CN110198955A - 前列腺特异性膜抗原结合蛋白质 - Google Patents

前列腺特异性膜抗原结合蛋白质 Download PDF

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Abstract

本文公开了具有改善的结合亲和力和稳健的聚集特性的PSMA结合蛋白质。本文还描述了包含根据本公开内容的PSMA结合蛋白质的多特异性结合蛋白质。进一步提供了包含本文公开的结合蛋白质的药物组合物和使用这样的制剂的方法。

Description

前列腺特异性膜抗原结合蛋白质
交叉引用
本申请要求于2016年11月23日提交的第62/426,086号美国临时申请的权益，该临时申请通过引用以其全文并入本文。
序列表
本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式通过电子方式提交，并且通过引用整体并入本文。所述ASCII副本创建于2017年11月22日，被命名为47517-707_601_SL.txt，并且大小为148,650字节。
援引并入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同特别地且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用而并入，并且如同以其全文进行说明。
背景技术
本公开内容提供了前列腺特异性膜抗原(PSMA)结合蛋白质，其可用于诊断和治疗前列腺病况和与PSMA表达相关的其他适应症。
发明内容
在一些实施方案中，本文提供了前列腺特异性膜抗原(PSMA)结合蛋白质，其包含互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，其中
(a)CDR1的氨基酸序列如RFMISX1YX2MH(SEQ ID NO:1)所示；
(b)CDR2的氨基酸序列如X3INPAX4X5TDYAEX6VKG(SEQ ID NO:2)所示；并且(c)CDR3的氨基酸序列如DX7YGY(SEQ ID NO:3)所示。在一些实施方案中，所述前列腺特异性膜抗原结合蛋白质包含下式：f1-r1-f2-r2-f3-r3-f4，其中r1是SEQ ID NO.1；r2是SEQ ID NO.2；且r3是SEQ ID NO.3；并且其中f1、f2、f3和f4是选定的框架残基，使得所述蛋白质与SEQ IDNO.4所示的氨基酸序列至少80％相同。在一些实施方案中，X1是脯氨酸。在一些实施方案中，X2是组氨酸。在一些实施方案中，X3是天冬氨酸。在一些实施方案中，X4是赖氨酸。在一些实施方案中，X5是谷氨酰胺。在一些实施方案中，X6是酪氨酸。在一些实施方案中，X7是丝氨酸。在一些实施方案中，所述前列腺特异性膜抗原结合蛋白质相对于具有如SEQ ID NO:4所示的序列的结合蛋白质对人前列腺特异性膜抗原具有更高的亲和力。在一些实施方案中，X1是脯氨酸。在一些实施方案中，X5是谷氨酰胺。在一些实施方案中，X6是酪氨酸。在一些实施方案中，X4是赖氨酸，并且X7是丝氨酸。在一些实施方案中，X2是组氨酸，X3是天冬氨酸，X4是赖氨酸，并且X7是丝氨酸。在一些实施方案中，X1是脯氨酸，X2是组氨酸，X3是天冬氨酸，并且X7是丝氨酸。在一些实施方案中，X2是组氨酸，X3是天冬氨酸，X5是谷氨酰胺，并且X7是丝氨酸。在一些实施方案中，X2是组氨酸，X3是天冬氨酸，X6是酪氨酸，并且X7是丝氨酸。在一些实施方案中，X2是组氨酸，并且X7是丝氨酸。在一些实施方案中，X2是组氨酸，X3是天冬氨酸，并且X7是丝氨酸。在一些实施方案中，所述前列腺特异性膜抗原结合蛋白质相对于具有SEQID NO:4所示的序列的结合蛋白质对人前列腺特异性膜抗原具有更高的亲和力。在一些实施方案中，所述前列腺特异性膜抗原结合蛋白质相对于具有SEQ ID NO:4所示的序列的结合蛋白质进一步对食蟹猴前列腺特异性膜抗原具有更高的亲和力。在一些实施方案中，r1包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7。在一些实施方案中，r2包含SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14。在一些实施方案中，r3包含SEQ ID NO:15。
本发明的另一个实施方案提供了包含CDR1、CDR2和CDR3的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质，其包含SEQ ID NO:4所示的序列，其中选自氨基酸位置31、33、50、55、56、62和97的一个或多个氨基酸残基被置换。在一些实施方案中，所述结合蛋白质在除位置31、33、50、55、56、62和97之外的氨基酸位置处包含一个或多个另外的置换。在一些实施方案中，所述结合蛋白质在位置31处包含置换。在一些实施方案中，所述结合蛋白质在位置33处包含置换。在一些实施方案中，所述结合蛋白质在位置50处包含置换。在一些实施方案中，所述结合蛋白质在位置55处包含置换。在一些实施方案中，所述结合蛋白质在位置56处包含置换。在一些实施方案中，所述结合蛋白质在位置62处包含置换。在一些实施方案中，所述结合蛋白质在位置97处包含置换。在一些实施方案中，所述结合蛋白质在位置55和97处包含置换。在一些实施方案中，所述前列腺特异性膜抗原结合蛋白质相对于具有SEQ ID NO:4所示的序列的结合蛋白质对人前列腺特异性膜抗原具有更高的亲和力。在一些实施方案中，所述结合蛋白质在氨基酸位置33和97处包含置换。在一些实施方案中，所述结合蛋白质在氨基酸位置33、50和97处包含置换。在一些实施方案中，所述前列腺特异性膜抗原结合蛋白质相对于具有SEQ ID NO:4所示的序列的结合蛋白质对人前列腺特异性膜抗原具有更高的亲和力。在一些实施方案中，所述前列腺特异性膜抗原结合蛋白质相对于具有SEQ ID NO:4所示的序列的结合蛋白质对食蟹猴前列腺特异性膜抗原具有更高的亲和力。在一些实施方案中，所述结合蛋白质在氨基酸位置31、33、50和97处包含置换。在一些实施方案中，所述结合蛋白质在氨基酸位置33、50、55和97处包含置换。在一些实施方案中，所述结合蛋白质在氨基酸位置33、50、56和97处包含置换。在一些实施方案中，在氨基酸位置33、50、62和97处包含置换。
另外的实施方案提供了包含CDR1、CDR2和CDR3的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质，其中CDR1包含SEQ ID NO:16所示的序列。一个实施方案提供了包含CDR1、CDR2和CDR3的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质，其中CDR2包含SEQ ID NO:17所示的序列。另外的实施方案提供了包含CDR1、CDR2和CDR3的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质，其中CDR3包含SEQ IDNO:18所示的序列。在一个实施方案中提供了包含与SEQ ID NO:4所示的序列至少80％相同的序列的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质。在一个实施方案中提供了包含CDR1、CDR2和CDR3的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质，其中CDR1与SEQ ID NO:16具有至少80％的同一性，CDR2与SEQ ID NO:17具有至少85％的同一性，并且CDR3与SEQ ID NO:18具有至少80％的同一性。
另一个实施方案提供了包含CDR1、CDR2和CDR3的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质，其中CDR1包含SEQ ID NO:16所示的序列，CDR2包含SEQ ID NO:17所示的序列，并且CDR3包含SEQ ID NO:18所示的序列。在一些实施方案中，所述前列腺特异性膜抗原结合蛋白质与人前列腺特异性膜抗原和食蟹猴前列腺特异性膜抗原中的一种或两种结合。在一些实施方案中，所述结合蛋白质以相当的结合亲和力与人前列腺特异性膜抗原和食蟹猴前列腺特异性膜抗原结合。在一些实施方案中，所述结合蛋白质相对于与食蟹猴前列腺特异性膜抗原结合以更高的结合亲和力与人前列腺特异性膜抗原结合。
另一个实施方案提供了编码根据本公开内容的PSMA结合蛋白质的多核苷酸。另一个实施方案提供了包含编码根据本公开内容的PSMA结合蛋白质的多核苷酸的载体。在另一个实施方案中，提供了用所述载体转化的宿主细胞。在另一个的实施方案中，提供了药物组合物，其包含(i)根据本共开内容的PSMA结合蛋白质、根据本共开内容的多核苷酸、根据本公开内容的载体或根据本公开内容的宿主细胞，以及(ii)药学上可接受的载剂(carrier)。另一个实施方案提供了用于产生根据本公开内容的PSMA结合蛋白质的方法，所述方法包括在允许所述PSMA结合蛋白质表达的条件下培养用包含编码根据本公开内容的PSMA白蛋白结合蛋白质的核酸序列的载体转化或转染的宿主，以及从所述培养物中回收并纯化所产生的蛋白质。
在另一个实施方案中，提供了用于治疗或改善增生性疾病、肿瘤疾病、炎性疾病、免疫性病症、自身免疫病、感染性疾病、病毒性疾病、变态反应、寄生虫反应、移植物抗宿主病或宿主抗移植物病的方法，其包括向有需要的受试者施用根据本公开内容的PSMA结合蛋白质。在一些实施方案中，所述受试者是人。在一些实施方案中，所述方法进一步包括与根据本公开内容的PSMA结合蛋白质联合施用药剂。
一个实施方案提供了包含根据本公开内容的PSMA结合蛋白质的多特异性结合蛋白质。另一个实施方案提供了包含根据本公开内容的PSMA结合蛋白质的抗体。在一个实施方案中，提供了多特异性抗体、双特异性抗体、sdAb、可变重链结构域、肽或配体，其包含根据本公开内容的PSMA结合蛋白质。在一个实施方案中，提供了抗体，其包含本公开内容的PSMA结合蛋白质，其中所述抗体是单结构域抗体。在一些实施方案中，所述单结构域抗体衍生自IgG的重链可变区。进一步的实施方案提供了包含根据本公开内容的PSMA结合蛋白质的多特异性结合蛋白质或抗体。在一个实施方案中，提供了用于治疗或改善增生性疾病、肿瘤疾病、炎性疾病、免疫性病症、自身免疫病、感染性疾病、病毒性疾病、变态反应、寄生虫反应、移植物抗宿主病或宿主抗移植物病的方法，其包括向有需要的受试者施用根据本公开内容的多特异性抗体。在进一步的实施方案中，提供了用于治疗或改善前列腺病况的方法，其包括向有需要的受试者施用根据本公开内容的多特异性抗体。进一步的实施方案提供了用于治疗或改善前列腺病况的方法，其包括向有需要的受试者施用根据上述实施方案中任一项的PSMA结合蛋白质。进一步的实施方案中，提供了用于治疗或改善前列腺病况的方法，其包括向有需要的受试者施用根据本公开内容的PSMA结合蛋白质。
在一些实施方案中，所述前列腺特异性膜抗原结合蛋白质包含以下的任意组合：(i)其中X1是脯氨酸；(ii)其中X2是组氨酸；(iii)其中X3是天冬氨酸；(iv)其中X4是赖氨酸；(v)其中X5是谷氨酰胺；(vi)其中X6是酪氨酸；以及(vii)其中X7是丝氨酸。在一些实施方案中，以上实施方案的所述前列腺特异性膜抗原结合蛋白质相对于具有如SEQ ID NO:4所示的序列的结合蛋白质对人前列腺特异性膜抗原具有更高的亲和力。在一些实施方案中，所述前列腺特异性膜抗原结合包含以下的任意组合：(i)其中X1是脯氨酸；其中X5是谷氨酰胺；(ii)其中X6是酪氨酸；其中X4是赖氨酸，并且X7是丝氨酸；(iii)其中X2是组氨酸，X3是天冬氨酸，X4是赖氨酸，并且X7是丝氨酸；(iv)其中X1是脯氨酸，X2是组氨酸，X3是天冬氨酸，并且X7是丝氨酸；(v)其中X2是组氨酸，X3是天冬氨酸，X5是谷氨酰胺，并且X7是丝氨酸；(vi)其中X2是组氨酸，X3是天冬氨酸，X4是赖氨酸，并且X7是丝氨酸；(vii)其中X1是脯氨酸，X2是组氨酸，X3是天冬氨酸，并且X7是丝氨酸；(viii)其中X2是组氨酸，X3是天冬氨酸，X5是谷氨酰胺，并且X7是丝氨酸；(ix)其中X2是组氨酸，X3是天冬氨酸，X6是酪氨酸，并且X7是丝氨酸；以及(x)其中X2是组氨酸，X3是天冬氨酸，并且X7是丝氨酸。在一些情况下，以上实施方案的所述前列腺特异性膜抗原结合蛋白质相对于具有SEQ ID NO:4所示的序列的结合蛋白质对人前列腺特异性膜抗原具有更高的亲和力。在一些情况下，以上实施方案的所述前列腺特异性膜抗原结合蛋白质相对于具有SEQ ID NO:4所示的序列的结合蛋白质进一步对食蟹猴前列腺特异性膜抗原具有更高的亲和力。在一些实施方案中，所述前列腺特异性膜抗原结合蛋白质包含以下的任意组合：(i)在位置31处的置换；(ii)在位置50处的置换；(iii)在位置55处的置换；在位置56处的置换；(iv)在位置62处的置换；(v)在位置97处的置换；(vi)在位置55和97处的置换；(vii)在位置33和97处的置换；(viii)在位置33、50和97处的置换；(ix)在位置31、33、50和97处的置换；(x)在位置33、50、55和97处的置换；(xi)在位置33、50、56和97处的置换；以及(xiii)在位置33、50、62和97处的置换。在一些情况下，以上实施方案的所述前列腺特异性膜抗原结合蛋白质相对于具有SEQ ID NO:4所示的序列的结合蛋白质对人前列腺特异性膜抗原具有更高的亲和力。在一些情况下，以上实施方案的所述前列腺特异性膜抗原结合蛋白质相对于具有SEQ ID NO:4所示的序列的结合蛋白质进一步对食蟹猴前列腺特异性膜抗原具有更高的亲和力。
一个实施方案提供了用于治疗或改善前列腺癌的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用包含互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的PSMA结合蛋白质，其中(a)CDR1的氨基酸序列如RFMISX1YX2MH(SEQ ID NO:1)所示；(b)CDR2的氨基酸序列如X3INPAX4X5TDYAEX6VKG(SEQID NO:2)所示；并且(c)CDR3的氨基酸序列如DX7YGY(SEQ ID NO:3)所示。
在一些实施方案中，所述PSMA结合蛋白质是单结构域抗体。在一些实施方案中，所述单结构域抗体是三特异性抗体的一部分。
附图说明
本发明的新特征在随附的权利要求书中具体阐述。通过参考以下对利用到本发明原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述及其附图，将会对本发明的特征和优点获得更好的理解，在这些附图中：
图1是示例性靶向PMSA的三特异性抗原结合蛋白质的示意图，其中该蛋白质具有包含抗CD3ε单链可变片段(scFv)和抗HSA可变重链区的恒定核心元件；以及PMSA结合域，该PMSA结合域可以是VH、scFv、非Ig结合物或配体。
图2A-图2B比较了对CD3具有不同亲和力的示例性靶向PSMA的三特异性蛋白质(靶向PSMA的TriTAC分子)诱导T细胞杀伤人前列腺癌细胞的能力。图2A示出了不同的靶向PSMA的TriTAC分子在前列腺癌模型LNCaP中的杀伤。图2B示出了不同的靶向PSMA的TriTAC分子在前列腺癌模型22Rv1中的杀伤。图2C示出了靶向PSMA的TriTAC在LNCaP和22Rv1前列腺癌模型中的EC50值。
图3示出了在静脉内(i.v.)施用(100μg/kg)后的三周内，靶向PSMA的TriTAC C236在食蟹猴中的血清浓度。
图4示出了在静脉内(i.v.)施用(100μg/kg)后的三周内，具有不同CD3亲和力的靶向PSMA的TriTAC分子在食蟹猴中的血清浓度。
图5A-图5C示出了对PSMA具有不同亲和力的靶向PSMA的TriTAC分子诱导T细胞杀伤人前列腺癌细胞系LNCaP的能力。图5A示出了在不存在人血清白蛋白的情况下进行的实验，以靶向PSMA的BiTE作为阳性对照。图5B示出了在人血清白蛋白的存在下进行的实验，以靶向PSMA的BiTE作为阳性对照。图5C示出了在LNCaP前列腺癌模型中，在存在或不存在HSA的情况下，靶向PSMA的TriTAC的EC50值，以靶向PSMA的BiTE作为阳性对照。
图6显示了在小鼠异种移植实验中，靶向PSMA的TriTAC分子抑制人前列腺癌细胞的肿瘤生长的能力。
图7A-图7D示出了在使用表达或不表达靶蛋白质的靶细胞系的细胞杀伤试验中，TriTAC分子的特异性。图7A示出了在LNCaP、KMS12BM和OVCAR8细胞系中的EGFR和PSMA表达。图7B示出了PSMA、EGFR和阴性对照TriTAC对LNCaP肿瘤细胞的杀伤。图7C示出了PSMA、EGFR和阴性对照TriTAC对KMS12BM肿瘤细胞的杀伤。图7D示出了PSMA、EGFR和阴性对照TriTAC对OVCAR8细胞的杀伤。
图8A-图8D描绘了在37℃下预温育和冷冻/解冻循环对TriTAC活性的影响。图8A示出了在37℃下预温育或冷冻/解冻循环后的PSMATriTAC C235活性。图8B示出了在37℃下预温育或冷冻/解冻循环后的PSMA TriTAC C359活性。图8C示出了在37℃下预温育或冷冻/解冻循环后的PSMA TriTAC C360活性。图8D示出了在37℃下预温育或冷冻/解冻循环后的PSMA TriTAC C361活性。
图9A-图9B描绘了本公开内容的靶向PSMA的TriTAC分子在T细胞依赖性细胞毒性试验(TDCC)中在重导向T细胞杀伤方面的活性。图9A示出了靶向PSMA的TriTAC分子在重新引导来自食蟹猴供体G322的食蟹猴外周血单个核细胞(PBMC)杀伤LNCaP细胞的影响。图9B示出了靶向PSMA的TriTAC分子在重新引导来自食蟹猴供体D173的食蟹猴PBMC杀伤MDAPCa2b细胞的影响。
图10描绘了本公开内容的靶向PSMA的TriTAC分子对T细胞活化标志物CD25和CD69的表达的影响。
图11描绘了本公开内容的靶向PSMA的TriTAC分子在表达PSMA的靶细胞的存在下刺激T细胞增殖的能力。
图12描绘了由靶向PSMA的TriTAC分子PSMA Z2 TriTAC(SEQ ID NO:156)重导向的对LnCaP细胞的T细胞杀伤。
具体实施方式
虽然本文已经显示并描述了本发明的优选实施方案，但是对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方案仅以示例的方式提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现将想到许多变化、改变和替换。应当理解，本文所述的本发明实施方案的各种替代方案均可用于实施本发明。以下权利要求旨在限定本发明的范围，并且由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。
某些定义
本文使用的术语仅用于描述特定情况的目的，而非限制性的。如本文所用，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”也旨在包括复数形式。此外，就具体实施方式和/或权利要求书中使用的术语“包括”、“包含”、“具有”或其变化形式而言，这些术语旨在以与术语“包含”类似的方式为包含性的。
术语“约”或“大约”意指在本领域普通技术人员测定的特定值的可接受误差范围内，所述可接受误差范围将部分取决于该值如何测量或测定，例如，测量系统的局限性。例如，根据给定值的实践，“约”可以表示在1个或大于1个标准差内。在本申请和权利要求书中描述特定值的情况下，除非另有说明，否则术语“约”应被认为意指该特定值的可接受误差范围。
术语“个体”、“患者”或“受试者”可互换使用。这些术语均不要求或不限于以医疗保健工作者(例如，医生、注册护士、护士执业者、医师助理、护理员或临终关怀工作者)的监督(例如，持续或间歇的)为特征的情况。
术语“框架”或“FR”残基(或区)是指除如本文定义的CDR或高变区残基之外的可变域残基。“人共有框架”是代表在选择人免疫球蛋白VL或VH框架序列中最常出现的氨基酸残基的框架。
如本文所用，“可变区”或“可变域”是指以下情况：可变域的某些部分在抗体之间在序列上广泛不同，并且在每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性中使用。然而，变异性并非均匀地分布在抗体的整个可变域中。其集中在轻链和重链可变域中称为互补决定区(CDR)或高变区的三个区段中。可变域更高度保守的部分被称为框架(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR区，其主要采取β-折叠构型，且通过三个CDR连接，所述三个CDR形成连接β折叠结构的环，并且在一些情况下形成β折叠结构的一部分。每条链中的CDR通过FR区紧密靠近保持在一起，并且与来自另一条链的CDR一起有助于形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,National Institute of Health,Bethesda,Md.(1991))。恒定域虽然不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出各种效应物功能，诸如抗体参与抗体依赖性细胞毒性。“按照Kabat的可变域残基编号”或“按照Kabat的氨基酸位置编号”及其变化形式是指在Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)中用于抗体编译的重链可变域或轻链可变域的编号系统。使用该编号系统，实际的线性氨基酸序列可含有减少或添加的氨基酸，其对应于可变域的FR或CDR的缩短或插入。例如，重链可变域可包含在H2的残基52之后的单氨基酸插入(根据Kabat为残基52a)和在重链FR残基82之后的插入残基(例如，根据Kabat为残基82a、82b和82c等)。可通过将抗体序列在同源性区域与“标准”Kabat编号的序列进行比对来确定给定抗体的残基的Kabat编号。这并不意味着本公开内容的CDR必然对应于Kabat编号约定。
如本文所用，相对于序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为在将序列进行比对并引入缺口(如果需要)以达到最大序列同一性百分比之后，候选序列中的氨基酸残基与特定序列中的氨基酸残基相同的百分比，并且不认为任何保守置换是序列同一性的一部分。为了确定氨基酸序列同一性百分比目的的比对可通过本领域技术范围内的各种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件，如EMBOSS MATCHER、EMBOSS WATER、EMBOSSSTRETCHER、EMBOSS NEEDLE、EMBOSS LALIGN、BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定用于测量比对的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
如本文所用，“消除半衰期”以其普通含义使用，如在Goodman和Gillman的ThePharmaceutical Basis of Therapeutics 21-25(Alfred Goodman Gilman、LouisS.Goodman和Alfred Gilman编著，第六版1980)中所述。简言之，该术语意在包括药物消除的时间过程的定量量度。大多数药物的消除是指数式的(即，遵循一级动力学)，因为药物浓度通常并未接近消除过程的饱和所需的浓度。指数过程的速率可由其速率常数k或由其半衰期t1/2表示，速率常数k表示每单位时间的分数变化，半衰期t1/2表示该过程完成50％所需的时间。这两个常数的单位分别是时间-1和时间。反应的一级速率常数和半衰期简单相关(k×t1/2＝0.693)并且可以相应地互换。由于一级消除动力学指示每单位时间损失恒定分数的药物，因此药物浓度的对数相对于时间的图形在初始分布阶段之后(即在药物吸收和分布完成之后)一直是线性的。可从这样的图形准确地确定药物消除的半衰期。
如本文所用，术语“结合亲和力”是指本公开内容中描述的蛋白质与其结合靶标的亲和力，并且使用“Kd”值以数字表示。如果表明两种或更多种蛋白质对其结合靶标具有相当的结合亲和力，那么各蛋白质对其结合靶标结合的Kd值在彼此的±2倍之内。如果表明两种或更多种蛋白质对单一结合靶标具有相当的结合亲和力，那么各蛋白质与所述单一结合靶标结合的Kd值在彼此的±2倍之内。如果表明蛋白质以相当的结合亲和力结合两种或更多种靶标，那么所述蛋白质与该两种或更多种靶标结合的Kd值在彼此的±2倍之内。通常，较高的Kd值对应于较弱的结合。在一些实施方案中，使用BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,N.J.)通过放射性标记的抗原结合测定(RIA)或表面等离子体共振测定来测量“Kd”。在某些实施方案中，还使用BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,N.J.)通过表面等离子体共振技术来测定“缔合率”或“缔合的速率”或“缔合速率”或“kon”以及“解离率”或“解离的速率”或“解离速率”或“koff”。在另外的实施方案中，使用Systems(Pall Life Sciences)测量“Kd”、“kon”和“koff”。在使用Systems测量结合亲和力的示例性方法中，将配体(例如，生物素化的人或食蟹猴PSMA)固定在链霉亲和素毛细管传感器端头表面上，然后根据制造商的说明书使用约20-50μg/ml的人或食蟹猴PSMA蛋白质激活链霉亲和素端头。还引入PBS/酪蛋白溶液作为封闭剂。对于缔合动力学测量，以约10μg/ml至约1000μg/ml的浓度引入PSMA结合蛋白质变体。在阴性对照，即不含结合蛋白质的测定缓冲液的情况下观察到完全解离。然后使用适当的工具例如ForteBio软件来确定结合反应的动力学参数。
本文描述了PSMA结合蛋白质、药物组合物以及用于制备这样的PSMA结合蛋白质的核酸、重组表达载体和宿主细胞。还提供了使用所公开的PSMA结合蛋白质预防和/或治疗疾病、病况和病症的方法。该PSMA结合蛋白质能够特异性结合PSMA。在一些实施方案中，该PSMA结合蛋白质包含其他结构域，诸如CD3结合域。
前列腺特异性膜抗原(PSMA)及其在前列腺病况中的作用
本文涉及前列腺特异性膜抗原结合蛋白质。前列腺特异性膜抗原(PSMA)，也称为谷氨酸羧肽酶II、N-乙酰基-α-连接的酸性二肽酶I[Naaladase(NLD)I]或叶酸水解酶，是已经被发现在前列腺癌细胞和非前列腺实体瘤新血管系统中高度表达但在其他组织(包括健康的前列腺、肾、肝、小肠管、小肠、唾液腺、十二指肠粘膜、近端肾小管和脑)中以较低水平表达的750个残基的II型跨膜糖蛋白。PSMA是锌依赖性外肽酶超家族的成员，该超家族包括具有单核锌活性位点的羧肽酶(例如，羧肽酶A)和具有双核锌活性位点的羧肽酶和氨肽酶[例如，羧肽酶G2(CPG2)、肽酶T和V(PepT和PepV)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)氨肽酶(Sgap)和解蛋白气单胞菌(Aeromonas proteolytica)氨肽酶(AAP)]。除了与这些可溶性单结构域(例如AAP)或双结构域(例如CPG2)锌依赖性外肽酶的有限区域的同源性外，PSMA的完整序列与至少四种其他人蛋白质同源：NLDL(在回肠中表达；35％同一性)、NLD2(在卵巢、睾丸和脑中表达；67％同一性)、转铁蛋白受体(TfR)1(TfR1；在大多数细胞类型中表达；26％同一性)和TfR2(主要在肝中表达；28％同一性)。
PSMA的晶体结构已显示包含对称二聚体，每条多肽链含有类似于三个TfR1结构域的三个结构域：蛋白酶结构域、顶端结构域和螺旋结构域。在三个结构域之间的界面处的大空腔包括双核锌位点并且主要是极性残基(70个残基中的66％)。在PSMA直向同源物和同源物中发现的两个锌离子和许多空腔形成残基的保守性将空腔鉴别为可能的底物结合位点。
通常，发现PSMA表达随着前列腺疾病进展和转移而增加。PSMA的表达在前列腺癌中增加，特别是在低分化、转移性和激素难治性癌中。PSMA还在某些恶性肿瘤(包括肾细胞癌和结肠癌)的肿瘤周围和肿瘤内区域的毛细血管的内皮细胞中表达，但在来自正常组织的血管中不表达。此外，据报道PSMA与肿瘤血管生成有关。PSMA已被证明在结肠癌、乳腺癌、膀胱癌、胰腺癌、肾癌和黑素瘤中在肿瘤相关的新血管系统的内皮细胞中表达。
除了其作为肿瘤标志物的作用外，PSMA还含有双核锌位点，并且其作为谷氨酸羧肽酶具有催化从肽或小分子水解裂解α-或γ-连接的谷氨酸的活性。其底物包括作为必需营养素的聚-γ-谷氨酸叶酸，以及抗癌药物甲氨蝶呤的聚-γ-谷氨酸形式，在这种情况下，裂解使效力降低。PSMA的酶活性可用于前药的设计，其中药物的非活性谷氨酸形式被选择性裂解，从而仅在表达PSMA的细胞中活化。PSMA还使丰富的神经肽N-乙酰基-1-天冬氨酰-1-谷氨酸(α-NAAG)——其是NMDA离子型受体的抑制剂和II型代谢型谷氨酸受体亚型3的激动剂——裂解和失活。通过α-NAAG对谷氨酸能神经传递调节的破坏涉及精神分裂症、癫痫发作症、阿尔茨海默病、亨廷顿病和肌萎缩侧索硬化。因此，PSMA的抑制可能通过减少谷氨酸和增加α-NAAG来赋予神经保护作用。例如，已显示次纳摩尔的抑制剂2-(膦酰基甲基)戊二酸在细胞培养和/或缺血、糖尿病神经病变、药物滥用、慢性疼痛和肌萎缩侧索硬化的动物模型中提供神经保护。
前列腺癌是最常见的癌症类型，也是美国男性癌症死亡的主要原因之一。由于老年男性人口的增加以及对导致其早期诊断的疾病的了解的增加，被诊断为患有前列腺癌的男性人数稳步增加。男性在一生中患有前列腺癌的风险对于高加索人约为五分之一，对于非裔美国人约为六分之一。高危人群的代表是具有前列腺癌阳性家族史的人群或非裔美国人。在一生中，超过三分之二的被诊断为患有前列腺癌的男性死于该疾病。此外，许多未死于前列腺癌的患者需要持续治疗以改善诸如疼痛、出血和尿路梗阻等症状。因此，前列腺癌也代表了遭受病痛和医疗保健支出增加的主要原因。在前列腺癌是局部的并且患者的预期寿命为10年或更长时间的情况下，根治性前列腺切除术提供了根除该疾病的最佳机会。从历史上看，这种方法的缺点在于大多数癌症在被检测到时已经扩散到了超出手术的范围。具有较大的、高等级肿瘤的患者不太可能通过根治性前列腺切除术成功治疗。放疗也被广泛用作根治性前列腺切除术的替代方案。通常通过放疗治疗的患者是那些年龄较大且健康状况较差的患者，以及具有较高等级的临床较晚期肿瘤的患者。特别优选的方法是外照射疗法，其涉及三维共焦放疗，其中辐射场被设计成符合所治疗组织的体积；间质放疗，其中使用超声引导植入放射性化合物的种子；以及外照射疗法和间质放疗的组合。对于患有局部晚期疾病的患者的治疗，已经在根治性前列腺切除术或放疗之前或之后使用了激素疗法。激素疗法是治疗患有播散性前列腺癌的男性的主要形式。睾丸切除术降低血清睾酮浓度，而雌激素治疗同样有益。来自雌激素的己烯雌酚是另一种有用的激素疗法，其具有引起心血管毒性的缺点。当施用促性腺激素释放激素激动剂时，睾酮浓度最终降低。氟他胺和其他非甾体抗雄激素剂阻断睾酮与其细胞内受体的结合。因此，其阻断睾酮的作用，提高血清睾酮浓度，并允许患者保持有性交能力——这是根治性前列腺切除术和放射治疗后的重要问题。细胞毒性化疗在治疗前列腺癌方面在很大程度上无效。其毒性使得这种疗法不适合于老年患者。此外，前列腺癌对细胞毒性剂具有相对抗性。复发性或更晚期的疾病也用抗雄激素疗法治疗。遗憾的是，在没有任何有效疗法的情况下，几乎所有肿瘤都变得具有激素抗性并且进展迅速。因此，需要对前列腺癌有效的治疗，其对患者的正常组织不具有过分的毒性，并且在选择性消除前列腺癌细胞方面是有效的。在某些实施方案中，本公开内容提供了可用于治疗前列腺癌的PSMA结合蛋白质。在另外的实施方案中，本公开内容提供了使用本文所述的PSMA结合蛋白质通过免疫疗法治疗前列腺癌的方法。
前列腺癌在诊断方面也是困难的，因为前列腺特异性膜抗原筛选方法与许多假阳性相关。因此，在一些实施方案中，本公开内容提供了使用本文所述的PSMA结合蛋白质检测前列腺癌的改进方法。
PSMA结合蛋白质
本文在某些实施方案中提供了结合蛋白质，如与PSMA蛋白质结合的抗PSMA抗体或抗体变体。在一些实施方案中，PSMA蛋白质是多聚体。如本文所用，PSMA蛋白质多聚体是至少两个PSMA蛋白质或其片段的蛋白质复合物。PSMA蛋白质多聚体可由全长PSMA蛋白质(例如，SEQ ID NO:20)、重组可溶性PSMA(rsPSMA，例如，SEQ ID NO:20的氨基酸44-750)和形成多聚体的前述的片段(即，保留形成PSMA的二聚体和/或更高级多聚体所需的蛋白质结构域)的各种组合组成。在一些实施方案中，形成多聚体的PSMA蛋白质中的至少一个是重组可溶性PSMA(rsPSMA)多肽。在一些实施方案中，PSMA蛋白质多聚体是二聚体，如由重组可溶性PSMA蛋白质形成的那些。在一些实施方案中，rsPSMA是同型二聚体。尽管不受任何特定理论的束缚，但认为本文提及的PSMA蛋白质多聚体呈现天然构象并且优选地具有这样的构象。在某些实施方案中，PSMA蛋白质非共价结合在一起以形成PSMA蛋白质多聚体。例如，已发现PSMA蛋白质在非变性条件下非共价缔合以形成二聚体。PSMA蛋白质多聚体可以并且优选地保留PSMA的活性。在某些实施方案中，PSMA蛋白质的活性是酶活性，如叶酸水解酶活性、NAALADase活性、二肽基肽酶IV活性和γ-谷氨酰水解酶活性。用于检测多聚体的PSMA活性的方法是本领域已知的(例如，O'Keefe等人综述于Prostate Cancer:Biology,Genetics,and the New Therapeutics，以及L.W.K.Chung、W.B.Isaacs和J.W.Simons编著，HumanaPress,Totowa,N.J.,2000,307-326页)。
在一些实施方案中，与PSMA蛋白质或PSMA蛋白质多聚体结合的本公开内容的结合蛋白质调节PSMA蛋白质或PSMA蛋白质多聚体的酶活性。在一些实施方案中，PSMA结合蛋白质抑制至少一种酶活性，如NAALADase活性、叶酸水解酶活性、二肽基二肽酶IV活性、γ-谷氨酰水解酶活性或其组合。在其他实施方案中，PSMA结合蛋白质增强至少一种酶活性，如NAALADase活性、叶酸水解酶活性、二肽基二肽酶IV活性、γ-谷氨酰水解酶活性或其组合。
如本文所用，术语“抗体变体”是指本文所述的抗体的变体和衍生物。在某些实施方案中，涉及本文所述的抗PSMA抗体的氨基酸序列变体。例如，在某些实施方案中，预期本文所述的抗PSMA抗体的氨基酸序列变体改善抗体的结合亲和力和/或其他生物学性质。用于制备氨基酸变体的示例性方法包括但不限于将适当的修饰引入编码抗体的核苷酸序列中，或者通过肽合成。这样的修饰包括例如抗体的氨基酸序列内残基的缺失和/或插入和/或置换。
可进行缺失、插入和置换的任意组合以获得最终构建体，条件是最终构建体具有期望的特性，例如抗原结合。在某些实施方案中，提供了具有一个或多个氨基酸置换的抗体变体。用于置换诱变的感兴趣的位点包括CDR和框架区。这样的置换的实例描述如下。可将氨基酸置换引入感兴趣的抗体中，并筛选产物的期望活性，例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性或改善的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)。保守和非保守的氨基酸置换均考虑用于制备抗体变体。
在用于产生变异抗PSMA抗体的置换的另一个实例中，亲本抗体的一个或多个高变区残基被置换。通常在之后基于与亲本抗体相比的期望的性质的改善来选择变体，例如，增加的亲和力、降低的亲和力、降低的免疫原性、增加的结合的pH依赖性。例如，可以产生亲和力成熟的变异抗体，例如，使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术，如本文所述和本领域已知的那些。
可以在亲本抗PSMA抗体的高变区(HVR)中进行置换以产生变体，然后基于结合亲和力，即通过亲和力成熟来选择变体。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法中的任一种(例如，易错PCR、链改组或寡核苷酸定点诱变)向选择用于成熟的可变基因中引入多样性。然后创建次级文库。随后筛查文库以鉴别具有期望亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一种方法涉及HVR定向方法，其中几个HVR残基(例如，一次4-6个残基)被随机化。参与抗原结合的HVR残基可以例如使用丙氨酸扫描诱变或建模来特异性鉴别。置换可以在亲本抗体序列内的一个、两个、三个、四个或更多个位点处。
在一些实施方案中，本文所述的PSMA结合蛋白质是单结构域抗体，诸如对PSMA具有特异性的重链可变域(VH)、骆驼科来源的sdAb的可变域(VHH)、肽、配体或小分子实体。在一些实施方案中，本文所述的PSMA结合蛋白质的PSMA结合域是与PSMA结合的任何结构域，包括但不限于来自单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体的结构域。在某些实施方案中，该PSMA结合蛋白质是单结构域抗体。在其他实施方案中，该PSMA结合蛋白质是肽。在进一步的实施方案中，该PSMA结合蛋白质是小分子。
通常，应当注意，本文中以其最广泛的含义使用的术语单结构域抗体不限于特定的生物学来源或特定的制备方法。例如，在一些实施方案中，通过以下方法获得本公开内容的单结构域抗体：(1)通过分离天然存在的重链抗体的VHH结构域；(2)通过表达编码天然存在的VHH结构域的核苷酸序列；(3)通过天然存在的VHH结构域的“人源化”或通过表达编码这样的人源化VHH结构域的核酸；(4)通过来自任何动物物种，特别是来自哺乳动物的物种，如来自人类的天然存在的VH结构域的“骆驼化”，或通过表达编码这样的骆驼化VH结构域的核酸；(5)通过“结构域抗体”或“Dab”的“骆驼化”，或通过表达编码这样的骆驼化VH结构域的核酸；(6)通过使用合成或半合成技术制备蛋白质、多肽或其他氨基酸序列；(7)通过使用本领域已知的核酸合成技术制备编码单结构域抗体的核酸，然后表达由此获得的核酸；以及/或者(8)通过前述一种或多种的任意组合。
在一个实施方案中，单结构域抗体对应于针对PSMA的天然存在的重链抗体的VHH结构域。如本文进一步描述的，这样的VHH序列通常可以通过以下方法来生成或获得：用PSMA适当地免疫骆驼科物种(即，以产生针对PSMA的免疫应答和/或重链抗体)，获得来自所述骆驼科的合适的样品(如血液样品、血清样品或B细胞样品)，并使用本领域已知的任何合适技术从所述样品起始生成针对PSMA的VHH序列。
在另一个实施方案中，这样的天然存在的针对PSMA的VHH结构域从幼稚骆驼科VHH序列文库获得，例如通过使用本领域已知的一种或多种筛选技术使用PSMA或其至少一个部分、片段、抗原决定簇或表位筛查这样的文库。这样的文库和技术例如在WO 99/37681、WO01/90190、WO 03/025020和WO 03/035694中描述。或者，使用衍生自幼稚VHH文库的改进的合成或半合成文库，如通过诸如随机诱变和/或CDR改组等技术从幼稚VHH文库获得的VHH文库，例如WO 00/43507中所述。
在进一步的实施方案中，又一种获得针对PSMA的VHH序列的技术涉及适当地免疫能够表达重链抗体的转基因哺乳动物(即，以产生针对PSMA的免疫应答和/或重链抗体)，从所述转基因哺乳动物获得合适的生物样品(诸如血液样品、血清样品或B细胞样品)，然后使用本领域已知的任何合适技术从所述样品起始生成针对PSMA的VHH序列。例如，为此目的，可以使用表达重链抗体的大鼠或小鼠以及在WO 02/085945和WO 04/049794中描述的其他方法和技术。
在一些实施方案中，如本文所述的单结构域PSMA抗体包括单结构域抗体，其具有对应于天然存在的VHH结构域的氨基酸序列的氨基酸序列，但是已经“人源化”，即通过用存在于来自人类的常规4-链抗体(例如，如上所述)的VH结构域中的相应位置处的一个或多个氨基酸残基替换所述天然存在的VHH序列(特别是框架序列中)的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基。这可以以本领域已知的方式进行，该方式对于本领域技术人员将会是显而易见的，例如基于本文的进一步描述。此外，应当注意，本公开内容的此类人源化抗PSMA单结构域抗体以本质上已知的任何合适的方式获得(即，如上文(1)-(8)点所示)，因此不严格限于使用包含天然存在的VHH结构域的多肽作为起始材料获得的多肽。在一些另外的实施方案中，如本文所述的单结构域PSMA抗体包括单结构域抗体，其具有对应于天然存在的VH结构域的氨基酸序列的氨基酸序列，但是已经“骆驼化”，即通过用存在于重链抗体的VHH结构域中的相应位置处的一个或多个氨基酸残基替换来自常规4链抗体的天然存在的VH结构域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基。此类“骆驼化”置换优选地在形成VH-VL界面和/或存在于VH-VL界面处的氨基酸位置处以及/或者所谓的骆驼科标志残基处插入(参见例如WO 94/04678，以及Davies和Riechmann(1994和1996))。优选地，用作生成或设计骆驼化单结构域的起始材料或起始点的VH序列优选来自哺乳动物的VH序列，更优选人的VH序列，诸如VH3序列。此外，应当注意，在某些实施方案中，本公开内容的此类骆驼化抗PSMA单结构域抗体以本领域已知的任何合适的方式获得(即，如上文(1)-(8)点所示)，因此不严格限于使用包含天然存在的VH结构域的多肽作为起始材料获得的多肽。例如，如本文进一步描述的，“人源化”和“骆驼化”均通过分别提供编码天然存在的VHH结构域或VH结构域的核苷酸序列，然后分别以新核苷酸序列编码“人源化”或“骆驼化”单结构域抗体的方式改变所述核苷酸序列中的一个或多个密码子来进行。然后可以表达该核酸，以提供本公开内容的期望的抗PSMA单结构域抗体。或者，在其他实施方案中，分别基于天然存在的VHH结构域或VH结构域的氨基酸序列，分别设计本公开内容的期望的人源化或骆驼化抗PSMA单结构域抗体的氨基酸序列，然后使用已知的肽合成技术从头合成。在一些实施方案中，分别基于天然存在的VHH结构域或VH结构域的氨基酸序列或核苷酸序列，分别设计编码本公开内容的期望的人源化或骆驼化抗PSMA单结构域抗体的核苷酸序列，然后使用已知的核酸合成技术从头合成，之后使用已知的表达技术表达由此获得的核酸，以提供本公开内容的期望的抗PSMA单结构域抗体。
用于从天然存在的VH序列或VHH序列起始获得本公开内容的抗PSMA单结构域抗体和/或编码该抗PSMA单结构域抗体的核酸的其他合适方法和技术包括例如以合适的方式组合一个或多个天然存在的VH序列(诸如一个或多个框架(FR)序列和/或互补决定区(CDR)序列)的一个或多个部分、一个或多个天然存在的VHH序列(诸如一个或多个FR序列或CDR序列)的一个或多个部分以及/或者一个或多个合成或半合成序列，以提供本公开内容的抗PSMA单结构域抗体或编码该抗PSMA单结构域抗体的核苷酸序列或核酸。
在一些实施方案中，考虑到PSMA结合蛋白质相当小，并且在一些实施方案中不大于25kD、不大于20kD、不大于15kD或不大于10kD。在某些情况下，PSMA结合蛋白质如果是肽或小分子实体，则为5kD或更小。
在一些实施方案中，PSMA结合蛋白质是抗PSMA特异性抗体，其包含重链可变互补决定区(CDR)CDR1、重链可变CDR2、重链可变CDR3、轻链可变CDR1、轻链可变CDR2和轻链可变CDR3。在一些实施方案中，PSMA结合蛋白质包含与PSMA结合的任何结构域，包括但不限于来自单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体的结构域，或者抗原结合片段如单结构域抗体(sdAb)、Fab、Fab'、F(ab)2和Fv片段、由一个或多个CDR组成的片段、单链抗体(例如，单链Fv片段(scFv))、二硫键稳定的Fv(dsFv)片段、异缀合抗体(例如，双特异性抗体)、pFv片段、重链单体或二聚体、轻链单体或二聚体以及由一条重链和一条轻链组成的二聚体。在一些情况下，PSMA结合域来源于本文所述的PSMA结合蛋白质最终将在其中使用的相同物种是有益的。例如，对于人用而言，PSMA结合蛋白质的PSMA结合域包含来自抗体或抗体片段的抗原结合域的人或人源化残基可能是有益的。在一些实施方案中，PSMA结合蛋白质是包含重链可变CDR1、重链可变CDR2和重链可变CDR3的抗PSMA特异性结合蛋白质。在一些实施方案中，PSMA结合蛋白质是包含重链可变CDR1、重链可变CDR2和重链可变CDR3的抗PSMA单结构域抗体。
在一些实施方案中，本公开内容的PSMA结合蛋白质是包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列由被三个互补决定区/序列中断的四个框架区/序列(f1-f4)组成，如下式所示：f1-r1-f2-r2-f3-r3-f4，其中r1、r2和r3分别是互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，并且f1、f2、f3和f4是框架残基。本公开内容的PSMA结合蛋白质的框架残基包含例如75、76、77、78、79、80、81个氨基酸残基，并且互补决定区包含例如30、31、32、33、34、35、36个氨基酸残基。在一些实施方案中，PSMA结合蛋白质包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，其包含框架残基以及CDR1、CDR2和CDR3，其中(a)CDR1包含如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列，或在SEQID NO:16中具有一个、两个、三个或四个氨基酸置换的变体，(b)CDR2包含如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列，或在SEQ ID NO:17中具有一个、两个、三个或四个氨基酸置换的变体，以及(c)CDR3包含如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，或在SEQ ID NO:18中具有一个、两个、三个或四个氨基酸置换的变体。
在一些实施方案中，PSMA结合蛋白质包含如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，其包含框架残基以及CDR1、CDR2和CDR3，其中(a)CDR1包含如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列，或在SEQ ID NO:16中具有一个、两个、三个或四个氨基酸置换的变体，(b)CDR2包含如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列，或在SEQ ID NO:17中具有一个、两个、三个或四个氨基酸置换的变体，以及(c)CDR3包含如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，或在SEQ ID NO:18中具有一个、两个、三个或四个氨基酸置换的变体。
在PSMA结合蛋白质的CDR1包含如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列或者在SEQ IDNO:16中具有一个、两个、三个或四个氨基酸置换的变体的实施方案中，这样的置换包括例如脯氨酸、组氨酸。在PSMA结合蛋白质的CDR2包含如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列或者在SEQ ID NO:17中具有一个、两个、三个或四个氨基酸置换的变体的实施方案中，这样的置换包括例如天冬氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸。
在PSMA结合蛋白质的CDR3包含如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列或者在SEQ IDNO:18中具有一个、两个、三个或四个氨基酸置换的变体的实施方案中，这样的置换包括例如丝氨酸。
在一些实施方案中，本公开内容的PSMA结合蛋白质包含下式：f1-r1-f2-r2-f3-r3-f4，其中r1、r2和r3分别是互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，并且f1、f2、f3和f4是框架残基，并且其中r1包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7，r2包含SEQ ID NO:8、SEQID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14，并且r3包含SEQ ID NO:15。在一些实施方案中，本公开内容的PSMA结合蛋白质是包含下式的单结构域抗体：f1-r1-f2-r2-f3-r3-f4，其中r1、r2和r3分别是互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，并且f1、f2、f3和f4是框架残基，并且其中r1是SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ IDNO:7，r2是SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQID NO:13或SEQ ID NO:14，并且r3是SEQ ID NO:15。
在一些实施方案中，PSMA结合蛋白质包含CDR1、CDR2和CDR3，其中(a)CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1(RFMISX1YX2MH)所示，(b)CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2(X3INPAX4X5TDYAEX6VKG)所示，并且(c)CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3(DX7YGY)所示。在一些实施方案中，PSMA结合蛋白质包含CDR1、CDR2和CDR3，其中(a)CDR1的氨基酸序列如SEQID NO:1(RFMISX1YX2MH)所示，(b)CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，并且(c)CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示。在一些实施方案中，PSMA结合蛋白质包含CDR1、CDR2和CDR3，其中(a)CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示，(b)CDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO:2(X3INPAX4X5TDYAEX6VKG)所示，并且(c)CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示。在一些实施方案中，PSMA结合蛋白质包含CDR1、CDR2和CDR3，其中(a)CDR1的氨基酸序列如SEQID NO:16所示，(b)CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，并且(c)CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3(DX7YGY)所示。在一些实施方案中，PSMA结合蛋白质包含CDR1、CDR2和CDR3，其中(a)CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1(RFMISX1YX2MH)所示，(b)CDR2的氨基酸序列如SEQID NO:2(X3INPAX4X5TDYAEX6VKG)所示，并且(c)CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示。在一些实施方案中，PSMA结合蛋白质包含CDR1、CDR2和CDR3，其中(a)CDR1的氨基酸序列如SEQID NO:1(RFMISX1YX2MH)所示，(b)CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，并且(c)CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3(DX7YGY)所示。在一些实施方案中，PSMA结合蛋白质包含CDR1、CDR2和CDR3，其中(a)CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示，(b)CDR2的氨基酸序列如SEQID NO:2(X3INPAX4X5TDYAEX6VKG)所示，并且(c)CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3(DX7YGY)所示。
在一些实施方案中，氨基酸残基X1、X2、X3、X4、X5、X6和X7独立地选自谷氨酸、脯氨酸、丝氨酸、组氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、赖氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺和酪氨酸。在一些实施方案中，X1是脯氨酸。在一些实施方案中，X2是组氨酸。在一些实施方案中，X3是天冬氨酸。在一些实施方案中，X4是赖氨酸。在一些实施方案中，X5是谷氨酰胺。在一些实施方案中，X6是酪氨酸。在一些实施方案中，X7是丝氨酸。在一些实施方案中，本公开内容的PSMA结合蛋白质可包含CDR1、CDR2和CDR3序列，其中X1是谷氨酸，X2是组氨酸，X3是天冬氨酸，X4是甘氨酸，X5是苏氨酸，X6是丝氨酸，并且X7是丝氨酸。
在一些实施方案中，PSMA结合蛋白质包含CDR1、CDR2和CDR3，其中(a)CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1(RFMISX1YX2MH)所示，(b)CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2(X3INPAX4X5TDYAEX6VKG)所示，并且(c)CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3(DX7YGY)所示，其中X1是脯氨酸。在一些实施方案中，PSMA结合蛋白质包含CDR1、CDR2和CDR3，其中(a)CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1(RFMISX1YX2MH)所示，(b)CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2(X3INPAX4X5TDYAEX6VKG)所示，并且(c)CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3(DX7YGY)所示，其中X5是谷氨酰胺。在一些实施方案中，PSMA结合蛋白质包含CDR1、CDR2和CDR3，其中(a)CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1(RFMISX1YX2MH)所示，(b)CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2(X3INPAX4X5TDYAEX6VKG)所示，并且(c)CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3(DX7YGY)所示，其中X6是酪氨酸。在一些实施方案中，PSMA结合蛋白质包含CDR1、CDR2和CDR3，其中(a)CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1(RFMISX1YX2MH)所示，(b)CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2(X3INPAX4X5TDYAEX6VKG)所示，并且(c)CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3(DX7YGY)所示，其中X4是赖氨酸，并且X7是丝氨酸。在一些实施方案中，PSMA结合蛋白质包含CDR1、CDR2和CDR3，其中(a)CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1(RFMISX1YX2MH)所示，(b)CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2(X3INPAX4X5TDYAEX6VKG)所示，并且(c)CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3(DX7YGY)所示，其中X2是组氨酸，X3是天冬氨酸，X4是赖氨酸，并且X7是丝氨酸。在一些实施方案中，PSMA结合蛋白质包含CDR1、CDR2和CDR3，其中(a)CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1(RFMISX1YX2MH)所示，(b)CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2(X3INPAX4X5TDYAEX6VKG)所示，并且(c)CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3(DX7YGY)所示，其中X1是脯氨酸，X2是组氨酸，X3是天冬氨酸，并且X7是丝氨酸。在一些实施方案中，PSMA结合蛋白质包含CDR1、CDR2和CDR3，其中(a)CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1(RFMISX1YX2MH)所示，(b)CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2(X3INPAX4X5TDYAEX6VKG)所示，并且(c)CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3(DX7YGY)所示，其中X2是组氨酸，X3是天冬氨酸，X5是谷氨酰胺，并且X7是丝氨酸。在一些实施方案中，PSMA结合蛋白质包含CDR1、CDR2和CDR3，其中(a)CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1(RFMISX1YX2MH)所示，(b)CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2(X3INPAX4X5TDYAEX6VKG)所示，并且(c)CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3(DX7YGY)所示，其中X2是组氨酸，X3是天冬氨酸，X6是酪氨酸，并且X7是丝氨酸。在一些实施方案中，PSMA结合蛋白质包含CDR1、CDR2和CDR3，其中(a)CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1(RFMISX1YX2MH)所示，(b)CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2(X3INPAX4X5TDYAEX6VKG)所示，并且(c)CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3(DX7YGY)所示，其中X2是组氨酸，X3是天冬氨酸，并且X7是丝氨酸。
在一些实施方案中，本公开内容的PSMA结合蛋白质可包含CDR1、CDR2和CDR3序列，其中X1是谷氨酸，X2是组氨酸，X3是苏氨酸，X4是甘氨酸，X5是苏氨酸，X6是丝氨酸，并且X7是丝氨酸。在一些实施方案中，本公开内容的PSMA结合蛋白质可包含CDR1、CDR2和CDR3序列，其中X1是谷氨酸，X2是组氨酸，X3是苏氨酸，X4是甘氨酸，X5是苏氨酸，X6是丝氨酸，并且X7是丝氨酸。在一些实施方案中，本公开内容的PSMA结合蛋白质可包含CDR1、CDR2和CDR3序列，其中X1是谷氨酸，X2是丝氨酸，X3是苏氨酸，X4是赖氨酸，X5是苏氨酸，X6是丝氨酸，并且X7是丝氨酸。在一些实施方案中，本公开内容的PSMA结合蛋白质可包含CDR1、CDR2和CDR3序列，其中X1是脯氨酸，X2是丝氨酸，X3是苏氨酸，X4是甘氨酸，X5是苏氨酸，X6是丝氨酸，并且X7是甘氨酸。在一些实施方案中，本公开内容的PSMA结合蛋白质可包含CDR1、CDR2和CDR3序列，其中X1是谷氨酸，X2是丝氨酸，X3是苏氨酸，X4是甘氨酸，X5是谷氨酰胺，X6是丝氨酸，并且X7是甘氨酸。在一些实施方案中，本公开内容的PSMA结合蛋白质可包含CDR1、CDR2和CDR3序列，其中X1是谷氨酸，X2是丝氨酸，X3是苏氨酸，X4是甘氨酸，X5是苏氨酸，X6是酪氨酸，并且X7是甘氨酸。在一些实施方案中，本公开内容的PSMA结合蛋白质可包含CDR1、CDR2和CDR3序列，其中X1是谷氨酸，X2是组氨酸，X3是天冬氨酸，X4是赖氨酸，X5是苏氨酸，X6是丝氨酸，并且X7是丝氨酸。在一些实施方案中，本公开内容的PSMA结合蛋白质可包含CDR1、CDR2和CDR3序列，其中X1是脯氨酸，X2是组氨酸，X3是天冬氨酸，X4是甘氨酸，X5是苏氨酸，X6是丝氨酸，并且X7是丝氨酸。在一些实施方案中，本公开内容的PSMA结合蛋白质可包含CDR1、CDR2和CDR3序列，其中X1是谷氨酸，X2是组氨酸，X3是天冬氨酸，X4是谷氨酰胺，X5是苏氨酸，X6是丝氨酸，并且X7是丝氨酸。在一些实施方案中，本公开内容的PSMA结合蛋白质可包含CDR1、CDR2和CDR3序列，其中X1是谷氨酸，X2是组氨酸，X3是天冬氨酸，X4是甘氨酸，X5是苏氨酸，X6是酪氨酸，并且X7是丝氨酸。在一些实施方案中，本公开内容的PSMA结合蛋白质可包含CDR1、CDR2和CDR3序列，其中X2是组氨酸，并且X7是丝氨酸。示例性的框架序列被公开为SEQ ID NO:165-168。
在一些实施方案中，前列腺特异性膜抗原结合蛋白质包含以下的任意组合：(i)其中X1是脯氨酸；(ii)其中X2是组氨酸；(iii)其中X3是天冬氨酸；(iv)其中X4是赖氨酸；(v)其中X5是谷氨酰胺；(vi)其中X6是酪氨酸；以及(vii)其中X7是丝氨酸。在一些实施方案中，以上实施方案的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质相对于具有如SEQ ID NO:4所示的序列的结合蛋白质对人前列腺特异性膜抗原具有更高的亲和力。在一些实施方案中，前列腺特异性膜抗原结合包含以下的任意组合：(i)其中X1是脯氨酸；其中X5是谷氨酰胺；(ii)其中X6是酪氨酸；其中X4是赖氨酸，并且X7是丝氨酸；(iii)其中X2是组氨酸，X3是天冬氨酸，X4是赖氨酸，并且X7是丝氨酸；(iv)其中X1是脯氨酸，X2是组氨酸，X3是天冬氨酸，并且X7是丝氨酸；(v)其中X2是组氨酸，X3是天冬氨酸，X5是谷氨酰胺，并且X7是丝氨酸；(vi)其中X2是组氨酸，X3是天冬氨酸，X4是赖氨酸，并且X7是丝氨酸；(vii)其中X1是脯氨酸，X2是组氨酸，X3是天冬氨酸，并且X7是丝氨酸；(viii)其中X2是组氨酸，X3是天冬氨酸，X5是谷氨酰胺，并且X7是丝氨酸；(ix)其中X2是组氨酸，X3是天冬氨酸，X6是酪氨酸，并且X7是丝氨酸；以及(x)其中X2是组氨酸，X3是天冬氨酸，并且X7是丝氨酸。
在一些实施方案中，PSMA结合蛋白质具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，PSMA结合蛋白质具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸位置被置换。在一些实施方案中，SEQ ID NO:4的氨基酸位置19、86、87和106中的一个或多个被置换。氨基酸位置19、86、87和106的示例性置换包括但不限于T19R、K86R、P87A和Q106L。在一些实施方案中，SEQ ID NO:4的氨基酸位置31、33、50、55、56、62和97的中一个或多个被置换。在一些实施方案中，SEQ ID NO:4的氨基酸位置31被置换为E31P。在一些实施方案中，SEQ ID NO:4的氨基酸位置33被置换为S33H。在一些实施方案中，SEQ ID NO:4的氨基酸位置50被置换为T50D。在一些实施方案中，SEQ ID NO:4的氨基酸位置55被置换为G55K。在一些实施方案中，SEQ ID NO:4的氨基酸位置56被置换为T56Q。在一些实施方案中，SEQ ID NO:4的氨基酸位置62被置换为S62Y。在一些实施方案中，SEQ ID NO:4的氨基酸位置97被置换为G97S。在一些实施方案中，SEQ ID NO:4的氨基酸位置33被置换为S33H。在一些实施方案中，在位置31处的SEQ ID NO:4的置换与在位置50和97处的置换组合。在一些实施方案中，SEQ ID NO:4的氨基酸位置31、50和97分别被置换为E31P、T50D和G97S。在一些实施方案中，在位置33处的SEQ ID NO:4的置换与在位置97处的置换组合。在一些实施方案中，SEQ ID NO:4的氨基酸位置33和97分别被置换为S33H和G97S。在一些实施方案中，在位置33处的SEQ ID NO:4的置换与在位置50和97处的置换组合。在一些实施方案中，SEQ IDNO:4的氨基酸位置33、50和97分别被置换为S33H、T50D和G97S。在一些实施方案中，在位置33处的SEQ ID NO:4的置换与在位置50、55和97处的置换组合。在一些实施方案中，SEQ IDNO:4的氨基酸位置33、50、55和97分别被置换为S33H、T50D、G55K和G97S。在一些实施方案中，在位置33处的SEQ ID NO:4的置换与在位置31、50和97处的置换组合。在一些实施方案中，SEQ ID NO:4的氨基酸位置31、33、50和97分别被置换为E31P、S33H、T50D和G97S。在一些实施方案中，在位置33处的SEQ ID NO:4的置换与在位置50、56和97处的置换组合。在一些实施方案中，SEQ ID NO:4的氨基酸位置33、50、56和97分别被置换为S33H、T50D、T56Q和G97S。在一些实施方案中，在位置33处的SEQ ID NO:4的置换与在位置50、62和97处的置换组合。在一些实施方案中，SEQ ID NO:4的氨基酸位置33、50、62和97分别被置换为S33H、T50D、S62Y和G97S。
在一些实施方案中，PSMA结合蛋白质具有如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，PSMA结合蛋白质具有如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸位置被置换。在一些实施方案中，SEQ ID NO:19的氨基酸位置31、33、50、55、56、62和97中的一个或多个被置换。在一些实施方案中，SEQ ID NO:4的氨基酸位置31被置换为E31P。在一些实施方案中，SEQ ID NO:19的氨基酸位置33被置换为S33H。在一些实施方案中，SEQ ID NO:19的氨基酸位置50被置换为T50D。在一些实施方案中，SEQ ID NO:19的氨基酸位置55被置换为G55K。在一些实施方案中，SEQ ID NO:19的氨基酸位置56被置换为T56Q。在一些实施方案中，SEQ ID NO:19的氨基酸位置62被置换为S62Y。在一些实施方案中，SEQID NO:19的氨基酸位置97被置换为G97S。在一些实施方案中，SEQ ID NO:19的氨基酸位置33被置换为S33H。在一些实施方案中，在位置31处的SEQ ID NO:19的置换与在位置50和97处的置换组合。在一些实施方案中，SEQ ID NO:19的氨基酸位置31、50和97分别被置换为E31P、T50D和G97S。在一些实施方案中，在位置33处的SEQ ID NO:19的置换与在位置97处的置换组合。在一些实施方案中，SEQ ID NO:19的氨基酸位置33和97分别被置换为S33H和G97S。在一些实施方案中，在位置33处的SEQ ID NO:19的置换与在位置50和97处的置换组合。在一些实施方案中，SEQ ID NO:19的氨基酸位置33、50和97分别被置换为S33H、T50D和G97S。在一些实施方案中，在位置33处的SEQ ID NO:19的置换与在位置50、55和97处的置换组合。在一些实施方案中，SEQ ID NO:19的氨基酸位置33、50、55和97分别被置换为S33H、T50D、G55K和G97S。在一些实施方案中，在位置33处的SEQ ID NO:19的置换与在位置31、50和97处的置换组合。在一些实施方案中，SEQ ID NO:19的氨基酸位置31、33、50和97分别被置换为E31P、S33H、T50D和G97S。在一些实施方案中，在位置33处的SEQ ID NO:19的置换与在位置50、56和97处的置换组合。在一些实施方案中，SEQ ID NO:19的氨基酸位置33、50、56和97分别被置换为S33H、T50D、T56Q和G97S。在一些实施方案中，在位置33处的SEQ ID NO:4的置换与在位置50、62和97处的置换组合。在一些实施方案中，SEQ ID NO:4的氨基酸位置33、50、62和97分别被置换为S33H、T50D、S62Y和G97S。
在一些实施方案中，前列腺特异性膜抗原结合蛋白质包含以下的任意组合：(i)在位置31处的置换；(ii)在位置50处的置换；(iii)在位置55处的置换；在位置56处的置换；(iv)在位置62处的置换；(v)在位置97处的置换；(vi)在位置55和97处的置换；(vii)在位置33和97处的置换；(viii)在位置33、50和97处的置换；(ix)在位置31、33、50和97处的置换；(x)在位置33、50、55和97处的置换；(xi)在位置33、50、56和97处的置换；以及(xiii)在位置33、50、62和97处的置换。
在一些实施方案中，PSMA结合蛋白质与人和食蟹猴PSMA具有交叉反应性。在一些实施方案中，PSMA结合蛋白质对人PSMA具有特异性。在各个实施方案中，本公开内容的PSMA结合蛋白质与SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列至少约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％相同。
在各个实施方案中，本公开内容的PSMA结合蛋白质与SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列至少约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％相同。
在各个实施方案中，本公开内容的PSMA结合蛋白质的互补决定区与SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％相同。
在各个实施方案中，本公开内容的PSMA结合蛋白质的互补决定区与SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列至少约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％相同。
在各个实施方案中，本公开内容的PSMA结合蛋白质的互补决定区与SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列至少约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％相同。
人源化和亲和力成熟
在为了治疗应用设计结合蛋白质时，期望产生例如调节靶标的功能活性的蛋白质以及/或者改善的结合蛋白质(如具有更高特异性和/或亲和力的结合蛋白质)以及/或者在特定的细胞或组织环境中更具生物利用度或更稳定或更可溶的结合蛋白质。
本公开内容中描述的PSMA结合蛋白质表现出改善了对靶结合域即PSMA的结合亲和力。本公开内容鉴别了本文所述的PSMA结合蛋白质的互补决定区(CDR)中的氨基酸置换，其导致对人和食蟹猴PSMA中的一种或两种的更高的结合亲和力。在一些实施方案中，PSMA结合蛋白质是抗体。在某些实施方案中，PSMA结合蛋白质是人源化抗体。通常，人源化抗体包含一个或多个可变域，其中CDR或CDR的部分来源于非人抗体，并且框架区或框架区的部分来源于人抗体序列。任选地，人源化抗体还包含人恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，选择的框架残基被来自非人抗体(例如，CDR所来源于的抗体)的相应残基置换，例如，以恢复或改善抗体特异性、亲和力或pH依赖性。可用于人源化的人框架区包括但不限于使用最佳拟合方法选择的框架区(例如，Sims等人，J Immunol 151:2296,1993)；衍生自轻链或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列的框架区(例如，Carter等人，Proc Natl AcadSci USA,89:4285,1992；和Presta等人，J Immunol,151:2623,1993)；人成熟(体细胞突变)框架区或人种系框架区(例如，Almagro和Fransson,Front Biosci 13:1619-1633,2008)；以及衍生自筛选框架文库的框架区(例如，Baca等人，J Biol Chem 272:10678-10684,1997；和Rosok等人，J Biol Chem 271:22611-22618,1996)。因此，在一个方面，PSMA结合蛋白质包含人源化抗体或人抗体或者抗体片段。在一个实施方案中，人源化或人抗PSMA结合蛋白质包含本文所述的人源化或人抗PSMA结合域的轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)中的一个或多个(例如，全部三个)，以及/或者本文所述的人源化或人抗PSMA结合域的重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)中的一个或多个(例如，全部三个)，例如，人源化或人抗PSMA结合域包含一个或多个，例如，全部三个LC CDR，以及一个或多个，例如全部三个HC CDR。在一些实施方案中，人源化或人抗PSMA结合域包含对PSMA具有特异性的人源化或人轻链可变区，其中对PSMA具有特异性的轻链可变区在人轻链框架区中包含人或非人轻链CDR。在某些情况下，该轻链框架区为λ(lamda)轻链框架。在其他情况下，该轻链框架区为κ(kappa)轻链框架。在一些实施方案中，人源化或人抗PSMA结合域包含对PSMA具有特异性的人源化或人重链可变区，其中对PSMA具有特异性的重链可变区在人重链框架区中包含人或非人重链CDR。在某些情况下，重链和/或轻链的互补决定区衍生自已知的抗PSMA抗体，例如7E11、EPR6253、107.1A4、GCP-05、EP3253、BV9、SP29、人PSMA/FOLH1/NAALADase I抗体。
在一些实施方案中，本公开内容的PSMA结合蛋白质是亲和力成熟的，以增加其对靶结合域的结合亲和力。当需要改善本公开内容的PSMA结合蛋白质，如含有一种或多种上述CDR的抗PSMA抗体的亲和力时，可通过许多亲和力成熟方案获得具有改善的亲和力的这样的抗体，该方案包括但不限于维持CDR、链改组、使用大肠杆菌(E.coli)的突变菌株、DNA改组、噬菌体展示和有性获得。Vaughan等人讨论了上述亲和力成熟的示例性方法(NatureBiotechnology,16,535-539,1998)。因此，除了前述部分中讨论的PSMA结合蛋白质变体之外，本公开内容进一步提供了改善了结合蛋白质对其靶标即PSMA的亲和力的序列变体。在某些实施方案中，这样的序列变体在PSMA结合蛋白质序列内包含一个或多个半保守或保守置换，并且这样的置换优选地不显著影响结合蛋白质的期望活性。置换可以是天然存在的或可以例如使用诱变引入(例如，Hutchinson等人，1978,J.Biol.Chem.253:6551)。例如，甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸等氨基酸通常可以相互置换(具有脂肪族侧链的氨基酸)。在这些可能的置换中，通常使用甘氨酸和丙氨酸相互置换，因为它们具有相对短的侧链，并且使用缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸相互置换，因为它们具有疏水性的较大脂肪族侧链。可以经常相互置换的其他氨基酸包括但不限于：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸(具有芳香族侧链的氨基酸)；赖氨酸、精氨酸和组氨酸(具有碱性侧链的氨基酸)；天冬氨酸和谷氨酸(具有酸性侧链的氨基酸)；天冬酰胺和谷氨酰胺(具有酰胺侧链的氨基酸)；以及半胱氨酸和甲硫氨酸(具有含硫侧链的氨基酸)。
在一些实施方案中，通过筛查组合文库来分离PSMA结合蛋白质，例如，通过生成噬菌体展示文库并筛查这样的文库以获得具有期望的结合特性的抗体。此外，可以选择PSMA结合蛋白质对其结合靶标的结合亲和力，以便针对特定PSMA白蛋白结合蛋白质中的特定消除半衰期。因此，在一些实施方案中，PSMA结合蛋白质对其结合靶标具有高结合亲和力。在其他实施方案中，PSMA结合蛋白质对其结合靶标具有中等结合亲和力。在其他实施方案中，PSMA结合蛋白质对其结合靶标具有低或微小的结合亲和力。示例性结合亲和力包括10nM或更小(高)、10nM至100nM(中等)和大于100nM(低)的Kd。与PSMA结合的亲和力可通过例如结合蛋白质本身或其PSMA结合域与测定板上包被的PSMA、微生物细胞表面上展示的PSMA、溶液中的PSMA等结合的能力来确定。本公开内容的蛋白质与PSMA的结合活性还可通过将配体(例如，PSMA)或所述结合蛋白质本身或其PSMA结合域固定至珠子、基底、细胞等来测定。在一些实施方案中，PSMA结合蛋白质本身或其PSMA结合域与靶配体(如PSMA)之间的结合例如通过结合动力学测定来测定。在某些实施方案中，结合动力学测定使用系统进行。在这样的实施方案中，第一步包括以最佳加载密度将配体(例如，生物素化的PSMA)固定在生物传感器(例如，链霉亲和素生物传感器)的表面上，然后用测定缓冲液洗涤来去除未结合的配体，然后将分析物缔合，即PSMA结合蛋白质本身或其PSMA结合域与配体缔合，然后将生物传感器暴露于不含分析物的缓冲液，从而导致PSMA结合蛋白质本身或其PSMA结合域与配体解离。使用合适的封闭剂如BSA、酪蛋白、吐温-20、PEG、明胶等来封闭生物传感器上的非特异性结合位点。随后使用适当的软件(例如，ForteBio的Octet软件)分析结合动力学数据，以确定PSMA结合蛋白本身或其PSMA结合域与配体之间的结合相互作用的缔合和解离速率常数。
在某些实施方案中，本文公开的PSMA结合蛋白质以人Kd(hKd)与人PSMA结合。在某些实施方案中，本文公开的PSMA结合蛋白质以食蟹猴Kd(cKd)与食蟹猴PSMA结合。在某些实施方案中，本文公开的PSMA结合蛋白质以食蟹猴Kd(cKd)与食蟹猴PSMA结合并且以人Kd(hKd)与人PSMA结合。在一些实施方案中，hKd和cKd的范围为约0.1nM至约500nM。在一些实施方案中，hKd和cKd的范围为约0.1nM至约450nM。在一些实施方案中，hKd和cKd的范围为约0.1nM至约400nM。在一些实施方案中，hKd和cKd的范围为约0.1nM至约350nM。在一些实施方案中，hKd和cKd的范围为约0.1nM至约300nM。在一些实施方案中，hKd和cKd的范围为约0.1nM至约250nM。在一些实施方案中，hKd和cKd的范围为约0.1nM至约200nM。在一些实施方案中，hKd和cKd的范围为约0.1nM至约150nM。在一些实施方案中，hKd和cKd的范围为约0.1nM至约100nM。在一些实施方案中，hKd和cKd的范围为约0.1nM至约90nM。在一些实施方案中，hKd和cKd的范围为约0.2nM至约80nM。在一些实施方案中，hKd和cKd的范围为约0.3nM至约70nM。在一些实施方案中，hKd和cKd的范围为约0.4nM至约50nM。在一些实施方案中，hKd和cKd的范围为约0.5nM至约30nM。在一些实施方案中，hKd和cKd的范围为约0.6nM至约10nM。在一些实施方案中，hKd和cKd的范围为约0.7nM至约8nM。在一些实施方案中，hKd和cKd的范围为约0.8nM至约6nM。在一些实施方案中，hKd和cKd的范围为约0.9nM至约4nM。在一些实施方案中，hKd和cKd的范围为约1nM至约2nM。在一些实施方案中，PSMA结合蛋白质以相当的结合亲和力(Kd)与人和食蟹猴PSMA结合。
在一些实施方案中，本公开内容的PSMA结合蛋白质包含如SEQ ID NO:4所示的序列并且具有约10nM至约20nM的hKd。在一些实施方案中，本公开内容的PSMA结合蛋白质在SEQ ID NO:4的氨基酸位置31处包含谷氨酸到脯氨酸的突变并且具有约5nM至约10nM的hKd。在一些实施方案中，本公开内容的PSMA结合蛋白质在SEQ ID NO:4的氨基酸位置56处包含苏氨酸到谷氨酰胺的突变并且具有约1nM至约7nM的hKd。在一些实施方案中，本公开内容的PSMA结合蛋白质在SEQ ID NO:4的氨基酸位置55处包含甘氨酸到赖氨酸的突变并且具有约0.5nM至约5nM的hKd。在一些实施方案中，本公开内容的PSMA结合蛋白质在SEQ ID NO:4的氨基酸位置33处包含丝氨酸到组氨酸的突变，在氨基酸位置50处包含苏氨酸到天冬氨酸的突变，以及在氨基酸位置97处包含甘氨酸到丝氨酸的置换，并且具有约5nM至约10nM的hKd。在一些实施方案中，本公开内容的PSMA结合蛋白质在SEQ ID NO:4的氨基酸位置33处包含丝氨酸到组氨酸的突变，以及在氨基酸位置97处包含甘氨酸到丝氨酸的置换，并且具有约0.05nM至约2nM的hKd。因此，在各个实施方案中，与如SEQ ID NO:4所示的序列相比包含一个或多个置换的PSMA结合蛋白质相比于包含没有任何置换的SEQ ID NO:4的序列的蛋白质对人PSMA具有高达1.5倍至约300倍的结合亲和力。例如，当SEQ ID NO:4的置换包含E31P时，结合亲和力高达约1.5倍至约3倍；当SEQ ID NO:4的置换包含T56Q时，高达约2倍至约15倍；当SEQ ID NO:4的置换包含G55K时，高达约3倍至约30倍；当SEQ ID NO:4的置换包含S33H T50D G97S时，高达约2倍至约3倍；并且当SEQ ID NO:4的置换包含S33H G97S时，高达约5倍至约300倍。在一些实施方案中，如上所述，SEQ ID NO:4的一个或多个氨基酸置换导致对人和食蟹猴PSMA的结合亲和力增强，例如，与包含没有任何置换的SEQ ID NO:4的序列的蛋白质相比，包含SEQ ID NO:4中的氨基酸置换S33H和G97S的本公开内容的PSMA结合蛋白质显示出对人和食蟹猴PSMA的增加的亲和力。在包含SEQ ID NO:4中的氨基酸置换S33H、T50D和G97S的PSMA结合蛋白质的情况下，观察到这样的双重亲和力增强的另一个实例。在一些实施方案中，任何前述PSMA结合蛋白质(例如，SEQ ID No.21-32的抗PSMA单结构域抗体)是亲和肽标记的，以便易于纯化。在一些实施方案中，亲和肽标签是六个连续的组氨酸残基，也称为6his(SEQ ID NO:33)。
本公开内容的PSMA结合蛋白质(例如抗PSMA单结构域抗体)的结合亲和力还可以用相对术语描述，或与同样与PSMA特异性结合的第二结合蛋白质(例如，对PSMA具有特异性的第二种抗PSMA单结构域抗体，其在本文可称为“第二PSMA特异性抗体”)的结合亲和力进行比较。在一些实施方案中，第二PSMA特异性抗体是本文所述的任何PSMA结合蛋白质变体，如SEQ ID No.21-32所定义的结合蛋白质。因此，本公开内容的某些实施方案涉及相对于SEQ ID NO:4的结合蛋白质以更高的亲和力与人PSMA和/或食蟹猴PSMA结合，或者相对于SEQ ID NO:4的结合蛋白质的Kd具有更低的Kd的抗PSMA单结构域抗体。此外，本公开内容的另外的实施方案涉及相对于SEQ ID NO:19的结合蛋白质以更高的亲和力与人PSMA和/或食蟹猴PSMA结合，或者相对于SEQ ID NO:19的结合蛋白质的Kd具有更低的Kd的抗PSMA单结构域抗体。
CD3结合域
T细胞应答的特异性由T细胞受体复合物对抗原(在主要组织相容性复合物MHC的环境中展示)的识别来介导。作为T细胞受体复合物的一部分，CD3是包含CD3γ(gamma)链、CD3δ(delta)链和存在于细胞表面上的两条CD3ε(epsilon)链的蛋白质复合物。CD3与T细胞受体(TCR)的α(alpha)和β(beta)链缔合并与CD3ζ(zeta)一起构成T细胞受体复合物。CD3在T细胞上诸如通过固定化抗CD3抗体的簇集导致T细胞活化，这类似于T细胞受体的接合，但不依赖于其克隆特有的特异性。
在一个方面，本文描述了包含根据本公开内容的PSMA结合蛋白质的多特异性蛋白质。在一些实施方案中，该多特异性蛋白质进一步包含与CD3特异性结合的结构域。在一些实施方案中，该多特异性蛋白质进一步包含与CD3γ特异性结合的结构域。在一些实施方案中，该多特异性蛋白质进一步包含与CD3δ特异性结合的结构域。在一些实施方案中，该多特异性蛋白质进一步包含与CD3ε特异性结合的结构域。
在另外的实施方案中，所述多特异性蛋白质进一步包含与T细胞受体(TCR)特异性结合的结构域。在一些实施方案中，该多特异性蛋白质进一步包含与TCR的α链特异性结合的结构域。在一些实施方案中，该多特异性蛋白质进一步包含与TCR的β链特异性结合的结构域。
在一些实施方案中，所述多特异性蛋白质进一步包含与大量血清蛋白质如人血清白蛋白(HSA)特异性结合的结构域。在一些实施方案中，该HSA结合域包含选自SEQ ID NO:123-146的序列。
在一些实施方案中，所述多特异性蛋白质是靶向PSMA的三特异性抗原结合蛋白质，在本文中也称为靶向PSMA的TriTAC分子或PSMA三特异性分子或三特异性分子。
在某些实施方案中，包含本文所述的PSMA结合蛋白质的多特异性蛋白质的CD3结合域不仅表现出有效的对人CD3的CD3结合亲和力，而且还显示出与相应的食蟹猴CD3蛋白质的优异的交叉反应性。在一些情况下，该多特异性蛋白质的CD3结合域与来自食蟹猴的CD3具有交叉反应性。
在一些实施方案中，包含本文所述的PSMA结合蛋白质的多特异性蛋白质的CD3结合域可以是与CD3结合的任何结构域，包括但不限于来自单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体的结构域，或者CD3结合抗体的抗原结合片段，诸如单结构域抗体(sdAb)、Fab、Fab'、F(ab)2和Fv片段、由一个或多个CDR组成的片段、单链抗体(例如，单链Fv片段(scFv))、二硫键稳定的Fv(dsFv)片段、异缀合抗体(例如，双特异性抗体)、pFv片段、重链单体或二聚体、轻链单体或二聚体以及由一条重链和一条轻链组成的二聚体。在一些情况下，CD3结合域来源于包含本文所述的单一PSMA结合蛋白质的多特异性蛋白质最终将在其中使用的相同物种是有益的。例如，对于人用而言，包含本文所述的PSMA结合蛋白质的多特异性蛋白质的CD3结合域包含来自抗体或抗体片段的PSMA结合域的人或人源化残基可能是有益的。
因此，在一个方面，包含PSMA结合蛋白质的多特异性蛋白质的CD3结合域包含人源化或人抗体或抗体片段，或者鼠抗体或抗体片段。在一个实施方案中，人源化或人抗CD3结合域包含本文所述的人源化或人抗CD3结合域的轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)中的一个或多个(例如，全部三个)轻链互补决定区，以及/或者本文所述的人源化或人抗CD3结合域的重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)中的一个或多个(例如，全部三个)重链互补决定区，例如，人源化或人抗CD3结合域包含一个或多个，例如全部三个LC CDR，以及一个或多个，例如全部三个HC CDR。
在一些实施方案中，人源化或人抗CD3结合域包含对CD3具有特异性的人源化或人轻链可变区，其中对CD3具有特异性的轻链可变区包含人轻链框架区中的人或非人轻链CDR。在某些情况下，该轻链框架区为λ(lambda)轻链框架。在其他情况下，该轻链框架区为κ(kappa)轻链框架。
在一些实施方案中，人源化或人抗CD3结合域包含对CD3具有特异性的人源化或人重链可变区，其中对CD3具有特异性的重链可变区包含人重链框架区中的人或非人重链CDR。
在某些情况下，重链和/或轻链的互补决定区衍生自已知的抗CD3抗体，例如，莫罗单抗-CD3(OKT3)、奥昔珠单抗(TRX4)、替利珠单抗(MGA031)、维西珠单抗(Nuvion)、SP34、TR-66或X35-3、VIT3、BMA030(BW264/56)、CLB-T3/3、CRIS7、YTH12.5、F111-409、CLB-T3.4.2、TR-66、WT32、SPv-T3b、11D8、XIII-141、XIII-46、XIII-87、12F6、T3/RW2-8C8、T3/RW2-4B6、OKT3D、M-T301、SMC2、F101.01、UCHT-1和WT-31。
在一个实施方案中，抗CD3结合域为包含本文提供的氨基酸序列的轻链和重链的单链可变片段(scFv)。如本文所用的，“单链可变片段”或“scFv”是指包含轻链可变区的抗体片段和至少一个包含重链可变区的抗体片段，其中该轻链和重链可变区经由短的柔性多肽连接体连续连接，并且能够表达为单多肽链，并且其中该scFv保留其所衍生自的完整抗体的特异性。在一个实施方案中，抗CD3结合域包含：轻链可变区，其包含具有本文提供的轻链可变区的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰(例如，置换)但不超过30、20或10个修饰(例如，置换)的氨基酸序列，或与本文提供的氨基酸序列具有95％-99％同一性的序列；和/或重链可变区，其包含具有本文提供的重链可变区的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰(例如，置换)但不超过30、20或10个修饰(例如，置换)的氨基酸序列，或与本文提供的氨基酸序列具有95％-99％同一性的序列。在一个实施方案中，人源化或人抗CD3结合域为scFv，并且包含本文所述氨基酸序列的轻链可变区经由scFv连接体附接至包含本文所述氨基酸序列的重链可变区。scFv的轻链可变区和重链可变区可以是例如以下方向中的任何一种：轻链可变区-scFv连接体-重链可变区或重链可变区-scFv连接体-轻链可变区。
在一些情况下，根据已知方法制备与CD3结合的scFv。例如，可通过利用柔性多肽连接体将VH和VL区连接在一起来产生scFv分子。该scFv分子包含具有优化的长度和/或氨基酸组成的scFv连接体(例如，Ser-Gly连接体)。因此，在一些实施方案中，该scFv连接体的长度使得VH或VL结构域可以与其他可变域进行分子间缔合，从而形成CD3结合位点。在某些实施方案中，这样的scFv连接体是“短的”，即，由0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸残基组成。因此，在某些情况下，该scFv连接体由约12个或更少的氨基酸残基组成。在0个氨基酸残基的情况下，该scFv连接体为肽键。在一些实施方案中，这些scFv连接体由约3个至约15个，例如8、9或10个连续氨基酸残基组成。关于scFv连接体的氨基酸组成，选择能赋予柔性、不干扰可变域以及允许链间折叠以使两个可变域一起形成功能性CD3结合位点的肽。例如，包含甘氨酸和丝氨酸残基的scFv连接体通常提供蛋白酶抗性。在一些实施方案中，scFv中的连接体包含甘氨酸和丝氨酸残基。该scFv连接体的氨基酸序列可通过例如噬菌体展示法进行优化，以提高scFv的CD3结合和产率。适合于连接scFv中可变轻链结构域和可变重链结构域的肽scFv连接体的实例包括但不限于(GS)n(SEQ ID NO:157)、(GGS)n(SEQID NO:158)、(GGGS)n(SEQ ID NO:159)、(GGSG)n(SEQ ID NO:160)、(GGSGG)n(SEQ ID NO:161)或(GGGGS)n(SEQ ID NO:162)，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一个实施方案中，scFv连接体可以是(GGGGS)4(SEQ ID NO:163)或(GGGGS)3(SEQ ID NO:164)。连接体长度的变化可保持或增强活性，从而在活性研究中产生优异的功效。
在一些实施方案中，PSMA三特异性抗原结合蛋白质的CD3结合域对表达CD3的细胞上的CD3具有亲和力，其KD为1000nM或更低、500nM或更低、200nM或更低、100nM或更低、80nM或更低、50nM或更低、20nM或更低、10nM或更低、5nM或更低、1nM或更低或者0.5nM或更低。在一些实施方案中，PSMA三特异性抗原结合蛋白质的CD3结合域对CD3ε、CD3γ或CD3δ具有亲和力，其KD为1000nM或更低、500nM或更低、200nM或更低、100nM或更低、80nM或更低、50nM或更低、20nM或更低、10nM或更低、5nM或更低、1nM或更低或者0.5nM或更低。在进一步的实施方案中，PSMA三特异性抗原结合蛋白质的CD3结合域对CD3具有低亲和力，即，约100nM或更高。
与CD3结合的亲和力可通过例如PSMA三特异性抗原结合蛋白质本身或其CD3结合域与测定板上包被的CD3、微生物细胞表面上展示的CD3、溶液中的CD3等结合的能力来确定。本发明的PSMA三特异性抗原结合蛋白质本身或其CD3结合域与CD3的结合活性可以如下测定：将配体(例如，CD3)或PSMA三特异性抗原结合蛋白质本身或其CD3结合域固定至珠子、基底、细胞等。可将试剂添加至合适的缓冲液中并将结合配偶体在给定的温度下温育一段时间。洗涤以去除未结合的物质后，可采用例如SDS、高pH缓冲液等释放结合的蛋白质，并通过例如表面等离子体共振(SPR)进行分析。
在一些实施方案中，本文所述的CD3结合域包含具有表7中所述序列(SEQ ID NO:34-88)及其子序列的多肽。在一些实施方案中，该CD3结合域包含与表7中所述序列(SEQ IDNO:34-122)具有至少70％-95％或更高同源性的多肽。在一些实施方案中，该CD3结合域包含与表7中所述序列(SEQ ID NO:34-122)具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高同源性的多肽。在一些实施方案中，该CD3结合域具有包含表7中所述序列(SEQ ID NO:34-122)的至少一部分的序列。在一些实施方案中，该CD3结合域包含含有表7中所述序列(SEQ ID NO:34-122)中的一种或多种序列的多肽。
在某些实施方案中，CD3结合域包含具有重链CDR1的scFv，该重链CDR1包含SEQ IDNO:49和56-67。在某些实施方案中，CD3结合域包含具有重链CDR2的scFv，该重链CDR2包含SEQ ID NO:50和68-77。在某些实施方案中，CD3结合域包含具有重链CDR3的scFv，该重链CDR3包含SEQ ID NO:51和78-87。在某些实施方案中，CD3结合域包含具有轻链CDR1的scFv，该轻链CDR1包含SEQ ID NO:53和88-100。在某些实施方案中，CD3结合域包含具有轻链CDR2的scFv，该轻链CDR2包含SEQ ID NO:54和101-113。在某些实施方案中，CD3结合域包含具有轻链CDR3的scFv，该轻链CDR3包含SEQ ID NO:55和114-120。
与CD3结合的亲和力可通过例如包含PSMA结合蛋白质的多特异性蛋白质本身或其CD3结合域与测定板上包被的CD3、微生物细胞表面上展示的CD3、溶液中的CD3等结合的能力来确定。根据本公开内容的包含PSMA结合蛋白质的多特异性蛋白质本身或其CD3结构域与CD3的结合活性可通过将配体(例如，CD3)或所述多特异性蛋白质本身或其CD3结合域固定至珠子、基底、细胞等来测定。包含PSMA结合蛋白质的多特异性蛋白质本身或其CD3结构域与CD3结合的结合活性可通过将配体(例如，CD3)或所述多特异性蛋白质本身或其PSMA结合域固定至珠子、基底、细胞等来测定。在一些实施方案中，包含PSMA结合蛋白质的多特异性蛋白质与靶配体(如CD3)之间的结合通过例如结合动力学测定来测定。在某些实施方案中，结合动力学测定使用系统进行。在这样的实施方案中，第一步包括以最佳加载密度将配体(例如，生物素化的CD3)固定在生物传感器(例如，链霉亲和素生物传感器)的表面上，然后用测定缓冲液洗涤来去除未结合的配体；然后将分析物缔合，例如，包含PSMA结合蛋白质的多特异性蛋白质与配体缔合，随后将生物传感器暴露于不含分析物的缓冲液，从而导致包含PSMA结合蛋白质的多特异性蛋白质与配体解离。在动力学测定期间，使用合适的封闭剂如BSA、酪蛋白、吐温-20、PEG、明胶等来封闭生物传感器上的非特异性结合位点。随后使用适当的软件(例如，ForteBio的Octet软件)分析结合动力学数据，以确定包含PSMA结合蛋白质的多特异性蛋白质与配体之间的结合相互作用的缔合和解离速率常数。
在一个方面，所述靶向PSMA的三特异性蛋白质包含与CD3特异性结合的结构域(A)、与人血清白蛋白(HSA)特异性结合的结构域(B)以及与PSMA特异性结合的结构域(C)。靶向PSMA的三特异性蛋白质中的这三个结构域以任意顺序排列。因此，预计所述靶向PSMA的三特异性蛋白质的结构域顺序为：
H2N-(A)-(B)-(C)-COOH、
H2N-(A)-(C)-(B)-COOH、
H2N-(B)-(A)-(C)-COOH、
H2N-(B)-(C)-(A)-COOH、
H2N-(C)-(B)-(A)-COOH或
H2N-(C)-(A)-(B)-COOH。
在一些实施方案中，所述靶向PSMA的三特异性蛋白质具有H2N-(A)-(B)-(C)-COOH的结构域顺序。在一些实施方案中，所述靶向PSMA的三特异性蛋白质具有H2N-(A)-(C)-(B)-COOH的结构域顺序。在一些实施方案中，所述靶向PSMA的三特异性蛋白质具有H2N-(B)-(A)-(C)-COOH的结构域顺序。在一些实施方案中，所述靶向PSMA的三特异性蛋白质具有H2N-(B)-(C)-(A)-COOH的结构域顺序。在一些实施方案中，所述靶向PSMA的三特异性蛋白质具有H2N-(C)-(B)-(A)-COOH的结构域顺序。在一些实施方案中，所述靶向PSMA的三特异性蛋白质具有H2N-(C)-(A)-(B)-COOH的结构域顺序。
在一些实施方案中，所述靶向PSMA的三特异性蛋白质具有HSA结合域作为中间结构域，使得结构域顺序为H2N-(A)-(B)-(C)-COOH或H2N-(C)-(B)-(A)-COOH。预计在HSA结合域作为中间结构域的这类实施方案中，赋予CD3和PSMA结合域额外的柔性以结合其各自的靶标。
在一些实施方案中，本文所述的靶向PSMA的三特异性蛋白质包含具有表10中所述序列(SEQ ID NO:147-156)及其子序列的多肽。在一些实施方案中，该三特异性抗原结合蛋白质包含与表10中所述序列(SEQ ID NO:147-156)具有至少70％-95％或更高同源性的多肽。在一些实施方案中，该三特异性抗原结合蛋白质包含与表10中所述序列(SEQ ID NO:1470-156)具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高同源性的多肽。在一些实施方案中，该三特异性抗原结合蛋白质具有包含表10中所述序列(SEQ ID NO:147-156)的至少一部分的序列。在一些实施方案中，该PSMA三特异性抗原结合蛋白质包含含有表10中所述序列(SEQ ID NO:147-156)中的一种或多种序列的多肽。在进一步的实施方案中，该PSMA三特异性抗原结合蛋白质包含如表10中的序列(SEQ ID NO:147-156)所述的一种或多种CDR。
本文所述的靶向PSMA的三特异性蛋白质被设计为允许通过募集细胞毒性T细胞来特异性靶向表达PSMA的细胞。这与ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)相比提高了功效，ADCC是利用针对唯一抗原的全长抗体并且不能直接募集细胞毒性T细胞。相反，通过接合在这些细胞上特异性表达的CD3分子，所述靶向PSMA的三特异性蛋白质可使细胞毒性T细胞与表达PSMA的细胞以高度特异性的方式交联，从而将T细胞的细胞毒性潜能引导至靶细胞。本文所述的靶向PSMA的三特异性蛋白质经由与表面表达的CD3蛋白质结合而接合细胞毒性T细胞，这形成TCR的一部分。数个PSMA三特异性抗原结合蛋白质与CD3和特定细胞表面上表达的PSMA的同时结合引起T细胞活化，并介导特定PSMA表达细胞的后续裂解。因此，预期靶向PSMA的三特异性蛋白质显示出强烈的、特异的和有效的靶细胞杀伤。在一些实施方案中，本文所述的靶向PSMA的三特异性蛋白质刺激细胞毒性T细胞杀死靶细胞以消除致病细胞(例如，表达PSMA的肿瘤细胞)。在一些这样的实施方案中，细胞被选择性地消除，从而减小毒副作用的可能性。
与传统单克隆抗体和其他较小的双特异性分子相比，本文所述的靶向PSMA的三特异性蛋白质提供进一步的治疗优点。通常，重组蛋白质药物的有效性在很大程度上取决于蛋白质本身的内在药代动力学。一种这样的益处在于，本文所述的靶向PSMA的三特异性蛋白质由于具有半衰期延长结构域，如对HSA具有特异性的结构域，而具有延长的药代动力学消除半衰期。就此而言，在一些实施方案中，本文所述的靶向PSMA的三特异性蛋白质具有约两天、三天、约五天、约七天、约10天、约12天或约14天的延长的血清消除半衰期。这与具有相对短得多的消除半衰期的其他结合蛋白质如BiTE或DART分子形成对照。例如，BiTE CD19×CD3双特异性scFv-scFv融合分子由于其消除半衰期短而需要连续的静脉内输注(i.v.)药物递送。所述靶向PSMA的三特异性蛋白质的较长的内在半衰期解决了这个问题，从而允许增加的治疗潜力，如低剂量药物制剂、减少的定期给药和/或新的药物组合物。
本文所述的靶向PSMA的三特异性蛋白质还具有对于增强的组织穿透和组织分布而言最优的大小。较大的大小限制或阻止蛋白质在靶组织中的穿透或分布。本文所述的靶向PSMA的三特异性蛋白质通过具有允许增强的组织穿透和分布的小尺寸而避免了这一问题。因此，在一些实施方案中，本文所述的靶向PSMA的三特异性蛋白质具有约50kD至约80kD、约50kD至约75kD、约50kD至约70kD或约50kD至约65kD的大小。因此，所述靶向PSMA的三特异性蛋白质的大小优于约150kD的IgG抗体以及约55kD但半衰期没有延长并因此快速通过肾脏清除的BiTE和DART双抗体分子。
在进一步的实施方案中，本文所述的靶向PSMA的三特异性蛋白质具有针对增强的组织穿透和分布而言最优的大小。在这些实施方案中，靶向PSMA的三特异性蛋白质被构建为尽可能小，同时保留对其靶标的特异性。因此，在这些实施方案中，本文所述的靶向PSMA的三特异性蛋白质具有约20kD至约40kD，或约25kD至约35kD至约40kD、至约45kD、至约50kD、至约55kD、至约60kD、至约65kD的大小。在一些实施方案中，本文所述的靶向PSMA的三特异性蛋白质具有约50kD、49kD、48kD、47kD、46kD、45kD、44kD、43kD、42kD、41kD、40kD、约39kD、约38kD、约37kD、约36kD、约35kD、约34kD、约33kD、约32kD、约31kD、约30kD、约29kD、约28kD、约27kD、约26kD、约25kD、约24kD、约23kD、约22kD、约21kD或约20kD的大小。获得小尺寸的示例性方法是对每个结构域都采用单结构域抗体(sdAb)片段。例如，特定的PSMA三特异性抗原结合蛋白质具有抗CD3sdAb、抗HSA sdAb和针对PSMA的sdAb。这使得示例性PSMA三特异性抗原结合蛋白质的大小减小至40kD以下。因此，在一些实施方案中，所述靶向PSMA的三特异性蛋白质的结构域都是单结构域抗体(sdAb)片段。在其他实施方案中，本文所述的靶向PSMA的三特异性蛋白质包含针对HSA和/或PSMA的小分子实体(SME)结合物。SME结合物是大小平均为约500Da至2000Da的小分子，并且通过已知方法如分选酶连接或缀合而附接至靶向PSMA的三特异性蛋白质。在这些情况下，PSMA三特异性抗原结合蛋白质的结构域之一为分选酶识别序列，例如，LPETG(SEQ ID NO:57)。为了将SME结合物附接至具有分选酶识别序列的PSMA三特异性抗原结合蛋白质，将该蛋白质与分选酶和SME结合物一起温育，从而分选酶将SME结合物附接至该识别序列。已知的SME结合物包括与前列腺特异性膜抗原(PSMA)结合的MIP-1072和MIP-1095。在另外的实施方案中，本文所述的靶向PSMA的三特异性蛋白质中与PSMA结合的结构域包含用于结合PSMA的knottin肽。Knottin是具有半胱氨酸结支架(knot scaffold)的二硫键稳定的肽，并且具有约3.5kD的平均大小。预期Knottin与某些肿瘤分子如PSMA结合。在进一步的实施方案中，本文所述的靶向PSMA的三特异性蛋白质中与PSMA结合的结构域包含天然PSMA配体。
本文所述的靶向PSMA的三特异性蛋白质的另一个特征是，它们是具有其结构域的柔性连接的单多肽设计。这允许容易地产生并制备靶向PSMA的三特异性蛋白质，因为它们可以由易于引入载体中的单个cDNA分子编码。另外，由于本文所述的靶向PSMA的三特异性蛋白质为单体单多肽链，因此不存在链配对问题或不需要二聚化。预计本文所述的靶向PSMA的三特异性蛋白质的聚集趋势减小，不同于其他报道的分子，如具有Fc-γ免疫球蛋白结构域的双特异性蛋白质。
在本文所述的靶向PSMA的三特异性蛋白质中，结构域通过内部连接体L1和L2连接，其中L1连接靶向PSMA的三特异性蛋白质的第一和第二结构域，而L2连接靶向PSMA的三特异性蛋白质的第二和第三结构域。连接体L1和L2具有优化的长度和/或氨基酸组成。在一些实施方案中，连接体L1和L2具有相同的长度和氨基酸组成。在其他实施方案中，L1和L2不同。在某些实施方案中，内部连接体L1和/或L2是“短的”，即，由0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基残基组成。因此，在某些情况下，内部连接体由约12个或更少的氨基酸残基组成。在0个氨基酸残基的情况下，内部连接体为肽键。在某些实施方案中，内部连接体L1和/或L2是“长的”，即，由15、20或25个氨基残基组成。在一些实施方案中，这些内部连接体由约3个至约15个，例如8、9或10个连续氨基酸残基组成。关于内部连接体L1和L2的氨基酸组成，选择具有以下性质的肽，即，能赋予靶向PSMA的三特异性蛋白质柔性，不干扰结合域，以及抵抗蛋白酶切割。例如，甘氨酸和丝氨酸残基通常提供蛋白酶抗性。适合于连接靶向PSMA的三特异性蛋白质中的结构域的内部连接体的实例包括但不限于(GS)n(SEQ ID NO:157)、(GGS)n(SEQ ID NO:158)、(GGGS)n(SEQ ID NO:159)、(GGSG)n(SEQ ID NO:160)、(GGSGG)n(SEQ ID NO:161)或(GGGGS)n(SEQ ID NO:162)，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一个实施方案中，内部连接体L1和/或L2是(GGGGS)4(SEQ ID NO:163)或(GGGGS)3(SEQ ID NO:164)。
PSMA结合蛋白质修饰
本文所述的PSMA结合蛋白质包括衍生物或类似物，其中(i)氨基酸被不是由遗传密码编码的氨基酸残基置换，(ii)成熟多肽与另一化合物如聚乙二醇融合，或(iii)额外的氨基酸与该蛋白质融合，如前导序列或分泌序列或阻断免疫原性结构域的序列和/或用于纯化该蛋白质的序列。
典型的修饰包括但不限于乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价附接、血红素部分的共价附接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价附接、脂质或脂质衍生物的共价附接、磷脂酰肌醇的共价附接、交联、环化、二硫键形成、脱甲基化、共价交联的形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ羧化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、转移RNA介导的向蛋白质添加氨基酸，如精氨酰化，和泛素化。
在本文所述的PSMA结合蛋白质中的任何位置进行修饰，该位置包括肽骨架、氨基酸侧链以及氨基或羧基末端。可用于修饰PSMA结合蛋白质的某些常见肽修饰包括糖基化、脂质附接、硫酸化、谷氨酸残基的γ-羧化、羟基化、多肽中的氨基或羧基基团或两者被共价修饰的封闭，以及ADP-核糖基化。
编码PSMA结合蛋白质的多核苷酸
在一些实施方案中，还提供了编码如本文所述的PSMA结合蛋白质的多核苷酸分子。在一些实施方案中，该多核苷酸分子以DNA构建体的形式提供。在其他实施方案中，该多核苷酸分子以信使RNA转录物的形式提供。
所述多核苷酸分子通过已知方法构建，例如通过将编码抗PSMA结合蛋白质的基因与合适的启动子以及可选的合适的转录终止子可操作地连接，并且将其在细菌或其他合适的表达系统例如CHO细胞中表达。
在一些实施方案中，将所述多核苷酸插入载体中，优选表达载体中，这代表进一步的实施方案。该重组载体可根据已知方法来构建。特别感兴趣的载体包括质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、病毒(virii)(例如，逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、慢病毒等)和粘粒。
可利用多种表达载体/宿主系统，以包含并表达编码所述PSMA结合蛋白质的多肽的多核苷酸。表达载体的实例是用于在大肠杆菌中表达的pSKK(Le Gall等人,J ImmunolMethods.(2004)285(1):111-27)、用于在哺乳动物细胞中表达的pcDNA5(Invitrogen)、PICHIAPINKTM酵母表达系统(Invitrogen)、BACUVANCETM杆状病毒表达系统(GenScript)。
因此，在一些实施方案中，如本文所述的PSMA白蛋白结合蛋白质通过以下步骤产生：将编码如上所述的蛋白质的载体引入宿主细胞中，并在允许蛋白质结构域表达的条件下培养所述宿主细胞，可将其分离并任选地进一步纯化。
PSMA结合蛋白质的产生
在一些实施方案中，本文公开了用于产生PSMA结合蛋白质的方法。在一些实施方案中，该方法包括在允许PSMA结合蛋白质表达的条件下培养用包含编码PSMA结合蛋白质的核酸序列的载体转化或转染的宿主，并从培养物中回收并纯化所产生的蛋白质。
在另外的实施方案中，提供了针对与参考结合化合物相比改善本文所述的PSMA结合蛋白质和/或包含PSMA结合蛋白质的多特异性结合蛋白质的一种或多种性质的方法，所述性质例如是亲和力、稳定性、耐热性、交叉反应性等。在一些实施方案中，提供了多个单置换文库，每个文库对应于PSMA结合蛋白质或参考结合化合物的不同结构域或氨基酸区段，使得单置换文库的每个成员仅编码在其相应的结构域或氨基酸区段中的单氨基酸变化。一般而言，这允许用少量小文库探测大的蛋白质或蛋白质结合位点中的所有潜在置换。在一些实施方案中，多个结构域形成或覆盖PSMA结合蛋白质或参考结合化合物的氨基酸连续序列。不同单置换文库的核苷酸序列与至少一个其他单置换文库的核苷酸序列重叠。在一些实施方案中，设计多个单置换文库，使得每个成员与编码相邻结构域的每个单置换文库的每个成员重叠。
单独选择由这样的单置换文库表达的结合化合物以获得每个文库的变体子集，所述变体子集具有与参考结合化合物的性质至少一样好的性质，并且其得到的文库大小减小。通常，编码结合化合物的选定组的核酸数目少于编码原始单置换文库的成员的核酸数目。这样的性质包括但不限于对靶标化合物的亲和力，在诸如加热、高pH或低pH、酶促降解等各种条件下的稳定性，与其他蛋白质的交叉反应性，等等。来自每个单置换文库的选定化合物在本文可互换地称为“预候选化合物”或“预候选蛋白质”。然后使用基于PCR的基因改组技术，将编码来自单独的单置换文库的预候选化合物的核酸序列在PCR中改组以生成改组文库。
本文描述了筛选过程的示例性工作流程。从单置换文库生成预候选化合物的文库并针对与靶蛋白的结合进行选择，之后将预候选文库改组以产生编码候选化合物的核酸文库，继而将该核酸文库依次克隆到适宜的表达载体如噬菌粒表达系统中。然后，表达候选化合物的噬菌体经历一轮或多轮选择以改善期望的性质，如对靶分子的结合亲和力。靶分子可以被吸附或以其他方式附着到孔或其他反应容器的表面，或者靶分子可以用结合部分如生物素进行衍生化，该结合部分在与候选结合化合物一起温育后可以用与珠子如磁珠结合的互补部分如链霉亲和素捕获，以供洗涤。在示例性选择方案中，候选结合化合物经历洗涤步骤，使得仅选择与靶分子具有非常低的解离速率的候选化合物。这样的实施方案的示例性洗涤时间为约10分钟、约15分钟、约20分钟、约20分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时；或在其他实施方案中为约24小时；或在其他实施方案中为约48小时；或在其他实施方案中为约72小时。在选择后，将分离的克隆扩增并使其经受另外的选择循环或分析，例如通过测序和通过对结合亲和力进行比较测量，例如通过ELISA、表面等离子体共振(SPR)、生物层干涉法(例如，系统，Pall Life Sciences,ForteBio,MenloPark,CA)等。
在一些实施方案中，实施上述方法以鉴别与参考PSMA结合蛋白质相比具有改善的结合亲和力、对选定组的结合靶标具有改善的交叉反应性的一种或多种PSMA结合蛋白质。在一些实施方案中，参考结合蛋白质是具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的蛋白质。在一些实施方案中，参考结合蛋白质是具有如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列的蛋白质。在某些实施方案中，通过改变参考PSMA结合蛋白质的VH区中的密码子(包括框架区和CDR中的密码子)来制备单置换文库。在另一个实施方案中，密码子发生变化的位置包括参考PSMA结合蛋白质的重链的CDR3，或这样的CDR3的子集，如仅CDR1、仅CDR2、仅CDR3或CDR对。在另一个实施方案中，密码子发生变化的位置仅在框架区中出现。在一些实施方案中，文库仅包含相对于参考PSMA结合蛋白质的单个密码子改变，其仅在VH编号范围为10至111的框架区中。在另一个实施方案中，密码子发生变化的位置包括参考PSMA结合蛋白质的重链的CDR3，或这样的CDR3的子集。在另一个实施方案中，VH编码区的密码子发生变化的位置的数目在10至111的范围内，使得至多80个位置在框架区中。在制备如上所述的单置换文库后，进行以下步骤：(a)单独表达每个单置换文库的每个成员作为预候选蛋白质；(b)选择编码与结合配偶体结合的预候选蛋白质的每个单置换文库的成员，该结合配偶体可与原始结合靶标[例如，期望的交叉反应靶标]不同或相同；(c)在PCR中改组所选文库的成员以产生组合的改组文库；(d)表达改组文库的成员作为候选PSMA结合蛋白质；以及(e)对该改组文库的成员进行一次或多次选择以获得与原始结合配偶体结合的候选PSMA结合蛋白质，并且可能地(f)针对与期望的交叉反应性靶标的结合进一步选择候选蛋白质，从而提供相对于参考PSMA结合蛋白质对于一种或多种物质具有增加的交叉反应性而不丧失对原始配体的亲和力的核酸编码的PSMA结合蛋白质。在另外的实施方案中，可通过用以下步骤代替步骤(f)来实现该方法，以获得对选定的交叉反应性物质或化合物或表位具有降低的反应性的PSMA结合蛋白质：从候选PSMA结合蛋白质的子集中一次或多次排除与不需要的交叉反应性化合物结合的候选结合化合物。
药物组合物
在一些实施方案中，还提供了药物组合物，其包含本文所述的PSMA结合蛋白质、包含编码PSMA结合蛋白质的多肽的多核苷酸的载体或被该载体转化的宿主细胞，以及至少一种药学上可接受的载剂。术语“药学上可接受的载剂”包括但不限于不干扰成分的生物活性的有效性且对所施用的患者无毒的任何载剂。合适的药物载剂的实例是本领域公知的，并且包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液如水包油乳液、各种类型的润湿剂、无菌溶液等。这样的载剂可通过常规方法配制，并且可以以合适的剂量施用于受试者。优选地，该组合物是无菌的。这些组合物还可含有辅料如防腐剂、乳化剂和分散剂。可通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂来确保阻止微生物的作用。
在药物组合物的一些实施方案中，本文所述的PSMA结合蛋白质被包封在纳米颗粒中。在一些实施方案中，该纳米颗粒是富勒烯、液晶、脂质体、量子点、超顺磁纳米颗粒、树状聚体或纳米棒。在药物组合物的其他实施方案中，将PSMA结合蛋白质附着至脂质体。在一些情况下，PSMA结合蛋白质与脂质体表面缀合。在一些情况下，PSMA结合蛋白质被包封在脂质体的壳内。在一些情况下，该脂质体为阳离子脂质体。
本文所述的PSMA结合蛋白质被考虑用作药物。给药通过不同方式实现，例如，通过静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、局部或真皮内给药。在一些实施方案中，给药途径取决于疗法的种类和药物组合物中包含的化合物的种类。给药方案将由主治医师根据其他临床因素来确定。对于任何一名患者的剂量依赖于许多因素，包括患者体型、体表面积、年龄、性别、待施用的具体化合物、给药的时间和途径、疗法的种类、总体健康和其他同时施用的药物。“有效剂量”是指活性成分的量，该量足以影响疾病的病程和严重程度，从而导致这种病理学的减轻或缓解，并且可使用已知方法来确定。
治疗方法
在一些实施方案中，本文还提供了用于刺激有需要的个体的免疫系统的方法和用途，其包括施用本文所述的PSMA结合蛋白质或包含PSMA结合蛋白质的多特异性结合蛋白质。在一些情况下，本文所述的PSMA结合蛋白质的施用诱导和/或保持对表达靶抗原的细胞的细胞毒性。在一些情况下，该表达靶抗原的细胞是癌细胞或肿瘤细胞、病毒感染的细胞、细菌感染的细胞、自身反应性T细胞或B细胞、受损的红细胞、动脉斑块或纤维化组织。
本文还提供了用于治疗与靶抗原相关的疾病、病症或病况的方法和用途，其包括向有需要的个体施用本文所述的PSMA结合蛋白质或包含PSMA结合蛋白质的多特异性结合蛋白质。与靶抗原相关的疾病、病症或病况包括但不限于病毒感染、细菌感染、自身免疫病、移植排斥、动脉粥样硬化或纤维化。在其他实施方案中，与靶抗原相关的疾病、病症或病况为增生性疾病、肿瘤疾病、炎性疾病、免疫性病症、自身免疫病、感染性疾病、病毒性疾病、变态反应、寄生虫反应、移植物抗宿主病或宿主抗移植物病。在一个实施方案中，与靶抗原相关的疾病、病症或病况为癌症。在一种情况下，该癌症为血液系统癌症。在另一种情况下，该癌症为前列腺癌。
在一些实施方案中，该前列腺癌是晚期前列腺癌。在一些实施方案中，该前列腺癌是抗药性的。在一些实施方案中，该前列腺癌是抗雄激素药物抗性的。在一些实施方案中，该前列腺癌是转移性的。在一些实施方案中，该前列腺癌是转移性且抗药性的(例如，抗雄激素药物抗性的)。在一些实施方案中，该前列腺癌是去势抗性的。在一些实施方案中，该前列腺癌是转移性且去势抗性的。在一些实施方案中，该前列腺癌是恩杂鲁胺抗性的。在一些实施方案中，该前列腺癌是恩杂鲁胺和阿比特龙(arbiraterone)抗性的。在一些实施方案中，该前列腺癌是恩杂鲁胺、阿比特龙和比卡鲁胺抗性的。在一些实施方案中，该前列腺癌是多西他赛抗性的。在一些实施方案中，该前列腺癌是恩杂鲁胺、阿比特龙、比卡鲁胺和多西他赛抗性的。
在一些实施方案中，施用本文所述的抗PSMA单结构域抗体或本文所述的靶向PSMA的三特异性蛋白质抑制前列腺癌细胞生长；抑制前列腺癌细胞迁移；抑制前列腺癌细胞侵袭；改善前列腺癌的症状；减小前列腺癌肿瘤的大小；减少前列腺癌肿瘤的数目；减少前列腺癌细胞的数目；诱导前列腺癌细胞坏死、焦亡(pyroptosis)、胀亡(oncosis)、凋亡、自噬或其他细胞死亡；或增强选自恩杂鲁胺、阿比特龙、多西他赛、比卡鲁胺及其任意组合的化合物的治疗效果。
在一些实施方案中，所述方法包括通过施用本文所述的抗PSMA单结构域抗体或本文所述的靶向PSMA的三特异性蛋白质来抑制前列腺癌细胞生长。在一些实施方案中，该方法包括通过施用本文所述的抗PSMA单结构域抗体或本文所述的靶向PSMA的三特异性蛋白质来抑制前列腺癌细胞迁移。在一些实施方案中，该方法包括通过施用本文所述的抗PSMA单结构域抗体或本文所述的靶向PSMA的三特异性蛋白质来抑制前列腺癌细胞侵袭。在一些实施方案中，该方法包括通过施用本文所述的抗PSMA单结构域抗体或本文所述的靶向PSMA的三特异性蛋白质来改善前列腺癌的症状。在一些实施方案中，该方法包括通过施用本文所述的抗PSMA单结构域抗体或本文所述的靶向PSMA的三特异性蛋白质来减小前列腺癌肿瘤的大小。在一些实施方案中，该方法包括通过施用本文所述的抗PSMA单结构域抗体或本文所述的靶向PSMA的三特异性蛋白质来减少前列腺癌肿瘤的数目。在一些实施方案中，该方法包括通过施用本文所述的抗PSMA单结构域抗体或本文所述的靶向PSMA的三特异性蛋白质来减少前列腺癌细胞的数目。在一些实施方案中，该方法包括通过施用本文所述的靶向PSMA的三特异性蛋白质来诱导前列腺癌细胞坏死、焦亡、胀亡、凋亡、自噬或其他细胞死亡。
在一些实施方案中，如本文所用的，“治疗”或“处理”是指治疗性处理，其中目的是减缓(减轻)不期望的生理病况、病症或疾病，或是获得有益或期望的临床结果。对于本文所述的目的，有益或期望的临床结果包括但不限于症状的减轻；病况、病症或疾病程度的减小；病况、病症或疾病状态的稳定(即不恶化)；病况、病症或疾病的延迟发作或进展减缓；病况、病症或疾病状态的改善；以及病况、病症或疾病的可检测到的或不可检测的缓解(部分或全部的)或者增强或改善。治疗包括引发临床上显著的反应，而没有过高水平的副作用。治疗还包括与不接受治疗的情况下预期的生存期相比延长生存期。在其他实施方案中，“治疗”或“处理”是指预防性措施，其中目的是例如在易患疾病的人(例如，携带诸如乳腺癌等疾病的遗传标志物的个体)中，延迟不希望的生理病况、病症或疾病的发作或者降低其严重程度。
在本文所述方法的一些实施方案中，本文所述的PSMA结合蛋白质或包含该PSMA结合蛋白质的多特异性结合蛋白质与用于治疗特定疾病、病症或病况的活性物质联合施用。活性物质包括但不限于涉及抗体、小分子(例如，化疗药物)、激素(甾体、肽等)的疗法，放疗(γ射线，X射线，和/或放射性同位素、微波、UV辐射等的定向递送)，基因疗法(例如，反义疗法(antisense)、逆转录病毒疗法等)，和其他免疫疗法。在一些实施方案中，本文所述的PSMA蛋白质或包含该PSMA结合蛋白质的多特异性结合蛋白质与止泻剂、止吐剂、镇痛药、阿片类药物和/或非甾体抗炎药联合施用。在一些实施方案中，本文所述的PSMA结合蛋白质或包含该PSMA结合蛋白质的多特异性结合蛋白质在手术之前、期间或之后施用。根据本发明的另一个实施方案，提供了用于检测前列腺癌以供诊断、预后或监测的试剂盒。试剂盒包含前述PSMA结合蛋白质(例如，标记的抗PSMA单结构域抗体或其抗原结合片段)，以及一种或多种用于检测标记物的化合物。在一些实施方案中，该标记物选自荧光标记物、酶标记物、放射性标记物、核磁共振活性标记物、发光标记物和发色团标记物。
进一步的实施方案提供了以冻干形式包装或包装在水性介质中的一种或多种上述结合蛋白质，诸如抗PSMA单结构域抗体或其抗原结合片段。在本公开内容的另一个方面，提供了用于检测样品中的PSMA或表达PSMA的细胞的存在的方法。这样的方法包括使样品与特异性地与PSMA的胞外域结合的任何前述PSMA结合蛋白质(如抗PSMA单结构域抗体或其抗原结合片段)接触足以允许在抗体或其抗原结合片段与PSMA之间形成复合物的时间，并检测PSMA-抗体复合物或PSMA-抗原结合片段复合物。在一些实施方案中，样品中存在复合物指示样品中存在PSMA或表达PSMA的细胞。在另一个方面，本公开内容提供了用于诊断受试者中的PSMA介导的疾病的其他方法。这样的方法包括向疑似患有或先前诊断为患有PSMA介导的疾病的受试者施用一定量的与前列腺特异性膜抗原的胞外域特异性结合的任何前述PSMA结合蛋白质(诸如抗PSMA单结构域抗体或其抗原结合片段)。该方法还包括允许在抗体或其抗原结合片段与PSMA之间形成复合物，并检测针对靶表位的PSMA-抗体复合物或PSMA-抗原结合片段抗体复合物的形成。在疑似患有或先前诊断为患有前列腺癌的受试者中存在复合物指示存在PSMA介导的疾病。
在所述方法的某些实施方案中，PSMA介导的疾病是前列腺癌。在其他实施方案中，PSMA介导的疾病是非前列腺癌，如选自以下的非前列腺癌：包括移行细胞癌在内的膀胱癌；包括胰管癌在内的胰腺癌；包括非小细胞肺癌在内的肺癌；包括普通型肾细胞癌在内的肾癌；包括软组织肉瘤在内的肉瘤；包括乳腺恶性肿瘤在内的乳腺癌；包括多形性胶质母细胞瘤在内的脑癌；神经内分泌癌；包括结肠恶性肿瘤在内的结肠癌；包括睾丸胚胎性癌在内的睾丸癌；以及包括恶性黑素瘤在内的黑素瘤。
在前述方法的一些实施方案中，标记PSMA结合蛋白质(诸如抗PSMA单结构域抗体或其抗原结合片段)。在前述方法的其他实施方案中，施用第二抗体以检测第一抗体或其抗原结合片段。在本公开内容的进一步的方面，提供了用于评估患有PSMA介导的疾病的受试者的预后的方法。这样的方法包括向疑似患有或先前诊断为患有PSMA介导的疾病的受试者施用有效量的任何前述PSMA结合蛋白质(诸如抗PSMA单结构域抗体或其抗原结合片段)，从而允许在抗体或其抗原结合片段与PSMA之间形成复合物，并检测针对靶表位的复合物的形成。疑似患有或先前诊断为患有PSMA介导的疾病的受试者中的复合物的量指示预后。
在本公开内容的另一个方面，提供了用于评估治疗具有PSMA介导的疾病的受试者的有效性的方法。这样的方法包括向患有或先前诊断为患有PSMA介导的疾病的受试者施用有效量的任何前述PSMA结合蛋白质(诸如抗PSMA单结构域抗体或其抗原结合片段)，从而允许在抗体或其抗原结合片段与PSMA之间形成复合物，并检测针对靶表位的复合物的形成。疑似患有或先前诊断为患有PSMA介导的疾病的受试者中复合物的量指示治疗的有效性。在某些实施方案中，PSMA介导的疾病是前列腺癌。在其他实施方案中，PSMA介导的疾病是非前列腺癌。在那些实施方案中，非前列腺癌优选地选自包括移行细胞癌在内的膀胱癌；包括胰管癌在内的胰腺癌；包括非小细胞肺癌在内的肺癌；包括普通型肾细胞癌在内的肾癌；包括软组织肉瘤在内的肉瘤；包括乳腺恶性肿瘤在内的乳腺癌；包括多形性胶质母细胞瘤在内的脑癌；神经内分泌癌；包括结肠恶性肿瘤在内的结肠癌；包括睾丸胚胎性癌在内的睾丸癌；以及包括恶性黑素瘤在内的黑素瘤。在其他实施方案中，标记抗体或其抗原结合片段。在进一步的实施方案中，施用第二抗体以检测第一抗体或其抗原结合片段。
根据本公开内容的又一个方面，提供了用于抑制表达PSMA的细胞的生长的方法。这样的方法包括使表达PSMA的细胞与有效抑制该表达PSMA的细胞的生长的量的与PSMA胞外域特异性结合的至少一种前述抗体或其抗原结合片段接触。
实施例
以下实施例进一步说明所描述的实施方案，但不限制本发明的范围。
实施例1：具有与亲本抗PSMA单结构域抗体相当或改善的结合性质的抗PSMA单结构域 抗体变体的生成
亲本抗PSMA噬菌体的表征
确定亲本抗PSMA噬菌体与PSMA抗原的特异性结合(表1)。用食蟹猴PSMA选择的单置换PSMA sdAb噬菌体文库
对于三个CDR结构域中的每一个提供单置换文库。单置换文库与食蟹猴PSMA结合，然后在缓冲液中洗涤30分钟。获得在0分钟和30分钟结合的噬菌体并计数。使用通过在缓冲液中洗涤30分钟而选择的噬菌体来产生两个独立的组合噬菌体文库。
组合抗PSMA文库
对于三轮选择，使用食蟹猴PSMA作为选择靶标。对于三轮选择，在来自两个独立文库的组合噬菌体结合后，将孔洗涤2至4小时。将从第三轮选择物中PCR扩增的插入片段亚克隆到p34表达载体中。挑取96个克隆，将DNA纯化，测序，并转染到Expi293细胞中。
用人PSMA选择的单置换PSMA sdAb噬菌体文库
对于三个CDR结构域中的每一个提供单置换文库。单置换文库与人PSMA结合，然后在含有30μg/ml h PSMA-Fc的缓冲液中洗涤24小时。获得在0小时和24小时结合的噬菌体并计数。使用通过24小时的竞争性洗涤选择的噬菌体来产生组合噬菌体文库。
组合抗PSMA文库
对于三轮选择，使用人PSMA作为选择靶标。在三轮选择的组合噬菌体结合后，将孔用含有30μg/ml–850μg/ml人PSMA-Fc的缓冲液洗涤24-96小时。将从第三轮选择物PCR扩增的插入片段亚克隆到p34表达载体中。挑取96个克隆，将DNA纯化，测序，并转染到Expi293中。
结合亲和力测量
使用上清液用系统估计对人和食蟹猴PSMA的Kd、kon和koff(或kdis)。基于与亲本sdAb相比的结合亲和力和对人PSMA的相互作用的缔合和解离速率常数，以及稳健的产生、聚集和稳定性特征，选择几个克隆用于进一步表征(表1)。亲本sdAb在表1中列为抗PSMA野生型sdAb.6his。
表1：几种PSMA结合蛋白质对人PSMA的结合亲和力(Kd)
实施例2：评估示例性靶向PSMA的三特异性抗原结合分子的结合和细胞毒活性的方法
蛋白质产生
将三特异性分子的序列克隆到哺乳动物表达载体pcDNA 3.4(Invitrogen)中，其之前是前导序列，之后是6x组氨酸标签(SEQ ID NO:33)。将Expi293F细胞(LifeTechnologies A14527)以0.2-8×1e6个细胞/ml悬浮保持在Optimum Growth Flasks(Thomson)中的Expi293培养基中。根据Expi293Expression System Kit(LifeTechnologies，A14635)方案，将纯化的质粒DNA转染到Expi293细胞中，并在转染后保持4-6天。通过亲和色谱法和脱盐色谱法对条件培养基进行部分纯化。三特异性蛋白质随后通过离子交换进行精制，或者用Amicon Ultra离心过滤单元(EMD Millipore)浓缩，施加到Superdex 200大小排阻介质(GE Healthcare)，并在含有赋形剂的中性缓冲液中解析。通过SDS-PAGE和分析SEC评估级分合并和最终纯度。
亲和力测量
使用Octet仪器通过生物层干涉法测量所有结合域分子的亲和力。
PSMA亲和力如下测量：将人PSMA-Fc蛋白质(100nM)加载到抗人IgG Fc生物传感器上120秒，随后是60秒基线，之后通过将该传感器端头在三特异性分子的稀释系列中温育180秒来测量缔合，然后解离50秒。EGFR和CD3亲和力如下测量：分别将人EGFR-Fc蛋白质或人CD3-Flag-Fc蛋白质(100nM)加载到抗人IgG Fc生物传感器上120秒，随后是60秒基线，之后通过将该传感器端头在三特异性分子稀释系列中温育180秒来测量缔合，然后解离300秒。通过将生物素化的白蛋白加载到链霉亲和素生物传感器上，然后按照与CD3亲和力测量相同的动力学参数，测量对人血清白蛋白(HSA)的亲和力。所有步骤均在30℃下在含0.25％酪蛋白的磷酸盐缓冲盐水中进行。
细胞毒性试验
使用人T细胞依赖性细胞毒性(TDCC)试验来测量T细胞接合物(包括三特异性分子)引导T细胞杀伤肿瘤细胞的能力(Nazarian等人,2015.J Biomol Screen.20:519-27)。在该试验中，将T细胞和靶癌细胞系细胞在384孔板中以10:1的比例混合在一起，并添加不同量的T细胞接合物。48小时后，洗去T细胞，留下未被T细胞杀死的靶细胞附着在板上。为了对剩余的活细胞进行定量，使用Luminescent Cell Viability Assay(Promega)。在一些情况下，将靶细胞工程化为表达萤光素酶。在这些情况下，通过用试剂(Promega)进行发光萤光素酶试验来评估靶细胞的活力，其中活力与萤光素酶活性的量成正比。
稳定性试验
在非人灵长类动物血清的存在下，以低浓度评估三特异性结合蛋白质的稳定性。将TriTAC在食蟹猴血清(BioReclamationIVT)中稀释至33μg/ml，并在37℃下温育2天或进行5次冷冻/解冻循环。处理后，在细胞毒性(TDCC)试验中评估样品，并将其剩余活性与未处理的储备溶液进行比较。
异种移植试验
在异种移植实验(Crown Bioscience，Taicang)中评估了三特异性结合蛋白质的体内功效。在第0天用5e6个22Rv1人前列腺癌细胞与5e6个静息的、从健康人供体中分离的人T细胞的混合物接种缺乏共同γ链的NOD/SCID小鼠(NCG，南京大学模型动物研究中心(Model Animal Research Center ofNanjing University))。将小鼠随机分成三组，并用媒介物、0.5mg/kg PSMA TriTAC C324或0.5mg/kg PSMA BiTE处理。每天经由静脉内团注进行处理，持续10天。每天检查动物的发病率和死亡率。每周两次用卡尺测量肿瘤体积。该研究在30天后终止。
PK分析
本研究的目的是评价三特异性结合蛋白质在静脉内注射后的单剂量药代动力学。经由在约1分钟内进行的缓慢静脉内(IV)团注向每组2只首次进行实验的食蟹猴(1只雄性和1只雌性)给予化合物。剂量施用后，每天进行一次笼侧观察，并且每周记录体重。到施用剂量后21天，收集血液样品并处理成血清以供药代动力学分析。
用电致发光读出器(Meso Scale Diagnostics，Rockville)从猴血清测定测试品的浓度。使用具有固定的重组CD3的96孔板捕获分析物。根据制造商的说明书，在MSD读取器上用磺基标记的重组PSMA进行检测。
实施例3：评估CD3亲和力对示例性靶向PSMA的三特异性分子的性质的影响
研究了具有不同CD3结合域的靶向PSMA的三特异性分子，以证明改变CD3亲和力的作用。示例性靶向PSMA的三特异性分子在图1中示出。表2列出了每种分子对三种结合配偶体(PSMA、CD3、HSA)的亲和力。使用Octet仪器(Pall Forté Bio)通过生物层干涉法测量亲和力。降低的CD3亲和力导致在T细胞介导的细胞毒性方面的效力损失(图2A-图2C)。在食蟹猴中评估这些三特异性分子的药代动力学性质。对CD3具有高亲和力的分子，如TriTACC236，具有大约90h的终末半衰期(图3)。尽管与T细胞上的CD3结合的能力改变，但图4中显示的具有不同CD3亲和力的两种分子的终末半衰期非常相似。然而，降低的CD3亲和力似乎导致更大的分布体积，这与T细胞对三特异性分子的隔离的减少相一致。在研究期间没有注意到不良的临床观察结果或体重变化。
表2：对人和食蟹猴抗原的结合亲和力
实施例4：评估PSMA亲和力对示例性靶向PSMA的三特异性分子的性质的影响
研究了具有不同PSMA结合域的靶向PSMA的三特异性分子，以证明改变PSMA亲和力的作用。表3列出了每种分子对三种结合配偶体(PSMA、CD3、HSA)的亲和力。降低的PSMA亲和力导致在T细胞介导的细胞毒性方面的效力损失(图5A-图5C)。
表3：对人和食蟹猴抗原的结合亲和力
实施例5：示例性靶向PSMA的三特异性分子的体内功效
评估了示例性靶向PSMA的三特异性分子C324抑制小鼠中的肿瘤生长的能力。对于该实验，用表达PSMA的人前列腺肿瘤细胞(22Rv1)皮下接种用人T细胞重建的免疫受损小鼠，并且每天用0.5mg/kg的靶向PSMA的BiTE或TriTAC分子静脉内(i.v.)处理，持续10天。测量肿瘤生长30天。在实验过程中，三特异性分子能够以与BiTE分子相当的功效抑制肿瘤生长(图6)。
实施例6：示例性靶向PSMA的三特异性分子的特异性
为了评估靶向PSMA的TriTAC分子的特异性，用对PSMA呈阴性的肿瘤细胞测试其诱导T细胞杀伤肿瘤细胞的能力(图7A)。靶向EGFR的TriTAC分子充当阳性对照，靶向GFP的TriTAC分子充当阴性对照。具有不同PSMA结合域的所有三种TriTAC都显示出预期的针对PSMA阳性细胞系LNCaP的活性(图7B)，但在PSMA阴性肿瘤细胞系KMS12BM和OVCAR8中未达到EC50(图7C和图7D)。EC50总结于表3中。在非常高的TriTAC浓度(>1nM)下，对于TriTAC C362和C363可以观察到一些有限的脱靶细胞杀伤，而C364在任何测试条件下都没有显示出显著的细胞杀伤。
表4：TriTAC分子在抗原阳性和阴性肿瘤细胞系中的细胞杀伤活性(EC50[pM])
TriTAC LNCaP KMS12BM OVCAR8
PSMA p8TriTAC C362 13.0 >10,000 >10,000
PSMA HDS TriTAC C363 6.2 >10,000 >10,000
PSMA HTS TriTAC C364 0.8 >10,000 >10,000
EGFR TriTAC C131 9.4 >10,000 6
GFP TriTAC C >10,000 >10,000 >10,000
实施例7：应激测试和蛋白质稳定性
将四种靶向PSMA的三特异性分子在食蟹猴血清中以低浓度(33.3μg/ml)温育48小时，或在食蟹猴血清中进行五次冷冻解冻循环。处理后，在细胞杀伤试验中评估TriTAC分子的生物活性，并与无应激的样品(“阳性对照”)进行比较(图8A-图8D)。所有分子都保持大部分其细胞杀伤活性。TriTAC C362是最具应激抗性的，并且在此处测试的条件下似乎未失去任何活性。
实施例8：异种移植肿瘤模型
在异种移植模型中评价示例性靶向PSMA的三特异性蛋白质。
向雄性免疫缺陷NCG小鼠的右背侧皮下接种5x 106个22Rv1细胞。当肿瘤达到100至200mm3时，将动物分成3个处理组。第2组和第3组(各8只动物)腹膜内注射1.5×107个活化的人T细胞。三天后，随后用50μg本公开内容的示例性PSMA三特异性抗原结合蛋白质的总共9个静脉内剂量(qdx9d)处理第3组的动物。第1组和第2组仅用媒介物处理。测量体重和肿瘤体积30天。预计与相应媒介物处理的对照组中的肿瘤生长相比，用PSMA三特异性抗原结合蛋白质处理的小鼠中的肿瘤生长显著降低。
实施例9：关于向前列腺癌患者施用示例性PSMA三特异性抗原结合蛋白质的概念验证 临床试验方案
这是用于研究实施例1的PSMA三特异性抗原结合蛋白质作为前列腺治疗方法的I/II期临床试验。
研究结果：
主要：前述实施例的靶向PSMA的三特异性蛋白质的最大耐受剂量
次要：确定前述实施例的靶向PSMA的三特异性蛋白质的体外反应是否与临床反应相关
I期
最大耐受剂量(MTD)在该试验的I期部分确定。
1.1最大耐受剂量(MTD)在该试验的I期部分确定。
1.2满足合格性标准的患者加入针对前述实施例的靶向PSMA的三特异性蛋白质的试验。
1.3目标是确定前述实施例的靶向PSMA的三特异性蛋白质可以在参与者中安全施用而没有严重的或难以处理的副作用的最高剂量。给定的剂量取决于之前已经入选该研究的参与者的数目以及剂量耐受程度。并非所有参与者都接受相同的剂量。
II期
2.1随后的II期部分以MTD进行治疗，目的是确定采用前述实施例的靶向PSMA的三特异性蛋白质的疗法是否会导致至少20％的反应率。
II期的主要结果---确定采用前述实施例的靶向PSMA的三特异性蛋白质的疗法是否会致使至少20％的患者实现临床反应(强烈反应(blast response)、轻微反应、部分反应或完全反应)。
合格性
从2001年至2007年，根据当前的世界卫生组织分类，经组织学证实的新诊断的侵袭性前列腺癌
疾病的任何阶段
用多西他赛和泼尼松(+/-手术)治疗
年龄≥18岁
Karnofsky体能状态≥50％或ECOG体能状态为0-2
预期寿命≥6周
实施例10：在使用一组表达PSMA的细胞系和来自不同供体的T细胞的重导向T细胞杀伤 试验中，示例性PSMA抗原结合蛋白质(靶向PSMA的TriTAC分子)的活性
进行该研究以证明示例性PSMA三特异性抗原结合蛋白质的活性不限于LNCaP细胞或单一细胞供体。
使用来自四个不同供体的T细胞和表达PSMA的人前列腺癌细胞系VCaP、LNCaP、MDAPCa2b和22Rv1进行重导向T细胞杀伤试验。除一个例外之外，PSMA三特异性抗原结合蛋白质能够使用来自所有供体的T细胞引导对这些癌细胞系的杀伤，EC50值为0.2至1.5pM，如表5所示。对于前列腺癌细胞系22 Rv1和供体24，没有或几乎没有观察到杀伤(数据未示出)。供体24也仅导致MDAPCa2b细胞系的约50％的杀伤，而来自其他3个供体的T细胞导致对该细胞系的几乎完全的杀伤(数据未示出)。对照试验证明，PSMA三特异性抗原结合蛋白质的杀伤是PSMA特异性的。当用靶向绿色荧光蛋白(GFP)而不是PSMA的对照三特异性蛋白质处理表达PSMA的细胞时，未观察到杀伤(数据未示出)。类似地，PSMA三特异性抗原结合蛋白质对缺乏PSMA表达的细胞系NCI-1563和HCT116无活性，也显示在表5中。
表5：来自使用六种人癌症细胞系和四个不同T细胞供体的TDCC试验的EC50值
实施例11：在重导向T细胞杀伤试验中，示例性PSMA三特异性抗原结合蛋白质(靶向 PSMA的TriTAC分子)对细胞因子表达的刺激
进行该研究以通过测量活化的T细胞分泌到测定培养基中的细胞因子来证明重导向T细胞杀伤试验期间示例性PSMA三特异性抗原结合蛋白质对T细胞的活化。
分析从以上实施例9中所述的重导向T细胞杀伤试验收集的条件培养基的细胞因子TNFα和IFNγ的表达。使用AlphaLISA测定(Perkin-Elmer)测量细胞因子。将滴定量的PSMA抗原结合蛋白质添加到来自四个不同供体的T细胞和四种表达PSMA的细胞系LNCaP、VCaP、MDAPCa2b和22Rv1导致TNFα的水平增加。条件培养基中TNFα表达和IFNγ表达水平的结果分别显示在表6和表7中。PSMA抗原结合蛋白质诱导这些细胞因子表达的EC50值的范围为3至15pM。对于靶向GFP的对照三特异性蛋白质，未观察到细胞因子水平增加。类似地，当用缺乏PSMA表达的两种细胞系HCT116和NCI-H1563进行测定时，PSMA HTS TriTAC也不增加TNFα或IFNγ表达。
表6：采用六种人癌症细胞系和来自四个不同供体的T细胞的PSMA三特异性抗原结合蛋 白质TDCC试验中，培养基中的TNFα表达的EC50值
细胞系 供体24 供体8144 供体41 供体72
LNCaP 4.9E-12 2.8E-12 4.0E-12 3.2E-12
VCaP 3.2E-12 2.9E-12 2.9E-12 2.9E-12
MDAPCa2b 2.1E-11 4.0E-12 5.5E-12 3.6E-12
22Rv1 8.9E-12 2.5E-12 4.0E-12 3.3E-12
HCT116 >1E-8 >1E-8 >1E-8 >1E-8
NCI-H1563 >1E-8 >1E-8 >1E-8 >1E-8
表7：采用六种人癌症细胞系和来自四个不同供体的T细胞的PSMA三特异性抗原结合蛋 白质TDCC试验中，培养基中的IFNγ表达的EC50值
细胞系 供体24 供体8144 供体41 供体72
LNCaP 4.2E-12 4.2E-12 4.2E-12 2.8E-12
VCaP 5.1E-12 1.5E-11 3.4E-12 4.9E-12
MDAPCa2b 1.5E-11 5.8E-12 9.7E-12 3.5E-12
22Rv1 7.8E-12 3.0E-12 9.1E-12 3.0E-12
HCT116 >1E-8 >1E-8 >1E-8 >1E-8
NCI-H1563 >1E-8 >1E-8 >1E-8 >1E-8
实施例12：在使用来自食蟹猴的T细胞的重导向T细胞杀伤试验(TDCC)中，示例性PSMA 三特异性抗原结合蛋白质(靶向PSMA的TriTAC)的活性
进行该研究以测试示例性PSMA三特异性抗原结合蛋白质引导来自食蟹猴的T细胞杀伤表达PSMA的细胞系的能力。
使用来自食蟹猴的外周血单个核细胞(PBMC)建立TDCC试验。将食蟹猴PBMC以10:1的比例添加至LNCaP细胞。观察到PSMA三特异性抗原结合蛋白质重新引导食蟹猴PBMC对LNCaP的杀伤，EC50值为11pM。结果在图9A中示出。为了证实这些结果，使用第二种细胞系MDAPCa2b，并测试来自第二个食蟹猴供体的PBMC。观察到重导向的靶细胞杀伤，EC50值为2.2pM。结果在图9B中示出。杀伤是PSMA三特异性抗原结合蛋白的抗PMSA臂所特有的，因为对于靶向GFP的阴性对照三特异性蛋白质未观察到杀伤。这些数据证明，PSMA抗原结合性三特异性蛋白质可以引导食蟹猴T细胞杀伤表达人PSMA的靶细胞。
实施例13：在使用示例性PSMA三特异性抗原结合蛋白质(靶向PSMA的TriTAC分子)的重 导向T细胞杀伤试验中，T细胞活化标志物的表达
进行该研究以评估当示例性PSMA三特异性抗原结合蛋白质引导T细胞杀伤靶细胞时，T细胞是否被活化。
使用以上实施例中描述的重导向T细胞杀伤试验的条件建立试验。通过使用流式细胞术测量T细胞表面上CD25和CD69的表达来评估T细胞活化。将PSMA三特异性抗原结合蛋白质添加至纯化的人T细胞与前列腺癌细胞系VCaP的10:1混合物。在添加渐增量的PSMA三特异性抗原结合蛋白质后，观察到增加的CD69表达和CD25表达，如图10所示。对于CD69的EC50值为0.3pM，而对于CD25的EC50值为0.2pM。在这些试验中包含靶向GFP的三特异性蛋白质作为阴性对照，并且对于靶向GFP的三特异性蛋白质观察到CD69或CD25表达没有或几乎没有增加，同样在图10中示出。
实施例14：在表达PSMA的靶细胞的存在下，示例性PSMA三特异性抗原结合蛋白质(靶向 PSMA的TriTAC分子)对T细胞增殖的刺激
该研究作为另一方法，用来证明示例性PSMA三特异性抗原结合蛋白质在重新引导T细胞杀伤靶细胞时能够激活T细胞。
如上所述，使用LNCaP靶细胞，用T细胞重导向杀伤试验的条件建立T细胞增殖试验，并测量72小时时存在的T细胞数目。示例性PSMA三特异性抗原结合蛋白质刺激增殖，EC50值为0.5pM。作为阴性对照，在该试验中包含靶向GFP的三特异性蛋白质，并且对于该蛋白质未观察到增殖增加。T细胞增殖试验的结果在图11中示出。
实施例15：示例性PSMA三特异性抗原结合蛋白质(靶向PSMA的TriTAC分子Z2)对LNCaP 细胞的重导向T细胞杀伤
进行该研究以测试具有如SEQ ID No:156所示序列的示例性PSMA三特异性抗原结合蛋白质重新引导T细胞杀伤LNCaP细胞系的能力。
在如以上实施例中所述设置的TDCC试验中，PSMA Z2 TriTAC(SEQ ID NO:156)蛋白质引导杀伤，EC50值为0.8pM，如图12所示。
表8
表9：CD3结合域序列
表10：HSA结合域序列
表11：靶向PSMA的三特异性蛋白质的序列
表12：示例性框架序列
SEQ ID NO: 描述 序列
165 框架(f1) EVQLVESGGGLVQPGGSLTLSCAAS
166 框架(f2) WVRQAPGKGLEWVS
167 框架(f3) RFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC
168 框架(f4) DGYGYRGQGTLVTVSS
序列表
<110> 哈普恩治疗公司
<120> 前列腺特异性膜抗原结合蛋白质
<130> 47517-707.601
<140>
<141>
<150> 62/426,086
<151> 2016-11-23
<160> 168
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Glu、Pro、Ser、His、Thr、Asp、Gly、Lys、Gln或Tyr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> Glu、Pro、Ser、His、Thr、Asp、Gly、Lys、Gln或Tyr
<400> 1
Arg Phe Met Ile Ser Xaa Tyr Xaa Met His
1 5 10
<210> 2
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Glu、Pro、Ser、His、Thr、Asp、Gly、Lys、Gln或Tyr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(7)
<223> Glu、Pro、Ser、His、Thr、Asp、Gly、Lys、Gln或Tyr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> Glu、Pro、Ser、His、Thr、Asp、Gly、Lys、Gln或Tyr
<400> 2
Xaa Ile Asn Pro Ala Xaa Xaa Thr Asp Tyr Ala Glu Xaa Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Glu、Pro、Ser、His、Thr、Asp、Gly、Lys、Gln或Tyr
<400> 3
Asp Xaa Tyr Gly Tyr
1 5
<210> 4
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 4
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Phe Met Ile Ser Glu Tyr
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Asn Pro Ala Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Glu Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asp
85 90 95
Gly Tyr Gly Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 5
Arg Phe Met Ile Ser Glu Tyr His Met His
1 5 10
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 6
Arg Phe Met Ile Ser Pro Tyr Ser Met His
1 5 10
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 7
Arg Phe Met Ile Ser Pro Tyr His Met His
1 5 10
<210> 8
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 8
Asp Ile Asn Pro Ala Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 9
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 9
Thr Ile Asn Pro Ala Lys Thr Thr Asp Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 10
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 10
Thr Ile Asn Pro Ala Gly Gln Thr Asp Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 11
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 11
Thr Ile Asn Pro Ala Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Glu Tyr Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 12
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 12
Asp Ile Asn Pro Ala Lys Thr Thr Asp Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 13
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 13
Asp Ile Asn Pro Ala Gly Gln Thr Asp Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 14
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 14
Asp Ile Asn Pro Ala Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Glu Tyr Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 15
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 15
Asp Ser Tyr Gly Tyr
1 5
<210> 16
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 16
Arg Phe Met Ile Ser Glu Tyr Ser Met His
1 5 10
<210> 17
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 17
Thr Ile Asn Pro Ala Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 18
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 18
Asp Gly Tyr Gly Tyr
1 5
<210> 19
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 19
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Phe Met Ile Ser Glu Tyr
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Asn Pro Ala Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Glu Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asp
85 90 95
Gly Tyr Gly Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 20
<211> 750
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 20
Met Trp Asn Leu Leu His Glu Thr Asp Ser Ala Val Ala Thr Ala Arg
1 5 10 15
Arg Pro Arg Trp Leu Cys Ala Gly Ala Leu Val Leu Ala Gly Gly Phe
20 25 30
Phe Leu Leu Gly Phe Leu Phe Gly Trp Phe Ile Lys Ser Ser Asn Glu
35 40 45
Ala Thr Asn Ile Thr Pro Lys His Asn Met Lys Ala Phe Leu Asp Glu
50 55 60
Leu Lys Ala Glu Asn Ile Lys Lys Phe Leu Tyr Asn Phe Thr Gln Ile
65 70 75 80
Pro His Leu Ala Gly Thr Glu Gln Asn Phe Gln Leu Ala Lys Gln Ile
85 90 95
Gln Ser Gln Trp Lys Glu Phe Gly Leu Asp Ser Val Glu Leu Ala His
100 105 110
Tyr Asp Val Leu Leu Ser Tyr Pro Asn Lys Thr His Pro Asn Tyr Ile
115 120 125
Ser Ile Ile Asn Glu Asp Gly Asn Glu Ile Phe Asn Thr Ser Leu Phe
130 135 140
Glu Pro Pro Pro Pro Gly Tyr Glu Asn Val Ser Asp Ile Val Pro Pro
145 150 155 160
Phe Ser Ala Phe Ser Pro Gln Gly Met Pro Glu Gly Asp Leu Val Tyr
165 170 175
Val Asn Tyr Ala Arg Thr Glu Asp Phe Phe Lys Leu Glu Arg Asp Met
180 185 190
Lys Ile Asn Cys Ser Gly Lys Ile Val Ile Ala Arg Tyr Gly Lys Val
195 200 205
Phe Arg Gly Asn Lys Val Lys Asn Ala Gln Leu Ala Gly Ala Lys Gly
210 215 220
Val Ile Leu Tyr Ser Asp Pro Ala Asp Tyr Phe Ala Pro Gly Val Lys
225 230 235 240
Ser Tyr Pro Asp Gly Trp Asn Leu Pro Gly Gly Gly Val Gln Arg Gly
245 250 255
Asn Ile Leu Asn Leu Asn Gly Ala Gly Asp Pro Leu Thr Pro Gly Tyr
260 265 270
Pro Ala Asn Glu Tyr Ala Tyr Arg Arg Gly Ile Ala Glu Ala Val Gly
275 280 285
Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro Ile Gly Tyr Tyr Asp Ala Gln Lys
290 295 300
Leu Leu Glu Lys Met Gly Gly Ser Ala Pro Pro Asp Ser Ser Trp Arg
305 310 315 320
Gly Ser Leu Lys Val Pro Tyr Asn Val Gly Pro Gly Phe Thr Gly Asn
325 330 335
Phe Ser Thr Gln Lys Val Lys Met His Ile His Ser Thr Asn Glu Val
340 345 350
Thr Arg Ile Tyr Asn Val Ile Gly Thr Leu Arg Gly Ala Val Glu Pro
355 360 365
Asp Arg Tyr Val Ile Leu Gly Gly His Arg Asp Ser Trp Val Phe Gly
370 375 380
Gly Ile Asp Pro Gln Ser Gly Ala Ala Val Val His Glu Ile Val Arg
385 390 395 400
Ser Phe Gly Thr Leu Lys Lys Glu Gly Trp Arg Pro Arg Arg Thr Ile
405 410 415
Leu Phe Ala Ser Trp Asp Ala Glu Glu Phe Gly Leu Leu Gly Ser Thr
420 425 430
Glu Trp Ala Glu Glu Asn Ser Arg Leu Leu Gln Glu Arg Gly Val Ala
435 440 445
Tyr Ile Asn Ala Asp Ser Ser Ile Glu Gly Asn Tyr Thr Leu Arg Val
450 455 460
Asp Cys Thr Pro Leu Met Tyr Ser Leu Val His Asn Leu Thr Lys Glu
465 470 475 480
Leu Lys Ser Pro Asp Glu Gly Phe Glu Gly Lys Ser Leu Tyr Glu Ser
485 490 495
Trp Thr Lys Lys Ser Pro Ser Pro Glu Phe Ser Gly Met Pro Arg Ile
500 505 510
Ser Lys Leu Gly Ser Gly Asn Asp Phe Glu Val Phe Phe Gln Arg Leu
515 520 525
Gly Ile Ala Ser Gly Arg Ala Arg Tyr Thr Lys Asn Trp Glu Thr Asn
530 535 540
Lys Phe Ser Gly Tyr Pro Leu Tyr His Ser Val Tyr Glu Thr Tyr Glu
545 550 555 560
Leu Val Glu Lys Phe Tyr Asp Pro Met Phe Lys Tyr His Leu Thr Val
565 570 575
Ala Gln Val Arg Gly Gly Met Val Phe Glu Leu Ala Asn Ser Ile Val
580 585 590
Leu Pro Phe Asp Cys Arg Asp Tyr Ala Val Val Leu Arg Lys Tyr Ala
595 600 605
Asp Lys Ile Tyr Ser Ile Ser Met Lys His Pro Gln Glu Met Lys Thr
610 615 620
Tyr Ser Val Ser Phe Asp Ser Leu Phe Ser Ala Val Lys Asn Phe Thr
625 630 635 640
Glu Ile Ala Ser Lys Phe Ser Glu Arg Leu Gln Asp Phe Asp Lys Ser
645 650 655
Asn Pro Ile Val Leu Arg Met Met Asn Asp Gln Leu Met Phe Leu Glu
660 665 670
Arg Ala Phe Ile Asp Pro Leu Gly Leu Pro Asp Arg Pro Phe Tyr Arg
675 680 685
His Val Ile Tyr Ala Pro Ser Ser His Asn Lys Tyr Ala Gly Glu Ser
690 695 700
Phe Pro Gly Ile Tyr Asp Ala Leu Phe Asp Ile Glu Ser Lys Val Asp
705 710 715 720
Pro Ser Lys Ala Trp Gly Glu Val Lys Arg Gln Ile Tyr Val Ala Ala
725 730 735
Phe Thr Val Gln Ala Ala Ala Glu Thr Leu Ser Glu Val Ala
740 745 750
<210> 21
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 21
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Phe Met Ile Ser Glu Tyr
20 25 30
His Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Asp Ile Asn Pro Ala Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Glu Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asp
85 90 95
Ser Tyr Gly Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 22
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 22
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Phe Met Ile Ser Glu Tyr
20 25 30
His Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Asn Pro Ala Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Glu Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asp
85 90 95
Ser Tyr Gly Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 23
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 23
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Phe Met Ile Ser Glu Tyr
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Asn Pro Ala Lys Thr Thr Asp Tyr Ala Glu Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asp
85 90 95
Ser Tyr Gly Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 24
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 24
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Phe Met Ile Ser Pro Tyr
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Asn Pro Ala Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Glu Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asp
85 90 95
Gly Tyr Gly Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 25
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 25
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Phe Met Ile Ser Glu Tyr
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Asn Pro Ala Gly Gln Thr Asp Tyr Ala Glu Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asp
85 90 95
Gly Tyr Gly Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 26
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 26
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Phe Met Ile Ser Glu Tyr
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Asn Pro Ala Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Glu Tyr Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asp
85 90 95
Gly Tyr Gly Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 27
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 27
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Phe Met Ile Ser Glu Tyr
20 25 30
His Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Asp Ile Asn Pro Ala Lys Thr Thr Asp Tyr Ala Glu Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asp
85 90 95
Ser Tyr Gly Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 28
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 28
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Phe Met Ile Ser Pro Tyr
20 25 30
His Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Asp Ile Asn Pro Ala Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Glu Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asp
85 90 95
Ser Tyr Gly Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 29
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 29
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 30
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65 70 75 80
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
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1 5 10 15
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20 25 30
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
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<220>
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
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多肽
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多肽
<400> 37
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多肽
<400> 38
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多肽
<400> 39
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<213> 人工序列
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多肽
<400> 40
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<212> PRT
<213> 人工序列
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多肽
<400> 41
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<211> 249
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 42
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<210> 43
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 43
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<210> 44
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 44
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 45
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245
<210> 46
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 46
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Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val
130 135 140
Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu
145 150 155 160
Thr Cys Gly Ser Tyr Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn
165 170 175
Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly
180 185 190
Thr Lys Phe Asn Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu
195 200 205
Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp
210 215 220
Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ala Asn Arg Trp Val Phe
225 230 235 240
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
245
<210> 47
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 47
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Glu Phe Asn Lys Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Glu Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Leu Ile Ser Tyr Trp
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val
130 135 140
Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu
145 150 155 160
Thr Cys Gly Ser Ser Ser Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn
165 170 175
Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly
180 185 190
Thr Lys Phe Gly Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu
195 200 205
Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp
210 215 220
Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe
225 230 235 240
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
245
<210> 48
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val
130 135 140
Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu
145 150 155 160
Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn
165 170 175
Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly
180 185 190
Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu
195 200 205
Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp
210 215 220
Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe
225 230 235 240
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
245
<210> 49
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 49
Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr Ala Met Asn
1 5 10
<210> 50
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 50
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys
<210> 51
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 51
His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr
1 5 10
<210> 52
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 52
Leu Pro Glu Thr Gly
1 5
<210> 53
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 53
Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn
1 5 10
<210> 54
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 54
Gly Thr Lys Phe Leu Ala Pro
1 5
<210> 55
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 55
Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val
1 5
<210> 56
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 56
Gly Asn Thr Phe Asn Lys Tyr Ala Met Asn
1 5 10
<210> 57
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 57
Gly Phe Glu Phe Asn Lys Tyr Ala Met Asn
1 5 10
<210> 58
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 58
Gly Phe Met Phe Asn Lys Tyr Ala Met Asn
1 5 10
<210> 59
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 59
Gly Phe Thr Tyr Asn Lys Tyr Ala Met Asn
1 5 10
<210> 60
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 60
Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr Ala Met Asn
1 5 10
<210> 61
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 61
Gly Phe Thr Phe Asn Gly Tyr Ala Met Asn
1 5 10
<210> 62
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 62
Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Met Asn
1 5 10
<210> 63
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 63
Gly Phe Thr Phe Asn Glu Tyr Ala Met Asn
1 5 10
<210> 64
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 64
Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr Pro Met Asn
1 5 10
<210> 65
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 65
Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr Ala Val Asn
1 5 10
<210> 66
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 66
Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr Ala Ile Asn
1 5 10
<210> 67
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 67
Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr Ala Leu Asn
1 5 10
<210> 68
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 68
Arg Ile Arg Ser Gly Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys
<210> 69
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 69
Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys
<210> 70
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 70
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Lys Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys
<210> 71
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 71
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Glu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys
<210> 72
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 72
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Glu Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys
<210> 73
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 73
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Lys Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys
<210> 74
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 74
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Glu
1 5 10 15
Val Lys
<210> 75
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 75
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ala
1 5 10 15
Val Lys
<210> 76
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 76
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Gln
1 5 10 15
Val Lys
<210> 77
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 77
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Asp
1 5 10 15
Val Lys
<210> 78
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 78
His Ala Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr
1 5 10
<210> 79
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 79
His Thr Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr
1 5 10
<210> 80
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 80
His Gly Asn Phe Asn Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr
1 5 10
<210> 81
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 81
His Gly Asn Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr
1 5 10
<210> 82
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 82
His Gly Asn Phe Gly Asn Ser His Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr
1 5 10
<210> 83
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 83
His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Pro Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr
1 5 10
<210> 84
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 84
His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Gln Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr
1 5 10
<210> 85
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 85
His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Leu Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr
1 5 10
<210> 86
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 86
His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Gly Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr
1 5 10
<210> 87
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 87
His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp Ala Thr
1 5 10
<210> 88
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 88
Ala Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn
1 5 10
<210> 89
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 89
Gly Glu Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn
1 5 10
<210> 90
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 90
Gly Ser Tyr Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn
1 5 10
<210> 91
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 91
Gly Ser Ser Phe Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn
1 5 10
<210> 92
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 92
Gly Ser Ser Lys Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn
1 5 10
<210> 93
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 93
Gly Ser Ser Ser Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn
1 5 10
<210> 94
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 94
Gly Ser Ser Thr Gly Tyr Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn
1 5 10
<210> 95
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 95
Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Val Ser Gly Asn Tyr Pro Asn
1 5 10
<210> 96
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 96
Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Asp Gly Asn Tyr Pro Asn
1 5 10
<210> 97
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 97
Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Lys Gly Asn Tyr Pro Asn
1 5 10
<210> 98
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 98
Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr His Gly Asn Tyr Pro Asn
1 5 10
<210> 99
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 99
Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Val Gly Asn Tyr Pro Asn
1 5 10
<210> 100
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 100
Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Tyr Tyr Pro Asn
1 5 10
<210> 101
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 101
Gly Ile Lys Phe Leu Ala Pro
1 5
<210> 102
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 102
Gly Thr Glu Phe Leu Ala Pro
1 5
<210> 103
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 103
Gly Thr Tyr Phe Leu Ala Pro
1 5
<210> 104
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 104
Gly Thr Ser Phe Leu Ala Pro
1 5
<210> 105
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 105
Gly Thr Asn Phe Leu Ala Pro
1 5
<210> 106
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 106
Gly Thr Lys Leu Leu Ala Pro
1 5
<210> 107
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 107
Gly Thr Lys Glu Leu Ala Pro
1 5
<210> 108
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 108
Gly Thr Lys Ile Leu Ala Pro
1 5
<210> 109
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 109
Gly Thr Lys Met Leu Ala Pro
1 5
<210> 110
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 110
Gly Thr Lys Val Leu Ala Pro
1 5
<210> 111
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 111
Gly Thr Lys Phe Asn Ala Pro
1 5
<210> 112
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 112
Gly Thr Lys Phe Gly Ala Pro
1 5
<210> 113
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 113
Gly Thr Lys Phe Leu Val Pro
1 5
<210> 114
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 114
Thr Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val
1 5
<210> 115
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 115
Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val
1 5
<210> 116
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 116
Val Leu Trp Tyr Asp Asn Arg Trp Val
1 5
<210> 117
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 117
Val Leu Trp Tyr Ala Asn Arg Trp Val
1 5
<210> 118
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 118
Val Leu Trp Tyr Ser Asn Ser Trp Val
1 5
<210> 119
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 119
Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Ile
1 5
<210> 120
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 120
Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Ala
1 5
<210> 121
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 121
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr
20 25 30
Ala Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Glu Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Pro Ile Ser Tyr Trp
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val
130 135 140
Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu
145 150 155 160
Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn
165 170 175
Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly
180 185 190
Thr Asn Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Leu
195 200 205
Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp
210 215 220
Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Ala Phe
225 230 235 240
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
245
<210> 122
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 122
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Glu Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Asp Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Gly Ile Ser Tyr Trp
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val
130 135 140
Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu
145 150 155 160
Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Val Gly Asn Tyr Pro Asn
165 170 175
Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly
180 185 190
Thr Glu Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu
195 200 205
Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp
210 215 220
Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe
225 230 235 240
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
245
<210> 123
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 123
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 124
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 124
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ala Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Leu
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Lys Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 125
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 125
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Tyr Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Lys Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 126
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 126
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Thr Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 127
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 127
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Lys Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 128
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 128
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Arg Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Val Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 129
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 129
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 130
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 130
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser
1 5 10
<210> 131
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 131
Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
<210> 132
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 132
Gly Gly Ser Leu Ser Arg
1 5
<210> 133
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 133
Gly Phe Thr Phe Ser Arg Phe Gly Met Ser
1 5 10
<210> 134
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 134
Gly Phe Thr Phe Ser Lys Phe Gly Met Ser
1 5 10
<210> 135
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 135
Gly Phe Thr Tyr Ser Ser Phe Gly Met Ser
1 5 10
<210> 136
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 136
Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ala Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Leu Lys
1 5 10 15
<210> 137
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 137
Ser Ile Ser Gly Ser Gly Thr Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
<210> 138
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 138
Ser Ile Ser Gly Ser Gly Arg Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
<210> 139
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 139
Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Glu Ser Val Lys
1 5 10 15
<210> 140
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 140
Ser Ile Ser Gly Ser Gly Thr Asp Thr Leu Tyr Ala Glu Ser Val Lys
1 5 10 15
<210> 141
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 141
Ser Ile Ser Gly Ser Gly Arg Asp Thr Leu Tyr Ala Glu Ser Val Lys
1 5 10 15
<210> 142
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 142
Gly Gly Ser Leu Ser Lys
1 5
<210> 143
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 143
Gly Gly Ser Leu Ser Val
1 5
<210> 144
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 144
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 145
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 145
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Thr Asp Thr Leu Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 146
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 146
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Arg Asp Thr Leu Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Val Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 147
<211> 499
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 147
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Phe Met Ile Ser Glu Tyr
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Asn Pro Ala Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Glu Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asp
85 90 95
Gly Tyr Gly Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
130 135 140
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala
145 150 155 160
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Arg
165 170 175
Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
180 185 190
Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro
195 200 205
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Val
210 215 220
Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
225 230 235 240
Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
245 250 255
Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr
260 265 270
Phe Asn Lys Tyr Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
275 280 285
Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr
290 295 300
Tyr Tyr Ala Asp Gln Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp
305 310 315 320
Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp
325 330 335
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Ala Asn Phe Gly Asn Ser Tyr
340 345 350
Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
355 360 365
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
370 375 380
Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
385 390 395 400
Thr Val Thr Leu Thr Cys Ala Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly
405 410 415
Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
420 425 430
Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu Val Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
435 440 445
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val
450 455 460
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Thr Leu Trp Tyr Ser Asn
465 470 475 480
Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu His His His
485 490 495
His His His
<210> 148
<211> 499
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 148
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Phe Met Ile Ser Glu Tyr
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Asn Pro Ala Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Glu Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asp
85 90 95
Gly Tyr Gly Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
130 135 140
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala
145 150 155 160
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Arg
165 170 175
Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
180 185 190
Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro
195 200 205
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Val
210 215 220
Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
225 230 235 240
Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
245 250 255
Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr
260 265 270
Phe Asn Asn Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
275 280 285
Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Gly Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr
290 295 300
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp
305 310 315 320
Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp
325 330 335
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr
340 345 350
Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
355 360 365
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
370 375 380
Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
385 390 395 400
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Tyr Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly
405 410 415
Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
420 425 430
Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Asn Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
435 440 445
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val
450 455 460
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ala Asn
465 470 475 480
Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu His His His
485 490 495
His His His
<210> 149
<211> 499
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 149
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Phe Met Ile Ser Glu Tyr
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Asn Pro Ala Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Glu Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asp
85 90 95
Gly Tyr Gly Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
130 135 140
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala
145 150 155 160
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Arg
165 170 175
Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
180 185 190
Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro
195 200 205
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Val
210 215 220
Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
225 230 235 240
Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
245 250 255
Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Glu
260 265 270
Phe Asn Lys Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
275 280 285
Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Glu Thr
290 295 300
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp
305 310 315 320
Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp
325 330 335
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Leu
340 345 350
Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
355 360 365
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
370 375 380
Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
385 390 395 400
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Ser Gly Ala Val Thr Ser Gly
405 410 415
Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
420 425 430
Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Gly Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
435 440 445
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val
450 455 460
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn
465 470 475 480
Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu His His His
485 490 495
His His His
<210> 150
<211> 499
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 150
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Phe Met Ile Ser Glu Tyr
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
130 135 140
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala
145 150 155 160
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser
165 170 175
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195 200 205
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Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
225 230 235 240
Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
245 250 255
Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr
260 265 270
Phe Asn Lys Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
275 280 285
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290 295 300
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp
305 310 315 320
Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp
325 330 335
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr
340 345 350
Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
355 360 365
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
370 375 380
Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
385 390 395 400
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly
405 410 415
Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
420 425 430
Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
435 440 445
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val
450 455 460
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465 470 475 480
Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu His His His
485 490 495
His His His
<210> 151
<211> 499
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 151
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Phe Met Ile Ser Glu Tyr
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
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Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
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Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
245 250 255
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Tyr Tyr Ala Asp Gln Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp
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325 330 335
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Thr Val Thr Leu Thr Cys Ala Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly
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Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu Val Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
435 440 445
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485 490 495
His His His
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<211> 499
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 152
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Phe Met Ile Ser Glu Tyr
20 25 30
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
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Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
225 230 235 240
Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
245 250 255
Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr
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325 330 335
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355 360 365
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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Thr Val Thr Leu Thr Cys Ala Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly
405 410 415
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420 425 430
Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu Val Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
435 440 445
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Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Thr Leu Trp Tyr Ser Asn
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485 490 495
His His His
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<211> 499
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 153
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Phe Met Ile Ser Glu Tyr
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Ser Tyr Gly Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
130 135 140
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala
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Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
245 250 255
Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr
260 265 270
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275 280 285
Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr
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Tyr Tyr Ala Asp Gln Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp
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Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
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Thr Val Thr Leu Thr Cys Ala Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly
405 410 415
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420 425 430
Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu Val Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
435 440 445
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val
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Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Thr Leu Trp Tyr Ser Asn
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His His His
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<211> 504
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 154
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
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Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Ile Ile Ser Asp Gly Gly Tyr Tyr Thr Tyr Tyr Ser Asp Ile Ile
50 55 60
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro
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Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys
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Asp Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Ala Ser Gly Thr Asp Phe Thr
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Gln Gln Tyr Asp Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
225 230 235 240
Glu Ile Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
245 250 255
Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala
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Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln
275 280 285
Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr
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Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr
305 310 315 320
Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn
325 330 335
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Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
355 360 365
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly
405 410 415
Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly
420 425 430
Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly
435 440 445
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Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val
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Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr
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Val Leu His His His His His His
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<211> 512
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 155
Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Arg Ser Tyr
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Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
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Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln
225 230 235 240
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
245 250 255
Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
260 265 270
Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys
275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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<211> 499
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 156
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Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Phe Met Ile Ser Glu Tyr
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65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asp
85 90 95
Ser Tyr Gly Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
245 250 255
Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr
260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp
325 330 335
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340 345 350
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Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
385 390 395 400
Thr Val Thr Leu Thr Cys Ala Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly
405 410 415
Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
420 425 430
Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu Val Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
435 440 445
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val
450 455 460
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Thr Leu Trp Tyr Ser Asn
465 470 475 480
Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu His His His
485 490 495
His His His
<210> 157
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(20)
<223> 该序列可包含1-10个"Gly Ser"重复单元
<400> 157
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5 10 15
Gly Ser Gly Ser
20
<210> 158
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(30)
<223> 该序列可包含1-10个"Gly Gly Ser"重复单元
<400> 158
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
20 25 30
<210> 159
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(40)
<223> 该序列可包含1-10个"Gly Gly Gly Ser"重复单元
<400> 159
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
20 25 30
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
35 40
<210> 160
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(40)
<223> 该序列可包含1-10个"Gly Gly Ser Gly"重复单元
<400> 160
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly
35 40
<210> 161
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(50)
<223> 该序列可包含1-10个"Gly Gly Ser Gly Gly"重复单元
<400> 161
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
35 40 45
Gly Gly
50
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<211> 50
<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(50)
<223> 该序列可包含1-10个"Gly Gly Gly Gly Ser"重复单元
<400> 162
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Ser
50
<210> 163
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 163
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 164
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 164
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 165
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 165
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 166
<211> 14
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 166
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
1 5 10
<210> 167
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 167
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 168
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 168
Asp Gly Tyr Gly Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10 15

Claims (85)

1.一种前列腺特异性膜抗原结合蛋白质，其包含互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，其中
(a)CDR1的氨基酸序列如RFMISX1YX2MH(SEQ ID NO:1)所示；
(b)CDR2的氨基酸序列如X3INPAX4X5TDYAEX6VKG(SEQ ID NO:2)所示；并且
(c)CDR3的氨基酸序列如DX7YGY(SEQ ID NO:3)所示。
2.如权利要求1所述的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质，其中所述蛋白质包含下式：
f1-r1-f2-r2-f3-r3-f4
其中r1是SEQ ID NO.1；r2是SEQ ID NO.2；并且r3是SEQ ID NO.3；并且其中f1、f2、f3和f4是选定的框架残基，使得所述蛋白质与SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列至少80％相同。
3.如权利要求2所述的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质，其中X1是脯氨酸。
4.如权利要求2所述的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质，其中X2是组氨酸。
5.如权利要求2所述的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质，其中X3是天冬氨酸。
6.如权利要求2所述的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质，其中X4是赖氨酸。
7.如权利要求2所述的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质，其中X5是谷氨酰胺。
8.如权利要求2所述的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质，其中X6是酪氨酸。
9.如权利要求2所述的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质，其中X7是丝氨酸。
10.如权利要求1-9中任一项所述的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质，其中所述结合蛋白质相对于具有如SEQ ID NO:4所示的序列的结合蛋白质对人前列腺特异性膜抗原具有更高的亲和力。
11.如权利要求1-9中任一项所述的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质，其中X1是脯氨酸。
12.如权利要求1-9中任一项所述的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质，其中X5是谷氨酰胺。
13.如权利要求1-9中任一项所述的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质，其中X6是酪氨酸。
14.如权利要求1-9中任一项所述的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质，其中X4是赖氨酸，并且X7是丝氨酸。
15.如权利要求1-9中任一项所述的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质，其中X2是组氨酸，X3是天冬氨酸，X4是赖氨酸，并且X7是丝氨酸。
16.如权利要求1-9中任一项所述的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质，其中X1是脯氨酸，X2是组氨酸，X3是天冬氨酸，并且X7是丝氨酸。
17.如权利要求1-9中任一项所述的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质，其中X2是组氨酸，X3是天冬氨酸，X5是谷氨酰胺，并且X7是丝氨酸。
18.如权利要求1-9中任一项所述的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质，其中X2是组氨酸，X3是天冬氨酸，X6是酪氨酸，并且X7是丝氨酸。
19.如权利要求1-9中任一项所述的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质，其中X2是组氨酸，并且X7是丝氨酸。
20.如权利要求1-9中任一项所述的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质，其中X2是组氨酸，X3是天冬氨酸，并且X7是丝氨酸。
21.如权利要求11-20中任一项所述的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质，其中所述结合蛋白质相对于具有SEQ ID NO:4所示的序列的结合蛋白质对人前列腺特异性膜抗原具有更高的亲和力。
22.如权利要求19-21中任一项所述的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质，其中所述结合蛋白质相对于具有SEQ ID NO:4所示的序列的结合蛋白质进一步对食蟹猴前列腺特异性膜抗原具有更高的亲和力。
23.如权利要求1-22中任一项所述的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质，其中r1包含SEQID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7。
24.如权利要求1-23中任一项所述的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质，其中r2包含SEQID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或SEQID NO:14。
25.如权利要求1-24中任一项所述的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质，其中r3包含SEQID NO:15。
26.一种包含CDR1、CDR2和CDR3的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质，其包含SEQ ID NO:4所示的序列，其中选自氨基酸位置31、33、50、55、56、62和97的一个或多个氨基酸残基被置换。
27.如权利要求26所述的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质，其在除位置31、33、50、55、56、62和97之外的氨基酸位置处包含一个或多个另外的置换。
28.如权利要求26或27所述的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质，其在位置31处包含置换。
29.如权利要求26或27所述的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质，其在位置33处包含置换。
30.如权利要求26或27所述的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质，其在位置50处包含置换。
31.如权利要求26或27所述的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质，其在位置55处包含置换。
32.如权利要求26或27所述的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质，其在位置56处包含置换。
33.如权利要求26或27所述的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质，其在位置62处包含置换。
34.如权利要求26或27所述的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质，其在位置97处包含置换。
35.如权利要求26或27所述的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质，其在氨基酸位置55和97处包含置换。
36.如权利要求28-35中任一项所述的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质，其中所述结合蛋白质相对于具有SEQ ID NO:4所示的序列的结合蛋白质对人前列腺特异性膜抗原具有更高的亲和力。
37.如权利要求26或27所述的特异性膜抗原结合蛋白质，其在氨基酸位置33和97处包含置换。
38.如权利要求26或27所述的特异性膜抗原结合蛋白质，其在氨基酸位置33、50和97处包含置换。
39.如权利要求37或38所述的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质，其中所述结合蛋白质相对于具有SEQ ID NO:4所示的序列的结合蛋白质对人前列腺特异性膜抗原具有更高的亲和力。
40.如权利要求37或38所述的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质，其中所述结合蛋白质相对于具有SEQ ID NO:4所示的序列的结合蛋白质进一步对食蟹猴前列腺特异性膜抗原具有更高的亲和力。
41.如权利要求26或27所述的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质，其在氨基酸位置31、33、50和97处包含置换。
42.如权利要求26或27所述的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质，其在氨基酸位置33、50、55和97处包含置换。
43.如权利要求26或27所述的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质，其在氨基酸位置33、50、56和97处包含置换。
44.如权利要求26或27所述的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质，其在氨基酸位置33、50、62和97处包含置换。
45.一种包含CDR1、CDR2和CDR3的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质，其中CDR1包含如SEQ ID NO:16所示的序列。
46.一种包含CDR1、CDR2和CDR3的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质，其中CDR2包含如SEQ ID NO:17所示的序列。
47.一种包含CDR1、CDR2和CDR3的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质，其中CDR3包含如SEQ ID NO:18所示的序列。
48.一种包含与SEQ ID NO:4所示的序列至少80％相同的序列的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质。
49.一种包含CDR1、CDR2和CDR3的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质，其中CDR1与SEQ IDNO:16具有至3少80％的同一性，CDR2与SEQ ID NO:17具有至少85％的同一性，并且CDR与SEQ ID NO:18具有至少80％的同一性。
50.一种包含CDR1、CDR2和CDR3的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质，其中CDR1包含SEQID NO:16，CDR2包含SEQ ID NO:17，并且CDR3包含SEQ ID NO:18。
51.如权利要求1-50中任一项所述的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质，其中所述结合蛋白质与人前列腺特异性膜抗原和食蟹猴前列腺特异性膜抗原中的一种或两种结合。
52.如权利要求1-51中任一项所述的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质，其中所述结合蛋白质以相当的结合亲和力与人前列腺特异性膜抗原和食蟹猴前列腺特异性膜抗原结合。
53.如权利要求1-51中任一项所述的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质，其中所述结合蛋白质相对于与食蟹猴前列腺特异性膜抗原结合以更高的结合亲和力与人前列腺特异性膜抗原结合。
54.一种编码根据权利要求1-53中任一项所述的PSMA结合蛋白质的多核苷酸。
55.一种包含如权利要求54所述的多核苷酸的载体。
56.一种用根据权利要求55所述的载体转化的宿主细胞。
57.一种药物组合物，其包含(i)根据权利要求1-53中任一项所述的PSMA结合蛋白质、根据权利要求54所述的多核苷酸、根据权利要求55所述的载体或根据权利要求56所述的宿主细胞，和(ii)药学上可接受的载剂。
58.一种用于产生根据权利要求1-53中任一项所述的PSMA结合蛋白质的方法，所述方法包括在允许所述PSMA结合蛋白质表达的条件下培养用包含编码根据权利要求1-53中任一项所述的PSMA白蛋白结合蛋白质的核酸序列的载体转化或转染的宿主，以及从培养物中回收并纯化所产生的蛋白质。
59.一种用于治疗或改善增生性疾病、肿瘤疾病、炎性疾病、免疫性病症、自身免疫病、感染性疾病、病毒性疾病、变态反应、寄生虫反应、移植物抗宿主病或宿主抗移植物病的方法，其包括向有需要的受试者施用根据权利要求1-53中任一项所述的PSMA结合蛋白质。
60.如权利要求59所述的方法，其中所述受试者是人。
61.如权利要求60所述的方法，其中所述方法进一步包括与根据权利要求1-53中任一项所述的PSMA结合蛋白质联合施用活性物质。
62.一种多特异性结合蛋白质，其包含根据权利要求1、权利要求26或权利要求45-50中任一项所述的PSMA结合蛋白质。
63.一种抗体，其包含根据权利要求1、权利要求26或权利要求45-50所述的PSMA结合蛋白质。
64.一种多特异性抗体、双特异性抗体、sdAb、重链可变域、肽或配体，其包含根据权利要求1、权利要求26或权利要求45-50所述的PSMA结合蛋白质。
65.一种抗体，其包含根据权利要求1、权利要求26或权利要求45-50所述的PSMA结合蛋白质，其中所述抗体是单结构域抗体。
66.如权利要求64所述的单结构域抗体，其中所述抗体衍生自IgG的重链可变区。
67.一种多特异性结合蛋白质或抗体，其包含根据权利要求1、权利要求26或权利要求45-50中任一项所述的PSMA结合蛋白质以及CD3结合域。
68.一种用于治疗或改善增生性疾病、肿瘤疾病、炎性疾病、免疫性病症、自身免疫病、感染性疾病、病毒性疾病、变态反应、寄生虫反应、移植物抗宿主病或宿主抗移植物病的方法，其包括向有需要的受试者施用根据权利要求64-68中任一项所述的多特异性抗体。
69.一种用于治疗或改善前列腺病况的方法，其包括向有需要的受试者施用根据权利要求64-68中任一项所述的多特异性抗体。
70.一种用于治疗或改善前列腺病况的方法，其包括向有需要的受试者施用根据权利要求1-53中任一项所述的PSMA结合蛋白质。
71.如权利要求1所述的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质，其包含以下的任意组合：
(i)其中X1是脯氨酸；
(ii)其中X2是组氨酸；
(iii)其中X3是天冬氨酸；
(iv)其中X4是赖氨酸；
(v)其中X5是谷氨酰胺；
(vi)其中X6是酪氨酸；以及
(vii)其中X7是丝氨酸。
72.如权利要求71所述的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质，其中所述结合蛋白质相对于具有如SEQ ID NO:4所示的序列的结合蛋白质对人前列腺特异性膜抗原具有更高的亲和力。
73.如权利要求1所述的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质，其包含以下的任意组合：
(i)其中X1是脯氨酸；其中X5是谷氨酰胺；
(ii)其中X6是酪氨酸；其中X4是赖氨酸，并且X7是丝氨酸；
(iii)其中X2是组氨酸，X3是天冬氨酸，X4是赖氨酸，并且X7是丝氨酸；
(iv)其中X1是脯氨酸，X2是组氨酸，X3是天冬氨酸，并且X7是丝氨酸；
(v)其中X2是组氨酸，X3是天冬氨酸，X5是谷氨酰胺，并且X7是丝氨酸；
(vi)其中X2是组氨酸，X3是天冬氨酸，X4是赖氨酸，并且X7是丝氨酸；
(vii)其中X1是脯氨酸，X2是组氨酸，X3是天冬氨酸，并且X7是丝氨酸；
(viii)其中X2是组氨酸，X3是天冬氨酸，X5是谷氨酰胺，并且X7是丝氨酸；
(ix)其中X2是组氨酸，X3是天冬氨酸，X6是酪氨酸，并且X7是丝氨酸；以及
(x)其中X2是组氨酸，X3是天冬氨酸，并且X7是丝氨酸。
74.如权利要求73所述的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质，其中所述结合蛋白质相对于具有SEQ ID NO:4所示的序列的结合蛋白质对人前列腺特异性膜抗原具有更高的亲和力。
75.如权利要求74所述的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质，其中所述结合蛋白质相对于具有SEQ ID NO:4所示的序列的结合蛋白质进一步对食蟹猴前列腺特异性膜抗原具有更高的亲和力。
76.如权利要求26所述的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质，其包含以下的任意组合：
(i)在位置31处的置换；
(ii)在位置50处的置换；
(iii)在位置55处的置换；在位置56处的置换；
(iv)在位置62处的置换；
(v)在位置97处的置换；
(vi)在位置55和97处的置换；
(vii)在位置33和97处的置换；
(viii)在位置33、50和97处的置换；
(ix)在位置31、33、50和97处的置换；
(x)在位置33、50、55和97处的置换；
(xi)在位置33、50、56和97处的置换；以及
(xiii)在位置33、50、62和97处的置换。
77.如权利要求76所述的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质，其中所述结合蛋白质相对于具有SEQ ID NO:4所示的序列的结合蛋白质对人前列腺特异性膜抗原具有更高的亲和力。
78.如权利要求77所述的前列腺特异性膜抗原结合蛋白质，其中所述结合蛋白质相对于具有SEQ ID NO:4所示的序列的结合蛋白质进一步对食蟹猴前列腺特异性膜抗原具有更高的亲和力。
79.一种用于治疗或改善前列腺癌的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用包含互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的PSMA结合蛋白质，其中
(a)CDR1的氨基酸序列如RFMISX1YX2MH(SEQ ID NO:1)所示；
(b)CDR2的氨基酸序列如X3INPAX4X5TDYAEX6VKG(SEQ ID NO:2)所示；并且
(c)CDR3的氨基酸序列如DX7YGY(SEQ ID NO:3)所示。
80.一种抗体，其包含根据权利要求1所述的PSMA结合蛋白质，其中所述抗体是单结构域抗体。
81.一种抗体，其包含根据权利要求80所述的PSMA结合蛋白质，其中所述单结构域抗体是三特异性抗体的一部分。
82.一种抗体，其包含根据权利要求26所述的PSMA结合蛋白质，其中所述抗体是单结构域抗体。
83.一种抗体，其包含根据权利要求82所述的PSMA结合蛋白质，其中所述单结构域抗体是三特异性抗体的一部分。
84.一种抗体，其包含根据权利要求49所述的PSMA结合蛋白质，其中所述抗体是单结构域抗体。
85.一种抗体，其包含根据权利要求84所述的PSMA结合蛋白质，其中所述单结构域抗体是三特异性抗体的一部分。
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