JP2022527517A - 一体型かつ連続した組換えタンパク質の製造 - Google Patents

一体型かつ連続した組換えタンパク質の製造 Download PDF

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Abstract

哺乳動物細胞において組換えタンパク質を製造するための一体型システム及び方法を提供する。このシステム及び方法は単回使用バイオリアクタ（ＳＵＢ）、タンジェンシャルフローろ過システム、カラムクロマトグラフィースキッド、タンクレスホールド、ウイルス不活性化プラグフローリアクタ及びポンプを含む。

Description

本主題の技術は、連続細胞培養システム及び方法を用いる培養動物細胞のタンパク質の製造、好ましくは哺乳動物細胞におけるタンパク質の製造方法に関する。
現在の連続細胞培養システム及び方法（灌流バイオリアクタ又は流加バイオリアクタを含む）は、スケーラビリティの欠如及び生産収率の低さを含む、多くの不都合に見舞われている。したがって、こうした制限を克服する、代替的な連続細胞培養システム又は方法が必要である。
本主題の技術の目標は、連続細胞培養システム及び方法の現在の限界を克服することである。
本発明の１つ以上の態様は、簡便さのために以下、番号付き条項（例えば、１、２、３など）として説明される。こうした条項は例として提供され、本主題の技術の限定するものとしては提供されない。以下の任意の従属条項が（任意の組合せにより）含まれ、個々の独立条項へと位置づけられてもよい。例えば、条項２が従属する条項１といったものである。他の条項は同様の方式にて表され得る。
１．組換えタンパク質製品を製造するための一体型システムであって、当該システムは単回使用バイオリアクタ（ＳＵＢ）、タンジェンシャルフローろ過システム、カラムクロマトグラフィースキッド、タンクレスホールド、ウイルス不活性化プラグフローリアクタ、及びポンプを含む、組換えタンパク質製品を製造するための一体型システム。
２．システムは自動化され、連続使用及び／又は単回使用である、条項１の一体型システム。
３．ＳＵＢ、タンジェンシャルフローろ過システム、カラムクロマトグラフィースキッド、タンクレスホールド、ウイルス不活性化プラグフローリアクタ及びポンプのそれぞれは、単回使用である、条項１に記載の一体型システム。
４．ＳＵＢは、約１０Ｌ～約２２５０Ｌの容積を有する灌流バイオリアクタを含む、条項１の一体型システム。
５．ＳＵＢは、約２Ｌ～約４５００Ｌの容積を有する流加バイオリアクタを含む、条項１の一体型システム。
６．ＳＵＢはタンクなしで管材により、ろ過生成物を生成するタンジェンシャルフローろ過システムへと流体的に接続される、条項５に記載の一体型システム。
７．ろ過生成物は、約１／４インチ～約３／８インチ（又は約６mm～約１０mm）の単回使用管材により、タンクなしで直接カラムクロマトグラフィースキッドへと運ばれる、条項６に記載の一体型システム。
８．ろ過生成物は熱交換器を用いて室温に冷却される、条項７に記載の一体型システム。
９．カラムクロマトグラフィースキッドはデュアルカラム捕捉クロマトグラフィーを含み、それぞれが流出液を生成する、条項１に記載の一体型システム。
１０．第１カラム又は捕捉カラムはタンパク質Ａカラムである、条項９に記載の一体型システム。
１１．第２カラムはアニオン交換カラムである、条項９に記載の一体型システム。
１２．カラムクロマトグラフィースキッドはタンクなしで管材によりタンクレスホールドに流体的に接続される、条項９に記載の一体型システム。
１３．流出液は約１／４インチ～約３／８インチ（又は約６mm～約１０mm）の単回使用管材により、タンクレスホールドへと運ばれる、条項９に記載の一体型システム。
１４．タンクレスホールドは、ウイルス不活性化プラグフローリアクタ（例えば、蛇行したデザイン又は結び目のデザインは、２０１８年１０月８日に出願され、そのそれぞれの全体の内容が参照として本明細書に組み入れられる同時係属中の特許出願である６２／７４２，５３０号及び／又は６２／７４２，５３４号に説明されるように形成する）に流体的に接続される、条項１に記載の一体型システム。
１５．ポンプがＳＵＢ、タンジェンシャルフローろ過システム、カラムクロマトグラフィースキッド、タンクレスホールド、及び／又はウイルス不活性化プラグフローリアクタに流体的に接続される、条項１に記載の一体型システム。
１６．ポンプは第１セットのポンプ及び第２セットのポンプを含む、条項１に記載の一体型システム。
１７．第１セットのポンプは、約６０mL／分～約５Ｌ／分又は約６０mL／分～約６００mL／分の範囲で動作する、条項１６に記載の一体型システム。
１８．第２セットのポンプは、約１２５mL／分～約２．５Ｌ／分の範囲で動作する、条項１６に記載の一体型システム。
１９．システムは、１日あたり１０ｇ～５，０００ｇの組換えタンパク質を処理可能である、条項１に記載の一体型システム。
２０．自動化された一体型単回使用連続細胞培養システムであって、
ａ．１０Ｌ～２２５０Ｌの単回使用バイオリアクタ（ＳＵＢ）、
ｂ．ろ過生成物を生成する単回使用タンジェンシャルフローろ過システム、
ｃ．流出液を生成する単回使用デュアルカラム捕捉カラムクロマトグラフィースキッド、
ｄ．タンクレスホールド及び
ｅ．単回使用ウイルス不活性化プラグフローリアクタ、並びに
ｆ．約６０mL／分～約５Ｌ／分、又は約６０mL／分～約６００mL／分の範囲で動作する第１セットのポンプ及び約１２５mL／分～約２．５Ｌ／分の範囲で動作する第２セットのポンプを含み、
単回使用ＳＵＢは、タンクなしで管材により、単回使用タンジェンシャルフローろ過システムへと流体的に取り付けられ、ろ過生成物は、タンクなしで、約１／４インチ～約３／８インチ（又は約６mm～約１０mm）の単回使用管材により、単回使用デュアルカラム捕捉カラムクロマトグラフィースキッドへと運ばれ、流出液は、タンクなしで、約１／４インチ～約３／８インチ（又は約６mm～約１０mm）の単回使用管材により、タンクレスホールドへと運ばれ、タンクレスホールドは単回使用ウイルス不活性化プラグフローリアクタに流体的に接続され、第１セットのポンプ及び第２セットのポンプは、構成要素ａ～ｅのうち１つ以上に流体的に接続される、自動化された一体型単回使用連続細胞培養システム。
２１．システムは、１日あたり１０ｇ～５，０００ｇの組換えタンパク質の間で処理可能である、条項２０に記載の自動化された一体型単回使用連続細胞培養システム。
２２．ＳＵＢは灌流バイオリアクタ又は流加バイオリアクタである、条項２０に記載の自動化された一体型単回使用連続細胞培養システム。
２３．実験室規模の自動化された一体型単回使用連続細胞培養システムであって、
ａ．１０Ｌ～２２５０Ｌの単回使用バイオリアクタ（ＳＵＢ）、
ｂ．ろ過生成物を生成する単回使用タンジェンシャルフローろ過システム、
ｃ．流出液を生成する単回使用デュアルカラム捕捉カラムクロマトグラフィースキッド、
ｄ．タンクレスホールド及び
ｅ．単回使用ウイルス不活性化プラグフローリアクタ、並びに
ｆ．約０．０６０mL／分～約５mL／分、又は約０．０６０mL／分～約０．６６００mL／分の範囲で動作する第１セットのポンプ及び約０．１２５mL／分～約２．５mL／分の範囲で動作する第２セットのポンプを含む、実験室規模の自動化された一体型単回使用連続細胞培養システム。
２４．単回使用ＳＵＢは、タンクなしで管材により単回使用タンジェンシャルフローろ過システムに流体的に取り付けられ、ろ過生成物は、タンクなしで約０．０１２～約０．０３６インチ（又は約０．３～約１mm）の単回使用管材により、単回使用デュアルカラム捕捉カラムクロマトグラフィースキッドに運ばれる、条項２３に記載の実験室規模の自動化された一体型単回使用連続細胞培養システム。
２５．流出液は、タンクなしで、０．０１２～０．０３６インチ（又は約０．３～約１mm）の単回使用管材により、タンクレスホールドに運ばれ、タンクレスホールドが単回使用ウイルス不活性化プラグフローリアクタに流体的に接続される、条項２４に記載の実験室規模の自動化された一体型単回使用連続細胞培養システム。
２６．第１セットのポンプ及び第２セットのポンプは、構成要素ａ～ｅの１つ以上に流体的に接続される、条項２５に記載の実験室規模の自動化された一体型単回使用連続細胞培養システム。
２７．ＳＵＢは灌流バイオリアクタ又は流加バイオリアクタである、条項２３に記載の実験室規模の自動化された一体型単回使用連続細胞培養システム。
２８．実験室規模の自動化された一体型単回使用連続細胞培養システムであって、
ａ．１０Ｌ～２２５０Ｌの単回使用バイオリアクタ（ＳＵＢ）、
ｂ．ろ過生成物を生成する単回使用タンジェンシャルフローろ過システム、
ｃ．流出液を生成する単回使用デュアルカラム捕捉カラムクロマトグラフィースキッド、
ｄ．タンクレスホールド及び
ｅ．単回使用ウイルス不活性化プラグフローリアクタ、並びに
ｆ．約０．０６０mL／分～約５mL／分、又は約０．０６０mL／分～約０．６６００mL／分の範囲で動作する第１セットのポンプ及び約０．１２５mL／分～約２．５mL／分の範囲で動作する第２セットのポンプを含み、
単回使用ＳＵＢは、タンクなしで管材により単回使用タンジェンシャルフローろ過システムに流体的に取り付けられ、ろ過生成物はタンクなしで約０．０１２～約０．０３６インチ（又は約０．３～約１mm）の単回使用管材により、単回使用デュアルカラム捕捉カラムクロマトグラフィースキッドに運ばれ、流出液はタンクなしで、０．０１２～０．０３６インチ（又は約０．３～約１mm）のタンクレスホールドに運ばれ、タンクレスホールドは、単回使用ウイルス不活性化プラグフローリアクタに流体的に接続され、第１セットのポンプ及び第２セットのポンプは構成要素ａ～ｅのうち１つ以上に流体的に接続される、実験室規模の自動化された一体型単回使用連続細胞培養システム。
２９．ＳＵＢは灌流バイオリアクタ又は流加バイオリアクタである、条項２８に記載の実験室規模の自動化された一体型単回使用連続細胞培養システム。
３０．システムは車輪に取り付けられる、条項１～２９のうちいずれか一項に記載の一体型システム。
３１．システムは、約１０～２０日間で約５～約６０kgの組換えタンパク質を作製する、条項１～３０のうちいずれか一項に記載の実験室規模の自動化された一体型システム。
本主題の技術の追加的な機能及び利点は以下の説明にて概説され、この目的は説明から明らかである又は本主題の技術の実践により習得される。本主題の技術の利点はここに説明され、実施態様は記載の説明及びこの特許請求の範囲にて特に指摘され、添付の図面に説明されるように、当業者により想定され得る。
前述の一般的な説明及び以後の詳細な説明は例示的かつ説明的なものであり、主張されるような本主題の技術の更なる説明を提供しようと意図される。
主張された方法、装置及びシステムのこうした及び他の機能、態様、及び利点は、添付の図面に対する参照と共に以下の詳細な説明を理解するときに、より良好に理解される。
３つのパイロットスケールでのｉＳｋｉｄの運転である１（△）、２（□）及び３（○）といった生細胞密度（実線、一次ｙ軸）及び生育能力（波線、二次ｙ軸）を示す。全ての運転は、１４日間以上組換えモノクローナル抗体を発現している哺乳動物の細胞株を動作させながら１００Ｌにて実施した。点線は＋／－３標準偏差を表す。 タンパク質Ａ工程の代表的な溶出クロマトグラムを例示する。 アニオン交換工程の代表的なクロマトグラムを示す。 プラグフローリアクタに入っている物質の代表的なｐＨ記録を示す。 プロセスフローを示す。 プラグフローリアクタ（インキュベーションチャンバと呼ばれる）及びタンクレスホールド（溶出流チャンバと呼ばれる）を含む、設計の概略を示す。単回通過タンジェンシャルフローろ過システムは、本出願では論じられない。 タンパク質Ａのサイクル数の関数としての、ＢＩ－５の運転１及び２の宿主細胞タンパク質値を示す。灌流ろ過生成物、タンパク質Ａクロマトグラフィー後、及びＡＥＸクロマトグラフィー後といった３種類の異なるユニットオペレーション後の結果を示す。ＣＨＯＰは、チャイニーズハムスターの卵巣タンパク質又は宿主細胞タンパク質を意味する。 サイクル数の関数としてのＢＩ％の低分子量（ＬＭＷ）及び高分子量（ＨＭＷ）値を示す。サンプルは単回使用ミキサから取得される。ＣＲは一貫した運転の略である。 全運転に対して実証されたアニオン交換工程の収率測定の一例を示す。
いかなる理論にも束縛されることを望むものではないが、本発明は、単回使用ポンプの特定のセットのサイズ、管材のサイズ及びカラムサイズを有する本主題の技術による自動化された組換え製造システム、並びに単回使用リアクタ（「タンクレスホールド」）、単回使用バッファ濃縮物希釈システム及びユニットオペレーション間のサージタンクなしの使用が、５００倍のダイナミックレンジを有するという驚くべき発見に部分的に基づいている。現在の灌流システムは１０～２０のダイナミックレンジしか有さない。
一態様では、本主題の技術は、管材によって単回タンジェンシャルフローろ過システムに取り付けられた、１０Ｌ～２２５０Ｌの単回使用灌流バイオリアクタ又は流加バイオリアクタ（ＳＵＢ）を制御する、自動化された一体型単回使用システムに関し、このろ過生成物は、１／４インチ～３／８インチの単回使用管材により、単回使用デュアルカラム捕捉クロマトグラフィースキッドに直接取り付けられ、その製品流出液は、タンクなしで１／４インチ～３／８インチの単回使用管材により、タンクレスホールド及び単回使用ウイルス不活性化プラグフローリアクタに取り付けられ、その生成物流出液は、１／４インチ～３／８インチ（又は径にして約６mm～約１０mm）の管材により、フロースルークロマトグラフィー工程へと取り付けられる。このシステムは、１日あたり１０ｇ～５，０００ｇの組換えタンパク質を処理可能である、６０mL／分～６００mL／分の範囲である単回使用のセットのポンプ及び１２５mL／分～２．５Ｌ／分の範囲である単回使用のセットのポンプを有する単回使用バッファ供給送達システムを使用する。本明細書にて使用される場合、用語「タンク」は、液体を保持及び混合することができ、使用中気液界面を有する容器を指す。
一実施態様では、ＳＵＢ機器は、スキッドの残りに対して他の機器の変更なしに１０～２２５０Ｌの異なる体積の別のＳＵＢへと変更され得る。ＳＵＢ機器は、ＳＵＢ枠組み、Ｏ２、ＣＯ２及び空気の質量フローコントローラ、再循環ポンプ及びろ過生成物ポンプを含む、耐久性のある構成要素として定義される。クロマトグラフィーカラム、任意の生成物接触物質、フローメータなどの単回使用アセンブリは、処理される物質の質量及び体積に応じてサイズを変更する。例えば、１００ＬのＳＵＢは通常、１Ｌのデュアル捕捉カラム及び約１．１～３Ｌのタンクレスホールドを必要とし得るが、２０００ＬのＳＵＢは１３Ｌのデュアル捕捉カラム及び約１４Ｌ～約３９Ｌのタンクレスホールドを必要とする場合がある。
別の実施態様では、タンクレスホールドはアフィニティーカラム体積の１．１～３倍の容積を有する。
別の実施態様では、バッファ供給システム及び付属のバルブ及びポンプにより、５倍の処理バッファ濃度のバッファ濃縮物からバッファ溶液の希釈を行うことができ、効果又は物質の損失なしで１日あたり少量（５０ｇ）～大量（５kg）を処理することができる。
別の実施態様では、単回使用熱交換器は、ＴＦＦとデュアル捕捉カラムの間のろ過生成物ラインに配置される。熱交換器は、約３７℃から２０～２５℃にろ過生成物の温度を低下させることができるようにサイズ決めされる。熱交換器のサイズは流量によって変化し、これは当業者には明らかである。
別の実施態様では、捕捉工程への溶液の供給は２つのポンプを含み、このうち一方は１つの水／希釈ラインに取り付けられ、他方のポンプは３～８のバッファ濃縮物に取り付けられ、このうちの一方は殺菌液体を含有する。
別の実施態様では、精製工程への溶液の供給は２つのポンプを含み、このうち一方は１つの水／希釈ラインに取り付けられ、他方のポンプは３～９のバッファ濃縮物に取り付けられ、このうち一方は１つの水／希釈ラインに取り付けられ、他方のポンプは３～８のバッファ濃縮物に取り付けられ、このうちの一方は殺菌液体を含有する。
別の実施態様では、ウイルス不活性化工程への溶液の供給は２つのバッファラインを含有し、少なくとも１つのラインは殺菌用ラインである。
別の実施態様では、ＳＰＴＦＦへの溶液の供給は１つのポンプ、及び１～２個のバッファ濃縮物、及び殺菌用の１つのラインを有する。
別の実施態様では、ポンプ特性は１００mL／分～１０Ｌ／分の流量を可能にする単回使用ポンプを含む。単一のポンプは通常、約２０倍、５％の最大ポンプ容量～９５％の最大ポンプ容量の範囲にわたり、正確に動作することができる。このようにして、０LPM～１０LPMの容量を有するポンプは、約０．５LPM～約９．５LPMで正確に動作することができる。ポンプは１０％～９０％の最大ポンプ容量、約１０倍の範囲で更により正確に動作することができる。バッファ濃縮物の使用は、最も正確なポンプがバッファ濃縮物ポンプでなければならず、１０～９０％の最大ポンプ容量以内で維持されるべきであることを意味する。５倍のバッファ濃縮物の流量における５％の差異は、意図されるよりも２０％異なるバッファをもたらし、これは通常、大半のバイオプロセスにとって多すぎる。
別の実施態様では、ポンプの各ペアは、６０mL／分～６００mL／分の範囲（バッファ濃縮物と同等）であるバッファ濃縮物ポンプ及び１２５mL／分～２．５Ｌ／分の範囲である別のセットのポンプを有し、主に希釈のためのものである。
別の実施態様では、より小さなスケールでは、バッファは１倍にて作製され得る。より小さなスケールでは、１倍の溶液が使用され、バッファポンプのみが使用される。当業者はこれらのポンプのサイズを好ましいものとして認識している。バッファ濃縮物及び希釈物用のポンプは同様の容量を有し得るが、容量の全ダイナミックレンジにおける影響はわずかである。
以下の表１は、表２に列挙されたパラメータに基づき、説明の能力の範囲を示す。実行可能な最小日別質量は、管材と比較すると、カラム体積を考慮することで最小日別質量よりも高くなる。この場合、カラム体積は管材体積のわずか約６倍の体積である（一例として１ｍの管材）。この余分なカラム体積は、ｉｓｋｉｄにおいて生成物の大幅な希釈を引き起こし、収率損失を引き起こすこともある。
Figure 2022527517000002
Figure 2022527517000003
Figure 2022527517000004
本発明の１つ以上の態様に関する様々な他の例又は実施態様は、簡便さのために以下、番号付き条項（１、２、３など）として説明される。こうした条項は例として提供され、本主題の技術を限定するものではない。既に言及したように、従属条項のいずれかは任意の組合せで組み合わされてよく、例えば、条項１といった個々の独立条項へと位置づけられる。他の条項は同様の方式にて表され得る。
１．管材により単回使用タンジェンシャルフローろ過システムに取り付けられた、１０Ｌ～２２５０Ｌの単回使用灌流バイオリアクタ（ＳＵＢ）を制御する自動化された一体型単回使用システムであって、このろ過生成物はタンクなしで、１／４インチ～３／８インチの単回使用管材により、単回使用デュアルカラム捕捉クロマトグラフィースキッドに取り付けられ、この生成物の流出液は、タンクなしで１／４インチ～３／８インチの単回使用管材により、タンクレスホールド及び６０mL／分～５Ｌ／分又は好ましくは６０mL／分～６００mL／分の範囲である単回使用のセットのポンプ及び１２５mL／分～２．５Ｌ／分の範囲であるセットのポンプを有する、単回使用ウイルス不活性化プラグフローリアクタに取り付けられる、自動化された一体型単回使用システム。
２．この生成物の流出液は、１／４インチ～３／８インチの管材によりクロマトグラフィー工程に取り付けられる、条項１に記載の一体型システム。
３．システムは、６０mL／分～６００mL／分の範囲の単回使用のセットのポンプ及び１日あたり、１０ｇ～５，０００ｇの組換えタンパク質を処理可能である１２５mL／分～２．５Ｌ／分の範囲のセットのポンプを有する、単回使用バッファ供給送達システムである、条項１又は２に記載の一体型システム。
４．捕捉カラムはタンパク質Ａカラムである、一体型システム。
５．第２カラムはアニオン交換カラムである、一体型システム。
６．細胞除去デバイスに取り付けられた２Ｌ～４５００Ｌの単回使用流加バイオリアクタ（ＳＵＢ）を制御する、自動化された一体型単回使用システムであって、この流出液は、１／４インチ～３／８インチの単回使用管材により単回使用デュアルカラム捕捉クロマトグラフィースキッドに取り付けられ、この生成物の流出液は、タンクなしで、１／４インチ～３／８インチの単回使用管材によりタンクレスホールド及び単回使用ウイルス不活性化プラグフローリアクタに取り付けられ、この生成物の流出液は、１／４インチ～３／８インチの単回使用管材によりクロマトグラフィー工程に取り付けられる、自動化された一体型単回使用システム。このシステムは、６０mL／分～６００mL／分の範囲である単回使用のセットのポンプ及び１日あたり１０ｇ～５，０００ｇの組換えタンパク質を処理可能である１２５mL／分～２．５Ｌ／分の範囲のセットのポンプを有する、単回使用バッファ供給送達システムを使用する。
７．単回使用タンジェンシャルフローろ過システムに取り付けられた１０mL～２２５０mLの単回使用灌流バイオリアクタ（ＳＵＢ）を制御する、実験室規模の自動化された一体型単回使用システムであって、このろ過生成物は、タンクなしで、０．０１２～０．０３６インチの単回使用管材により、単回使用デュアルカラム捕捉クロマトグラフィースキッドに取り付けられ、この生成物の流出液は、タンクなしで、０．０１２～０．０３６インチの単回使用管材により、０．０６０mL／分～５mL／分、又は好ましくは０．０６０mL／分～０．６６００mL／分の範囲である単回使用ポンプ及び０．１２５mL／分～２．５mL／分の範囲であるセットのポンプを有するタンクレスホールドに取り付けられる、実験室規模の自動化された一体型単回使用システム。
８．単回使用ウイルス不活性化プラグフローリアクタを有する、条項７に記載の実験室規模の一体型システム。
９．この生成物の流出液である、０．０１２～０．０３６インチの管材によりクロマトグラフィー工程に取り付けられる、条項７に記載の一体型システム。
１０．このシステムが、０．０６mL／分～０．６００mL／分の範囲である単回使用のセットのポンプ及び１日あたり１０mg～５，０００mgの組換えタンパク質を処理可能である０．１２５mL／分～２．５mL／分の範囲であるセットのポンプを有する単回使用バッファ供給送達システムである、条項７又は条項８又は条項９に記載の一体型システム。
１１．車輪上に取り付けられる、請求項１～６に記載の一体型システム。
１２．方法であって、請求項１～７からの一体型スキッドシステムは、１０日間、１４日間、２０日間で、５kg、１０kg、１５kg、２０kg、３０kg、４０～６０kgの抗体化合物を作製する、方法。
１３．１０日間、１４日間、２０日間で、５kg、１０kg、１５kg、２０kg、３０kg、４０～６０kgの組換えタンパク質を作製するための、上のスキッドデバイス／システムの使用。
１４．単回使用容器での５倍のバッファ濃縮物の使用。
１５．単回使用容器での１０倍のバッファ濃縮物の使用。
１６．システムへと接続可能である種々の容積を有するポータブルバイオリアクタ（例えば、１００Ｌ、５００Ｌ、１０００Ｌ、又は２０００Ｌの単回使用バイオリアクタ）の使用。
１７．捕捉工程、プラグフローリアクタ内及び精製工程において、１日あたり２回の殺菌溶液（１５分間、０．５ＭのＮａＯＨなど）の使用。
実施例１
自動化された単回使用システム
自動化された単回使用システムは、３／４インチの管材により、再循環ポンプ（Ｌｅｖｉｔｒｏｎｉｃｓ Ｐｕｍｐ ａｎｄ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ製の０．２μmのＴＦＦフィルタ）及びろ過生成物ポンプ（Ｑｕａｔｒｏｆｌｏ １５０）を有する単回使用タンジェンシャルフローろ過システムに取り付けられた、１００Ｌの単回使用灌流バイオリアクタ（ＳＵＢ）を制御した。
１／４インチの単回使用管材により、クロマトグラフィースキッド又は捕捉工程にて、ろ過生成物を単回使用の１ＬデュアルカラムであるＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ ＬＸ タンパク質Ａ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムへと取り付けた。各カラムオペレーションは、充填段階、３回の洗浄段階、溶出段階、ストリップ段階、殺菌段階、平衡化段階及び（場合により）保持段階を含む、タンパク質Ａ工程の標準段階からなり、これは当業者には公知である。使用されるバッファ及び体積を表２に示す。溶液をバッファ濃縮物から水で希釈した。以下の表２は、タンパク質Ａバッファ、体積及び動作パラメータを列挙する。希釈後のバッファの濃度を示す。２倍高かった洗浄２溶液を除き、希釈前のバッファの濃度は５倍高かった。
Figure 2022527517000005
デュアルカラム捕捉工程の各カラムを、一方のカラムは充填状態、もう一方のカラムは他の段階を通過した状態で並行して動作させた。
溶出段階の流出液を、バルブ及び１／４インチの管材を用いて３Ｌのタンクレスホールドへと方向付けた。プラグフローリアクタの動作準備が整うまで、タンクレスホールドに生成物の流出液を保持する。ｐＨ３．３～３．５の５０mmグリシンで、プラグフローリアクタを最初にプライミングした。プラグフローリアクタの準備が整うと、生成物をタンクレスホールドからプラグフローリアクタへと５０mL／分でポンプにより送り出しつつ、同時に７．５mL／分にて流れるｐＨ３．３の２Ｍのグリシンを生成物と混合させた。生じた生成物流はｐＨ３．３～３．５であった。プラグフローリアクタ中に含有された生成物流がタンクレスホールドから完全に除去されると、タンクレスホールドの流出液をバルブによって切り替え、排出した。次いでタンクレスホールドをフラッシュし、０．５ＭのＮａＯＨ溶液で３０分間殺菌した。同時に一連のバルブを切り替えて別のポンプを起動し、ｐＨ３．３の５０mmグリシンをプラグフローリアクタへとポンプで送り出すことで、プラグフローリアクタ内の流れを５０mL／分で維持し、これによってプラグフローリアクタを通る生成物の経路をもたらした。プラグフローリアクタの流出液のＵＶシグナルが１００ｍＡＵ超に上がったときには、予定していた汚水管から流出液を方向転換し、１／４インチの管材によりアニオン交換カラムへと方向付けつつ、３１５mmのトリス塩基からなる中和溶液をＰＦＲ生成物流出液に５８mL／分の速度で加えた。生成物流は、５００mLのアニオン交換カラム上を通過する前にスタティックミキサを通過した。
生成物流をプラグフローリアクタへと完全に排出した後、プラグフローリアクタからの流出液を廃棄するように方向付けた。次の製造サイクル前に、０．５ＭのＮａＯＨの殺菌溶液で少なくとも３０分間システムをフラッシュした。
充填工程及びその後の洗浄工程中にカラムを生成物がほとんど通過するように、当業者が熟知している弱分配クロマトグラフィーモードにてアニオン交換カラムを動作させた。アニオン交換カラムの条件を表３に示す。表３はアニオン交換バッファ、体積及び動作パラメータを列挙する。希釈後のバッファの濃度を示す。２倍高かった殺菌溶液を除き、希釈前のバッファの濃度は５倍高かった。
Figure 2022527517000006
アニオン交換からの生成物の流出液を、１／４インチの管材を介し、単回通過タンジェンシャルフロー（ＳＰＴＦＦ）工程に方向付ける。ＳＰＴＦＦ工程は、当業者が熟知している限外ろ過工程を用いて生成物を濃縮する。ＳＰＴＦＦからのろ過生成物流量は約５８mL／分であり、バルブによって濃縮された生成物を方向付け、１０体積％であり、ｐＨ６．０である１ＭのＭＥＳ溶液と混合させた。次いで１／４インチの管材を介し、混合物をバルブにより１００Ｌの単回使用ミキサ又は単回使用タンクへと方向付けた。生成物流がＳＰＴＦＦを通過した後、ＳＰＴＦＦの流出液を変更して廃棄し、０．５ＭのＮａＯＨ殺菌溶液で３０分間にわたりシステムをフラッシュした。
システムを１４日間動作させ、図１に示すようにmLあたり約１億５千万個の細胞の細胞密度を得た。図２ではタンパク質Ａ工程及び図３ではアニオン交換工程の代表的なクロマトグラムを示す。図４では、プラグフローリアクタを出入りする物質の代表的なｐＨ記録を示す。
実施例２
手法の概要
図５に示される図は、１００Ｌの単回使用灌流バイオリアクタシステムを利用する、１０００ｇ超の製剤化された原薬材料を製造する手法を説明する。この技術の現状は、特異的細胞株の要件に従うシードトレイン拡大手法が既存の流加手順に依存している必要がある。
実施例３
精製手法の概要
ここに説明される手法は、ｍＡｂの下流処理のためのものである。下流手法は、１日あたり、３個のバイオリアクタの体積の最大流量で０．４～３．３g/L/d又は０．８～６．６g/L/dの範囲での連続回収流の生産性を目的として設計されている。下流処理は８～１３日間行う。図６を参照されたい。
本実施例にて、連続して加えられる炭酸ナトリウム及び炭酸カリウムの混合物を用いて、Ｌ－乳酸ナトリウムが灌流培養液中にある場合に灌流培養液からの乳酸の消費をもたらしたであろうｐＨにおける上昇圧力を提供したが、恐らくは、連続方式又は半連続方式で培養液へと加えられた任意の適切な非毒性の塩基性物質は、同様の効果を提供することであろう。そのような塩基の例としては、とりわけ、水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムが挙げられ得る。
本主題の技術はその特定の実施態様を参照して詳細に説明されるが、その精神及び範囲から逸脱することなく、主張される発明に種々の変更及び修飾を行うことができることは、当業者には明らかであろう。したがって、例えば当業者は、日常的な実験のみを使用し、特定の物質及び本明細書において説明される手順に対する多数の等価物を認識又は確認することができるであろう。こうした等価物は、本主題の技術の範囲内にあり、かつ特許請求の範囲によって含まれると考えられる。
実施例４
異なるｍＡｂ間の製品品質の概要
発明者らはｉＳＫＩＤと呼んでいる組換えタンパク質製品を製造するための本発明の一体型システムの大規模な開発及び試験は、この技術が堅牢でありかつ信頼性があると実証している。１００Ｌのバイオリアクタを有するパイロットスケールのプロトタイプシステムの動作は、一貫した動作性能を実証している。このシステムは、いくつかの細胞株及び複数の製造運転を用いて試験される。
発明者らの発見は、従来の流加手法を用いて製造された原薬と比較した場合、ｉＳＫＩＤ（商標）を用いて製造された原薬が製品品質においては差異がないことを示している。高品質の物質を提供するｉＳＫＩＤ（商標）能力の実証として、プロトタイプシステムから得られたデータは、４種類のモノクローナル抗体であるＳＴＬ－Ｂ、ＡＮＤ－Ｔ、ＢＩ－５及びＢＩ－１０を製造する細胞株を示している。全ての分子は、特定のいかなる製品も開発することなく、ｉＳＫＩＤシステムを用いて製造された。全ての物質又は原薬を、情報収集のみを目的として非ＧＭＰ環境にて生成した。原薬材料における製品品質データの概要を表４に示す。このデータは、生成物間の製品品質は臨床用途に適していることを示す。運転間（又はバッチ間）の一貫性は、一貫した条件下でのｉＳＫＩＤ（商標）１回を超えて運転させた製品に関して実証された。
Figure 2022527517000007
ＢＩ－５分子について選択された特質に関する周期的段階の異なる段階における製品品質のプロファイルもまた、稼働間での一貫性を例示する（図７、図８）
実施例５
収率を測定するためのｉＳＫＩＤ（商標）能力
ｉＳＫＩＤ（商標）にて１つの中央自動化システムを使用することにより、リアルタイムでのデータの生成が可能となり、これによりリアルタイムでの収率計算が可能となる。この計算は、監査機関への正式な提出に通常は必要とされる。通常、この計算をリアルタイムで行うことは困難である。ｉＳＫＩＤ（商標）を使用することにより、本発明者らは、周期的段階におけるユニットオペレーションごとに容易に利用可能である収率を実証した。アニオン交換工程のための収率測定の一例を、フル運転で実証する（図９）。
本明細書に開示される装置及び方法は、灌流バイオマニュファクチャリングに有用であり、したがって、治療用の組換えタンパク質を製造する産業的方法を向上させるのに有用である。

Claims (30)

  1. 組換えタンパク質製品を製造するための一体型システムであって、前記システムが、単回使用バイオリアクタ（ＳＵＢ）、タンジェンシャルフローろ過システム、カラムクロマトグラフィースキッド、タンクレスホールド、ウイルス不活性化プラグフローリアクタ、及びポンプを含む、一体型システム。
  2. システムが自動化され、連続使用及び／又は単回使用である、請求項１に記載の一体型システム。
  3. 前記ＳＵＢ、前記タンジェンシャルフローろ過システム、前記カラムクロマトグラフィースキッド、前記タンクレスホールド、前記ウイルス不活性化プラグフローリアクタ及び前記ポンプのそれぞれが単回使用である、請求項１に記載の一体型システム。
  4. 前記ＳＵＢが、約２Ｌ～約２２５０Ｌの容積を有する灌流バイオリアクタを含む、請求項１の一体型システム。
  5. 前記ＳＵＢが、約２Ｌ～約４５００Ｌの容積を有する流加バイオリアクタを備え、請求項１の一体型システム。
  6. 前記ＳＵＢがタンクなしで管材により、ろ過生成物を生成する前記タンジェンシャルフローろ過システムへと流体的に接続される、請求項５に記載の一体型システム。
  7. 前記ろ過生成物が、タンクなしで約１／４インチ～約３／８インチの単回使用管材により、直接前記カラムクロマトグラフィースキッドへと運ばれる、請求項６に記載の一体型システム。
  8. 前記ろ過生成物が熱交換器を用いて室温に冷却される、請求項７に記載の一体型システム。
  9. 前記カラムクロマトグラフィースキッドがデュアルカラム捕捉クロマトグラフィーを備え、それぞれが流出液を生成する、請求項１に記載の一体型システム。
  10. 第１カラム又は捕捉カラムがタンパク質Ａカラムである、請求項９に記載の一体型システム。
  11. 第２カラムがアニオン交換カラムである、請求項９に記載の一体型システム。
  12. 前記カラムクロマトグラフィースキッドがタンクなしで管材により前記タンクレスホールドに流体的に接続される、請求項９に記載の一体型システム。
  13. 前記流出液が、１／４インチ～３／８インチの単回使用管材により、前記タンクレスホールドへと運ばれる、請求項９に記載の一体型システム。
  14. 前記タンクレスホールドが、前記ウイルス不活性化プラグフローリアクタに流体的に接続される、請求項１に記載の一体型システム。
  15. 前記ポンプが、前記ＳＵＢ、前記タンジェンシャルフローろ過システム、前記カラムクロマトグラフィースキッド、前記タンクレスホールド、及び／又は前記ウイルス不活性化プラグフローリアクタに流体的に接続される、請求項１に記載の一体型システム。
  16. 前記ポンプが、第１セットのポンプ及び第２セットのポンプを備える、請求項１に記載の一体型システム。
  17. 前記第１セットのポンプが、約６０mL／分～約５Ｌ／分又は約６０mL／分～約６００mL／分の範囲で動作する、請求項１６に記載の一体型システム。
  18. 前記第２セットのポンプが、約１２５mL／分～約２．５Ｌ／分の範囲で動作する、請求項１６に記載の一体型システム。
  19. 前記システムが、１日あたり１０ｇ～５，０００ｇの組換えタンパク質を処理可能である、請求項１に記載の一体型システム。
  20. 自動化された一体型単回使用連続細胞培養システムであって、
    ａ．１０Ｌ～２２５０Ｌの単回使用バイオリアクタ（ＳＵＢ）、
    ｂ．ろ過生成物を生成する単回使用タンジェンシャルフローろ過システム、
    ｃ．流出液を生成する単回使用デュアルカラム捕捉カラムクロマトグラフィースキッド、
    ｄ．タンクレスホールド及び
    ｅ．単回使用ウイルス不活性化プラグフローリアクタ、並びに
    ｆ．約６０mL／分～約５Ｌ／分、又は約６０mL／分～約６００mL／分の範囲で動作する第１セットのポンプ及び約１２５mL／分～約２．５Ｌ／分の範囲で動作する第２セットのポンプを含み、
    前記単回使用ＳＵＢが、タンクなしで管材により、前記単回使用タンジェンシャルフローろ過システムへと流体的に取り付けられ、前記ろ過生成物が、タンクなしで、１／４インチ～３／８インチの単回使用管材により、前記単回使用デュアルカラム捕捉カラムクロマトグラフィースキッドへと運ばれ、前記流出液が、タンクなしで、１／４インチ～３／８インチの単回使用管材により、前記タンクレスホールドへと運ばれ、前記タンクレスホールドが前記単回使用ウイルス不活性化プラグフローリアクタに流体的に接続され、前記第１セットのポンプ及び前記第２セットのポンプが、構成要素ａ～ｅのうち１つ以上に流体的に接続される、自動化された一体型単回使用連続細胞培養システム。
  21. 前記システムが、１日あたり１０ｇ～５，０００ｇの組換えタンパク質を処理可能である、請求項２０に記載の自動化された一体型単回使用連続細胞培養システム。
  22. 前記ＳＵＢが、灌流バイオリアクタ又は流加バイオリアクタである、請求項２０に記載の自動化された一体型単回使用連続細胞培養システム。
  23. 実験室規模の自動化された一体型単回使用連続細胞培養システムであって、
    ａ．１０Ｌ～２２５０Ｌの単回使用バイオリアクタ（ＳＵＢ）、
    ｂ．ろ過生成物を生成する単回使用タンジェンシャルフローろ過システム、
    ｃ．流出液を生成する単回使用デュアルカラム捕捉カラムクロマトグラフィースキッド、
    ｄ．タンクレスホールド及び
    ｅ．単回使用ウイルス不活性化プラグフローリアクタ、並びに
    ｆ．約０．０６０mL／分～約５mL／分、又は約０．０６０mL／分～約０．６６００mL／分の範囲で動作する第１セットのポンプ及び約０．１２５mL／分～約２．５mL／分の範囲で動作する第２セットのポンプを含む、実験室規模の自動化された一体型単回使用連続細胞培養システム。
  24. 前記単回使用ＳＵＢが、タンクなしで管材により前記単回使用タンジェンシャルフローろ過システムに流体的に取り付けられ、前記ろ過生成物が、タンクなしで約０．０１２～約０．０３６インチの単回使用管材により、前記単回使用デュアルカラム捕捉カラムクロマトグラフィースキッドに運ばれる、請求項２３に記載の実験室規模の自動化された一体型単回使用連続細胞培養システム。
  25. 前記流出液が、タンクなしで、０．０１２～０．０３６インチの単回使用管材により、前記タンクレスホールドに運ばれ、前記タンクレスホールドが前記単回使用ウイルス不活性化プラグフローリアクタに流体的に接続される、請求項２４に記載の実験室規模の自動化された一体型単回使用連続細胞培養システム。
  26. 前記第１セットのポンプ及び前記第２セットのポンプは、構成要素ａ～ｅの１つ以上に流体的に接続される、請求項２５に記載の実験室規模の自動化された一体型単回使用連続細胞培養システム。
  27. 前記ＳＵＢが灌流バイオリアクタ又は流加バイオリアクタである、請求項２３に記載の実験室規模の自動化された一体型単回使用連続細胞培養システム。
  28. 実験室規模の自動化された一体型単回使用連続細胞培養システムであって、
    ａ．２Ｌ～２２５０Ｌの単回使用バイオリアクタ（ＳＵＢ）、
    ｂ．ろ過生成物を生成する単回使用タンジェンシャルフローろ過システム、
    ｃ．流出液を生成する単回使用デュアルカラム捕捉カラムクロマトグラフィースキッド、
    ｄ．タンクレスホールド及び
    ｅ．単回使用ウイルス不活性化プラグフローリアクタ、
    ｆ．並びに約０．０６０mL／分～約５mL／分、又は約０．０６０mL／分～約０．６６００mL／分の範囲で動作する第１セットのポンプ及び約０．１２５mL／分～約２．５mL／分の範囲で動作する第２セットのポンプを含み、
    前記単回使用ＳＵＢが、タンクなしで管材により前記単回使用タンジェンシャルフローろ過システムに流体的に取り付けられ、前記ろ過生成物が、タンクなしで約０．０１２～約０．０３６インチの単回使用管材により、前記単回使用デュアルカラム捕捉カラムクロマトグラフィースキッドに運ばれ、前記流出液がタンクなしで、０．０１２～０．０３６インチの単回使用管材により前記タンクレスホールドに運ばれ、前記タンクレスホールドが、前記単回使用ウイルス不活性化プラグフローリアクタに流体的に接続され、前記第１セットのポンプ及び前記第２セットのポンプが構成要素ａ～ｅのうち１つ以上に流体的に接続される、実験室規模の自動化された一体型単回使用連続細胞培養システム。
  29. 前記システムが車輪に取り付けられる、請求項１～２８のうちいずれか一項に記載の一体型システム。
  30. 前記システムが、約１０～２０日間で約５～約６０kgの組換えタンパク質を作製する、請求項１～２９のうちいずれか一項に記載の一体型システム。
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