CN101166755A

CN101166755A - 具有可切割连接物的单链抗体

Info

Publication number: CN101166755A
Application number: CNA200680014387XA
Authority: CN
Inventors: 查冬兴; 崔秉权; T·U·格恩格罗斯
Original assignee: Glycofi Inc
Current assignee: Glycofi Inc
Priority date: 2005-04-26
Filing date: 2006-04-26
Publication date: 2008-04-23
Also published as: WO2006116657A2; AU2006239253A1; JP2008538926A; WO2006116657A3; CA2604786A1; US20060252096A1; EP1877421A2

Abstract

本发明涉及抗体以及制造抗体的方法，所述抗体具有理想的糖基化并能有效的制造。经过编码融合蛋白的核酸转化的宿主细胞经培养以表达所述核酸，并由合适的蛋白酶切割以制造抗体，其中所述融合蛋白包含信号序列、免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链，每一个各自含有可变区和恒定区并被含有至少一个蛋白水解切割位点的间隔肽所隔开。

Description

具有可切割连接物的单链抗体

相关申请的交叉引用

[0001]本申请是2005年4月26日递交的60/675,218的非临时申请，将其以引用的方式在此全文引入用于所有各种目的。

背景技术

[0002]虽然哺乳动物细胞体系已成功地用于制造医疗用途的抗体，但是其开发昂贵，并且目前没有足够的生产能力以满足未来对抗体的预期需求。从低等真核生物和细菌中表达蛋白的细胞体系更加低廉并且更易于操作，但涉及其他一些制造抗体的困难。在这些细胞类型中，由于在这些体系中完整抗体的折叠和/或产率很差，之前大部分工作局限于抗体片段而不是完整的抗体的表达(参见，例如Better et al.，Science240，1041-1043(1988))。然而，抗体片段仅仅在抗体的结合对于治疗活性是充分的情况下，换言之，在不需要效应子功能时有用。

[0003]即使当不需要效应子功能时，由于不具有合适的糖基化，由原核生物和低等真核生物制造的抗体通常也不及来源于哺乳动物细胞的抗体有用。不同的生物体制造不同的糖基化酶(例如，糖基转移酶和糖苷酶)，具有不同的底物(核苷酸糖)，因此所述糖基化的模式以及各个寡糖的组成，甚至对于相同的蛋白，也会根据其中将表达特定蛋白的宿主体系而不同。细菌通常不对蛋白进行糖基化，即使进行糖基化，也仅仅是以相当非特异的方式进行(Moens and Vanderleyden，Arch Microbiol.168(3)：169-175(1997))。低等真核生物诸如丝状真菌和酵母主要添加甘露糖和甘露糖磷酸酯糖。所得聚糖已知为“高甘露糖”型聚糖或甘露聚糖。植物细胞和昆虫细胞(诸如Sf9细胞)通过其他方式对蛋白质进行糖基化。相比较，在高等真核生物如人类中，新生寡糖侧链可经过修饰而移去数个甘露糖残基并通过附加通常在低等真核生物的N-聚糖中没有发现过的糖残基而延长(Coloma et al.，2000，Mol.Immunol.37：1081-1090；Raju et al.，2000，Glycobiology，10：477-486；Weikert，et al.NatureBiotechnology，1999，17，1116-1121；Malissard，et al.Biochemical andBiophysical Research Communications，2000，267，169-173)。在细菌或低等真核生物制造的抗体中缺乏合适的糖基化可对治疗用蛋白的免疫原性、药物代谢动力学性质、运输和功效产生不利影响。

[0004]已知在细菌和低等真核生物中表达的抗体片段的一种形式为单链抗体(参见例如US 4,946,778和US 5,132,405)。这些分子包括通过间隔肽与重链可变区分开的轻链可变区，但典型地缺少部分，通常缺少全部的恒定区。所述单链抗体形式非常适用于为所需的结合特异性进行的大量抗体的筛选，尤其是通过噬菌体展示(参见例如McCafferty et al.，Nature 348,552,554(1990))。在这些筛选中，相对于完整的抗体，更小尺寸的单链抗体优势在于能实现展示而不破坏噬菌体的生存能力，并且所述恒定区的缺失与结合特异性无关。已提出缺少恒定区的小尺寸单链抗体在不需要效应子功能的应用中对于治疗目的具有优势(Cochet et al.，Cancer Detect.Prev.，23，506-510(1999)；McCall et al.，Mol.Immunol，36，433-445(1999)；Pavlinkova et al.，J.Nuclear Med.，40，1536-1546(1999))。已提出所述小尺寸能提高对目标组织的渗透。还已报道由于可解的抗体构象的数目减少，所述小尺寸在减少错误的折叠方面也有优势(Jaeger et al.，FEBS Letters，462，307-312(1999))。

发明内容

[0005]本发明提供了制造抗体的方法。所述方法包括培养经过编码融合蛋白的核酸转化的真菌细胞，所述融合蛋白从N-端至C-端依次包含：(a)信号序列，(b)含有可变区和恒定区的第一免疫球蛋白链，(c)含有可被蛋白酶切割的蛋白水解切割位点的间隔肽，所述蛋白酶是独立于所述融合蛋白的分子，以及(d)含有可变区和恒定区的第二免疫球蛋白链；其中，所述第一免疫球蛋白链是轻链，而第二免疫球蛋白链是重链，或者反过来；所述融合蛋白在所述间隔肽和所述第二免疫球蛋白链之间没有第二信号序列；并且所述间隔肽没有自加工切割位点。所述融合蛋白经表达，在信号序列的C-端末端被切割以移除所述信号序列，并在所述间隔肽的蛋白水解位点被蛋白酶切割。制造了含有一对分子间结合的免疫球蛋白重链和轻链的抗体。

[0006]优选地，所述抗体是包含两对分子间结合的免疫球蛋白重链和轻链的四聚抗体。在一些方法中，所述第一免疫球蛋白链是轻链而第二免疫球蛋白链是重链。在其他一些方法中，所述第一免疫球蛋白链是重链而第二免疫球蛋白链是轻链。

[0007]在一些方法中，在所述蛋白水解位点发生切割之前，所述融合蛋白的轻链和重链通过分子内键合而相互结合，两个融合蛋白拷贝通过其各自重链恒定区的分子间键合而相互结合。在一些方法中，在所述蛋白水解位点发生切割之后，所述免疫球蛋白重链和轻链发生分子间结合以形成一对分子间结合的重链和轻链，并在两对分子间结合的重链和轻链之间发生分子间结合形成所述四聚体抗体。在一些方法中，所述间隔肽含有可被第一和第二蛋白酶切割的第一和第二蛋白水解位点，两种蛋白酶是独立于所述融合蛋白的分子，其中所述第一和第二蛋白水解切割位点被连接肽所分隔，并且所述第一和第二蛋白酶对蛋白水解切割位点的切割从所述融合蛋白中移除了所述连接肽。在一些方法中，所述第一和第二蛋白酶是相同的蛋白酶。

[0008]在一些方法中，所述第一和第二蛋白水解位点的切割在细胞内发生。在一些方法中，所述细胞分泌所述抗体。在一些方法中，所述细胞经过对切割所述第一和第二蛋白水解位点的蛋白酶进行编码的核酸的转化。在一些方法中，所述核酸编码第二融合蛋白，所述第二融合蛋白含有与所述蛋白酶融合的第二信号序列，其中所述第二信号序列使所述蛋白酶被摄取进入内质网。在一些方法中，所述融合蛋白从细胞中分泌而不包含信号序列，并且所述方法进一步包括使用在间隔肽的蛋白水解位点进行切割的蛋白酶处理所述分泌的融合蛋白。

[0009]一些方法进一步包括从细胞中或者从培养细胞的培养基中回收所述抗体。一些方法进一步包括纯化所述抗体至基本同质。一些方法进一步包括在药物组合物中将所述抗体与可药用载体相结合。一些方法进一步包括将编码所述融合蛋白的核酸引入细胞。

[0010]在一些方法中，所述细胞是丝状真菌细胞。在一些方法中，所述细胞是酵母细胞。优选的细胞来自于选自由毕赤巴斯德酵母(Pichiapastoris)、芬兰毕赤酵母(Pichia finlandica)、Pichia trehalophila、Pichiakoclamae、膜醭毕赤氏酵母(Pichia membranaefaciens)、Pichia minuta(Ogataea minuta、Pichia lindneri)、Pichia opuntiae、Pichiathermotolerans、Pichia salictaria、Pichia guercuum、Pichia pijperi、Pichiastiptis、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、毕赤属物种、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、酵母属物种(Saccharomyces sp.)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、克鲁维酵母属物种(Kluyveromycessp.)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、Candida albicans、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉菌(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、Chrysosporiumlucknowense、镰刀菌属物种(Fusarium sp.)、Fusarium gramineum、镰孢霉(Fusarium venenatum)和粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)构成的组的菌株。

[0011]在一些方法中，所述蛋白水解切割位点是Kex2p位点。可选地是，所述蛋白水解切割位点具有氨基酸序列XXKR，其中X是任何氨基酸。可选地是，所述蛋白水解切割位点具有氨基酸序列XXKR，其中所述X是任何疏水氨基酸或亲水氨基酸。可选地是，所述蛋白水解切割位点具有氨基酸序列RHKR。可选地是，所述间隔肽包含具有氨基酸序列LVKR的N-端蛋白水解切割位点和具有氨基酸序列RLVKR的C-端蛋白水解切割位点。可选地是，所述抗体不含有所述间隔肽的任何残基。

[0012]在一些方法中，所述四聚抗体具有效应子功能。可选地是，所述效应子功能是补体固定或者抗体依赖性细胞毒性。

[0013]在一些方法中，所述免疫球蛋白轻链和重链是人源化的免疫球蛋白轻链和重链。

[0014]在一些方法中，所述抗体以至少50 mg/升培养基的产率进行制造。在一些方法中，所述抗体的糖基化至少位于位点Asn297。

[0015]在一些方法中，所述重量恒定区包含CH1、铰链区、CH2和CH3区。在一些方法中，所述重量恒定区进一步包含CH4区。

[0016]一些方法进一步包括纯化所述抗体并将所述抗体整合到诊断试剂盒中。

[0017]在一些方法中，所述融合蛋白在所述信号序列和所述第一免疫球蛋白链之间或者在间隔肽和第二免疫球蛋白链之间不含有来自宿主蛋白的肽节段。

[0018]本发明进一步提供编码融合蛋白的核酸，所述融合蛋白从N-端至C-端依次包含：(a)信号序列，(b)含有可变区和恒定区的第一免疫球蛋白链，(c)含有可被蛋白酶切割的蛋白水解切割位点的间隔肽，所述蛋白酶是独立于所述融合蛋白的分子，以及(d)含有可变区和恒定区的第二免疫球蛋白链；其中，所述第一免疫球蛋白链是轻链，而第二球蛋白链是重链，或者反过来；所述融合蛋白在所述间隔肽和所述第二免疫球蛋白链之间没有第二信号序列；并且所述间隔肽没有自加工切割位点。本发明还提供一种含有与调控序列可操作地相连的此种核酸的载体，以及经此种核酸转化的细胞。

[0019]本发明进一步提供一种抗体组合物，所述抗体组合物含有通过上述方法制造的抗体的复数个分子，其中每一种均具有糖型，并且主要糖型(predominant glycoform)是复合的并缺少海藻糖。可选地是，所述主要聚糖结构以比所述抗体组合物的第二主要的聚糖结构多至少约10～25摩尔百分数的水平存在。

[0020]本发明进一步提供通过上述方法制造的单克隆抗体。可选地是，所述单克隆抗体与EGFR、CD20、CD33或TNF-α特异性结合。

[0021]本发明进一步提供了制造抗体的方法。所述方法包括：培养经过编码融合蛋白的核酸转化的细胞，其中所述融合蛋白包含信号序列，含有可变区和恒定区的免疫球蛋白轻链，含有可被第一或第二蛋白酶切割的第一和第二蛋白水解切割位点的间隔肽，其中所述蛋白酶可以是相同或者不同，二者均为独立于所述融合蛋白的分子，以及含有可变区和恒定区的免疫球蛋白重链，其中所述间隔肽没有自切割蛋白水解位点，其中所述融合蛋白被表达，在信号序列的C-端末端被切割以移除所述信号序列，并在所述间隔肽的第一和第二蛋白水解位点被第一和第二蛋白酶切割，制造了含有分子间结合的免疫球蛋白重链和轻链对的抗体。

[0022]在一些方法中，所述抗体是包含两对分子间结合的免疫球蛋白重链和轻链的四聚抗体。在一些方法中，所述第一免疫球蛋白链是轻链而第二免疫球蛋白链是重链。在其他方法中，所述第一免疫球蛋白链是重链而第二免疫球蛋白链是轻链。

[0023]在一些方法中，在所述蛋白水解位点发生切割之前，所述融合蛋白的轻链和重链通过分子内键合而相互结合，两个融合蛋白拷贝通过其各自重链恒定区的分子间键合而相互结合。在一些方法中，在所述蛋白水解位点发生切割之后，所述免疫球蛋白重链和轻链发生分子间结合以形成所述的一对分子间结合的重链和轻链，并在两对分子间结合的重链和轻链之间发生分子间结合形成所述四聚体抗体。

[0024]在一些方法中，所述间隔肽含有可被第一和第二蛋白酶切割的第一和第二蛋白水解位点，两种蛋白酶是独立于所述融合蛋白的分子，其中所述第一和第二蛋白水解切割位点被连接肽所分隔，并且所述第一和第二蛋白酶对蛋白水解切割位点的切割从所述融合蛋白中移除了所述连接肽。在一些方法中，所述第一和第二蛋白酶是相同的蛋白酶。

[0025]在一些方法中，所述第一和第二蛋白水解位点的切割在细胞内发生。在一些方法中，所述细胞分泌所述抗体。在一些方法中，所述细胞经过对切割所述第一和第二蛋白水解位点的蛋白酶进行编码的核酸的转化。

[0026]在一些方法中，所述核酸编码第二融合蛋白，所述第二融合蛋白含有与所述蛋白酶融合的第二信号序列，其中所述第二信号序列使所述蛋白酶被摄取进入内质网。在一些方法中，所述融合蛋白从细胞中分泌而不包含信号序列，并且所述方法进一步包括使用在间隔肽的蛋白水解位点进行切割的蛋白酶处理所述分泌的融合蛋白。一些方法进一步包括从细胞中或者从培养细胞的培养基中回收所述抗体。一些方法进一步包括纯化所述抗体至基本同质。

[0027]一些方法进一步包括在药物组合物中将所述抗体与可药用载体相结合。

[0028]一些方法进一步包括将编码所述融合蛋白的核酸引入细胞。

[0029]在一些方法中，所述细胞是丝状真菌细胞。在一些方法中，所述细胞是酵母细胞。优选的细胞来自于选自由毕赤巴斯德酵母(Pichiapastoris)、芬兰毕赤酵母(Pichia finlandica)、Pichia trehalophila、Pichiakoclamae、膜醭毕赤氏酵母(Pichia membranaefaciens)、Pichia mmuta(Ogataea minuta、Pichia lindneri)、Pichia opuntiae、Pichiathermotolerans、Pichia salictaria、Pichia guercuum、Pichia pijperi、Pichiasttptis、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、毕赤属物种、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、酵母属物种(Saccharomyces sp.)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、克鲁维酵母属物种(Kluyveromycessp.)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、Candida albicans、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉菌(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、Chrysosporiumlucknowense、镰刀菌属物种(Fusarium sp.)、Fusarium grammeum、镰孢霉(Fusarium venenatum)和粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)构成的组的菌株。

[0030]在一些方法中，所述蛋白水解切割位点是Kex2p位点。可选地是，所述蛋白水解切割位点具有氨基酸序列XXKR，其中X是任何氨基酸。可选地是，所述蛋白水解切割位点具有氨基酸序列XXKR，其中所述X是任何疏水氨基酸或亲水氨基酸。可选地是，所述蛋白水解切割位点具有氨基酸序列RHKR。可选地是，所述间隔肽包含具有氨基酸序列LVKR的N-端蛋白水解切割位点和具有氨基酸序列RLVKR的C-端蛋白水解切割位点。可选地是，所述抗体不含有所述间隔肽的任何残基。

[0031]在一些方法中，所述四聚抗体具有效应子功能。可选地是，所述效应子功能是补体固定或者抗体依赖性细胞毒性。

[0032]在一些方法中，所述免疫球蛋白轻链和重链是人源化的免疫球蛋白轻链和重链。

[0033]在一些方法中，所述抗体以至少50mg/升培养基的产率进行制造。在一些方法中，所述抗体至少在位点Asn297被糖基化。

[0034]在一些方法中，所述重量恒定区包含CH1、铰链区、CH2和CH3区。在一些方法中，所述重量恒定区进一步包含CH4区。

一些方法进一步包括纯化所述抗体并将所述抗体整合到诊断试剂盒中。

[0035]在一些方法中，所述融合蛋白在所述信号序列和所述第一免疫球蛋白链之间或者在间隔肽和第二免疫球蛋白链之间不含有来自宿主蛋白的肽片段。

附图说明

[0036]图1显示作为来自单套转录和翻译调控序列的单个转录和翻译单元表达的重链和轻链。

[0037]图2显示已组装好的具有间隔肽的抗体。

[0038]图3显示在体内或体外切割间隔肽之后留下完全组装好的抗体。

[0039]图4显示用于表达单链抗体的构建体。

[0040]图5显示确认四聚抗体表达的凝胶。

[0041]图6显示抗体二聚体与FcγRIIIA-LV的结合。

[0042]图7显示抗体与其抗原的结合。

定义

[0043]基本抗体结构单元已知为包括亚基的四聚体。每个四聚体具有两对相同的多肽链，每一对包括一条“轻”链(约25 kDa)和一条“重”链(约50～70kDa)。每条链的氨基端部分包括主要用于抗原识别的约100～110或者更多氨基酸的可变区。每条链的羧基端部分确定了主要用于效应子功能的恒定区。

[0044]轻链分类为κ或λ。重链分类为γ、μ、α、δ或ε，并定义所述抗体的同种型分别为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。所述轻链和重链再细分为可变区和恒定区(一般参见，Fundamental Immunology(Paul，W.，ed.，第二版Raven Press，N.Y.，1989)，第7章(以引用的方式整体引入用于所有各种目的)。

[0045]所述每条轻/重链对的可变区形成所述抗体的结合位点。因此，完整的抗体具有两个结合位点。除在双功能或双特异抗体中，所述两个结合位点是相同的。所有链均表现出由三个超变区域连结而成的相对保守的框架区域(FR)的相同常规结构，也称为互补决定区或CDR。所述来自每对的两条链的CDR通过所述框架区域而对齐，使之能与特异性表位结合。从N-端至C-端，轻链和重链均包括结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。所述重链恒定区再细分为CH1、铰链、CH2、CH3，并在某些情况下的CH4区域。每个结构域的氨基酸指认和氨基酸的编号是根据Kabat，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(National Institutes of Health，Bethesda，MD，1987 and 1991)的定义

[0046]完整抗体指上文所述的四聚体结构，具有完整长度的免疫球蛋白可变区和恒定区。所述在完整免疫球蛋白里的可变区是成熟的，意指它不含有免疫球蛋白信号序列。在此使用的术语“抗体”和“免疫球蛋白”是可相互替换的。完整抗体的结合片段，如Fab，也可指作抗体。

[0047]所述疏水氨基酸是met、ala、val、leu、ile，以及可选地为cys、phe、pro、trp和tyr。所述亲水氨基酸是arg、asn、asp、gln、glu、his、lys、ser和thr。

[0048]在两个实体间的特异性结合指至少10⁶、10⁷、10⁸、10⁹或10¹⁰ M^-1的亲和力。优选大于10⁸M^-1的亲和力。

[0049]所关心的本发明的抗体的靶包括生长因子受体(例如，FGFR、PDGFR、EGFR、NGFR和VEFR)及其配体。其他靶是G-蛋白受体并包括物质K受体、血管紧张素受体、α-和β-肾上腺素能受体、血清素受体、PAF受体。参见例如Gilman，Ann.Rev.Biochem.56：625-649(1987)。其他靶包括离子通道(例如，钙、钠、钾通道)，毒蕈碱受体，乙酰胆碱受体、GABA受体、谷氨酸受体和多巴胺受体(参见Harpold，5,401,629和US 5,436,128)。其他靶有粘连蛋白，诸如整联蛋白、选择蛋白和免疫球蛋白超级家族成员(参见Springer，Nature 346：425-433(1990).Osborn，Cell 62：3(1990)；Hynes，Cell 69：11(1992))。其他靶有细胞因子，诸如白细胞介素IL-1～IL-13，肿瘤坏死因子α&β，干扰素α、β和γ，肿瘤生长因子Beta(TGF-β)，集落刺激因子(CSF)和粒细胞单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)。参见Human Cytokines：Handbook for Basic&Clinical Research(Aggrawal et al.eds.，Blackwell Scientific，Boston，MA1991)。其他靶有荷尔蒙、酶，以及胞内和胞间信使，诸如腺苷酸环化酶、鸟苷酸环化酶和磷脂酶C。其他所关心的靶是白细胞抗原，诸如CD20和CD33。药物也可以是所关心的靶。靶分子可以是人类、哺乳动物或者细菌。其他靶有抗原，诸如来自微生物病原体包括病毒和病菌的蛋白、糖蛋白和糖类，和肿瘤。更多其他靶在US 4,366,241中描述。

[0050]“包含”一种或多种列明要素的组合物或方法也可包括其他没有具体列明的要素。

[0051]当将核酸置于与另一种核酸序列的功能性关系中时，所述核酸是可操作的相连的。例如，如果启动子或增强子增强编码序列的转录，则其与编码序列可操作的相连。可操作的相连指所连接的DNA序列通常是连续的，并且在需要将两个蛋白编码区域连接在一起时是连续的并处于读码框中。然而，因为增强子通常在远离启动子多至数千个或者更多碱基时起作用，所以一些多聚核苷酸元件可以是可操作相连但不是连续的。

[0052]如此处所使用，关于聚糖物种(species)，术语“主要地(predominantly)”或其变化形式诸如“所述主要的”或“其中是主要的”是指在糖蛋白经PNGase加工并释放出聚糖，经过诸如MALDI-TOFMS等质谱分析后，具有最高的总N-聚糖摩尔百分比(％)的聚糖物种。换言之，相比任何其他单独实体，以更多摩尔百分比存在的单独实体，诸如特定的糖型，是“主要的”。例如，如果组合物由40摩尔％的物种A，35摩尔％的物种B和25摩尔％的物种C组成，则所述组合物主要含有物种A。

[0053]本发明的抗体通常以基本纯净的形式与不需要的杂质包括宿主细胞中的可溶性蛋白分离。这意味着抗体通常为至少约50％w/w(重量/重量)纯。有时所述抗体为至少约80％w/w纯，更优选为至少90％或者约95％w/w纯。使用传统蛋白纯化技术，可以得到至少99％w/w纯的抗体。当在非还原条件下，抗体在凝胶中跑出单条带，在还原条件下，抗体跑出对应于组分免疫球蛋白重链和轻链的两条带，从而可将抗体纯化至基本同质。

[0054]此处使用的低等真核宿主细胞指任何常规地制造高甘露糖含量的N-聚糖的真核细胞，并因此意味着包括一些动物或植物细胞以及大多数典型的低等真核细胞，包括酵母和丝状真菌细胞。

[0055]如此处所使用，术语“N-聚糖”指N-连接寡糖，例如，一种通过天冬酰胺-N-乙酰葡萄糖胺键与多肽的天冬酰胺残基相连的寡糖。N-聚糖包括共有的Man₃GlcNAc₂五糖核(“Man”指甘露糖；“Glc”指葡萄糖；“Nac”指N-乙酰基；GlcNAc指N-乙酰葡萄糖胺)。N-聚糖之间不同之处在于附加在Man₃GlcNAc₂(“Man3”)核心结构上的含有外围糖的支链(分支)数目。根据其支链组成将N-聚糖进行分类(例如高甘露糖，复合体或杂交体)。“高甘露糖”型N-聚糖具有五个或更多的甘露糖残基。“复合体”型N-聚糖通常具有至少一个与“三甘露糖核心”的1，3甘露糖臂相连接的GlcNAc和至少一个与其1，6甘露糖臂相连接的GlcNAc。所述“三甘露糖核心”是具有Man3结构的五糖核心。复合N-聚糖也可以具有任选地经唾液酸或其衍生物(“NeuAc”，其中“Neu”指甘露糖胺丙酮酸，“Ac”指乙酰基)修饰的半服糖(“Gal”)残基。复合N-聚糖也可具有包含“平分”的GlcNAc和核心海藻糖(“fuc”)的链内取代。“杂交”聚糖通常具有至少一个在三甘露糖核心的1，3甘露糖臂末端的GlcNAc和至少一个在其1，6甘露糖臂上的零个或零个以上的甘露糖。

[0056]本发明中的间隔肽包含一个或多个用于将所述轻链和重链从本发明的表达融合蛋白上切割下来的蛋白水解位点。间隔肽也可包括肽连接物。所述连接物的一个功能是提供在本发明的融合蛋白内轻链和重链间的物理空间和柔韧性。可选地是，所述连接物还具有其他功能。例如，所述连接物能编码功能性分泌蛋白结构域。然而并非必须的是所述免疫球蛋白重链或轻链中的任一条与来自于其中表达了融合蛋白的宿主的蛋白质的肽序列融合。在所述融合蛋白的N-端存在的信号序列足以将所述融合蛋白靶向至合适的细胞位置以发生如下所述的加工和组装步骤。

具体实施方式

I综述

[0057]本发明提供了适用于在多种细胞类型中表达完整抗体的方法。虽然所述方法特别适用于在低等真核生物体中表达，但也可应用于在高等真核生物体和细菌中表达。本方法涉及在单启动子的控制下对编码单链抗体的核酸进行表达。所述单链抗体包括含有可变区和恒定区的免疫球蛋白轻链、间隔肽和含有可变区和恒定区的免疫球蛋白重链。所述间隔肽含有至少一个但通常为两个或更多个蛋白水解切割位点。虽然本发明的实现并不取决于对机理的理解，但据信由于在融合蛋白中的关联，所述重链和轻链以等摩尔比例表达至少部分上克服了先前在低等真核生物和细菌中获得完整抗体的组装中所遇到的困难。可在抗体的组装前、组装中或组装后通过蛋白水解切割移除所述间隔肽。不管何时移除，所述间隔肽不影响重链-轻链对或四聚体抗体的形成。如此表达和蛋白水解切割的最终产品是含有至少一对，优选为两对重链和轻链并且不含有大部分或者全部间隔子残基的抗体。

[0058]通过选择经过基因修饰的低等真核生物宿主细胞，也可实现合适的糖基化。由这些基因修饰宿主制造的抗体的显著优点在于由所述细胞制造的抗体具有一种主要的糖型并且不含有海藻糖(除非海藻糖被工程化到宿主中)。所述过程因此可得到具有许多理想的特点(诸如与在哺乳动物细胞中制造的抗体相似的功能和治疗活性)的抗体组合物，并且不具有在哺乳动物细胞培养中固有的低效率和昂贵成本，但还可具有某些潜在的优势性特征，诸如聚糖结构的一致性。

II单链抗体的组成部分

[0059]本发明的抗体初始表达为具有多个组成部分的融合蛋白。所述组成部分从N-端～C-端至少包括如下：信号序列、第一免疫球蛋白链、间隔肽和第二免疫球蛋白链。经任意地选择，所述轻链或重链中的任一条可被指定为所述第一链，而另一条则为第二链。所述信号序列指引所述融合蛋白沿途径从细胞质中进入细胞器中和/或穿过细胞膜(取决于所述生物体)。在原核生物中，信号序列指引所述融合蛋白穿过所述细胞膜至周质间隙，抗体将在其中形成。在真核细胞中，信号序列指引所述融合蛋白从所述细胞质中进入内质网以及高尔基体，通常随后从细胞中分泌而出。由于所述融合细胞沿该途径移动，它经过以下详细描述的多个蛋白水解加工步骤，糖基化和折叠步骤。

[0060]与所述信号序列相连的是由间隔肽隔开的第一和第二免疫球蛋白链。位于所述第一免疫球蛋白链的N-端侧的单信号序列用于指导包括所述免疫球蛋白重链和轻链的整个融合蛋白的细胞器靶向和/或分泌。因此，不必要也不希望在所述间隔肽和所述第二免疫球蛋白链之间具有第二信号序列。

[0061]所述轻链和重链均具有可变区和恒定区。所述可变区优选为完整的可变区，或者如果不完整的情况下，它们至少相互组合以足以提供与靶抗原的特异性结合。所述重链和轻链恒定区至少足以容许形成稳定的重链和轻链对(例如，Fab片段)。优选地，所述轻链恒定区足以形成重链和轻链对，而所述重链恒定区足以容许既可通过分子间二硫键和重链轻链恒定区的非共价结合形成轻链-重链对，也可形成含有两对重链和轻链的四聚体抗体，所述两对链通过各自的重链区的非共价和二硫键结合。优选为所述重链和轻链恒定区都是全长的。优选为所述抗体是具有效应子功能，诸如补体固定或抗体依赖性细胞毒性等的四聚抗体。所述效应子功能的性质取决于同种型。例如，人类同种型(isotopes)IgG1和IgG3具有补体活性，而同种型IgG2和IgG4没有。

[0062]通常，在所述融合蛋白的N-端的信号序列用以指引所述融合蛋白转录本(mRNA)至ER通过分泌途径进行进一步加工，即，通过高尔基体，并导出至细胞外。所述信号序列常常来自于与其中发生抗体表达的细胞相同的生物体。然而，这不是必需的。可以使用的信号序列的例子包括来自于如下分泌蛋白中的一种的信号序列：酿酒酵母(S.cerevisiae)α交配因子pre、曲霉α淀粉酶、曲霉葡萄糖淀粉酶(GLA)、人血清白蛋白(HSA)、K.lactis菊糖酶(INU)、酿酒酵母(S.cerevisiae)转化酶(INV)、毕赤巴斯德酵母(P.pastoris)KAR2、酿酒酵母放毒型毒素(S.cerevisiae killer toxin)pre(KILM)、毕赤巴斯德酵母(P.pastoris)磷酸酶I(PHOI)、酿酒酵母α交配因子prepro、毕赤巴斯德酵母(P.pastoris)α交配因子prepro KR和鸡溶菌酶(ChicLys)。通常在胞内加工中将所述信号序列从融合蛋白上切割掉。

[0063]所述免疫球蛋白重链和轻链可来自于任何类型的抗体。通常所述抗体是单克隆抗体，虽然多克隆抗体也可重组表达(参见例如US6,555,310)。所述可以表达的抗体的例子包括小鼠或鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体、联合抗体(veneered antibody)和人类抗体。嵌合抗体是通常由属于不同物种(参见例如Boyce et al.，Annals of Oncology 14：520-535(2003))的免疫球蛋白基因节段通过基因工程构建其轻链和重链基因的抗体。例如，来自小鼠单克隆抗体的基因可变(V)节段可与人类恒定(C)节段相连。典型的嵌合抗体因此是由所述来自于小鼠抗体的V或者抗原结合结构域和所述来自于人类抗体的C或效应子结构域构成的杂种蛋白。

[0064]人源化抗体具有基本来自于人类抗体(称为受体抗体)的可变区框架残基和基本来自于小鼠抗体的互补决定区，(称为供体免疫球蛋白)。参见Queen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：10029-10033(1989)和WO 90/07861、US 5,693,762、US 5,693,761、US 5,585,089、US 5,530,101和Winter，US 5,225,539。所述恒定区，如果存在，也基本上或者完全来自于人类免疫球蛋白。可通过常规杂交瘤方法，噬菌体展示(参见例如Dower et al.，WO 91/17271和McCafferty et al.，WO 92/01047)，使用具有人体免疫系统的转基因小鼠(Lonberg et al.，W093/12227(1993))，以及其他来源获得抗体。编码免疫球蛋白链的核酸可从制造抗体的杂交瘤或细胞系中获得，或者基于公开文献中的免疫球蛋白核酸或氨基酸序列获得。

[0065]所述轻链和重链由间隔肽隔开。所述肽将与所述信号序列相连的链的C-端与另一条链的N-端相连。所述间隔肽含有至少一个，优选为两个或两个以上的可被蛋白酶切割的蛋白水解切割位点，所述蛋白酶是独立于所述融合蛋白的分子。即，在本发明中，所述蛋白水解位点的切割是分子间反应而不是分子内反应。所述肽间隔子不含有可被所述融合蛋白，或尤其是其间隔肽组成部分所进行的分子内自催化机制切割的自加工切割位点。自加工切割位点的例子由de Felipe et al.，J.Biol.Chem.278，11441-11448(2003)所描述。如此的自切割位点在成熟前在诸如细胞器官靶向和抗体组装等其他加工步骤发生前切割所述肽间隔子。作为所述成熟前切割的结果，至少在低等真核生物中，相同的信号肽不能将所述两条免疫球蛋白链靶向于内质网以进行进一步的蛋白水解加工。

[0066]如果所述肽间隔子包含两个或以上的蛋白水解切割位点，所述蛋白水解切割位点可以是相同或者不同，以及由相同或者不同的蛋白酶切割。通常，如果所述肽间隔子包含两个或更多的蛋白水解切割位点，则所有位点均被相同的蛋白酶水解。然而，如果所述肽间隔子含有两个或更多被不同蛋白酶切割的蛋白水解切割位点，则所述不同的蛋白酶均为独立于所述融合蛋白的分子。即，所述蛋白水解切割位点中没有自切割蛋白水解切割位点。

[0067]可选地是，所述间隔肽包括一个或者多个串联的蛋白水解切割位点。作为另外一种选择，间隔肽可包括两侧是一对蛋白水解切割位点的连接物。所述蛋白水解位点经排列使得在这些位点的切割将所述重链和轻链从同一融合蛋白上分离，不再成为其组成部分，并作为独立的链释放。所述链被分离是指它们不再由肽键相连。然而，所述链可由重链和轻链之间的分子间二硫键和非共价键相连。优选为，所述蛋白水解切割位点经排列使之能将所述免疫球蛋白重链和轻链与大多数或者全部的间隔肽分离而不切割任何的免疫球蛋白残基。

[0068]蛋白水解切割位点的选择部分取决于宿主细胞的选择。在一些方法中，所述位点是被在理想的宿主细胞中天然存在的蛋白酶切割的位点。在其他方法中，所述蛋白水解切割位点是被通过基因工程引入理想的宿主细胞中的蛋白酶切割的位点。所述蛋白水解切割位点优选为经选择使得相同位点不存在于免疫球蛋白重链或轻链上。对于酵母宿主细胞优选的蛋白水解切割位点是蛋白酶Kex2p。该酶在氨基酸对KR的C-端侧切割。优选为，所述氨基酸对位于N-端侧之前并与之间隔一个或两个疏水残基诸如LV，或者亲水残基诸如RH或者KH。可选地是，也存在精氨酸残基，如在RLV中。融合蛋白的优选形式是信号序列-轻链-LVKR连接物RLVKR-重链。Kex2p切割发生在两个KR残基对之后。通过另一种蛋白酶的降解将LVKR残基除去留下分离的免疫球蛋白轻链和重链并且没有之间的间隔子残基。

[0069]除Kex2p之外，其他已知的内源性酵母蛋白水解酶包括：均位于后高尔基体上的Kex1p和Ste13p，位于液胞(溶酶体)中的Bp1Ip、CPYp和Pep4p。这些酶的切割序列之前已披露(JCB，1992，119：1459-1468；Yeast，1994，10：801-810；FEMS Microbiol.Lett，1995，130：221-229；Ann.Rev Genet.1984，18：233-270.)。当内源性Kex2p表达低时，在所述连接物的Kex2p位点中的任一者或两者之后加入EAEA(例如，LVKREAEA)提高了Kex2p和/或Ste13p的切割。在第二Kex2p位点之后，加入EAEA是特别有用的。可选地是，在可诱导的启动子的调控下，在宿主细胞中过表达来自于酿酒酵母菌(S.cerevisiae)或毕赤巴斯德酵母(P.pastoris)的Kex2p。

[0070]至于在哺乳动物宿主细胞内的体内切割，可以使用的蛋白水解切割位点和酶可包括：细胞因子Xa、凝血酶、信号肽酶I和弗林蛋白酶。这些蛋白水解酶在本领域中公知。

[0071]除这些蛋白水解切割位点之外，所述间隔肽的组成并非关键。如果所述间隔肽不止包含所述蛋白水解切割位点，并包含连接物，则各种适用于单链抗体表达的连接物及其设计原理在本领域中公知(见Huston et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85 5879-5883(1988)；Bird et al.，Science 242，423-426(1988)；US 4,946,778，US 5,132,405和US 5,482,858，US 5,258,498)。一般而言，所述连接物应当具有足够的长度和柔性使相同融合蛋白的重链和轻链可分子内结合或者不同融合蛋白的重链和轻链可分子间结合。甘氨酸和/或丝氨酸尤其适用于包含在连接物中。适合的长度为约0～100个氨基酸。15个氨基酸或更长的总间隔肽长度(包括蛋白水解切割位点)有利于重链和轻链的分子内键合。较短的间隔肽有利于分子间键合。合适的连接物的一个例子是紧接在C-端蛋白水解切割位点之前的重复16次的四个甘氨酸(G)和一个丝氨酸(S)的基序，并紧接有脯氨酸(P)和再五个甘氨酸残基[(GGGGS)₁₆PGGGGG]。具有四方环结构的脯氨酸为柔性的甘氨酸连接物提供了稳定的铰链样结构。柔性连接物的另一个例子是至少三个单元的gly、Ser的重复[例如GSGSGS]。作为再一种选择，所述间隔子可具有串联的蛋白水解切割位点链(例如5～30个Kex2位点)。

[0072]除上述组成部分之外，所述肽间隔子可包括分泌蛋白结构域。所述分泌蛋白结构域可能至少扮演两个角色。首先，它能增强和/或促进下游链的分泌和组装。其次，在低等真核生物宿主中，该分泌蛋白结构域可用于使O-糖基化酶饱和，从而减少在表达的重链和轻链中存在的非人类O-糖基化的程度。

[0073]然而，对于所述免疫球蛋白重链或轻链，并非必须与来自其中将表达融合蛋白的宿主的蛋白的肽序列融合。在所述融合蛋白的N-端存在所述信号序列足以将所述融合蛋白靶向于恰当的细胞部位以进行如下描述的加工和组装步骤。因此，例如，所述信号序列可直接与所述第一免疫球蛋白链融合而其间没有氨基酸，所述间隔肽可直接与所述第二免疫球蛋白链融合，并且所述间隔肽自身可不包含任何来自宿主蛋白的肽序列。

[0074]所述融合蛋白的再一个可选的组成部分是肽标记，以协助所述融合蛋白或者其经加工所得的抗体的鉴别或纯化。如此的标记可位于第一免疫球蛋白链的N-端，在所述间隔肽的内部或者与所述间隔肽的一端相连，或者可位于所述第二免疫球蛋白链的C-端。标记的例子有FLAG^TM系统(柯达)。所述FLAG^TM分子标记由与所述靶结合部分相连接的八氨基酸FLAG肽标记构成。抗体适合于与所述FLAG肽标记一起使用。另一个例子是能与金属螯合配体结合的多组氨酸标记(参见Hochuliin Genetic Engineering：Principles and Methods(ed.JK Setlow，PlenumPress，NY)，Ch.18，pp.87-96和maltose binding protein(Maina，et al.，Gene74：365-373(1988))。多种其他肽标记广为人知并可容易地获得。

III编码所述融合蛋白的核酸

[0075]上述融合蛋白由核酸编码。所述核酸可以是DNA或者RNA，优选为DNA。所述编码融合蛋白的核酸可操作地与调控序列相连，所述调控序列允许融合蛋白的表达。这样的调控序列包含启动子以及可选的位于所述编码融合蛋白的核酸的上游，或5’的增强子，以及位于所述编码融合蛋白的核酸的3’，或下游的转录终止位点。所述核酸也通常编码具有核糖体结合位点的5’UTR区域和3’未翻译区域。所述核酸通常为在其中表达所述抗体的细胞中可复制的载体的组成部分。所述载体也可含有能识别转化细胞的标记。然而，一些细胞类型，尤其是酵母可成功地用不含有外来载体序列的核酸转化。

[0076]编码免疫球蛋白轻链和重链的核酸可由数个来源获得。cDNA序列可使用针对保守区的引物从表达抗体的杂交瘤或其他细胞系扩增(参见例如Marks et al.，J.Mol.Biol.581-596(1991))。核酸也可根据在科学文献中的序列从头进行合成。核酸也可以通过跨越想要的序列的重叠寡聚核苷酸的延长而合成(参见例如Caldas et al.，ProteinEngineering，13，353-360(2000))。

IV 宿主细胞

[0077]由于低等真核生物可经济地培养，产率高，并且当适宜的修饰时能进行适当的糖基化，因此低等真核生物优选用于抗体的表达。酵母和丝状真菌特别提供了确定的遗传学，使得可以进行快速转化、经测试的蛋白定位策略和容易的基因敲除技术。合适的载体具有表达控制序列，诸如启动子，包括3-磷酸甘油酸酯激酶或其他糖酵解酶，以及复制起点，终止序列等，如果需要的话。载体也可包括位于本发明的编码融合蛋白的核酸两侧的片段，所述片段能与宿主染色体的选定区域重组，从而将核酸靶向于有助于表达的染色体位置。

[0078]各种酵母诸如：毕赤巴斯德酵母(Pichia pastoris)、芬兰毕赤酵母(Pichia finlandica)、Pichia trehalophila、Pichia koclamae、膜醭毕赤氏酵母(Pichia membranaefaciens)、Pichia minuta(Ogataeaminuta、Pichia lindneri)、Pichia opuntiae、Pichia thermotolerans、Pichiasalictaria、Pichia guercuum、Pichia pijperi、Pichia stiptis、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、毕赤属物种(Pichia sp.)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、酵母属物种(Saccharomyces sp.)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、克鲁维酵母属物种(Kluyveromycessp.)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、白色念珠菌(Candidaalbicans)优选用于细胞培养，这是因为它们能生长至高细胞密度并分泌大量重组蛋白。同样，丝状真菌，诸如构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉菌(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、Chrysosporium lucknowense、镰刀菌(Fusariumsp.)、Fusarium grammeum、镰孢霉(Fusarium venenatum)和粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)(参见例如US 5,364,770，EP 214,914和WO90/15860)及其他能用于以工业规模制造本发明的糖基化抗体。

[0079]低等真核生物，尤其是酵母和丝状真菌能被基因修饰，从而使得它们表达的抗体(或其他蛋白)其中的糖基化模式是类人的或者人源化的。这可通过除去选定的内源性糖基化酶和/或提供外源性酶而实现，如Gerngross et al.，US 20040018590；Hamilton et al，2003，Science，301：1244-1246所述。例如，可选择或者工程化宿主细胞以耗竭α-1，6-甘露糖基转移酶活性，否则其将会把甘露糖残基加到糖蛋白的N-聚糖上。

[0080]可附加地或者作为另外的选择，将如此的宿主细胞经工程化以表达一种或多种能进行活体内复杂糖类结构(及其合成中间体)制造的酶。例如通过通常不与所述酶相连的信号肽等方法，所述酶可靶向于宿主亚细胞器，其中所述酶具有最佳活性。所述宿主细胞也可经修饰以表达糖核苷酸运输体和/或核苷酸二磷酸酶。通过在适当的区室中为糖基化酶提供合适的底物，降低竞争性产品抑制和促进核苷酸二磷酸酶的移除，所述运输体和二磷酸酶提高了工程化糖基化步骤的效率。

[0081]这些工程化宿主细胞的又一优点在于它们能用于制造主要具有一种糖型结构的抗体组合物，所述糖型结构不含有海藻糖，除非海藻糖被特意地经工程化加入。与其他糖蛋白中的糖基化的角色类似，所述抗体的寡糖侧链影响该糖蛋白的功能。例如，已显示具有降低的海藻糖化N-连接聚糖的抗体组合物能提高与人类FcγRIII的结合并因此提高抗体依赖性细胞毒性(ADCC)(Shields et al.，2002，J.Biol Chem，277：26733-26740；Shinkawa et al，2003，J.Biol.Chem.278：3466-3473)。在CHO细胞中制造的海藻糖化G2(Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂)IgGs的同质形式提高CDC活性至超过异质抗体的程度(Raju，2004，US Pat.Appl.No.2004/0136986)

[0082]本发明的方法在合适地工程化低的级真核生物宿主细胞中的实施形成占主要部分的同质糖型。即，由这样的细胞制造的抗体在相应的N-糖基化位点具有主要的N-聚糖结构。此外，在本发明中披露的酵母和丝状真菌宿主中制造的聚糖天然地缺乏海藻糖。因此，本发明的工程化宿主细胞能够制造抗体，所述抗体具有以一种糖型结构为主并缺少海藻糖的复杂N-聚糖(除非海藻糖被特意地经工程化加入)。在一个具体实施方式中，本发明提供了通过本发明的方法制造的抗体组合物，所述抗体组合物包含一种主要的聚糖结构，其中所述主要的聚糖结构以比所述抗体组合物的第二主要的聚糖结构多至少约5摩尔百分数的水平存在。

[0083]在另一个实施方式中，本发明提供了通过本发明的方法制造的抗体组合物，所述抗体组合物包含一种主要的聚糖结构，其中所述主要的聚糖结构以比所述抗体组合物的第二主要的聚糖结构多至少约10～25摩尔百分数的水平存在。

[0084]在另一个实施方式中，本发明提供了通过本发明的方法制造的抗体组合物，所述抗体组合物包含一种主要的聚糖结构，其中所述主要的聚糖结构以比所述抗体组合物的第二主要的聚糖结构多至少约25～50摩尔百分数的水平存在。

[0085]在另一个实施方式中，本发明提供了通过本发明的方法制造的抗体组合物，所述抗体组合物主要包含一种聚糖结构，其中所述主要的聚糖结构以比所述抗体组合物的第二主要的聚糖结构多至少约50摩尔百分数的水平存在。

[0086]可用于表达抗体的原核宿主包括E.Coli，杆菌如枯草杆菌和其他肠细菌如沙门氏菌、沙雷氏菌和各种假单胞菌物种。在培养容易性方面，原核生物具有低等真核生物的一些优点，但其不能进行适当的糖基化。在原核生物宿主中，也可以制造表达载体，其通常含有与宿主细胞相容的表达调控序列(例如，复制起点)。此外，存在大量已知的启动子，诸如乳糖启动子系统，色氨酸(trp)启动子系统，β-内酰胺酶启动子系统或者源自噬菌体λ的启动子系统。可选地与操纵子序列一起，所述启动子通常调控表达，并且具有核糖体结合位点序列等以引发和完成转录和翻译。

[0087]植物和植物细胞培养物可用于本发明的抗体的表达(Larrick&Fry，Hum.Antibodies Hybridomas 2(4)：172-89(1991)；Benvenuto et al.，Plant Mol.Biol.17(4)：865-74(1991)；Durin et al.，Plant Mol.Biol.15(2)：281-93(1990)；Hiatt et al，Nature 342：76-8(1989))。优选的植物宿主包括例如：拟南芥(Arabidopsis)、烟草(Nicotiana tabacum)、黄花烟草(Nicotiana rustica)和马铃薯(Solanum tuberosum)。

[0088]昆虫细胞培养物也可用于制造本发明的抗体，通常使用基于杆状病毒的表达系统(参见Putlitz et al.，Bio/Technology 8：651-654(1990))。

[0089]虽然在培养方面不如低等真核生物和原核生物经济，但是哺乳动物组织细胞培养物也可用于表达和制造本发明的多肽(参见Winnacker，From Genes to Clones(VCH Publishers，NY，1987)。合适的宿主包括CHO细胞系、各种COS细胞系、Hela细胞，优选骨髓瘤细胞系等，或者转化的B-细胞或者杂交瘤。用于这些细胞的表达载体包括表达调控序列，诸如复制起始点、一个或多个启动子、一个或多个增强子(Queen et al.，Immunol.Rev.89：49-68(1986))，以及必需的加工信息位点，诸如核糖体结合位点、RNA拼接位点、聚腺苷酸化位点，和转录终止序列。表达调控序列可以是源自免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳头状瘤病毒、巨细胞病毒等的启动子。优选的启动子可以是组成型的或可诱导型的。通常，可选择的标记，诸如neoR表达盒，包括在所述表达载体中。

[0090]所述编码被表达的免疫球蛋白链的核酸可通过常规方法转移进入宿主细胞，其取决于细胞宿主类型而有所不同。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理、原生质体融合、天然杂交、脂质转染法、生物射弹法(biolistics)、基于病毒的转导或者电穿孔等可用于其他细胞宿主。钨颗粒冲击基因转移优选用于植物细胞和组织(参见，一般地，Maniatis et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold SpringHarbor Press，1982)，在此以参考的方式出于各种目的全文引入)。优选地，将核酸作为游离基因，或者整合到宿主细胞的基因组中从而稳定地保持在宿主细胞中。

[0091]一旦已表达，本发明的抗体可依照本领域的标准方法进行纯化，包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱色谱、凝胶电泳等(参见一般地，Scopes，R.，Protein Purification(Springer-Verlag，N.Y.，1982)，在此以参考的方式出于各种目的全文引入)。优选具有至少约90％～95％同质性的，最优选98％～99％或以上的同质性的基本上纯的免疫球蛋白用于药物应用。一旦如所需地被纯化，部分地或纯化至均质，所述多肽随即可被治疗性地使用(包括体外性地)或者用于发展和进行化验过程，荧光免疫染色等。(参见，一般地，Immunological Methods，Vols.I and II(Lefkovitsand Pernis，eds.，Academic Press，NY，1979 and 1981)。

V 抗体表达、加工、组装和分泌

[0092]编码含有信号序列、免疫球蛋白轻链、间隔肽和免疫球蛋白重链的融合蛋白的核酸起始表达为所述融合蛋白。所述融合蛋白随即经过一系列的加工和折叠事件以制造含有重链轻链对的抗体，其中所述链是分子间而不是分子内相结合。这些事件可包括由所述信号序列介导的将所述融合蛋白靶向于细胞器和/或从宿主分泌，所述信号序列的加工，免疫球蛋白重链和轻链的分子内或分子间结合以形成异源二聚体对，两个异二聚体配对形成四聚体，二硫键的形成，糖基化，和在间隔肽中的蛋白水解位点处的切割，从而使得所述重链和轻链不再是相同肽链的组成部分。这些事件的顺序和精确性质可依培养条件，所述构建体的性质、信号序列、间隔肽和宿主细胞而变化。实施本发明并不要求对机理的理解。

[0093]图2显示在所述融合蛋白的翻译后修饰的一种可能序列中的中间体。该图显示通过两个融合蛋白相结合形成的四聚体抗体。在每个融合蛋白中，所述免疫球蛋白轻链和重链通过所述轻链和重链的可变区间的非共价键和恒定区间的二硫键从而分子内结合。这两个融合蛋白通过各自重链的Fc区之间的非共价和二硫键相互作用而保持在一起。在两个融合蛋白中，重链恒定区的残基Asn297被糖基化。图3显示在间隔肽蛋白水解位点切割后的同一蛋白。所述四聚抗体的构象没有变化，除曾经为相同融合蛋白的一部分并且分子间相结合的重链和轻链现在则为分开的链并且分子间相结合。任何仍与抗体相连的间隔肽，如果有的话，其长度取决于所述切割位点在间隔肽上的位置，以及任何外肽酶对降解任何残留间隔肽的作用。已发现侧翼是Kex2p位点LVKR和RLVKR的连接物在R残基之后由Kex2p切割而移除，随后，外蛋白酶活性移除第一(N-端)蛋白水解切割的LVKR，从而得到不含有间隔肽残基的基本同质的抗体产品。在所述抗体产品的异质性的范围内，通过进一步在体外进行的切割和/或疏水作用色谱(HIC)和阳离子交换色谱(参见实施例3)，可将所需形式的抗体与其他切割产品分离。

[0094]虽然蛋白水解位点的切割优选在体内发生，但其也可在体外进行。抗体从宿主细胞中分泌或者释放，并经已知的蛋白酶加工以切割所述蛋白水解位点。可以使用多个蛋白水解位点。除在宿主细胞中发现的蛋白水解位点之外，其他蛋白水解位点也可引入到所述融合蛋白构建体中。或者可以通过将蛋白水解酶引入到宿主细胞中进行体内切割，或者通过表达并纯化所述未切割的融合蛋白并在体外反应中切割所述连接物区域，从而切割这些位点。所以已经披露的可在体内作用的蛋白水解酶都可经纯化或者购买而用在体外切割反应中。

[0095]对于体外Kex2p切割，首先将Kex2p纯化(PNAS，1992，89：922-926)，然后如所述将Kex2p和蛋白A-纯化的未切割抗体(实施例X)温育(JBC，1995，270：3154-3159)。在该体外切割之后，进行第二蛋白A色谱以将所述重链和轻链与Kex2p蛋白分离。

[0096]通常，所述信号序列导致与该信号序列融合的蛋白从宿主细胞中分泌。如果没有分泌，则可以通过诱发胞解从宿主细胞中释放抗体。可以通过超声波处理、冷冻-解冻循环或者用溶菌酶处理以及其他方法诱发胞解。

VII变体

如上述讨论，用于切割间隔肽中的蛋白水解位点的蛋白酶可天然存在于细胞中，外来提供至细胞中或者体外提供。在变体中，通过选择合适的信号肽可将所述蛋白酶靶向于分泌途径中的细胞器。所述靶向可通过对与蛋白酶相连的信号肽的选择而实现。所述靶向既可用于在宿主细胞中天然发现的蛋白酶(例如酵母细胞中的Kex2p)，也可用于外来提供的蛋白酶。靶向影响蛋白水解切割相对于其他加工步骤的发生时间。例如，如果蛋白酶靶向于分泌途径的较早细胞器，那么蛋白水解加工相对于融合蛋白的折叠而更早发生。在该情况下，蛋白水解加工更可能完成。例如，在天然酵母细胞中，大多数Kex2p加工发生在后高尔基体(lateGolgi)。在融合蛋白达到所述后高尔基体时，抗体组装基本上完成。通过表达更多的与ER-靶向肽相连的Kex2p，将Kex2p在内质网中表达。在该情况下，所述蛋白水解切割位点在显著的抗体折叠发生之前进行，从而获得更有效的切割。

[0098]通过本发明的方法制造的抗体的产率优选为至少50mg/升培养基，更优选为至少100mg/l，500mg/L，1g/L或2g/L培养基。

VIII药物组合物

[0099]本发明的抗体可加入到药物组合物中，所述药物组合物包含所述抗体作为活性治疗试剂以及多种其他可药用成分。参见Remington′s Pharmaceutical Science(15th ed.，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania，1980)。优选形式取决于预期的给药模式和治疗应用。根据所需配方，所述组合物也可包括可药用非毒性载体或稀释剂，其被定义为通常用于配制动物或人类施用的药物组合物的赋形剂。选择所述稀释剂使之不影响所述组合的生物活性。所述稀释剂的例子有蒸馏水、生理磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和汉克氏溶液。此外，所述药物组合物或制剂也可包括其他载体、佐剂，或者非毒性、非治疗性、非免疫原性稳定剂等。

[0100]用于肠胃外给药的药物组合物无菌，基本等张，不含有热原质，并依照FDA或者类似实体的GMP进行制备。抗体可以以可注射剂量的所述物质与药用载体在生理可接受的稀释剂中的溶液或悬浮液施用，所述药用载体可以是无菌液体如水、油、盐水、甘油或乙醇。此外，辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、表面活性剂、pH缓冲物质等也可存在于组合物中。药物组合物的其他成分有来自石油、动物、蔬菜或合成来源的成分，例如花生油、大豆油和矿物油。通常，诸如丙二醇或聚乙二醇等二醇优选为液体载体，尤其是用于可注射溶液。抗体可以以储库注射或植入制剂的形式施用，可配制所述制剂使之能持续释放活性成分。通常，将组合物制备为可注射剂，或者是液体溶液或者是悬浮液；也可制备适合于在注射前溶解在或者悬浮在液体载体中的固体形式。正如上文中所讨论，所述制剂也可以乳化或者封装在脂质体或微粒如聚交酯、聚乙交酯或共聚物中以增强辅助效果(参见Langer，Science 249，1527(1990)和Hanes，Advanced Drug Delivery Reviews 28，97-119(1997).

XI诊断产品

[0101]本发明的抗体也可加入到多种诊断试剂盒以及其他诊断产品如阵列中。通常抗体被提供为与固相如微量滴定盘的小孔预先结合的形式。试剂盒也通常含有用于检测抗体结合的试剂，以及提供所述试剂盒使用指南的标签。免疫测量或者夹心式分析是诊断试剂盒的优选形式(参见US 4,376,110，4,486,530，5,914,241和5,965,375)。抗体阵列通过例如US 5,922,615，US 5,458,852，US 6,019,944和US 6,143,576描述。

实施例

1.融合蛋白和对其编码的核酸的设计

[0102]用于表达抗体anti-DX的融合蛋白设计如下：

MVAWWSLFLYGLQVAAPALA[SEQ ID NO：l]成熟轻链

LVKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGASGGGGSGGGGS

GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSPGGGGGRLVKR[SEQ ID NO:2]

成熟重链

[0103]α-淀粉酶信号序列以斜体表示。在成熟轻链和重链间的间隔肽以下划线表示。编码所述信号序列的DNA序列是：

ATG GTC GCTTGG TGG TCT TTG TTT CTG TAC GGT CTT CAG GTC GCT GCA CCT

GCT TTG GCT[SEQ ID NO：3]

[0104]编码所述连接物的DNA序列是

ttggttaagagaGGTGGAGGTGGATCTGGTGGAGGTGGTTCCGGTGGAGGTGGATCTGG

TGGAGGTGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGT

TCTGGTGGTGGTGCTAGCGGTGGTGGTGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCGGTGGTG

GTGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCCGG

TGGTGGTGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCTCCAGGTGGTGGTGGTGGTagattggttaagaga

[SEQ IDNO：4]

[0105]编码所述anti-DX抗体的轻链可变区的DNA由PCR重叠合成并在所述第一免疫球蛋白链的上游加入Mly1位点。编码IgG1的轻链恒定区的DNA从GeneArt Inc.订购。编码整条轻链的DNA通过PCR重叠延长而制备并克隆入pCR2.1 topo载体。整条轻链在5’端具有Mly1位点以及终止密码子3’的Not1位点。编码整个轻链的DNA与编码α-淀粉酶信号序列的DNA相连接进入pPICZA载体。所述α-淀粉酶信号序列由重叠寡聚核苷酸合成。所述信号序列在ATG之前具有Kozak序列，并且也在5’末端具有EcoR1位点。用EcoR1和Not1消化pPICZA。所述o-淀粉酶信号序列具有悬挂于5’和3’端的EcoR1位点，所述末端均为平末端。所述轻片段被Mly1和Not1由pCR2.1 topo载体消化，然后这三片连接在一起。所得质粒为pDX398。

[0106]采用重叠寡聚核苷酸合成了编码所述anti-DX抗体的重链和轻链可变区的DNA。编码IgG1的重链恒定区的DNA从GeneArt Inc.订购。编码完整重链的DNA通过重叠PCR而制备并克隆入pCR2.1 topo载体，生成质粒pDX344。

[0107]所述载体pPICZA被EcoR1和Not1切断。含有所述α-淀粉酶信号序列的轻链片段由EcoR1和Sph1所消化，其位于所述轻链恒定区末端。包含部分轻链恒定区的连接物通过重叠寡聚核苷酸而合成，在5’端寡聚核苷酸中含有一个Sph1位点。带有重链的质粒pCR2.1 topo经Mly1和Not1消化并从琼脂糖胶中回收带。将四条片段连接给出如图4所示的载体。

[0108]质粒pDX560经Pme1线性化，并且转化进入多个毕赤巴斯德酵母(Pichia pastoris)株中-例如用α-甘露糖苷酶I、II、N-乙酰基葡萄糖胺转移酶I、II和半乳糖基转移酶，在不含有α-1，6甘露糖转移酶(Δochl)(Choi et al，2003，100：5022-5027)、甘露糖磷酸(Δpnol、Δmnn4b)(美国专利申请第11/020808号)和α-甘露糖酶抗性2(Δamr2)基因(美国专利申请第60/566736号和第60/620186号)的背景下，转化的菌株YAS306(Gerngross et al.，US 20040018590；Hamilton et al.，Nature，2003，301：1244-1246)。

2.毕赤巴斯德酵母(P.pastoris)菌株-例如YAS306的培养条件

[0109]将含有质粒pDX560的新鲜YAS306菌落接种到10毫升缓冲甘油复合培养基上(BMGY)并生长两天，所述培养基由1％酵母提取物、2％蛋白胨、100mM磷酸钾缓冲剂(pH6.5)、1.34％酵母氮基、4×10^-5％生物素和1％甘油构成。随之将所述培养物转移到在1升烧瓶中的100ml新鲜BMGY中1天。然后将该培养物离心并用BMMY(buffered minimalmethanol：除使用0.5％甲醇替代1％甘油之外，与BMGY相同)清洗细胞球。将所述细胞球再次悬浮在BMMY中至起始BMGY培养物体积的1/5，然后放置在1.5升发酵反应器中24小时。通过离心将生物物质粒化并转移培养基至干净的试管中从而收获分泌的蛋白。含有所述分泌抗体的上清液被收集以进行纯化。

3.融合蛋白的纯化。

[0110]使用streamline蛋白A柱从培养上清液中俘获单克隆抗体。在Tris-甘氨酸pH3.5中洗提抗体并用1M Tris pH8.0进行中和。采用疏水作用色谱(HIC)进行进一步的纯化。HIC柱的具体类型取决于所述抗体。对于anti-DX抗体，使用苯基琼脂糖柱和20mM Tris(7.0)，1M(NH₄)₂SO₄缓冲液，并用1M～0M(NH₄)₂SO₄的线性梯度缓冲液洗提。得自所述苯基琼脂糖柱的抗体级分被收集并交换到50mM NaOAc/TrispH5.2缓冲液中以通过阳离子交换(SP Sepharose Fast Flow)(GEHealthcare)柱进行最终的纯化。用50mM Tris，1M NaCl(pH7.0)的线性梯度洗提抗体。

[0111]图5是考马斯蓝非还原SDS-PAGE凝胶，显示了正如对于重链和轻链的四聚组装体所预期的，以约150 kDa迁移的重链和轻链。(Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Chapter14，1998；Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，Academic PressLimited，1996)。泳道1显示商业制备的IgG对照，泳道2显示采用用于重组抗体制造的传统方法在毕赤巴斯德酵母(P.pastoris)中制造的DX-IgG，其中所述重链和轻链的表达由不同的启动子驱动，以及泳道3显示根据本发明的单启动子方法在毕赤巴斯德酵母(P.pastoris)中制造的SC-DX-IgG。

[0112]从Bio-Rad Laboratories购买SDS-PAGE Tris-HCl胶(4-20％梯度和15％)，以及分子量标记Bio-Rad预染色SDS-PAGE宽范围分子量标准(Bio-Rad Prestained SDS-PAGE Broad Range Molecular WeightStandards)。考马斯蓝蛋白染色剂购自Bio-Rad。

[0113]根据已知方法(Nature，227，680，1970)，如在上述实施例中所披露的，制造20μg的anti-DX抗体并纯化，然后经SDS-PAGE分析分子量和纯化度。如在图5中所示，在非还原条件下存在分子量约150 kDa的单条带。该分子量与报道相吻合，所述报道指出IgG抗体在非还原条件下具有约150kDa的分子量，并在还原条件下由于分子中二硫键的切断分解为分子量约为50 kDa的重链和分子量约为25kDa的轻链(Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Chapter 14，1998；Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，Academic Press Limited，1996)。

4.抗原结合ELISA分析

[0114]在PBS，pH7.4中用10μg抗原涂覆高结合滴定板(Costar)，并在4℃温育过夜。除去缓冲液并加入阻断缓冲液(在PBS中的3％BSA)然后在室温下温育1小时。除去阻断缓冲液并用PBS清洗所述板三次。在最后一次清洗后，加入从0.2ng至100ng的量逐渐增加的纯化抗体并在室温下温育一小时。然后用PBS+0.05 Tween20清洗板。在最后一次清洗后，加入在1∶2000 PBS溶液中的anti-human Fc-HRP，然后在室温下温育一小时。然后用PBS-Tween20清洗板四次。按照制造商的说明(Pierce Biotechnology)使用TMB底物试剂盒对板进行分析。

5.Fc受体结合分析

[0115]根据之前描述的方案进行对于FcγRI、FcγRII、FcγRIII和FcγRn的Fc受体结合分析(JBC，2001，276：6591-6604)。对于FcγRIII结合：在PBS，pH7.4中的1ug/ml的FcγRIII融合蛋白在4℃下被涂覆到ELISA板上(Nalge-Nunc，Naperville，IL)48小时。用在PBS中的3％牛血清白蛋白(bovine serum albumin)(BSA)在25℃阻断板1小时。通过在25℃下混合2∶1摩尔量的anti-DX IgG和HRP-缀合的F(Ab′)2anti-F(Ab′)2一小时，制备在PBS中的1％BSA中的anti-DX IgG1二聚复合物。随后以1∶2在1％BSA/PBS中连续稀释二聚复合物，并在25℃下涂覆到板上1小时。所使用的底物是3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)(VectorLaboratories)。按照制造商的说明书(Vector Laboratories)读取在450nm的吸光度。图6对比了DX IgG与在毕赤巴斯德酵母(P.pastoris)中制造的SC DX IgG的结合。

6.抗体与ErbB2/Fc抗原的结合

[0016]在室温下用100μl/孔的在PBS中10ug/ml的重组人类ErbB2/Fc融合蛋白(R&D Systems)涂覆ELISA板(Coming Costar)2小时。吸掉上清液并加入250μl/孔的在PBS中的3％牛血清白蛋白(bovineserum albumm)(Sigma)并温育1小时。在PBS中，将抗体稀释在1％BSA中并在吸掉阻断溶液后加入100μl/孔；抗体溶液温育1小时。随后用250μl/孔的PBS和0.5％Tween-20清洗板三次。100μl/孔的HRP-缀合的anti-FAB抗体(Sigma)在PBS中的1％BSA中稀释1∶1000并温育1小时。如上所述对板进行清洗并加入100μl/孔的3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(Sigma)。当出现蓝色后，用1M H₂SO₄终止反应并读取450nm下的吸光度。图7对比了DX IgG和SC-DX IgG，两者均在毕赤巴斯德酵母(P.pastoris)中制造。

[0117]虽然为便于理解的目的对前述发明进行了详细描述，但对本领域技术人员显而易见的是，在所附权利要求所限定的本发明的范围内可实施某些修改。所有在此处引用的出版物和专利文献为所有目的以引用的方式在此全文引入，如同每份被单独指明一样。除非另外从上下文中是显而易见的，本发明的每一个实施方式、特征、方面、要素或步骤可与任何其他的实施方式、特征、方面、要素或步骤组合使用。

Claims

1.一种制造抗体的方法，所述方法包括：

培养经过编码融合蛋白的核酸转化的真菌细胞，所述融合蛋白从N-端至C-端依次包含：(a)信号序列，(b)含有可变区和恒定区的第一免疫球蛋白链，(c)含有可被蛋白酶切割的蛋白水解切割位点的间隔肽，所述蛋白酶是独立于所述融合蛋白的分子，以及(d)含有可变区和恒定区的第二免疫球蛋白链；其中，所述第一免疫球蛋白链是轻链，而第二免疫球蛋白链是重链，或者反过来；所述融合蛋白在所述间隔肽和所述第二免疫球蛋白链之间没有第二信号序列；并且所述间隔肽没有自加工切割位点；

其中所述融合蛋白被表达，在信号序列的C-端末端被切割以移除所述信号序列，并在所述间隔肽的蛋白水解位点被蛋白酶切割；以及

制造了含有分子间结合的免疫球蛋白重链和轻链对的抗体。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述抗体是包含两对分子间结合的免疫球蛋白重链和轻链的四聚抗体。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述第一免疫球蛋白链是轻链而第二免疫球蛋白链是重链。

4.如权利要求2所述的方法，其中所述第一免疫球蛋白链是重链而第二免疫球蛋白链是轻链。

5.如权利要求2所述的方法，其中在所述蛋白水解位点发生切割之前，所述融合蛋白的轻链和重链通过分子内键合而相互结合，两个融合蛋白拷贝通过其各自重链恒定区的分子间键合而相互结合。

6.如权利要求2所述的方法，其中在所述蛋白水解位点发生切割之后，所述免疫球蛋白重链和轻链发生分子间结合以形成所述分子间结合的重链和轻链对，并在两对分子间结合的重链和轻链之间发生分子间结合形成所述四聚体抗体。

7.如权利要求2所述的方法，其中所述间隔肽含有可被第一和第二蛋白酶切割的第一和第二蛋白水解位点，两种蛋白酶是独立于所述融合蛋白的分子，其中所述第一和第二蛋白水解切割位点被连接肽所分隔，并且所述第一和第二蛋白酶对所述蛋白水解切割位点的切割从所述融合蛋白中移除了所述连接肽。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述第一和第二蛋白酶是相同的蛋白酶。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述第一和第二蛋白水解位点的切割在细胞内发生。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述细胞分泌所述抗体。

11.如权利要求8所述的方法，其中所述细胞经过编码切割所述第一和第二蛋白水解位点的蛋白酶的核酸的转化。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述核酸编码第二融合蛋白，所述第二融合蛋白含有与所述蛋白酶融合的第二信号序列，其中所述第二信号序列使所述蛋白酶被摄取进入内质网。

13.如权利要求1所述的方法，其中所述融合蛋白从细胞中分泌而不包含信号序列，并且所述方法进一步包括使用在间隔肽的蛋白水解位点进行切割的蛋白酶处理所述分泌的融合蛋白。

14.如权利要求1所述的方法，进一步包括从所述细胞中或者从培养细胞的培养基中回收所述抗体。

15.如权利要求14所述的方法，进一步包括纯化所述抗体至基本同质。

16.如权利要求15所述的方法，进一步包括在药物组合物中将所述抗体与可药用载体相结合。

17.如权利要求1所述的方法，进一步包括将编码所述融合蛋白的核酸引入细胞。

18.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞是丝状真菌细胞。

19.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞是酵母细胞。

20.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞选自由来源于毕赤巴斯德酵母(Pichiapastoris)、芬兰毕赤酵母(Pichia finlandica)、Pichiatrehalophila、Pichia koclamae、膜醭毕赤氏酵母(Pichiamembranaefaciens)、Pichia minuta(Ogataea minuta、Pichia lindneri)、Pichia opuntiae、Pichia thermotolerans、Pichia salictaria、Pichiaguercuum、Pichia pijperi、Pichia stiptis、甲醇毕赤酵母(Pichiamethanolica)、毕赤属物种、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、酵母属物种(Saccharomyces sp.)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、克鲁维酵母属物种(Kluyveromyces sp.)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、Candida albicans、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉菌(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、Chrysosporium lucknowense、镰刀菌属物种(Fusarium sp.)、Fusarium gramineum、镰孢霉(Fusariumvenenatum)和粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)的细胞构成的组。

21.如权利要求10所述的方法，其中所述蛋白水解切割位点是Kex2p位点。

22.如权利要求21所述的方法，其中所述蛋白水解切割位点具有氨基酸序列XXKR，其中X是任何氨基酸。

23.如权利要求21所述的方法，其中所述蛋白水解切割位点具有氨基酸序列XXKR，其中所述X是选自由met、ala、val、leu、ile、cys、phe、pro、trp和tyr构成的组的疏水氨基酸，或者是选自由arg、asn、asp、gln、glu、his、lys、ser和thr构成的组的亲水氨基酸。

24.如权利要求23所述的方法，其中所述间隔肽包含具有氨基酸序列LVKR的N-端蛋白水解切割位点和具有氨基酸序列RLVKR的C-端蛋白水解切割位点。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述抗体不含有所述间隔肽的任何残基。

26.如权利要求2所述的方法，其中所述四聚抗体具有效应子功能。

27.如权利要求26所述的方法，其中所述效应子功能是补体固定或者抗体依赖性细胞毒性。

28.如权利要求1所述的方法，其中所述免疫球蛋白轻链和重链是人源化的免疫球蛋白轻链和重链。

29.如权利要求1所述的方法，其中所述抗体以至少50mg/升培养基的产率进行制造。

30.如权利要求1所述的方法，其中所述糖基化至少位于位点Asn297。

31.如权利要求1所述的方法，其中所述重链恒定区包含CH1、铰链区、CH2和CH3区。

32.如权利要求31所述的方法，其中所述重链恒定区进一步包含CH4区。

33.如权利要求1所述的方法，进一步包括纯化所述抗体并将所述抗体整合到诊断试剂盒中。

34.如权利要求1所述的方法，其中所述融合蛋白在所述信号序列和所述第一免疫球蛋白链之间或者在间隔肽和第二免疫球蛋白链之间不含有来自宿主蛋白的肽节段。

35.一种编码融合蛋白的核酸，所述融合蛋白从N-端至C-端依次包含：(a)信号序列，(b)含有可变区和恒定区的第一免疫球蛋白链，(c)含有可被蛋白酶切割的蛋白水解切割位点的间隔肽，所述蛋白酶是独立于所述融合蛋白的分子，以及(d)含有可变区和恒定区的第二免疫球蛋白链；其中，所述第一免疫球蛋白链是轻链，而第二免疫球蛋白链是重链，或者反过来；所述融合蛋白在所述间隔肽和所述第二免疫球蛋白链之间没有第二信号序列；并且所述间隔肽没有自加工切割位点。

36.一种含有与调控序列可操作地相连的权利要求34所述的核酸的载体。

37.一种经权利要求35所述的核酸转化的细胞。

38.一种抗体组合物，所述抗体组合物含有通过权利要求1所述的方法制造的抗体的复数个分子，其中每一种均具有糖型，并且主要糖型是复合的并缺少海藻糖。

39.如权利要求38所述的组合物，其中所述主要聚糖结构以比所述抗体组合物的第二主要的聚糖结构多至少约10～25摩尔百分数的水平存在。

40.一种通过权利要求1所述的方法制造的单克隆抗体。

41.如权利要求40所述的单克隆抗体，其与EGFR、CD20、CD33或TNF-α特异性结合。

42.一种制造抗体的方法，所述方法包括：

培养经过编码融合蛋白的核酸转化的细胞，其中所述融合蛋白包含信号序列，含有可变区和恒定区的免疫球蛋白轻链，含有可被第一和第二蛋白酶切割的第一和第二蛋白水解切割位点的间隔肽，其中所述蛋白酶可以相同或者不同，二者均为独立于所述融合蛋白的分子，以及含有可变区和恒定区的免疫球蛋白重链，其中所述间隔肽没有自切割蛋白水解位点，其中所述融合蛋白被表达，在信号序列的C-端末端被切割以移除所述信号序列，并在所述间隔肽的第一和第二蛋白水解位点被第一和第二蛋白酶切割，制造了含有分子间结合的免疫球蛋白重链和轻链对的抗体。

43.如权利要求42所述的方法，其中所述抗体是包含两对分子间结合的免疫球蛋白重链和轻链的四聚抗体。

44.如权利要求42所述的方法，其中所述第一免疫球蛋白链是轻链而第二免疫球蛋白链是重链。

45.如权利要求42所述的方法，其中所述第一免疫球蛋白链是重链而第二免疫球蛋白链是轻链。

46.如权利要求42所述的方法，其中在所述蛋白水解位点发生切割之前，所述融合蛋白的轻链和重链通过分子内键合而相互结合，两个融合蛋白拷贝通过其各自重链恒定区的分子间键合而相互结合。

47.如权利要求42所述的方法，其中在所述蛋白水解位点发生切割之后，所述免疫球蛋白重链和轻链发生分子间结合以形成所述分子间结合的重链和轻链，并在两对分子间结合的重链和轻链之间发生分子间结合形成所述四聚抗体。

48.如权利要求2所述的方法，其中所述间隔肽含有可被第一和第二蛋白酶切割的第一和第二蛋白水解位点，两种蛋白酶是独立于所述融合蛋白的分子，其中所述第一和第二蛋白水解切割位点被连接肽所分隔，并且所述第一和第二蛋白酶对蛋白水解切割位点的切割从所述融合蛋白中移除了所述连接肽。

49.如权利要求48所述的方法，其中所述第一和第二蛋白酶是相同的蛋白酶。

50.如权利要求49所述的方法，其中所述第一和第二蛋白水解位点的切割在细胞内发生。

51.如权利要求50所述的方法，其中所述细胞分泌所述抗体。

52.如权利要求49所述的方法，其中所述细胞经过编码切割所述第一和第二蛋白水解位点的蛋白酶的核酸的转化。

53.如权利要求52所述的方法，其中所述核酸编码第二融合蛋白，所述第二融合蛋白含有与所述蛋白酶融合的第二信号序列，其中所述第二信号序列使所述蛋白酶被摄取进入内质网。

54.如权利要求52所述的方法，其中所述融合蛋白从细胞中分泌而不包含信号序列，并且所述方法进一步包括使用在间隔肽的蛋白水解位点进行切割的蛋白酶处理所述分泌的融合蛋白。

55.如权利要求52所述的方法，进一步包括从所述细胞中或者从培养细胞的培养基中回收所述抗体。

56.如权利要求55所述的方法，进一步包括纯化所述抗体至基本同质。

57.如权利要求56所述的方法，进一步包括在药物组合物中将所述抗体与可药用载体相结合。

58.如权利要求42所述的方法，进一步包括将编码所述融合蛋白的核酸引入细胞。

59.如权利要求42所述的方法，其中所述细胞是丝状真菌细胞。

60.如权利要求42所述的方法，其中所述细胞是酵母细胞。

61.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞选自由来源于毕赤巴斯德酵母(Pichia pastoris)、芬兰毕赤酵母(Pichia finlandica)、Pichiatrehalophila、Pichia koclamae、膜醭毕赤氏酵母(Pichiamembranaefaciens)、Pichia minuta(Ogataea minuta、Pichia lindneri)、Pichia opuntiae、Pichia thermotolerans、Pichia salictaria、Pichiaguercuum、Pichia pijperi、Pichia stiptis、甲醇毕赤酵母(Pichiamethanolica)、毕赤属物种、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、酵母属物种(Saccharomyces sp.)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、克鲁维酵母属物种(Kluyveromyces sp.)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、Candida albicans、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉菌(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、Chrysosporium lucknowense、镰刀菌属物种(Fusarium sp.)、Fusarium grammeum、镰孢霉(Fusariumvenenatum)和粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)的细胞构成的组。

62.如权利要求51所述的方法，其中所述蛋白水解切割位点是Kex2p位点。

63.如权利要求62所述的方法，其中所述蛋白水解切割位点具有氨基酸序列XXKR，其中X是任何氨基酸。

64.如权利要求62所述的方法，其中所述蛋白水解切割位点具有氨基酸序列XXKR，其中所述X是选自由met、ala、val、leu、ile、cys、phe、pro、trp和tyr构成的组的疏水氨基酸，或者是选自由arg、asn、asp、gln、glu、his、lys、ser构成的组的亲水氨基酸。

65.如权利要求64所述的方法，其中所述间隔肽包含具有氨基酸序列LVKR的N-端蛋白水解切割位点和具有氨基酸序列RLVKR的C-端蛋白水解切割位点。

66.如权利要求65所述的方法，其中所述抗体不含有所述间隔肽的任何残基。

67.如权利要求43所述的方法，其中所述四聚抗体具有效应子功能。

68.如权利要求67所述的方法，其中所述效应子功能是补体固定或者抗体依赖性细胞毒性。

69.如权利要求42所述的方法，其中所述免疫球蛋白轻链和重链是人源化的免疫球蛋白轻链和重链。

70.如权利要求42所述的方法，其中所述抗体以至少50mg/升培养基的产率进行制造。

71.如权利要求42所述的方法，其中所述糖基化至少位于位点Asn297。

72.如权利要求42所述的方法，其中所述重链恒定区包含CH1、铰链区、CH2和CH3区。

73.如权利要求72所述的方法，其中所述重链恒定区进一步包含CH4区。

74.如权利要求42所述的方法，进一步包括纯化所述抗体并将所述抗体整合到诊断试剂盒中。

75.如权利要求42所述的方法，其中所述融合蛋白在所述信号序列和所述第一免疫球蛋白链之间或者在间隔肽和第二免疫球蛋白链之间不含有来自宿主蛋白的肽片段。