JP2016523812A - タンパク質のピログルタミン酸形成を増加させるための方法 - Google Patents

Abstract

タンパク質のピログルタミン酸形成を増加させるための方法。精製プロセス中のタンパク質のＮ末端グルタミン及び／又はグルタミン酸残基のピログルタミン酸への変換のための方法。【選択図】なし

Description

本発明は、精製プロセス中のタンパク質のＮ末端グルタミン及び／又はグルタミン酸残基のピログルタミン酸への変換のための方法に関する。その上、本発明はＮ末端ピログルタミン酸を含むタンパク質の精製のための方法にも関する。本発明の方法は、Ｎ末端ピログルタミン酸を有するタンパク質を調製するため、特に医薬製品のための医薬品有効成分（ＡＰＩ）を調製するための、製造プロセスに含まれ得る。

組換え治療用タンパク質の大部分は、一又は複数の翻訳後修飾を表示する。これらの修飾は、そのリボソーム合成の間又は（より一般的には）合成が完了した後に生じ得る。今まで多くの翻訳後修飾の特徴が明らかにされてきており、これらの修飾は影響を受けるタンパク質のいくつかの構造的特徴又は機能的役割を与え得る。治療用タンパク質に関連する一般的な翻訳後修飾は、カルボキシル化及びヒドロキシル化、アミド化及び硫酸化、ジスルフィド結合形成及びタンパク質分解処理、並びにグリコシル化、異性化、酸化、Ｎ末端グルタミン又はグルタミン酸のピログルタミン酸への環化、断片化、及び凝集を含む。したがって、翻訳後修飾はタンパク質の酵素的修飾又は非酵素的変換のいずれかにより引き起こされ得、翻訳後修飾は、細胞培養中、又はタンパク質の精製若しくは保管中に発現宿主内で生じ得る。

組換えモノクローナル抗体は、バイオテクノロジー産業にとって大きな価値となっており、数多くの抗体が様々な疾患を治療するために承認されてきた。抗体は一般的にＣＨＯ細胞等の哺乳動物細胞で産生されるため、多くの異なる翻訳後修飾を有し得、生成物に不均一性をもたらす。不均一性は、抗体の表面電荷における変化により、荷電残基の数の変化のように直接的に、あるいは、グリコシル化、重鎖のＣ末端リジンのカルボキシペプチダーゼクリッピング又はＮ末端グルタミン若しくはグルタミン酸残基のピログルタミン酸への環化等の表面電荷分布を変更する化学的又は物理的変成のように間接的に引き起こされ得る。

抗体は典型的には基本的な構造ユニットで作製されており、それぞれはジスルフィド架橋及び非共有結合的相互作用を介して接合される二の大きな重鎖及び二の小さな軽鎖を有する。抗体重鎖にはいくつかの異なる型があり、それらが持つ重鎖に基づく異なるアイソタイプに分類される抗体にはいくつかの異なる種類がある。例えば、重鎖定常領域に関する遺伝子に応じて、ヒトＩｇＧ（１から４）の４つのアイソタイプがある。軽鎖定常ドメインは、二つの遺伝子（κ又はλ）によりコードされる。結果として、各ＩｇＧアイソタイプは、κ又はλ、例えばＩｇＧ１κのいずれかであり得る。細胞株の異なる型において産生される抗体にはいくつかの型があるが、臨床的に最も重要な抗体はＩｇＧ１又はＩｇＧ２タイプの完全長抗体である。

多くのヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ２型抗体は、軽鎖若しくは重鎖のいずれか又は両方のＮ末端でグルタミン酸（Ｇｌｕ）及び／又はグルタミン（Ｇｌｎ）残基を含む。軽鎖遺伝子の重要な部分は、グルタミン酸又はグルタミンのいずれかをコードする。そのようなＮ末端グルタミン酸及び／又はグルタミン残基は、環化を受けて図１に示されるようにピログルタミン酸塩（ｐＧｌｕ）を形成することがある。したがって、ピログルタミン酸塩形成は、事実上全ての臨床的に重要な抗体において生じ、プロセスの完全性の異なるレベルは不均一性の共通ソースである。この不均一性は治療抗体において望ましくなく、これらの変更は荷電群の数を変更することにより直接的に、又は構造変成を誘導することにより間接的に、抗体の表面電荷特性を変えることができる。そのような修飾は生物活性を減少させ、薬物動態及び抗原性を変える潜在力を有する。

グルタミンの環化中、Ｎ末端第一級アミン（中性ｐＨでプラスに帯電）は中性アミドに変換され、抗体の正味電荷の変更をもたらす。反応は、アンモニアの損失（１７Ｄａ）に付随して生じる。結果として、環化の欠如は、主ピークが完全に環化した種の典型であるため、陽イオン交換クロマトグラフィーにより基本変異体として、又はＮ末端アミンの損失後の疎水性の増加に起因する逆相ＨＰＬＣによる遅延溶出ピークとして検出され得る。

グルタミン酸の環化は側鎖のカルボキシル基及びＮ末端アミンを介して生じ、それ故、中性アミド及び放出水を形成する（１８Ｄａ）。一酸性基及び一塩基性基は反応中に凝結するため正味電荷は同一のままであるが、二の荷電残基の損失は分子の疎水性を増加させ、逆相ＨＰＬＣによる検出を可能にする。

抗体におけるピログルタミン酸形成の機序は、完全には理解されていない。環化は自発的に生じ得るか又は酵素グルタミニルシクラーゼにより補助され得る。抗体産生に最も一般的に使用されるグルタミニルシクラーゼがＣＨＯ細胞株で活性であるかについては明らかになっていないが、自発環化の割合は、その反応が非酵素的である可能性が高いことを示す。

例えば、Yu et al. (Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 2006; 42:455‐463)は、モノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖の両方のＮ末端でのグルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）からの非酵素的ピログルタミン酸塩形成を３ヵ月の期間研究した。Yu et al.は、ｍＡｂｓのｐＧｌｕへのＧｌｕのこの非酵素的環化は、プロセス開発中のｐＨ及び温度条件に応じて、ｍＡｂ産生及び保管において発生する主要な分解経路のうちの一つであり得ると述べている。そのようなピロＧｌｕが更なる修飾を誘導し、ｍＡｂ生物活性又は治療効力を変え得るかどうかは明らかではないと彼らは結論付け、Ｎ末端ＧｌｕでのｍＡｂ治療の質を保証することは重大であり得るため、Ｎ末端ｐＧｌｕ形成を密にモニターすることを提案した。

Chelius et al. (Anal. Chem. 2006, 78, 2370‐2376)もまた、いくつかのモノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖の両方のＮ末端でのグルタミン酸からの非酵素的ピログルタメート形成を研究し、この非酵素的反応は非常によく生じること並びに３７℃及び４５℃での数週間のインキュベーション後に検出され得ることを発見した。この反応の割合は、異なるｐＨ値を有するいくつかの水性バッファー中で測定され、ｐＨ６．２でピログルタミン酸の最小の形成を示し、ｐＨ４及びｐＨ８でピログルタミン酸の形成の増加を示した。

グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）のピログルタメートへの変換を考慮して、Dick et al. (Biotechnology and Bioengineering, Vol. 97, No. 3, June 15, 2007)は、組換えモノクローナル抗体のＮ末端グルタミンのそのような環化は自発的に生じることを示し、多くの最終容器モノクローナル抗体で観察される完成が近い変換はバイオリアクターインキュベーションとバイオリアクター中で生じる大部分の修飾を含む精製条件との組合せにより生じる可能性が最も高いことを結論付けた。この研究は、多くの組換え抗体で一般に観察されるピロＱ変異体は精製プロセスからの僅かな貢献のみを有するバイオリアクター内で生じ、高温及び溶媒組成により促進されることを証明する。特に、より高い変換は３７℃で、７５ｍＭのＮａＣｌを含む３５ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ６．２）中にみられる。

したがって、Ｎ末端グルタミン又はグルタミン酸残基のピログルタミン酸への環化等の翻訳後修飾は、産生及び精製条件のわずかな変化により、バッチ間で異なり得る、発現したタンパク質の不均一性をもたらす。したがって、バイオシミラータンパク質を産生するための一又は複数の難題は、革新的な生成物の不均一性に合致させることである。故に、薬学的タンパク質、例えば抗体を厳密な精製要件を満たすために、分析支援を有するよりロバストで再現性のよい産業的な大規模精製プロセスが必要とされる。

本発明の第一の態様は、Ｎ末端グルタミン及び／又はグルタミン酸残基の環化を促進させる条件下でタンパク質をインキュベートする工程を含む、精製プロセス中のタンパク質のＮ末端グルタミン及び／又はグルタミン酸残基のピログルタミン酸への変換のための方法に関する。

本発明の第二の態様は、前記タンパク質のＮ末端グルタミン及び／又はグルタミン酸残基のＮ末端ピログルタミン酸への変換の工程を含む、Ｎ末端グルタミン及び／又はグルタミン酸残基を含むタンパク質の精製のための方法に関する。そのような変換は、Ｎ末端グルタミン及び／又はグルタミン酸残基の環化を促進する条件下でなされる。

本発明の第三の態様は、第一又は第二の態様並びにそれらの実施態様のうちのいずれか一つの精製方法を含む、医薬製品のためのＡＰＩとしてＮ末端ピログルタミン酸を有するタンパク質を調製する方法に関する。

本発明の目的は、所望の製品不均一性を低減する又は獲得するために、増加したか又は制御されたＮ末端ピログルタミン酸レベルを有するタンパク質を調製する代替的なプロセスを提供することである。

発明者は、Ｎ末端グルタミン及び／又はグルタミン酸残基を有するタンパク質、特にモノクローナル抗体の精製工程中、ピログルタミン酸にＮ末端グルタミン及び／又はグルタミン酸残基のインキュベーション／変換の工程を導入することにより、不均一性のレベルを所望のレベルになるよう操作することができることを発見した。

本発明の更なる目的は、本明細書、図面及び請求項を読むことにより明らかとなるであろう。

定義
本明細書で使用される用語「同一性」とは、二のアミノ酸配列間又は二のヌクレオチド配列間の関連性を指し、パラメーター「配列同一性」により表される。本発明の目的上、二のアミノ酸配列間の配列同一性の程度は、ＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅプログラム(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276‐277)、好ましくはバージョン３．０．０以降で実行されるように、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443‐453)を使用して決定される。使用される任意選択的なパラメーターは、１０のギャップ開始ペナルティ、０．５のギャップ伸長ペナルティ、及びＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換行列である。「最長同一性」として標識されたＮｅｅｄｌｅ出力（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを使用して得られる）は、同一性のパーセントとして使用され、次のように計算される：（同定残基ｘ１００）／（アライメント長−アライメント中の全ギャップ数）。

本明細書で使用される用語「Ｎ末端（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ）」、「Ｎ末端（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎｕｓ）」又は「アミノ末端」とは、タンパク質又はポリペプチドの末端部分における遊離アミノ基（−ＮＨ_２）を指す。タンパク質又はポリペプチド配列を記す通常の方法は、左にＮ末端を置きＮからＣ末端へ配列を記すことである。タンパク質又はポリペプチドがメッセンジャーＲＮＡから翻訳される場合、Ｎ末端からＣ末端へ作り出される。

本明細書で使用される用語「グルタミン」、「２−アミノ−４−カルバモイルブタン酸」、「Ｇｌｎ」又は「Ｑ」は、標準的な遺伝子コードによりコードされる２０アミノ酸の一つである。その側鎖は、グルタミン酸の側鎖カルボキシルをアミド官能基で置き換えることにより形成されるアミドである。したがって、それはグルタミン酸のアミドと考えられ得る。

本明細書で使用される用語「グルタミン酸」、「２−アミノペンタン二酸」、「Ｇｌｎ」又は「Ｅ」は、標準的な遺伝子コードによりコードされる２０アミノ酸の一つである。側鎖カルボン酸官能基は、生理的ｐＨでそのマイナスに帯電した脱プロトン化カルボキシレート体中に存在する。

本明細書で使用される用語「ポリペプチド」とは、ペプチド結合により連結されたアミノ酸モノマーの単一直鎖を指す。ポリペプチドに含まれているアミノ酸は「残基」と称され；全てのポリペプチドはポリペプチドのそれぞれの端部で一のＮ末端及び一のＣ末端残基を有する。本明細書で使用されるポリペプチドは、約２０を超える連続アミノ酸を含むより長いペプチドである。

本明細書で使用される用語「タンパク質」とは、典型的には球状又は繊維状に折られた一又は複数のポリペプチドからなる生化学化合物を指し、生物学的機能を促進する。タンパク質はペプチド結合以外の結合により連結されてもよく、例えばタンパク質を作り出すそのようなポリペプチドはジスルフィド結合により連結されてもよい。本明細書で使用される用語「タンパク質」は、約２０を超える連続アミノ酸残基である抗体、タンパク質及び抗体の断片、タンパク質及び抗体の切断型等を包含することが意図される。その上、本明細書で使用されるタンパク質は、天然に存在するポリペプチド及び組換え産生されたポリペプチドを包含することが意図される。

本明細書で使用される用語「ピログルタミン酸」、「５−オキソプロリン」、「ピドル酸」、又は「ピログルタメート」は、グルタミン酸又はグルタミンの遊離アミノ基がラクタムを形成するために環化する稀なアミノ酸誘導体を指す。多くのタンパク質（例えばバクテリオロドプシン、フィブリン、フィブリノゲン）において、神経ペプチド及びホルモン（例えばニューロテシン、ガストリン、アペリン及びオレキシンＡ）並びに抗体（例えばインフリキシマブ、セツキシマブ、リツキシマブ、トラスツズマブ、ベバシズマブ、パニツムマブ、アダリムマブ、ラニビズマブ）が発見されている。Ｎ末端グルタミン及びグルタミン酸残基は、自発的に環化してピログルタメートとなり得る。これはブロックされたＮ末端のいくつかの形態のうちのひとつであり、ピログルタミン酸には存在しない遊離第一級アミノ基を要するエドマン科学を使用したＮ末端配列の問題を提示する。エンザイムピログルタメートアミノペプチダーゼは、ピログルタメート残基を切断することにより遊離Ｎ末端を修復し得る。

本明細書で使用される「精製プロセス」とは、タンパク質を複合混合物から単離することを意図された一のプロセス又は一連のプロセスを指す。タンパク質は、一又は複数のアイソフォームで構成されていてもよく、即ち不均一性を呈する。用語「精製プロセス」とは、タンパク質及び抗体精製を包含するがこれに限定されない。出発物質は典型的には細胞培養物（例えば哺乳動物細胞培養物、酵母培養物又は微生物培養物）であり、精製プロセス中の様々な工程が、それを限定し、混合物のタンパク質及び非タンパク質部分を分離し、最終的に全ての他のタンパク質から所望のタンパク質を分離するマトリックスからタンパク質を放出し得る。タンパク質が抗体である場合、典型的な分離はプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用及び／又はヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含む。

本明細書で使用される用語「抗体」とは、ジスルフィド結合により相互連結された二本の重（Ｈ）鎖及び二本の軽（Ｌ）鎖の四本のタンパク質鎖を含む免疫グロブリン分子を指す。各重鎖は重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲ又はＶＨと略される）及び重鎖定常領域（ＣＨ）に含まれる。重鎖定常領域は三つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３に含まれる。各軽鎖は軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域に含まれる。軽鎖定常領域は一つのドメイン、ＣＬに含まれる。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保全された領域で空間を満たす相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変領域に更に細分化され得る。各ＶＨ及びＶＬは、次の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端に配置される三つのＣＤＲ及び四つのＦＲからなる。抗体は、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆａｂ及びその単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、二重特異性抗体、ヘテロコンジュゲート、ヒト及びヒト化抗体を含む。そのような抗体は、ハイブリドーマ培養物、細菌又は哺乳動物細胞培養物中の組換え発現、及び遺伝子組換え動物中の組換え発現を含む様々な方法で産生され得る。また抗体は、線状ファージ、細菌、酵母又はリボソーム等のディスプレイ系で発現する配列のライブラリーから配列を選択することにより産生され得る。例えばChadd and Chamow, Curr. Opin. Biotechnol., 12:188‐194 (2001)の特定の酸性方法を選択するための文献に十分な手引が存在する。製造方法の選択は、所望の抗体構造、抗体の炭化水素部分の重要性、培養及び精製の容易さ並びに費用を含むいくつかの要因に基づく。多くの異なる抗体構造は、完全長抗体、抗体断片、例えばＦａｂ及びＦｖ断片、並びに異なる種からの成分を含むキメラ抗体を含む標準的な発現技術を使用して生成され得る。

本明細書で使用される用語「医薬製品」とは、哺乳動物、例えばヒト対象への投与に適した医薬品有効成分（ＡＰＩ）を含む投与形態を意味し、その投与形態は好適な担体及び／又は賦形剤を含んでもよく、臨床治験において使用されているか又は国、地域又は国際機関により販売が承認されている。本発明の方法のいずれか一つにより調製されるタンパク質、例えばタンパク質又は抗体を含む医薬製品は、例えばRemington: The Science and Practice of Pharmacy 1995, edited by E. W. Martin, Mack Publishing Company, 19th edition, Easton, Pa.に記載されるような従来の技術により調製されてもよい。医薬製品は、例えばカプセル、錠剤、凍結乾燥されたケーキ若しくは粉末、エアロゾル、溶液、懸濁液又は局所適用、特に注射、例えば皮下若しくは静脈内注射の従来の形態で見られる。医薬製品は様々な薬学的に許容される製剤中に見られ、一又は複数の生理的に許容される担体と組み合わされてもよい。用いられる薬学的担体又は希釈剤は、慣習的な固体又は液体の担体又は希釈剤であってもよい。固体担体の例は、ラクトース、白土、スクロース、シクロデキストリン、タルク、ゼラチン、アガー、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又はセルロースの低級アルキルエーテルである。液体担体の例は、シロップ、ピーナッツオイル、オリーブオイル、リン脂質、ステロール、脂肪酸、脂肪酸アミン、ポリオキシエチレン、等張緩衝液、水及び無菌生理食塩水である。

Ｎ末端グルタミン及びＮ末端グルタミン酸の環化中のピログルタミン酸形成の機序の配置図である。 二つの市販のリツキシマブバッチ参照ロットＭ８６１８８及び参照ロットＢ６１０９Ｂ０１、並びに本明細書中で産生されるＤ８３ ＢＳＲ４リツキシマブ調製物の陽イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＩＥＸ−ＨＰＬＣ）プロファイルを示す。ピーク前、主ピーク及びピーク後はクロマトグラムプロファイル中で示される。主ピークは、二つのＣ末端リジン残基を欠き、ピログルタメートに変換された４つ全てのグルタミン残基を有するリツキシマブ分子からなるように見られる。本明細書中で産生されるＤ８３ ＢＳＲ４リツキシマブ調製物と比較した場合の、市販のリツキシマブ抗体調製物のピーク後の出現の有意差は、主にＮ末端グルタミン残基の不完全な環化により引き起こされるとみられる。 ＡＥＸ（陰イオン交換）及びＣＥＸ（陽イオン交換）における全ピーク範囲間の相関並びに異なる温度でのインキュベーションの時間を示す四つのグラフである。上のグラフは常温又は室温のインキュベーションに相当し、下のグラフは３７℃のインキュベーションに相当する。ＦＴはクロマトグラフィーのフロースルーに相当する。 リン酸ナトリウムを３５ｍＭに追加し、ｐＨ６．２５に滴定した溶液中常温（４−１）、３７℃（４−２）及び４５℃（４−３）での低タンパク質濃度（１．８５ｍｇ／ｍＬ；左パネル）、中タンパク質濃度（３．７ｍｇ／ｍＬ；中間パネル）及び高タンパク質濃度（９．２５ｍｇ／ｍＬ；右パネル）のリツキシマブピーク後アイソフォームの主ピークアイソフォームへの変換の動態を示す。 リツキシマブのピーク後アイソフォームの主ピークアイソフォームへの変換動態上のｐＨ５．８及び６．２での異なるホスフェート濃度（３０、６０及び９０ｍＭ）、塩化ナトリウム濃度（５０及び２５ｍＭ）の効果を示す。

発明者は、Ｎ末端グルタミン及び／又はグルタミン酸残基を有するタンパク質の精製工程中、ピログルタミン酸にＮ末端グルタミン及び／又はグルタミン酸残基のインキュベーション／変換の工程を導入することにより、不均一性のレベルが所望のレベルへ減少され、同時に所望のタンパク質の算出を増加するよう操作され得ることを発見した。

タンパク質のＮ末端グルタミン及びグルタミン酸は図１に示されるようなピログルタメートを形成する環化を受けることができる。グルタミンの環化中、Ｎ末端第一級アミン（中性ｐＨでプラスに帯電）は中性アミドに変換され、タンパク質の正味電荷の変更をもたらす。反応はアンモニア（１７Ｄａ）の損失に付随して生じ、結果として、環化の欠如は、主ピークが完全に環化した種の典型であるため、陽イオン交換クロマトグラフィーにより基本変異体として、又はＮ末端アミンの損失後の疎水性の増加に起因する逆相ＨＰＬＣによる遅延溶出ピークとして検出され得る。

グルタミン酸の環化は側鎖のカルボキシル基及びＮ末端アミンを介して生じ、中性アミド及び放出水を形成する（１８Ｄａ）。一酸性基及び一塩基性基は反応中に凝結するため正味電荷は同一のままであるが、二の荷電残基の損失は分子の疎水性を増加させ、逆相ＨＰＬＣによる検出を可能にする。

多くのヒト抗体はそのＮ末端にグルタミン酸及び／又はグルタミン残基を含むため、ピログルタメート形成は多くの臨床的に重要な抗体の調製中に生じることがあり、しばしば発現した抗体の不均一性をもたらし、これは産生及び精製条件のわずかな変化によりバッチ間で異なり得る。これは産業規模等の大規模でのタンパク質の精製における重要な問題であるため、ポリペプチドを含むタンパク質に同じことが当てはまる。

第一の態様において、本発明は、Ｎ末端グルタミン及び／又はグルタミン酸残基の環化を促進させる条件下でタンパク質をインキュベートする工程を含む、精製プロセス中のタンパク質のＮ末端グルタミン及び／又はグルタミン酸残基のピログルタミン酸への変換のための方法に関する。

第二の態様において、本発明は、前記タンパク質のＮ末端グルタミン及び／又はグルタミン酸残基のＮ末端ピログルタミン酸への変換の工程を含む、Ｎ末端グルタミン及び／又はグルタミン酸残基を含むタンパク質の精製のための方法に関する。そのような変換は、Ｎ末端グルタミン及び／又はグルタミン酸残基の環化を促進する条件下でなされる。

本明細書で使用される生成プロセスは、当該技術分野で知られる方法に従って実施され得、特定のタンパク質により様々である。タンパク質精製スキームは、精製されるタンパク質と望ましくないタンパク質夾雑物との間の大きさ、電荷及び溶解度の分子特性における差異を前提としている。これらのパラメーターに基づくプロトコールは、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、示差沈殿等を含む。

抗体を精製するためのプロセスは、一般的に捕獲のためのアフィニティークロマトグラフィー、典型的にはプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーである。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーとは、プロテインＡを使用した物質及び／又は粒子の分離又は精製を指し、プロテインＡは一般的に固体相上に固定化されている。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィープロセスの後には、典型的にはイオン交換及び／又は疎水性相互作用及び／又は混合モードクロマトグラフィー工程が続く。そのようなプロセスは、一般的に二つのウイルス減少工程、典型的にはアフィニティ工程からの溶出における低ｐＨによる減少及びプロセスの好適な位置でのウイルスフィルターの実行を含む。抗体精製プロセス中に除去された不純物は、半抗体、抗体断片、ダイマー、及び凝集体、ＤＮＡ、ウイルス、ＨＣＰ（宿主細胞タンパク質）、プロテインＡ漏出、エンドトキシン並びにその他関連する不純物を含む。

本発明の一実施態様において、タンパク質は酵素、ホルモン又は抗体から選択される。タンパク質の好適な例は、バクテリオロドプシン、フィブリノゲン、コラーゲン、キニン、ニューロテンシン、ガストリン、アペリン及びオレキシンＡ抗体又は抗体断片を含む、一又は複数のＮ末端グルタミン及び／又はグルタミン酸残基を含む任意のタンパク質を含む。抗体の例は、限定するものではないが、トラスツズマブ、インフリキシマブ、バシリキシマブ、ダクリズマブ、アダリムマブ、オマリズマブ、ゲムツズマブ、リツキシマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、オファツムバブ、ベルツズマブ又はオクレリズマブ、パニツムマブ、ラニビズマブ、イビリツモマブ、チウキセタン、アビシキシマブ、エクリズマブ、アレムツズマブ、オゾガマイシン、エファリズマブ、パリビズマブ、ナタリズマブ、オマリズマブ及びトシリズマブを含む。

本発明の更なる実施態様において、抗体は、配列番号３の軽鎖配列及び配列番号４の重鎖配列を有するトラスツズマブ並びに配列番号５の軽鎖配列及び配列番号６の重鎖配列を有するベバシズマブである。

本発明の更なる実施態様において、抗体は抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である。抗ＣＤ２０抗体の好適な例は、リツキシマブ、オファツムマブ、ベルツズマブ又はオクレリズマブである。

本発明の好ましい実施態様において、抗体はリツキシマブと同一配列、例えばリツキシマブである。

更なる実施態様において、タンパク質は、それぞれ配列番号１及び配列番号２であるリツキシマブの軽鎖及び重鎖配列と同一配列を含む。

本発明の更なる実施態様において、タンパク質は、配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性、例えば９５％、９７％、９８％、９９％の同一性を、及び配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性、例えば９５％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する配列を含む。

本発明の更なる実施態様において、タンパク質は、変換前に１から４のＮ末端グルタミン及び／又は１から４のＮ末端グルタミン酸残基を有する。したがって、タンパク質が単一鎖タンパク質である場合、一のＮ末端グルタミン残基又は一のＮ末端グルタミン酸残基を含んでもよい。しかしながら、タンパク質が一以上のサブユニットからなる場合、一のＮ末端グルタミン残基及び一のＮ末端グルタミン酸残基又は二のＮ末端グルタミン残基又は二のＮ末端グルタミン酸残基を含んでもよい。上で説明したように、抗体は、ジスルフィド結合により相互連結された四本のポリペプチド鎖（即ち、サブユニット）、二本の重（Ｈ）鎖及び二本の軽（Ｌ）鎖を含む。各重鎖配列は、一のＮ末端グルタミン残基又は一のＮ末端グルタミン酸残基のいずれかをコードしてもよい。同様に、各軽鎖配列は、一のＮ末端グルタミン残基又は一のＮ末端グルタミン酸残基のいずれかをコードしてもよい。
したがって、更なる実施態様において、タンパク質は、２のＮ末端グルタミン残基、４のＮ末端グルタミン残基、２のＮ末端グルタミン酸残基、４のＮ末端グルタミン酸残基、又は２のＮ末端グルタミン残基及び２のＮ末端グルタミン酸残基から選択される、本発明の方法に従って変換される２若しくは４のＮ末端グルタミン及び／又はグルタミン酸残基を有する抗体である。

Ｎ末端グルタミン及び／又はグルタミン酸残基のピログルタミン酸への変換は、自発的に生じ得るか又はグルタミニルシクラーゼ等の酵素により補助され得る。グルタミニルシクラーゼは、様々なペプチドホルモンン及びタンパク質に関するグルタミン及びグルタミン酸環化に関与しており、酵素活性は異なる組織において検出されている。高温で保管された精製抗体におけるグルタミン及びグルタミン酸の自発的環化もまた検出されている(Schilling et al., FEBS Lett., 2004, 563,191-196; Kumar and Bachhawat, Current Science, Vol. 102, No. 2, 25 January 2012)。

本発明の一実施態様において、Ｎ末端グルタミン及び／又はグルタミン酸残基のピログルタミン酸への変換は、非酵素的変換である。典型的には、非酵素的変換は高温で好適な期間で生じ、ｐＨの変化は変換に寄与し得る。これらのパラメーターの二又は三の任意の組合せだけではなく、これらのパラメーターのいずれか一つも本発明の一実施態様と考えられる。

Ｎ末端グルタミン及び／又はグルタミン酸残基のピログルタミン酸への変換に好適な温度は、２０−５０℃の範囲、例えば２５−４５℃、例えば３５−４０℃、例えば３７℃である。Ｎ末端グルタミン及び／又はグルタミン酸残基のピログルタミン酸への変換に好適な期間は、４から１２０時間、例えば１２から９６時間、例えば２４から７２時間、例えば８から４８時間である。

Ｎ末端グルタミン及び／又はグルタミン酸残基のピログルタミン酸への変換に好適なｐＨ範囲は、３．５−９．０の範囲、例えば４．０−８．０、例えば４．５−７．５、例えば５．０−７．０、例えば５．８−６．５、例えばｐＨ６．２である。

本発明の典型的な実施態様において、変換は２０−５０℃の温度で４から１２０時間、例えば３０−４５℃、例えば３７−４０℃の温度で１２から７２時間生じる。

Ｎ末端グルタミン及び／又はグルタミン酸残基のピログルタミン酸への非酵素的変換は、数多くの異なる培地で生じ得る。タンパク質が溶液又は懸濁液に存在する好適な培地は、水、細胞培地、バッファー、例えばリン酸バッファー、トリス−ＨＣｌバッファー又は炭酸アンモニウムバッファーから選択され得る。変換は精製プロセス中、タンパク質がクロマトグラフィー樹脂又は膜に結合している間に生じ得る。

典型的にはＮ末端グルタミン及び／又はグルタミン酸残基のピログルタミン酸への非酵素的変換は、リン酸バッファー等の溶液中で生じ得る。本発明の更なる実施態様において、変換は細胞培地中で行われる。

本発明の更なる実施態様において、変換はリン酸バッファー又は炭酸アンモニウムバッファー等のバッファー中で行われる。

典型的には、Ｎ末端グルタミン及び／又はグルタミン酸残基のピログルタミン酸への変換は、採取され、部分的に精製された後に、５０Ｌを超える細胞培地を保持し得る大規模産生バイオリアクター由来のタンパク質上で実施される。変換は典型的には、静止状態下又は中程度の撹拌を伴う１０ｍｌから１０Ｌの容量で実施され得、本発明の一実施態様において、変換は少なくとも１０ｍｌの容量で行われる。

Ｎ末端グルタミン及び／又はグルタミン酸残基のピログルタミン酸への非酵素的変換に特に好適な培地は、５から１５０ｍＭ、例えば１０から１２５ｍＭ、例えば２５から１００ｍＭのバッファー濃度を含む培地である。バッファーは、塩、例えばＮａＣｌを含んでもよく、５から１５０ｍＭの範囲、例えば１０から１２５ｍＭ、例えば２５から１００ｍＭ、例えば５０から８５ｍＭの濃度を有する。

本発明の更なる実施態様において、Ｎ末端グルタミン及び／又はグルタミン酸残基のピログルタミン酸への非酵素的変換に関するバッファーの濃度は、２０ｍＭから１５０ｍＭの範囲より選択される。本発明の典型的な実施態様において、バッファーの濃度は約９０ｍＭである。

特に好ましいバッファーは、ｐＨ３．５で７５ｍＭのＮａＣｌを含む３５ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ６．２で７５ｍＭのＮａＣｌを含む３５ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ７．０の１００ｍＭのトリス−ＨＣｌバッファー、ｐＨ８．６の１００ｍＭ炭酸アンモニウムバッファー、ｐＨ６．２の３５ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ６．２で７５ｍＭのＮａＣｌを含む３５ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ６．２で５０ｍＭのＮａＣｌを含む６０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ６．２で２５ｍＭのＮａＣｌを含む６０ｍＭのリン酸バッファー、ｐＨ６．２で２５ｍＭのＮａＣｌを含む９０ｍＭリン酸バッファー又はｐＨ６．２で５０ｍＭのＮａＣｌを含む９０ｍＭのリン酸バッファーである。

Ｎ末端グルタミン及び／又はグルタミン酸残基のピログルタミン酸への変換の割合は、選択されたバッファー、変換が生じる温度及び変換の進行が許可される期間に応じて変化し得る。当業者は、分解又は不要な翻訳後修飾を生じることなく最適な変換をもたらす条件を同定することに気付くであろう。多くの場合において、ピログルタミン酸に変換される可能な限り多くのＮ末端グルタミン及び／又はグルタミン酸を得ることは利点となるであろう。

本発明の一実施態様において、Ｎ末端グルタミン及び／又はグルタミン酸のピログルタミン酸への変換は少なくとも５０％に達し、即ちタンパク質中の少なくとも５０％のＮ末端グルタミン及び／又はグルタミン酸がピログルタミン酸である。例えば、タンパク質組成中のピログルタミン酸残基の総数が５０％以上である限り、二のＮ末端グルタミン残基を有するタンパク質又は抗体は、変換後、０、１、又は２のピログルタミン酸を有するタンパク質を含む不均一な組成物をもたらし得る。

本発明の更なる実施態様において、Ｎ末端グルタミン及び／又はグルタミン酸からのピログルタミン酸への変換は、少なくとも５３％、例えば５３％から６８％に達する。

本発明の更なる実施態様において、Ｎ末端グルタミン及び／又はグルタミン酸からのピログルタミン酸への変換は、少なくとも６８％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％に達する。

当業者は、ピログルタミン酸に変換されているＮ末端グルタミン及び／又はグルタミン酸の量を同定し測定することを理解している。それにもかかわらず、ピログルタミン酸形成のレベルを測定するための好適な方法は、Lyubarskaya et al. 2006 (Analytical Biochemistry 348, 24-39)及びDick et al. 2007 (Biotechnology and Bioengineering, Vol. 97, No. 3, June 15, 2007)に記載されている。環化したＮ末端グルタミンの直接的決定もまた、エレクトロスプレーＱ−ＴＯＦ質量分析を使用して最近達成された(Gadgil et al., 2006 J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17: 867‐872)。

上に記載されたように、抗体を精製するためのプロセスは一般的にアフィニティークロマトグラフィー、典型的には後にイオン交換クロマトグラフィー工程が続くプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーに基づいており、プロセスの好適な位置にウイルス減少工程を含む。

本発明の方法の更なる実施態様において、該方法は次の工程を更に含む：好適な樹脂でのプロテインＡ捕獲、陰イオン交換クロマトグラフィー及び陽イオン交換クロマトグラフィー工程の前に、好ましくは陽イオン交換クロマトグラフィー工程の直前に変換の工程が生じる、好適な樹脂での陽イオン交換クロマトグラフィー。

本発明の方法の更なる実施態様において、該方法は次の工程を含む：
（ａ）好適な樹脂でのプロテインＡ捕獲、
（ｂ）低ｐＨでのウイルス不活性化、
（ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィー、
（ｄ）タンパク質のＮ末端グルタミン及び／又はグルタミン酸のピログルタミン酸への変換、
（ｅ）生成物アイソフォームを分離するための好適な樹脂及び勾配溶出での陽イオン交換クロマトグラフィー、
（ｆ）ウイルス濾過、及び
（ｇ）限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）。

本発明の方法の更なる実施態様において、工程（ａ）−（ｇ）はその特定の順序で続く。

本発明の方法の更なる実施態様において、受動冷却の工程は、工程（ｄ）の後、典型的には工程（ｅ）の前に挿入される。

本発明の文脈では、プロテインＡ捕獲工程ａ）は任意の好適なプロテインＡ樹脂フィルター又は培地を使用して実施され得る。プロテインＡは、主にそのＦｃ領域を通じて哺乳動物ＩｇＧに結合する細菌細胞壁タンパク質である。プロテインＡは、天然状態で五つのＩｇＧ結合ドメイン並びに未知の機能のその他のドメインを有する。プロテインＡ樹脂に関するいくつかの商業的供給源がある。当業者は、何が好適なプロテインＡ樹脂フィルター又は培地になり得るか及び修飾されたプロテインＡ樹脂、フィルター又は培地になり得るかを理解している。それにもかかわらず、好適なプロテインＡ樹脂、フィルター又は培地は、限定するものではないが、ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＭａｂＳｅｌｅｃｔ^ＴＭ Ｓｕｒｅ及びＭｉｌｌｉｐｏｒｅのＰｒｏＳｅｐ Ｕｌｔｒａ Ｐｌｕｓ^ＴＭを含む。大量精製に使用され得るＭａｂＳｅｌｅｃｔ^ＴＭでパックされた好適なカラムの非制限的な例は、例えばベッド容量が約６．６Ｌである２０ｃｍ×２１ｃｍカラムであり得る。カラムに関係なく、パックはＭａｂＳｅｌｅｃｔ^ＴＭ又はＰｒｏＳｅｐ Ｕｌｔｒａ Ｐｌｕｓ^ＴＭ等の好適な樹脂を使用してパックされ得る。

本発明の文脈では、プロテインＡ捕獲工程は、典型的には結合／溶出モードで、浄化された採取溶液を、タンパク質を結合する樹脂にロードすることにより実施される。当業者はまた、何がプロテインＡ樹脂又は培地から不純物を除去するための適切な洗浄条件になり得るかを理解している。それにもかかわらず、洗浄バッファーはしばしば２０−１００ｍＭのトリス及び７．０−８．０のｐＨを有する２０から１．０ＭのＮａＣｌを含むバッファーから選択される。好適な溶出バッファーの一例は、約２００ｍＭのアセテート、５０ｍＭのＮａＣｌ及び約３．５のｐＨを含む溶出バッファーであり得る。

タンパク質は、大腸菌及び桿菌等の細菌、サッカロミセス、ピチア、アスペルギルス、フザリウム及びクリュイベロミセス等の酵母、藻類、植物細胞、昆虫細胞並びにＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞、ハイブリドーマ、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓）細胞、骨髄腫細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、ヒトリンパ芽球様細胞及びマウス細胞等の哺乳動物細胞を含む様々な細胞中で発現し得る。抗体等の多くの複合タンパク質は、ＣＨＯ細胞、ＮＳＯ及びＮＳ１細胞等のマウス骨髄腫細胞、又はＰＥＲ．Ｃ６^ＴＭ等のヒト胎児網膜芽細胞においてしばしば発現する。そのような哺乳動物細胞は内因性のレトロウイルス様粒子を含むため、臨床的使用のための目的の哺乳動物細胞ベースのタンパク質産生にレトロウイルス不活性化工程、例えば工程ｂ）が必要とされる。当業者はどのようにレトロウイルス不活性化工程を実行するかを理解している。それにもかかわらず、プロテインＡ捕獲工程からの溶出液のｐＨを低下させることにより、ウイルス不活性化はしばしばプロテインＡ捕獲工程から溶出液上で実行される。したがって、溶出液のｐＨは、５分から２４時間の期間、３．０−４．０の範囲のｐＨ、例えば３．１から４、例えば３．２から４、例えば３．３から４、例えば３．４から４、例えば３．５から４、例えば３．６から４、例えば３．７から４、例えば３．８から４、例えばｐＨ４まで、又は３から３．９、例えば３．１から３．９、例えば３．２から３．９、例えば３．３から３．９、例えば３．４から３．９、例えば３．５から３．９、例えば３．６から３．８、例えば３．６のｐＨまで低下されてもよい。

上で述べられるように、プロテインＡ捕獲工程からの溶出液は、５分間から２４時間、例えば１０分間から２４０分間、例えば２０から９０分間の期間、これらのｐＨ値のいずれかで保たれてもよく、プロテインＡアフィニティ―精製工程は、ｐＨ値の前記低下前及び／又はｐＨの再調整後に濾過されてもよい。低ｐＨウイルス不活性化工程の最後に、製品はその後の処理の必要に応じて中性化され再調整されてもよい。例えば、溶出液のｐＨは７．５から８．５のｐＨに調整されてもよい。

プロテインＡ捕獲工程の後に、イオン交換樹脂を軽く撹拌した試料溶液中に沈めて更にその後液体媒体を交換することによる、特定の流速のカラムモード又はバッチ操作モードで操作される陰イオン交換クロマトグラフィー工程が続いてもよい。しかしながら、好ましい実施態様において、この陰イオン交換クロマトグラフィー工程ｃ）は、フロースルーモードで操作されるクロマトグラフィー工程である。この点において、第一のイオン交換体をロードするためのｐＨ及びイオン強度の好適な条件をどのように定義するかを当業者は理解しており、不活性化ウイルス粒子及びその他不純物が陰イオン樹脂に結合され、したがって抗体溶液から除去される一方、その条件はフロースルー中の抗体の保持をもたらす。

陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂、フィルター又は培地の好適な例は当該技術分野で知られており、アガロースベースの樹脂及びビーズ、デキストランビーズ、ポリスチレンビーズ並びにポリスチレン／ジビニルベンゼン樹脂を含む。好ましくは、陰イオン交換樹脂はＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂ又はＳｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＦＦ）等のアガロースマトリックスに取り付けられた第四級アミンベースの陰イオン交換体である。好ましい陰イオン交換物質であるＡｍｅｒｓｈａｍ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ／ＰｈａｒｍａｃｉａのそのようなＳｅｐｈａｒｏｓｅ Ｑ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑ又はＰａｌｌ Ｍｕｓｔａｎｇ Ｑ．Ａの例は、ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ樹脂である。

本発明による陰イオン交換クロマトグラフィーにおける平衡バッファーは、好ましくは置換剤塩の塩濃度、例えば１から１５０ｍＭ、より好ましくは５から１１０ｍＭ、最も好ましくは２０から１００ｍＭ塩の範囲の塩化ナトリウムを有する。平衡バッファーのｐＨは、好ましくはｐＨ６．５からｐＨ９．０の範囲、より好ましくはｐＨ７．５からｐＨ８．５の範囲、最も好ましくはｐＨ７．９からｐＨ８．２の範囲である。本発明による平衡バッファーは、好ましくは１から１００ｍＭ、より好ましくは５から５０ｍＭ、最も好ましくは１０から３０ｍＭトリスの範囲のトリスを含む。好ましくは、本発明による平衡バッファーの伝導度は、ｐＨ８．０で１０ｍＳ／ｃｍを下回る。

本発明によると、第一の陰イオン交換クロマトグラフィー工程の後には、典型的には非環化Ｎ末端グルタミン及び／又はグルタミン酸残基のピログルタメートへの変換を可能にするピログルタメート変換工程が続く。精製プロセス中のタンパク質のＮ末端グルタミン及び／又はグルタミン酸残基のピログルタミン酸への変換のための好適な条件は上に記載されている。しかしながら、本発明によると変換が約２５℃を超える温度で実施される場合、Ｎ末端グルタミン及び／又はグルタミン酸残基のピログルタメートへの変換は、任意選択的な冷却工程の後に続いてもよい。この冷却工程は、能動冷却工程によって、即ち、例えば水ベースの冷却工程又はフロースルー熱交換体を使用して；又はポンプ及びファンのようなエネルギーを消費する機械的構成要素が温度を下げるために使用されていない受動冷却プロセスによって、実施されてもよい。冷却プロセスは、得られた変換溶液が約１８から３０℃の温度に達するまで継続してもよい。冷却プロセスは、１から１２０時間、例えば１２から９６時間、例えば２４から７２時間、例えば２４から４８時間の範囲の期間で行われてもよい。本発明の好ましい実施態様において、変換は１２から７２時間の受動冷却の工程を含む。

ピログルタメート変換工程の最後に、バッファー条件はその後の処理の必要に応じて調整されてもよい。例えば、変換溶液のｐＨは、酢酸で約ｐＨ５．５に調整されてもよい。

本発明によると、生成物アイソフォームを分離するための好適な樹脂及び勾配溶出での陽イオン交換クロマトグラフィーは、ピログルタメート変換工程の後に続いてもよい。陽イオン交換体の好適な例は、Ｓ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ又はＳＰ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰ（Pharmacia）、ＳＰ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（Sigma）及びＰｏｒｏｓ ＨＳ５０（Applied Biosystems）を含む。好ましい陽イオン交換体は、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＰｏｒｏｓ ＨＳ５０である。

ピログルタメート変換工程からのタンパク質溶液は、酢酸で約ｐＨ５．５のｐＨに調整され、陽イオン交換体にロードされてもよい。好適な洗浄バッファーは、５から５０ｍＭの範囲の酢酸ナトリウム及び５から５０ｍＭの範囲のＮａＣｌを含み、５．０から７．０の範囲のｐＨを有してもよい。結合タンパク質は、数多くの画分への１３のカラム洗浄にわたる１５から１８０ｍＭのＮａＣｌの勾配溶出を使用して溶出されてもよい。溶出後、タンパク質画分は分析され、プールされてもよい。

陽イオン交換クロマトグラフィー工程前に変換を実行することの特に有利な点は、変換種の異なる電荷にある。したがって、Ｎ末端グルタミンがピログルタミン酸に完全に変換されていないタンパク質分子は、よりプラスに帯電している。よって、例えば、抗体の一画分が、ピログルタミン酸に変換された一のＮ末端グルタミン残基、及びピログルタミン酸に変換された二のＮ末端グルタミン残基を含む第二の画分、及びピログルタミン酸に変換された三のＮ末端グルタミン残基を含む第三の画分、及び四全てのＮ末端グルタミン残基がピログルタミン酸に変換された第四の画分を有する、４のＮ末端グルタミン残基を有する抗体は、四つの異なる電荷を有する四つの異なるアイソフォームをもたらすであろう。そのような異なる電荷のアイソフォームは、陽イオン交換クロマトグラフィーにより分離され得、好ましくないアイソフォームが除去され得る。

本発明によると、ウイルス濾過工程は陽イオン交換体工程の後に実施される。ウイルス不活性化は、好適なフィルターの使用を介して達成され得る。本発明のある実施態様は第一の回収段階でそのような濾過を用いるが、他の実施態様においては、精製の最後から二番目又は最終工程のいずれかを含む精製プロセスの他の段階で用いられる。ある実施態様において、代替的なフィルターがウイルス不活性化に用いられ、例えば限定されないが、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ^ＴＭフィルター（Millipore）、Ｚｅｔａ Ｐｌｕｓ ＶＲ^ＴＭフィルター（CUNO）、Ｐｌａｎｏｖａ^ＴＭフィルター（旭化成ファーマ）及びＵｌｔｉｐｏｒ ＤＶ５０ＴＭフィルター（Pall Corporation）がある。好ましいフィルターは、Ｐｌａｎｏｖａ ２０Ｎパルボウイルス評価フィルターである。

ウイルス濾過の後、タンパク質溶液は、濃縮及びバッファー交換のため限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）を受ける。バッファー交換は、３０ｋＤａ分子量カットオフ膜を使用し、最終製剤バッファーの洗浄剤不要バージョンへ透析濾過して、接線流濾過（ＴＦＦ）により実施されてもよい。

本発明の第三の態様は、Ｎ末端ピログルタミン酸を含む医薬製品のためのタンパク質を調製する方法であって、該方法は精製プロセス中にタンパク質のＮ末端グルタミン及び／又はグルタミン酸残基をピログルタミン酸へ変換するための方法を含み、該精製プロセスはＮ末端グルタミン及び／又はグルタミン酸残基の環化を促進させる条件下でタンパク質をインキュベートする工程を含む、方法に関する。

本発明の第四の態様は、ＡＰＩとしてのＮ末端ピログルタミン酸を含む医薬製品のためのタンパク質を調製する方法であって、該方法はＮ末端グルタミン及び／又はグルタミン酸残基を含むタンパク質の精製のための方法を含み、精製のための方法がＮ末端グルタミン及び／又はグルタミン酸残基の環化を促進させる条件下でタンパク質のＮ末端グルタミン及び／又はグルタミン酸残基のＮ末端ピログルタミン酸への変換の工程を含む、方法に関する。

本発明の第一又は第二の態様に関連する上の実施態様のいずれか一つもまた、第三及び第四の態様の実施態様である。

一実施態様において、医薬製品は、典型的にはトラスツズマブ、インフリキシマブ、バシリキシマブ、ダクリズマブ、アダリムマブ、オマリズマブ、ゲムツズマブ、リツキシマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、オファツムバブ、ベルツズマブ又はオクレリズマブ、パニツムマブ、ラニビズマブ、イビリツモマブ、チウキセタン、アビシキシマブ、エクリズマブ、アレムツズマブ、オゾガマイシン、エファリズマブ、パリビズマブ、ナタリズマブ、オマリズマブ及びトシリズマブから選択される抗体を含む。好ましい実施態様において、抗体は抗ＣＤ２０抗体である。

刊行物、特許出願及び特許を含む、本明細中に引用される全ての参考文献は、各参考文献が個別に且つ特に参照により援用されるよう示され、本明細書中に全文が明記されるのと同程度に、参照により本明細書中に援用される。

全ての見出し及び小見出しは、便宜のためのみに使用され、決して本発明を限定するものと解釈されるべきではない。

本明細書中で別途指示がない限り、又は文脈により明確に相反しない限り、考えられる全ての変更における上で説明された要素の任意の組合せは、本発明に包含される。

本発明を記載する文脈中で使用される用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」並びに類似の指示語は、本明細書中で別途指示がない限り、又は文脈により明確に相反しない限り、単数形及び複数形の両方を含むと解釈される。例えば、「ａ」又は「ａｎ」は「一又は複数」を意味する。

本明細書における値域の記述は、本明細書中で別途指示がない限り、範囲内の別々の値に個別に言及する簡潔にした方法として機能することが単に意図され、別々の値は本明細書中に個別に記述されるかのように、本明細書中に包含される。別途指定のない限り、本明細書中で提供される全ての厳密値は、対応するおおよその値の代表である（例えば、特定の要因又は測定値に関して提供された全ての厳密な例示的な値は、必要に応じて「約」で修飾された対応するおおよその測定値を提供するとも考えられ得る）。

本明細書中に記載された全ての方法は、本明細書中に別途指示がない限り、又は文脈により別途明確に相反しない限り、任意の適切な順序で実施され得る。

本明細書中で提供されるいかなる例、又は例示的な言語の使用（例えば「等」）も、単に本発明の理解をより容易にすることを意図され、別途指示がない限り、本発明の範囲を限定するものとはならない。本明細書中のいかなる言語も、同様のことが明記されていない限り、本発明の実行に不可欠な要素を示すものとして解釈されるべきではない。

本明細書中の特許文献の引用及び援用は便宜のためのみになされ、そのような特許文献の正確性、特許性及び／又は権利行使可能性を反映しない。

要素（単数又は複数）に関する用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」「有する」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」又は「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」等を使用した本発明のあらゆる態様又は実施態様の本明細書中の記載は、別途指定のない限り、又は文脈により明確に相反しない限り、その特定の要素（単数又は複数）「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ）」、「から実質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」、又は「を実質的に含む（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」本発明の同様の態様又は実施態様への支持を提供することが意図される（例えば、特定の工程を含むような本明細書に記載される精製方法の変換の方法は、別途指定のない限り、又は文脈により明確に相反しない限り、その工程からなる方法を記載すると理解されるべきである）。

この発明は、適用法により許可される最大限の範囲で、本明細書中で提示される態様又は請求項に記述される対象事項の全ての修正点及び等価物を含む。

本発明は以下の実施例により更に説明されるが、保護の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。前述の記載及び以下の実施例で開示される特徴は、個別に及びその組み合わせの両方で、本発明をその多様な形態で実現するために重要であり得る。

実施例１
リツキシマブモノクローナル抗体（Ｒｉｔｕｘａｎの商標下でも知られる）を発現するＣＨＯ産生細胞株を選択して使用し、ストレートフェッドバッチ発酵プロセスを使用して、撹拌タンク設計を備えた１０Ｌ使い捨てバイオリアクター中でリツキシマブ抗体を産生させた。

リツキシマブは、マウス可変ドメイン並びにヒトＩｇＧ１重鎖及びカッパ軽鎖定常領域を含むキメラ抗体である。リツキシマブの重鎖及び軽鎖の両方は、そのＮ末端にグルタミンを有し（分泌シグナルペプチドの除去後）、重鎖はそのＣ末端にリジンを有する。Ｎ末端グルタミンは細胞酵素及び化学変換の両方によりピログルタミン酸に環化することができ、細胞カルボキシペプチダーゼによるＣ末端リジンクリッピングは非常に一般的である。これらの修飾の両方は、プロテイン上の正電荷の数を減少させ、これらのＮ及びＣ末端修飾の不均一性は、複合陽イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＩＥＸ−ＨＰＬＣ）プロファイルに寄与する（図２に示される）。

浄化した採取試料を初めにＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ樹脂を使用したプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー工程にロードし、結合／溶出モードで実行した。結合リツキシマブ抗体を４．５カラム容積の２００ｍＭのアセテート、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ３．５±０．１で溶出する前に、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅを５カラム容積の２０ｍＭのトリス、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０で洗浄し、続いて２．５カラム容積の２０ｍＭのトリス、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０で洗浄して、低ｐＨで１０５±１５分間常温でのインキュベーションによりウイルス不活性化を施した。

ウイルス不活性化後、０．６Ｍのトリス、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．５を使用して溶液をｐＨ８に中性化し、フロースルーモードで操作されるＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ樹脂を使用した陰イオン交換クロマトグラフィーにより更に精製した。この手順は良好なＤＮＡ及びウイルス排除を提供すると知られている。それまでの経験に基づき、良好なウイルス排除は、伝導度が≦１０ｍＳ／ｃｍである場合、ｐＨ８．０でのＡＥＸ−ＦＴから予想され得る。これは注射用水（ＷＦＩ）での単純希釈だけではなく、プロセス容積の増加そして時間の経過の結果よっても達成され得る。単純２倍希釈が１０ｍＳ／ｃｍ未満の最終ＡＥＸロードを確実にもたらすことを保証するため、プロテインＡ洗浄及び溶出バッファーのＮａＣｌ濃度を半分に低減させることが望ましいとされた。

Ａｇｉｌｅｎｔ高速液体クロマトグラフィー系を使用してＤｉｏｎｅｘ Ｐｒｏｐａｃ ＷＣＸ−１０カラム上で実施される陽イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＩＥＸ−ＨＰＬＣ）により、得られたフロースルー溶液を分析して、図２で示されるように参照ロットＭ８６１８８及び参照ロットＢ６１０９Ｂ０１に指定された市販のリツキシマブ抗体調製物の二つの異なるバッチと比較した。

参照ロットＭ８６１８８及び参照ロットＢ６１０９Ｂ０１の市販のリツキシマブ抗体調製物の両方の質量分析によるペプチドマッピング並びに本明細書中で産生されたＤ８３ ＢＳＲ４リツキシマブ調製物の結果は、ＩＥＸ−ＨＰＬＣアッセイの主ピークは二のＣ末端リジン残基を欠き、環化されたピログルタメートに変換された４の全てのグルタミン残基を有するリツキシマブ分子からなることを示した。その上、ＩＥＸ−ＨＰＬＣ分析は、本明細書中で産生されたＤ８３ ＢＳＲ４リツキシマブ調製物と比較して、市販のリツキシマブ抗体調製物のピーク後の見掛けにおける有意差を明らかにした。

ペプチドマッピング及び質量分析によるリツキシマブのロットの組成物の分析は、市販のリツキシマブと本明細書中で産生されたＤ８３ ＢＳＲ４リツキシマブ調製物との間のピーク後の見掛けにおける差異は、主にＮ末端グルタミンの不完全な環化によるものであったことを明らかにした。

ピーク後のリツキシマブアイソフォームの量を減少させる一つの方法は、後に続く陽イオン交換精製工程中、過剰な遊離Ｎ末端グルタミンと共に生成物を除去及び廃棄することかもしれない。しかしながら、ピーク後のリツキシマブアイソフォームはＤ８３ ＢＳＲ４等の調製物中全リツキシマブアイソフォームの５０％までを占めるため、収量はおよそ半分低下する。

したがって、リツキシマブ主ピークアイソフォームの収量を改善するために、後に続く実験を実施し、操作的に妥当な温度で陰イオン交換溶液のグルタミン環化を促進させる最適条件を同定した。

実施例２
第一の試験条件は、陰イオン交換フロースルー溶液（ＡＥＸ ＦＴ）又は後に続く陽イオン交換ローディング溶液（ＣＥＸロード）のいずれかが常温又は３７℃でグルタミン環化を促進させるかどうかを単に決定することであった。

陰イオン交換フロースルー工程の最後に試料を採取し（ｐＨ８）、陽イオン交換ロードのための調製を実施した後（ｐＨ５．５）、時点に関して複製チューブにアリコートし、常温又は３７℃のいずれかで保持した。１３日間にわたり周期的に、各条件から一つのチューブを−７０℃の冷凍庫に移し、経時変化の最後に全ての試料を解凍してＩＥＸ−ＨＰＬＣで分析した（図３）。（常温での保持のためにＣＥＸロードの少数のアリコートを作製した。）

図３に示されるように、リツキシマブＡＥＸ ＦＴ溶液を常温又は３７℃でインキュベートした場合、リツキシマブピーク後アイソフォームの主ピークアイソフォームへの変換は観察されなかった。反対に、リツキシマブ抗体をＣＥＸ−ロード溶液中でインキュベートした場合、リツキシマブピーク後アイソフォームは、常温及び３７℃でのインキュベートの場合の両方で、主ピークアイソフォームに変換されることが発見された。しかしながら、ピーク後の合計パーセントが８日間のインキュベーション後〜１０％減少したように、常温及び３７℃の両方での変換速度はやや遅いことが発見され、これは主ピークに変換されるピーク後の出発量の〜２０％に相当した。

実施例３
本明細書中で観察されるよりも速い変換速度が、ｐＨ６．２での３５ｍＭのリン酸バッファーの存在下、Dick et al.（2007, Biotechnol, Bioeng. v97 p544）により報告されている。したがって、新たな実験を実施して、常温、３７℃及び４５℃での変換の動態及びタンパク質濃度が有し得る変換速度に対する影響を調査した。

製造プロセスで実行するための最も操作的に簡潔な手法として、濃縮された貯蔵溶液からリツキシマブＡＥＸ ＦＴ溶液をリン酸ナトリウムで３５ｍＭにスパイクし、酢酸でｐＨ６．２５に滴定した。

リツキシマブＡＥＸ ＦＴリン酸ナトリウム溶液を３アリコートに分け、一つは１．８５ｍｇ／ｍＬタンパク質の濃度で未変化のままにし、他の二つはおよそ３．７と９．２５ｍｇ／ｍＬになるよう、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ３０ｋＤａ ＭＷＣＯスピン濃縮器を使用して、２倍（中間パネル）及び５倍（右パネル）に濃縮した。各試料を０．２μｍシリンジフィルターで濾過滅菌し、個別の時点に関してエッペンドルフ型チューブにサブアリコートした。いくつかの複製アリコートを常温（１）、３７℃（２）、及び４５℃（３）で３日間まで保持した（図４）。示された時点で、各条件からの一つのチューブを２−８℃に移し、実験の最後に全ての試料を同じアッセイで共に分析した。各パネルは、各インキュベーション条件に関する経時変化にわたるＩＥＸ−ＨＰＬＣピーク前、主ピーク及びピーク後の割合を示す。比較のため、市販のリツキシマブ参照基準に関するピーク前、主ピーク及びピーク後の割合を各列の最初のグラフに示した。

結果は、ピログルタミン酸変換は各条件でピーク前形成よりも常に高速であったが、ピログルタミン酸変換及びピーク前形成の両方の速度はより高温で明確に増加したことを示した（図４）。４５℃では、主ピーク％は第一日目までに６０−７０％の最大値に達し、ピーク前形成が更なるピーク後変換を上回るにつれて下降し始めた。３７℃では、変換はより遅く、第３日目までに同一の最大主ピーク％に達した。いくつかの変換が常温で明白であるのに対し、常温での変換速度は３７℃で観察されたものの半分未満であった。いかなる温度でもタンパク質濃度の明らかな影響は観察されなかった。

実施例４
次いで、後に続く陽イオン交換ＰＯＲＯＳ ＨＳ５０カラム上へのローディングをより助長するであろう、様々なｐＨ及び希釈要因（即ち［ＮａＣｌ］の低下）を含むホスフェート濃度（３０、６０、９０ｍＭ）の影響を評価した。

リツキシマブＡＥＸ−ＦＴ溶液（Ｄ８３）を５０ｍＭのＮａＣｌ（〜５０ｍＭのＮａＣｌ最終になる−上部パネル）又は注射用水（ＷＦＩ）（〜２５ｍＭのＮａＣｌ最終になる−下部パネル）のいずれかで２倍に希釈し、濃縮したストックからリン酸ナトリウムでスパイクして、３０、６０、又は９０ｍＭのいずれかの最終溶液を調製し、酢酸でｐＨ６．２又はｐＨ５．８のいずれかに滴定した。これらの溶液を３７℃で２日間インキュベートし、実施例３にあるようにＩＥＸ−ＨＰＬＣで分析した。比較のため、同一の市販のリツキシマブ参照基準及びコントロールＤ８３ Ｔ＝０試料を各グラフに示す。

結果は、３７℃での２日間のインキュベーション後に、より高濃度のホスフェートがピーク後にはわずかに大きな減少をもたらし、主ピークにはより高い増加をもたらしたことを示した（図５）。同様に、ｐＨ６．２はｐＨ５．８よりもわずかに改善した変換を促進させた。２５ｍＭのＮａＣｌを使用したことと５０ｍＭのＮａＣｌを使用したこととの間に明らかな差異は見られなかった。

この時点で全ての実験は小型チューブ中静止状態で実施したが、実験を大規模製造に適するように、撹拌した振盪フラスコモデル中で繰り返し、３７℃で３日間にわたる均一の温度を保証するよう、インペラーでの混合を実施した。これらの結果は、変換動態から以外のより小さな静止モデルで得られた前回観測が、振盪フラスコモデル中９０ｍＭホスフェートでわずかに速かったことを裏付けた。

実施例５
ナノ濾過及び全ての微生物抑制対策を含むフルスケール完全プロセス製造実施を、５００Ｌバイオリアクターを使用して実施し、実施例１に記載されるように本質的に精製した。リツキシマブ抗体を３７℃でおよそ２８時間インキュベートした後、４８時間かけて徐々に室温に冷却した。得られたリツキシマブ溶液を陽イオン交換クロマトグラフィーＰＯＲＯＳ ＨＳ樹脂上にロードし、４カラム容積の１５ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭの酢酸Ｎａ、ｐＨ５．５及び５．５カラム容積の１５ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのリン酸Ｎａ、ｐＨ６．５で洗浄した。一画分につき０．５カラム容積の分取での１３カラム容積にわたる１５から１８０ｍＭのＮａＣｌの直線勾配を使用して、リツキシマブ抗体を溶出した。以下の表１は、画分１から９の総タンパク質含有量と、個別の画分及びプールされた画分１から６並びにリツキシマブ参照に指定されている市販のリツキシマブ調製物に関するＩＥＸ−ＨＰＬＣアッセイとを示す。

表１からわかるように、プールされた画分１から６は、全体的に溶出したタンパク質、即ちリツキシマブの９６％に相当し、ピーク前、主ピーク及びピーク後％（１６．３；６３．０；２０．７）は市販のリツキシマブ調製物（２０．２；６６．５；１３：４）とかなり類似している。言い換えれば、プールされた画分１から６のリツキシマブアイソフォーム組成物は、市販のリツキシマブ調製物に酷似している。

これは、ピーク後リツキシマブアイソフォームの量が総リツキシマブアイソフォームの５０％までを占める実験１の結果とは大きく異なる。

結論
実施例１から５に示されるように、製造規模でのＮ末端グルタミン又はグルタミン酸残基のピログルタミン酸への変換のためのロバストでより再現性のある手順が開発されてきた。プロセスはバッチ間の変動を減少させ、イオンプロファイルに関して市販の製品と同様の製品を作製するよう設計されている。

プロセスは、未環化のＮ末端グルタミン残基を含むタンパク質を含有する陰イオン交換フロースルー溶液を、精製手順中の未環化のＮ末端グルタミン残基のピログルタミン酸への非酵素的変換のための、約６．２のｐＨを有する最適量のホスフェート及びＮａＣｌを含有する組成物に容易且つ迅速に移動させるために、最適化されている。

参考文献
Yu et al., 2006. Investigation of N-terminal glutamate cyclization of recombinant monoclonal antibody in formulation development. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 42, 455‐463.

Chelius et al., 2006 Formation of Pyroglutamic Acid from N-Terminal Glutamic Acid in Immunoglobulin Gamma Antibodies. Anal. Chem. 78, 2370‐2376.

Dick et al., 2007. Determination of the Origin of the N-Terminal Pyro-Glutamate Variation in Monoclonal Antibodies Using Model Peptides. Biotechnology and Bioengineering, Vol. 97, No. 3, June 15, 544‐553.

Needleman and Wunsch 1970. Needleman-Wunsch Algorithm for Sequence Similarity Searches. J. Mol. Biol. 48: 443‐453.

Rice et al., 2000. EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite Trends Genet. 16: 276‐277.

Lyubarskaya et al. 2006. Analysis of recombinant monoclonal antibody isoforms by electrospray ionization mass spectrometry as a strategy for streamlining characterization of recombinant monoclonal antibody charge heterogeneity (Analytical Biochemistry 348, 24‐39.

Gadgil et al., 2006: Improving mass accuracy of high performance liquid chromatography/electrospray ionization time-of-flight mass spectrometry of intact antibodies. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17: 867‐872.

Chadd and Chamow 2001. Therapeutic antibody expression technology. Curr. Opin. Biotechnol., 12:188‐194.

Kumar and Bachhawat 2012. Pyroglutamic acid: throwing light on a lightly studied metabolite. Current Science, Vol. 102, No. 2, 25, 288‐297.

Claims (15)

1. Ｎ末端グルタミン及び／又はＮ末端グルタミン酸を含むタンパク質の精製のための方法であって、前記タンパク質のＮ末端グルタミン及び／又はＮ末端グルタミン酸のＮ末端ピログルタミン酸への環化を促進させる条件下で、前記タンパク質をインキュベートする工程を含む、方法。
2. タンパク質が抗体である、請求項１に記載の方法。
3. タンパク質が抗ＣＤ２０抗体である、請求項１又は２に記載の方法。
4. 抗ＣＤ２０抗体が配列番号１と同一の軽鎖配列及び配列番号２と同一の重鎖配列を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
5. 変換が２０から４５℃の温度で生じる、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
6. 変換が細胞培地中又はバッファー中で行われる、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
7. バッファーの濃度が２０ｍＭから１５０ｍＭの範囲より選択される、請求項６に記載の方法。
8. ｐＨが３．５から９．０の範囲である、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
9. Ｎ末端グルタミン及び／又はグルタミン酸からのピログルタミン酸への変換が少なくとも５０％に達する、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
10. 変換工程がＮ末端グルタミン及び／又はグルタミン酸のピログルタミン酸への非酵素的変換を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
11. タンパク質が、変換前に１から４のＮ末端グルタミン残基及び／又は１から４のＮ末端グルタミン酸残基を有する、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 好適な樹脂でのプロテインＡクロマトグラフィー及び好適な樹脂でのイオン交換クロマトグラフィーの工程を更に含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
13. （ａ）好適な樹脂でのプロテインＡ捕獲、
    （ｂ）３．０から４．０の範囲のｐＨでのウイルス不活性化、
    （ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィー、
    （ｄ）タンパク質のＮ末端グルタミン及び／又はグルタミン酸のピログルタミン酸への変換、
    （ｅ）生成物アイソフォームを分離するための好適な樹脂及び勾配溶出での陽イオン交換クロマトグラフィー、
    （ｆ）ウイルス濾過、及び
    （ｇ）限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）
    の工程を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 工程（ｄ）の後に１２から７２時間の受動冷却の工程を含む、請求項１３に記載の方法。
15. 医薬製品のための医薬品有効成分としてＮ末端ピログルタミン酸を有するタンパク質を調製する方法であって、請求項１から１４のいずれか一項に記載の精製方法を含む、方法。

Images