KR102530742B1 - 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질 - Google Patents

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브라이언 디. 레몬
리차드 제이. 오스틴
루크 에브닌
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Abstract

본원은 개선된 열 안정성, 결합 친화성 및 강력한 응집 프로파일을 가진 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질을 개시한다. 본 개시에 따른 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질을 포함하는 다중특이적 결합 단백질도 기재되어 있다. 본원에 개시된 결합 단백질을 포함하는 약학 조성물 및 이러한 제형을 사용하는 방법이 제공된다.

Description

단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질
교차참조
본원은 전체로서 본원에 참고로 도입되는, 2016년 5월 20일에 출원된 미국 가출원 제62/339,682호의 이익을 주장한다.
서열목록
본원은 ASCII 포맷으로 전자적으로 제출되었고 전체로서 본원에 참고로 도입되는 서열목록을 함유한다. 2017년 5월 18일에 생성된 상기 ASCII 사본은 47517-703_601_SEQ.txt로서 명명되고, 크기가 22,218 바이트이다.
참고 도입
본 명세서에서 언급된 모든 공개문헌들, 특허들 및 특허출원들은 각각의 개별 공개문헌, 특허 또는 특허출원이 참고로 도입되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 표시되는 것처럼, 그리고 전체로서 기재되는 것처럼 동일한 정도로 본원에 참고로 도입된다.
알부민은 가장 풍부한 혈장 단백질이고, 높은 가용성을 갖고, 매우 안정하고 엄청나게 긴 순환 반감기를 가진다. 알부민은 치료 분자의 순환 반감기를 증가시키기 위해 다양한 방식들로 사용될 수 있다. 본 개시는 치료 분자의 반감기를 연장시키기 위해 사용될 수 있는 단일 도메인 알부민 결합 단백질을 제공한다.
한 실시양태에서, 본원은 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질로서, (a) CDR1의 아미노산 서열이 GFX1X2X3X4FGMS(서열번호 1)로 기재된 바와 같고, X1이 쓰레오닌, 아르기닌, 라이신, 세린 또는 프롤린이고, X2가 페닐알라닌 또는 티로신이고, X3이 세린, 아르기닌 또는 라이신이고, X4가 세린, 라이신, 아르기닌 또는 알라닌이고; (b) CDR2의 아미노산 서열이 SISGSGX5X6TLYAX7SX8K(서열번호 2)로 기재된 바와 같고, X5가 세린, 아르기닌, 쓰레오닌 또는 알라닌이고, X6이 아스파르트산, 히스티딘, 발린 또는 쓰레오닌이고, X7이 아스파르트산, 히스티딘, 아르기닌 또는 세린이고, X8이 발린 또는 류신이고; (c) CDR3의 아미노산 서열이 GGSLX9X10(서열번호 3)으로 기재된 바와 같고, X9가 세린, 아르기닌, 쓰레오닌 또는 라이신이고, X10이 아르기닌, 라이신, 발린, 프롤린 또는 아스파라긴이고, X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, X9 및 X10이 동시에 각각 쓰레오닌, 페닐알라닌, 세린, 세린, 세린, 아스파르트산, 아스파르트산, 발린, 세린 및 아르기닌이 아닌 것인 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질을 제공한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 식 f1-r1-f2-r2-f3-r3-f4를 포함하고, 이때 r1은 서열번호 1이고; r2는 서열번호 2이고; r3은 서열번호 3이고; f1, f2, f3 및 f4는 상기 단백질이 서열번호 10으로 기재된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일하도록 선택된 프레임워크(framework) 잔기이다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 r1이 서열번호 14, 서열번호 15 또는 서열번호 16을 포함하는 것인 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 r2가 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21 또는 서열번호 22를 포함하는 것인 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 r3이 서열번호 23 또는 서열번호 24를 포함하는 것인 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 r1이 서열번호 14를 포함하는 것인 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 r1이 서열번호 15를 포함하고 r2가 서열번호 17을 포함하고 r3이 서열번호 23을 포함하는 것인 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 r1이 서열번호 16을 포함하고 r3이 서열번호 23을 포함하는 것인 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 r1이 서열번호 15를 포함하고 r2가 서열번호 18을 포함하는 것인 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 r1이 서열번호 14를 포함하고 r3이 서열번호 23을 포함하는 것인 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 r1이 서열번호 15를 포함하고 r2가 서열번호 19를 포함하고 r3이 서열번호 24를 포함하는 것인 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 r1이 서열번호 14를 포함하고 r2가 서열번호 20을 포함하는 것인 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 r1이 서열번호 15를 포함하고 r2가 서열번호 21을 포함하는 것인 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 r1이 서열번호 15를 포함하고 r2가 서열번호 22를 포함하고 r3이 서열번호 24를 포함하는 것인 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 25, 서열번호 26 및 서열번호 27로부터 선택된 아미노산 서열을 가진다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 서열번호 4로서 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 서열번호 7로서 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 서열번호 9로서 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 서열번호 26으로서 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 서열번호 27로서 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 서열번호 5로서 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 서열번호 6으로서 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 서열번호 8로서 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 서열번호 25로서 기재된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 인간 혈청 알부민, 사이노몰구스 혈청 알부민 및 마우스 혈청 알부민으로부터 선택된 혈청 알부민에 결합한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 필적할만한 결합 친화성(Kd)으로 인간 혈청 알부민 및 사이노몰구스 혈청 알부민에 결합한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 인간 및 사이노몰구스 혈청 알부민에 대한 상기 단백질의 결합 친화성(Kd)보다 약 1.5배 내지 약 20배 더 약한 결합 친화성(Kd)으로 마우스 혈청 알부민에 결합한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 약 1 nM 내지 약 100 nM의 인간 Kd(hKd)로 인간 혈청 알부민에 결합하고 1 nM 내지 100 nM의 사이노몰구스 Kd(cKd)로 사이노몰구스 혈청 알부민에 결합한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질의 hKd 및 cKd는 1 nM 내지 약 5 nM, 또는 약 5 nM 내지 약 10 nM이다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질의 hKd 및 cKd는 약 1 nM 내지 약 2 nM, 약 2 nM 내지 약 3 nM, 약 3 nM 내지 약 4 nM, 약 4 nM 내지 약 5 nM, 약 5 nM 내지 약 6 nM, 약 6 nM 내지 약 7 nM, 약 7 nM 내지 약 8 nM, 약 8 nM 내지 약 9 nM, 또는 약 9 nM 내지 약 10 nM이다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질의 hKd와 cKd의 비(hKd:cKd)는 약 20:1 내지 약 1:2의 범위이다.
일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 서열번호 4로서 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 이때 hKd 및 cKd는 약 1 nM 내지 약 5 nM이다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 서열번호 5로서 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 이때 hKd 및 cKd는 약 1 nM 내지 약 5 nM이다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 서열번호 6으로서 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 이때 hKd 및 cKd는 약 1 nM 내지 약 5 nM이다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 서열번호 7로서 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 이때 hKd 및 cKd는 약 1 nM 내지 약 5 nM이다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 서열번호 8로서 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 이때 hKd 및 cKd는 약 5 nM 내지 약 10 nM이다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 서열번호 9로서 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 이때 hKd 및 cKd는 약 1 nM 내지 약 5 nM이다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 서열번호 22로서 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 이때 hKd 및 cKd는 약 1 nM 내지 약 5 nM이다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 서열번호 23으로서 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 이때 hKd 및 cKd는 약 1 nM 내지 약 5 nM이다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 서열번호 24로서 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 이때 hKd 및 cKd는 약 1 nM 내지 약 5 nM이다.
일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 적어도 12시간, 적어도 20시간, 적어도 25시간, 적어도 30시간, 적어도 35시간, 적어도 40시간, 적어도 45시간, 적어도 50시간 또는 적어도 100 시간의 제거 반감기를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 서열번호 10으로서 기재된 서열을 포함하는, CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질로서, CDR1의 아미노산 위치 28, 29, 30 또는 31; CDR2의 위치 56, 57, 62 또는 64; 및 CDR3의 위치 103 및 104로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환되어 있고, 아미노산 위치 28이 아르기닌, 라이신, 세린 또는 프롤린으로 치환되어 있고, 아미노산 위치 29가 티로신으로 치환되어 있고, 아미노산 위치 30이 아르기닌 또는 라이신으로 치환되어 있고, 아미노산 위치 31이 라이신, 아르기닌 또는 알라닌으로 치환되어 있고, 아미노산 위치 56이 아르기닌, 쓰레오닌 또는 알라닌으로 치환되어 있고, 아미노산 위치 57이 히스티딘, 발린 또는 쓰레오닌으로 치환되어 있고, 아미노산 위치 62가 히스티딘, 아르기닌, 글루탐산 또는 세린으로 치환되어 있고, 아미노산 위치 64가 류신으로 치환되어 있고, 아미노산 위치 103이 아르기닌, 쓰레오닌 또는 라이신으로 치환되어 있고, 아미노산 위치 104가 라이신, 발린, 프롤린 또는 아스파라긴으로 치환되어 있는 것인 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질이 제공된다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 위치 28, 29, 30, 31, 56, 57, 62, 64, 103 및 104 이외의 아미노산 위치에서 하나 이상의 추가 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 위치 29에서 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 위치 31에서 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 위치 56에서 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 위치 62에서 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 위치 64에서 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 위치 104에서 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 아미노산 위치 31 및 62에서 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 위치 31이 아르기닌으로 치환되어 있는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 위치 31이 아르기닌으로 치환되어 있고 아미노산 위치 62가 글루탐산으로 치환되어 있는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 아미노산 위치 31, 56, 64 및 104에서 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 위치 31이 라이신으로 치환되어 있고, 아미노산 위치 56이 알라닌으로 치환되어 있고, 아미노산 위치 64가 류신으로 치환되어 있고, 아미노산 위치 104가 라이신으로 치환되어 있는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 아미노산 위치 29 및 104에서 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 아미노산 위치 29가 티로신으로 치환되어 있고, 아미노산 위치 104가 라이신으로 치환되어 있는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 아미노산 위치 31 및 56에서 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 아미노산 위치 31이 라이신으로 치환되어 있고, 아미노산 위치 56이 쓰레오닌으로 치환되어 있는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 아미노산 위치 31, 56 및 62에서 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 아미노산 위치 31이 라이신으로 치환되어 있고, 아미노산 위치 56이 쓰레오닌으로 치환되어 있고, 아미노산 위치 62가 글루탐산으로 치환되어 있는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 아미노산 위치 31 및 104에서 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 아미노산 위치 31이 아르기닌으로 치환되어 있고, 아미노산 위치 104가 라이신으로 치환되어 있는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 아미노산 위치 31, 56 및 104에서 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 아미노산 위치 31이 라이신으로 치환되어 있고, 아미노산 위치 56이 아르기닌으로 치환되어 있고, 아미노산 위치 104가 발린으로 치환되어 있는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 아미노산 위치 31, 56, 62 및 104에서 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 아미노산 위치 31이 라이신으로 치환되어 있고, 아미노산 위치 56이 아르기닌으로 치환되어 있고, 아미노산 위치 62가 글루탐산으로 치환되어 있고, 아미노산 위치 104가 발린으로 치환되어 있는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 아미노산 위치 31이 아르기닌으로 치환되어 있는 아미노산 서열을 포함하고, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질의 hKd 및 cKd는 약 1 nM 내지 약 5 nM이다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 아미노산 위치 31이 아르기닌으로 치환되어 있고, 아미노산 위치 62가 글루탐산으로 치환되어 있는 아미노산 서열을 포함하고, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질의 hKd 및 cKd는 약 1 nM 내지 약 5 nM이다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 아미노산 위치 31이 라이신으로 치환되어 있고, 아미노산 위치 56이 알라닌으로 치환되어 있고, 아미노산 위치 64가 류신으로 치환되어 있고, 아미노산 위치 104가 라이신으로 치환되어 있는 아미노산 서열을 포함하고, 이때 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질의 hKd 및 cKd는 약 1 nM 내지 약 5 nM이다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 아미노산 위치 29가 티로신으로 치환되어 있고, 아미노산 위치 104가 라이신으로 치환되어 있는 아미노산 서열을 포함하고, 이때 hKd 및 cKd는 약 1 nM 내지 약 5 nM이다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 아미노산 위치 31이 라이신으로 치환되어 있고, 아미노산 위치 56이 쓰레오닌으로 치환되어 있는 아미노산 서열을 포함하고, 이때 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질의 hKd 및 cKd는 약 1 nM 내지 약 5 nM이다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민은 아미노산 위치 31이 라이신으로 치환되어 있고, 아미노산 위치 56이 쓰레오닌으로 치환되어 있고, 아미노산 위치 62가 글루탐산으로 치환되어 있는 아미노산 서열을 포함하고, 이때 hKd 및 cKd는 약 1 nM 내지 약 5 nM이다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 아미노산 위치 31이 아르기닌으로 치환되어 있고, 아미노산 위치 104가 라이신으로 치환되어 있는 것인 아미노산 서열을 포함하고, 이때 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질의 hKd 및 cKd는 약 5 nM 내지 약 10 nM이다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 아미노산 위치 31이 라이신으로 치환되어 있고, 아미노산 위치 56이 아르기닌으로 치환되어 있고, 아미노산 위치 104가 발린으로 치환되어 있는 아미노산 서열을 포함하고, 이때 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질의 hKd 및 cKd는 약 1 nM 내지 약 5 nM이다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 아미노산 위치 31이 라이신으로 치환되어 있고, 아미노산 위치 56이 아르기닌으로 치환되어 있고, 아미노산 위치 62가 글루탐산으로 치환되어 있고, 아미노산 위치 104가 발린으로 치환되어 있는 아미노산 서열을 포함하고, 이때 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질의 hKd 및 cKd는 약 1 nM 내지 약 5 nM이다.
또 다른 실시양태에서, 본원은 CDR1, CDR2 또는 CDR3에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질로서, CDR1이 서열번호 11로 기재된 서열을 포함하고, CDR2가 서열번호 12로 기재된 서열을 포함하고, CDR3이 서열번호 13으로 기재된 서열을 포함하고, 상기 적어도 하나의 돌연변이가 서열번호 11의 아미노산 위치 1, 2, 7, 8, 9 또는 10, 서열번호 12의 위치 1, 3, 6, 10 또는 11, 또는 서열번호 13의 위치 1 또는 2에 존재하지 않는 것인 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질을 제공한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 CDR1(서열번호 11)의 위치 3, 4, 5 및 6, CDR2(서열번호 12)의 아미노산 위치 7, 8, 13 및 15, 및 CDR3(서열번호 13)의 아미노산 위치 5 및 6으로부터 선택된 아미노산 위치에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 CDR1(서열번호 11)의 3, 4, 5 및 6, CDR2(서열번호 12)의 아미노산 위치 7, 8, 13 및 15, 및 CDR3(서열번호 13)의 아미노산 위치 5 및 6 이외의 아미노산 위치에서 하나 이상의 추가 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 CDR1(서열번호 11)의 아미노산 위치 6에서 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 CDR1(서열번호 11)의 아미노산 위치 6 및 CDR2(서열번호 12)의 아미노산 위치 13에서 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 (서열번호 11)의 아미노산 위치 6, CDR2(서열번호 12)의 아미노산 위치 7 및 15, 및 CDR3(서열번호 13)의 아미노산 위치 6에서 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 CDR1(서열번호 11)의 아미노산 위치 4 및 CDR3(서열번호 13)의 아미노산 위치 6에서 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 CDR1(서열번호 11)의 아미노산 위치 6 및 CDR2(서열번호 12)의 아미노산 위치 7에서 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 CDR1(서열번호 11)의 아미노산 위치 6, 및 CDR2(서열번호 12)의 아미노산 위치 7 및 13에서 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 CDR1(서열번호 11)의 아미노산 위치 6 및 CDR3(서열번호 13)의 아미노산 위치 6에서 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 CDR1(서열번호 11)의 아미노산 위치 6, CDR2(서열번호 12)의 아미노산 위치 7 및 CDR3(서열번호 13)의 아미노산 위치 6에서 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 CDR1(서열번호 11)의 아미노산 위치 6, CDR2(서열번호 12)의 아미노산 위치 7 및 13, 및 CDR3(서열번호 13)의 아미노산 위치 6에서 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 CDR1(서열번호 11)의 아미노산 위치 6이 아르기닌으로 돌연변이되어 있는 아미노산 서열을 포함하고, 이때 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질의 hKd 및 cKd는 약 1 nM 내지 약 5 nM이다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 CDR1(서열번호 11)의 아미노산 위치 6이 아르기닌으로 돌연변이되어 있고 CDR2(서열번호 12)의 아미노산 위치 13이 글루탐산으로 돌연변이되어 있는 아미노산 서열을 포함하고, 이때 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질의 hKd 및 cKd는 약 1 nM 내지 약 5 nM이다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 CDR1(서열번호 11)의 아미노산 위치 6이 라이신으로 돌연변이되어 있고 CDR2(서열번호 12)의 아미노산 위치 7 및 15가 각각 알라닌 및 류신으로 돌연변이되어 있고 CDR3(서열번호 13)의 아미노산 위치 6이 라이신으로 돌연변이되어 있는 아미노산 서열을 포함하고, 이때 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질의 hKd 및 cKd는 약 1 nM 내지 약 5 nM이다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 CDR1(서열번호 11)의 아미노산 위치 4가 티로신으로 돌연변이되어 있고 CDR3(서열번호 13)의 아미노산 위치 6이 라이신으로 돌연변이되어 있는 아미노산 서열을 포함하고, 이때 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질의 hKd 및 cKd는 약 1 nM 내지 약 5 nM이다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 CDR1(서열번호 11)의 아미노산 위치 6이 라이신으로 돌연변이되어 있고 CDR2(서열번호 12)의 아미노산 위치 7이 쓰레오닌으로 돌연변이되어 있는 아미노산 서열을 포함하고, 이때 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질의 hKd 및 cKd는 약 1 nM 내지 약 5 nM이다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 CDR1(서열번호 11)의 아미노산 위치 6이 라이신으로 돌연변이되어 있고 CDR2(서열번호 12)의 아미노산 위치 7 및 13이 각각 쓰레오닌 및 글루탐산으로 돌연변이되어 있는 아미노산 서열을 포함하고, 이때 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질의 hKd 및 cKd는 약 1 nM 내지 약 5 nM이다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 CDR1(서열번호 11)의 아미노산 위치 6이 아르기닌으로 돌연변이되어 있고 CDR3(서열번호 12)의 아미노산 위치 6이 라이신으로 돌연변이되어 있는 아미노산 서열을 포함하고, 이때 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질의 hKd 및 cKd는 약 5 nM 내지 약 10 nM이다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 CDR1(서열번호 11)의 아미노산 위치 6이 라이신으로 돌연변이되어 있고 CDR2(서열번호 12)의 아미노산 위치 7이 아르기닌으로 돌연변이되어 있고 CDR3(서열번호 13)의 아미노산 위치 6이 발린으로 돌연변이되어 있는 아미노산 서열을 포함하고, 이때 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질의 hKd 및 cKd는 약 1 nM 내지 약 5 nM이다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 CDR1(서열번호 11)의 아미노산 위치 6이 라이신으로 돌연변이되어 있고 CDR2(서열번호 12)의 아미노산 위치 7 및 13이 각각 아르기닌 및 글루탐산으로 돌연변이되어 있고 CDR3(서열번호 13)의 아미노산 위치 6이 발린으로 돌연변이되어 있는 아미노산 서열을 포함하고, 이때 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질의 hKd 및 cKd는 약 1 nM 내지 약 5 nM이다.
또 다른 실시양태에서, 본원은 본 개시에 따른 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 추가 실시양태는 본원에 개시된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 기술한다. 또 다른 실시양태는 본 개시에 따른 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 기술한다. 한 실시양태에서, (i) 본 개시에 따른 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질, 본 개시에 따른 폴리뉴클레오타이드, 본 개시에 따른 벡터 또는 본 개시에 따른 숙주 세포, 및 (ii) 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물이 제공된다.
또 다른 실시양태에서, 본 개시에 따른 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질을 제조하는 방법으로서, 본원에 기재된 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터로 형질전환되거나 형질감염된 숙주를, 상기 혈청 알부민 결합 단백질의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양하는 단계, 및 생성된 단백질을 배양물로부터 회수하고 정제하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재되어 있다.
증식 질환, 종양 질환, 염증 질환, 면역학적 장애, 자가면역 질환, 감염 질환, 바이러스 질환, 알레르기 반응, 기생충 반응(parasitic reaction), 이식편-대-숙주 질환 또는 숙주-대-이식편 질환의 치료 또는 완화 방법으로서, 본 개시에 따른 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질을, 이러한 치료 또는 완화를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법도 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 본 개시에 따른 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질과 조합하여 작용제(약제)를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 개시에 따른 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질을 포함하는 다중특이적 결합 단백질이 기재되어 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시에 따른 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질을 포함하는 항체가 기재되어 있다.
추가 실시양태는 본 개시에 따른 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질을 포함하는 다중특이적 항체, 이중특이적 항체, sdAb, 가변 중쇄 도메인, 펩타이드 또는 리간드를 기술한다. 한 실시양태에서, 본 개시에 따른 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질을 포함하는 항체로서, 단일 도메인 항체인 항체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 항체는 IgG의 중쇄 가변 영역으로부터 유래한다.
한 실시양태는 본 개시에 따른 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질 및 CD3 결합 도메인을 포함하는 다중특이적 결합 단백질 또는 항체를 기술한다. 한 실시양태에서, 증식 질환, 종양 질환, 염증 질환, 면역학적 장애, 자가면역 질환, 감염 질환, 바이러스 질환, 알레르기 반응, 기생충 반응, 이식편-대-숙주 질환 또는 숙주-대-이식편 질환의 치료 또는 완화 방법으로서, 본 개시에 따른 다중특이적 항체를, 이러한 치료 또는 완화를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 기재되어 있다.
본 발명의 신규 특징은 첨부된 청구범위에 구체적으로 기재되어 있다. 본 발명의 특징 및 장점은 본 발명의 원리가 이용되는 예시적 실시양태가 기재되어 있는 하기 상세한 설명, 및 첨부된 도면을 참조함으로써 더 잘 이해될 것이다.
도 1은 ELISA 적정에 의해 측정되었을 때 모 항-HSA 파지와 HSA 항원 및 CD3 항원의 특이적 결합을 보여준다.
도 2는 ELISA 적정에 의해 측정되었을 때 인간, 사이노몰구스 원숭이 및 마우스 혈청 알부민에 대한 항-HSA 파지의 교차반응성을 보여준다.
도 3은 정제된 sdAb를 사용한 보다 더 정확한 Kd 측정을 위해 선택된 9개의 클론들의 결합 친화성 프로파일을 제공한다.
도 4는 여러 항-HSA sdAb 변이체들에 대한 소수성 노출의 온도(Th ℃)를 보여준다.
도 5는 낮은 pH에서 여러 항-HSA sdAb 변이체들이 단량체에 비해 이량체를 형성하는 성향을 보여준다.
본 발명의 바람직한 실시양태가 본원에 제시되고 기재되어 있지만, 이러한 실시양태가 예로써만 제공된다는 것은 당분야에서 숙련된 자에게 자명할 것이다. 다수의 변경, 변화 및 치환이 본 발명을 벗어나지 않으면서 당분야에서 숙련된 자에 의해 인식될 것이다. 본원에 기재된 본 발명의 실시양태에 대한 다양한 대안들이 본 발명의 실시에 사용될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 하기 청구범위는 본 발명의 범위를 정의하고 이 청구범위 내의 방법 및 구조, 및 이들의 균등물은 이러한 청구범위에 의해 커버된다.
일부 정의
본원에서 사용된 용어는 특정 경우만을 기술하기 위한 것이고 한정하기 위한 것이 아니다. 본원에서 사용된 바와 같이, 문맥이 달리 명시하지 않은 한, 단수 형태는 복수 형태도 포함하기 위한 것이다. 나아가, 용어 "포함하는", "포함한다", "가진", "가진다", "갖고" 또는 이들의 어미변화가 상세한 설명 및/또는 청구범위에서 사용되는 경우, 이러한 용어들은 용어 "포괄하는"과 유사한 방식으로 포괄하기 위한 것이다.
용어 "약" 또는 "대략"은 값이 어떻게 측정되거나 결정되는 지, 예를 들면, 측정 시스템의 한계에 의존할, 당분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 결정된 특정 값에 대한 허용가능한 오차 범위 내에 있다는 것을 의미한다. 예를 들면, "약"은 소정의 값에서 관행에 따라 1 이내 또는 1 초과의 표준 편차를 의미할 수 있다. 특정 값이 본원 및 청구범위에 기재되어 있는 경우, 달리 언급되어 있지 않은 한, 용어 "약"은 특정 값에 대한 허용가능한 오차 범위를 의미하는 것으로 추정될 것이다.
용어 "개체", "환자" 또는 "대상체"는 상호교환가능하게 사용된다. 상기 용어들 중 어느 것도 건강 관리 종사자(예를 들면, 의사, 등록된 간호사, 임상 간호사, 의사 보조자, 연락병 또는 호스피스 종사자)의 (예를 들면, 꾸준한 또는 간헐적인) 감독을 특징으로 하는 상황을 요구하지 않거나 이러한 상황으로 한정되지 않는다.
용어 "프레임워크" 또는 "FR" 잔기(또는 영역)는 본원에서 정의된 CDR 또는 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다. "인간 컨센서스 프레임워크"는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택에 있어서 가장 흔히 존재하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체들 사이에 서열 면에서 광범위하게 상이하고 그의 특정 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에서 사용된다는 사실을 의미한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전체에 균일하게 분포되어 있지 않다. 가변성은 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인 둘 다에서 상보성 결정 영역(CDR) 또는 초가변 영역으로서 지칭되는 3개의 분절들에 집중되어 있다. 가변 도메인의 보다 더 고도로 보존된 부분은 프레임워크(FR)로서 지칭된다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 β 시트 구조의 루프 연결을 형성하고 일부 경우 β 시트 구조의 일부를 형성하는, 3개의 CDR들에 의해 연결된, 주로 β 시트 입체형상을 채택하는 4개의 FR 영역들을 각각 포함한다. 각각의 쇄에서 CDR들은 FR 영역에 의해 가깝게 인접하여 함께 모여 있고, 다른 쇄로부터의 CDR들과 함께 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다(문헌(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)) 참조). 불변 도메인은 항체와 항원의 결합에 직접 관여하지 않으나, 다양한 이펙터 기능, 예컨대, 항체 의존적 세포 독성에 항체를 참여시키는 기능을 나타낸다. "카바트에서와 같은 가변 도메인 잔기 넘버링" 또는 "카바트에서와 같은 아미노산 위치 넘버링", 및 이들의 어미변화는 문헌(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))에서 항체의 컴파일레이션(compilation)의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인을 위해 사용된 넘버링 시스템을 지칭한다. 이 넘버링 시스템을 사용할 때, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 CDR의 단축, 또는 이러한 FR 또는 CDR 내로의 삽입에 상응하는 보다 더 적은 또는 추가 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들면, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52 다음에 단일 아미노산 삽입물(카바트에 따른 잔기 52a) 및 중쇄 FR 잔기 82 다음에 삽입된 잔기(예를 들면, 카바트에 따른 잔기 82a, 82b 및 82c 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 카바트 넘버링은 항체의 서열의 상동성 영역에서 "표준" 카바트 넘버링된 서열과 정렬시킴으로써 소정의 항체에 대해 결정될 수 있다. 본 개시의 CDR이 반드시 카바트 넘버링 약정에 상응한다는 것은 아니다.
본원에서 사용된 바와 같이, 서열과 관련하여 용어 "퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성"은 서열들을 정렬하고 필요하다면 갭을 도입하여 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하고 어느 보존적 치환도 서열의 동일성의 부분으로서 간주하지 않은 후 특정 서열의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 측정하기 위한 정렬은 예를 들면, 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어를 이용함으로써 당분야의 기술 내에 있는 다양한 방식들에 의해 달성될 수 있다. 당분야에서 숙련된 자는 비교되는 서열들의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하기 위해 요구된 임의의 알고리즘을 포함하는, 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라미터를 확인할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "제거 반감기"는 문헌(Goodman and Gillman's The Pharmaceutical Basis of Therapeutics 21-25 (Alfred Goodman Gilman, Louis S. Goodman, and Alfred Gilman, eds., 6th ed. 1980))에 기재된 바와 같이 그의 통상의 의미로 사용된다. 요약하건대, 상기 용어는 약물 제거의 시간 경과의 정량적 측정치를 포괄하기 위한 것이다. 약물 농도가 통상적으로 제거 과정의 포화를 위해 요구된 약물 농도에 도달하지 않기 때문에, 대부분의 약물의 제거는 기하급수적이다(즉, 1차 반응식을 따른다). 기하급수적 과정의 속도는 그의 속도 상수, 즉 시간의 단위당 비율 변화를 표현하는 k, 또는 그의 반감기, 즉 상기 과정의 50% 완료를 위해 요구된 시간인 t1/2로 표현될 수 있다. 이들 두 상수들의 단위는 각각 시간-1 및 시간이다. 반응의 1차 속도 상수 및 반감기는 단순하게 관련되어 있으므로(k×t1/2=0.693) 상호교환될 수 있다. 1차 제거 반응식은 단위 시간당 일정한 비율의 약물이 손실되는 것을 좌우하기 때문에, 약물 농도의 로그 대 시간의 도표는 초기 분포기 후(즉, 약물 흡수 및 분포가 완료된 후) 모든 시간에서 선형이다. 약물 제거를 위한 반감기는 이러한 그래프로부터 정확히 측정될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "결합 친화성"은 그의 결합 표적에 대한 본 개시에 기재된 단백질의 친화성을 지칭하고, "Kd" 값을 사용함으로써 수치적으로 표현된다. 2개 이상의 단백질들이 그들의 결합 표적들에 대한 필적할만한 결합 친화성을 가진 것으로 표시되는 경우, 그들의 결합 표적들에 대한 각각의 단백질의 결합에 대한 Kd 값은 서로의 ±2배 이내에 있다. 2개 이상의 단백질들이 단일 결합 표적에 대한 필적할만한 결합 친화성을 가진 것으로 표시되는 경우, 상기 단일 결합 표적에 대한 각각의 단백질의 결합에 대한 Kd 값은 서로의 ±2배 이내에 있다. 단백질이 필적할만한 결합 친화성으로 2개 이상의 표적들에 결합하는 것으로 표시되는 경우, 상기 단백질과 2개 이상의 표적들의 결합에 대한 Kd 값은 서로의 ±2배 이내에 있다. 일반적으로, 더 높은 Kd 값은 더 약한 결합에 상응한다. 일부 실시양태에서, "Kd"는 BIAcore™-2000 또는 BIAcore™-3000(BIAcore, Inc., 뉴저지주 피스카타웨이 소재)을 이용함으로써 방사성표지된 항원 결합 어세이(RIA) 또는 표면 플라스몬 공명 어세이에 의해 측정된다. 일부 실시양태에서, "on-속도" 또는 "결합의 속도" 또는 "결합 속도" 또는 "kon", 및 "off-속도" 또는 "해리의 속도" 또는 "해리 속도" 또는 "koff"도 BIAcore™-2000 또는 BIAcore™-3000(BIAcore, Inc., 뉴저지주 피스카타웨이 소재)을 이용함으로써 표준 플라스몬 공명 기법에 의해 측정된다. 추가 실시양태에서, "Kd", "kon" 및 "koff"는 Octet® 시스템(Pall Life Sciences)을 이용함으로써 측정된다.
단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질, 약학 조성물뿐만 아니라, 핵산, 재조합 발현 벡터, 및 이러한 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질의 제조를 위한 숙주 세포도 본원에 기재되어 있다. 질환, 질병 및 장애의 예방 및/또는 치료에 있어서 개시된 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질을 사용하는 방법도 제공된다. 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 혈청 알부민에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 추가 도메인, 예컨대, CD3 결합 도메인뿐만 아니라, 다른 표적 항원에 대한 결합 도메인도 포함한다.
단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질
단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질이 본원에서 고려된다. 혈청 알부민은 간에 의해 생성되고, 혈액 혈장에 용해된 상태로 존재하고, 포유동물에서 가장 풍부한 혈액 단백질이다. 알부민은 혈관과 체조직 사이의 체액의 적절한 분포를 위해 필요한 삼투압을 유지하는 데 필수적이이고; 알부민이 없는 경우, 혈관 내의 높은 압력은 더 많은 유체가 조직 내로 들어가게 할 것이다. 알부민은 여러 소수성 스테로이드 호르몬들에 비-특이적으로 결합함으로써 혈장 담체로서도 작용하고 헤민(hemin) 및 지방산을 위한 수송 단백질로서도 작용한다. 인간 혈청 알부민(HSA)(분자 질량 약 67 kDa)은 혈장에서 가장 풍부한 단백질이고, 약 50 mg/㎖(600 μM)로 존재하고, 인간에서 약 20일의 반감기를 가진다. HSA는 혈장 pH를 유지하는 데 기여하고, 콜로이드성 혈압에 기여하고, 많은 대사물질들 및 지방산들의 담체로서 작용하고, 혈장에서 주요 약물 수송 단백질로서 기여한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 HSA에 결합한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 사이노몰구스 원숭이로부터의 혈청 알부민 단백질에 결합한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 사이노몰구스 원숭이로부터의 HSA 및 혈청 알부민 단백질에 결합한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 마우스 혈청 알부민 단백질에도 결합한다. 일부 실시양태에서, 마우스 혈청 알부민에 대한 결합 친화성은 인간 또는 사이노몰구스 혈청 알부민에 대한 결합 친화성보다 약 1.5배 내지 약 20배 더 약하다.
알부민과의 비-공유결합은 짧은 생존 단백질의 제거 반감기를 연장시킨다. 예를 들면, 알부민 결합 도메인과 Fab 단편의 재조합 융합은 마우스 및 토끼에게 정맥내로 투여될 때 Fab 단편 단독의 투여에 비해 생체내 제거를 각각 25배 및 58배 감소시켰고 반감기를 각각 26배 및 37배 연장시켰다. 또 다른 예에서, 인슐린이 알부민과의 결합을 촉진하기 위해 지방산에 의해 아실화된 경우, 토끼 또는 돼지에게 피하 주사되었을 때 오래 지속된 효과가 관찰되었다. 종합하건대, 이 연구들은 알부민 결합과 연장된 작용/혈청 반감기 사이의 연관성을 입증한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 혈청 알부민에 특이적인 단일 도메인 항체, 예컨대, 중쇄 가변 도메인(VH), 낙타과 유래의 sdAb의 가변 도메인(VHH), 펩타이드, 리간드 또는 소분자 물질이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 HSA에 특이적인 단일 도메인 항체, 예컨대, 중쇄 가변 도메인(VH), 낙타과 유래의 sdAb의 가변 도메인(VHH), 펩타이드, 리간드 또는 소분자 물질이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질의 혈청 알부민 결합 도메인은 단일클론 항체, 다중클론 항체, 재조합 항체, 인간 항체, 인간화된 항체로부터의 도메인들을 포함하나 이들로 한정되지 않는, 혈청 알부민에 결합하는 임의의 도메인이다. 일부 실시양태에서, 혈청 알부민 결합 도메인은 단일 도메인 항체이다. 다른 실시양태에서, 혈청 알부민 결합 도메인은 펩타이드이다. 추가 실시양태에서, 혈청 알부민 결합 도메인은 소분자이다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 꽤 작고 25 kD 이하, 20 kD 이하, 15 kD 이하 또는 10 kD 이하인 것으로 생각된다. 일부 경우, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 펩타이드 또는 소분자 물질인 경우 5 kD 이하이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질 그 자체의 변경된 약물력학 및 약물동력학을 제공하는 반감기 연장 도메인이다. 전술된 바와 같이, 반감기 연장 도메인은 제거 반감기를 연장시킨다. 반감기 연장 도메인은 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질의 조직 분포, 침투 및 확산의 변경을 포함하는 약물력학적 성질도 변경시킨다. 일부 실시양태에서, 반감기 연장 도메인은 반감기 연장 도메인을 갖지 않는 단백질에 비해 개선된 조직(종양을 포함함) 표적화, 조직 분포, 조직 침투, 조직 내부에서의 확산 및 향상된 효능을 제공한다. 한 실시양태에서, 치료 방법은 감소된 양의 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질을 효과적으로 및 효율적으로 사용하여, 부작용, 예컨대, 비-종양 세포 세포독성을 감소시킨다.
추가로, 그의 결합 표적에 대한 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질의 결합 친화성은 특정 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질에서 특정 제거 반감기를 표적화하도록 선택될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 그의 결합 표적에 대한 높은 결합 친화성을 가진다. 다른 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 그의 결합 표적에 대한 중간 결합 친화성을 가진다. 다른 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 그의 결합 표적에 대한 낮은 또는 미미한 결합 친화성을 가진다. 예시적 결합 친화성은 10 nM 이하(높음), 10 nM 내지 100 nM (중간), 및 100 nM 초과(낮음)의 KD를 포함한다. 전술된 바와 같이, 결합 표적에 대한 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질의 결합 친화성은 공지된 방법, 예컨대, 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 측정된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 인간 Kd(hKd)로 HSA에 결합한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 사이노몰구스 Kd(cKd)로 사이노몰구스 원숭이 혈청 알부민에 결합한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 사이노몰구스 Kd(cKd)로 사이노몰구스 원숭이 혈청 알부민에 결합하고 인간 Kd(hKd)로 HSA에 결합한다. 일부 실시양태에서, hKd는 1 nM 내지 100 nM이다. 일부 실시양태에서, hKd는 1 nM 내지 10 nM이다. 일부 실시양태에서, cKd는 1 nM 내지 100 nM이다. 일부 실시양태에서, cKd는 1 nM 내지 10 nM이다. 일부 실시양태에서, hKd 및 cKd는 약 1 nM 내지 약 5 nM, 또는 약 5 nM 내지 10 nM이다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 인간 혈청 알부민, 사이노몰구스 혈청 알부민 및 마우스 혈청 알부민으로부터 선택된 혈청 알부민에 결합한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 필적할만한 결합 친화성(Kd)으로 인간 혈청 알부민, 사이노몰구스 혈청 알부민 및 마우스 혈청 알부민에 결합한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 약 1 nM 내지 약 10 nM의 인간 Kd(hKd)로 인간 혈청 알부민에 결합하고 1 nM 내지 10 nM의 사이노몰구스 Kd(cKd)로 사이노몰구스 혈청 알부민에 결합한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 약 10 nM 내지 약 50 nM의 마우스 Kd(mKd)로 마우스 혈청 알부민에 결합한다.
일부 실시양태에서, hKd는 약 1.5 nM, 약 1.6 nM, 약 1.7 nM, 약 1.8 nM, 약 1.9 nM, 약 2 nM, 약 2.1 nM, 약 2.2 nM, 약 2.3 nM, 약 2.4 nM, 약 2.5 nM, 약 2.6 nM, 약 2.7 nM, 약 2.8 nM, 약 2.9 nM, 약 3 nM, 3.1 nM, 약 3.2 nM, 약 3.3 nM, 약 3.4 nM, 약 3.5 nM, 약 3.6 nM, 약 3.7 nM, 약 3.8 nM, 약 3.9 nM, 약 4 nM, 약 4.5 nM, 약 5 nM, 약 6 nM, 약 6.5 nM, 약 7 nM, 약 7.5 nM, 약 8 nM, 약 8.5 nM, 약 9.0 nM, 약 9.5 nM 또는 약 10 nM이다.
일부 실시양태에서, cKd는 약 1.5 nM, 약 1.6 nM, 약 1.7 nM, 약 1.8 nM, 약 1.9 nM, 약 2 nM, 약 2.1 nM, 약 2.2 nM, 약 2.3 nM, 약 2.4 nM, 약 2.5 nM, 약 2.6 nM, 약 2.7 nM, 약 2.8 nM, 약 2.9 nM, 약 3 nM, 3.1 nM, 약 3.2 nM, 약 3.3 nM, 약 3.4 nM, 약 3.5 nM, 약 3.6 nM, 약 3.7 nM, 약 3.8 nM, 약 3.9 nM, 약 4 nM, 약 4.5 nM, 약 5 nM, 약 6 nM, 약 6.5 nM, 약 7 nM, 약 7.5 nM, 약 8 nM, 약 8.5 nM, 약 9.0 nM, 약 9.5 nM 또는 약 10 nM이다.
일부 실시양태에서, mKd는 약 10 nM, 약 11 nM, 약 12 nM, 약 13 nM, 약 14 nM, 약 15 nM, 약 16 nM, 약 17 nM, 약 18 nM, 약 19 nM, 약 20 nM, 약 21 nM, 약 22 nM, 약 23 nM, 약 24 nM, 약 25 nM, 약 26 nM, 약 27. nM, 약 28 nM, 약 29 nM, 약 30 nM, 약 31 nM, 약 32 nM, 약 33 nM, 약 34 nM, 약 35 nM, 약 36 nM, 약 37 nM, 약 38 nM, 약 39 nM, 약 40 nM, 약 41 nM, 약 42 nM, 약 43 nM, 약 44 nM, 약 45 nM, 약 46 nM, 약 47 nM, 약 48 nM 또는 약 50 nM이다.
일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 25, 서열번호 26 및 서열번호 27로부터 선택된 아미노산 서열을 가진다.
일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 서열번호 4로서 기재된 아미노산 서열을 갖고, hKd 및 cKd는 약 1 nM 내지 약 5 nM이다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 서열번호 4로서 기재된 아미노산 서열을 갖고, hKd는 약 2.3 nM이고 cKd는 약 2.4 nM이다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 서열번호 25로서 기재된 아미노산 서열을 갖고, hKd 및 cKd는 약 1 nM 내지 약 5 nM이다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 서열번호 25로서 기재된 아미노산 서열을 갖고, hKd는 약 2.1 nM이고 cKd는 약 2.2 nM이다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 서열번호 5로서 기재된 아미노산 서열을 갖고, hKd 및 cKd는 약 1 nM 내지 약 5 nM이다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 서열번호 5로서 기재된 아미노산 서열을 갖고, hKd는 약 1.9 nM이고 cKd는 약 1.7 nM이다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 서열번호 6으로서 기재된 아미노산 서열을 갖고, hKd 및 cKd는 약 1 nM 내지 약 5 nM이다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 서열번호 6으로서 기재된 아미노산 서열을 갖고, hKd는 약 3.2 nM이고 cKd는 약 3.6 nM이다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 서열번호 7로서 기재된 아미노산 서열을 갖고, hKd 및 cKd는 약 1 nM 내지 약 5 nM이다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 서열번호 7로서 기재된 아미노산 서열을 갖고, hKd는 약 2.7 nM이고 cKd는 약 2.6 nM이다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 서열번호 26으로서 기재된 아미노산 서열을 갖고, hKd 및 cKd는 약 1 nM 내지 약 5 nM이다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 서열번호 26으로서 기재된 아미노산 서열을 갖고, hKd는 약 2.1 nM이고 cKd는 약 2 nM이다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 서열번호 8로서 기재된 아미노산 서열을 갖고, hKd 및 cKd는 약 5 nM 내지 약 10 nM이다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 서열번호 8로서 기재된 아미노산 서열을 갖고, hKd는 약 6 nM이고 cKd는 약 7.5 nM이다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 서열번호 9로서 기재된 아미노산 서열을 갖고, hKd 및 cKd는 약 1 nM 내지 약 5 nM이다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 서열번호 9로서 기재된 아미노산 서열을 갖고, hKd는 약 2.2 nM이고 cKd는 약 2.3 nM이다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 서열번호 27로서 기재된 아미노산 서열을 갖고, hKd 및 cKd는 약 1 nM 내지 약 5 nM이다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 서열번호 27로서 기재된 아미노산 서열을 갖고, hKd는 약 1.6 nM이고 cKd는 약 1.6 nM이다.
일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 서열번호 4로서 기재된 아미노산 서열을 갖고 약 17 nM의 mKd를 가진다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 서열번호 5로서 기재된 아미노산 서열을 갖고 약 12 nM의 mKd를 가진다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 서열번호 6으로서 기재된 아미노산 서열을 갖고 약 33 nM의 mKd를 가진다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 서열번호 7로서 기재된 아미노산 서열을 갖고 약 14 nM의 mKd를 가진다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 서열번호 9로서 기재된 아미노산 서열을 갖고 약 16 nM의 mKd를 가진다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 서열번호 25로서 기재된 아미노산 서열을 갖고 약 17 nM의 mKd를 가진다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 서열번호 26으로서 기재된 아미노산 서열을 갖고 약 17 nM의 mKd를 가진다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 서열번호 27로서 기재된 아미노산 서열을 갖고 약 16 nM의 mKd를 가진다.
일부 실시양태에서, hKd와 cKd의 비(hKd:cKd)는 약 20:1 내지 약 1:2의 범위이다.
일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 적어도 1시간, 적어도 2시간, 적어도 4시간, 적어도 6시간, 적어도 12시간, 적어도 20시간, 적어도 25시간, 적어도 30시간, 적어도 35시간, 적어도 40시간, 적어도 45시간, 적어도 50시간 또는 적어도 100시간의 제거 반감기를 가진다.
CD3 결합 도메인
T 세포의 반응의 특이성은 T 세포 수용체 복합체에 의한 항원(주조직적합성 복합체인 MHC의 환경 하에서 디스플레이됨)의 인식에 의해 매개된다. T 세포 수용체 복합체의 부분으로서, CD3은 CD3γ(감마) 쇄, CD3δ(델타) 쇄, 및 세포 표면에 존재하는 2개의 CD3ε(엡실론) 쇄를 포함하는 단백질 복합체이다. CD3은 T 세포 수용체 복합체를 구성하기 위해 T 세포 수용체(TCR)의 α(알파) 및 β(베타) 쇄뿐만 아니라 CD3ζ(제타)와도 함께 결합한다. 예컨대, 고정된 항-CD3 항체에 의한 T 세포에서의 CD3의 밀집은 T 세포 수용체의 개입과 유사하나 그의 클론 전형적 특이성과 무관한 T 세포 활성화를 유발한다.
한 양태에서, 본 개시에 따른 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질을 포함하는 다중특이적 단백질이 본원에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 다중특이적 단백질은 CD3에 특이적으로 결합하는 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 다중특이적 단백질은 인간 CD3에 특이적으로 결합하는 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 다중특이적 단백질은 CD3γ에 특이적으로 결합하는 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 다중특이적 단백질은 CD3δ에 특이적으로 결합하는 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 다중특이적 단백질은 CD3ε에 특이적으로 결합하는 도메인을 추가로 포함한다.
추가 실시양태에서, 다중특이적 단백질은 T 세포 수용체(TCR)에 특이적으로 결합하는 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 다중특이적 단백질은 TCR의 α 쇄에 특이적으로 결합하는 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 다중특이적 단백질은 TCR의 β 쇄에 특이적으로 결합하는 도메인을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질을 포함하는 다중특이적 단백질의 CD3 결합 도메인은 인간 CD3에 대한 강력한 CD3 결합 친화성을 나타낼 뿐만 아니라, 각각의 사이노몰구스 원숭이 CD3 단백질과의 현저한 교차반응성도 보인다. 일부 경우, 다중특이적 단백질의 CD3 결합 도메인은 사이노몰구스 원숭이로부터의 CD3과 교차반응한다. 일부 경우, CD3 결합에 대한 인간:사이노몰구스 KD(hKd:cKd) 비는 20:1 내지 1:2이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질을 포함하는 다중특이적 단백질의 CD3 결합 도메인은 단일클론 항체, 다중클론 항체, 재조합 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 또는 CD3 결합 항체의 항원 결합 단편, 예컨대, 단일 도메인 항체(sdAb), Fab, Fab', F(ab)2 및 Fv 단편, 하나 이상의 CDR로 구성된 단편, 단일 쇄 항체(예를 들면, 단일 쇄 Fv 단편(scFv)), 디설파이드 안정화된 Fv(dsFv) 단편, 이종접합체 항체(예를 들면, 이중특이적 항체), pFv 단편, 중쇄 단량체 또는 이량체, 경쇄 단량체 또는 이량체, 및 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄로 구성된 이량체로부터의 도메인들을 포함하나 이들로 한정되지 않는, CD3에 결합하는 임의의 도메인일 수 있다. 일부 경우, CD3 결합 도메인은 본원에 기재된 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질을 포함하는 다중특이적 단백질이 궁극적으로 사용될 종과 동일한 종으로부터 유래하는 것이 유리하다. 예를 들면, 인간에서 사용하기 위해, 본원에 기재된 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질을 포함하는 다중특이적 단백질의 CD3 결합 도메인은 항체 또는 항체 단편의 항원 결합 도메인으로부터의 인간 또는 인간화된 잔기를 포함하는 것이 유리할 수 있다.
따라서, 한 양태에서, 항원 결합 도메인은 인간화된 또는 인간 항체 또는 항체 단편, 또는 뮤린 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간화된 또는 인간 항-CD3 결합 도메인은 본원에 기재된 인간화된 또는 인간 항-CD3 결합 도메인의 하나 이상(예를 들면, 모든 3개)의 경쇄 상보성 결정 영역 1(LC CDR1), 경쇄 상보성 결정 영역 2(LC CDR2) 및 경쇄 상보성 결정 영역 3(LC CDR3), 및/또는 본원에 기재된 인간화된 또는 인간 항-CD3 결합 도메인, 예를 들면, 하나 이상, 예를 들면, 모든 3개의 LC CDR들 및 하나 이상, 예를 들면, 모든 3개의 HC CDR들을 포함하는 인간화된 또는 인간 항-CD3 결합 도메인의 하나 이상(예를 들면, 모든 3개)의 중쇄 상보성 결정 영역 1(HC CDR1), 중쇄 상보성 결정 영역 2(HC CDR2) 및 중쇄 상보성 결정 영역 3(HC CDR3)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 인간화된 또는 인간 항-CD3 결합 도메인은 CD3에 특이적인 인간화된 또는 인간 경쇄 가변 영역을 포함하고, 이때 CD3에 특이적인 경쇄 가변 영역은 인간 경쇄 프레임워크 영역 내에 인간 또는 비-인간 경쇄 CDR을 포함한다. 일부 경우, 경쇄 프레임워크 영역은 λ(람다) 경쇄 프레임워크이다. 다른 경우, 경쇄 프레임워크 영역은 κ(카파) 경쇄 프레임워크이다.
일부 실시양태에서, 인간화된 또는 인간 항-CD3 결합 도메인은 CD3에 특이적인 인간화된 또는 인간 중쇄 가변 영역을 포함하고, 이때 CD3에 특이적인 중쇄 가변 영역은 인간 중쇄 프레임워크 영역 내에 인간 또는 비-인간 중쇄 CDR을 포함한다.
일부 경우, 중쇄 및/또는 경쇄의 상보성 결정 영역은 공지된 항-CD3 항체, 예를 들면, 뮤로모납(muromonab)-CD3(OKT3), 오텔릭시주맙(otelixizumab)(TRX4), 테플리주맙(teplizumab)(MGA031), 비실리주맙(visilizumab)(Nuvion), SP34, TR-66 또는 X35-3, VIT3, BMA030(BW264/56), CLB-T3/3, CRIS7, YTH12.5, F111-409, CLB-T3.4.2, TR-66, WT32, SPv-T3b, 11D8, XIII-141, XIII-46, XIII-87, 12F6, T3/RW2-8C8, T3/RW2-4B6, OKT3D, M-T301, SMC2, F101.01, UCHT-1 및 WT-31로부터 유래한다.
CD3에 결합하는 친화성은 예를 들면, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질을 포함하는 다중특이적 단백질 그 자체 또는 그의 CD3 결합 도메인이 어세이 플레이트에 코팅되어 있거나, 미생물 세포 표면에 디스플레이되어 있거나 용액에 있는 CD3에 결합하는 능력에 의해 결정될 수 있다. CD3에 대한 본 개시에 따른 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질을 포함하는 다중특이적 단백질 그 자체 또는 그의 CD3 결합 도메인의 결합 활성은 리간드(예를 들면, CD3) 또는 상기 다중특이적 단백질 그 자체 또는 그의 CD3 결합 도메인을 비드, 기판, 세포 등에 고정시킴으로써 어세이될 수 있다. 물질을 적절한 완충제에 첨가할 수 있고 소정의 온도에서 일정한 시간 동안 결합 파트너들을 항온처리할 수 있다. 결합되지 않은 물질을 제거하기 위한 세척 후, 결합된 단백질을 예를 들면, SDS, 높은 pH를 가진 완충제 등으로 방출시킬 수 있고, 예를 들면, 표면 플라스몬 공명(SPR)으로 분석할 수 있다.
표적 항원 결합 도메인
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질을 포함하는 다중특이적 결합 단백질은 기재된 혈청 알부민 결합 및 CD3 도메인 이외에 표적 항원에 결합하는 도메인도 포함한다. 표적 항원은 질환, 장애 또는 질병에 관여하고/하거나 질환, 장애 또는 질병과 관련되어 있다. 구체적으로, 표적 항원은 증식 질환, 종양 질환, 염증 질환, 면역학적 장애, 자가면역 질환, 감염 질환, 바이러스 질환, 알레르기 반응, 기생충 반응, 이식편-대-숙주 질환 또는 숙주-대-이식편 질환과 관련되어 있다. 일부 실시양태에서, 표적 항원은 종양 세포에서 발현된 종양 항원이다. 대안적으로, 일부 실시양태에서, 표적 항원은 병원체, 예컨대, 바이러스 또는 세균과 관련되어 있다.
일부 실시양태에서, 표적 항원은 세포 표면 분자, 예컨대, 단백질, 지질 또는 폴리사카라이드이다. 일부 실시양태에서, 표적 항원은 종양 세포, 바이러스에 의해 감염된 세포, 세균에 의해 감염된 세포, 손상된 적혈 세포, 동맥 플라크 세포 또는 섬유증 조직 세포에 존재한다.
본 개시에 따른 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질을 포함하는 다중특이적 결합 단백질의 디자인은 표적 항원에 대한 결합 도메인이 단일클론 항체, 다중클론 항체, 재조합 항체, 인간 항체, 인간화된 항체로부터의 도메인들을 포함하나 이들로 한정되지 않는 임의의 유형의 결합 도메인일 수 있다는 점에서 표적 항원에 대한 결합 도메인이 유연성을 가질 수 있게 한다. 일부 실시양태에서, 표적 항원에 대한 결합 도메인은 단일 쇄 가변 단편(scFv), 단일 도메인 항체, 예컨대, 중쇄 가변 도메인(VH), 경쇄 가변 도메인(VL) 및 낙타과 유래의 sdAb의 가변 도메인(VHH)이다. 다른 실시양태에서, 표적 항원에 대한 결합 도메인은 비-Ig 결합 도메인, 즉 항체 모방 물질, 예컨대, 안티칼린(anticalin), 아필린(affilin), 아피바디(affibody) 분자, 아피머(affimer), 아피틴(affitin), 알파바디(alphabody), 아비머(avimer), DARPin, 피노머(fynomer), 쿠니츠(kunitz) 도메인 펩타이드 및 모노바디(monobody)이다. 추가 실시양태에서, 표적 항원에 대한 결합 도메인은 표적 항원에 결합하거나 표적 항원과 회합하는 리간드 또는 펩타이드이다. 추가 실시양태에서, 표적 항원에 대한 결합 도메인은 노틴(knottin)이다. 추가 실시양태에서, 표적 항원에 대한 결합 도메인은 소분자 물질이다.
단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질 변형
본원에 기재된 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 (i) 아미노산이 유전 코드에 의해 코딩된 아미노산 잔기가 아닌 아미노산 잔기로 치환되어 있거나, (ii) 성숙 폴리펩타이드가 또 다른 화합물, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜과 융합되어 있거나, (iii) 추가 아미노산, 예컨대, 리더 또는 분비 서열, 또는 면역원성 도메인을 차단하고/하거나 단백질을 정제하기 위한 서열이 단백질에 융합되어 있는 유도체 또는 유사체를 포괄한다.
전형적인 변형은 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아마이드화, 플라빈(flavin)의 공유부착, 헴(heme) 모이어티의 공유부착, 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유도체의 공유부착, 지질 또는 지질 유도체의 공유부착, 포스파티딜이노시톨의 공유부착, 가교결합, 고리화, 디설파이드 결합 형성, 탈메틸화, 공유 가교결합의 형성, 시스틴의 형성, 피로글루타메이트의 형성, 포르밀화, 감마 카복실화, 글리코실화, GPI 앵커 형성, 하이드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스틸화, 산화, 단백질용해성 프로세싱, 인산화, 프레닐화, 라세미체화, 셀레노일화, 황산화, 단백질에의 아미노산의 전달 RNA 매개 추가, 예컨대, 아르기닐화, 및 유비퀴틴화를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
펩타이드 골격, 아미노산 측쇄 및 아미노 또는 카복실 말단을 포함하는, 본원에 기재된 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질의 임의의 위치에서 변형시킨다. 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질의 변형에 유용한 일부 흔한 펩타이드 변형은 글리코실화, 지질 부착, 황산화, 글루탐산 잔기의 감마-카복실화, 하이드록실화, 공유변형에 의한 폴리펩타이드의 아미노 또는 카복실 기, 또는 이들 둘 다의 차단, 및 ADP-리보실화를 포함한다.
단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자도 제공된다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드 분자는 DNA 구축물로서 제공된다. 다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드 분자는 메신저 RNA 전사체로서 제공된다.
폴리뉴클레오타이드 분자는 공지된 방법, 예컨대, 펩타이드 링커에 의해 분리되어 있거나, 다른 실시양태에서, 펩타이드 결합에 의해 직접 연결된 3개의 결합 도메인들을 코딩하는 유전자들을, 적합한 프로모터 및 임의적으로 적합한 전사 터미네이터에 작동가능하게 연결된 단일 유전 구축물로 조합하고 이를 세균 또는 다른 적절한 발현 시스템, 예를 들면, CHO 세포에서 발현시킴으로써 구축된다.
일부 실시양태에서, 본 개시에 따른 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질을 포함하는 다중특이적 결합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자도 제공된다. 일부 실시양태에서, 상기 다중특이적 결합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 CD3 결합 도메인에 대한 코딩 서열도 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 다중특이적 결합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 표적 항원 결합 도메인에 대한 코딩 서열도 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 다중특이적 결합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 CD3 결합 도메인 및 표적 항원 결합 도메인에 대한 코딩 서열도 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드 분자는 DNA 구축물로서 제공된다. 다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드 분자는 메신저 RNA 전사체로서 제공된다. 표적 항원 결합 도메인이 소분자인 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 혈청 알부민 결합 도메인 및 CD3 결합 도메인을 코딩하는 유전자를 함유한다. 반감기 연장 도메인이 소분자인 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 CD3 및 표적 항원에 결합하는 도메인을 코딩하는 유전자를 함유한다. 사용되는 벡터 시스템 및 숙주에 따라, 항시성 프로모터 및 유도성 프로모터를 포함하는 임의의 수의 적합한 전사 및 번역 요소가 사용될 수 있다. 프로모터는 각각의 숙주 세포에서 폴리뉴클레오타이드의 발현을 유도하도록 선택된다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 추가 실시양태를 대표하는 벡터, 바람직하게는 발현 벡터 내에 삽입된다. 이 재조합 벡터는 공지된 방법에 따라 구축될 수 있다. 특히 관심 있는 벡터는 플라스미드, 파지미드, 파지 유도체, 바이러스(예를 들면, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스 바이러스, 렌티바이러스 등), 및 코스미드를 포함한다.
다양한 발현 벡터/숙주 시스템들이 기재된 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질의 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하고 발현하는 데 사용될 수 있다. 이. 콜라이에서의 발현을 위한 발현 벡터의 예는 pSKK(Le Gall et al., J Immunol Methods. (2004) 285(1):111-27), 포유동물 세포에서의 발현을 위한 pcDNA5(Invitrogen), PICHIAPINK™ 효모 발현 시스템(Invitrogen), BACUVANCE™ 바큘로바이러스 발현 시스템(GenScript)이다.
따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 앞서 기재된 단백질을 코딩하는 벡터를 숙주 세포 내로 도입하고 단백질 도메인이 발현되는 조건 하에서 상기 숙주 세포를 배양함으로써 생성되고, 단리될 수 있고, 임의적으로 더 정제될 수 있다.
단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질의 제조
일부 실시양태에서, 본원은 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질의 제조 방법을 개시한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터로 형질전환되거나 형질감염된 숙주를, 상기 혈청 알부민 결합 단백질의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양하는 단계, 및 생성된 단백질을 배양물로부터 회수하고 정제하는 단계를 포함한다.
추가 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질, 및/또는 본원에 기재된 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질을 포함하는 다중특이적 결합 단백질의 하나 이상의 성질, 예를 들면, 친화성, 안정성, 내열성, 교차반응성 등을 기준 결합 화합물에 비해 개선하는 것에 관한 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 단일 치환 라이브러리의 각각의 구성원이 그의 상응하는 도메인 또는 아미노산 분절 내의 단일 아미노산 변화만을 코딩하도록 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질 또는 기준 결합 화합물의 상이한 도메인 또는 아미노산 분절에 각각 상응하는 복수의 단일 치환 라이브러리들이 제공된다. (이것은 큰 단백질 또는 단백질 결합 부위 내의 모든 잠재적 치환들이 몇몇 작은 라이브러리들에 의해 프로빙될 수 있게 한다.) 일부 실시양태에서, 복수의 도메인들은 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질 또는 기준 결합 화합물의 아미노산들의 연속 서열을 형성하거나 덮는다. 상이한 단일 치환 라이브러리의 뉴클레오타이드 서열은 적어도 하나의 다른 단일 치환 라이브러리의 뉴클레오타이드 서열과 중첩된다. 일부 실시양태에서, 모든 구성원이 인접 도메인을 코딩하는 각각의 단일 치환 라이브러리의 모든 구성원과 중첩되도록 복수의 단일 치환 라이브러리들을 디자인한다.
이러한 단일 치환 라이브러리로부터 발현된 결합 화합물은 적어도 기준 결합 화합물의 성질만큼 우수한 성질을 갖고 그의 생성된 라이브러리의 크기가 감소되어 있는 각각의 라이브러리에서 변이체들의 서브세트를 수득하도록 따로 선택된다. (다시 말해, 선택된 세트의 결합 화합물을 코딩하는 핵산의 수는 원래의 단일 치환 라이브러리의 구성원을 코딩하는 핵산의 수보다 더 작다.) 이러한 성질은 표적 화합물에 대한 친화성, 다양한 조건들, 예컨대, 열, 높은 또는 낮은 pH, 효소 분해에 대한 안정성, 다른 단백질과의 교차반응성 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 각각의 단일 치환 라이브러리로부터의 선택된 화합물은 본원에서 "예비후보 화합물" 또는 "예비후보 단백질"로서 상호교환가능하게 지칭된다. 그 다음, PCR 기반 유전자 셔플링 기법을 이용하여, 별개의 단일 치환 라이브러리로부터의 예비후보 화합물을 코딩하는 핵산 서열을 PCR에서 셔플링하여 셔플링된 라이브러리를 생성한다.
스크리닝 방법의 예시적 작업 흐름은 본원에 기재되어 있다. 단일 치환 라이브러리로부터 예비후보 화합물의 라이브러리를 생성하고 표적 단백질(들)에의 결합에 대해 선택한 후, 예비후보 라이브러리를 셔플링하여, 후보 화합물을 코딩하는 핵산의 라이브러리를 생성한 다음, 이 라이브러리를 편리한 발현 벡터, 예컨대, 파지미드 발현 시스템 내로 클로닝한다. 그 다음, 원하는 성질, 예컨대, 표적 분자에 대한 결합 친화성을 개선하기 위해 후보 화합물을 발현하는 파지에 대해 하나 이상의 라운드의 선택을 수행한다. 표적 분자를 웰 또는 다른 반응 용기의 표면에 흡착시킬 수 있거나 다른 방식으로 부착시킬 수 있거나, 표적 분자를 결합 모이어티, 예컨대, 바이오틴으로 유도체화할 수 있고, 이 결합 모이어티를 후보 결합 화합물과 함께 항온처리한 후 세척을 위해 비드, 예컨대, 자기 비드에 결합된 상보적 모이어티, 예컨대, 스트렙타비딘으로 포획할 수 있다. 예시적 선택법에서, 표적 분자로부터의 매우 낮은 해리 속도를 가진 후보 화합물만이 선택되도록 후보 결합 화합물에 대해 연장된 세척 단계를 수행한다. 이러한 실시양태를 위한 예시적 세척 시간은 적어도 8시간이거나; 다른 실시양태에서 적어도 24시간이거나; 다른 실시양태에서 적어도 48시간이거나; 다른 실시양태에서 적어도 72시간이다. 선택 후 단리된 클론은 증폭되고 추가 주기의 선택으로 처리되거나, 예를 들면, 시퀀싱 및, 예를 들면, ELISA, 표면 플라스몬 공명 결합, 바이오-층 간섭측정(예를 들면, Octet 시스템, ForteBio, 캘리포니아주 멘로 파크 소재) 등에 의한 결합 친화성의 비교 측정에 의해 분석된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 기준 혈청 알부민 결합 단백질, 예컨대, 서열번호 10의 아미노산 서열을 가진 단백질에 비해 개선된 열 안정성 및 선택된 세트의 결합 표적들에 대한 개선된 교차반응성을 가진 하나 이상의 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질, 및/또는 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질을 포함하는 다중특이적 결합 단백질을 확인하기 위해 수행된다. 단일 치환 라이브러리는 프레임워크 영역 내의 코돈 및 CDR 내의 코돈 둘 다를 포함하는, 기준 혈청 알부민 결합 단백질의 VH 영역 내의 코돈을 변경시킴으로써 제조되고; 또 다른 실시양태에서, 코돈이 변경되는 위치는 기준 혈청 알부민 결합 단백질의 중쇄의 CDR들, 또는 이러한 CDR들의 서브세트, 예컨대, 오로지 CDR1, 오로지 CDR2, 오로지 CDR3 또는 이들의 쌍을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 코돈이 변경되는 위치는 프레임워크 영역에만 존재한다. 일부 실시양태에서, 라이브러리는 10부터 250까지의 범위 내에서 VH 넘버링의 프레임워크 영역에서만 기준 혈청 알부민 결합 단백질로부터의 단일 코돈 변화만을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 코돈이 변경되는 위치는 기준 혈청 알부민 결합 단백질의 중쇄의 CDR3들, 또는 이러한 CDR3들의 서브세트를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, VH 코딩 영역의 코돈이 변경되는 위치의 수는 최대 100개의 위치가 프레임워크 영역 내에 있도록 10부터 250까지의 범위 내에 있다. 상기 요약된 바와 같이, 단일 치환 라이브러리의 제조 후, 하기 단계들을 수행한다: (a) 각각의 단일 치환 라이브러리의 각각의 구성원을 예비후보 단백질로서 따로 발현시키는 단계; (b) 원래의 결합 표적[예를 들면, 원하는 교차반응 표적(들)]과 상이할 수 있거나 상이하지 않을 수 있는 결합 파트너에 결합하는 예비후보 단백질을 코딩하는 각각의 단일 치환 라이브러리의 구성원을 선택하는 단계; (c) PCR에서 선택된 라이브러리의 구성원을 셔플링하여 조합 셔플링된 라이브러리를 생성하는 단계; (d) 셔플링된 라이브러리의 구성원을 후보 혈청 알부민 결합 단백질로서 발현시키는 단계; 및 (e) 셔플링된 라이브러리의 구성원을 원래의 결합 파트너에 결합하는 후보 혈청 알부민 결합 단백질에 대해 1회 이상 선택하는 단계 및 잠재적으로 (f) 원하는 교차반응성 표적(들)에의 결합에 대해 후보 단백질을 더 선택함으로써, 원래의 리간드에 대한 친화성을 상실하지 않으면서 기준 혈청 알부민 결합 단백질에 비해 하나 이상의 물질에 대한 증가된 교차반응성을 가진 핵산 코딩된 혈청 알부민 결합 단백질을 제공하는 단계. 추가 실시양태에서, 단계 (f)를 하기 단계로 치환시킴으로써 선택된 교차반응성 물질(들) 또는 화합물(들) 또는 에피토프(들)에 대한 감소된 반응성을 가진 혈청 알부민 결합 단백질을 수득하는 방법을 수행할 수 있다: 원치 않는 교차반응성 화합물에 결합하는 후보 혈청 알부민 결합 단백질의 서브세트로부터 후보 결합 화합물을 1회 이상 고갈시키는 단계.
최근의 연구는 제조, 저장 및 생체내 사용 동안 치료 항체가 다수의 경로들을 통한 분해에 대한 위험에 있다고 보고하였다. 단백질에서 가장 흔히 일어나는 화학적 분해 반응들 중에는 아스파라긴(N)의 탈아마이드화 및 아스파르트산(D) 잔기의 이성질체화가 있다. 특히, N 및 D 잔기가 항원 인식에 관여하는 경우, 이들의 화학적 변경은 효능의 심각한 상실을 유발할 수 있다고 추정된다. 아스파라긴 및 아스파르트산 잔기는 고리형 석신이미드 중간체의 형성을 통해 진행하는 분해 경로를 공유하는 것으로 공지되어 있다. 항체의 아스파르트산 부위에서의 석신이미드 중간체 및 이의 가수분해 생성물(아스파르테이트 및 이소아스파르테이트)의 형성은 안정성 문제점을 대표한다. 이성질체화가 일어날 때, 항체의 화학적 구조가 변경되고, 이것은 예를 들면, 응집 및 보다 더 짧은 저장 수명으로 나타나는 약한 안정성을 유발할 수 있다. 따라서, 본 개시의 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질이 제공되고, 이때 하나 이상의 아스파르트산 잔기는 돌연변이됨으로써, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질의 이성질체화 잠재력을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 아스파르트산 잔기는 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질의 CDR2 내에 있고, 아스파르트산 잔기는 글루탐산으로 돌연변이된다. 일부 실시양태에서, 서열번호 10으로 정의된 단백질의 위치 62에서 아스파르트산 잔기는 글루탐산으로 돌연변이된다(D62E). 일부 실시양태에서, D62E 돌연변이를 함유하는 단일 도메인 혈청 알부민 단백질의 혈청 알부민 결합 친화성은 돌연변이에 의해 영향을 받지 않는다. 일부 실시양태에서, D62E 돌연변이를 가진 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질 및 D62E 돌연변이를 갖지 않는 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 혈청 알부민에 대한 필적할만한 결합 친화성을 가진다.
약학 조성물
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질의 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 또는 이 벡터로 형질전환된 숙주 세포 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물도 제공된다. 용어 "약학적으로 허용가능한 담체"는 성분의 생물학적 활성의 효능을 방해하지 않고 이것이 투여된 환자에게 독성을 나타내지 않는 임의의 담체를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 적합한 약학 담체의 예는 당분야에서 잘 공지되어 있고 포스페이트 완충 식염수 용액, 물, 유화액, 예컨대, 유/수 유화액, 다양한 유형의 습윤화제, 멸균 용액 등을 포함한다. 이러한 담체는 보편적인 방법에 의해 제형화될 수 있고 적합한 용량으로 대상체에게 투여될 수 있다. 바람직하게는, 조성물은 멸균 조성물이다. 이 조성물은 보조제, 예컨대, 보존제, 유화제 및 분산제도 함유할 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항균제들 및 항진균제들의 포함에 의해 보장될 수 있다.
약학 조성물의 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 나노입자 내에 캡슐화된다. 일부 실시양태에서, 나노입자는 풀러렌, 액정, 리포좀, 양자 점, 초상자성 나노입자, 덴드리머 또는 나노막대이다. 약학 조성물의 다른 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 리포좀에 부착된다. 일부 경우, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 리포좀의 표면에 접합된다. 일부 경우, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 리포좀의 외피 내에 캡슐화된다. 일부 경우, 리포좀은 양이온성 리포좀이다.
본원에 기재된 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 약물로서 사용될 것으로 예상된다. 투여는 상이한 방식, 예를 들면, 정맥내, 복강내, 피하, 근육내, 국소 또는 피내 투여에 의해 달성된다. 일부 실시양태에서, 투여 경로는 요법의 종류 및 약학 조성물에 함유된 화합물의 종류에 의존한다. 용법은 주치의 및 다른 임상 요인에 의해 결정될 것이다. 어느 한 환자를 위한 용량은 환자의 신장, 신체 표면적, 연령, 성별, 투여될 구체적인 화합물, 투여 시간 및 경로, 요법의 종류, 일반적인 건강 및 동시에 투여되는 다른 약물을 비롯한 많은 요인들에 의존한다. "유효 용량"은 질환의 경과 및 중증도에 영향을 미침으로써, 이러한 병리학적 상태의 감소 또는 차도를 이끌어내기에 충분한 활성 성분의 양을 지칭하고 공지된 방법을 이용함으로써 결정될 수 있다.
치료 방법
일부 실시양태에서, 본원은 면역 시스템의 자극을 필요로 하는 개체의 면역 시스템을 자극하는 방법 및 용도로서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질, 또는 본원에 기재된 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질을 포함하는 다중특이적 결합 단백질을 투여하는 단계를 포함하는 방법 및 용도도 제공한다. 일부 경우, 본원에 기재된 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질의 투여는 표적 항원을 발현하는 세포에 대한 세포독성을 유도하고/하거나 지속한다. 일부 경우, 표적 항원을 발현하는 세포는 암 또는 종양 세포, 바이러스에 의해 감염된 세포, 세균에 의해 감염된 세포, 자가반응성 T 또는 B 세포, 손상된 적혈 세포, 동맥 플라크 또는 섬유증 조직이다.
본원은 표적 항원과 관련된 질환, 장애 또는 질병의 치료 방법 및 용도로서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질, 또는 본원에 기재된 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질을 포함하는 다중특이적 결합 단백질을, 이러한 치료를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법 및 용도도 제공한다. 표적 항원과 관련된 질환, 장애 또는 질병은 바이러스 감염, 세균 감염, 자가면역 질환, 이식 거부, 죽상동맥경화증 또는 섬유증을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 다른 실시양태에서, 표적 항원과 관련된 질환, 장애 또는 질병은 증식 질환, 종양 질환, 염증 질환, 면역학적 장애, 자가면역 질환, 감염 질환, 바이러스 질환, 알레르기 반응, 기생충 반응, 이식편-대-숙주 질환 또는 숙주-대-이식편 질환이다. 한 실시양태에서, 표적 항원과 관련된 질환, 장애 또는 질병은 암이다. 한 경우, 암은 혈액학적 암이다. 또 다른 경우, 암은 고형 종양 암이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 일부 실시양태에서, "치료" 또는 "치료하는" 또는 "치료된"은 치유적 치료를 의미하고, 이때 목적은 원치 않는 생리학적 질병, 장애 또는 질환을 늦추거나(경감시키거나) 유리한 또는 원하는 임상 결과를 수득하는 것이다. 본원에 기재된 목적을 위해, 유리한 또는 원하는 임상 결과는 증상의 완화; 질병, 장애 또는 질환의 정도의 감소; 질병, 장애 또는 질환의 상태의 안정화(즉, 악화되지 않음); 질병, 장애 또는 질환의 발병의 지연 또는 진행의 늦춤; 질병, 장애 또는 질환 상태의 호전; 및 질병, 장애 또는 질환의 검출 가능한 또는 검출 불가능한 (부분적 또는 전체적) 차도, 또는 향상 또는 개선을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 치료는 과도한 수준의 부작용 없이 임상적으로 유의미한 반응을 이끌어내는 것을 포함한다. 치료는 치료를 받지 않은 경우 예상된 생존에 비해 생존을 연장시키는 것도 포함한다. 다른 실시양태에서, "치료" 또는 "치료하는" 또는 "치료된"은 예방적 조치를 의미하고, 이때 목적은 예를 들면, 질환에 걸리기 쉬운 사람(예를 들면, 질환, 예컨대, 유방암의 유전 마커를 보유하는 개체)에서 원치 않는 생리학적 질병, 장애 또는 질환의 발병을 지연시키거나 이러한 질병, 장애 또는 질환의 중증도를 감소시키는 것이다.
본원에 기재된 방법의 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질, 또는 본원에 기재된 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질을 포함하는 다중특이적 결합 단백질은 특정 질환, 장애 또는 질병의 치료를 위한 약제와 조합되어 투여된다. 약제는 항체를 사용하는 요법, 소분자(예를 들면, 화학요법제), 호르몬(스테로이드, 펩타이드 등), 방사선요법(γ-선, X-선, 및/또는 방사성동위원소의 유도 전달, 마이크로파, UV 방사선 등), 유전자 요법(예를 들면, 안티센스, 레트로바이러스 요법 등) 및 다른 면역요법을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질, 또는 본원에 기재된 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질을 포함하는 다중특이적 결합 단백질은 지사제, 진토제, 진통제, 오피오이드 및/또는 비-스테로이드성 소염제와 조합되어 투여된다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질, 또는 본원에 기재된 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질을 포함하는 다중특이적 결합 단백질은 수술 전, 동안 또는 후 투여된다.
실시예
실시예 1: 모 항-HSA 단일 도메인 항체와 동등한 결합 성질을 가진 항-HSA 단일 도메인 항체 변이체의 생성
모 항-HSA 파지의 특징규명
CD3을 음성 대조군으로서 사용하여 모 항-HSA 파지와 HSA 항원의 특이적 결합을 측정하였고(도 1), 인간, 사이노몰구스 원숭이 및 마우스 혈청 알부민에 대한 항-HSA 파지의 교차반응성을 측정하였다(도 2).
단일 치환 HSA sdAb 파지 라이브러리
3개의 CDR 도메인들 각각에 대한 단일 치환 라이브러리를 제공하였다. 단일 치환 라이브러리를 HSA에 결합시킨 후, 다양한 수준의 HSA를 함유하는 완충제로 세척하였다. 0시간 및 24시간에서 결합된 파지를 레스큐하고 카운팅하였다. 완충제 중의 2.5 mg/㎖ HSA를 사용한 24시간 세척을 이용함으로써 선택된 파지를 사용하여 2개의 독립적 조합 파지 라이브러리들을 생성하였다.
조합 항-HSA 라이브러리
MSA를 제1 라운드에서 선택 표적으로서 사용하였다. 2개의 독립적 라이브러리들로부터의 조합 파지 결합 후 24시간 동안 웰을 세척하였다. HSA를 제2 라운드에서 선택 표적으로서 사용하였다. 두 라이브러리들의 결합 후 24시간 동안 웰을 1 mg/㎖ HSA로 세척하였다. 제2 라운드의 선택으로부터의 삽입물 PCRed를 ME10 His6 발현 벡터(서열번호 38로서 개시된 6XHis 서열) 내로 서브클로닝하였다. 96개의 클론들을 골라내었고 DNA를 정제하고 시퀀싱하고 Expi293 세포 내로 형질감염시켰다.
결합 친화성 측정
상청액은 Octet 플랫폼을 사용하여 HSA 및 CSA에 대한 Kd를 평가하는 데 사용되었다. 모 sdAb와 비교된 결합 친화성뿐만 아니라 강력한 생성, 응집 및 안정성 프로파일을 기반으로 추가 특징규명(도 3)을 위해 9개의 클론들을 선택하였다.
실시예 2: 항-HSA 단일 도메인 항체를 포함하는 삼중특이적 항체의 약물동력학
실시예 1의 항-HSA 단일 도메인 항체를 사용하여, 동물 연구에서 반감기 제거를 위해 평가된 삼중특이적 항체를 제조한다.
삼중특이적 항체를 0.5 mg/kg 볼루스 주사로서 사이노몰구스 원숭이에게 근육내로 투여한다. 또 다른 사이노몰구스 원숭이 군은 크기 면에서 CD3 및 CD20에 대한 결합 도메인에 필적할만하되 HSA 결합을 결여하는 단백질을 제공받는다. 제3군 및 제4군은 각각 CD3 및 HSA 결합 도메인을 가진 항체, 및 CD20 및 HSA 결합 도메인을 가진 단백질을 제공받는데, 상기 항체 및 단백질은 둘 다 크기 면에서 삼중특이적 항체에 필적할만하다. 각각의 시험 군은 5마리의 원숭이들로 구성된다. 혈청 샘플을 표시된 시점에서 채취하고 연속적으로 희석하고, CD3 및/또는 CD20에 대한 결합 ELISA를 이용하여 단백질의 농도를 측정한다.
시험 제품 혈장 농도를 사용하여 약물동력학 분석을 수행한다. 각각의 시험 제품에 대한 군 평균 혈장 데이터는 투약 후 시간에 대해 작도될 때 다중-기하급수적 프로파일과 일치한다. 상기 데이터는 볼루스 투입, 및 분포기 및 제거기에 대한 1차 속도 상수를 사용한 표준 2-구획 모델에 의해 피팅된다. 정맥내 투여에 대한 상기 데이터의 가장 우수한 피트에 대한 일반 방정식은 c(t)=Ae-αt+Be-βt이고, 이때 c(t)는 시간 t에서의 혈장 농도이고, A 및 B는 Y-축의 절편이고, α 및 β는 각각 분포기 및 제거기에 대한 겉보기 1차 속도 상수이다. α-기는 제거의 초기이고 동물의 모든 세포외 유체 내로의 단백질의 분포를 반영하는 반면, 붕괴 곡선의 제2 또는 β-기 부분은 진정한 혈장 제거를 나타낸다. 이러한 방정식을 피팅하는 방법은 당분야에서 잘 공지되어 있다. 예를 들면, A=D/V(α-k21)/(α-β), B=D/V(β-k21)/(α-β), 및 α 및 β(α>β인 경우)는 추정된 파라미터인 V=분포 부피, k10=제거 속도, k12=구획 1로부터 구획 2로의 전달 속도 및 k21=구획 2로부터 구획 1로의 전달 속도, 및 D=투여된 용량을 사용하였을 때 이차 방정식 r2+(k12+k21+k10)r+k21k10=0의 근이다.
데이터 분석: 칼레이다그래프(KaleidaGraph)(KaleidaGraph™ V. 3.09 Copyright 1986-1997. Synergy Software. 펜실배니아주 리딩 소재)를 이용하여 농도 대 시간 프로파일의 그래프를 작성한다. 보고 가능한 값(LTR) 미만으로서 보고된 값은 PK 분석에 포함되지 않고 그래프로 표시되지 않는다. 윈놀린(WinNonlin) 소프트웨어(WinNonlin® Professional V. 3.1 WinNonlin™ Copyright 1998-1999. Pharsight Corporation. 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재)를 이용한 구획 분석으로 약물동력학 파라미터를 측정한다. 약물동력학 파라미터는 문헌(Ritschel W A and Kearns G L, 1999, IN: Handbook Of Basic Pharmacokinetics Including Clinical Applications, 5th edition, American Pharmaceutical Assoc., Washington, D.C)에 기재된 바와 같이 계산된다.
실시예 1의 항-HSA 단일 도메인 항체를 포함하는 삼중특이적 항체는 HSA 결합 도메인을 결여하는 단백질에 비해 개선된 약물동력학 파라미터, 예컨대, 제거 반감기의 증가를 가진다는 것이 예상된다.
실시예 3: 항-HSA 단일 도메인 항체 변이체의 열 안정성
단백질의 소수성 노출의 온도(Th)는 피크 염료 형광의 변곡점의 도함수에 상응하고, 단백질 안정성의 척도인 용융 온도(Tm)와 상호관련되어 있는 것으로 공지되어 있다. 이 연구의 목적은 여러 항-HSA 단일 도메인 항체 변이체들에 대한 Th를 평가하는 것이었다.
단백질 제조
리더 서열을 앞에 두고 6x 히스티딘 태크(서열번호 38)를 뒤에 두면서 항-인간 ALB 단일 도메인 항체의 서열을 pcDNA3.4(Invitrogen) 내로 클로닝하였다. Expi293F 세포(Life Technologies A14527)를 Expi 293 배지 중의 0.2 내지 8 x 1e6개 세포/㎖의 농도로 최적 생장 플라스크(Thomson) 내의 현탁액으로 유지하였다. 정제된 플라스미드 DNA를 Expi293 발현 시스템 키트(Life Technologies, A14635) 프로토콜에 따라 Expi293F 세포 내로 형질감염시켰고 형질감염 후 4일 내지 6일 동안 유지하였다. 컨디셔닝된 배지를 친화성 및 탈염 크로마토그래피로 부분적으로 정제하였다. 항-인간 CD3e scFv 단백질을 아미콘 울트라(Amicon Ultra) 원심분리 여과 유닛(EMD Millipore)으로 농축하였고 수퍼덱스(Superdex) 200 크기 배제 매질(GE Healthcare)에 적용하였고 부형제를 함유하는 중성 완충제에 용해시켰다. 분획 풀링 및 최종 순도를 SDS-PAGE 및 분석 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 평가하였다. 스펙트라맥스(SpectraMax) M2(Molecular Devices) 및 UV 투명 96웰 플레이트(Corning 3635)를 이용하여 정제된 단백질 용액의 흡광도를 280 nm에서 측정하였고, 그의 농도를 몰 흡광계수로부터 계산하였다.
시차 주사 형광측정
부형제를 함유하는 중성 완충제로 정제된 항-HSA 단일 도메인 항체 단백질을 0.15% DMSO 최종 농도의 5x SYPRO 주황색 염료(Life Technologies S6651)와 함께 0.2 내지 0.25 mg/㎖로 마이크로앰프 엔듀라플레이트(MicroAmp EnduraPlate) 광학 마이크로플레이트 및 접착 필름(Applied Biosystems 4483485 및 4311971) 내로 희석하였다. 희석된 단백질 및 염료 혼합물을 함유하는 플레이트를 ABI 7500 패스트(Fast) 실시간 PCR 기계(Applied Biosytems) 내에 적재하고 25℃부터 95℃까지 다단계 열 구배로 처리하였다. 열 구배는 500 nm에서 여기하고 ROX 필터로 방사를 수집하면서 각각의 섭씨 1도에서 2분 유지하는 것으로 구성되었다. 정제된 항-HSA 단일 도메인 항체 단백질에 대한 Th는 섭씨온도로 도 4에 제시되어 있다.
실시예 4: 낮은 pH에 노출될 때 항-HSA 단일 도메인 항체 변이체의 이량체화의 상대적 성향
항-HSA 단일 도메인 항체 단백질을 전술된 바와 같이 Expi293-F 세포에서 발현시켰다. 각각의 변이체에 대한 컨디셔닝된 배지를 컬럼에 팩킹된 단백질 A 아가로스(GE Healthcare, 17519901)에 적용하였고 TRIS 완충 식염수로 광범위하게 세척하였고 pH 3에서 0.05%(부피/부피) 아세트산으로 용출하였고 pH 5로의 부분적 중화 전에 최대 10분 동안 실온에서 유지한 후, 세파덱스(Sephadex) G25 컬럼(GE Healthcare 17058401)을 사용하여 부형제를 함유하는 중성 완충제 내로 탈염하였다.
정제된 항-HSA 단일 도메인 항체 변이체의 농도를 실시예 3에 기재된 바와 같이 280 nm에서 흡광도로 측정하였다. 켐스테이션(Chemstation) 소프트웨어(Agilent)를 갖춘 1200 LC에서 포스페이트 완충제 함유 용매에 용해된 정제된 단백질을, 야라(Yarra) 2000 SEC 컬럼(Phenomenex 00H-4512-E0)을 사용하여 SDS-PAGE 및 분석 SEC로 평가하였다. 이량체 및 단량체에 상응하는 피크를 수동으로 적분하였고, 값은 도 5에 제시되어 있다.
Figure 112018127903465-pct00001
Figure 112018127903465-pct00002
SEQUENCE LISTING <110> HARPOON THERAPEUTICS, INC. <120> SINGLE DOMAIN SERUM ALBUMIN BINDING PROTEIN <130> 47517-703.601 <140> <141> <150> 62/339,682 <151> 2016-05-20 <160> 38 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Thr, Arg, Lys, Ser or Pro <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Phe or Tyr <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Ser, Arg or Lys <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Ser, Lys, Arg or Ala <400> 1 Gly Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Gly Met Ser 1 5 10 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Ser, Arg, Thr or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Asp, His, Val or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Asp, His, Arg or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (15)..(15) <223> Val or Leu <400> 2 Ser Ile Ser Gly Ser Gly Xaa Xaa Thr Leu Tyr Ala Xaa Ser Xaa Lys 1 5 10 15 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Ser, Arg, Thr or Lys <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Arg, Lys, Val, Pro or Asn <400> 3 Gly Gly Ser Leu Xaa Xaa 1 5 <210> 4 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 4 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Phe 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 5 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 5 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Phe 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ala Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Leu 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Lys Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 6 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 6 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Tyr Ser Ser Phe 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Lys Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 7 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 7 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Phe 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Thr Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 8 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 8 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Phe 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Lys Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 9 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 9 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Phe 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Arg Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Val Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 10 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 10 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 11 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser 1 5 10 <210> 12 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 12 Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 <210> 13 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 13 Gly Gly Ser Leu Ser Arg 1 5 <210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 14 Gly Phe Thr Phe Ser Arg Phe Gly Met Ser 1 5 10 <210> 15 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 15 Gly Phe Thr Phe Ser Lys Phe Gly Met Ser 1 5 10 <210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 16 Gly Phe Thr Tyr Ser Ser Phe Gly Met Ser 1 5 10 <210> 17 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 17 Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ala Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Leu Lys 1 5 10 15 <210> 18 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 18 Ser Ile Ser Gly Ser Gly Thr Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 <210> 19 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 19 Ser Ile Ser Gly Ser Gly Arg Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 <210> 20 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 20 Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Glu Ser Val Lys 1 5 10 15 <210> 21 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 21 Ser Ile Ser Gly Ser Gly Thr Asp Thr Leu Tyr Ala Glu Ser Val Lys 1 5 10 15 <210> 22 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 22 Ser Ile Ser Gly Ser Gly Arg Asp Thr Leu Tyr Ala Glu Ser Val Lys 1 5 10 15 <210> 23 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 23 Gly Gly Ser Leu Ser Lys 1 5 <210> 24 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 24 Gly Gly Ser Leu Ser Val 1 5 <210> 25 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 25 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Phe 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Glu Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 26 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 26 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Phe 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Thr Asp Thr Leu Tyr Ala Glu Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 27 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 27 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Phe 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Arg Asp Thr Leu Tyr Ala Glu Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Val Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 28 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(20) <223> This region may encompass 1-10 "Gly Ser" repeating units <400> 28 Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser 1 5 10 15 Gly Ser Gly Ser 20 <210> 29 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(30) <223> This region may encompass 1-10 "Gly Gly Ser" repeating units <400> 29 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 20 25 30 <210> 30 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(40) <223> This region may encompass 1-10 "Gly Gly Gly Ser" repeating units <400> 30 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 20 25 30 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 35 40 <210> 31 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(40) <223> This region may encompass 1-10 "Gly Gly Ser Gly" repeating units <400> 31 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly 20 25 30 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly 35 40 <210> 32 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(50) <223> This region may encompass 1-10 "Gly Gly Ser Gly Gly" repeating units <400> 32 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 35 40 45 Gly Gly 50 <210> 33 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(50) <223> This region may encompass 1-10 "Gly Gly Gly Gly Ser" repeating units <400> 33 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 35 40 45 Gly Ser 50 <210> 34 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(50) <223> This region may encompass 1-10 "Gly Gly Gly Gly Gly" repeating units <400> 34 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 35 40 45 Gly Gly 50 <210> 35 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(30) <223> This region may encompass 1-10 "Gly Gly Gly" repeating units <400> 35 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 20 25 30 <210> 36 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 36 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 37 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 37 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 38 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag <400> 38 His His His His His His 1 5

Claims (125)

  1. 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질로서, CDR1, CDR2 및 CDR3이
    (i) (a) 서열번호 15로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1;
    (b) 서열번호 19로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및
    (c) 서열번호 24로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
    (ii) (a) 서열번호 14로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1;
    (b) 서열번호 12로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및
    (c) 서열번호 13으로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
    (iii) (a) 서열번호 15로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1;
    (b) 서열번호 18로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및
    (c) 서열번호 13으로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
    (iv) (a) 서열번호 15로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1;
    (b) 서열번호 22로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및
    (c) 서열번호 24로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
    (v) (a) 서열번호 14로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1;
    (b) 서열번호 20으로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및
    (c) 서열번호 13으로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
    또는
    (vi) (a) 서열번호 15로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1;
    (b) 서열번호 21로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및
    (c) 서열번호 13으로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3
    인 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단백질이 하기 식을 포함하고:
    f1-r1-f2-r2-f3-r3-f4
    상기 식에서, r1은 CDR1이고; r2는 CDR2이고; r3은 CDR3이고; f1, f2, f3 및 f4는 상기 단백질이 서열번호 10으로 기재된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일하도록 선택된 프레임워크 잔기인 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질.
  3. 제1항에 있어서, 상기 단백질이 인간 혈청 알부민, 사이노몰구스 혈청 알부민 및 마우스 혈청 알부민으로부터 선택된 혈청 알부민에 결합하는 것인 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질.
  4. 제1항에 있어서, 상기 단백질은 필적할만한 결합 친화성(Kd)으로 인간 혈청 알부민 및 사이노몰구스 혈청 알부민에 결합하는 것인 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질.
  5. 제1항에 있어서, 상기 단백질은 사이노몰구스 혈청 알부민에 대한 것과 거의 동일한 결합 친화성(Kd)으로 인간 혈청 알부민에 결합하는 것인 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질.
  6. 제1항에 있어서, 상기 단백질은 인간 및 사이노몰구스 혈청 알부민에 대한 상기 단백질의 결합 친화성(Kd)보다 1.5배 내지 20배 더 약한 결합 친화성(Kd)으로 마우스 혈청 알부민에 결합하는 것인 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질.
  7. 제1항에 있어서, 상기 단백질이 1 nM 내지 100 nM의 인간 Kd(hKd)로 인간 혈청 알부민에 결합하고 1 nM 내지 100 nM의 사이노몰구스 Kd(cKd)로 사이노몰구스 혈청 알부민에 결합하는 것인 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질.
  8. 제7항에 있어서, 상기 hKd 및 cKd는 1 nM 내지 5 nM, 또는 5 nM 내지 10 nM인 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질.
  9. 제8항에 있어서, 상기 hKd 및 cKd는 1 nM 내지 2 nM, 2 nM 내지 3 nM, 3 nM 내지 4 nM, 4 nM 내지 5 nM, 5 nM 내지 6 nM, 6 nM 내지 7 nM, 7 nM 내지 8 nM, 8 nM 내지 9 nM, 또는 9 nM 내지 10 nM인 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질.
  10. 제4항에 있어서, 인간 kd(hKd)와 사이노몰구스 Kd(cKd)의 비(hKd:cKd)는 20:1 내지 1:2의 범위인 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질.
  11. 제1항에 있어서, 상기 단백질이 적어도 12시간, 적어도 20시간, 적어도 25시간, 적어도 30시간, 적어도 35시간, 적어도 40시간, 적어도 45시간, 적어도 50시간 또는 적어도 100 시간의 제거 반감기를 갖는 것인 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질.
  12. 제11항에 있어서, 상기 단백질이 적어도 12시간의 제거 반감기를 갖는 것인 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질.
  13. 제1항에 있어서, 링커를 추가로 포함하는 것인 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질.
  14. 제13항에 있어서, 상기 링커가 (GS)n, (GGS)n, (GGGS)n, (GGSG)n, (GGSGG)n, (GGGGS)n, (GGGGG)n, (GGG)n, (GGGGS)3, 또는 (GGGGS)4를 포함하는 것인 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질.
  15. 제1항에 있어서, 상기 단백질이 서열번호 4, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 25, 서열번호 26 및 서열번호 27 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 것인 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질.
  16. 제1항에 있어서, 상기 단백질이 서열번호 9로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 것인 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질.
  17. 제1항에 있어서, 상기 단백질이 서열번호 10(야생형 항-HSA)으로 기재된 아미노산 서열과 비교하여 아미노산 위치 31, 56, 62 또는 104로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환을 포함하며, 여기서,
    아미노산 위치 31은 라이신 또는 아르기닌으로 치환되고,
    아미노산 위치 56은 아르기닌 또는 쓰레오닌으로 치환되고,
    아미노산 위치 62는 글루탐산으로 치환되고,
    아미노산 위치 104는 발린으로 치환되는 것인 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질.
  18. 제17항에 있어서, 아미노산 위치 31, 56, 62 및 104 이외의 아미노산 위치에서 하나 이상의 추가 치환을 포함하는 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질.
  19. 제17항에 있어서, 아미노산 위치 31에서 치환을 포함하는 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질.
  20. 제17항에 있어서, 아미노산 위치 56에서 치환을 포함하는 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질.
  21. 제17항에 있어서, 아미노산 위치 62에서 치환을 포함하는 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질.
  22. 제17항에 있어서, 아미노산 위치 104에서 치환을 포함하는 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질.
  23. 제17항에 있어서, 아미노산 위치 31 및 56에서 치환을 포함하는 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질.
  24. 제17항에 있어서, 아미노산 위치 31, 56 및 104에서 치환을 포함하는 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질.
  25. 제17항에 있어서, 아미노산 위치 31 및 62에서 치환을 포함하는 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질.
  26. 제19항에 있어서, 아미노산 위치 31이 아르기닌으로 치환되는 것인 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질.
  27. 제19항에 있어서, 아미노산 위치 31이 라이신으로 치환되는 것인 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질.
  28. 제17항에 있어서, 아미노산 위치 31, 56, 62 및 104에서 치환을 포함하는 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질.
  29. 제17항에 있어서, 아미노산 위치 31이 라이신으로 치환되고, 아미노산 위치 56이 아르기닌으로 치환되고, 아미노산 위치 104가 발린으로 치환되는 것인 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질.
  30. 제17항에 있어서, 아미노산 위치 31이 라이신으로 치환되고, 아미노산 위치 56이 아르기닌으로 치환되고, 아미노산 위치 62가 글루탐산으로 치환되고, 아미노산 위치 104가 발린으로 치환되는 것인 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
  32. 제31항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
  33. 제32항에 따른 벡터로 형질전환된 단리된 숙주 세포.
  34. (i) 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질, 상기 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터, 또는 상기 벡터로 형질전환된 단리된 숙주 세포, 및 (ii) 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 증식 질환, 종양 질환, 염증 질환, 면역학적 장애, 자가면역 질환, 감염 질환, 바이러스 질환, 알레르기 반응, 기생충 반응, 이식편-대-숙주 질환 또는 숙주-대-이식편 질환의 치료 또는 완화를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 완화시키기 위한 약학 조성물.
  35. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터로 형질전환되거나 형질감염된 숙주를, 이 혈청 알부민 결합 단백질의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양하는 단계, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질을 회수하는 단계, 및 생성된 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질을 배양물로부터 정제하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질의 제조 방법.
  36. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항의 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질을 포함하는 약학 조성물로서, 증식 질환, 종양 질환, 염증 질환, 면역학적 장애, 자가면역 질환, 감염 질환, 바이러스 질환, 알레르기 반응, 기생충 반응, 이식편-대-숙주 질환 또는 숙주-대-이식편 질환의 치료 또는 완화를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 완화시키기 위한 의약의 제조에 사용하기 위한 것인, 약학 조성물.
  37. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항의 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질을 포함하는, 증식 질환, 종양 질환, 염증 질환, 면역학적 장애, 자가면역 질환, 감염 질환, 바이러스 질환, 알레르기 반응, 기생충 반응, 이식편-대-숙주 질환 또는 숙주-대-이식편 질환의 치료 또는 완화를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 완화시키기 위한 의약.
  38. 제37항에 있어서, 상기 대상체가 인간인 의약.
  39. 제37항에 있어서, 상기 질환이 암인 의약.
  40. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질을 포함하는 다중특이적 결합 단백질.
  41. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질을 포함하는 항체.
  42. 제40항의 다중특이적 결합 단백질을 포함하는, 증식 질환, 종양 질환, 염증 질환, 면역학적 장애, 자가면역 질환, 감염 질환, 바이러스 질환, 알레르기 반응, 기생충 반응, 이식편-대-숙주 질환 또는 숙주-대-이식편 질환의 치료 또는 완화를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 완화시키기 위한 약학 조성물.
  43. 제40항의 다중특이적 결합 단백질을 포함하는, 증식 질환, 종양 질환, 염증 질환, 면역학적 장애, 자가면역 질환, 감염 질환, 바이러스 질환, 알레르기 반응, 기생충 반응, 이식편-대-숙주 질환 또는 숙주-대-이식편 질환의 치료 또는 완화를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 완화시키기 위한 의약.
  44. 제43항에 있어서, 상기 대상체가 인간인 의약.
  45. 제41항의 항체를 포함하는, 증식 질환, 종양 질환, 염증 질환, 면역학적 장애, 자가면역 질환, 감염 질환, 바이러스 질환, 알레르기 반응, 기생충 반응, 이식편-대-숙주 질환 또는 숙주-대-이식편 질환의 치료 또는 완화를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 완화시키기 위한 의약.
  46. 제41항의 항체를 포함하는, 증식 질환, 종양 질환, 염증 질환, 면역학적 장애, 자가면역 질환, 감염 질환, 바이러스 질환, 알레르기 반응, 기생충 반응, 이식편-대-숙주 질환 또는 숙주-대-이식편 질환의 치료 또는 완화를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 완화시키기 위한 약학 조성물.
  47. 제45항에 있어서, 상기 대상체가 인간인 의약.
  48. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항의 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질, 상기 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질을 포함하는 다중특이적 결합 단백질, 또는 상기 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질을 포함하는 항체를 포함하는, 증식 질환, 종양 질환, 염증 질환, 면역학적 장애, 자가면역 질환, 감염 질환, 바이러스 질환, 알레르기 반응, 기생충 반응, 이식편-대-숙주 질환 또는 숙주-대-이식편 질환의 치료 또는 완화를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 완화시키기 위한 의약으로서, 작용제가 상기 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질, 상기 다중특이적 결합 단백질, 또는 상기 항체와 조합하여 투여되는 것인 의약.
  49. 제48항에 있어서, 상기 작용제가 항체, 소분자, 호르몬, 방사선요법, 유전자 요법 또는 면역요법에서 선택되는 것인 의약.
  50. 제48항에 있어서, 상기 작용제가 지사제, 진토제, 진통제, 오피오이드 또는 비-스테로이드성 소염제인 의약.
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