TW201444863A - 增加蛋白質之焦－麩胺酸形成的方法 - Google Patents

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Abstract

一種在純化過程中將蛋白質的N-端麩醯胺和/或麩胺酸殘基轉化成焦-麩胺酸的方法。

Description

增加蛋白質之焦-麩胺酸形成的方法
本發明涉及一種蛋白質轉化的方法，可在蛋白質純化過程中，將蛋白質N-端麩醯胺和/或麩胺酸殘基轉化成焦-麩胺酸。而且，本發明亦與純化帶有N-端焦麩胺酸之蛋白質的方法有關。本發明所提及的方法可被採用於製備具有N-端焦-麩胺酸的蛋白質之製造過程，尤其是在製備藥物產品中的活性藥物成分(active pharmaceutical ingredient,API)時可使用。
大多數重組治療性蛋白質呈現一個或多個轉譯後修飾現象，這些修飾可能是在其核糖體合成時發生或(更常見)在合成完畢後發生。載至目前為止，大量的蛋白質轉譯後修飾已被詳細描述，並且這些修飾可能對受影響的蛋白質之結構層面或其功能角色造成影響。常見與治療性蛋白質相關之轉譯後修飾包括：羧化和羥基化、醯胺化和硫酸化、雙硫鍵之形成和蛋白質裂解過程，以及醣化作用、異構化作用、氧化作用、N-端麩醯胺或麩胺酸環化成焦-麩胺酸、斷裂和聚集。因此，轉譯後修飾可以透過該蛋白質之酶促性修飾或透過非酶促性轉化而引起，並且轉譯後修飾有可能在細胞培養過程或蛋白質純化或貯存期間，發生在表現該蛋白質的宿主體內。
重組單株抗體對於生物技術產業界已具有深遠價值，而且相當多的抗體已被批准可用於治療多種疾病。由於抗體通常是在哺乳動物細胞中生 產，例如：CHO細胞，它們可能會有多種不同的轉譯後修飾，其造成產物的異質性。異質性可以經由改變抗體的表面電荷而引起，無論是直接的，如：改變帶電荷殘基的數量，或間接的，如：改變表面電荷分佈的化學或物理性變更，例如：醣化作用、重鏈之C-端離胺酸的羧肽酶剪切，和N-端麩醯胺或麩胺酸殘基轉化成焦-麩胺酸的環化作用。
抗體通常是由基本的結構單元所組成，每個結構單元具有兩個大的重鏈和兩個小的輕鏈，透過雙硫鍵和非共價交互作用結合而成。由於抗體重鏈有數種不同的類型，且抗體也有數種不同的種類，基於其所帶重鏈之不同而被分類為不同的抗體同型(isotype)。例如：有四種人類IgG(1至4)之同型，取決於重鏈恆定區上的基因。輕鏈的恆定區是由兩個基因(κ或λ)編碼而成。因此，每個IgG同型可以是κ或λ，舉例而言IgG1 κ。儘管在不同的細胞株類型中會生產數種類型的抗體，最具臨床意義的抗體是IgG1或IgG2類型的全長抗體。
許多人類的IgG1或IgG2類型的抗體在其輕鏈或重鏈或兩者的N-端含有麩胺酸(Glu)和/或麩醯胺(Gln)殘基。輕鏈基因的顯著部分編碼麩胺酸或麩醯胺。這種N-端麩胺酸和/或麩醯胺殘基有可能進行環化作用而形成焦-麩胺酸鹽(pGlu)，如圖1所示。因此，焦-麩胺酸鹽的形成發生在幾乎所有具臨床意義的重要抗體上，並且形成焦-麩胺酸鹽過程的不同完成程度是其異質性的常見來源。這種存在於治療用途的抗體中的異質性是不被希望的，由於這些變化會改變抗體的表面電荷性質，無論是藉由直接改變帶電基團的數量或間接地引入結構性變更。這種修飾具有降低生物活性，以及改變藥物動力學和抗原性的潛力。
於麩醯胺環化期間，N-端的一級胺(在中性pH中帶正電)被轉換成中性醯胺，導致抗體淨電荷的改變。該反應伴隨著氨(17Da)的喪失。因此，由於主峰是典型的全環化物質或是在反相高效液相色層分析法(HPLC)中洗提較晚的峰(這是由於在失去N-端的胺後增加的疏水性所造成)，缺乏環化作用可能會在陽離子交換色層分析法中被檢測為鹼性變異體。
麩胺酸的環化作用是發生在側鏈的羧基和N-端胺上，於是形成中性醯胺並釋放水分子(18Da)。淨電荷仍然保持不變，這是因為一個酸性基團和一個鹼性基團於反應中縮合所使然，但是，失去兩個帶電荷殘基會增加分子的疏水性，以致可以在反相HPLC中檢測到。
在抗體中形成焦-麩胺酸的機制尚未完全清楚。環化作用可以自發性發生，或者藉由一種酵素稱麩醯胺醯基環化酶來協助發生。目前仍然不清楚麩醯胺醯基環化酶在CHO細胞株中是否處於活化狀態，CHO是最常用來生產抗體的細胞株；然而，透過自發性環化作用的速率顯示出該反應可能是非酶促反應。
舉例而言，Yu等人(Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 2006；42：455-463)以為期3個月的時間研究非酶促之焦-麩胺酸鹽如何在單株抗體的輕鏈和重鏈兩者之N-端麩胺酸(Glu或E)上形成。Yu等人指出，mAbs上的Glu經非酶促環化作用轉變成pGlu可能是mAb的生產和儲存過程中發生的主要降解途徑之一，而此反應的發生取決於過程中的pH值和溫度條件。他們得出的結論是，焦-麩胺酸是否可能誘發進一步的修飾並改變mAb的生物活性或治療效力是不清楚的，而且他們建議密切監測N-端pGlu的形成，因為它可以是確保具N-端Glu之mAb療效品質的至關重要因素。
Chelius等人(Anal.Chem.2006,78,2370-2376)也研究了幾種單株抗體的輕鏈和重鏈兩者N-端麩胺酸之非酶促焦-麩胺酸鹽的形成。結果發現，這種非酶促反應確實非常普遍地發生，並且可以在37℃和45℃作用數週後即可被檢測出。該反應的速率是在幾個不同pH值的水性緩衝液中測量而得，顯示最少的焦-麩胺酸形成在pH值6.2，且在pH值4和pH值8可增加焦-麩胺酸形成。
關於麩醯胺(Gln或Q)可轉化為焦-麩胺酸鹽，Dick等人(Biotechnology and Bioengineering,Vol.97,No.3,June 15,2007)指出：重組之單株抗體，其N-端麩醯胺的環化作用是自發性發生的，並得出結論，在許多最終承裝容器中單株抗體已接近完全轉化，最可能是結合了生物反應器的反應作用和純化條件所造成，而大部分的修飾在生物反應器中發生。此研究證明，在許多重組抗體中普遍觀察到的焦-麩醯胺異變體是在生物反應器內發生的，且僅少數是來自於純化過程，透過高溫和溶劑組合成分可加速其形成。具體地說，較高的轉化率是在37℃，含有75mM氯化鈉的35mM磷酸鹽緩衝液(pH值6.2)中發現。
因此，轉譯後修飾如N-端麩醯胺或麩胺酸殘基轉化為焦-麩胺酸的環化作用，導致所表現的蛋白質具異質性，不同批次的產品可能會有不同程度的異質性，這是因為在生產和純化條件中的細微變化所造成。因此，製造生物相似性蛋白質較為困難的挑戰之一是配合創新產品的異質性。所以，需要一個具有分析支援而較為健全並可再現的工業大規模純化過程，以迎合對藥用蛋白質(例如：抗體)純度的嚴格要求。
本發明的第一層面涉及一種用於純化過程中將蛋白質N-端麩醯胺和/或麩胺酸殘基轉化成焦-麩胺酸的方法，其步驟包括使蛋白質在促進N-端麩醯胺和/或麩胺酸殘基環化作用的條件下作用。
本發明的第二個層面涉及一種方法，用於純化含有N-端麩醯胺和/或麩胺酸殘基的蛋白質，本方法包括轉換該蛋白質的N-端麩醯胺和/或麩胺酸殘基為N-端焦-麩胺酸的步驟。此轉換是在促進N-端麩醯胺和/或麩胺酸殘基的環化作用的條件下完成。
本發明的第三個層面論及一種方法，關乎製備一種可作為藥物產品的API而帶有N-端焦-麩胺酸的蛋白質，該方法包括在第一或第二層面中任一項所述之純化方法，以及其具體實例。
本發明的目的之一是提供替代過程以製備一種N-端焦-麩胺酸已被強化或在可控制等級的蛋白質，以減少異質性或得到產品所需的異質性。
發明人目前已經發現，藉由在具有N-端麩醯胺和/或麩胺酸殘基之蛋白質的純化過程中，加入作用/轉化N-端麩醯胺和/或麩胺酸殘基為焦-麩胺酸的步驟，尤其是在單株抗體的純化過程中，其異質性的程度可被操控到所需要的水平。
在閱讀了本說明書、圖式和申請專利範圍後，本發明的其它目的將變得顯而易見。
定義：
本文所用的術語“同一性”是指兩個胺基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的相關性，並由參數“序列同一性”來描述。對於本發明目的而言，兩個胺基酸序列之間的序列同一性程度是依據Needleman-Wunsch演算法 (Needleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48：443-453)來確認，並在EMBOSS軟件包的Needle程式(EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice et al.,2000,Trends Genet.16：276-277)中執行，優先選用3.0.0或更新版本。所使用的選擇性參數是：開放一個空位的罰分為10分，延伸一個空位的罰分0.5分，和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩陣。Needle輸出時標記為“最長同一性”(其獲取是因使用nobrief選項)的作為百分比同一性，並計算如下：(同一性殘基×100)/(所比對序列的長度-所比對序列的空位總數)。
本文所用的術語“N-端的”，“N-端”或“胺基端”指的是位在蛋白質或多肽的末端部位之游離胺基(-NH2)。描寫蛋白質或多肽序列的方式通常是將N-端放在左邊，並且寫的順序是從N-到C-端。當該蛋白質或多肽從信息RNA轉譯時，它是從N-端被建構至C-端。
本文所用的術語“麩醯胺”，“2-胺基-4-胺甲醯基丁酸”，“Gln”或“Q”是由標準遺傳密碼編碼成的20個胺基酸中的其中一個。其側鏈是一個醯胺，主要是以醯胺官能基取代了麩胺酸的側鏈羧基而形成。因此，它可以被視為麩胺酸的醯胺。
本文所用的術語“麩胺酸”，“2-胺戊二酸”，“Glu”或“E”是由標準遺傳密碼編碼而成的20個胺基酸中的其中之一。在正常生理pH值中，其側鏈羧酸官能基以帶負電荷之去質子化羧酸鹽形式存在。
本文所用術語“多肽”是指透過肽鍵連接之單一直鏈的胺基酸單體。其中，已併入多肽的胺基酸被稱為“殘基”；每個多肽在其個別端點，各具有一個N-端殘基和C-端殘基。本文中所用的多肽是指含超過約20個連續 胺基酸的長胜肽。
本文所用術語“蛋白質”指的是由一個或多個多肽組成，並典型地折疊成球狀或纖維狀形式的生物化學化合物，促進生物功能的執行。蛋白質可經由肽鍵以外的鍵結方式連接，例如：多肽組成的蛋白質可以透過雙硫鍵連接。本文所用術語“蛋白質”，涵蓋抗體、蛋白質和抗體的片段、蛋白質和抗體的裂解形式，以及其它類似物，如大於約20個連續的胺基酸殘基。此外，本文中所使用的蛋白質，旨在涵蓋天然存在的多肽和重組產生的多肽。
本文所用的術語“焦-麩胺酸”，“5-側氧基脯胺酸”，“氧脯胺酸(pidolic acid)”，或“焦-麩胺酸鹽”是廣泛指稱不常見的胺基酸衍生物，其麩胺酸或麩醯胺之游離胺基環化並形成內醯胺。在許多蛋白質(如：菌紫質，纖維蛋白，纖維蛋白原)，神經肽和激素(如：神經調壓素、胃泌素、脂肪細胞素(Apelin)及食慾素A)和抗體(例如：英夫利昔單抗(Infliximab)、西妥昔單抗(Cetuximab)、利妥昔單抗(Rituximab)、曲妥珠單抗(Trastuzumab)、貝伐單抗(Bevacizumab)、帕尼單抗(Panitumumab)、阿達木單抗(Adalimumab)、蘭尼單抗(Ranibizumab))中皆可找到。N-端麩醯胺和麩胺酸殘基可以自發地環化形成焦-麩胺酸鹽。這是數種封閉N-端型態中其中的一種，其造成在使用埃德曼(Edman)化學之N-端定序時出現問題，因其中所需要的游離一級胺基不存在於焦-麩胺酸中。酵素如焦-麩胺酸鹽胺肽酶可以藉由切除焦-麩胺酸鹽殘基而還原成游離之N-端。
本文所用“純化過程”指的是一個過程或一系列旨在從複雜混合物中分離出蛋白質的過程。該蛋白質可能由一種或多種同功型組成，意即表現 出異質性。術語“純化過程”包括但不侷限於蛋白質和抗體的純化。起始材料通常是細胞培養(如：哺乳動物細胞培養、酵母菌培養或微生物培養)且在純化過程中的各個步驟可從包含蛋白質的基質中釋放蛋白質，從混合物中分離出蛋白質和非蛋白質部分，最後從所有其他蛋白質中分離出所要的蛋白質。若所要的蛋白質是一種抗體，典型分離方式包括：蛋白質A親和色層分析法、陽離子交換色層分析法、陰離子交換色層分析法、疏水性交互作用和/或羥基磷灰石色層分析法。
本文所用術語“抗體”乃指由四個蛋白質鏈，兩條重鏈(H)和兩條輕鏈(L)藉由雙硫鍵相互連接的免疫球蛋白分子。每條重鏈由重鏈可變區(本文縮寫為HCVR或VH)和重鏈恆定區(CH)組合而成。重鏈恆定區包含三個結構域：CH1、CH2和CH3。每條輕鏈是由輕鏈可變區和輕鏈恆定區組合而成。輕鏈恆定區則是由一個結構域CL所組成。VH區和VL區可以進一步細分成高變異區，稱為互補決定區(CDRs)，散佈其中之區域為更保守的區域，稱為框架區(FR)。每個VH區和VL區由三個CDR和四個FR組成，從胺基端到羧基端按以下順序排序成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。所述抗體包括，例如：多株抗體、單株抗體、Fab和其單鏈Fv(scFv)片段、雙特異性抗體、異共軛物、人類抗體和人類化抗體。此類抗體可以以各種不同的方式製成，包括：融合瘤培養、在細菌或哺乳動物細胞培養中重組表現和在基因轉殖動物中重組表現。抗體亦可以從顯示系統中表現的序列庫選擇一段序列來製備，這些顯示系統包括：絲狀噬菌體、細菌、酵母或核糖體。文獻中有大量教導如何選擇特定的生產方法，如：Chadd and Chamow,Curr.Opin.Biotechnol.,12：188-194(2001)。製造方法的選擇 取決於幾個因素，包括：所需抗體的結構，抗體上碳水化合物部分的重要性，易於培養和純化，以及成本。許多不同抗體的結構可以使用標準的表現技術來生產，包括：全長抗體、抗體片段，如：Fab和Fv片段，以及包含來自不同物種組成的嵌合抗體。
本文所用的術語“藥物產品”是指劑型，其包含活性藥物成分(API)，適合施用於哺乳動物，如：人類個體，劑型可含合適的載體和/或賦形劑，並在臨床試驗使用過，或由國家、區域或國際權威機構批准上市。藥物產品包含蛋白質，例如：由本發明的任何一種方法製備之蛋白質或抗體，也可以是藉由常規技術製備，如Remington：The Science and Practice of Pharmacy 1995,edited by E.W.Martin,Mack Publishing Company,19th edition,Easton,Pa所描述。藥物產品可能會以傳統形式生產，例如：膠囊、錠劑、低壓凍乾餅塊或粉末、氣霧劑、溶液劑、懸浮液或局部應用，特別是作為注射劑，如：皮下或靜脈注射。所述藥物產品可在多種藥學上可接受的調配物中發現，並且可能混於一種或多種生理學可接受的載體。所使用的藥物載體或稀釋劑可以是傳統的固態或液態載體或稀釋劑。固態載體的實例有乳糖、石膏粉、蔗糖、環糊精、滑石、明膠、瓊脂、果膠、阿拉伯膠、硬脂酸鎂、硬脂酸或纖維素的低階烷基醚。液態載體的例子有糖漿、花生油、橄欖油、磷脂、固醇、脂肪酸、脂肪酸胺、聚氧乙烯、等滲透壓緩衝液、水和無菌生理鹽水溶液。
圖一：此圖為N-端麩醯胺和N-端麩胺酸環化過程中焦-麩胺酸形成的機制示意圖。
圖二：此圖顯示出兩種市售的利妥昔單抗批號Ref Lot M86188和Ref Lot B6109B01之陽離子交換高效液相色層分析法(IEX-HPLC)數據，以及本文所生產製備的D83 BSR4利妥昔單抗。前峰、主峰和後峰被標示在色層分析法的圖表中。主峰被發現由缺乏兩個C-端離胺酸殘基的利妥昔單抗分子組成，以及帶有完整4個已轉化為焦-麩胺酸鹽的麩醯胺殘基。比較市售的利妥昔單抗抗體製劑及本文所生產製備的D83 BSR4利妥昔單抗，兩者後峰外觀之顯著的差異主要是因為N-端麩醯胺殘基環化不完整所引起。
圖三：此附圖指出了四張線圖代表AEX(陰離子交換)和CEX(陽離子交換)的總峰面積和不同溫度下作用時間之間的相關性。上面兩個線圖為環境溫度或室溫作用情形，下面兩個線圖則為37℃作用情形。FT指色層分析法的流過液。
圖四：此附圖顯示利妥昔單抗後峰同功型轉化成主峰同功型的動力學，在環境溫度(上圖區)，在37℃(中圖區)和45℃(下圖區)，在低蛋白質濃度(1.85毫克/毫升；左圖區)，在中蛋白質濃度(3.7毫克/毫升；中圖區)，以及在高蛋白質濃度(9.25毫克/毫升；右圖區)的溶液中，加入磷酸鈉至35mM並滴定至pH值6.25。
圖五：此附圖顯示不同的磷酸鹽濃度(30、60和90mM)、氯化鈉濃度(50和25mM)於pH值5.8和6.2情況下影響利妥昔單抗後峰同功型轉變成主峰同功型的轉化動力學。
本發明的發明者已經發現，在具有N-端麩醯胺和/或麩胺酸殘基之蛋白質純化過程中，藉由引入作用/轉化N-端麩醯胺和/或麩胺酸殘基至焦-麩胺 酸的步驟，藉此蛋白質異質性的程度可以被操控，例如：把異質性降低到所要的水平，並同時提高所需蛋白質的產量。
蛋白質的N-端麩醯胺和麩胺酸能進行環化作用而形成焦-麩胺酸鹽，如圖一所示。在麩醯胺環化作用進行期間，N-端的一級胺(在中性pH下帶正電)被轉換為中性醯胺，造成該蛋白質淨電荷的改變。該反應伴隨著氨(17Da)的喪失，結果，缺少環化作用可能在陽離子交換色層分析法中被檢測為鹼性變異體，因為主峰為典型的全環化類型或在反相HPLC呈現為洗提較晚的峰，由於失去N-端胺後疏水性增加所導致。
麩胺酸環化作用的發生是透過側鏈的羧基和N-端胺，形成一個中性醯胺並釋放水分子(18Da)。淨電荷保持不變，因為一個酸性基團和一個鹼性基團於反應中縮合所使然，但是，失去兩個帶電荷殘基會增加分子的疏水性，以致可以在反相HPLC中檢測到。
由於許多人類抗體在其N-端都含有麩胺酸和/或麩醯胺殘基，因此焦-麩胺酸鹽的形成會發生於許多具臨床重要性的抗體製備之時，並經常導致所表現抗體的異質性，以致不同批次的產品可能會有所不同，乃因生產和純化條件中的細微變化所造成。這現象同樣發生於蛋白質的生產過程，包括多肽，因此這是在大規模生產蛋白質時的重大問題，如工業等級的規模。
本發明的第一個層面關係到一種方法，即在蛋白質純化過程中，將蛋白質的N-端麩醯胺和/或麩胺酸殘基轉化成焦-麩胺酸的方法，涵蓋使蛋白質作用於可促進其N-端麩醯胺和/或麩胺酸殘基環化的條件下之步驟。
本發明的第二個層面關係到一種方法，可用於純化含有N-端麩醯胺和/或麩胺酸殘基的蛋白質，本方法包括轉換該蛋白質的N-端麩醯胺和/或麩胺 酸殘基成N-端焦-麩胺酸的步驟。這樣的轉換，是在促進N-端麩醯胺和/或麩胺酸殘基環化作用的條件下完成。
本文所用的純化方法可根據本技術領域中已知的方法，然依據特定的蛋白質而有所改變。蛋白質純化方案取決於待純化蛋白質與不想要的蛋白污染物之間的大小、電荷及溶解度之分子特性差異。基於這些參數可採用的技術包括：分子大小排阻色層分析法、離子交換色層分析法、微差沉澱法等。
用於純化抗體之方法通常是以親和色層分析法為基礎來取得所要的抗體，典型的是蛋白質A親和色層分析法。蛋白質A親和色層分析法是指利用蛋白質A來分離或純化物質和/或顆粒，其中蛋白質A一般而言是固定在固相上。蛋白質A親和色層分析過程完成後，通常接著進行離子交換和/或疏水交互作用和/或混合模式色層分析步驟。這樣的過程一般還包括至少兩個病毒削減步驟，通常削減的方法是在親和步驟降低洗提法的pH值，並且在過程中的一個合適位置加增病毒過濾器。在抗體純化過程中除去不純的物質包括：不完整的抗體、抗體片段、二聚體和聚集體、DNA、病毒、HCP(宿主細胞蛋白質)、蛋白質A滲出液、內毒素及其他相關的雜質。
本發明的一項具體實例，其中蛋白質是從一種酶、激素或抗體中挑選出。適合使用的蛋白質實例涵蓋下述任何的蛋白質，只要它含有一個或多個N-端麩醯胺和/或麩胺酸殘基，包括：細菌視紫質、纖維蛋白原、膠原蛋白、激肽、神經調壓素、胃泌素、脂肪細胞素和食慾素A抗體或抗體片段。抗體的實例包括，但不限於：曲妥珠單抗(Trastuzumab)、英夫利昔單抗(Infliximab)、巴利昔單抗(Basiliximab)、達利珠單抗(Daclizumab)、阿達 木單抗(Adalimumab)、奧馬珠單抗(Omalizumab)、吉妥珠單抗(gemtuzumab)、利妥昔單抗(Rituximab)、貝伐單抗(Bevacizumab)、西妥昔單抗(Cetuximab)、奧法木單抗(Ofatumumab)、微圖組單抗(Veltuzumabor)、奧克力組單抗(Ocrelizumab)、帕尼單抗(Panitumumab)、蘭尼單抗(Ranibizumab)、替伊莫單抗(Ibritumomab,Tiuxetan)、阿昔單抗(Abciximab)、艾庫組單抗(Eculizumabe)、阿崙單抗(Alemtuzumab)、奥佐米星(Ozogamicin)、依法利珠單抗(Efalizumab)、帕利珠單抗(Palivizumab)、那他珠單抗(Natalizumabf)、奧馬珠單抗(Omalizumab)和托珠單抗(Tocilizumab)。
在本發明的進一步具體實例，所使用的抗體是具有輕鏈序列SEQ ID NO：3和重鏈序列SEQ ID NO：4的曲妥珠單抗，以及具有輕鏈序列SEQ ID NO：5和重鏈序列SEQ ID NO：6之貝伐單抗。
在本發明的另一項具體實例，所使用的抗體是抗-CD20單株抗體。抗-CD20抗體的合適實例包括：利妥昔單抗、奧法木單抗、微圖組單抗或奧克力組單抗。
在本發明中一個較佳的具體實例，所使用的抗體與利妥昔單抗有相同的序列，如：利妥昔單抗。
進一步的具體實例，所使用的蛋白質包含與利妥昔單抗輕及重鏈序列相同的序列，即是SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2個別對應的序列。
在本發明的進一步具體實例中，蛋白質包含之序列與SEQ ID NO：1具有至少90%的同一性，例如：有95%、97%、98%、99%的同一性，並與SEQ ID NO：2有至少90%的同一性，例如：95%，97%，98%，99%的同 一性。
在本發明的進一步具體實例中，蛋白質在轉換前，具有1至4個N-端麩醯胺和/或1至4個N-端麩胺酸殘基。因此，如果此蛋白質是單鏈蛋白質，它可能含有一個N-端麩醯胺殘基，或是一個N-端麩胺酸殘基。然而，如果該蛋白質是由一個以上的子單元組成，它可能包含一個N-端麩醯胺殘基和一個N-端麩胺酸殘基，或兩個N-端麩醯胺殘基，或兩個N-端麩胺酸殘基。如上述解釋，抗體包含4條多肽鏈(即子單元)，兩條重鏈(H)和兩條輕(L)鏈，並由雙硫鍵相互連接成。每個重鏈序列可能編碼入一個N-端麩醯胺殘基或一個N-端麩胺酸殘基。類似地，每個輕鏈序列可能編碼入一個N-端麩醯胺殘基或一個N-端麩胺酸殘基。因此，在進一步的具體實例中，所使用的蛋白質是具有2個或4個N-端麩醯胺和/或麩胺酸殘基之抗體，根據本發明的方法進行轉換，可以選擇2個N-端麩醯胺殘基，4個N-端麩醯胺殘基，2個N-端麩胺酸殘基，4個N-端麩胺酸殘基，或2個N-端麩醯胺殘基和2個N-端麩胺酸殘基。
N-端麩醯胺和/或麩胺酸殘基轉變為焦-麩胺酸可以是自發地發生，或者它可以經由一種酶，如：麩醯胺醯基環化酶來輔助進行。麩醯胺醯基環化酶已經應用於各種胜肽類激素和蛋白質的麩醯胺和麩胺酸的環化作用，而且其酵素活性已經在不同組織中被檢測到。麩醯胺和麩胺酸的自發性環化作用在被存放於較高溫度下的純化抗體中也可被檢測到(Schilling et al.,FEBS Lett.,2004,563,191-196；Kumar and Bachhawat,Current Science,Vol.102,No.2,25 January 2012)。
在本發明的一個具體實例中，N-端麩醯胺和/或麩胺酸殘基轉化為焦- 麩胺酸是一種非酶促轉化。一般情況下，非酶促轉化發生在溫度升高時，在合適的一段時間內，並且pH值的變化亦有助於轉化。這些參數中的任何一個，以及兩個或三個這些參數的任意組合，被認為是本發明的具體實例。
適合N-端麩醯胺和/或麩胺酸殘基進行轉換成焦-麩胺酸的溫度範圍是從20-50℃，諸如從25-45℃，諸如從35-40℃，如37℃。適合N-端麩醯胺和/或麩胺酸殘基進行轉換成焦-麩胺酸的時間長度是在4至120小時範圍內，諸如從12到96小時，諸如從24至72小時，例如從8到48個小時。
適合N-端麩醯胺和/或麩胺酸殘基進行轉換成焦-麩胺酸的pH值範圍是3.5-9.0，諸如從4.0-8.0，諸如從4.5-7.5，諸如從5.0-7.0，諸如從5.8-6.5，例如在pH值為6.2。
在本發明中的一個典型具體實例，轉換發生在20-50℃的溫度下，為時4至120小時，像是在溫度30-45℃，例如37-40℃下進行12至72小時。
非酶促轉化將N-端麩醯胺和/或麩胺酸殘基轉化成焦-麩胺酸，可能會出現在許多不同的介質中。蛋白質存在溶液或懸浮液中時合適的介質，可從水、細胞培養液、緩衝液，如：磷酸鹽緩衝液、Tris-HCl緩衝液，或碳酸銨緩衝液中選擇。在純化過程中，當蛋白質結合到色層分析樹脂或膜片上時，轉換也可發生。
一般情況下，從N-端麩醯胺和/或麩胺酸殘基轉化成焦-麩胺酸的非酶促轉化，可能會發生在溶液中，如：磷酸鹽緩衝液。
在本發明的進一步具體實例中，轉換是在細胞培養液中進行。
在本發明的進一步具體實例中，轉換是在一種緩衝液中進行，如：磷酸鹽緩衝液或碳酸銨緩衝液。
一般情況下，蛋白質N-端麩醯胺和/或麩胺酸殘基轉化成焦-麩胺酸的非酶促轉化，可發生在從一個大規模生產可以承裝超過50公升細胞培養液之生物反應器中獲得的蛋白質，在其被收集並被部分純化之後進行。該轉化可典型地在一個10毫升至10公升的容積，在靜態條件下或以適當的攪拌下進行；而在本發明的一個具體實例中，轉換是在至少10毫升的容積下執行。
特別適合從N-端麩醯胺和/或麩胺酸殘基非酶促轉化成焦-麩胺酸的介質，是含有緩衝液濃度從5到150mM的介質，諸如從10到125mM，諸如從25到100mM。緩衝液也可以含有鹽，如NaCl，具有從5到150mM範圍內的濃度，諸如從10至125mM，諸如從25到100mM，諸如從50到85mM。
在本發明的進一步具體實例中，非酶促轉化從N-端麩醯胺和/或麩胺酸殘基非酶促轉化成焦-麩胺酸的緩衝液濃度，選擇在20mM到150mM的範圍內。在本發明的一個典型具體實例中，緩衝液的濃度約為90mM。
特別較優先選擇的緩衝液是pH值3.5之35mM磷酸鹽緩衝液含75mM NaCl、pH值6.2之35mM磷酸鹽緩衝液含75mM NaCl、pH值為7.0之100mM的Tris-HCl緩衝液、pH值8.6的100mM碳酸銨緩衝液、pH值6.2的35mM磷酸鹽緩衝液、pH值6.2之35mM磷酸鹽緩衝液含75mMNaCl、pH值6.2之60mM磷酸鹽含50mM NaCl、pH值6.2之60mM磷酸鹽緩衝液含25mM NaCl、pH值6.2之90mM磷酸鹽緩衝液含25mM的NaCl，或pH值6.2之90mM磷酸鹽緩衝液含50mM NaCl。
從N-端麩醯胺和/或麩胺酸殘基轉化成焦-麩胺酸的轉化率，取決於所選用的緩衝液、轉化發生的溫度，及允許轉化進行的時間長度。熟習該項技術者會辨識導致轉化的最佳條件，而不會造成蛋白質降解或不需要的轉譯 後修飾。在許多情況下，盡可能得到越多N-端麩醯胺和/或麩胺酸殘基轉化成的焦-麩胺酸，越具優勢。
在本發明的具體實例中，從N-端麩醯胺和/或麩胺酸轉化成焦-麩胺酸的轉化率達到至少50%，亦即在蛋白質的N-端麩醯胺和/或麩胺酸至少有50%是焦-麩胺酸。例如：具有兩個N-端麩醯胺殘基的蛋白質或抗體，可能會在轉換後導致異質性組合物的形成而含具有0、1或2個焦-麩胺酸的蛋白質，只要是焦-麩胺酸殘基的總數佔蛋白質組合物的50%或更多。
在本發明的進一步具體實例中，經轉化作用N-端麩醯胺和/或麩胺酸所轉化成的焦-麩胺酸，達到至少53%，諸如從53%至68%。
在本發明更進一步的具體實例中，經轉化作用N-端麩醯胺和/或麩胺酸所轉化成的焦-麩胺酸，達到至少68%，諸如至少75%，諸如至少80%，諸如至少85%，諸如至少90%，諸如至少95%，諸如至少99%。
熟習該項技術者了解如何辨別並測量N-端麩醯胺和/或麩胺酸已轉換成焦-麩胺酸的數量。然而，測量焦-麩胺酸形成程度的合適方法已被描述於2006年Lyubarskaya等人(Analytical Biochemistry 348,24-39)，及2007年Dick等人(Biotechnology and Bioengineering,Vol.97,No.3,June 15,2007)之論文。直接測定環化的N-端麩醯胺，最近也使用電灑Q-TOF質譜分析法來完成(Gadgil et al.,2006 J.Am.Soc.Mass Spectrom.17：867-872.)。
如上所述，用於純化抗體的方法一般是基於親和色層分析法、典型的是蛋白質A親和色層分析法，隨後透過離子交換色層分析步驟，並在該方法的合適位置加上病毒削減步驟。
本發明方法的進一步之具體實例，本方法還進一步包括以下步驟：使 用合適的樹脂協助蛋白質A捕獲，陰離子交換色層分析法，使用合適的樹脂進行陽離子交換色層分析法，在陽離子交換色層分析步驟之前轉化的步驟即已發生，較佳者為緊接在陽離子交換色層分析步驟之前發生。
在本發明方法的進一步具體實例中，本方法包括以下步驟：(a)使用合適樹脂的蛋白質A捕獲步驟，(b)在低pH值下進行病毒去活化，(c)一種陰離子交換色層分析法，(d)轉化該蛋白質的N-端麩醯胺和/或麩胺酸成焦-麩胺酸，(e)一種使用合適樹脂陽的離子交換色層分析法，和使用梯度洗提法來分離產物之同功型，(f)一種病毒過濾法，及(g)一種超濾作用/透濾作用。
在本發明方法的進一步具體實例中，步驟(a)-(g)是依照該特定的順序進行。
在本發明方法的進一步具體實例中，步驟(d)之後安插一個被動冷卻的步驟，通常是在步驟(e)之前。
在本發明的內容中，蛋白質A捕獲步驟(a)可以使用任何合適的蛋白質A樹脂過濾器或介質來執行。蛋白質A是一種細菌細胞壁蛋白質，主要藉由其Fc區結合到哺乳動物的IgGs。在它的自然狀態中，蛋白質A有五個IgG結合區，以及其他功能未知的區域。蛋白質A的樹脂有幾個市售來源。熟習該項技術者了解何者才是適合的蛋白質A樹脂過濾器或介質，也可以是修飾過的蛋白質A樹脂、過濾器或介質。然而，合適的蛋白質A樹脂、 過濾器或介質包括，但不限於，來自奇異醫療集團(GE Healthcare)的MabSelectTM Sure和密理博(Millipore)公司的ProSep Ultra PlusTM。一個非限制性例子即以MabSelectTM填充的適用管柱，可以用於較大規模的純化過程，例如20cm x 21cm管柱，其柱床體積為約6.6公升。無論何種管柱，管柱可以使用合適的樹脂填充，諸如MabSelectTM或ProSep Ultra PlusTM。
在本發明的內容中，蛋白質A捕獲步驟通常是在結合/洗提模式下進行，透過把澄清的收集溶液載入可結合蛋白質的樹脂。熟習該項技術者了解哪一種洗滌條件適合用以除去蛋白質A樹脂或介質中的雜質。然而，洗滌緩衝液通常是選自具有7.0-8.0之pH值、含20-100mM的Tris和20到1.0M NaCl的緩衝液。一個合適的洗提緩衝液例子可以是一種洗提緩衝液包含大約200mM的醋酸鹽，50mM的NaCl且pH值約為3.5。
蛋白質可在多種細胞中表現，包括細菌如：大腸桿菌和芽孢桿菌，酵母菌如：酵母菌屬(Saccharomyces)、畢赤酵母菌屬(Pichia)、麴菌屬(Aspergillus)、鐮菌屬(Fusarium)和克魯維酵母菌屬(Kluyveromyces)，藻類，植物細胞，昆蟲細胞和哺乳動物細胞如CHO(中國倉鼠卵巢)細胞、融合瘤、BHK(幼倉鼠腎臟)細胞、骨髓瘤細胞、HEK-293細胞、人類類淋巴母細胞和小鼠細胞。許多複雜的蛋白質，例如：抗體，通常表現於CHO細胞、小鼠骨髓瘤細胞如NSO和NS1細胞，或人類胚胎視網膜母細胞諸如PER.C6TM。因為這樣的哺乳動物細胞含有內生性類反轉錄病毒顆粒，反轉錄病毒去活化步驟，如步驟b)，對於準備提供臨床用途之哺乳動物細胞生產的蛋白質是有必要的。熟習該項技術者了解如何進行反轉錄病毒去活化步驟。然而，病毒去活化通常是在蛋白質A捕獲步驟所得到的析出液中執 行，透過降低從蛋白質A捕獲步驟得到的析出液的pH值。因此，析出液的pH值可以降低至3.0-4.0的範圍內，時間維持在5分鐘至24小時，例如pH值從3.1到4，例如從3.2到4，例如從3.3到4，例如從3.4到4，例如從3.5到4，例如從3.6到4，例如從3.7到4，例如從3.8到4，例如至pH值為4或從3到3.9，例如從3.1到3.9，例如3.2到3.9，例如從3.3到3.9，例如從3.4到3.9，例如從3.5到3.9，例如從3.6到3.8，例如至pH值為3.6。
如上所述，從蛋白質A捕獲步驟所得到的析出液可以被維持在上述pH值中，時間持續5分鐘至24小時，例如從10分鐘到240分鐘，例如從20至90分鐘，而從蛋白質A親和純化步驟所得到的析出液可先過濾，再降低該析出液的pH值和/或調整pH值後再過濾。在低pH值病毒去活化步驟結束時，所得產物可被中和，依下一步流程所需可再調整其pH值。譬如析出液的pH值可被調整至pH為7.5~8.5。
蛋白質A捕獲步驟之後，可接續進行陰離子交換色層分析步驟，可以在管柱模式下以一定的流速操作，或在分批操作模式下，藉由將離子交換樹脂浸入輕度攪拌中的樣品溶液，隨後進一步藉由過濾步驟交換液體介質。然而，在一個較佳的具體實例中此陰離子交換色層分析步驟c)是以流過模式的陰離子色層分析步驟來操作。如此考量下，熟習該項技術者知道如何定義合適條件的pH值，和用於載入第一個離子交換劑之離子強度，此條件將會保留抗體在流過液中，同時去活化的病毒顆粒和其它雜質則被結合到陰離子樹脂上，因此從該抗體溶液中移除。
合適的陰離子交換色層分析樹脂、過濾器或介質的實例在本技術領域是已知的，並且涵蓋以瓊脂糖為基底的樹脂和圓珠、葡聚糖圓珠、聚苯乙 烯圓珠及聚苯乙烯/二乙烯苯樹脂。較優先選擇的是，該陰離子交換樹脂是一種基於四級胺基陰離子交換劑，且鑲嵌在瓊脂糖基質上，例如：安瑪西亞公司(Amersham-Biosciences/Pharmacia)出產之瓊脂糖凝膠CL-6B或瓊脂糖凝膠快速流動(Sepharose Fast Flow；FF)。這類例子有安瑪西亞公司出產之瓊脂糖凝膠Q，賽多利斯賽多結Q(Sartorius Sartobind Q)或頗爾野馬Q(Pall Mustang Q)。較優先選擇的陰離子交換材料是來自奇異醫療集團出產的Q-瓊脂糖凝膠快速流動樹脂(Q-Sepharose Fast Flow)。
有關陰離子交換色層分析法之平衡緩衝液，根據本發明，較優先選擇的是具有鹽類型置換劑的鹽濃度，例如：氯化鈉從1到150mM的範圍，更好的是從5到110mM，最好的是從20至100mM範圍的鹽。平衡緩衝液的pH值較好的是在pH值為6.5至9.0範圍內的，更好的是在pH值為7.5至8.5範圍內的，最好的是在pH值為7.9至8.2範圍內的。有關平衡緩衝液，根據本發明，較好的是含有Tris在1至100mM範圍內，更好的是5至50mM，最好的是10至30mM的Tris。根據本發明的平衡緩衝液，其導電性，較好的是在pH值為8.0下低於10毫西門子/厘米。
根據本發明，第一個陰離子交換色層分析步驟一般上是緊接著進行焦-麩胺酸鹽轉化步驟，以便允許未環化的N-端麩醯胺和/或麩胺酸殘基轉化成焦-麩胺酸鹽。在純化過程中，蛋白質N-端麩醯胺和/或麩胺酸殘基轉化成焦-麩胺酸的合適條件已經描述如上。然而，根據本發明，N-端麩醯胺和/或麩胺酸殘基轉化成焦-麩胺酸鹽之後，如果轉換過程已經在溫度高於約25℃狀態下執行，可以接著選擇性進行冷卻步驟。此冷卻步驟可以經由主動冷卻過程，亦即例如使用以水為基礎的冷卻程序或流過熱交換器；或利用被動 冷卻過程，亦即沒有使用到耗能的機械配件如：泵和風扇，以讓溫度降低。冷卻過程可以持續直到所得到的轉化溶液達到約18至30℃的溫度。冷卻過程可以進行的時間長達1至120小時的範圍，例如從12到96小時，例如從24到72小時，譬如從24至48小時。在本發明中一個較佳的具體實例，轉化過程包括為時12~72小時的被動冷卻步驟。
在焦-麩胺酸鹽轉化步驟結束時，緩衝液條件可以根據後續步驟的需求來調整。例如：該轉化溶液的pH值可用醋酸調節至約pH值5.5。
根據本發明，在焦-麩胺酸鹽轉化步驟之後，可用具合適的樹脂和梯度洗提之陽離子交換色層分析法來分離產物同功型。陽離子交換劑合適的例子，包括：S-瓊脂糖凝膠FF或SP-瓊脂糖凝膠HP〔法碼西亞(Pharmacia)公司〕，SP-瓊脂糖凝膠FF〔西格瑪(Sigma)公司〕和波羅斯(Poros)HS50〔美商應用生命系統(Applied Biosystems)股份有限公司〕。較好的陽離子交換劑是美商應用生命系統股份有限公司的波羅斯HS50。
焦-麩胺酸鹽轉化步驟的蛋白質溶液可用醋酸調節至pH值約為pH 5.5，並載入陽離子交換劑。合適的洗滌緩衝液含有5至50mM範圍內的醋酸鈉和5至50mM範圍內的NaCl，而其pH值可以在5.0至7.0的範圍內。被結合的蛋白質可以用梯度洗提法洗提，從15至180mM的NaCl，超過13管柱沖洗成數個分液。洗提後，可將蛋白質分液進行分析並匯集。
於陽離子交換色譜分析步驟之前，執行轉換步驟之特別優勢在於轉化物種的不同電荷。因此，蛋白質分子在N-端麩醯胺尚未完全轉變成焦-麩胺酸時，帶更多正電。相對應地，例如一種抗體具有4個N-端麩醯胺殘基，其中該抗體的一個分液具有一個N-端麩醯胺殘基轉變成焦-麩胺酸，以及第 二分液具有兩個N-端麩醯胺殘基轉變成焦-麩胺酸，以及第三分液具有三個N-端麩醯胺殘基轉變成焦-麩胺酸，以及第四分液，其中所有四個N-端麩醯胺殘基被轉化為焦-麩胺酸，將導致形成四種不同的同功型帶有四種不同的電荷。這樣不同帶電的同功型可以藉由陽離子交換色層分析被分離出來，並且可以去除較不需要的同功型。
根據本發明，在陽離子交換步驟後會執行一項病毒過濾程序。病毒去活化可以經由使用合適的過濾器來達成。雖然本發明的某些具體實例，在主要的蛋白質恢復階段採用這樣的過濾方式，在其它具體實例中，它是被採用於純化過程的其它階段，包括像倒數第二個或最後的純化階段。在某些具體實例中，用於病毒去活化的過濾器另有其他選擇，例如，但不限於，ViresolveTM過濾器(密理博公司)，Zeta PlusVRTM過濾器〔坤諾(CUNO)公司〕，PlanovaTM過濾器〔日本旭化成製藥(Asahi Kasei Pharma)公司〕和頗爾(Pall)公司之Ultipor DV50TM過濾器。較優選的過濾器是Planova 20N小病毒型過濾器。
病毒過濾後的蛋白質溶液經由超濾作用/透濾作用(UF/DF)以達到濃縮和緩衝液交換目的。緩衝液交換可透過利用30kDa分子量截止膜之切面流過濾(TFF)來執行，和透濾處理以得到無清潔劑形式的最終調配緩衝液。
本發明的第三個層面涉及一種方法，用於製備具有N-端焦-麩胺酸之蛋白質，以便作為藥物產品，其中該方法包含在純化過程中，轉化蛋白質N-端麩醯胺和/或麩胺酸殘基成焦-麩胺酸，該純化過程包含在促進N-端麩醯胺和/或麩胺酸殘基的環化作用的條件下培養蛋白質。
本發明的第四個層面論及一種方法，關乎製備具有N-端焦-麩胺酸之蛋 白質，以便作為藥物產品的API，該方法包含具有N-端麩醯胺和/或麩胺酸殘基的蛋白質純化方式，該純化方法包括蛋白質N-端麩醯胺和/或麩胺酸殘基轉化成N-端焦-麩胺酸的步驟，在促進N-端麩醯胺和/或麩胺酸殘基環化作用的條件下進行。
關係到本發明的第一或第二個層面的任何上述具體實例，也是第三和第四個層面的具體實例。
在一個具體實例中，所述藥物產品包含抗體，通常從以下抗體中選擇：曲妥珠單抗、英夫利昔單抗、巴利昔單抗、達利珠單抗、阿達木單抗、奧馬珠單抗、吉妥珠單抗、利妥昔單抗、貝伐單抗、西妥昔單抗、奧法木單抗、微圖組單抗、奧克力組單抗、帕尼單抗、蘭尼單抗、替伊莫單抗、阿昔單抗、艾庫組單抗、阿崙單抗、奥佐米星、依法利珠單抗、帕利珠單抗、那他珠單抗、奧馬珠單抗和托珠單抗。在一個較佳的具體實例中，所用抗體是抗-CD20抗體。
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本文列舉的數值範圍，僅意欲作為個別提及每一個單獨數值在該範圍內的簡略表達方式，除非本文另外指明，並且每個單獨數值被納入本說明書中，就如同它在本文中被個別詳述引用。除非另有說明，本文提供的所有精確數值代表相對應之近似值(例如：關於一個特定因子或測量所提供的所有精確示範數值，可以被視為是提供了相對應的近似測量值，適當時透過使用“大約”一詞作修飾)。
本文中所描述的所有方法可以任何合適的順序進行，除非本文另有說明或以其它方式與內文明顯相抵觸。
本文提供的任何和所有使用的實例或示範性文字(例如：“諸如”)僅旨在更清楚地闡明本發明，且不造成限制本發明的範圍，除非另有說明。在本說明書中沒有文字應該被理解為暗示任何元素對本發明的實踐而言是不可或缺的，除非同樣清楚明確地指出說明。
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本發明包含列舉於各層面或本文提出之請求項的標的之所有修正和等效物，至法律允許的最大範圍。
本發明藉由下列實施例進一步說明，但是，不應被解釋為限制保護範圍。在前述中揭露和在以下實施例所述的的特徵，可單獨和以任何組合方式，成為了解本發明中不同形式之資料。
實施例：
實施例一
選擇表現利妥昔單株抗體(也以商品名Rituxan被知曉)的CHO生產細胞株，並用來在一個10公升之單次使用生物反應器中以生產利妥昔單抗抗體，此反應器具攪拌槽設計並使用直接饋料批式發酵程序。
利妥昔單抗是嵌合抗體，具有小鼠可變區和人類IgG1重鏈和Kappa輕鏈恆定區。利妥昔單抗的重鏈和輕鏈的N-端皆有麩醯胺(在除去分泌訊息胜肽後)，而重鏈具有離胺酸位於其C-端。N-端麩醯胺能透過細胞酵素和化學轉換環化成為焦-麩胺酸，而C-端之離胺酸被細胞的羧肽酶剪切是很常見的。這兩種修飾降低蛋白質的正電荷數目，並且它們的N-端和C-端修飾後的異質性造成陽離子交換高效液相色層分析法(IEX-HPLC)出現複雜的數據圖表(如圖二所示)。
該澄清的收集樣品先載入使用MabSelect SuRe樹脂的蛋白質A親和色層分析步驟，且以結合/洗提模式進行。該MabSelect SuRe先用5倍管柱容積的溶液來洗滌，此溶液為20mM Tris，1M NaCl，pH值為8.0。隨後用2.5倍管柱容積的溶液來洗滌，溶液為20mM Tris，50mM NaCl，pH值為8.0，於結合在管柱上的利妥昔單抗抗體被洗提前進行，再用4.5倍管柱容積200 mM醋酸鹽，50mM NaCl，pH值3.5±0.1的溶液將利妥昔單抗洗提出來，然後以低pH值的方式進行病毒去活化，在環境溫度下作用105±15分鐘。
病毒去活化後，利用pH值8.5的0.6M Tris,50mM NaCl，將溶液中和至pH值為8，並進一步藉由帶有Q-瓊脂糖凝膠快速流動樹脂之陰離子交換色層分析法，在流過操作模式下執行純化。這個過程是已知能提供品質較好的DNA和病毒清除效果。根據以往的經驗，如果電導率10毫西門子/厘米，良好的病毒清除成效可預期在pH值8.0之AEX-FT時即可得到。這可以透過利用注射用水(WFI)簡單稀釋來達成，但隨著處理容量增加，結果處理時間也隨之增加。為了確保一個簡單的2倍稀釋將可靠地促成最終AEX載入低於10毫西門子/厘米，值得一試的是可以將蛋白質A洗滌和洗提緩衝液中的NaCl濃度減少一半。
所得到的流過液經由陽離子交換高效液相色層分析法(IEX-HPLC)，在Dionex PROPAC WCX-10管柱中進行分析，使用安捷倫(Agilent)公司的高效液相色層分析系統，並與市售可用的兩個不同批次的利妥昔單抗抗體製劑(標示為Ref Lot M86188和Ref Lot B6109B01)比較，如圖二所示。
藉由質譜法所得兩個市售之利妥昔單抗抗體製劑RefLot M86188和Ref Lot B6109B01，以及從本文所生產的D83 BSR4利妥昔單抗製劑的胜肽定位結果顯示，IEX-HPLC檢測的主峰由缺乏兩個C-端離胺酸殘基和所有4個麩醯胺殘基皆轉化成環化焦-麩胺酸鹽的利妥昔單抗分子組成。此外，IEX-HPLC分析透露市售之利妥昔單抗抗體製劑，當與本文所製造的D83 BSR4利妥昔單抗製劑做比較時，其後峰外觀出現的顯著差異。
透過胜肽定位和質譜法分析不同批次利妥昔單抗的組成，顯示市售的 利妥昔單抗與本文所生產的D83 BSR4利妥昔單抗製劑，它們後峰外觀的差異，主要是由於N-端麩醯胺的不完全環化所致。
一種可降低利妥昔單抗後峰同功型數量的方法是在後續陽離子交換純化步驟時，移除並丟棄具有過量的游離N-端麩醯胺產物。然而，由於利妥昔單抗的後峰同功型佔利妥昔單抗製劑如D83 BSR4的同功型總產量，高達50%，這將減少了幾乎一半的產量。
因此，隨後實驗的執行是為了確認最佳條件，在操作上合理的溫度下促進陰離子交換溶液中的麩醯胺環化，以便改善利妥昔單抗主峰同功型的產率。
實施例二
欲試驗之第一條件，是簡單地確定陰離子交換流過溶液(AEX FT)或後續的陽離子交換載入溶液(CEX-載入)，何者在環境溫度下或在37℃下可促進麩醯胺的環化作用。
樣品取自陰離子交換流過步驟結束時的流過液(pH 8)和已經進行製備陽離子交換載入後的溶液(pH 5.5)，並將兩者分裝到用於不同時間點多個同樣的試管中，在環境溫度下或在37℃進行。週期性地超過13天，每個條件下將其中的一根試管移至-70℃冷凍櫃保存，並在時間流程結束時，將所有的樣品都解凍並藉由IEX-HPLC進行分析(圖三)。(對於在環境溫度下作用製備了較少的CEX-載入等分樣品)。
如圖三所示，當利妥昔單抗AEX FT溶液在環境溫度下或在37℃下作用，沒有觀察到利妥昔單抗後峰同功型轉化成主峰同功型。相反地，當利妥昔單抗抗體在CEX載入溶液作用時，發現利妥昔單抗後峰同功型，無論 是在環境溫度下或是在37℃下，皆被轉換到主峰同功型。然而，無論是在環境溫度或是37℃下，發現它們的轉化率皆相當緩慢，以至於後峰總百分比經過8天的作用後減少近10%，這幾乎是對應到被轉化成主峰的後峰之起始量的20%。
實施例三
Dick等人報告了比本文觀察到的轉化率更高(2007,Biotechnol,Bioeng.v97 p544)，在pH值6.2的35mM磷酸鹽緩衝液下進行。因此，進行新實驗以調查在環境溫度、37℃和45℃下的轉化動力學，並同時研究該蛋白質的濃度可能會對轉化率造成的影響。
在利妥昔單抗AEX FT溶液中摻入濃縮母液的磷酸鈉以將濃度調至35mM，並用醋酸滴定至pH值為6.25，作為在製造過程中執行最簡單之可操作的方法。
利妥昔單抗AEX FT磷酸鈉溶液分成3等分試樣，其中一份維持不變，蛋白質的濃度維持在1.85毫克/毫升，而另外兩份則採用密理博公司之30kDa分子量截止的旋轉濃縮器，分別做2倍濃縮成約3.7毫克/毫升的蛋白質濃度(中間圖)與5倍濃縮成約9.25毫克/毫升的蛋白質濃度(右圖)。針對每個樣品用0.2微米的注射過濾器過濾除菌，且在各個時間點進一步將溶液等分入微量塑料離心管(Eppendorf)中。幾個重複的等分樣品保持在室溫(上列圖)、37℃(中列圖)和45℃(下列圖)下至3天(圖四)。在指定的時間點，每個條件下將其中的一根試管移至2-8℃，並在實驗結束時，所有的樣品以同樣的方法一起進行分析。每個圖區顯示在各個作用條件和時間流程中IEX-HPLC前峰、主峰及後峰的比例。為了進行比較，市售利妥昔 單抗之前峰、主峰及後峰的比例，當成參考標準展示於每一列中的第一張圖。
結果顯示(圖四)，較高的溫度明顯增加了焦-麩胺酸之轉化和前峰形成的速率，儘管在各個條件下，焦-麩胺酸轉化總是較前峰的形成更加迅速。在45℃時，主峰百分比在第一天即已達到最大值(60-70%)，接著開始下降，因為前峰形成的速度超越後峰任何額外的轉換作用。在37℃下，轉化率較慢且主峰在第3天才達到相同的最大百分比。雖然某些轉化在環境溫度下是顯而易見的，該溫度下之轉化率卻低於在37℃下所觀察到的一半。在任何溫度下，觀察到蛋白質濃度並無明顯的影響。
實施例四
然後，對不同磷酸鹽濃度(30、60、90mM)的影響進行評估，包括：pH值變數和稀釋倍數(即較低的[NaCl])，這將有利於載入後續的陽離子交換POROS HS50管柱。
利妥昔單抗AEX-FT溶液(D83)被稀釋2倍，以50mM的NaCl稀釋(導致最終約50mM的NaCl溶液-上圖區)，或以注射用水(WFI)稀釋(導致最終約25mM的NaCl溶液-下圖區)，並摻入濃縮母液的磷酸鈉以製備成30、60或90mM的最終溶液濃度，這些溶液以醋酸滴定至pH值6.2或pH值5.8。將這些溶液放置在37℃作用2天，並藉由IEX-HPLC進行分析如同實施例三。為了比較，相同的市售利妥昔單抗參考標準和控制組D83 T=0的樣品都顯示在每個線圖中。
結果顯示(圖五)，經過在37℃下作用2天，高磷酸鹽濃度導致後峰略有較大的降減和主峰較明顯的增加。同樣地，pH值6.2促進轉化的現象比 pH值5.8略為好些。使用25或50mM NaCl並沒有看到明顯的差異。
而在這一點上，所有的實驗是在小試管中靜態條件下進行，這些實驗在攪拌搖瓶模式下重複進行，為了適合大規模的生產，用葉輪混合器進行攪拌，以確保溫度均衡，在37℃下作用超過3天。這些結果驗證了先前在較小靜態模式下獲得的觀察報告，除了90mM磷酸鹽在搖瓶模式下，其轉化動力學速度稍快之外。
實施例五
一個全方位完整的生產運作過程，包括：奈米過濾和所有微生物控制量測，都是在500公升的生物反應器中進行，基本上如實施例一中所描述的純化方式。利妥昔單抗抗體在37℃下作用約28小時後，在接下來的48小時期間它逐漸冷卻至室溫。將所得到的利妥昔單抗溶液載入陽離子交換色層分析的POROS HS樹脂，並以4倍管柱體積15mM的NaCl，20mM的醋酸鈉pH值5.5，和5.5倍管柱體積15mM的NaCl，20mM的磷酸鈉pH 6.5洗滌。使用線性梯度從15到180mM NaCl，以超過13倍管柱容積將利妥昔單抗抗體洗提出來，並同時收集分液，每個分液收集0.5倍管柱體積。以下表一顯示了分液1至9的總蛋白質含量，和IEX-HPLC測定各個分液與合併分液1至6，以及指定為利妥昔單抗參考值之市售利妥昔單抗製劑的結果。
從表一中可以看出，合併分液1至6相當於全部洗提蛋白(即，利妥昔單抗)的96%，且前峰、主峰和後峰的百分比(16.3；63.0；20.7)相當類似於市售的利妥昔單抗製劑(20.2；66.5；13.4)。換言之，合併分液1至6的利妥昔單抗同功型的組合物與市售利妥昔單抗製劑十分相似。
這與實驗一的結果有顯著不同，其中利妥昔單抗同功型後峰的佔量高 達總利妥昔單抗同功型之50%。
結論
如實施例一至五所示，N-端麩醯胺或麩胺酸殘基轉化成焦-麩胺酸的一種健全和更可重複之生產規模等級的程序已經建立。這個程序的設計是為了減少批次與批次之間的變異，並製作一種產品，在離子特性方面與市售的產品類似。
該過程已被最佳化成簡易且快速的步驟，在一個純化過程中，將具N-端麩醯胺殘基非環化之蛋白質的陰離子交換流過溶液，轉化成一組合物內含最佳量的磷酸鹽和NaCl(pH值約6.2)，供未環化N-端麩醯胺殘基進行非酶促轉化形成焦-麩胺酸。
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Claims (15)

  1. 一種用於純化含N-端麩醯胺和/或N-端麩胺酸的蛋白質之方法，該方法包括在促進該蛋白質N-端麩醯胺和/或N-端麩胺酸環化成N-端焦-麩胺酸的條件下培養該蛋白質的步驟。
  2. 根據請求項1的方法，其中該蛋白質是抗體。
  3. 根據請求項1或2的方法，其中該蛋白質是抗-CD20抗體。
  4. 根據請求項3的方法，其中該抗-CD20抗體包含與SEQ ID NO：1相同之輕鏈序列和與SEQ ID NO：2相同之重鏈序列。
  5. 根據請求項1或2的方法，其中轉化發生在20-45℃之溫度下。
  6. 根據請求項1或2的方法，其中轉化是在細胞培養基或在緩衝液中進行。
  7. 根據請求項6的方法，其中緩衝液濃度是選自20mM至150mM之範圍。
  8. 根據請求項1或2的方法，其中pH值是在3.5-9.0的範圍。
  9. 根據請求項1或2的方法，其中從N-端麩醯胺和/或麩胺酸轉化成焦-麩胺酸的轉化達到至少50%。
  10. 根據請求項1或2的方法，其中轉化步驟包括將N-端麩醯胺和/或麩胺酸非酶促轉化成焦-麩胺酸。
  11. 根據請求項1或2的方法，其中蛋白質在轉化之前具有從1至4個N-端麩醯胺殘基和/或從1至4個N-端麩胺酸殘基。
  12. 根據請求項1或2的方法，其進一步包含使用合適樹脂的蛋白質A色層分析法和使用合適樹脂的離子交換色層分析法之步驟。
  13. 根據請求項1或2的方法，其中該方法包含下列步驟：(a)使用合適樹脂的蛋白質A捕獲，(b)在pH值介於3.0-4.0的範圍內之病毒去活化，(c)陰離子交換色層分析法，(d)將該蛋白質的N-端麩醯胺和/或麩胺酸轉化成焦-麩胺酸，(e)使用合適樹脂的陽離子交換色層分析法和梯度洗提法，以分離產物之異構體，(f)病毒過濾法，及(g)超濾作用/透濾作用(UF/DF)。
  14. 根據請求項13的方法，其包括在步驟(d)之後被動冷卻12至72小時的步驟。
  15. 一種用以製備具有N-端焦-麩胺酸之作為藥物產品的活性藥物成分的蛋白質的方法，該方法包括根據請求項1-14中任一項的純化方法。
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