶化的蛋白质溶液的送液用泵5、6，使得流入微型混合器时的缓冲液和可溶化溶液的流速在所述范围内。

图4是在图3的微反应器装置的基础上，添加了预温度调整用线圈P1、P2、滞留管R1和水浴槽(图中，虚线表示的)。线圈P1、P2设置在送液用泵5、6与微型混合器M1之间，使得两种溶液到达微型混合器M1时都被调整至期望的温度。滞留管R1设置在微型混合器M1与接收罐7之间，使得暂时接收从微型混合器M1流出的混合液，在存在中间体的情况下，使蛋白质变为具有活性的折叠状态，从而完成重折叠。预温度调整用线圈P1、P2、微型混合器M1、滞留管R1、第一流路、第二流路和第三流路设置在温度调整用的水浴槽内，使得可在混合之前和之后调节两种溶液的温度。

本发明的装置可单独使用，但是可通过串联或并联多个来提高生产量。根据本发明，只需通过增加相同体系，就能够容易地扩大规模(scale-up)而不会出现规模差距受到扩大规模造成的影响。

实施例

FMR装置和操作概要

图3表示FMR装置的概要图。FMR装置由以下部件构成：保存缓冲液和变性蛋白质的可溶化溶液的储槽1、2(具有保温功能)、用于流通缓冲液的第一流路3、用于流通可溶化的蛋白质的第二流路4、缓冲液和可溶化的蛋白质的送液用注射泵5、6、微型混合器M1、用于接收混合液的接收罐7。微型混合器M1是图2A表示的T字微型混合器或图2B表示的V字微型混合器。第一流路3和第二流路4的流路为1.0m。需要说明的是，该装置采取了根据需要可如图4所示使用预温度调整用线圈P1、P2、滞留管R1和温度调整用的水浴槽(图中，虚线表示的)的构造。微型混合器M1内的流路的内径和形状如表1所示。需要说明的是，流路内径是指混合部的流路宽度。

[表1]

类型	流路内径Y	流路形状	L<sub>1</sub>	L<sub>2</sub>
					1	0.2mm	V字	2.5mm	2.5mm
2	0.25mm	V字	2.5mm	2.5mm
					3	0.5mm	V字	2.5mm	2.5mm
4(比较用)	1.0mm	T字	2.5mm	2.5mm
					5	1.0mm	V字	2.5mm	2.5mm

以下的实施例中，使用如此构建的FMR装置进行重折叠。具体而言，通过送液用泵输送保存在储槽中的缓冲液和可溶化的蛋白质，在微型混合器内混合。需要说明的是，要改变混合温度时，将微型混合器浸入水浴槽中。需要说明的是，没有特别所述时，将混合温度设为25℃。

〔不溶化的或失去了高阶结构的蛋白质的可溶化溶液的制备〕

如下所述，使用变性剂使商购的蛋白质变性，制备不溶化的或失去了高阶结构的蛋白质的可溶化溶液。

将重组人IL-6(rhIL-6)溶解在0.1％TFA、40％乙腈溶液中并使其变性(变性rhIL-6浓度3.5mg/mL，pH 2.0)。在下文中，将该溶液称为“变性rhIL-6溶液A”。

将重组人IL-6(rhIL-6)溶解在8M盐酸胍溶液(pH 9.0)中并使其变性(变性rhIL-6浓度3.5mg/mL，pH 9.0)。在下文中，将该溶液称为“变性rhIL-6溶液B”。

将重组人IL-6(rhIL-6)溶解在8M尿素溶液中并使其变性(变性rhIL-6浓度3.5mg/mL，pH 9.0)。在下文中，将该溶液称为“变性rhIL-6溶液C。”

在2mg/mL的溶菌酶溶液中添加8M盐酸胍和4M DTT溶液使其变性(溶菌酶浓度0.5mg/mL，pH 9.0)。在下文中，将该溶液称为“变性溶菌酶溶液。”

〔实施例1〕rhIL-6的重折叠(1)

实施例1中，研究了缓冲液的流速和微型混合器的流路形状对经过重折叠的rhIL-6的收率的影响。

将如上制备的变性rhIL-6溶液A与缓冲液(50mM乙酸钠，pH4.3)通过FMR装置进行混合，稀释20倍(rhIL-6浓度0.175mg/mL)。得到的样品通过可分离目标产物和副产物的凝胶过滤层析(Superdex 75 10/300GL(GE医疗公司))对成分峰定量。将上清液20μL进行凝胶过滤HPLC(柱，Superdex 7510/300GL，GE医疗制；展开液0.1M磷酸钠，0.2M精氨酸盐酸盐，1M尿素，pH 6.8；流速0.8mL/min；检测法，225nm和280nm中的紫外吸收；定量用标准样品，纯化rhIL-6)，对形成了单体结构和二聚体、凝聚体结构的rhIL-6进行定量。

需要说明的是，以各种流速将缓冲液和变性rhIL-6溶液导入如上构建的FMR装置(图3，微型混合器为类型1或类型3)。将两种溶液的导入开始时间设为同时。各溶液的流速如表2所示。

[表2]

将结果示于图5。图5的横轴“总流速”表示缓冲液的流速与变性蛋白质的可溶化溶液的流速的合计(图7、9、10，11、12也相同)。需要说明的是，正确进行重折叠时，rhIL-6作为单体得到，因此图5中用单体收率表示rhIL-6的收率。由图5可知流速提高时收率也提高。由图5还可知，将混合器内的流路的内径从0.5mm减小至0.2mm，收率也提高。通过使用FMR进行的高速混合，可抑制凝聚体的形成，提高收率。

〔实施例2〕rhIL-6的重折叠(2)

实施例2中，使用本发明的FMR装置、间歇式或凝胶过滤柱进行重折叠，比较重折叠率。

变性蛋白质的可溶化溶液和缓冲液使用与实施例1中使用的相同的。

基于本发明的重折叠，使用类型3作为微型混合器，将缓冲液的流速设为38mL/min，将变性蛋白质溶液A的流速设为2.0mL/min，除此之外，以与实施例1相同的方式进行。

间歇式中，向用磁力搅拌器搅拌的，填满稀释缓冲液的烧杯的反应器中滴加变性rhIL-6溶液。将溶液的规模设为10mL。

使用了凝胶过滤柱的缓冲液交换通过BIOTECHNOLOGY AND BIOEN GINEERING，VOL.62，NO.3，FEBRUARY 5，1999所述的方法进行。

结果示于图6。图6A表示通过本发明被重折叠的rhIL-6(单体)和rhIL-6的凝聚物(二聚体)的峰。图6B表示以间歇式混合时的、经过重折叠的rhIL-6(单体)和rhIL-6的二聚体的峰。图6C表示通过使用凝胶过滤柱进行的缓冲液交换进行了混合时的、经过重折叠的rhIL-6(单体)和rhIL-6的二聚体的峰。图6的结果总结在表3中。

[表3]

基于溶剂·酸变性的重折叠收率的比较

条件	单体(％)	二聚体
			FMR	93	7
间歇式重折叠	42	58
			柱交换	52	48

〔实施例3〕rhIL-6的重折叠(3)

实施例3中，比较本发明和间歇式的，蛋白质通过胍进行了变性时的重折叠率。

作为变性蛋白质的可溶化溶液，使用变性rhIL-6溶液B，作为缓冲液，使用50mM乙酸钠(pH5.0)，除此之外，以与实施例2同样的方式进行实验。

表4表示变性rhIL-6溶液B和缓冲液混合时的、经过重折叠的rhIL-6(单体)和rhIL-6的凝聚物(二聚体)的收率。由表4可知，与通过间歇式进行混合时相比，通过使用FMR进行的高速混合，能够抑制凝聚体的形成，提高收率。

[表4]

基于胍变性的重折叠收率的比较

条件	单体(％)	二聚体
			FMR	91.2	8.8
间歇式重折叠	77.1	22.9

〔实施例4〕溶菌酶(Lysozyme)的重折叠

实施例4中，研究了缓冲液的流速和微型混合器的流路形状对经过重折叠的溶菌酶的收率的影响。

将如上制备的变性溶菌酶溶液与缓冲液(6mM Cys，06mM Cystine，20mM Trisacetate)混合，稀释1O倍。以各种流速将缓冲液和溶菌酶溶液导入如上构建的、微型混合器为类型2(V0.25)、类型3(V05)或类型4(T1.0)的FMR装置(图3)中。各溶液的流速如表5所示。两种溶液的导入开始时间设为同时。用预调温线圈P1和P2调节，使得两种溶液的温度为4℃。

为了比较，也使用了间歇式代替FMR装置进行混合。间歇式中，向用磁力搅拌器搅拌的，填满稀释缓冲液的烧杯的反应器中滴加变性溶菌酶(Lysozy me)溶液。溶液的规模设为10mL。

将混合的样品静置2小时，用溶菌酶活性试剂盒(LY0100-kit，sigma)测定酶活性。结果示于图7。

[表5]

〔实施例5〕

实施例5中，研究了用于稳定性地进行连续送液的条件。

(实验方法)

将如上制备的变性rhIL-6溶液B用20mM TrisHCl缓冲液(pH 90)进行稀释(20倍稀释)，以与实施例2同样的方式，计算单体/二聚体的比例。此时，比较以下2个条件：作为最初在反应器内的溶液，首先填满8M盐酸胍溶液后使缓冲液流通的条件、以及首先用水填满后使缓冲液流通的条件。需要说明的是，将缓冲液和变性rhIL-6溶液B以各种流速导入上述构造的FMR装置(图3，微型混合器为类型3)。两种溶液的导入开始时间设为同时。各溶液的流速如表6所示。

[表6]

(结果)

表7显示各条件中的送液前的反应器内溶液的条件的比较。在反应器内被水取代的条件下，尽管有一些波动，但收率通常较低。这被认为是因为，虽然微型混合器内部因反应器内的水使变性剂浓度得到稀释而处于重折叠得到促进的状态，但另一方面，由于不是适合重折叠的溶液状态，因此凝聚体形成得到了促进。另一方面，在反应器内部被变性剂取代的条件下，可得到稳定的重折叠收率。

[表7]

各条件下的收率的比较

〔实施例6〕

实施例6中，比较了流动微反应器和静态混合器的混合时间。

如上引用的第848号专利中，变性蛋白质溶液和缓冲液的混合时间为约1msec～约10sec。因此使用模型蛋白质，以通过压力损失对混合时间进行定量化的方法推算混合时间。

(计算方法)

Falk等的报告(Chemical Engineering and Processing 50(2011)979-990)中，表明混合时间与能量散逸率ε相关，混合时间tm如下述式所示，

tm＝0.15ε^-0.45 (I)

(ε＝QΔP/ρV，Q：流量，ΔP：压力损失，ρ：密度，V：混合器体积)。使用本方法进行混合性能的评价。

(条件)

<使用模型蛋白质研究经过重折叠的蛋白质的制造>

送液体系：连续送液装置(配备流量、压力计)

微型混合器：内径0.5mm，V字形，混合器体积V：1.9×10^-9m³)

流量Q：100mL/min

压力损失ΔP：6～7MPa

密度ρ：1000kg/m³

将上述数据带入式(I)计算混合时间tm。

<第848号专利>

根据第848号专利的实施例的所述，使用了三通连接器、静态混合器、硅管(内径5mm×80cm)。需要说明的是，该专利未指定三通连接器的内径，因此从硅管的内径推测，推定使用了1/4英寸(内径6.35mm)的连接器。基于实施例对压力损失进行测定，其结果为20kPa(＝0.02MPa)左右。

(结果)

图8显示了相对于压力损失ΔP的混合时间的图。在使用模型蛋白质进行的蛋白质的重折叠中实施的条件(6～7MPa)下，推测混合时间为约0.05msec(＝50μsec)。此外，发现1msec的压力损失为8kPa(＝0.008MPa)。由此认为，通过FMR制造使用的条件在第848号专利公开的范围外。另一方面，基于第848号专利的图，发现其与FMR相比，混合性能显著降低。结果为推测在该8kPa的压力损失下的混合时间为22.68msec，混合性能显著较低。为了获得1msec以下的混合性能，需要施加约15MPa的压力。

〔实施例7〕

实施例7中，比较了流动微反应器和静态混合器的混合性能。

第848号专利中，使用静态混合器进行混合。因此，通过混合性能评价的方法之一的dushman反应(使用中和反应和还原反应的竞争性反应。Ehrfeld,W.et al.；Ind.Eng.Chem.Res.38 1075-1082(1999))，评价流动微反应器和静态混合器的混合性能。

(反应原理)

利用硼酸的中和和碘的还原反应的反应速度差。混合速度较快的情况下，进行反应(1)，因此没有显色。另一方面，混合速度较慢的情况下，进行反应(2)产生I^3-，因此溶液呈黄色。

(方法)

制备表8表示的组成的溶液1、2，使用FMR或静态混合器以1:1的比例将两种溶液混合后，使用吸光度计测定352nm的吸光度。需要说明的是，FMR装置使用了图2(微型混合器为表1的类型3)所示的类型。

[表8]

(结果)

图9表示相对于流速的352nm的吸光度的比较。使用FMR的10mL/min以上的条件下吸光度几乎为0，而在根据第848号专利的实施例的所述所假定的条件下吸光度虽然降低，但即使是本次使用的送液装置的最大条件200mL/min下也约为0.9左右。

〔实施例8〕

实施例8中，比较了使用了rhIL-6的流动微反应器和静态混合器的单体收率。

第848号专利中，通过使用了静态混合器的连续过程(以下，称为“CFR”)，进行蛋白质的重折叠。因此，使用IL-6的重折叠模型，比较FMR和CFR的单体收率。

(实验方法)

将如上制备的变性IL-6溶液A与缓冲液(50mM乙酸钠，pH 5.0)混合(稀释倍率20倍)。混合方法通过FMR、CFR或间歇式实施。混合条件示于表9。

混合后，将样品静置1小时或24小时，然后，进行凝胶过滤层析，计算单体/二聚体的比例。形成了单体和二聚体的rhIL-6的定量以与实施例1相同的方式进行。需要说明的是，该体系中，不产生凝聚物、3聚体、4聚体，重折叠失败的情况下几乎都变成2聚体，因此经过重折叠的蛋白质的收率通过单体/二聚体的比例评价。

[表9]

混合条件

(结果)

结果示于表10和图10。表10表示凝胶过滤层析的分析结果，图10表示相对于流速的单体比例的比较。在间歇式的情况下，单体比例为48％～68％是波动较大的结果。与之相对，在FMR的情况下，2.5、5.0mL/min条件下结果小于等于间歇式条件的结果。这重现了Dushman反应的结果。另一方面，在10mL/min以上的条件下表现出大于间歇式的结果。与之相对，使用CFR的条件下即使提高流速，单体比例也为80％以下等，不超过FMR。从以上的结果可确认，FMR是超过CFR的混合速度的方法。

[表10]

SEC；分析结果

C1、C2、C6-C9：比较例

〔实施例9〕激活素A(Activin A)重折叠

(菌株·培养)

通过市售的pET载体将编码激活素A的合成基因插入E.coli BL21株来构建菌株。在LB培养基中对菌株进行菌种培养后，在Select Soytone培养基中进行培养。回收培养液后，进行离心分离，回收菌体。

(不溶性颗粒的制备)

回收的菌体通过超声波破碎机一边冷却一边破碎，然后再次进行离心分离操作，回收沉淀部分。根据需要使用缓冲液进行清洗。

(重折叠原料制备)

通过变性剂和还原剂悬浮不溶性颗粒。以使得变性剂为8M尿素(Urea)和还原剂为100mM DTT的方式添加变性剂和还原剂。静置后，进行离心分离操作，回收上清液，然后通过Sephadex G-25柱除去DTT。

(FMR重折叠)

将上述制备的变性激活素A溶液与缓冲液(0.75％牛磺脱氧胆酸，0.75M尿素，10mMEDTA，20mM Tris HCl，1.5mM半胱氨酸，0.1mM胱氨酸)用FMR装置混合，制备激活素A重折叠溶液。使用类型5(V型，内径1.0mm)的微型混合器，以总流速为50mL/min、200mL/min进行重折叠。

(间歇式重折叠)

将上述制备的变性激活素A溶液与缓冲液在容器内混合，制备激活素A重折叠溶液。以反应规模1L、5L实施重折叠。

(激活素A的定量)

浓缩通过FMR或间歇式进行了重折叠的样品，然后进行缓冲液交换。然后，通过反相HPLC Vydac214 TP54(展开溶剂：A液0.1％-TFA，B液0.1％-TFA，80％乙腈溶液，检测法280nm中的紫外吸收；定量用标准样品，纯化激活素A)对激活素A进行定量。

(结果)

各规模中的激活素A收率的比较示于表11。在间歇式的重折叠的情况下，确认了收率倾向于随着规模扩大(scale-up)而降低，而使用FMR进行重折叠的情况下，确认了倾向于能够保持收率。由此，可确认规模扩大(scale-up)时通过FMR进行的重折叠的优越性。

[表11]

反应规模	1.0L	5.0L
			间歇式	13.7％	8.7％
FMR，总流速	50mL/min	200mL/min
			FMR	16.1％	15.1％

〔实施例10〕T3GF-β重折叠

通过市售的pET载体将编码TGF-β3的合成基因插入E.coli BL21株来构建菌株。在LB培养基中对菌株进行培养后，回收培养液后，进行离心分离，回收菌体。

(不溶性颗粒的制备)

回收的菌体通过超声波破碎机冷却并破碎，然后再次进行离心分离操作，回收沉淀部分。根据需要使用缓冲液进行清洗。

(重折叠原料制备)

通过变性剂悬浮不溶性颗粒。添加变性剂并使其为7.8M尿素溶液。

(FMR重折叠)

将上述制备的变性TGF-β3溶液与缓冲液(4％CHAPS，1.0M ArgHCL，0.5M尿素，1mMEDTA，3mM Cys)使用FMR装置进行混合，制备TGF-β3重折叠溶液。使用类型5(V型，内径1.0mm)的微型混合器，以总流速7.5mL/min、22.5mL/min进行重折叠。

(间歇式重折叠)

使上述制备的变性TGF-β3溶液与缓冲液分别在容器内混合，制备T3GF-β重折叠溶液。以反应规模为10mL规模实施重折叠。

(TGF-β3的定量)

对重折叠样品实施缓冲液两次取代操作(第一次稀释：20mM TrisHCl、0.5M尿素、1M NaCl、1mM EDTA(pH 7.5)，第二次稀释：20mM Tris HCl、0.5M尿素、1M NaCl、1 mM EDTA、(pH 7.5)).

对得到的样品进行凝胶过滤HPLC(柱，Superdex 7510/300GL，GE医疗制；展开液0.1M磷酸钠、0.2M精氨酸盐酸盐、1M尿素、pH 6.8；流速0.8mL/min；检测法，225nm和280nm中的紫外吸收；定量用标准样品，纯化TGF-β3)，对形成了二聚体结构的TGF-β3进行定量。

(结果)

各条件中的TGF-β3收率的比较示于表12。间歇式的重折叠的情况下，收率为约1.8％，而FMR重折叠的情况下为10.0％、12.1％，由此确认了使用FMR能够提高收率。由此可确认使用FMR进行重折叠的优越性。

[表12]

		收率(％)
			间歇式	10mL	1.8
FMR	7.5mL/min	10.0
			FMR	22.5mL/min	12.1

〔实施例11〕IGF-1重折叠

已知IGF-1在重折叠时分子内的S-S键产生几种状态。特别是作为IGF-1swap体生成的分子内SS键的错误交叉体(Ia)不会返回天然体(Ib)，已知是不可逆的副产物(Jamse，A.M.，(1993)Biochemistry 32，5203-5213)。另一方面，天然体(Ib)的前体(Ic)随着时间流逝必然会变成天然体(Ib)。因此决定验证利用FMR的高速混合体系是否可抑制所述错误交叉体的形成。

(变性样品的准备)

使IGF-1溶解在30mM TrisHCl、100mM GSH、8M尿素、pH 12溶液中制备变性IGF-1溶液样品。

(FMR重折叠)

将上述制备的变性IGF-1溶液与缓冲液(50mM Tris、0.56M Arg、10 mM GSSG、pH5)使用FMR装置进行混合，制备IGF-1重折叠溶液。使用类型5(V型，内径1.0mm)的微型混合器，以总流速15、20mL/min进行重折叠。

(间歇式重折叠)

使上述制备的变性IGF-1溶液与缓冲液(50mM Tris、0.56M Arg、2.2mM GSH、2.2mMGSSG、pH 5)在容器中混合，制备IGF-1重折叠溶液。以容器规模1mL管进行重折叠。

(IGF-1的定量)

将得到的样品静置3小时后，进行反相HPLC(C8柱，YMC制；展开溶剂：A液0.1％-TFA、B液0.1％-TFA、80％乙腈溶液、检测法280nm中的紫外吸收；定量用标准样品，纯化IGF-1)，对形成了IGF-1的错误折叠结构和单体结构的IGF-1进行定量。

(结果)

将各条件中的IGF-1生成物的比较用错误折叠结构(Ia)与单体结构(Ib，Ic)的比例表示。间歇式的情况下，错误折叠结构(Ia)为25％，而FMR重折叠条件下分别为17％、18％，确认了与间歇式相比，错误折叠结构百分比降低。如上所述，前体Ic随着时间流逝必然变成目标产物Ib。因此，Ib和Ic的合计可视为最终得到的(可获得)生成物。图11是Ib和Ic的合计与作为杂质的Ia进行比较的图表。由此表明FMR重折叠对IGF-1的重折叠有效。

[表13]

各条件下的IGF的Area值(Ia是不可逆的，Ib是生成物，Ic是Ib的前体)

[表14]

各成分的比率％(Ia是错误折叠体)

Ia	Ib	Ic
			IGF-swap	native	unbridge
25.0	29.5	45.6
			17.5	32.7	49.8
18.3	31.7	50.0

〔实施例12〕雷珠单抗重折叠

(变性样品的准备)

以使得雷珠单抗(抗体的FAB片段)溶液变为5mM DTT的方式进行添加，并在37℃下静置60min。接着，以使其变为6.0M GdnHCl、7.5mM EDTA、75mM Tris、1.25mM DTT的方式混合变性溶液，在37℃下静置15min之后在5℃下静置过夜。

(FMR重折叠)

将上述制备的变性雷珠单抗溶液与缓冲液(0.5M ArgHCl、GSH 0.22mM、GSSG0.22mM)使用FMR装置进行混合，制备雷珠单抗重折叠溶液。使用类型5(V型，内径1.0mm)的微型混合器，以总流速为10mL/min进行重折叠。

(间歇式重折叠)

使上述制备的变性雷珠单抗溶液与缓冲液(0.5M ArgHCl、GSH 0.22mM、GSSG0.22mM)在试验管中混合，制备雷珠单抗重折叠溶液。以容量1mL、10mL进行重折叠。

(雷珠单抗的定量)

通过超滤过滤器浓缩后，对得到的样品进行凝胶过滤HPLC(柱，Superde x 75 10/300GL，GE医疗制；展开液0.1M磷酸钠、0.2M精氨酸盐酸盐、1M尿素、pH 6.8；流速0.8mL/min；检测法，225nm和280nm中的紫外吸收；定量用标准样品，纯化雷珠单抗)，对雷珠单抗进行定量。

(结果)

各条件中的雷珠单抗收率的比较示于图12。间歇式的重折叠的情况下，除了雷珠单抗之外，还检测到许多错误折叠体，收率为0.41、0.69％。与之相对，FMR重折叠条件下，收率提高至5.25％。由此表明，FMR重折叠对雷珠单抗的重折叠有效。

〔实施例13〕流量UP条件的探讨

(FMR重折叠)

将上述制备的变性rhIL-6溶液A与缓冲液(50mM AcONa，pH 5.0)使用FMR装置进行混合，制备rhIL-6重折叠溶液。使用类型5(V型，内径1.0mm)的微型混合器，以总流速为10、50、100、300mL/min进行重折叠。

(rhIL-6的定量)

对得到的样品进行凝胶过滤HPLC(柱，Superdex 75 10/300GL，GE医疗制；展开液0.1M磷酸钠、0.2M精氨酸盐酸盐、1M尿素、pH 6.8；流速0.8mL/min；检测法，225nm和280nm中的紫外吸收；定量用标准样品，纯化rhIL-6)，对rhIL-6进行定量。

(结果)

可知即使在总流速为10、50、100、300mL/min，微型混合器的内径为1.0mm的条件下，通过使用FMR的高速混合，能够抑制凝聚体的形成，通过收率。

[表15]

〔实施例14〕混合时间的推算

通过基于实施例6的方法进行各微型混合器的混合时间的计算。

构建包含注射器和注射泵、压力传感器、微混合器(V字型内径1.0mm)的混合性能评价体系(基于图3)。以流速为5～80mL/min对构建的体系输送水，测定此时产生的压力损失。计算各流量中的压力损失和混合时间的推算值。结果示于表16。根据该结果推算15ml/min以上的情况下混合时间为1msec以下。

[表16]

此外，为了测定高流量区域的压力损失，构建包含柱塞泵、压力传感器、微型混合器的混合性能评价体系，通过构建的体系，对在100～600mL/min的区间内输送水时的压力损失进行测定，由此进行混合时间的推算。混合器使用V字型、T字型，使用内径为1.0mm、0.5mm、0.25mm的混合器。压力损失和混合时间的比较示于以下表17和表18。取决于流速的压力损失增大的同时，推算的混合时间显示降低倾向。还确认了，内径越小，混合时间越有提高倾向。

[表17]

压力损失(Mpa)

[表18]

混合时间(msec)

Claims

1.一种制造重折叠的蛋白质的方法，其中，所述方法包含：

2.根据权利要求1所述的制造方法，其中，

由下述式(I)求得的混合时间小于3msec，

tm＝0.15ε^-0.45 (I)

3.根据权利要求1或2所述的制造方法，其中，

缓冲液的流速与不溶化的或失去了高阶结构的蛋白质的可溶化溶液的流速的合计为5mL/min以上。

4.根据权利要求1～3中的任一项所述的制造方法，其中，

缓冲液的流速与不溶化的或失去了高阶结构的蛋白质的可溶化溶液的流速的合计为1650mL/min以下。

5.根据权利要求1～4中的任一项所述的制造方法，其中，

微型混合器前与后的压力损失为1kPa～10MPa。

6.根据权利要求1～5中的任一项所述的制造方法，其中，

微型混合器内的混合时间小于1毫秒。

7.根据权利要求1～6中的任一项所述的制造方法，其中，

混合时，使X1mL/min的流速的缓冲液与X2mL/min的流速的可溶化溶液接触，

所述X1和Y的关系由下述式(1)表示，

所述X1和X2的关系由下述式(2)表示，

[数学式1]

式中，10≤X1，

8.根据权利要求1～7中任一项所述的制造方法，其中，

缓冲液的流速X1为10～1500mL/min。

9.根据权利要求1～8中任一项所述的制造方法，其中，

微型混合器的内径Y为0.1～1.0mm。

10.根据权利要求1～9中的任一项所述的制造方法，其中，

所述可溶化溶液包含：

尿素、

盐酸胍、

或三氟乙酸与乙腈的组合中的任一种。

11.根据权利要求1～10中的任一项所述的制造方法，其中，

所述重折叠方法中，在使可溶化溶液流通之前，用不包含蛋白质但包含变性剂的溶液填满流路。

12.根据权利要求1～11中的任一项所述的制造方法，其中，

所述经过重折叠的蛋白质为单体。

13.根据权利要求1～12中的任一项所述的制造方法，其中，

重折叠工序之后包含纯化工序。

14.一种蛋白质的重折叠装置，其是重折叠蛋白质的装置，其中，所述装置具备：

第一流路，其供缓冲液流通；

用于混合的微型混合器，其内径为0.1～1.0mm，且第一流路和第二流路在微型混合器中合流。

15.根据权利要求14所述的装置，其具备注射泵、柱塞泵或隔膜泵，它们用于输送缓冲液和蛋白质的可溶化溶液。