KR20150138273A

KR20150138273A - 단백질의 피로글루타민산 형성을 증가시키기 위한 방법

Info

Publication number: KR20150138273A
Application number: KR1020157030512A
Authority: KR
Inventors: 마리에 로즈 반 스크라벤디즈크; 스티븐 워; 바바라 소온
Original assignee: 마브사이언스 에스. 에이.
Priority date: 2013-04-04
Filing date: 2014-04-03
Publication date: 2015-12-09
Also published as: EP2981553A1; CN105121469A; ECSP15043422A; BR112015025106A2; US20160060349A1; RU2015147187A; UY35517A; AR095977A1; CA2907766A1; SA515361251B1; WO2014161940A1; TW201444863A; US10400042B2; RU2015147187A3; SG10201708088WA; AU2014247034B2; MX2015014038A; JP2016523812A; SG11201507815XA; HK1221472A1

Abstract

본 발명은 정제 공정 내에서 단백질의 N-말단 글루타민 및/또는 글루타민산 잔기를 피로-글루타민산으로 변환하기 위한 방법에 관한 것이다.

Description

단백질의 피로글루타민산 형성을 증가시키기 위한 방법{A METHOD FOR INCREASING PYRO-GLUTAMIC ACID FORMATION OF A PROTEIN}

본 발명은 정제 공정 내에서 단백질의 N-말단 글루타민 및/또는 글루타민산 잔기를 피로-글루타민산으로 변환하기 위한 방법에 관한 것이다. 게다가, 본 발명은 또한 N-말단 피로글루타민산을 함유하는 단백질의 정제를 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 N-말단 피로-글루타민산을 갖는 단백질을 제조하기 위한, 특히 약학 생성물용 활성 약학 성분(API)을 제조하기 위한 제조 공정에 포함될 수 있다.

재조합 치료 단백질의 대부분은 하나 이상의 전사후 변형을 나타낸다. 이들 변형은 리보솜 합성 동안 또는 (더 일반적으로) 합성이 완료된 후에 발생할 수 있다. 다수의 전사후 변형은 날짜를 기록하도록 특징화되고, 그리고 이들 변형은 영향받는 단백질의 일부 구조 측면 또는 기능적 역할을 전달할 수 있다. 치료 단백질과 연관된 공통 전사후 변형은 글리코실화, 이성질화, 산화, N-말단 글루타민 또는 글루타민산의 피로-글루타민산으로의 고리화, 단편화, 및 응집은 물론, 카르복실화 및 하이드록실화, 아미드화 및 황산화, 이황화 결합 형성 및 단백질 가수분해 처리를 포함한다. 따라서, 전사후 변형은 단백질의 효소 변형에 의해 또는 비효소 변환에 의해 야기될 수 있고 그리고 전사후 변형은 세포 배양 동안, 또는 단백질의 정제 또는 저장 동안 발현 숙주 내부에 발생할 수 있다.

재조합 단일클론 항체는 바이오테크놀로지 산업에서 가치가 커지고 있고 다수의 항체가 다양한 질병을 치료하도록 승인되었다. 항체는 일반적으로 CHO 세포와 같은 포유류 세포에서 생성되기 때문에, 그들은 생성물에서 불균일성으로 유도하는, 다수의 다른 전사후 변형을 가질 수 있다. 불균일성은 직접적으로, 충전된 잔기의 수에서의 변화로서, 또는 간접적으로 글리코실화, 중쇄의 C-말단 리신의 카르복시펩티다아제 클립핑, 및 N-말단 글루타민 또는 글루타민산 잔기의 피로-글루타민산으로의 고리화와 같은 표면-전하 분포를 변화시키는 화학적 또는 물리적 변경으로서, 항체의 표면 전하에서의 변화에 의해 야기될 수 있다.

항체는 일반적으로 이황화물 다리 및 비공유 상호작용을 통해 결합된 2개의 커다란 중쇄 및 2개의 작은 경쇄 각각을 갖는 기본적인 구조적 유니트로 구성된다. 여러 다른 타입의 항체 중쇄 및 그들이 소유하는 중쇄에 기반해서 다른 이소타이프로 그룹화되는, 여러 다른 종류의 항체가 있다. 예를 들어 중쇄 불변부에 관한 유전자에 따라서, 인간 IgG(1 내지 4)의 4개의 이소타이프가 있다. 경쇄 불변 도메인은 2개의 유전자에 의해 코드화된다(κ 또는 λ). 결과적으로, 각각의 IgG 이소타이프는 κ 또는 λ, 예를 들어 IgG1κ일 수 있다. 다른 타입의 세포 라인에 생성된 여러 타입의 항체가 있음에도 대개의 임상적으로 중요한 항체는 IgG1 또는 IgG2 타입의 전장 항체이다.

인간 IgG1 또는 IgG2 타입 항체의 다수는 경쇄 또는 중쇄 중 어느 하나 또는 모두의 N-종단에서 글루타민산(Glu) 및/또는 글루타민(Gln) 잔기를 함유한다. 경쇄 유전자의 중요한 부분은 글루타민산 또는 글루타민에 대해 코드화한다. 그러한 N-말단 글루타민산 및/또는 글루타민 잔기는 도 1에 도시된 바와 같이 피로-글루타메이트(pGlu)를 형성하기 위한 고리화를 겪을 수 있다. 그러므로 피로-글루타메이트 형성은 가상으로 모든 임상적으로 중요한 항체에서 발생하고 그리고 다른 레벨의 공정 완전성은 불균일성의 공통 소스이다. 이들 변화가 직접적으로 충전된 그룹의 수를 변경하는 것에 의해 또는 간접적으로 구조적 변경을 도입하는 것에 의해 항체의 표면 전하 특징을 변경할 수 있기 때문에 이러한 불균일성은 치료 항체에서 요구되지 않는다. 그러한 변형은 약물동태 및 항원성을 변경하는 것은 물론, 생물학적 활성을 감소시킬 잠재성을 가진다.

글루타민 고리화 동안, N-말단 1차 아민(중성 pH에서 양으로 충전됨)은 중성 아미드로 변환되어, 항체의 순전하의 변화를 초래한다. 반응은 암모니아(17 Da)의 손실에 의해 수반된다. 결과적으로, 고리화의 부족은 메인 피크가 일반적인 완전히 고리화된 종이기 때문에 양이온 교환 크로마토그래피에 의한 염기 변종으로서 또는 N-말단 아민의 손실 후에 증가된 소수성으로 인한 역상 HPLC에 의해 후기 용리 피크로서 검출될 수 있다.

글루타민산의 고리화는 측쇄 및 N-말단 아민의 카르복실 그룹을 통해 발생하고, 따라서 중성 아미드를 형성하고 물(18 Da)을 방출한다. 하나의 산 그룹 및 하나의 염기 그룹이 반응에서 응축하기 때문에 순전하는 동일한 것을 남기지만, 2개의 충전된 잔기의 손실은 분자의 소수성을 증가시켜서, 역상 HPLC에 의한 검출을 허용한다.

항체에서 피로-글루타민산 형성의 메커니즘은 충분히 이해되지 않는다. 고리화는 자발적으로 발생할 수 있고 또는 그것은 효소 글루타미닐 시클라아제에 의해 보조될 수 있다. 글루타미닐 시클라아제가 항체 생성을 위해 가장 흔히 사용되는, CHO 세포 라인에서 활성인지 여부는 불분명하게 남아있다; 그러나, 자발적 고리화의 비율은 반응이 거의 비효소임을 나타낸다.

예를 들어 유 등(약학 및 생의학 분석지 2006; 42:455-463)은 3개월의 기간 동안 모노클론 항체의 경쇄 및 중쇄 모두의 N-종단에서 글루타민산(Glu 또는 E)으로부터 비효소 피로-글루타메이트 형성을 조사했다. 유 등은 mAb의 pGlu로의 Glu의 이러한 비효소 고리화는 공정 전개 동안 pH 및 온도 조건에 따른 mAb 생성 및 저장에서 발생된 주요 분해 경로 중 하나일 수 있다는 것을 언급한다. 그들은 그러한 피로-Glu가 또 다른 변형을 유도할 수 있고 mAb 생물활성을 변경할 수 있는지 또는 치료적 효능이 불분명한지 여부를 결론짓고, 그리고 그들은 N-말단 Glu로의 mAb 치료법의 품질을 보장하는 것이 중요할 수 있기 때문에 N-말단 pGlu 형성을 자세히 모니터링하는 것을 제안했다.

쉘리우스 등(분석 화학 2006, 78, 2370-2376)은 여러 모노클론 항체의 경쇄 및 중쇄 모두의 N-종단에서 글루타민산으로부터 비효소 피로-글루타메이트 형성을 조사했고 그리고 비효소 반응이 매우 흔하게 발생하고 37℃ 및 45℃에서의 배양 수주 후에 검출될 수 있다는 것을 발견했다. 반응의 비율은 다른 pH 값을 갖는 여러 수용 완충액에서 측정되었고, pH 6.2에서 피로-글루타민산의 최소 형성 및 pH 4 및 pH 8에서 피로-글루타민산의 증가된 형성을 나타냈다.

글루타민(Gln 또는 Q)의 피로-글루타메이트로의 변환에 관련해서 딕 등(바이오테크놀로지 및 바이오엔지니어링, 97권, 3호, 2007년 6월 15일)은 재조합 모노클론 항체의 N-말단 글루타민의 그러한 고리화가 자발적으로 발생함을 나타냈고 그리고 많은 최종 컨테이너 모노클론 항체에서 관찰된 거의 완전한 변환이 바이오리액터에서 발생하는 대부분의 변형과 바이오리액터 배양 및 정제 조건의 조합에 의해 야기되는 경향이 있다고 결론지었다. 이러한 연구는 많은 재조합 항체에서 일반적으로 관찰된 피로-Q 변종이 정제 공정으로부터의 작은 기여만으로 바이오리액터 내부에 야기되고, 고온 및 용매 성분에 의해 가속화된다는 것을 나타낸다. 구체적으로, 더 높은 변환이 37℃에서 그리고 75 mM NaCl(pH 6.2)을 갖는 35mM 인산 완충액에서 발견된다.

따라서, N-말단 글루타민 또는 글루타민산 잔기의 피로-글루타민산으로의 고리화와 같은 전사후 변형은 생성 및 정제 조건에서 약간의 변화로 인해 배치마다 다를 수 있는 발현 단백질의 불균일성으로 유도한다. 그러므로, 바이오시밀러 단백질을 생성하기에 더 어려운 도전 중 하나는 이노베이터 생성물의 불균일성을 일치시키는 것이다. 그래서, 분석적 지지를 갖는 더 강건하고 재생가능한 산업적으로 큰 규모의 정제 공정은 항체와 같은 약학 단백질에 관한 엄격한 순도 요구사항을 충족시킬 필요가 있다.

본 발명은 정제 공정 내에서 단백질의 N-말단 글루타민 및/또는 글루타민산 잔기를 피로-글루타민산으로 변환하기 위한 방법을 제공한다.

본 발명의 제 1 측면은 N-말단 글루타민 및/또는 글루타민산 잔기의 고리화를 촉진하기 위한 조건 하에 단백질을 배양하는 단계를 포함하는, 정제 공정 내에서 단백질의 N-말단 글루타민 및/또는 글루타민산 잔기의 피로-글루타민산으로의 변환을 위한 방법에 관한 것이다.

본 발명의 제 2 측면은 N-말단 글루타민 및/또는 글루타민산 잔기를 함유하는 단백질의 정제를 위한 방법에 관한 것이고, 그 방법은 언급된 단백질의 N-말단 글루타민 및/또는 글루타민산 잔기를 N-말단 피로-글루타민산으로 변환하는 단계를 포함한다. 그러한 변환은 N-말단 글루타민 및/또는 글루타민산 잔기의 고리화를 촉진하기 위한 조건 하에 행해진다.

본 발명의 제 3 측면은 약학적 생성물용 API로서 N-말단 피로-글루타민산을 갖는 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이고, 그 방법은 그것의 실시예는 물론 제 1 및 제 2 측면 중 어느 하나의 정제 방법을 포함한다.

본 발명의 목적은 요구되는 생성물 불균일성을 감소시키거나 얻기 위해 증가된 또는 제어된 N-말단 피로-글루타민산 레벨을 갖는 단백질을 제조하는 대안적인 공정을 제공하는 것이다.

본 발명자는 특히 모노클론 항체의 N-말단 글루타민 및/또는 글루타민산 잔기를 갖는 단백질의 정제 공정 동안 N-말단 글루타민 및/또는 글루타민산 잔기를 피로-글루타민산으로 배양/변환하는 단계를 도입하는 것에 의해, 불균일성의 레벨이 요구되는 레벨로 조절될 수 있다는 것을 발견했다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 설명, 도면 및 청구항을 읽을 때에 명백해질 것이다.

정의:

여기에 사용된 바와 같은 용어 "식별"은 2개의 아미노산 서열 사이의 또는 2개의 뉴클레오티드 서열 사이의 관련성을 말하고 파라미터 "서열 식별"에 의해 설명된다. 본 발명의 목적을 위해, 2개의 아미노산 서열 사이의 서열 식별의 정도가 EMBOSS 패키지(EMBOSS: 유럽 분자 생물학 공개 소프트웨어 스위트, 라이스 등, 2000, Trends Genet 16: 276-277)의 니들 프로그램, 바람직하게 버전 3.0.0 또는 그 후에 실행된 바와 같은 니들만-원츠 알고리즘(니들만 및 원츠, 1970, 분자 생물학지 48:443-453)을 사용하여 결정된다. 사용된 선택 파라미터는 갭 오픈 페널티 10, 갭 팽창 페널티 0.5, 및 EBLOSUM62(BLOSUM62의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스이다. "최장 식별"(-노브리프 옵션을 사용하여 얻어짐)로 라벨링된 출력은 퍼센트 식별로서 사용되고 다음과 같이 계산된다: (동일한 잔기×100)/정렬 길이-정렬에서 갭의 총 수).

여기에 사용된 바와 같은 용어 "N-말단", "N-종단" 또는 "아미노-종단"은 단백질 또는 폴리펩티드의 말단부에서 유리 아민 그룹(-NH₂)을 말한다. 단백질 또는 폴리펩티드 작성하는 일반적인 방식은 좌측 상에 N-종단을 놓는 것이고 N- 내지 C-종단으로부터 서열을 작성하는 것이다. 단백질 또는 폴리펩티드가 메신저 RNA로부터 전사될 때, N-종단부터 C-종단까지 생성된다.

여기에 사용된 바와 같은 용어 "글루타민", "2-아미노-4-카르바모일부탄산", "Gln" 또는 "Q"는 표준 유전 코드에 의해 인코딩된 20개의 아미노산 중 하나이다. 그것의 측쇄는 아미드 작용기를 갖는 글루타민산의 측쇄 카르복실을 대체하는 것에 의해 형성된 아미드이다. 그러므로 그것은 글루타민산의 아미드로 간주될 수 있다.

여기에 사용된 바와 같은 용어 "글루타민산", "2-아미노펜타네디오익산", "Glu" 또는 "E"는 표준 유전자 코드에 의해 인코딩된 20개의 아미노산 중 하나이다. 측쇄 카르복실산 기능기는 생리적 pH에서 음으로 충전된 디프로토네이티드 카르복실레이트 형태에 존재한다.

여기에 사용된 바와 같은 용어 "폴리펩티드"는 펩티드 결합에 의해 링크된 아미노산 모노머의 단일 선형 사슬을 말한다. 폴리펩티드로 병합된 아미노산은 "잔기"로 명명되고; 매 폴리펩티드는 폴리펩티드의 각각의 단부에서 하나의 N-종단 및 하나의 C-종단 잔기를 가진다. 여기에 사용된 바와 같은 폴리펩티드는 약 20개 이상의 연속적인 아미노산을 포함하는 더 긴 펩티드이다.

여기에 사용된 바와 같은 용어 "단백질"은 일반적으로 공 또는 섬유 형태로 접히는 하나 이상의 폴리펩티드로 구성되고, 생물학적 기능을 용이하게 하는 생화학 화합물을 말한다. 단백질은 펩티드 결합이 아닌 결합에 의해 연결될 수 있고, 예를 들어, 단백질을 채우는 그러한 폴리펩티드는 이황화물 결합에 의해 연결될 수 있다. 여기에 사용된 바와 같은 용어 "단백질"은 항체, 단백질 및 항체의 단편, 약 20개 이상의 연속적인 아미노산 잔기인 단백질 및 항체 및 그와 유사한 것의 클리브된 형태를 포함하도록 의도된다. 게다가, 여기에 사용된 바와 같은 단백질은 자연스럽게 발생한 폴리펩티드 및 재조합으로 생성된 폴리펩티드를 포함하도록 의도된다.

여기 사용된 바와 같은 용어 "피로-글루타민산", "5-옥소프롤린", "피돌릭산", 또는 "피로-글루타메이트"는 폭넓게 글루타민산 또는 글루타민의 유리 아미노 그룹이 락탐을 형성하도록 고리화하는 흔치않은 아미노산 유도체를 말한다. 그것은 많은 단백질(예, 박테리오로돕신, 피브린, 피브리노겐), 뉴런 펩티드 및 호르몬(예, 뉴로텐신, 가스트린, 아펠린 및 오렉신 A) 및 항체(예, 인플릭시맵, 세투시맵, 리투시맵, 트라스투주맵, 베바시주맵, 파니투무맵, 아달리무맵, 라니비주맵)에서 발견되었다. N-말단 글루타민 및 글루타민산 잔기는 피로-글루타메이트가 되도록 자발적으로 고리화할 수 있다. 이것은 피로-글루타민산에 존재하지 않는 유리 1차 아미노 그룹을 요구하는 에드먼 화학을 사용하여 N-말단 시퀀싱에 관한 문제를 나타내는 블록킹된 N-말단의 여러 형태 중 하나이다. 효소 피로-글루타메이트 아미노펩티다아제는 피로-글루타메이트 잔기를 쪼개 없애는 것에 의해 유리 N-종단을 복구시킬 수 있다.

여기에 사용된 바와 같은, "정제 공정"은 복합 혼합물로부터 단백질을 분리시키도록 의도된 하나의 공정 또는 일련의 공정을 말한다. 단백질은 하나 이상의 아이소폼으로 구성될 수 있다, 즉, 불균일성을 나타낸다. 용어 "정제 공정"은 제한 없이 단백질 및 항체 정제를 포함한다. 시작 물질은 일반적으로 세포 배양(예, 포유류 세포 배양, 이스트 배양 또는 미생물 배양)이고 정제 공정에서의 다양한 단계는 그것을 제한하는 매트릭스로부터 단백질을 방출할 수 있고, 혼합물의 단백질 및 비단백질 부분을 분리하고, 그리고 최종으로 모든 다른 단백질로부터 요구된 단백질을 분리한다. 단백질이 항체인 경우에, 일반적인 분리는 단백질 A 친화성 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 및/또는 하이드록시아파타이트 크로마토그래피를 포함한다.

여기에 사용된 바와 같은 용어 "항체"는 이황화 결합에 의해 상호연결된 4개의 단백질 사슬, 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)로 구성된 면역글로불린 분자를 말한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변부(HCVR 또는 VH로서 여기에 축약됨) 및 중쇄 불변부(CH)로 구성된다. 중쇄 불변부는 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변부 및 경쇄 불변부로 구성된다. 경쇄 불변부는 하나의 도메인, CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 초가변성의 영역으로 더 세분화되고, 상보성 결정 영역(CDR)으로 명명되고, 더 보존되는 영역으로 배치되고, 프레임워크 영역(FR)으로 명명된다. 각각의 VH 및 VL은 다음의 순서: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4로 아미노-종단으로부터 카르복시-종단까지 배열된, 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다. 항체는 예를 들어, 다클론성 항체, 모노클론성 항체, Fab 및 단쇄 Fv(scFv) 단편, 2중특이성 항체, 이형접합, 인간 및 인간화된 항체를 포함한다. 그러한 항체는 하이브리도마 배양, 박테리아 또는 포유류 세포 배양에서의 재조합 발현, 및 이식 유전자를 가진 동물에서 재조합 발현을 포함하는, 다양한 방식으로 생성될 수 있다. 또한 항체는 사상파지, 박테리아, 이스트 또는 리보솜과 같은 디스플레이 시스템에 발현된 서열의 라이브러리로부터 서열을 선택하는 것에 의해 생성될 수 있다. 특정 생성 방법론, 예를 들어, 채드(Chadd) 및 차모우(Chamow), 생물학에 관한 최신 견해, 12:188-194(2001)을 선택하기 위한 문헌에 풍부한 가이드가 있다. 제조 방법론의 선택은 요구된 항체 구조, 항체 상의 탄수화물성분의 중요성, 배양 및 정제의 용이함, 및 비용을 포함하는 여러 인자에 따른다. 많은 다른 항체 구조는 다른 종으로부터의 성분을 포함하는 키메라 항체는 물론, 전장 항체, Fab 및 Fv 단편과 같은 항체 단편을 포함하는, 표준 발현 기술을 사용하여 발생될 수 있다.

여기에 사용된 바와 같은 용어 "약학적 생성물"은 용량 형태가 적합한 담체 및/또는 부형제를 포함할 수 있는, 인간 대상과 같은 포유류에 투여하기에 적합한 활성 약학적 성분(API)을 포함하고 그리고 임상 시험에 사용되거나 국가, 지역 또는 국제 권한에 의해 시판되도록 승인된 용량 형태를 의미한다. 본 발명의 방법 중 어느 하나에 의해 제조된, 단백질을 포함하는 약학적 생성물, 예, 단백질 또는 항체는 예를 들어, E.W. 마틴, 맥 출판사, 19판, 이스턴, Pa에 의해 편집된, 레밍톤: 과학과 약학 시행 1995에 설명된 바와 같은, 종래의 기법에 의해 제조될 수 있다. 약학 생성물은 예를 들어, 캡슐, 정제, 감압 하에 동결건조된 케이크 또는 파우더, 에어로졸, 용액, 현탁액 또는 특히 피하 주입 또는 정맥내 주입과 같은 주입과 같은 국소 적용을 종래의 형태로 나타낼 수 있다. 약학적 생성물은 다양한 약학적으로 허용가능한 제제에서 발견될 수 있고 하나 이상의 생리학적으로 허용가능한 담체와 결합될 수 있다. 사용된 약학적 담체 또는 희석액은 종래의 고체 또는 액체 담체 또는 희석액일 수 있다. 고체 담체의 예는 락토스, 테라 알바, 수크로오스, 사이클로덱스트린, 탈크, 젤라틴, 아가, 펙틴, 아카시아, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 또는 셀룰로오스의 저급 알킬 에테르이다. 액체 담체의 예는 시럽, 피넛 오일, 올리브 오일, 인지질, 스테롤, 지방산, 지방산 아민, 폴리옥시에틸렌, 등장성 완충액, 물 및 살균된 염류 용액이다.

본 발명은 제조 규모에서 N-말단 글루타민 또는 글루타민산 잔기를 피로-글루타민산으로 변환하기 위한 강건한 그리고 더 재생가능한 절차를 제공한다.

도 1: 본 도면은 N-말단 글루타민 및 N-말단 글루타민산의 고리화 동안 피로-글루타민산 형성의 메커니즘의 개략적인 재현을 나타낸다.
도 2: 도면은 여기에 생성된 D83 BSR4 리투시맵 제조는 물론, 2개의 상업적으로 이용가능한 리투시맵 배치 Ref Lot M86188 및 Ref Lot B6109B01의 양이온 교환 고성능 액체 크로마토그래피(IEX-HPLC) 프로파일을 나타낸다. 프리-피크, 메인-피크 및 포스트-피크는 크로마토그램 프로파일에 지시된다. 메인-피크는 2개의 C-말단 리신 잔기가 부족하고 피로-글루타민으로 변환된 모두 4개의 글루타민 잔기를 갖는 리투시맵 분자로 구성되는 것으로 발견되었다. 여기에 생성된 D83 BSR4 리투시맵 제조에 비해, 상업적으로 이용가능한 리투시맵 항체 제조의 포스트-피크의 외관에서의 현저한 차이는 N-말단 글루타민 잔기의 불완전한 고리화에 의해 주로 야기되는 것으로 발견되었다.
도 3: 본 도면은 AEX(음이온 교환) 및 CEX(양이온 교환)에서의 총 피크 영역과 다른 온도에서의 배양 시간 사이의 상관성을 나타내는 4개의 그래프를 나타낸다. 상부 그래프는 주변 온도 또는 실온 배양에 대응하고 하부 그래프는 37℃에 대응한다. FT는 크로마토그래피의 플로우-스루에 대응한다.
도 4: 본 도면은 35mM까지의 인산나트륨의 첨가를 갖고 pH 6.25로 적정화된 용액에서의 저단백 농도(1.85 mg/mL; 좌측 판넬)에서, 중단백 농도(3.7mg/mL; 중간 판넬)에서 그리고 고단백 농도(9.25 mg/mL; 우측 판넬)에서, 주변 온도(상부 판넬)에서, 37℃(중간 판넬)에서 그리고 45℃(하부 판넬)에서 리투시맵 포스트-피크 아이소폼을 메인-피크 아이소폼으로 변환하는 과정을 나타낸다.
도 5: 본 도면은 리투시맵 포스트-피크 아이소폼의 메인-피크 아이소폼으로의 변환 운동역학 상의 pH 5.8 및 6.2에서 다른 인산염 농도(30, 60 및 90mM), 염화나트륨 농도(50 및 25 mM)의 효과를 나타낸다.

본 발명자는 N-말단 글루타민 및/또는 글루타민산 잔기를 갖는 단백질의 정제 공정 동안 N-말단 글루타민 및/또는 글루타민산 잔기의 피로-글루타민산으로의 배양/변환의 단계를 도입하는 것에 의해, 불균일성의 레벨이 요구되는 레벨로 감소되는 바와 같이, 조작될 수 있고 동시에 요구되는 단백질의 수득율을 증가시킬 수 있다는 것을 발견했다.

단백질의 N-말단 글루타민 및 글루타민산은 도 1에 도시된 바와 같이 피로-글루타메이트를 형성하는 고리화를 겪을 수 있다. 글루타민의 고리화 동안 N-말단 1차 아민(중성 pH에서 양으로 충전됨)은 중성 아미드로 변환되어, 단백질의 순전하의 충전을 초래한다. 반응은 암모니아의 손실(17Da)에 의해 수반되고 그리고 결과적으로, 고리화의 부족은 메인 피크가 일반적으로 완전히 고리화된 종이기 때문에, 양이온 교환 크로마토그래피에 의한 염기 변종으로서 또는 N-말단 아민의 손실 후에 증가된 소수성으로 인한 역상 HPLC에 의해 후기 용리 피크로서 검출될 수 있다.

글루타민산의 고리화는 측쇄의 카르복실 그룹 및 N-말단 아민을 통해 발생하고, 중성 아미드를 형성하고 그리고 물(18 Da)을 방출한다. 반응에서 하나의 산 그룹 및 하나의 염기 그룹이 응축하기 때문에 순전하는 동일한 것을 남기지만, 그러나 2개의 충전된 잔기의 손실은 분자의 소수성을 증가시키고, 역상 HPLC에 의한 검출을 허용한다.

많은 인간 항체가 N-종단에서 글루타민산 및/또는 글루타민 잔기를 포함하기 때문에, 그러므로 피로-글루타메이트 형성이 많은 임상적으로 중요한 항체의 제조 동안 발생할 수 있고 그리고 생성 및 정제 조건에서 약간의 변화로 인해 배치마다 다를 수 있는, 발현된 항체의 불균일성으로 매우 자주 유도한다. 이것은 산업적 규모와 같은, 큰 규모에서 단백질의 생성에서 중요한 문제이기 때문에, 동일한 것이 폴리펩티드를 포함하는, 단백질에 적용한다.

제 1 측면에서 본 발명은 N-말단 글루타민 및/또는 글루타민산 잔기의 고리화를 촉진하기 위한 조건 하에 단백질을 배양하는 방법을 포함하는, 정제 공정 내의 단백질의 N-말단 글루타민 및/또는 글루타민산 잔기의 피로-글루타민산으로의 변환을 위한 방법에 관한 것이다.

제 2 측면에서 본 발명은 N-말단 글루타민 및/또는 글루타민산 잔기를 함유하는 단백질의 정제를 위한 방법에 관한 것이고, 그 방법은 언급된 단백질의 N-말단 글루타민 및/또는 글루타민산 잔기의 N-말단 피로-글루타민산으로의 변환의 단계를 포함한다. 그러한 변환은 N-말단 글루타민 및/또는 글루타민산 잔기의 고리화를 촉진하는 조건 하에 행해진다.

여기에 사용된 바와 같이 정제 공정은 해당 기술분야에 공지된 방법에 따라 수행될 수 있고 특정 단백질에 따라 변할 것이다. 단백질 정제 스킴은 정제될 단백질과 요구되는 단백질 오염물질 사이의 크기, 전하 및 용해도의 분자 특징에서의 차이에 대해 예측된다. 이들 파라미터에 기반한 프로토콜은 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 차등 침전 및 그와 유사한 것을 포함한다.

항체를 정제하기 위한 공정은 일반적으로 포획을 위한 친화성 크로마토그래피, 일반적으로 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 기반한다. 단백질 A 친화성 크로마토그래피는 단백질 A를 이용한 물질 및/또는 입자의 분리 또는 정제를 말하고, 단백질 A는 일반적으로 고체상 상에 고정된다. 단백질 A 친화성 크로마토그래피 공정은 일반적으로 이온 교환 및/또는 소수성 상호작용 및/또는 혼합 모드 크로마토그래피 단계에 의해 이어진다. 그러한 공정은 또한 일반적으로 적어도 2개의 바이러스 감소 단계, 일반적으로 친화성 단계로부터 용리에서 낮은 pH에 의한 감소 및 공정의 적절한 위치에서 바이러스 필터의 실행을 포함한다. 항체 정제 공정 동안 제거된 불순물은 하프 항체, 항체 단편, 다이머, 및 응집물, DNA, 바이러스, HCP(숙주 세포 단백질), 단백질 A 누출, 내독소 및 다른 관련된 불순물을 포함한다.

본 발명의 실시예에서 단백질은 효소, 호르몬 또는 항체로부터 선택된다. 단백질의 적합한 예는 박테리오로돕신, 피브리노겐, 콜라겐, 키닌, 뉴로텐신, 가스트린, 아펠린 및 오레신 A 항체 또는 항체 단편을 포함하는 하나 이상의 N-말단 글루타민 및/또는 글루타민산 잔기를 함유하는 임의의 단백질을 포함한다. 항체의 실시예는 제한 없이 트라스투주맵, 인플리시맵, 바실리시맵, 다클리주맵, 아달리무맵, 오말리주맵, 겜투주맵, 리투시맵, 베바시주맵, 세투시맵, 오파투무맵, 벨투주마보르 오크레리주맵 패니투무맵, 래니비주맵, 이브리투모맵, 티우세탄, 앱시시맵, 에쿠리주맵, 아렘투주맵, 오조가미신, 에파리주맵, 파리비주맵, 나타리주맵, 오말리주맵 및 토시리주맵을 포함한다.

본 발명의 또 다른 실시예에서 항체는 경쇄 서열 SEQ ID NO:3 및 중쇄 서열 SEQ ID NO:4를 갖는 트라스투주맵 및 경쇄 서열 SEQ ID NO:5 및 중쇄 서열 SEQ ID NO:6를 갖는 베바시주맵이다.

본 발명의 더 또 다른 실시예에서 항체는 항-CD20 모노클론 항체이다. 항-CD20 항체의 적절한 예는 리투시맵, 오파투무맵, 벨투주맵 또는 오크레리주맵을 포함한다.

본 발명의 바람직한 실시예에서 항체는 리투시맵과 같은 리투시맵과 동일한 서열이다.

더 또 다른 실시예에서 단백질은 각각, 서열 SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2이도록, 리투시맵의 경쇄 및 중쇄 서열와 동일한 서열을 포함한다.

본 발명의 더 또 다른 실시예에서 단백질은 SEQ ID NO:1에 대해 95%, 97%, 98%, 99% 식별과 같은 적어도 90% 식별을 갖고 그리고 SEQ ID NO:2에 대해 95%, 97%, 98%, 99% 식별과 같은 적어도 90% 식별을 갖는 서열을 포함한다.

본 발명의 더 또 다른 실시예에서 단백질은 변환 전에 1 내지 4개의 N-말단 글루타민 및/또는 1 내지 4개의 N-말단 글루타민산 잔기를 가진다. 따라서, 단백질이 단쇄 단백질이라면 하나의 N-말단 글루타민 잔기 또는 하나의 N-말단 글루타민산 잔기를 포함할 수 있다. 그러나, 단백질이 하나 이상의 서브유닛으로 구성된다면 그것은 하나의 N-말단 글루타민 잔기 및 하나의 N-말단 글루타민산 잔기 또는 2개의 N-말단 글루타민 잔기 또는 2개의 N-말단 글루타민산 잔기를 포함할 수 있다. 위에 설명된 바와 같이 항체는 이황화물 결합에 의해 상호연결된 4개의 폴리펩티드 사슬(즉, 서브유닛), 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함한다. 각각의 중쇄 서열은 하나의 N-말단 글루타민 잔기 또는 하나의 N-말단 글루타민산 잔기를 인코딩할 수 있다. 유사하게, 각각의 경쇄 서열은 하나의 N-말단 글루타민 잔기 또는 하나의 N-말단 글루타민산 잔기를 인코딩할 수 있다. 따라서, 또 다른 실시예에서 단백질은 2개의 N-말단 글루타민 잔기, 4개의 N-말단 글루타민 잔기, 2개의 N-말단 글루타민산 잔기, 4개의 N-말단 글루타민산 잔기, 또는 2개의 N-말단 글루타민 잔기 및 2개의 N-말단 글루타민산 잔기로부터 선택된 본 발명의 방법에 따라 변환되는 2 또는 4개의 N-말단 글루타민 및/또는 글루타민산 잔기를 갖는 항체이다.

N-말단 글루타민 및/또는 글루타민산 잔기의 피로-글루타민산으로의 변환은 자발적으로 발생할 수 있고 또는 글루타미닐 시클라아제와 같은, 효소에 의해 도움받을 수 있다. 글루타미닐 시클라아제는 다양한 펩티드 호르몬 및 단백질에 대한 글루타민 및 글루타민산 고리화에 연관되어 있고 효소 활성은 다른 조직에서 검출된다. 상승된 온도에 저장된 정제된 항체에서 글루타민 및 글루타민산의 자발적인 고리화 역시 검출된다(실링 등, FEBS 레터, 2004, 563, 191-196; 쿠마 및 바차와트, 최신 과학, 102권, 2호, 2012년 1월 25일).

본 발명의 일 실시예에서 N-말단 글루타민 및/또는 글루타민산 잔기의 피로-글루타민산으로의 변환은 비효소 변환이다. 일반적으로, 비효소 변환은 적절한 시간 기간 동안 상승된 온도에서 발생하고, 또한 pH 변화는 변환에 기여할 수 있다. 이들 파라미터 중 2개 또는 3개의 임의의 조합은 물론 이들 파라미터 중 임의의 하나는 본 발명의 일 실시예로 간주된다.

N-말단 글루타민 및/또는 글루타민산 잔기의 피로-글루타민산으로의 변환에 적절한 온도는 25-45℃와 같은, 35-40℃와 같은, 20-50℃의 범위, 예를 들어, 37℃에 있다. N-말단 글루타민 및/또는 글루타민산 잔기의 피로-글루타민산으로의 변환을 위한 적절한 시간 기간은 12 내지 96 시간과 같은, 24 내지 72 시간과 같은, 4 내지 120 시간의 범위, 예를 들어 8 내지 48시간에 있다.

N-말단 글루타민 및/또는 글루타민산 잔기의 피로-글루타민산으로의 변환에 적절한 pH 범위는 4.0-8.0과 같은, 4.5-7.5와 같은, 5.0-7.0과 같은, 5.8-6.5와 같은 3.5-9.0의 범위, 예를 들어 pH 6.2에 있다.

본 발명의 일반적인 실시예에서 변환은 30-45℃의 온도에서와 같은, 4 내지 120 시간 동안 20-50℃의 온도, 예를 들어, 12 내지 72 시간 동안 37-40℃에서 발생한다.

N-말단 글루타민 및/또는 글루타민산 잔기의 피로-글루타민산으로의 비효소 변환은 많은 다른 매질에서 발생할 수 있다. 단백질이 용액 또는 현탁액으로 있는 적합한 매질은 물, 세포 매질, 인산 완충액, 트리스-HCl 완충액, 또는 암모니아 카보네이트 완충액과 같은 완충액으로부터 선택될 수 있다. 변환은 또한 단백질이 정제 공정 동안, 크로마토그래피 수지 또는 멤브레인에 결합되는 동안에 발생할 수 있다.

일반적으로, N-말단 글루타민 및/또는 글루타민산 잔기의 피로-글루타민산으로의 비효소 변환은 인산 완충액과 같은 용액에서 발생할 수 있다. 본 발명의 더 또 다른 실시예에서 변환은 세포 매질에서 수행된다.

본 발명의 또 다른 실시예에서 변환은 인산 완충액에서 또는 암모니아 카보네이트 완충액에서와 같은 완충액에서 수행된다.

일반적으로, N-말단 글루타민 및/또는 글루타민산 잔기의 피로-글루타민산으로의 비효소 변환은 회수되고 부분적으로 정제된 후에 50L 이상의 세포 매질을 유지할 수 있는 큰-규모 생성 바이오리액터로부터 유도된 단백질 상에 수행될 수 있다. 변환은 일반적으로 정적 조건 하에 또는 중간 교반으로 10ml 내지 10L의 부피로 수행될 수 있고 그리고 본 발명의 실시예에서 변환은 적어도 10ml의 부피로 수행된다.

N-말단 글루타민 및/또는 글루타민산 잔기의 피로-글루타민산으로의 비효소 변환에 특히 적합한 매질은 10 내지 125mM과 같은, 25 내지 100mM과 같은, 5 내지 150mM의 완충액의 농도를 포함하는 매질이다. 완충액은 또한 10 내지 125mM과 같은, 25 내지 100mM과 같은, 50 내지 85mM과 같은, 5 내지 150mM의 범위에서 농도를 갖는 NaCl과 같은 염을 함유할 수 있다.

본 발명의 더 또 다른 실시예에서, N-말단 글루타민 및/또는 글루타민산 잔기의 피로-글루타민산으로의 비효소 변환을 위한 완충액의 농도는 20 mM 내지 150 mM의 범위로부터 선택된다. 본 발명의 일반적인 실시예에서 완충액의 농도는 약 90mM이다.

특히 바람직한 완충액은 pH 3.5에서 75mM NaCl을 갖는 35 mM 인산 완충액, pH 6.2에서 75mM NaCl을 갖는 35mM 인산 완충액, pH 7.0에서 100mM 트리스-HCl 완충액, pH 8.6에서 100mM 암모니아 카보네이트 완충액, pH 6.2에서 35mM 인산 완충액, pH 6.2에서 75mM NaCl을 갖는 35mM 인산 완충액, pH6.2에서 50mM NaCl을 갖는 60mM 인산염, pH6.2에서 25mM NaCl을 갖는 60mM 인산 완충액, pH 6.2에서 25mM NaCl을 갖는 90mM 인산 완충액 또는 pH 6.2에서 50mM NaCl을 갖는 90mM 인산 완충액이다.

N-말단 글루타민 및/또는 글루타민산 잔기의 피로-글루타민산으로의 변환의 비율은 선택된 완충액, 변환이 발생하는 온도 및 변환이 처리하도록 허용된 시간의 기간에 따라 변할 수 있다. 해당 기술분야의 당업자는 저하 또는 원치않는 전사 후 변형을 초래하지 않고 최적 변환으로 유도하는 조건을 식별한다는 것을 알 것이다. 많은 경우에 피로-글루타민산으로 변환된 N-말단 글루타민 및/또는 글루타민산을 가능한 많이 얻는 것이 이점일 것이다.

본 발명의 실시예에서 N-말단 글루타민 및/또는 글루타민산으로부터 피로-글루타민산으로의 변환은 적어도 50%에 도달한다, 즉, 단백질에서 N-말단 글루타민 및/또는 글루타민산의 적어도 50%는 피로-글루타민산이다. 단백질 조성물에서 피로-글루타민산 잔기의 총 수가 50% 이상인 한에는, 예를 들어, 2개의 N-말단 글루타민 잔기를 갖는 단백질 또는 항체는 0, 1, 또는 2개의 피로-글루타민산(들)을 갖는 단백질을 포함하는 불균일한 조성물에서의 변환 후에 초래할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에서 N-말단 글루타민 및/또는 글루타민산으로부터 피로-글루타민산으로의 변환은 53% 내지 68%와 같은 적어도 53%에 도달한다.

본 발명의 더 또 다른 실시예에서 N-말단 글루타민 및/또는 글루타민산으로부터 피로-글루타민산으로의 변환은 적어도 75%와 같은, 적어도 80%와 같은, 85%와 같은, 적어도 90%와 같은, 적어도 95%와 같은, 적어도 99%와 같은, 적어도 68%에 도달한다.

해당 기술분야의 당업자는 피로-글루타민산으로 변환된 N-말단 글루타민 및/또는 글루타민산의 양을 식별하고 측정하는 것을 안다. 그럼에도, 피로-글루타민산 형성의 레벨을 측정하기에 적합한 방법이 리우브라스카야 등 2006(분석 생화학 348, 24-39)에 그리고 딕 등 2007(바이오테크놀로지 및 바이오엔지니어링, 97권, 3호, 2007년 6월 15일)에 설명된다. 고리화된 N-말단 글루타민의 직접 결정 역시 전기분무 Q-TOF 질량 분광분석을 사용하여 최근에 달성되었다(가드길 등, 2006 미국질량 분석 협회지 17:867-872.).

위에 설명된 바와 같이, 항체를 정제하기 위한 공정은 이온 교환 크로마토그래피 단계가 이어지는, 일반적으로 친화성 크로마토그래피, 일반적으로 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 기반하고, 공정의 적절한 위치에서 바이러스 감소 단계를 포함한다.

본 발명의 방법의 또 다른 실시예에서 방법은: 적합한 수지를 갖는 단백질 A 포획, 음이온 교환 크로마토그래피 및 적합한 수지를 갖는 양이온 교환 크로마토그래피 단계를 더 포함하고 변환의 단계는 양이온 교환 크로마토그래피 단계 전에, 바람직하게 양이온 교환 크로마토그래피 단계 전에 즉시 발생한다.

본 발명의 방법의 더 또 다른 실시예에서 그 방법은:

(a) 적합한 영역을 갖는 단백질 A 캡쳐,

(b) 낮은 pH에서 바이러스 불활성화,

(c) 음이온 교환 크로마토그래피,

(d) 단백질의 N-말단 글루타민 및/또는 글루타민산의 피로-글루타민산으로의 변환,

(e) 생성물 아이소폼을 분리시키도록 적합한 수지 및 기울기 용리를 갖는 양이온 교환 크로마토그래피,

(f) 바이러스 여과, 및

(g) 초미세여과/정용여과(UF/DF) 단계를 포함한다.

본 발명의 방법의 더 또 다른 실시예에서 단계(a)-(g)는 특정 순서로 이어진다.

본 발명의 방법의 또 다른 실시예에서 수동 냉각의 단계는 단계(d) 후에, 일반적으로 단계(e) 전에 삽입된다.

본 발명의 문맥에서 단백질 A 포획 단계(a)는 임의 적합한 단백질 A 수지 필터 또는 매질을 사용하여 수행될 수 있다. 단백질 A는 주로 Fc 영역을 통해 포유류 IgG에 결합하는 박테리아 세포벽 단백질이다. 자연 상태에서, 단백질 A는 알려지지 않은 기능의 다른 도메인은 물론 5개의 IgG 결합 도메인을 가진다. 단백질 A 수지에 관한 여러 상업적 소스가 있다. 해당 기술분야의 당업자는 무엇이 적합한 단백질 A 수지 필터 또는 매질일 수 있는지 그리고 또한 변형된 단백질 A 수지, 필터 또는 매질일 수 있는지를 안다. 그럼에도, 적절한 단백질 A 수지, 필터 또는 매질은 GE 헬스케어로부터의 맵셀렉트™ 슈레 및 밀리포레로부터의 프로셉 울트라 플러스™를 포함하지만, 그들로 한정되지 않는다. 더 큰 정제를 위해 사용될 수 있는 맵셀렉트™로 팩킹된 적합한 칼럼의 비제한적인 예는 예를 들어, 베드 볼륨이 약 6.6L인 20㎝ × 21cm 칼럼일 수 있다. 칼럼에 상관없이, 칼럼은 맵셀렉트™ 또는 프로셉 울트라 플러스™과 같은 적합한 수지를 사용하여 팩킹될 수 있다.

본 발명의 문맥에서 단백질 A 포획 단계는 일반적으로 단백질을 결합한 수지 상에 정화된 회수 용액을 적하하는 것에 의해 결합/용리 모드에서 수행된다. 해당 기술분야의 당업자는 또한 무엇이 단백질 A 수지 또는 매질로부터 불순물을 제거하기에 적합한 세정 조건일 수 있는지를 안다. 그럼에도, 세정 완충액은 종종 20-100mM 트리스 및 pH 7.0-8.0을 갖는 20 내지 1.0M NaCl을 포함하는 완충액으로부터 선택된다. 적합한 용리 완충액의 하나의 예는 약 200mM 아세테이트, 50mM NaCl을 포함하고 그리고 약 pH 3.5를 갖는 용리 완충액일 수 있다.

단백질은 대장균 및 바실러스와 같은 박테리아, 사카로미세스와 같은 이스트, 피치아, 아스페르길리우스, 푸사륨 및 클루이베로미세스, 조류, 식물 세포, 곤충 세포 및 CHO(중국 햄스터 난소) 세포, 하이브리도마, BHK(새끼 햄스터 신장) 세포, 미엘로마 세포, HEK-293 세포, 인간 림포아구성 세포 및 마우스 세포와 같은 포유류 세포를 포함하는 다양한 세포에 발현될 수 있다. 항체와 같은 많은 복잡한 단백질은 종종 CHO 세포, NSO 및 NS1과 같은 뮤린 미엘로마 세포에 또는 PER.C6™인간 배아 망막아세포에 발현된다. 그러한 포유류 세포가 내생 레트로바이러스 유사 입자를 포함하기 때문에, 단계 b)와 같은 레트로바이러스 불활성 단계는 임상적 사용을 위해 의도된 포유류 세포-기반 단백질 생성을 위해 요구된다. 해당 기술분야의 당업자는 레트로바이러스 불활성화 단계를 수행하는 방법을 안다. 그럼에도, 바이러스 불활성화는 종종 단백질 A 포획 단계로부터 용리액의 pH를 낮추는 것에 의해 단백질 A 포획 단계로부터의 용리액 상에 수행된다. 따라서, 용리액의 pH는 3.1 내지 4, 예를 들어, 3.2 내지 4와 같이, 3.3 내지 4, 예를 들어 3.4 내지 4와 같이, 3.5 내지 4, 예를 들어, 3.6 내지 4와 같이, 3.7 내지 4, 예를 들어 3.8 내지 4와 같이, pH 4 또는 3 내지 3.9와 같이, 3.1 내지 3.9, 예를 들어 3.2 내지 3.9와 같이, 3.3 내지 3.9, 예를 들어 3.4 내지 3.9와 같이, 3.5 내지 3.9, 예를 들어, 3.6 내지 3.8, 예를 들어, pH 3.6으로, 5분 내지 24시간의 기간 동안 3.0-4.0의 범위의 pH로 낮춰질 수 있다.

위에 언급된 바와 같이, 단백질 A 포획 단계로부터 용리액은 10분 내지 240분과 같은, 예를 들어 20 내지 90분과 같은 5분 내지 24시간의 기간으로부터 이들 pH 값에서 유지될 수 있고 그리고 단백질 A 친화성 정제 단계로부터의 용리액은 pH 값의 언급된 낮아짐 전에 그리고/또는 pH의 조정 후에 여과될 수 있다. 낮은 pH 바이러스 비활성화 단계의 끝에서, 생성물은 전송 처리를 위해 필요에 따라 중화되고 조정될 수 있다. 예를 들어 용리액의 pH는 pH 7.5 내지 8.5로 조절될 수 있다.

단백질 A 포획 단계는 이온 교환 수지를 부드럽게 교반된 샘플 용액 그리고 또한 교환액 매질에 담그는 것에 의해 이어서 여과에 의해, 특정 유속에서 칼럼 모드로 또는 배치 동작 모드에서 작동된 음이온 교환 크로마토그래피 단계로 이어질 수 있다. 그러나, 바람직한 실시예에서 이러한 음이온 교환 크로마토그래피 단계 c)는 플로우-스루 모드에서 작동된 음이온 크로마토그래피 단계이다. 이 점에서 해당 기술분야의 당업자는 제 1 이온 교환기를 로딩하기 위해 pH 및 이온 강도의 적절한 조건을 규정하는 방법을 안다, 그 조건은 비활성 바이러스 입자 및 다른 불순물이 음이온 수지에 결합되는 동안 플로우 스루에서 항체를 유지하는 것을 초래하고 따라서 항체 용액으로부터 제거된다.

적절한 음이온 교환 크로마토그래피 수지, 필터 또는 매질의 예는 해당 기술분야에 공지되어 있고 아가로스-기반 수지 및 비드, 덱스트란 비드, 폴리스티렌 비드 및 폴리스티렌/디비닐-벤젠 수지를 포함한다. 바람직하게, 음이온 교환 수지는 아머샴-바이오사이언스/파마시아로부터 예를 들어, 세파로오스 CL-6B 또는 세파로오스 패스트 플로우(FF)와 같은 아가로스 매트릭스 상에 고정된 4급 아민-기반 음이온 교환기이다. 그러한 예는 아머샴-바이오사이언스/파마시아로부터의 세파로오스 Q, 사르토리우스 사르토바인드 Q 또는 폴 머스탕 Q이다. 바람직한 음이온 교환 물질은 GE 헬스케어로부터의 Q-세파로오스 패스트 플로우 수지이다.

본 발명에 따른 음이온 교환 크로마토그래피에서 평형 완충액은 바람직하게, 예를 들어, 1 내지 150mM, 더 바람직하게 5 내지 110mM, 가장 바람직하게 20 내지 100mM 염의 범위에서 염화 나트륨과 같은 디스플레이서 염의 염 농도를 가진다. 평형 완충액의 pH는 바람직하게 pH 6.5 내지 pH 9.0의 범위에 있고, 더 바람직하게 pH 7.5 내지 pH 8.5의 범위에 있고, 가장 바람직하게 pH 7.9 내지 pH 8.2의 범위에 있다. 본 발명에 따른 평형 완충액은 바람직하게 1 내지 100mM의, 더 바람직하게 5 내지 50mM의, 가장 바람직하게 10 내지 30mM 트리스의 범위에서 트리스를 포함한다. 바람직하게 본 발명에 따른 평형 완충액의 전도도는 pH 8.0에서 10mS/cm 이하이다.

본 발명에 따라서 제 1 음이온 교환 크로마토그래피 단계는 일반적으로 비고리화된 N-말단 글루타민 및/또는 글루타민산 잔기의 피로-글루타메이트로의 변환을 허용하는 피로-글루타메이트 변환 단계로 이어진다. 정제 공정 내에서 단백질의 N-말단 글루타민 및/또는 글루타민산 잔기의 피로-글루타민산으로의 변환에 적합한 조건이 위에 설명된다. 그러나, 본 발명에 따라서 변환이 약 25℃ 이상의 온도에서 수행된다면 N-말단 글루타민 및/또는 글루타민산 잔기의 피로-글루타메이트로의 변환은 선택 냉각 단계에 의해 이어질 수 있다. 이러한 냉각 단계는 활성 냉각 공정에 의해, 즉, 예를 들어, 물 기반 냉각 공정 또는 플로우-스루 열-교환기를 사용하는 것에 의해 수행될 수 있고; 또는 수동 냉각 공정으로서, 즉, 펌프와 팬과 같은 에너지-소비 기계 구성요소는 온도를 낮추기 위해 사용되지 않는다. 냉각 공정은 결과 변환 용액이 약 18 내지 30℃의 온도에 도달할 때까지 이어질 수 있다. 냉각 공정은 12 내지 96시간과 같은, 24 내지 72시간과 같은, 예를 들어, 24 내지 48시간과 같은 1 내지 120 시간의 범위에서 시간의 기간 동안 수행될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 변환은 12 내지 72 시간 동안 수동 냉각의 단계를 포함한다.

피로-글루타메이트 변환 단계의 끝에서, 완충액 조건은 전송 처리를 위해 필요에 따라 조절될 수 있다. 예를 들어 변환 용액의 pH는 아세트산으로 약 pH 5.5의 pH로 조절될 수 있다.

본 발명에 따라서 생성물 아이소폼을 분리하도록 적합한 수지 및 기울기 용리를 갖는 양이온 교환 크로마토그래피는 피로-글루타메이트 변환 단계를 따를 수 있다. 양이온 교환기에 관한 적합한 예는 S-세파로오스FF 또는 SP-세파로오스HP(파마시아), SP-세파로오스FF(시그마) 및 포로스 HS50(응용 바이오시스템)을 포함한다. 바람직한 양이온 교환기는 응용 바이오시스템으로부터의 포로스 HS50이다.

피로-글루타메이트 변환 단계로부터의 단백질 용액은 아세트산으로 약 pH 5.5의 pH로 조절되고 양이온 교환기 상에 적하될 수 있다. 적합한 세정 완충액은 5 내지 50 mM의 범위에서 소듐 아세테이트 및 5 내지 50 mM의 범위에서 NaCl을 포함하고 5.0 내지 7.0의 범위에서 pH를 가질 수 있다. 결합된 단백질은 다수의 단편으로 13개의 칼럼 세정에 걸쳐 15 내지 180 mM NaCl의 기울기 용리를 사용하여 용리될 수 있다. 용리 후에, 단백질 단편은 분석되고 모아질 수 있다.

양이온 교환 크로마토그래피 단계 전에 변환 단계를 수행하는 특별한 이점은 변환 종의 다른 전하에 있다. 따라서, 단백질 분자 여기서 피로-글루타민산으로 완전히 변환되지 않은 N-말단 글루타민은 더 양으로 충전된다. 따라서, 예를 들어 4개의 N-말단 글루타민 잔기를 갖는 항체 여기서 항체의 하나의 단편은 피로-글루타민산으로 변환된 하나의 N-말단 글루타민 잔기를 갖고, 그리고 피로-글루타민산으로 변환된 2개의 N-말단 글루타민 잔기를 갖는 제 2 단편, 및 피로-글루타민산으로 변환된 3개의 N-말단 글루타민 잔기를 갖는 제 3 단편, 및 모두 4개의 N-말단 글루타민 잔기가 피로-글루타민산으로 변환된 제 4 단편은 4개의 다른 전하를 갖는 4개의 다른 아이소폼으로 유도할 것이다. 그러한 다른 충전된 아이소폼은 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있고 바람직하지 않은 아이소폼은 제거될 수 있다.

본 발명에 따라 바이러스 여과 단계는 양이온 교환기 단계 후에 수행된다. 바이러스 비활성화는 적합한 필터의 사용을 통해 얻어질 수 있다. 본 발명의 특정 실시예가 1차 복구 단계 동안 그러한 여과를 사용함에도, 다른 실시예에서 그것은 정제의 끝에서 두번째 또는 최종 단계로서 포함하는 정제 공정의 다른 단계에 사용된다. 특정 실시예에서, 바이러스 비활성화를 위해, 폴 코포레이션으로부터의 비레솔브™ 필터(밀리포레), 제타 플러스 VR™ 필터(쿠노), 플라노바™ 필터(아사히 카세이 파르마) 및 울티포르 DV50TM 필터와 같은 대안적인 필터가 사용되지만 그들로 한정되지 않는다. 바람직한 필터는 플라노바 20N 파보바이러스 등급 필터이다.

바이러스 여과 후에 단백질 용액은 농축 및 완충액 교환을 위해 초미세여과/정용여과(UF/DF)를 겪는다. 완충액 교환은 30 kDa 분자 중량 컷오프 멤브레인을 사용한 접선 유동 여과(TFF) 및 최종 제제 완충액의 무세제 버전으로의 정용 여과에 의해 수행될 수 있다.

본 발명의 제 3 측면은 약학적 생성물을 위해 N-말단 피로-글루타민산을 갖는 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이고 그 방법은 정제 공정 내에 단백질의 N-말단 글루타민 및/또는 글루타민산 잔기의 피로-글루타민산으로의 변환을 위한 방법을 포함하고, 정제 공정은 N-말단 글루타민 및/또는 글루타민산 잔기의 고리화를 촉진하기 위해 조건 하에 단백질을 배양하는 단계를 포함한다.

본 발명의 제 4 측면은 약학적 생성물을 위한 API로서 N-말단 피로-글루타민산을 갖는 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이고 그 방법은 N-말단 글루타민 및/또는 글루타민산 잔기를 포함하는 단백질의 정제를 위한 방법을 포함하고, 정제를 위한 방법은 N-말단 글루타민 및/또는 글루타민산 잔기의 고리화를 촉진하기 위한 조건 하에 단백질의 N-말단 글루타민 및/또는 글루타민산 잔기의 N-말단 피로-글루타민산으로의 변환의 단계를 포함한다.

본 발명의 제 1 또는 제 2 측면과 관련된 위의 실시예 중 어느 하나는 또한 제 3 및 제 4 측면의 일 실시예이다.

일 실시예에서, 약학적 생성물은 일반적으로 트라스투주맵, 인플리시맵, 바실리시맵, 다클리주맵, 아달리무맵, 오말리주맵, 겜투주맵, 리투시맵, 베바시주맵, 세투시맵, 오파투무맵, 벨투주마보르 오크레리주맵 패니투무맵, 라니비주맵, 이브리투모맵, 티우제탄, 압시시맵, 에쿨리주맵, 알렘투주맵, 오조가미신, 에파리주맵, 팔리비주맵, 나탈리주맵, 오말리주맵 및 토실리주맵으로부터 선택된 항체를 포함한다. 바람직한 실시예에서, 항체는 항-CD20 항체이다.

여기에 인용된 공개, 특허 출원 및 특허를 포함하는 모든 참조는 각각의 참조가 참조에 의해 병합되도록 개별적으로 그리고 구체적으로 지시되고 여기에 전체로 제시된 바와 동일한 범위로 참조에 의해 여기에 병합된다.

모든 표제 및 부표제는 편의에 의해서만 여기에 사용되고 어떤 방식으로든 본 발명을 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.

모든 가능한 변형에서 위에 설명된 요소의 임의의 조합은 여기에 달리 지시되지 않거나 달리 문맥에 의해 명백히 반대되지 않는다면 본 발명에 의해 포함된다.

본 발명을 설명하는 문맥에서 사용된 바와 같이 용어 "어(a)" 및 "언(an)" 및 "상기(the))" 및 유사한 지시 대상은 여기에 달리 지시되거나 문맥에 의해 명백히 반대되지 않는다면, 단수 및 복수 모두를 포함하는 것으로 해석되어야만 한다. 예를 들어, "어(a)" 또는 "언(an)"은 "하나 이상"을 의미한다.

여기에 값의 범위의 설명은 달리 여기에 지시되지 않는다면, 범위 내에 있는 각각의 분리값으로 개별적으로 언급하는 약칭 방법으로서 역할하도록만 의도되고, 각각의 분리값은 여기에 개별적으로 재인용되는 바와 같이 명세서에 병합된다. 달리 언급되지 않는다면, 여기에 제공된 모든 정확한 값은 대응하는 대략적인 값을 나타낸다(예, 특정 요소 또는 측정에 대해 제공된 모든 정확한 예시적인 값은 또한 "약(about)", 적절하게 수정된, 대응하는 대략적인 측정을 제공하는 것으로 간주될 수 있다).

여기에 설명된 모든 방법은 달리 여기 지시되거나 달리 문맥에 의해 명백히 반대되지 않는다면 임의의 적절한 순서로 수행될 수 있다.

여기에 제공된 임의의 그리고 모든 예시, 또는 예시적인 언어(예, "그러한 바와 같이")의 사용은 본 발명을 더 잘 나타내도록만 의도되고 달리 지시되지 않는다면 본 발명의 범위에 대한 한정을 나타내지 않는다. 명세서에서 어떠한 언어도 동일한 것이 명백하게 언급되지 않는다면 임의의 부재가 본 발명의 실시에 필수적인 것을 나타내는 바와 같이 해석되지 않아야 한다.

여기 특허 문헌의 인용 및 병합은 편의를 위해서만 행해지고 그러한 특허 문헌의 타당성, 특허성 및/또는 시행가능성 중 어느 하나의 관점을 반영하지 않는다.

부재 또는 부재들을 참조하여 "포함하는", "갖는", "구비하는" 또는 "함축하는"과 같은 용어를 사용하는 본 발명의 임의의 측면 또는 실시예에 관한 여기 설명은 달리 언급되거나 문맥에 의해 명백히 반대되지 않는다면, 특정 부재 또는 부재들을 "구성하는", "필수적으로 구성하는", 또는 "실질적으로 포함하는" 본 발명의 유사한 측면 또는 실시예에 관한 지지를 제공하도록 의도된다(예, 특정 단계를 포함하는 바와 같이 여기에 설명된 정제 방법의 변환의 방법은 달리 언급되지 않거나 문맥에 의해 명백히 반대되지 않는다면, 역시 단계를 구성하는 방법을 설명하는 바와 같이 이해될 수 있다).

본 발명은 허용가능한 법에 의해 허용된 최대 범위까지 여기에 제시된 측면 또는 청구항에 재인용된 대상 문제의 모든 수정 및 등가물을 포함한다.

본 발명은 다음의 예에 의해 더 도시되지만, 보호의 범위를 한정하는 바와 같이 해석되지 않는다. 앞서의 설명에서 그리고 다음의 예에서 개시된 특징은 모두 개별적으로 그리고 임의의 조합으로 다양한 형태로 본 발명을 구현하기 위한 소재일 수 있다.

실시예 :

실시예 1

리투시맵 모노클론 항체를 발현하는 CHO 생성기 세포 라인(또한 상표명 리투산으로 공지됨)이 직선 유가식 발효 공정을 사용하여 교반 탱크 설계를 갖는 10L 단일 사용 바이오리액터에서 리투시맵 항체를 생성하도록 선택되고 사용되었다.

리투시맵은 마우스 가변 도메인 및 인간 IgG1 중쇄 및 카파 경쇄 불변부를 갖는 키메라 항체이다. 리투시맵의 중쇄 및 경쇄 모두는 N-말단에서 글루타민을 갖고(분비 신호 펩티드를 제거한 후), 중쇄는 C-말단에서 리신을 가진다. N-말단 글루타민은 세포 효소 및 화학적 변환 모두에 의해 피로-글루타민산으로 고리화할 수 있고, 세포 카복시펩티다아제에 의한 C-말단 리신 클립핑은 매우 일반적이다. 이들 변형 모두는 단백질 상의 양전하의 수를 감소시키고, 이들 N-및 C-말단 변형의 불균일성은 복합 양이온 교환 고성능 액체 크로마토그래피(IEX-HPLC) 프로파일에 기여한다(도 2에 도시된 바와 같음).

정화된 회수 샘플은 맵셀렉트 슈레 수지를 사용하여 단백질 A 친화성 크로마토그래피 단계 상에 처음 적하되고 결합/용리 모드에서 작동되었다. 결합 리투시맵 항체가 4.5 칼럼 볼륨의 200mM 아세테이트, 50mM NaCl, pH 3.5±0.1을 사용하여 용리되고 주변 온도에서 105±15분 동안 낮은 pH에서 배양에 의해 바이러스 비활성에 영향받기 전에 맵셀렉트 슈레는 5 칼럼 볼륨의 20mM 트리스, 1M NaCl pH8.0으로 그리고 이어서 2.5 칼럼 볼륨의 20mM 트리스, 50mM NaCl pH8.0으로 세정되었다.

바이러스 비활성화 후에 용액은 0.6M 트리스, 50mM NaCl pH 8.5를 사용하여 pH 8로 중화되었고 그리고 또한 플로우-스루 모드에서 작동된 Q-세파로오스 패스트 플로우 수지를 사용하여 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 더 정제되었다. 이러한 절차는 양호한 DNA 및 바이러스 제거를 제공하는 것으로 알려져 있다. 선행 기술에 기반해서, 양호한 바이러스 제거는 전도도가 ≤10 mS/cm라면 pH 8.0에서 AEX-FT로부터 기대될 수 있다. 이것은 주사용 증류수(WFI)로 단순한 희석에 의해 달성될 수 있지만, 공정 볼륨 그리고 따라서 공정 시간을 증가시킨다. 단순한 2배 희석이 10 mS/cm 이하의 최종 AEX 로드를 확실히 초래할 수 있다는 것을 보장하기 위해, 단백질 A 세정 및 용리 완충액의 NaCl 농도를 절반으로 감소시키는 것이 소망될 수 있다.

결과 플로우-스루 용액은 도 2에 도시된 바와 같이, 애질런트 고성능 액체 크로마토그래피 시스템을 사용하여 그리고 Ref Lot M86188 및 Ref Lot B6109B01로 지시된 상업적으로 이용가능한 리투시맵 항체 제조의 2개의 다른 배치와 비교해서, 디오넥스 프로팩 WCX-10 칼럼 상에 수행된 양이온 교환 고성능 액체 크로마토그래피(IEX-HPLC)에 의해 분석되었다.

여기에 생성된 D83 BSR4 리투시맵 제조는 물론, 모두 상업적으로 이용가능한 리투시맵 항체 제조 Ref Lot M86188 및 Ref Lot B6109B01의 질량 분석에 의한 펩티드 매핑으로부터의 결과는 IEX-HPLC 분석의 메인-피크가 2개의 C-말단 리신 잔기가 부족하고 그리고 고리화된 피로-글루타메이트로 변환된 모두 4개의 글루타민 잔기를 갖는 리투시맵 분자로 구성됨을 나타냈다. 게다가, IEX-HPLC 분석은 여기 생성된 D83 BSR4 리투시맵 제조에 비해 상업적으로 이용가능한 리투시맵 항체 제조의 포스트-피크의 외관에서 현저한 차이를 나타냈다.

펩티드 매핑 및 질량 분석에 의한 다수의 리투시맵의 조성물의 분석은 상업적으로 이용가능한 리투시맵과 여기 생성된 D83 BSR4 리투시맵 제조 사이의 포스트-피크의 외관에서의 차이가 주로 N-말단 글루타민의 불완전한 고리화로 인한 것임을 나타냈다.

포스트-피크 리투시맵 아이소폼의 양을 감소시키는 한 가지 방법은 뒤이은 양이온 교환 정제 단계 동안 초과 유리 N-말단 글루타민을 갖는 생성물을 제거하고 폐기하는 것일 수 있다. 그러나, 포스트-피크 리투시맵 아이소폼은 D83 BSR4와 같은 제조에서 총 리투시맵 아이소폼의 50%까지 차지하기 때문에, 이것은 거의 절반까지 수득율을 감소시킬 수 있다.

그러므로, 이어지는 실험은 리투시맵 메인-피크 아이소폼의 수득율을 개선하기 위해 기능적으로 적절한 온도에서 음이온 교환 용액의 글루타민 고리화를 촉진할 수 있는 최적 조건을 식별하도록 수행되었다.

실시예 2

테스트하기 위한 제 1 조건은 단순히 음이온 교환 플로우-스루 용액(AEX FT) 또는 이어지는 양이온 교환 로딩 용액(CEX-로드)이 주변 온도에서 또는 37℃에서 글루타민 고리화를 촉진할 수 있는지 여부를 결정하는 것이다.

샘플은 음이온 교환 플로우-스루 단계(pH 8)의 끝에서 취해졌고 그 후에 양이온 교환 로드를 위한 제조가 수행되고(pH 5.5) 타임-포인트에 대해 복제 튜브로 부분표본화되고 주변 온도에서 또는 37℃에서 유지되었다. 13일에 걸쳐 주기적으로, 각각의 조건으로부터 하나의 튜브가 -70℃ 냉동고로 전달되었고, 시간 코스의 끝에서, 모든 샘플은 해동되고 IEX-HPLC에 의해 분석되었다(도 3). (CEX 로드의 더 적은 부분 표본이 주변 온도 유지를 위해 이루어졌다).

도 3에 도시된 바와 같이, 메인-피크 아이소폼으로의 리투시맵 포스트-피크 아이소폼의 어떠한 변환도 주변 온도에서 또는 37℃에서 리투시맵 AEX FT 용액을 배양할 때 발견되지 않았다. 반대로, 리투시맵 항체가 CEX-로드 용액에서 배양되었을 때 리투시맵 포스트-피크 아이소폼은 주변 온도에서 그리고 37℃에서 배양될 때 모두 메인-피크 아이소폼으로 변환되는 것으로 발견되었다. 그러나, 주변 온도에서 그리고 37℃에서 모두 변환 비율은 총 퍼센트 포스트-피크가 배양 8일 후에 ~10%까지 감소되는 바와 같이 다소 느려지는 것으로 발견되었고, 이는 포스트 피크의 시작량의 ~20%가 메인 피크로 변환되는 것에 대응한다.

실시예 3

여기 관찰한 것보다 더 높은 변환 비율은 pH 6.2에서 35 mM 인산 완충액의 존재 하에 딕 등(2007, 바이오테크놀로지, 바이오엔지니어링 97권 p544)에 의해 보고되었다. 따라서, 새로운 실험은 주변 온도, 37℃ 및 45℃에서 변환의 운동역학 그리고 또한 단백질 농도가 가질 수 있는 변환 비율에 대한 효과를 조사하도록 수행되었다.

리투시맵 AEX FT 용액은 제조 공정에서 실행하기에 가장 기능적으로 단순한 접근으로서, 농축된 모액으로부터 35mM까지 인산나트륨이 첨가되고 아세트산으로 pH 6.25로 적정화된다.

리투시맵 AEX FT 인산나트륨 용액은 3개의 부분 표본으로 나누어졌고 여기서 하나는 1.85 mg/mL 단백질의 농도에서 변경되지 않은 채 남는 한편 2개의 다른 것은 밀리포레 30 kDa MWCO 스핀 농축기를 사용하여 대략적으로 3.7 및 9.25 mg/mL까지 2x(중간 패널) 및 5x(우측 패널)로 농축되었다. 각각의 샘플은 0.2㎛ 시린지 필터로 필터 살균되고 개별적인 시간-포인트에 대해 에펜도르프 튜브로 하위 부분표본화되었다. 여러 복제 부분표본은 3일까지 동안 주변 온도(최상위열), 37℃(중간열), 및 45℃(최하위열)에서 유지되었다(도 4). 지시된 시간-포인트에서, 각각의 조건으로부터 하나의 튜브는 2-8℃로 전달되었고, 실험의 끝에서, 모든 샘플은 동일한 분석에서 함께 분석되었다. 각각의 패널은 각각의 배양 조건에 대해 시간-코스를 가로질러 IEX-HPLC 프리, 메인, 및 포스트-피크의 비율을 나타낸다. 비교를 위해, 상업적으로 이용가능한 리투시맵 기준 표준에 대한 프리, 메인, 및 포스트-피크의 비율은 각각의 열에서 제 1 그래프에 도시된다.

결과는 피로-글로타민산 변환이 각각의 조건에서 프리-피크 형성보다 항상 더 신속했음에도, 피로-글루타민산 변환 및 프리-피크 형성 모두의 비율을 명백히 증가시켰음을 나타냈다(도 4). 45℃에서, % 메인-피크는 1일에 최대 60-70%에 도달했고 임의의 추가적인 포스트-피크 변환을 앞지르는 프리-피크 형성으로서 강하하기 시작했다. 37℃에서, 변환은 더 늦어졌고 동일한 최대 % 메인-피크는 3일에 도달했다. 일부 변환은 주변 온도에서 분명한 한편, 그 온도에서 변환 비율은 37℃에서 관찰된 것의 절반이하였다. 단백질 농도의 어떠한 명백한 효과도 임의의 온도에서 관찰되지 않았다.

실시예 4

그런 후에, 뒤이은 양이온 교환 POROS HS50 칼럼 상에 로딩하기 위해 더 많은 전도성일 수 있는 pH 및 희석 인자(즉, 더 낮은 [NaCl])의 변수를 포함하는, 인산염(30, 60, 90 mM) 농도의 효과가 평가되었다.

리투시맵 AEX-FT 용액(D83)은 50mM NaCl(~50mM NaCl 최종을 초래함-상부 패널)로 또는 주사용 증류수(WFI)(~25mM NaCl 최종을 초래함-하부 패널)로 2배 희석되고 아세트산으로 pH 6.2 또는 pH 5.8로 적정화된, 30, 60, 또는 90 mM 최종 용액을 제조하기 위해 농축된 스톡으로부터 인산나트륨이 첨가되었다. 이들 용액은 실시예 3에서와 같이, 37℃에서 2일 동안 배양되었고 IEX-HPLC에 의해 분석되었다. 비교를 위해, 동일한 상업적으로 이용가능한 리투시맵 기준 표준 및 제어 D83 T=0 샘플이 각각의 그래프에 도시된다.

결과는 37℃에서 배양의 2일 후에, 더 높은 인산염 농도는 포스트-피크에서 약간 더 큰 감소 및 메인-피크에서 더 높은 증가를 초래함을 나타냈다(도 5). 유사하게, pH 6.2는 pH 5.8보다 약간 더 양호한 변환을 촉진했다. 25 또는 50 mM NaCl을 사용하는 것 사이에 어떠한 명백한 차이도 발견되지 않았다.

이 점에서, 모든 실험은 정적 조건 하에 작은 튜브에서 수행된 반면에 실험은 큰 규모 제조에 관련되도록, 교반된 진동 플라스크 모델에서 반복되었고, 임펠러로 혼합하는 것은 37℃에서 3일에 걸쳐, 고른 온도를 보장하도록 수행될 수 있다. 이들 결과는 변환으로부터 제외하고 더 작은 정적 모델에서 얻어진 이전의 관찰을 확인했고 운동역학은 진동 플라스크 모델에서 90mM 인산염에서 약간 더 빨랐다.

실시예 5

나노여과 및 모든 미생물 제어 특징을 포함하는 풀 스케일 완전한 공정 제조 작동이 500L 바이오리액터를 사용하여 수행되었고 실시예 1에 설명된 바와 같이 필수적으로 정제되었다. 37℃에서 대략적으로 28시간 동안 리투시맵 항체를 배양한 후에, 48시간 동안 실온으로 점차로 냉각되었다. 결과 리투시맵 용액이 양이온 교환 크로마토그래피 POROS HS 수지 상에 적하되었고 4 칼럼 볼륨의 15mM NaCl, 20 mM 나트륨 아세테이트 pH 5.5 및 5.5 칼럼 볼륨의 15mM NaCl, 20mM 인산나트륨 pH 6.5로 세정되었다. 리투시맵 항체는 단편 당 0.5 칼럼 볼륨의 단편 수집으로 13 칼럼 볼륨에 걸쳐 15 내지 180 mM NaCl의 선형 경사를 사용하여 용리되었다. 아래의 표 1은 상업적으로 이용가능한 리투시맵 제조를 위해 지시된 리투시맵 참조는 물론 단편 1 내지 9의 총 단백질 함량 및 개별적인 단편 상의 그리고 풀 단편 1 내지 6 상의 IEX-HPLC 분석을 나타낸다.

표 1로부터 보여질 수 있는 바와 같이, 풀 단편 1 내지 6은 완전히 용리된 단백질의 96%에 대응한다, 즉, 리투시맵 및 % 프리, 메인 및 포스트 피크(16.3; 63.0; 20.7)는 상업적으로 이용가능한 리투시맵 제조(20.2; 66.5; 13.4)와 다소 유사하다. 달리 말해서 풀 단편 1 내지 6의 리투시맵 아이소폼 조성물은 상업적으로 이용가능한 리투시맵 제조와 매우 유사하다.

이것은 실험 1의 결과와 상당히 다르고 포스트-피크 리투시맵 아이소폼의 양은 총 리투시맵 아이소폼의 50%까지 차지했다.

결론

실시예 1 내지 5에 도시된 바와 같이 제조 규모에서 N-말단 글루타민 또는 글루타민산 잔기를 피로-글루타민산으로 변환하기 위한 강건한 그리고 더 재생가능한 절차가 전개되었다. 공정은 배치 대 배치 변동을 감소시키고 이온 프로파일에 대해 상업적으로 이용가능한 생성물과 유사한 생성물을 구성하도록 설계된다.

공정은 정제 공정 내의 비고리화된 N-말단 글루타민 잔기의 피로-글루타민산으로의 비효소 변환을 위해 pH 약 6.2를 갖는 인산염 및 NaCl의 최적량을 포함하는 조성물로 비고리화된 N-말단 글루타민 잔기를 갖는 단백질을 포함하는 음이온 교환 플로우-스루 용액의 쉽고 빠른 전달에 최적화된다.

참조

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딕 등, 2007. 모델 펩티드를 사용하여 모노클론 항체에서 N-말단 피로-글루타메이트 변동의 기원의 결정. 바이오테크놀로지 및 바이오엔지니어링, 97권, 3호, 6월 15일, 544-553 (Dick et al., 2007. Determination of the Origin of the N-Terminal Pyro-Glutamate Variation in Monoclonal Antibodies Using Model Peptides. Biotechnology and Bioengineering, Vol. 97, No. 3, June 15, 544-553).

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SEQUENCE LISTING <110> MABXIENCE S.A. <120> A method for increasing pyro-glutamic acid formation of a polypeptide <130> P2661PC00 <140> PCT/EP2014/056700 <141> 2014-04-03 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody <400> 1 Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile 20 25 30 His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 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Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 420 425 430 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 435 440 445 Leu Ser Pro Gly Lys 450

Claims

N-말단 글루타민 및/또는 N-말단 글루타민산을 함유하는 단백질의 정제를 위한 방법으로서,
상기 방법은 상기 단백질의 N-말단 글루타민 및/또는 N-말단 글루타민산의 N-말단 피로-글루타민산의 고리화를 촉진하는 조건 하에 상기 단백질을 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서,
상기 단백질은 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 단백질은 항-CD20 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항-CD20 항체는 SEQ ID NO:1과 동일한 경쇄 서열 및 SEQ ID NO:2와 동일한 중쇄 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 변환은 20-45℃의 온도에서 발생하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 변환은 세포 매체에서, 또는 완충액에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 6항에 있어서,
상기 완충액의 농도는 20mM 내지 150mM의 범위에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서,
pH는 3.5-9.0의 범위에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서,
N-말단 글루타민 및/또는 글루타민산으로부터 피로-글루타민산으로의 상기 변환은 적어도 50%에 도달하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 변환 단계는 N-말단 글루타민 및/또는 글루타민산의 피로-글루타민산으로의 비효소 변환을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단백질은 변환 전에 1 내지 4개의 N-말단 글루타민 잔기 및/또는 1 내지 4개의 N-말단 글루타민산 잔기를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서,
적합한 수지를 갖는 단백질 A 크로마토그래피 및 적합한 수지를 갖는 이온 교환 크로마토그래피의 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 방법은:
(a) 적합한 수지를 갖는 단백질 A 포획,
(b) 3.0-4.0의 범위의 pH에서 바이러스성 비활성화,
(c) 음이온 교환 크로마토그래피,
(d) 상기 단백질의 상기 N-말단 글루타민 및/또는 글루타민산의 피로-글루타민산으로의 변환,
(e) 생성물 아이소폼을 분리하도록 적합한 수지 및 기울기 용리를 갖는 양이온 교환 크로마토그래피,
(f) 바이러스성 여과, 및
(g) 초여과/정용여과(UF/DF) 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 13항에 있어서,
단계(d) 후에 12 내지 72 시간 동안 수동 냉각의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
약학 생성물용 활성 약학 성분으로서 N-말단 피로-글루타민산을 갖는 단백질을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 제 1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 정제 방법을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.