CN105121469A - 用于增加蛋白质的焦谷氨酸形成的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于在纯化过程内将蛋白质的N-端谷酰胺和/或谷氨酸残基转化成焦谷氨酸的方法。

Description

用于增加蛋白质的焦谷氨酸形成的方法
技术领域
本发明涉及用于在纯化过程内将蛋白质的N-端谷酰胺和/或谷氨酸残基转化成焦谷氨酸的方法。此外，本发明还涉及用于纯化含有N-端焦谷氨酸的蛋白质的方法。本发明的方法可以包括在用于制备具有N-端焦谷氨酸的蛋白质，具体来说用于制备用于药学产物的活性药学成分(API)的制造过程中。
背景技术
大部分重组型治疗蛋白质显示一种或多种转译后修饰。这些修饰可在其核糖体合成期间或(更通常)在合成完成之后出现。迄今已表征许多转译后修饰，并且这些修饰可赋予所影响的蛋白质一些结构方面或功能性作用。与治疗蛋白质相关联的常见转译后修饰包括羧基化和羟基化、酰胺化和硫酸化、双硫键形成和蛋白水解处理，以及糖基化、异构化、氧化、环化(N-端谷酰胺或谷氨酸转化成焦谷氨酸)、片段化和聚集作用。因此，转译后修饰可由蛋白质的酶促修饰或由非酶促转化引起，并且转译后修饰可在细胞培养期间或在蛋白质的纯化或储存期间在表达宿主内部出现。
重组型单克隆抗体对生物技术行业具有巨大价值并且许多抗体已批准用于治疗多种疾病。由于抗体通常在哺乳动物细胞(如CHO细胞)中产生，其可具有许多不同的转译后修饰，从而引起产物的不均匀性。不均匀性可由抗体的表面电荷的变化引起，由带电残基的数目的变化直接引起，或由改变表面电荷分布的化学或生理变化(如糖基化、重链的C-端赖氨酸的羧基肽酶截割和N-端谷酰胺或谷氨酸残基环化成焦谷氨酸)间接引起。
抗体典型地由基本结构单元组成，每个基本结构单元具有通过二硫桥键和非共价相互作用接合的两个大型重链和两个小型轻链。存在若干不同类型的抗体重链和若干不同类型的抗体，该等抗体基于其所具有之重链而分组成不同的同型。举例来说，视重链恒定区的基因而定，存在四种人类IgG的同型(1到4)。轻链恒定结构域由两种基因(κ或λ)编码。因此，每个IgG同型可以是κ或λ，例如IgG1κ。尽管不同类型的细胞系中产生若干类型的抗体，但最有临床价值的抗体是IgG1或IgG2型全长抗体。
许多人类IgG1或IgG2型抗体在轻链或重链或其两者的N-端含有谷氨酸(Glu)和/或谷酰胺(Gln)残基。大部分轻链基因编码谷氨酸或谷酰胺。这类N-端谷氨酸和/或谷酰胺残基可经历环化以形成焦谷氨酸(pGlu)，如图1所示。因此，焦谷氨酸形成在几乎所有的有临床价值的抗体中发生并且过程的不同完整性程度成为不均匀性的常见原因。这种不均匀性在治疗抗体中不符合需要，因为这些变化可通过改变带电基团的数目直接地或通过引入结构变化间接地改变抗体的表面电荷特性。这类修饰具有降低生物活性以及改变药物动力学和抗原性的潜力。
在谷酰胺的环化期间，N-端伯胺(在中性pH值下带正电)转化成中性酰胺，引起抗体的净电荷变化。所述反应伴随有氨损失(17Da)。因此，环化不足可由阳离子交换色谱检测为碱性变异体，因为主峰通常是完全环化的物质，或由反相HPLC检测为较晚洗脱的峰，因为在N-端胺损失之后疏水性增加。
谷氨酸的环化通过侧链的羧基和N-端胺发生，因此形成中性酰胺并且释放水(18Da)。净电荷保持相同，因为一个酸性基团和一个碱性基团在反应中缩合，然而，损失两个带电残基可增加分子的疏水性，使得可通过反相HPLC检测。
尚未完全理解抗体中的焦谷氨酸形成机制。环化可自发地发生或其可由酶谷酰胺酰基环化酶辅助。仍然不清楚谷酰胺酰基环化酶在最通常用于抗体制备的CHO细胞系中是否是活性；然而，自发环化的比率表明反应可能是非酶促型的。
举例来说，Yu等人(药学和生物医学分析杂志(JournalofPharmaceuticalandBiomedicalAnalysis)2006；42:455-463)历时3个月的时间段研究单克隆抗体的轻链和重链的N-端处由谷氨酸(Glu或E)进行的非酶促焦谷氨酸形成。Yu等人陈述，视过程发展期间的pH值和温度条件而定，mAb的Glu到pGlu的这一非酶促环化可能是mAb制备和储存中发生的主要分解途径中的一种。其得出尚不清楚这类焦谷氨酸是否可引起其它修饰和改变mAb生物活性或治疗效能的结论，并且其提出密切监测N-端pGlu形成，因为其对于确保具有N-端Glu的mAb疗法的品质来说是重要的。
Chelius等人(分析化学(Anal.Chem.)2006,78,2370-2376)还研究若干单克隆抗体的轻链和重链的N-端处由谷氨酸进行的非酶促焦谷氨酸形成，并且发现这一非酶促反应确实极频繁发生且可在37℃和45℃下温育数周之后检测到。在若干具有不同pH值的水性缓冲液中测量这一反应的比率，在pH6.2下显示最低程度的焦谷氨酸形成并且在pH4和pH8下显示增加的焦谷氨酸形成。
考虑到谷酰胺(Gln或Q)转化成焦谷氨酸，Dick等人(生物技术和生物工程(BiotechnologyandBioengineering),第97卷,第3号,2007年6月15日)证实，重组型单克隆抗体的N-端谷酰胺的这类环化自发地发生并且得出以下结论：许多最终容器单克隆抗体中所观测到的几乎完全转化最可能由生物反应器温育和纯化条件与生物反应器中发生的大部分修饰的组合引起。这一研究证明，许多重组型抗体中通常观测到的焦谷酰胺变异体是在生物反应器内部产生，其中纯化过程仅具有小贡献，并且由高温和溶剂组合物促进。具体来说，在37℃下并且在具有75mMNaCl的35mM磷酸盐缓冲液(pH6.2)中发现较高转化率。
因此，如N-端谷酰胺或谷氨酸残基环化成焦谷氨酸的转译后修饰引起所表达的蛋白质的不均匀性，所述不均匀性可由于制备和纯化条件的微小差异而在各批次之间不同。因此，制备生物类似蛋白质的更困难挑战中的一项是匹配创新产物的不均匀性。因此，需要具有分析支持的更稳定并且可重复的工业大规模纯化工艺以满足药学蛋白质(如抗体)的严格的纯度要求。
发明内容
本发明的第一方面涉及用于在纯化过程内将蛋白质的N-端谷酰胺和/或谷氨酸残基转化成焦谷氨酸的方法，其包含在促进N-端谷酰胺和/或谷氨酸残基环化的条件下温育蛋白质的步骤。
本发明的第二方面涉及用于纯化含有N-端谷酰胺和/或谷氨酸残基的蛋白质的方法，所述方法包含将所述蛋白质的N-端谷酰胺和/或谷氨酸残基转化成N-端焦谷氨酸的步骤。这类转化是在促进N-端谷酰胺和/或谷氨酸残基环化的条件下进行。
本发明的第三方面涉及制备作为药学产物的API具有N-端焦谷氨酸的蛋白质的方法，所述方法包含如第一或第二方面以及其实施方式中的任一个的纯化方法。
本发明的一个目标是提供制备具有提高或受控制的N-端焦谷氨酸含量的蛋白质以便降低或获得所需产物不均匀性的替代性方法。
本发明人发现通过在具有N-端谷酰胺和/或谷氨酸残基的蛋白质(具体来说，单克隆抗体)的纯化过程期间引入将N-端谷酰胺和/或谷氨酸残基温育/转化成焦谷氨酸的步骤，可控制不均匀性程度达到所需程度。
在阅读本发明的说明书、附图和权利要求后，本发明的其它目标将变得显而易见。
定义：
如本文所使用的术语“标识”是指两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性并且由参数“序列同一性”描述。出于本发明的目的，两个氨基酸序列之间的序列同一性的程度使用尼德曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(尼德曼和翁施,1970,分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)测定，如在EMBOSS包的尼德尔(Needle)程序(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件包(TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite),莱斯(Rice)等人,2000,《遗传学趋势》(TrendsGenet.)16:276-277)，优选地3.0.0版或更高版本中所实施。所使用的任选参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。使用尼德尔标记的“最长标识”的输出(使用非简化选项获得)作为同一性百分比并且计算如下：(相同残基×100)/(对准长度-对准中的间隙总数)。
如本文所使用的术语“N-端”、“N-末端”或“氨基端”是指蛋白质或多肽的末端部分中的自由氨基(-NH2)。书写蛋白质或多肽序列的常见方式是将N-端放在左侧并且从N端到C-端书写序列。当蛋白质或多肽由信使RNA转译时，其以从N端到C-端的顺序产生。
如本文所使用的术语“谷酰胺”、“2-氨基-4-氨基甲酰基丁酸”、“Gln”或“Q”是由标准遗传密码编码的20种氨基酸中的一种。其侧链是通过用酰胺官能团置换谷氨酸的侧链羧基而形成的酰胺。因此，其可视为谷氨酸的酰胺。
如本文所使用的术语“谷氨酸”、“2-氨基戊二酸”、“Glu”或“E”是由标准遗传密码编码的20种氨基酸中的一种。在生理pH值下，侧链羧酸官能团以其带负电去质子化羧酸盐形式存在。
如本文所使用术语“多肽”是指通过肽键连接的氨基酸单体的线性单链。已并入多肽中的氨基酸称为“残基”；每个多肽在多肽的各别末端具有一个N-端残基和一个C-端残基。如本文所使用的多肽是更长的肽，其包含超过约20个连续氨基酸。
如本文所使用术语“蛋白质”是指由一个或多个典型地折叠成球形或纤维形形式(促进生物功能)的多肽组成的生物化学化合物。蛋白质可由除肽键以外的键连接，例如这类组成蛋白质的多肽可由二硫键连接。如本文所使用的术语“蛋白质”意图涵盖抗体、蛋白质和抗体的片段、蛋白质和抗体的裂解形式等，其大于约20个连续氨基酸残基。此外，如本文所使用的蛋白质意图涵盖天然存在的多肽和以重组方式产生的多肽。
如本文所使用的术语“焦谷氨酸”、“5-侧氧基脯氨酸”、“氧脯氨酸”或“焦谷氨酸”大体上是指不常见的氨基酸衍生物，其中谷氨酸或谷酰胺的自由氨基环化以形成内酰胺。其可见于许多蛋白质(例如噬菌调理素、纤维蛋白、血纤维蛋白原)、神经元肽以及激素(例如神经调压素、胃泌素、爱帕琳(Apelin)和食欲素A(OrexinA))抗体(例如英利昔单抗(Infliximab)、西妥昔单抗(Cetuximab)、利妥昔单抗(Rituximab)、曲妥珠单抗(Trastuzumab)、贝伐单抗(Bevacizumab)、帕尼单抗(Panitumumab)、阿达木单抗(Adalimumab)、兰比珠单抗(Ranibizumab))中。N-端谷酰胺和谷氨酸残基可自发地环化以变成焦谷氨酸。这是被阻断的N-端的若干形式中的一种，存在关于使用爱德曼化学方法(Edmanchemistry)进行N-端定序的一个问题，其需要焦谷氨酸中不存在的自由伯氨基。酶焦谷氨酸胺基肽酶可通过从焦谷氨酸残基裂解来恢复自由N-端。
如本文中所使用，“纯化过程”是指意图从复杂混合物分离蛋白质的一个过程或一系列过程。蛋白质可由一种或多种同种型(即呈现不均匀性)组成。术语“纯化过程”涵盖(但不限于)蛋白质和抗体纯化。起始物质通常是细胞培养物(例如哺乳动物细胞培养物、酵母培养物或微生物培养物)并且纯化过程中的不同步骤可从限制蛋白质的基质释放蛋白质，分离混合物中的蛋白质与非蛋白质部分，并且最终从所有其它蛋白质分离出所需蛋白质。在蛋白质是抗体的情况下，典型分离包含蛋白质A亲和色谱、阳离子交换色谱、阴离子交换色谱、疏水性相互相用和/或羟基磷灰石色谱。
如本文所使用的术语“抗体”是指免疫球蛋白分子，其包含四个蛋白质链，通过二硫键互连的两个重(H)链和两个轻(L)链。每个重链包含重链可变区(本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区(CH)。重链恒定区包含三个结构域：CH1、CH2和CH3。每个轻链包含轻链可变区和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域CL。VH和VL区可进一步再分为与更保守的区(称为构架区(FR))交替的高变区(称为互补决定区(CDR))。每个VH及VL由自氨基端到羧基端按以下顺序配置的三个CDR及四个FR组成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。抗体包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、其Fab和单链Fv(scFv)片段、双特异性抗体、异结合物、人类和人类化抗体。这类抗体可以多种方式产生，包括杂交瘤培养基、在细菌或哺乳动物细胞培养物中重组表达和在转基因动物中重组表达。抗体也可以通过从显示系统(如丝状噬菌体、细菌、酵母或核糖体)中表达的序列文库选择序列来产生。文献中存在大量关于选择特定制备方法的指导，例如Chadd和Chamow,现代生物技术观点(Curr.Opin.Biotechnol.),12:188-194(2001)。制造方法的选择取决于若干因素，包括所需抗体结构、碳水化合物部分对抗体的重要性、易于培养和纯化以及成本。可使用标准表达技术产生许多不同抗体结构，包括全长抗体、抗体片段，如Fab和Fv片段，以及包含来自不同物种的组分的嵌合抗体。
如本文所使用的术语“药学产物”意指包含适用于投予哺乳动物(如人类个体)的活性药学成分的剂型，所述剂型可含有适合的载剂和/或赋形剂并且用于临床试验或授权获准在国家、地区、或国际上销售。包含通过本发明的方法中的任一种制备的蛋白质(例如蛋白质或抗体)的药学产物可通过常规技术制备，例如雷明顿：药学科学和实践(Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy)1995,E.W.马丁(E.W.Martin)编辑,马克出版公司(MackPublishingCompany),第19版，伊斯顿(Easton),宾夕法尼亚州(Pa)中所描述。药学产物可呈现常规形式，例如胶囊、片剂、冻干饼状物或粉末、气雾剂、溶液、悬浮液或局部施用物，具体来说呈注射剂形式，如皮下或静脉内注射剂。药学产物可见于多种药学上可接受的调配物中并且可与一种或多种生理学上可接受的载剂组合。所使用的药学载剂或稀释剂可以是常规固体或液体载剂或稀释剂。固体载剂的实例是乳糖、白土(terraalba)、蔗糖、环糊精、滑石、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸镁、硬脂酸或纤维素的低碳烷基醚。液体载剂的实例是糖浆、花生油、橄榄油、磷脂、固醇、脂肪酸、脂肪酸胺、聚氧乙烯、等渗缓冲溶液、水和无菌生理食盐水溶液。
附图说明
图1：本图展示在N-端谷酰胺和N-端谷氨酸的环化期间，焦谷氨酸形成机制的示意性图示。
图2：本图展示两种市售利妥昔单抗批料(参考批号M86188和参考批号B6109B01)以及本文中制备的D83BSR4利妥昔单抗制剂的阳离子交换高效液相色谱(IEX-HPLC)曲线，色谱曲线中说明前峰、主峰和后峰。发现主峰由不含两个C-端赖氨酸残基并且所有4个谷酰胺残基皆转化成焦谷氨酸的利妥昔单抗分子组成。发现市售利妥昔单抗抗体制剂相比于本文中制备的D83BSR4利妥昔单抗制剂的后峰外观的显著差异主要由N-端谷酰胺残基的不完全环化引起。
图3：本图展示四条表示不同温度下AEX(阴离子交换)和CEX(阳离子交换)中的总峰面积与温育时间之间的关系的曲线。上部曲线对应于环境温度或室温温育并且下部曲线对应于37℃温育。FT对应于色谱的流通。
图4：本图展示在添加磷酸钠达到35mM并且滴定到pH6.25的溶液中，在环境温度下(上图)、在37℃下(中间图)和在45℃下(下图)，在低蛋白质浓度下(1.85mg/mL；左图)、在中等蛋白质浓度下(3.7mg/mL；中间图)和在高蛋白质浓度下(9.25mg/mL；右图)，利妥昔单抗后峰同种型转化成主峰同种型的动力学。
图5：本图展示在pH5.8和6.2下，不同磷酸盐浓度(30、60和90mM)、氯化钠浓度(50和25mM)对利妥昔单抗后峰同种型转化成主峰值同种型的动力学的影响。
发明详述
本发明人发现，通过在具有N-端谷酰胺和/或谷氨酸残基的纯化过程期间引入将N-端谷酰胺和/或谷氨酸残基温育/转化成焦谷氨酸的步骤，可控制不均匀性程度，如降低到所需程度并且同时增加所需蛋白质的产率。
蛋白质的N-端谷酰胺和谷氨酸可经历形成焦谷氨酸的环化，如图1所示。在谷酰胺的环化期间，N-端伯胺(在中性pH值下带正电)转化成中性酰胺，引起蛋白质的净电荷变化。反应伴随有氨损失(17Da)并且因此，可通过阳离子交换色谱以碱性变异体形式检测环化的不足，因为通过反相HPLC发现，由于在N-端胺损失之后疏水性提高，主峰通常是完全环化物质或较晚洗脱的峰。
谷氨酸的环化通过侧链的羧基和N-端胺发生，因此形成中性酰胺并且释放水(18Da)。净电荷保持相同，因为一个酸性基团和一个碱性基团在反应中缩合，然而，损失两个带电残基可增加分子的疏水性，使得可通过反相HPLC检测。
因为许多人类抗体在其N-端含有谷氨酸和/或谷酰胺残基，因此焦谷氨酸形成可在许多有临床价值的抗体的制备期间产生并且极通常引起所表达抗体的不均匀性，其可由于制备和纯化条件的微小差异而在各批次之间不同。相同情况也适用于蛋白质，包括多肽，因为这是大规模(如工业规模)蛋白质制备中的显著问题。
在第一方面中，本发明涉及在纯化过程内将蛋白质的N-端谷酰胺和/或谷氨酸残基转化成焦谷氨酸的方法，其包含在促进N-端谷酰胺和/或谷氨酸残基的环化的条件下温育蛋白质的步骤。
在第二方面中，本发明涉及纯化含有N-端谷酰胺和/或谷氨酸残基的蛋白质的方法，所述方法包含将所述蛋白质的N-端谷酰胺和/或谷氨酸残基转化成N-端焦谷氨酸的步骤。这类转化是在促进N-端谷酰胺和/或谷氨酸残基环化的条件下进行。
如本文所使用，纯化过程可根据本领域中已知的方法进行并且将视特定蛋白质而变化。蛋白质纯化方案以待纯化蛋白质与非所需蛋白质污染物之间的尺寸、电荷和可溶性的分子特性的差异为基础。基于这些参数的方案包括尺寸排阻色谱、离子交换色谱、差示沉淀等。
用于纯化抗体的方法通常基于用于捕获的亲和色谱，通常是蛋白质A亲和色谱。蛋白质A亲和色谱是指使用蛋白质A的物质和/或粒子的分离或纯化，其中蛋白质A通常固定在固相上。蛋白质A亲和色谱过程之后通常进行离子交换和/或疏水性相互作用和/或混合模式色谱步骤。这类方法通常还包括至少两个病毒减少步骤，典型地通过来自亲和步骤的洗提物中的低pH值降低并且由过程的适合位置中的病毒过滤器实施。在抗体纯化过程期间移除的杂质包括半抗体、抗体片段、二聚体和集聚物、DNA、病毒、HCP(宿主细胞蛋白)、蛋白质A漏出物、内毒素和其它相关杂质。
在本发明的实施方式中，蛋白质选自酶、激素或抗体。蛋白质的适合实例包括任何含有一个或多个N-端谷酰胺和/或谷氨酸残基的蛋白质，包括噬菌调理素、血纤维蛋白原、胶原蛋白、激肽、神经调压素、胃泌素、爱帕琳和食欲素A、抗体或抗体片段。抗体的实例包括(但不限于)曲妥珠单抗、英利昔单抗、巴利昔单抗(Basiliximab)、达利珠单抗(Daclizumab)、阿达木单抗、奥马珠单抗(Omalizumab)、吉妥单抗(gemtuzumab)、利妥昔单抗、贝伐单抗、西妥昔单抗、奥伐木单抗(Ofatumumab)、维妥珠单抗(Veltuzumabor)、奥克珠单抗(Ocrelizumab)、帕尼单抗、兰比珠单抗、异贝莫单抗(Ibritumomab)、泰泽坦(Tiuxetan)、阿昔单抗(Abciximab)、艾库组单抗(Eculizumabe)、阿仑单抗(Alemtuzumab)、奥唑米星(Ozogamicin)、依法利珠单抗(Efalizumab)、帕利珠单抗(Palivizumab)、那他珠单抗(Natalizumab)、奥马珠单抗(Omalizumab)和托西利单抗(Tocilizumab)。
在本发明的另一个实施方式中，抗体是具有SEQIDNO:3的轻链序列和重链序列SEQIDNO:4的曲妥珠单抗和具有SEQIDNO:5的轻链序列和重链序列SEQIDNO:6的贝伐单抗。
在本发明的另一个实施方式中，抗体是抗-CD20单克隆抗体。抗-CD20抗体的适合实例包括利妥昔单抗、奥伐木单抗、维托珠单抗或奥克珠单抗。
在本发明的优选实施方式中，抗体是与利妥昔单抗相同的序列，如利妥昔单抗。
在另一实施方式中，蛋白质包含与利妥昔单抗的轻链和重链序列，即分别与SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的序列相同的序列。
在本发明的另一实施方式中，蛋白质包含与SEQIDNO:1具有至少90％同一性，如95％、97％、98％、99％同一性和与SEQIDNO:2具有至少90％同一性，如95％、97％、98％、99％同一性的序列。
在本发明的另一实施方式中，蛋白质在转化之前具有1到4个N-端谷酰胺和/或1到4个N-端谷氨酸残基。因此，如果蛋白质是单链蛋白质，其可含有一个N-端谷酰胺残基或一个N-端谷氨酸残基。然而，如果蛋白质由超过一个亚基组成，那么其可含有一个N-端谷酰胺残基和一个N-端谷氨酸残基或两个N-端谷酰胺残基或两个N-端谷氨酸残基。如上文所解释，抗体包含四个多肽链(即亚基)，通过二硫键互连的两个重(H)链和两个轻(L)链。每个重链序列可编码一个N-端谷酰胺残基或一个N-端谷氨酸残基。类似地，每个轻链序列可编码一个N-端谷酰胺残基或一个N-端谷氨酸残基。因此，在其它实施方式中，蛋白质是具有2个或4个待根据本发明的方法转化的N-端谷酰胺和/或谷氨酸残基的抗体，选自2个N-端谷酰胺残基、4个N-端谷酰胺残基、2个N-端谷氨酸残基、4个N-端谷氨酸残基或2个N-端谷酰胺残基和2个N-端谷氨酸残基。
N-端谷酰胺和/或谷氨酸残基转化成焦谷氨酸可自发地进行或其可由酶(如谷酰胺酰基环化酶)辅助。谷酰胺酰基环化酶参与各种肽激素和蛋白质的谷酰胺和谷氨酸环化并且已在不同组织中检测到酶促活性。还检测到在高温下储存的纯化抗体中谷酰胺和谷氨酸的自发环化(Schilling等人,欧洲生物化学学会联合会快报(FEBSLett),2004,563,191-196；KumarandBachhawat,当代科学(CurrentScience),第102卷,第2号,2012年1月25日)。
在本发明的实施方式中，N-端谷酰胺和/或谷氨酸残基转化成焦谷氨酸是非酶促转化。通常，非酶促转化在高温下进行适合的时间段，并且pH值变化可促进转化。这些参数中的任一个以及这些参数中的两个或三个的任何组合视为本发明的实施方式。
用于将N-端谷酰胺和/或谷氨酸残基转化成焦谷氨酸的适合温度在20℃-50℃范围内，如25℃-45℃，如35℃-40℃，例如37℃。用于将N-端谷酰胺和/或谷氨酸残基转化成焦谷氨酸的适合时间段在4到120小时范围内，如12到96小时，如24到72小时，例如8到48小时。
用于将N-端谷酰胺和/或谷氨酸残基转化成焦谷氨酸的适合的pH值范围在3.5-9.0范围内，如4.0-8.0，如4.5-7.5，如5.0-7.0，如5.8-6.5，例如在pH6.2下。
在本发明的典型实施方式中，转化在20℃-50℃的温度下进行4到120小时，如在30℃-45℃(例如37℃-40℃)的温度下进行12到72小时。
N-端谷酰胺和/或谷氨酸残基以非酶促方式转化成焦谷氨酸可在许多不同培养基中发生。适合的培养基(其中蛋白质处于溶液或悬浮液中)可选自水、细胞培养基、缓冲液，如磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液或碳酸铵缓冲液。所述转化也可以在纯化过程期间，在蛋白质结合于色谱树脂或薄膜时进行。
典型地，N-端谷酰胺和/或谷氨酸残基以非酶促方式转化成焦谷氨酸可在溶液(如磷酸盐缓冲液)中发生。在本发明的另一个实施方式中，转化在细胞培养基中进行。
在本发明的另一个实施方式中，转化在缓冲液中，如在磷酸盐缓冲液中或在碳酸铵缓冲液中进行。
典型地，N-端谷酰胺和/或谷氨酸残基以非酶促方式转化成焦谷氨酸可在来源于可保持超过50L细胞培养基的大规模制备生物反应器的蛋白质(在其收集和部分纯化之后)上进行。转化可典型地在静态条件下或在适度搅拌下以10ml到10L的体积进行并且在本发明的实施方式中，转化是以至少10ml的体积进行。
用于N-端谷酰胺和/或谷氨酸残基以非酶促方式转化成焦谷氨酸的尤其适合的培养基是包含5到150mM(如10到125mM，如25to100mM)浓度的缓冲液的培养基。缓冲液还可以含有5到150mM(如10到125mM，如25到100mM，如50到85mM)浓度范围内的盐，如NaCl。
在本发明的另一个实施方式中，用于N-端谷酰胺和/或谷氨酸残基以非酶促方式转化成焦谷氨酸的缓冲液浓度选自20mM到150mM的范围内。在本发明的典型实施方式中，缓冲液的浓度是约90mM。
特别优选缓冲液是具有75mMNaCl的35mM磷酸盐缓冲液(pH3.5)、具有75mMNaCl的35mM磷酸盐缓冲液(pH6.2)、100mMTris-HCl缓冲液(pH7.0)、100mM碳酸铵缓冲液(pH8.6)、35mM磷酸盐缓冲液(pH6.2)、具有75mMNaCl的35mM磷酸盐缓冲液(pH6.2)、具有50mMNaCl的60mM磷酸盐(pH6.2)、具有25mMNaCl的60mM磷酸盐缓冲液(pH6.2)、具有25mMNaCl的90mM磷酸盐缓冲液(pH6.2)或具有50mMNaCl的90mM磷酸盐缓冲液(pH6.2)。
N-端谷酰胺和/或谷氨酸残基转化成焦谷氨酸的比率可视所选择的缓冲液、进行转化的温度和转化进行的时间段而变化。技术人员将知道鉴别产生最佳转化而不引起降级或不合需要的转译后修饰的条件。在许多情况下，有利的是使尽可能多的N-端谷酰胺和/或谷氨酸转化成焦谷氨酸。
在本发明的实施方式中，N-端谷酰胺和/或谷氨酸转化成焦谷氨酸达到蛋白质中至少50％，即至少50％的N-端谷酰胺和/或谷氨酸是焦谷氨酸。举例来说，在转化之后，只要蛋白质组成中焦谷氨酸残基的总数是50％或更多，那么具有两个N-端谷酰胺残基的蛋白质或抗体可产生包含具有0、1或2个焦谷氨酸的蛋白质的异质组合物。
在本发明的另一个实施方式中，N-端谷酰胺和/或谷氨酸到焦谷氨酸的转化达到至少53％，如53％到68％。
在本发明的另一个实施方式中，N-端谷酰胺和/或谷氨酸到焦谷氨酸的转化达到至少68％，如至少75％，如至少80％，如至少85％，如至少90％，如至少95％，如至少99％。
技术人员知道鉴别和测量转化成焦谷氨酸的N-端谷酰胺和/或谷氨酸的量。而且，测量焦谷氨酸形成量的适合方法描述于Lyubarskaya等人2006(分析型生物化学(AnalyticalBiochemistry)348,24-39)和Dick等人2007(生物技术和生物工程,第97卷,第3号,2007年6月15日)中。最近还使用电喷雾Q-TOF质谱实现环化N-端谷酰胺的直接测定(Gadgil等人,2006美国质谱学会杂志(J.Am.Soc.MassSpectrom)17:867-872)。
如上文所描述，用于纯化抗体的方法通常基于亲和色谱，典型地基于蛋白质A亲和色谱，接着进行离子交换色谱步骤并且在过程中适合位置包括病毒减少步骤。
在本发明的方法的另一个实施方式中，所述方法进一步包含以下步骤：用适合的树脂进行蛋白质A捕获、用适合的树脂进行阴离子交换色谱和阳离子交换色谱，其中转化步骤在阳离子交换色谱步骤之前进行，优选在阳离子交换色谱步骤即将开始之前。
在本发明的方法的另一个实施方式中，所述方法包含以下步骤：
(a)用适合的树脂进行蛋白质A捕获，
(b)在低pH值下进行病毒灭活，
(c)阴离子交换色谱，
(d)蛋白质的N-端谷酰胺和/或谷氨酸转化成焦谷氨酸，
(e)用适合的树脂和梯度洗脱物进行阳离子交换色谱以分离产物同种型，
(f)病毒过滤，和
(g)超滤/透滤(UF/DF)。
在本发明的方法的另一个实施例中，步骤(a)至(g)以特定顺序进行。
在本发明的方法的另一个实施例中，在步骤(d)之后，典型地在步骤(e)之前插入被动冷却步骤。
在本发明的情形下，蛋白质A捕获步骤a)可使用任何适合的蛋白质A树脂过滤器或培养基进行。蛋白质A是细菌细胞壁蛋白质，其主要通过其Fc区域结合于哺乳动物IgG。在原生状态下，蛋白质A具有五个IgG结合结构域以及其它未知功能结构域。存在蛋白质A树脂的若干商业来源。技术人员知道什么可以是适合的蛋白质A树脂过滤器或培养基并且还可以是经修饰的蛋白质A树脂、过滤器或培养基。然而，适合的蛋白质A树脂、过滤器或培养基包含(但不限于)来自通用电气医疗集团(GEHealthcare)的MabSelectTMSure和来自密理博公司(Millipore)的ProSepUltraPlusTM。可用于较大规模纯化的填充有MabSelectTM的适合的管柱的非限制性实例可以是例如20cm×21cm管柱，其床体积是约6.6L。与管柱无关，可使用适合的树脂(如MabSelectTM或ProSepUltraPlusTM)封装管柱。
在本发明的情形下，蛋白质A捕获步骤典型地以结合/洗脱模式，通过将澄清的采集溶液装载到结合于蛋白质的树脂上来进行。技术人员还知道什么可以是用于从蛋白质A树脂或培养基移除杂质的适合的洗涤条件。然而，洗涤缓冲液通常选自包含20-100mMTris和20到1.0MNaCl的具有7.0-8.0的pH值的缓冲液。适合的洗脱缓冲液的一个实例可以是包含约200mM乙酸盐、50mMNaCl并且pH值是约3.5的洗脱缓冲液。
蛋白质可在多种细胞中表达，包括细菌(如大肠杆菌(E.coli)和芽孢杆菌(Bacillus))、酵母(如酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵属(Pichia)、曲霉属(Aspergillus)、镰孢属(Fusarium)和克鲁维酵母属(Kluyveromyces))、藻类、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞(如CHO(中国仓鼠卵巢(ChineseHamsterOvary))细胞)、杂交瘤、BHK(婴儿仓鼠肾脏)细胞、骨髓瘤细胞、HEK-293细胞、人类淋巴母细胞和小鼠细胞。许多复杂的蛋白质(如抗体)通常在CHO细胞、鼠类骨髓瘤细胞(如NSO和NS1细胞)或人类胚胎成视网膜细胞(如PER.C6TM)中表达。因为这类哺乳动物细胞含有内源性逆转录病毒类粒子，需要逆转录病毒灭活步骤(如步骤b))用于意图用于临床使用的基于哺乳动物细胞的蛋白质制备。技术人员知道如何进行逆转录病毒灭活步骤。然而，病毒灭活通常通过降低来自蛋白质A捕获步骤的洗脱液的pH值来对来自蛋白质A捕获步骤的洗脱液进行。因此，洗脱液的pH值可降低到3.0-4.0范围内的pH值保持5分钟到24小时的时段，如3.1到4，例如3.2到4，如3.3到4，例如3.4到4，如3.5到4，例如3.6到4，如3.7到4，例如3.8到4，如pH4或pH3到3.9，如pH3.1到3.9，例如pH3.2到3.9，如pH3.3到3.9，例如pH3.4到3.9，如pH3.5到3.9，例如pH3.6到3.8，例如pH3.6。
如上所述，来自蛋白质A捕获步骤的洗脱液可保持在这些pH值下历时5分钟到24小时的时段，如10分钟到240分钟，例如20到90分钟，并且来自蛋白质A亲和纯化步骤的洗脱液可在所述PH值降低之前和/或在pH值的再调节之后过滤。在低pH值病毒灭活步骤结束时，可视需要中和并且调节产物以用于后续处理。举例来说，洗脱液的pH值可以调节到pH7.5到8.5。
蛋白质A捕获步骤之后可进行阴离子交换色谱步骤，其在某一流动速率下以管柱模式或以分批操作模式、通过将离子交换树脂浸没于轻度搅拌的样品溶液中并且接着通过过滤进一步交换液体介质来操作。然而，在优选实施例中，这一阴离子交换色谱步骤c)是以流通模式操作的阴离子色谱步骤。在这一方面，技术人员知道如何限定用于装载第一离子交换剂的适合的pH值和离子强度条件，所述条件引起保持抗体流动通过阴离子树脂而灭活病毒粒子和其它杂质结合于阴离子树脂并且因此从抗体溶液移除。
适合的阴离子交换色谱树脂、过滤器或培养基的实例在本领域中已知并且包括基于琼脂糖的树脂和珠粒、聚葡萄糖珠粒、聚苯乙烯珠粒和聚苯乙烯/二乙烯基-苯树脂。优选的是，阴离子交换树脂是安放在琼脂糖基质(如例如来自安玛西亚-生物科学公司(Amersham-Biosciences)/法玛西亚公司(Pharmacia)的SepharoseCL-6B或SepharoseFastFlow(FF))上的基于季铵的阴离子交换剂。这类琼脂糖的实例是来自安玛西亚-生物科学公司/法玛西亚公司的SepharoseQ、SartoriusSartobindQ或PallMustangQ。优选阴离子交换材料是来自通用电气医疗集团的Q-SepharoseFastFlow树脂。
根据本发明的阴离子交换色谱中的平衡缓冲液优选具有置换剂盐的盐浓度，如例如1到150mM，更优选5到110mM，最优选20到100mM盐范围内的氯化钠。平衡缓冲液的pH值优选在pH6.5到pH9.0范围内，更优选在pH7.5到pH8.5范围内，最优选在pH7.9到pH8.2范围内。根据本发明的平衡缓冲液优选含有1到100mM，更优选5到50mM，最优选10到30mMTris范围内的Tris。根据本发明的平衡缓冲液的导电性优选在pH8.0下低于10mS/cm。
根据本发明，第一阴离子交换色谱步骤之后通常进行焦谷氨酸转化步骤，以使未环化的N-端谷酰胺和/或谷氨酸残基转化成焦谷氨酸。上文已描述用于在纯化过程内将蛋白质的N-端谷酰胺和/或谷氨酸残基转化成焦谷氨酸的适合条件。然而，根据本发明，如果转化在超过约25℃的温度下进行，可在N-端谷酰胺和/或谷氨酸残基转化成焦谷氨酸之后进行任选的冷却步骤。这一冷却步骤可通过活性冷却过程进行，即例如通过使用水基冷却过程或流通热交换剂；或被动冷却过程，即其中耗费能量的机械组件(如泵和风扇)不用于降低温度。冷却过程可持续直到所得转化溶液达到约18℃到30℃的温度。冷却过程可进行1到120小时，如12到96小时，如24到72小时，例如24到48小时范围内的时间段。在本发明的优选实施例中，转化包含被动冷却12到72小时的步骤。
在焦谷氨酸转化步骤结束时，可视需要调节缓冲液条件以用于后续处理。举例来说，转化溶液的pH值可用乙酸调节到约pH5.5的pH值。
根据本发明，可在焦谷氨酸转化步骤之后用适合的树脂和梯度洗脱物进行阳离子交换色谱，以便分离产物同种型。阳离子交换剂的适合实例包括S-SepharoseFF或SP-SepharoseHP(法玛西亚公司)、SP-SepharoseFF(西格马公司(Sigma))和PorosHS50(应用生物系统公司(AppliedBiosystems))。优选地阳离子交换剂是AppliedBiosystems的PorosHS50。
可用乙酸将来自焦谷氨酸转化步骤的蛋白质溶液调节到约pH5.5的pH值并且装载到阳离子交换剂上。适合的洗涤缓冲液含有5到50mM范围内的乙酸钠和5到50mM范围内的NaCl，并且可具有5.0到7.0范围内的pH值。结合蛋白质可使用15到180mMNaCl的梯度洗脱物在13个管柱洗涤物上洗脱成大量洗脱份。在洗脱之后，可分析和收集蛋白质洗脱份。
在阳离子交换色谱步骤之前执行转化步骤的特别优势在于转化物质的不同电荷。因此，N-端谷酰胺未完全转化成焦谷氨酸的蛋白质分子带有更多正电荷。因此，例如具有4个N-端谷酰胺残基的抗体将产生具有四个不同电荷的四种不同同种型，其中抗体的一个部分具有一个转化成焦谷氨酸的N-端谷酰胺残基，并且具有两个N-端谷酰胺残基的第二部分转化成焦谷氨酸，并且具有三个N-端谷酰胺残基的第三部分转化成焦谷氨酸，和第四洗脱份，其中所有四个N-端谷酰胺残基转化成焦谷氨酸。这类不同带电同种型可通过阳离子交换色谱分离并且可移除非优选同种型。
根据本发明，病毒过滤步骤是在阳离子交换剂步骤之后进行。病毒灭活可通过使用适合的过滤器实现。尽管本发明的某些实施方式在主要回收阶段期间使用这类过滤，但在其它实施方式中，其在纯化过程的其它阶段使用，包括作为纯化的倒数第二或最终步骤。在某些实施例中，使用替代性过滤器进行病毒灭活，如(但不限于)ViresolveTM过滤器(密理博公司)、ZetaPlusVRTM过滤器(CUNO)、PlanovaTM过滤器(旭化成制药公司(AsahiKaseiPharma))和来自帕尔公司(PallCorporation)的UltiporDV50TM过滤器。优选的过滤器是Planova20N小病毒等级过滤器。
在病毒过滤之后，蛋白质溶液经过超滤/透滤(UF/DF)进行浓缩和缓冲液交换。缓冲液交换可使用30kDa分子量截止膜通过切向流过滤(TFF)进行并且透滤成最终调配缓冲液的不含清洁剂的形式。
本发明的第三方面涉及制备用于药学产物的具有N-端焦谷氨酸的蛋白质的方法，其中所述方法包含在纯化过程内将蛋白质的N-端谷酰胺和/或谷氨酸残基转化成焦谷氨酸的方法，纯化过程包含在促进N-端谷酰胺和/或谷氨酸残基的环化的条件下温育蛋白质的步骤。
本发明的第四方面涉及制备作为药学产物的API的具有N-端焦谷氨酸的蛋白质的方法，其中所述方法包含纯化含有N-端谷酰胺和/或谷氨酸残基的蛋白质的方法，所述纯化方法包含在促进N-端谷酰胺和/或谷氨酸残基的环化的条件下将蛋白质的N-端谷酰胺和/或谷氨酸残基转化成N-端焦谷氨酸的步骤。
与本发明的第一或第二方面有关的以上实施方式中的任一个也是第三和第四方面的实施方式。
在一个实施方式中，药学产物包含抗体，典型地选自曲妥珠单抗、英利昔单抗、巴利昔单抗、达利珠单抗、阿达木单抗、奥马珠单抗、吉妥单抗、利妥昔单抗、贝伐单抗、西妥昔单抗、奥伐木单抗、维妥珠单抗、奥克珠单抗、帕尼单抗、兰比珠单抗、异贝莫单抗、泰泽坦、阿昔单抗、艾库组单抗、阿仑单抗、奥唑米星、依法利珠单抗、帕利珠单抗、那他珠单抗、奥马珠单抗和托西利单抗。在优选实施方式中，抗体是抗-CD20抗体。
本文所引用的所有参考文献，包括公开、专利申请以及专利在此以引用的方式并入，其引用程度就如同每一个参考文献单独地并且特定地指示为以引用的方式并入并且全文阐述于本文中一般。
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除非本文另外指出或另外明显与内容相矛盾，否则本文中所描述的所有方法可以任何适合顺序进行。
本文中提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“如”)的使用，仅旨在更好地阐明本发明，并且除非另有说明，否则不对本发明的范围加以限制。除非明确说明，否则在说明书中的语言不应解释为指示任何元素为本发明的实践所必需的。
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本发明以可适用法律准许的最大程度包括本文中呈现的方面或权利要求中所述的标的物的所有变化形式和等同物。
通过以下实例进一步说明本发明，然而，其不应解释为限制保护范畴。披露于上述说明书和以下实施例中的特征可单独和以其任何组合作为以多样形式实现本发明的材料。
实施例：
实施例1
选择表达利妥昔单抗单克隆抗体(还具有商标名美罗华(Rituxan))的CHO产生者细胞系并且用于使用直线式分批进料发酵过程，在具有搅拌箱设计的10L单次使用生物反应器中产生利妥昔单抗抗体。
利妥昔单抗是嵌合抗体，具有小鼠可变结构域和人类IgG1重链和κ轻链恒定区。利妥昔单抗的重链和轻链在其N-端(在移除分泌信号肽之后)具有谷酰胺并且重链在其C-端具有赖氨酸。N-端谷酰胺可通过细胞酶和化学转化而环化成焦谷氨酸，并且通过细胞羧基肽酶进行C-端赖氨酸截割极常见。这些修饰皆降低蛋白质上的正电荷数目，并且这些N-端和C-端修饰的不均匀性有助于复杂的阳离子交换高效液相色谱(IEX-HPLC)曲线(如图2所示)。
澄清的采集样品首先装载到使用MabSelectSuRe树脂的蛋白质A亲和色谱步骤上并且以结合/洗脱模式进行。MabSelectSuRe用5倍管柱体积的20mMTris、1MNaClpH8.0洗涤，接着用2.5倍管柱体积的20mMTris、50mMNaClpH8.0洗涤，在结合之前，利妥昔单抗抗体使用4.5倍管柱体积的200mM乙酸盐、50mMNaClpH3.5±0.1洗脱并且通过在环境温度下，在低pH值下温育105±15分钟来经历病毒灭活。
在病毒灭活之后，使用0.6MTris、50mMNaClpH8.5将溶液中和到pH8，并且使用以流通模式中操作的Q-SepharoseFastFlow树脂，通过阴离子交换色谱来进一步纯化。已知这一程序可提供良好DNA和病毒清除率。基于先前经历，如果导电性≤10mS/cm，可由AEX-FT预期在pH8.0下的良好病毒清除率。这可以通过用注射用水(WFI)简单稀释来实现，但后果是增加过程体积并且因此增加处理时间。为了确保简单的2倍稀释将可靠地产生低于10mS/cm的最终AEX负载，需要使蛋白质A洗涤物和洗脱缓冲液的NaCl浓度降低一半。
使用Agilent高效液相色谱系统，通过在DionexPropacWCX-10管柱上进行的阳离子交换高效液相色谱(IEX-HPLC)分析所得流通溶液，并且与两个不同批次的指定为参考批号M86188和参考批号B6109B01的市售利妥昔单抗抗体制剂相比较，如图2所示。
通过市售利妥昔单抗抗体制剂参考批号M86188和参考批号B6109B01以及本文中制备的D83BSR4利妥昔单抗制剂的质谱进行的肽映射的结果表明，IEX-HPLC分析的主峰由不含两个C-端赖氨酸残基并且其中所有4个谷酰胺残基皆转化成环化焦谷氨酸的利妥昔单抗分子组成。此外，IEX-HPLC分析披露市售利妥昔单抗抗体制剂的后峰的外形相比于本文中制备的D83BSR4利妥昔单抗制剂的显著差异。
通过肽映射和质谱进行的利妥昔单抗批料的组成的分析披露市售利妥昔单抗与本文中制备的D83BSR4利妥昔单抗制剂之间的后峰外形的差异主要归因于N-端谷酰胺的不完全环化。
一种降低后峰利妥昔单抗同种型的量的方法可以是在后续阳离子交换纯化步骤期间移除和抛弃具有过量自由N-端谷酰胺的产物。然而，因为后峰利妥昔单抗同种型占制剂(如D83BSR4)中总利妥昔单抗同种型的高达50％，这将使产率降低约一半。
因此，进行后续实验以鉴别在操作合理温度下将促进阴离子交换溶液的谷酰胺环化的最佳条件，以便改良利妥昔单抗主峰同种型的产率。
实施例2
测试的第一条件是简单确定阴离子交换流通溶液(AEXFT)或后续阳离子交换负载溶液(CEX-Load)在环境温度下或在37℃下是否将促进谷酰胺环化。
在阴离子交换流通步骤(pH8)结束时采集样品并且在准备用于阳离子交换之后，进行装载(pH5.5)并且在各时间点等分到重复试管中且保持在环境温度或37℃下。以13天为一个周期，来自每种条件的一个试管转移到至70℃冷冻器中，并且在时程结束时，将所有样品解冻并且通过IEX-HPLC进行分析(图3)。(关于环境温度保持，制得较少的CEX负载的等分试样)。
如图3中所示，当在环境温度或37℃下温育利妥昔单抗AEXFT溶液时，未发现利妥昔单抗后峰同种型转化成主峰同种型。相比之下，当在CEX-Load溶液中温育利妥昔单抗抗体时，发现利妥昔单抗后峰同种型在环境温度下和在37℃下温育时转化成主峰同种型。然而，发现在环境温度下和在37℃下的转化速率相当缓慢，使得在温育8天之后的总后峰百分比降低约10％，其对应于约20％的起始量的后峰转化成主峰。
实施例3
狄克等人(2007,生物技术学刊(Biotechnol,Bioeng.)v97p544)已报导在35mM磷酸盐缓冲液存在下，在pH6.2下与本文中观察到的相比更高的转化率。因此，进行新的实验以研究在环境温度、37℃和45℃下转化的动力学以及蛋白质浓度对转化率的影响。
作为制造过程中实施的操作上最简单的方法，向利妥昔单抗AEXFT溶液中添加来自浓缩储备溶液的磷酸钠达到35mM并且用乙酸滴定到pH6.25。
将利妥昔单抗AEXFT磷酸钠溶液分成3个等分试样，其中一个保持1.85mg/mL蛋白质的浓度不变化，而另外两个使用Millipore30kDaMWCO自旋浓缩器浓缩2倍(中间图)和5倍(右图)达到约3.7和9.25mg/mL。每个样品用0.2μm针筒过滤器过滤灭菌并且在个别时间点再等分到艾本德试管(Eppendorftube)中。若干重复等分试样保持在环境温度(上部行)、37℃(中间行)和45℃(下部行)下长达3天(图4)。在所指示的时间点时，来自每种条件的一个试管转移到2℃-8℃下，并且在实验结束时，在同一分析法中共同分析所有样品。每个图展示在每种温育条件下，跨越时程的IEX-HPLC前峰、主峰和后峰的比例。作为对比，市售利妥昔单抗参考标准的前峰、主峰和后峰的比例展示于第一图中的每一行中。
结果表明(图4)较高温度可显著提高焦谷氨酸转化和前峰形成的比率，但在每种条件下，焦谷氨酸转化始终比前峰形成更快。在45℃下，主峰％在第1天达到最大值60％-70％，并且在前峰形成超过任何其它后峰转化时开始降低。在37℃下，转化更缓慢并且在第3天达到相同的最大主峰％。尽管一些转化在环境温度下是明显的，但在所述温度下的转化率小于在37℃下观察到的一半。在任何温度下皆未观察到蛋白质浓度的显著作用。
实施例4
接着，评估磷酸盐浓度(30、60、90mM)的作用，包括将更有助于装载到后续阳离子交换POROSHS50管柱上的pH值和稀释系数(即较低[NaCl])的变量。
利妥昔单抗AEX-FT溶液(D83)用50mMNaCl(最终产生约50mMNaCl-上图)或注射用水(WFI)(最终产生约25mMNaCl-下图)稀释两倍并且添加来自浓缩储备液的磷酸钠以制备30、60或90mM最终溶液，用乙酸将其滴定到pH6.2或pH5.8。这些溶液在37℃下温育2天并且通过IEX-HPLC分析，如实施例3中。作为对比。每个图中展示相同的市售利妥昔单抗参考标准和对照物D83T＝0样品。
结果表明(图5)在37℃下温育2天之后，较高磷酸盐浓度引起后峰中稍微更大的降低和主峰中更高的增加。类似地，pH6.2与pH5.8相比稍微更好地促进转化。未发现使用25mMNaCl或50mMNaCl之间存在显著差异。
在此时，所有实验在静态条件下在小试管中进行，实验在适用于大规模制造的搅拌摇瓶模型中重复，其中在37℃下用叶轮进行混合以确保均匀温度保持3天。除了在摇瓶模型中在90mM磷酸盐下的转化动力学稍微更快之外，这些结果证实在较小静态模型中获得的前述观察结果。
实施例5
进行全规模完全制造过程包括纳米过滤并且使用500L生物反应器进行所有微生物对照测量且实质上如实施例1中所描述进行纯化。在温育之后，利妥昔单抗抗体在37℃下保持约28小时，其在48小时期间逐渐冷却到室温。所得利妥昔单抗溶液装载到阳离子交换色谱POROSHS树脂上并且用4倍管柱体积的15mMNaCl、20mMNaAcetatepH5.5和5.5倍管柱体积的15mMNaCl、20mMNaPhosphatepH6.5洗涤。使用超过13倍管柱体积的15到180mMNaCl的线性梯度洗脱利妥昔单抗抗体，其中洗脱份收集以0.5倍管柱体积/洗脱份进行。以下表1展示洗脱份1到9的总蛋白含量，以及个别洗脱份和所收集的洗脱份1到6以及市售利妥昔单抗制剂(称为利妥昔单抗参考物)的IEX-HPLC分析。
如由表1可见，所收集的洗脱份1到6对应于总洗脱蛋白质(即利妥昔单抗)的96％，并且前峰％、主峰％和后峰％(16.3；63.0；20.7)与市售利妥昔单抗制剂(20.2；66.5；13.4)极类似。换句话说，所收集的洗脱份1到6的利妥昔单抗同种型组成与市售利妥昔单抗制剂极类似。
这与实验1的结果显著不同，其中后峰利妥昔单抗同种型的量占总利妥昔单抗同种型的高达50％。
表1.用于进行制造的POROSHS50洗脱份的分析(10-0071)。
结论
如实施例1到5中所示，已研发用于在制造规模下将N-端谷酰胺或谷氨酸残基转化成焦谷氨酸的稳定和更加可重复的程序。所述方法经设计以降低各批次之间的差异并且制造在离子概况方面与市售产物类似的产物。
所述过程针对将含有蛋白质的阴离子交换流通溶液简单和快速转移到用于在纯化程序内将未环化N-端谷酰胺残基以非酶促方式转化成焦谷氨酸的含有最佳量的磷酸盐和NaCl(pH值是约6.2)的组合物中进行优化，所述蛋白质具有未环化的N-端谷酰胺残基。
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Claims (15)

1.一种用于纯化含有N-端谷酰胺和/或N-端谷氨酸的蛋白质的方法，所述方法包含在促进所述蛋白质的N-端谷酰胺和/或N-端谷氨酸环化成N-端焦谷氨酸的条件下温育所述蛋白质的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质是抗体。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述蛋白质是抗-CD20抗体。
4.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的方法，其中所述抗-CD20抗体包含与SEQIDNO:1相同的轻链序列和与SEQIDNO:2相同的重链序列。
5.根据权利要求1至4中任一权利要求所述的方法，其中所述转化在20℃-45℃的温度下进行。
6.根据权利要求1至5中任一权利要求所述的方法，其中所述转化在细胞培养基中或在缓冲液中进行。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述缓冲液的浓度选自20mM到150mM的范围。
8.根据权利要求1至7中任一权利要求所述的方法，其中pH值在3.5-9.0范围内。
9.根据权利要求1至8中任一权利要求所述的方法，其中N-端谷酰胺和/或谷氨酸到焦谷氨酸的转化率达到至少50％。
10.根据权利要求1至9中任一权利要求所述的方法，其中所述转化步骤包含所述N-端谷酰胺和/或所述谷氨酸以非酶促方式转化成焦谷氨酸。
11.根据权利要求1至10中任一权利要求所述的方法，其中在转化之前，所述蛋白质具有1到4个N-端谷酰胺残基和/或1到4个N-端谷氨酸残基。
12.根据权利要求1至11中任一权利要求所述的方法，其进一步包含用适合的树脂进行蛋白质A色谱和用适合的树脂进行离子交换色谱的步骤。
13.根据权利要求1至12中任一权利要求所述的方法，其中所述方法包含以下步骤：
(a)用适合的树脂进行蛋白质A捕获，
(b)在3.0-4.0范围内的pH值下进行病毒灭活，
(c)阴离子交换色谱，
(d)所述蛋白质的N-端谷酰胺和/或谷氨酸转化成焦谷氨酸，
(e)用适合的树脂和梯度洗脱物进行阳离子交换色谱以分离产物同种型，
(f)病毒过滤，和
(g)超滤/透滤(UF/DF)。
14.根据权利要求13所述的方法，其包含在步骤(d)之后进行12到72小时的被动冷却的步骤。
15.一种制备作为药学产物的活性药学成分的具有N-端焦谷氨酸的蛋白质的方法，所述方法包含根据权利要求1至14中任一权利要求所述的纯化方法。
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