ES2713864T3 - Secuencias de aminoácidos dirigidas contra proteínas de la envuelta de un virus y polipéptidos que comprenden las mismas para el tratamiento de enfermedades virales - Google Patents

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Abstract

Constructo trivalente que consiste esencialmente en tres dominios variables individuales de inmunoglobulina que pueden unirse específicamente a la proteína F de VRS, en el que los dominios variables individuales de inmunoglobulina se unen específicamente al mismo determinante antigénico, epítopo, parte o dominio de la proteína F de VRS y consisten esencialmente en 4 regiones de entramado (FR1 a FR4, respectivamente) y 3 regiones determinantes de complementariedad (CDR1 a CDR3, respectivamente), en el que: (A) - CDR1 es la secuencia de aminoácidos NYVLG (SEQ ID NO: 2595); y - CDR2 es la secuencia de aminoácidos AINWRGDITIGPPNVEG (SEQ ID NO: 2611); y - CDR3 es la secuencia de aminoácidos GTPLNPGAYIYDWSYDY (SEQ ID NO: 2627); o (B) - CDR1 es la secuencia de aminoácidos NYVLG (SEQ ID NO: 935); y - CDR2 es la secuencia de aminoácidos AISFRGDSAIGAPSVEG (SEQ ID NO: 1499); y - CDR3 es la secuencia de aminoácidos GTPLNPGAYIYDWSYDY (SEQ ID NO: 2063); o (C) - CDR1 es la secuencia de aminoácidos SYAMG (SEQ ID NO: 918); y - CDR2 es la secuencia de aminoácidos AISWSDGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 1482); y - CDR3 es la secuencia de aminoácidos DLTSTNPGSYIYIWAYDY (SEQ ID NO: 2046).

Description

DESCRIPCION
Secuencias de aminoacidos dirigidas contra protemas de la envuelta de un virus y polipeptidos que comprenden las mismas para el tratamiento de enfermedades virales
Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a constructos trivalentes que se unen espedficamente a protema F de VRS, asf como a compuestos o constructos y, en particular, a protemas y polipeptidos, que comprenden o consisten esencialmente en uno o mas de tales constructos trivalentes (tambien denominados en el presente documento “secuencias de aminoacidos de la invencion”, "compuestos de la invencion” y "polipeptidos de la invencion”, respectivamente).
La invencion tambien se refiere a acidos nucleicos que codifican tales constructos trivalentes y polipeptidos (tambien denominados en el presente documento “acidos nucleicos de la invencion” o “secuencias de nucleotidos de la invencion”); a metodos para preparar tales constructos trivalentes y polipeptidos; a celulas huesped que expresan o capaces de expresar tales constructos trivalentes o polipeptidos; a composiciones y, en particular, a composiciones farmaceuticas, que comprenden tales constructos trivalentes, polipeptidos, acidos nucleicos y/o celulas huesped; y a usos de tales secuencias de aminoacidos o polipeptidos, acidos nucleicos, celulas huesped y/o composiciones, en particular con propositos profilacticos, terapeuticos o de diagnostico, tales como los propositos profilacticos, terapeuticos o de diagnostico mencionados en el presente documento.
Otros aspectos, realizaciones, ventajas y aplicaciones de la invencion quedaran claros a partir de la siguiente descripcion en el presente documento.
Antecedentes de la tecnica
Los virus con envuelta se ensamblan mediante gemacion en membranas de celulas huesped (Compans et al. En Comprehensive Virology, Fraenkel y Wagner, eds. Plenum Press, Nueva York 4: 179-252 (1975); Choppin y Compans, En Comprehensive Virology, Fraenkel y Wagner, eds. Plenum Press, Nueva York 4: 96-178 (1975); Wagner, En Comprehensive Virology, Fraenkel y Wagner, eds. Plenum Press, Nueva York 4:1-94 (1975)). Durante este proceso, adquieren una envuelta que tiene una bicapa lipfdica, cuya composicion refleja la de la membrana del huesped, glicoprotemas que forman proyecciones o espigas en la superficie de las partmulas virales, y protemas M no glicosiladas que se asocian con la superficie interior de la bicapa lipfdica de la partmula viral. Las protemas asociadas a virion son espedficas de virus.
Una de las etapas cruciales en la infeccion viral es la fusion entre la membrana viral y la membrana de la celula huesped, que esta mediada por glicoprotemas virales, tales como protemas de fijacion y protemas de fusion viral. La fusion de la membrana viral puede tener lugar o bien en la membrana plasmatica o bien en una ubicacion intracelular tras la captacion viral mediante endocitosis (Earp et al. Curr. Topics Microbiol. Immunol. 285, 25-66 (2005); Smith et al. Science 304, 237-242 (2004)). Los virus pertenecientes a las familias Retroviridae, Paramyxoviridae, Herpesviridae y Coronaviridae inician normalmente la fusion de manera independiente del pH mediante lo cual el virion se une inicialmente a receptores de superficie celular y, posteriormente, la membrana viral se fusiona con la membrana plasmatica de la celula huesped a pH neutro.
La determinacion de la estructura atomica de ectodominios completos o regiones centrales de muchas protemas de fusion virales en sus estados antes y/o despues de la fusion ha revelado una gran diversidad de conformaciones. No obstante, en todos los casos estudiados hasta ahora, la transicion estructural desde una conformacion antes de la fusion hasta una posterior conduce a una conformacion en horquilla estable que da como resultado la situacion de los dos anclajes a la membrana, los dominios transmembrana y de peptido de fusion, en el mismo extremo de una estructura similar a una varilla alargada trimerica. Se han identificado tres clases diferentes de protemas de fusion viral hasta la fecha basandose en sus motivos estructurales tras la fusion comunes (tabla C-3) (Kielian et al. Nat. Rev. Microbiol. 4: 67-76 (2006); Weissenhorn et al. FEBS Lett. 581,2150-2155 (2007)).
En su estado tras la fusion, final, las protemas de fusion viral de clase I se caracterizan por la interaccion de las regiones C-terminales proximales de membrana con los dominios de superenrollamiento de helice a mas N-terminales para formar un tnmero de horquillas que acerca los peptidos de fusion y dominios transmembrana (Skehel et al. Cell 95: 871-874 (1998)). De manera importante, para varias protemas de clase I, peptidos que contienen secuencias de estas regiones de interaccion N o C-terminales pueden unirse a la protema de fusion viral e inhibir la fusion e infeccion impidiendo el replegamiento para dar la conformacion en horquilla final (para una revision, vease Moore y Doms Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100: 10598-10602 (2003)). La estructura en horquilla trimerica final se denomina a menudo haz de seis helices. Tambien se han determinado a nivel cristalografico las estructuras de dos protemas de clase I con respecto a su estado antes de la activacion de la fusion. Para una protema, hemaglutinina (HA) de virus influenza, este estado inicial no presenta el haz de seis helices (Wilson et al. Nature 289: 366-373 (1981)), mientras que para otra, protema de fusion (F) del virus parainfluenza de simio 5, ya esta presente un haz de seis helices (Yin et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 9288-9293 (2005)), pero esta estructura no es identica al haz final. En ambos casos, al realizar la transicion desde su estado inicial hasta el final, las protemas experimentan cambios en la estructura secundaria que hacen las que partes de la protema, en particular peptidos de fusion, se desplacen largas distancias (Baker et al. Mol. Cell 3: 309-319 (1999). Chen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 8967-8972 (1999)). Ejemplos de familias de virus que expresan protemas de fusion de clase I son Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Filoviridae, Retroviridae y Coronaviridae.
Los virus que se sabe que expresan protemas de clase II pertenecen al genero de alfavirus (familia Togaviridae) y a la familia de Flaviviridae (Kielian et al. Virology 344: 38-47 (2006)). Los alfavirus y Flaviviridae son pequenos virus esfericos que contienen genomas de ARN de cadena positiva empaquetados con una protema de la capside. La nucleocapside esta envuelta por una bicapa lipfdica que contiene la protema de fusion de membrana viral (E1 de alfavirus o E de flavivirus). En viriones maduros, E1 de alfavirus se asocia como heterodfmero con la protema E2 viral, mientras que la protema E de flavivirus se encuentra como homodfmero E-E. El bajo pH provoca una drastica reorganizacion de la protema de fusion a la conformacion tras la fusion, disociandose sus interacciones dimericas y produciendose un homotnmero insertado en membrana diana que se cree que dirige la reaccion de fusion de membrana. Aunque las protemas de fusion de alfavirus y flavivirus no tienen similitud de secuencia de aminoacidos detectable, tienen estructuras secundarias y terciarias notablemente similares, indicando su relacion evolutiva y conduciendo a su clasificacion como elementos inaugurales de las protemas de fusion virales de clase II (Lescar et al. Cell 105: 137-148 (2001)). Se han determinado las estructuras a pH neutro (es decir, antes de la fusion) de los ectodominios de protema de fusion para el alfavirus, virus del bosque de Semliki (VBS; Lescar et al. Cell 105: 137­ 148 (2001)) y los flavivirus TBE, DV2 y DV3 (Rey 375: 291-298 (1995); Modis Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 6986­ 6991 (2003)). Las protemas son moleculas alargadas que se componen casi por completo de cadenas p y contienen tres dominios: el dominio I, que esta ubicado de manera central; el dominio II, que esta ubicado en un lado del dominio I y contiene el bucle de peptido de fusion de interaccion con membrana diana en su punta; y un dominio III de tipo Ig, que se conecta al otro lado del dominio I. Aunque no esta presente en la estructura de ectodominio, en las protemas de longitud completa, la region de tallo y el anclaje transmembrana se encuentran en el extremo C-terminal del dominio III, en el extremo opuesto de la protema al bucle de fusion. Las protemas de fusion se disponen con simetna icosaedrica y se encuentran de manera tangencial (casi paralela) a la membrana viral. Los cambios conformacionales de las protemas de fusion de clase II necesarios para realizar la transicion desde el estado inicial determinado a nivel cristalografico hasta el estado final no implican cambios sustanciales en la estructura secundaria. Mas bien, los dominios de protemas de clase II rotan en “puntos de pivote” de modo que movimientos a gran escala aproximan los bucles de fusion y dominios transmembrana, formando tnmeros de horquillas que se componen de estructuras p.
Una tercera clase de protemas de fusion forma en su estado tras la fusion tnmeros de horquillas combinando dos elementos estructurales. De manera similar a las protemas de fusion de clase I, las protemas de fusion de clase III presentan un nucleo trimerico de helice a central; sin embargo, cada dominio de fusion deja al descubierto dos bucles de fusion ubicados en la punta de una lamina p alargada revelando una convergencia sorprendente con protemas de fusion de clase II (Roche et al. Science 313: 187-191 (2006); Heldwein et al. Science 313: 217-220 (2006)). Ejemplos de familias de virus que expresan protemas de fusion de clase III son Rhabdoviridae y Herpesviridae.
Hasta ahora, los anticuerpos neutralizantes han sido cruciales para la proteccion contra enfermedades asociadas con los virus con envuelta. En principio, tales anticuerpos pueden actuar tanto contra el virus libre como contra celulas infectadas. La actividad antiviral mas marcada de los anticuerpos y la actividad que es la mas importante para la proteccion mediada por anticuerpos es la neutralizacion de partmulas virales libres. La actividad antiviral hacia partmulas virales libres puede activarse mediante la union del anticuerpo a una diana espedfica en la superficie del virion, tal como una protema de la envuelta que puede dar como resultado la inhibicion de la infeccion viral (neutralizacion) y/o la actividad de sistemas efectores que pueden conducir a eliminacion viral. Los anticuerpos que estan dirigidos espedficamente contra celulas infectadas tambien pueden mediar en varias actividades antivirales. Los sistemas efectores mediados por Fc pueden conducir a lisis celular o eliminacion mediante citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (CCDA) o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Tambien se ha descrito la inhibicion de la replicacion viral en el interior de celulas mediante la union de anticuerpos a moleculas virales que se expresan en la membrana de las celulas, presumiblemente a traves de mecanismos de senalizacion, particularmente para la infeccion viral de neuronas (Fujinami et al. Nature 279: 529-530 (1979); Levine et al. Science 254: 856-860 (1991)). Los anticuerpos tambien pueden inhibir la liberacion de virus desde celulas infectadas (Gerhard et al. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 260: 171-190 (2001)) y la transmision intercelular de virus (Pantaleo et al. Eur. J. Immunol. 25: 226-231 (1995); Burioni et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 355-359 (1994)). Los anticuerpos neutralizantes tienden a ser eficaces tanto contra celulas infectadas como contra partmulas virales libres porque se unen a moleculas de la envuelta que se presentan en celulas infectadas asf como en viriones. Sin embargo, los anticuerpos no neutralizantes tambien podnan ser eficaces contra celulas infectadas mediante la union a moleculas que se expresan en celulas infectadas, pero no en viriones, por ejemplo la protema M2 de virus influenza (Fiers et al. Virus Research 103 (1-2): 173-176 (2004)). Okuno et al. (1993, J. Virol.67: 2552-2558) describen un anticuerpo monoclonal (AcM C179) que se une a la region de tallo de HA e inhibe la actividad de fusion de HA dando como resultado neutralizacion viral e inhibicion de la fusion celular. En el documento EP2096121, se describen peptidos antivirales con un anticuerpo antiviral y una senal de fijacion a lfpidos.
Clmicamente, la terapia con anticuerpos que usa anticuerpos policlonales y monoclonales (AcM) se usa eficazmente como profilaxis contra infecciones de varicela, hepatitis A, hepatitis B, rabia (Montano-Hirose et al. Vaccine 11: 1259­ 1266 (1993) y Schumacher et al. Vaccine 10: 754-760 (1992)) y por el virus respiratorio sincitial (Sawyer Antiviral Res. 47: 57-77 (2000)). En los ultimos 10 anos, dos anticuerpos han obtenido licencia para una indicacion viral, RespiGam y Synagis®, ambos para la prevencion de infeccion por el virus respiratorio sincitial. RespiGam es un anticuerpo derivado de plasma humano y Synagis® es un anticuerpo monoclonal humanizado, el primero de tales anticuerpos en obtener una licencia para una indicacion de enfermedad infecciosa. Synagis® tambien se ha descrito en el documento WO 03/105894. A CytoGam para la prevencion de infeccion por citomegalovirus en pacientes con trasplante de rinon se le ha concedido recientemente una indicacion ampliada para incluir el uso en pacientes con trasplante de pulmon, tngado, pancreas y corazon. La terapia basada en anticuerpos para pacientes humanos con gripe se ha explorado poco hasta ahora. Nabi-HB es un anticuerpo derivado de plasma humano comercializado para tratar exposicion aguda o perinatal a VHB. Sin embargo, se ha mostrado que anticuerpos monoclonales espedficos pueden conferir proteccion profilactica y terapeutica contra la gripe en ratones (Smirnov et al. Arch Virol. 145: 1733­ 1741 (2000); Renegar et al. J Immunol. 173: 1978-1986 (2004); Palladino et al. J Virol. 69: 2075-2081 (1995)). Tambien se han usado AcM de raton humanizados y fragmentos F(ab')2 equinos espedficos para la protema hemaglutinina H5 del virus influenza para la profilaxis y terapia eficaces en el modelo de raton (Lu et al. Respir Res.
7: 43 (2006); Hanson et al. Respir Res. 7: 126 (2006)). El documento US 2006/0228367 proporciona anticuerpos que se unen a metapneumovirus de mairnfero, virus respiratorio sincitial y/o pneumovirus aviar.
Los fragmentos de anticuerpo, tales como fragmentos F(ab')2 , fragmentos Fab (Lamarre et al. J. Immunol. 154: 3975-3984 (1995); Thullier et al. J. Biotechnol. 69: 183-190 (1999); Schofield et al. J. Gen. Virol. 78: 2431-2439 (1997); Barbas et al. PNAS 89:10164 (1992); Crowe et al. PNAS 91: 1386 (1994); Prince et al. JVI 64: 3091 (1990)) y fragmentos Fv de cadena sencilla (Mason et al. Virology 224: 548 (1996)) tambien han demostrado ser satisfactorios en la neutralizacion de una variedad de virus con envuelta tanto in vitro como in vivo en modelos animales (predominantemente en ratones). Guirakhoo et al. 1996 (Immunotechnol. 2: 219) describen una IgA murina (HNK20) contra VRS y su fragmento de cadena sencilla (HNK20-scFv). En comparacion con la IgA parental, el scFv demostro una afinidad similar para VRS y una actividad de neutralizacion de VRS mejorada.
Se han descrito diversos formatos de anticuerpos recombinantes, incluyendo constructos multimericos, por Hudson y Kortt 1999 (J. Immunol. Methods 231: 177), Souriau y Hudson 2003 (Expert Opin. Ther. 3: 305), Holliger y Hudson 2005 (Nat. Biol 23: 1126), Filpula 2007 (Biomolecular Engineering 24: 201), y Jain et al. 2007 (TRENDS in Biotechnol. 25: 307). La valencia creciente en estos constructos dio como resultado efectos de avidez.
Se han generado dominios variables derivados de anticuerpos de cadena pesada de especies de camelidos contra la nucleoprotema del virus de Marburgo (Sherwood et al. al. J. Infect. Dis. 196 (2): S213-219 (2007)), contra la protema de la matriz p15 de retrovirus porcinos (Dekker et al. J. Virol. 77 (22): 12132-12139 (2003)), contra HBsAg del virus de la hepatitis B humana (Serruys et al. 12th International Symposium on Viral Hepatitis and Liver Disease (2006); Serruys et al. Novel compounds & strategies to combat pathogenic microorganisms (poster) (2006); Serruys et al. The Molecular Biology of Hepatitis B Viruses (poster) (2007); Serruys New insights in HBV diversity, pathogenesis, diagnosis and treatment (presentacion oral) (2007); Serruys NBC-12: Single-domain intrabodies inhibit Hepatitis B virus replication in mice (presentacion oral) (2008)), contra virus vaccinia (Goldman et al. Anal. Chem. 78 (24): 8245-8255 (2006)), y contra gp120 de VIH-1 (Forsman et al. Abstract EU-WHO Neut Workshop, Italia, marzo de 2007) en casos dando como resultado un bloqueo eficaz de la replicacion o neutralizacion viral in vitro y/o in vivo (en un modelo de raton). El documento WO 00/65057 describe fragmentos de VHH neutralizantes de bacteriofago y moleculas bicabeza. El documento WO 03/051912 describe glicocprotemas E1 y/o E2 recombinantes del virus de la hepatitis C (VHC) y anticuerpos monoclonales que reaccionan con estas protemas recombinantes.
La tecnica anterior comentada anteriormente en el presente documento indica claramente que el desarrollo de farmacos antivirales eficaces y potentes sigue constituyendo un reto cientffico importante. Solamente para una minona de infecciones virales, existe disponible actualmente un compuesto profilactico y/o terapeutico eficaz.
Sin embargo, estos farmacos antivirales existentes actualmente tienen numerosos efectos secundarios, tales como nauseas, vomitos, exantemas cutaneos, migrana, fatiga, temblores, y, mas rara vez, convulsiones epilepticas.
Ademas, la mutabilidad y adaptabilidad resultante de los virus presentan una enorme dificultad para el diseno de estrategias antivirales que sean eficaces a largo plazo. Aunque el diseno de farmacos ha aumentado a partir de avances en la comprension molecular de procesos de crecimiento viral, muchos farmacos inicialmente potentes pierden su eficacia a lo largo del tiempo debido a la aparicion de cepas resistentes a farmacos. Cuando surgen mutaciones que atenuan o compensan el efecto inhibidor del farmaco, las cepas virales que portan tales mutaciones obtienen una ventaja de crecimiento y se seleccionan posteriormente para la poblacion viral.
Asf, para la mayona de enfermedades virales humanas conocidas actualmente existe la necesidad urgente de farmacos antivirales potentes que puedan usarse para el tratamiento y la prevencion eficaces de estas enfermedades. Ademas, existe la necesidad de farmacos antivirales alternativos y mejorados con respecto a los farmacos existentes actualmente con relacion a su eficacia y/o potencia (a largo plazo), superando las desventajas que se encuentran actualmente, tales como, por ejemplo, los efectos secundarios adversos y la evasion viral/escape viral.
Sumario de la invencion
Es un objeto de la presente invencion proporcionar constructos trivalentes que pueden unirse espedficamente a una protema de la envuelta de un virus que es la protema F de VRS. Mas espedficamente, la presente invencion proporciona constructos trivalentes que consisten esencialmente en tres dominios variables individuales de inmunoglobulina, tal como se define adicionalmente en las reivindicaciones. Las secuencias de aminoacidos segun la presente invencion, que estan dirigidas contra y/o que se unen espedficamente a una protema de la envuelta de un virus, pueden usarse generalmente para modular y, en particular, para inhibir y/o para impedir las rutas biologicas mediadas por virus en las que participan una protema de la envuelta de un virus y/o un receptor viral. En particular, las secuencias de aminoacidos de la presente invencion pueden usarse para neutralizar un virus (tal como se definen en el presente documento) y/o para modular, reducir y/o inhibir la infectividad de un virus (tal como se definen en el presente documento).
Mas espedficamente, las secuencias de aminoacidos segun la presente invencion pueden neutralizar un virus (tal como se definen en el presente documento) y/o para modular, reducir y/o inhibir la infectividad de un virus (tal como se definen en el presente documento) en la fase previa a la entrada de la infeccion viral (es decir, antes de tener lugar y/o durante la entrada viral en una celula huesped diana) y/o en la fase posterior a la entrada de la infeccion viral (es decir, despues de tener lugar la entrada viral en una celula huesped diana). Por consiguiente, secuencias de aminoacidos de la presente invencion que neutralizan un virus (tal como se definen en el presente documento) y/o modulan, reducen y/o inhiben la infectividad de un virus (tal como se definen en el presente documento) en la fase previa a la entrada de la infeccion viral (es decir, antes de tener lugar y/o durante la entrada viral en una celula huesped diana), se dice en el presente documento que modulan y, en particular, inhiben y/o impiden la entrada viral (tal como se define adicionalmente en el presente documento) en una celula huesped diana.
Por consiguiente, las secuencias de aminoacidos de la presente invencion pueden modular y, en particular, inhibir y/o impedir la entrada viral en una celula huesped diana al unirse espedficamente a una protema de la envuelta de un virus en cualquier etapa adecuada de dicha(s) ruta(s) biologica(s); preferiblemente, las secuencias de aminoacidos de la presente invencion pueden modular y, en particular, inhibir y/o impedir la entrada viral en una celula huesped diana al unirse a una protema de la envuelta de un virus, de tal manera que se induce agregacion de viriones y/o se desestabiliza la estructura del virion y/o se modula, se inhibe y/o se impide la fijacion del virion a una celula huesped diana (por ejemplo, modulando y/o inhibiendo y/o impidiendo la interaccion entre la protema de la envuelta de un virus y un receptor viral y/o entre la protema de la envuelta de un virus y una celula huesped diana o compitiendo con dicha protema de la envuelta por la union a dicho receptor viral y/o dicha celula huesped diana) y/o se modula, se inhibe y/o se impide la fusion viral con dicha celula huesped diana (por ejemplo, en la membrana de la celula huesped diana o dentro de un compartimento endosomico y/o lisosomico de dicha celula huesped diana), por ejemplo impidiendo que dicha protema de la envuelta de un virus experimente un cambio conformacional.
Como tales, los polipeptidos y las composiciones de la presente invencion pueden usarse para la prevencion y el tratamiento (tal como se define en el presente documento) de enfermedades virales. Generalmente, “enfermedades virales” puede definirse como enfermedades y trastornos que estan provocados por uno o mas virus; en particular las enfermedades virales pueden ser enfermedades que pueden prevenirse y/o tratarse, respectivamente, administrando de manera adecuada a un sujeto que lo necesita (es decir, que tiene la enfermedad o el trastorno o al menos un smtoma de los mismos y/o que corre el riesgo de contraer o desarrollar la enfermedad o el trastorno) de o bien una secuencia de aminoacidos, polipeptido o bien una composicion de la invencion (y en particular, de una cantidad farmaceuticamente activa de los mismos) y/o de un compuesto antiviral conocido contra una protema de la envuelta de un virus o una ruta biologica mediada por virus en la que participa una protema de la envuelta de un virus y/o su receptor viral (y en particular, de una cantidad farmaceuticamente activa del mismo). Ejemplos de tales enfermedades virales le quedaran claros al experto basandose en la divulgacion en el presente documento y, por ejemplo, incluyen las siguientes enfermedades y trastornos (provocados por los siguientes virus): bronquiolitis (provocada, por ejemplo, por VRS [el virus VRS y las enfermedades provocadas por VRS se revisan en Ogra P. Paediatric Respiratory Reviews 5: S119-S126 (2004)]), resfriado comun (provocado, por ejemplo, por VRS [el virus VRS y las enfermedades provocadas por VRS se revisan en Ogra P. Paediatric Respiratory Reviews 5: S119-S126 (2004)]), infecciones de las vfas respiratorias bajas (provocadas, por ejemplo, por v Rs [el virus VRS y las enfermedades provocadas por VRS se revisan en Ogra P. Paediatric Respiratory Reviews 5: S119-S126 (2004)]), faringitis (provocada, por ejemplo, por VRS [el virus VRS y las enfermedades provocadas por VRS se revisan en Ogra P. Paediatric Respiratory Reviews 5: S119-S126 (2004)]), neumoma (viral) (provocada, por ejemplo, por VRS [el virus VRS y las enfermedades provocadas por VRS se revisan en Ogra P. Paediatric Respiratory Reviews 5: S119-S126 (2004)]), faringoamigdalitis estreptococica (provocada, por ejemplo, por VRS [el virus VRS y las enfermedades provocadas por VRS se revisan en Ogra P. Paediatric Respiratory Reviews 5: S119-S126 (2004)]).
Por consiguiente, las secuencias de aminoacidos, los polipeptidos y las composiciones de la presente invencion pueden usarse para la prevencion y el tratamiento de enfermedades virales que se caracterizan por ruta(s) biologica(s) mediada(s) por virus en las que participa la protema F de VRS.
En particular, las secuencias de aminoacidos, los polipeptidos y las composiciones de la presente invencion pueden usarse para la prevencion y el tratamiento de enfermedades virales caracterizada por cualquier ruta biologica por virus en las que participa la protema F de VRS. Sin embargo, preferiblemente, las secuencias de aminoacidos, los polipeptidos y las composiciones de la presente invencion pueden usarse para la prevencion y el tratamiento de enfermedades virales caracterizadas por la entrada viral en una celula huesped diana, tal como la fijacion del virion a una celula huesped diana y/o la fusion viral con una celula huesped diana.
Son usos espedficos:
Secuencias de aminoacidos y polipeptido de la invencion contra VRSh, y composiciones farmaceuticas que comprenden los mismos, pueden usarse en la prevencion y el tratamiento de infecciones de las vfas respiratorias bajas, bronquiolitis, resfriado comun, faringitis, neumoma viral y faringoamigdalitis estreptococica;
Por tanto, sin limitarse a ello, las secuencias de aminoacidos, los polipeptidos y las composiciones de la invencion pueden usarse, por ejemplo, para preveniry/o para tratartodas las enfermedades ytrastornos que se previenen o se tratan actualmente con compuestos antivirales conocidos que pueden modular ruta(s) biologica(s) mediada(s) por virus en las que participa la protema F de VRS, tales como las mencionadas en la tecnica anterior citada anteriormente. Tambien se preve que las secuencias de aminoacidos, los polipeptidos y las composiciones de la invencion pueden usarse para prevenir y/o para tratar todas las enfermedades y trastornos para los que esta desarrollandose actualmente, se ha propuesto o se propondra o desarrollara en el futuro el tratamiento con tales compuestos antivirales. Ademas, se preve que, debido a sus propiedades favorables tal como se describe adicionalmente en el presente documento, las secuencias de aminoacidos, los polipeptidos y las composiciones de la presente invencion pueden usarse para la prevencion y el tratamiento de otras enfermedades y trastornos distintos de aquellos para los que estan usandose o se propondran o desarrollaran estos compuestos antivirales conocidos; y/o que las secuencias de aminoacidos, los polipeptidos y las composiciones de la presente invencion pueden proporcionar nuevos metodos y regfmenes para tratar las enfermedades y los trastornos descritos en el presente documento.
Otras aplicaciones y usos de las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos de la invencion le quedaran claros al experto a partir de la divulgacion adicional en el presente documento.
Generalmente, es un objeto de la invencion proporcionar agentes farmacologicamente activos, asf como composiciones que comprenden los mismos, que pueden usarse en el diagnostico, la prevencion y/o el tratamiento de enfermedades virales y de las enfermedades y los trastornos adicionales mencionados en el presente documento; y proporcionar metodos para el diagnostico, la prevencion y/o el tratamiento de tales enfermedades y trastornos que implican la administracion y/o el uso de tales agentes y composiciones.
En particular, es un objeto de la invencion proporcionar tales agentes farmacologicamente activos, composiciones y/o metodos que tienen determinadas ventajas en comparacion con los agentes, las composiciones y/o los metodos que se usan actualmente y/o se conocen en la tecnica. Estas ventajas quedaran claras a partir de la descripcion adicional a continuacion.
Mas en particular, es un objeto de la invencion proporcionar protemas terapeuticas que pueden usarse como agentes farmacologicamente activos, asf como composiciones que comprenden las mismas, para el diagnostico, la prevencion y/o el tratamiento de enfermedades virales y de las enfermedades y los trastornos adicionales mencionados en el presente documento; y proporcionar metodos para el diagnostico, la prevencion y/o el tratamiento de tales enfermedades y trastornos que implican la administracion y/o el uso de tales protemas terapeuticas y composiciones.
En particular, es un objeto espedfico de la presente invencion proporcionar tales secuencias de aminoacidos y tales protemas y/o polipeptidos que son adecuados para uso profilactico, terapeutico y/o de diagnostico en un animal de sangre caliente y, en particular, en un mairnfero y, mas en particular, en un ser humano.
Mas en particular, es un objeto espedfico de la presente invencion proporcionar tales secuencias de aminoacidos y tales protemas y/o polipeptidos que pueden usarse para la prevencion, el tratamiento, alivio y/o diagnostico de una o mas enfermedades, trastornos o estados asociados con la entrada viral y/o mediados por una protema de la envuelta de un virus (tales como las enfermedades, los trastornos y estados mencionados en el presente documento) en un animal de sangre caliente, en particular en un mam^era y, mas en particular, en un ser humano. Tambien es un objeto espedfico de la invencion proporcionar tales secuencias de aminoacidos y tales protemas y/o polipeptidos que pueden usarse en la preparacion de composiciones farmaceuticas o veterinarias para la prevencion y el/o tratamiento de una o mas enfermedades, trastornos o estados asociados con la entrada viral y/o mediados por una protema de la envuelta de un virus (tales como las enfermedades, los trastornos y estados mencionados en el presente documento) en un animal de sangre caliente, en particular en un mamffero y, mas en particular, en un ser humano.
En la invencion, generalmente, se logran estos objetos mediante el uso de las secuencias de aminoacidos, protemas, los polipeptidos y las composiciones que se describen en el presente documento.
Mas en particular, la invencion proporciona secuencias de aminoacidos que pueden unirse a una protema de la envuelta de un virus con una afinidad (de manera adecuada medida y/o expresada como un valor de Kd (real o aparente), un valor de Ka (real o aparente), una velocidad de asociacion y/o una velocidad de disociacion, o alternativamente como valor de CI50, tal como se describe adicionalmente en el presente documento) que es tal como se define en el presente documento; asf como compuestos y constructos y, en particular, protemas y polipeptidos, que comprenden al menos una de tales secuencias de aminoacidos.
En particular, las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos de la invencion son preferiblemente tales que:
- se unen a una protema de la envuelta de un virus con una constante de disociacion (Kd) de 10"5 a 10"12 moles/litro o menos, y preferiblemente de 10"7 a 10"12 moles/litro o menos y mas preferiblemente de 10"8 a 10"12 moles/litro (es decir, con una constante de asociacion (Ka) de 105 a 1012 litros/mol o mas, y preferiblemente de 107 a 1012 litros/mol o mas y mas preferiblemente de 108 a 1012 litros/mol); y/o tales que:
- se unen a un
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- se unen a una protema de la envuelta de un virus con una velocidad de disociacion de entre 1 s-1 (t1/2 = 0,69 s) y 10-6 s-1 (proporcionando un complejo casi irreversible con un t1/2 de multiples dfas), preferiblemente entre 10-2 s'1 y 10-6 s-1, mas preferiblemente entre 1o-3 s-1 y 10-6 s-1, tal como entre 10-4 s-1 y 10-6 s-1.
Preferiblemente, una secuencia de aminoacidos monovalente descrita en el presente documento (o un polipeptido que contiene solamente una secuencia de aminoacidos descrita en el presente documento) es preferiblemente tal que se unira a una protema de la envuelta de un virus con una afinidad menor de 500 nM, preferiblemente menor de 200 nM, mas preferiblemente menor de 10 nM, tal como menor de 500 pM.
Algunos valores de CI50 preferidos para la union de las secuencias de aminoacidos o polipeptidos de la invencion a una protema de la envuelta de un virus quedaran claros a partir de la descripcion adicional y los ejemplos en el presente documento.
Las secuencias de aminoacidos monovalentes o los Nanobodies descritos en el presente documento no forman parte de la invencion reivindicada.
Para la union a una protema de la envuelta de un virus, una secuencia de aminoacidos descrita en el presente documento contendra habitualmente dentro de su secuencia de aminoacidos uno o mas residuos de aminoacido o uno o mas tramos de residuos de aminoacido (es decir, comprendiendo cada “tramo” dos o mas residuos de aminoacido que son adyacentes entre sf o estan en estrecha proximidad entre sf, es decir en la estructura primaria o terciaria de la secuencia de aminoacidos) mediante lo cual la secuencia de aminoacidos de la invencion puede unirse a una protema de la envuelta de un virus, residuos de aminoacido o tramos de residuos de aminoacido que forman por tanto el “sitio” para la union a una protema de la envuelta de un virus (tambien denominado en el presente documento el “sitio de union a antigeno”).
Las secuencias de aminoacidos descritas en el presente documento estan preferiblemente en forma esencialmente aislada (tal como se define en el presente documento), o forman parte de una protema o un polipeptido de la invencion (tal como se define en el presente documento), que puede comprender o consistir esencialmente en una o mas secuencias de aminoacidos descritas en el presente documento y que pueden comprender opcionalmente ademas una o mas secuencias de aminoacidos adicionales (todas unidas opcionalmente mediante uno o mas ligadores adecuados). Por ejemplo, y sin limitacion, la una o mas secuencias de aminoacidos descritas en el presente documento pueden usarse como unidad de union en una protema o un polipeptido de este tipo, que puede contener opcionalmente una o mas secuencias de aminoacidos adicionales que pueden servir como unidad de union (es decir, contra una o mas de otras dianas distintas a la protema de la envuelta de un virus, a las se unen espedficamente y/o estan dirigidas contra las secuencias de aminoacidos descritas en el presente documento), para proporcionar un polipeptido monovalente, multivalente o multiespedfico, respectivamente, todos tal como se describen en el presente documento. Una protema o un polipeptido de este tipo tambien puede estar en forma esencialmente aislada (tal como se define en el presente documento).
Las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos descritos en el presente documento como tales preferiblemente consisten esencialmente en una unica cadena de aminoacidos que no se une mediante puentes disulfuro a ninguna otra secuencia de aminoacidos o cadena (pero que puede contener o no uno o mas puentes disulfuro intramoleculares. Por ejemplo, se sabe que los Nanobodies (tal como se describe en el presente documento) pueden contener a veces un puente disulfuro entre CDR3 y CDR1 o FR2). Sin embargo, debe indicarse que una o mas secuencias de aminoacidos descritas en el presente documento deben ligarse entre sf y/o a otras secuencias de aminoacidos (por ejemplo, mediante puentes disulfuro) para proporcionar constructos peptidicos que tambien pueden ser utiles (por ejemplo, fragmentos Fab', fragmentos F(ab')2, constructos ScFv, “diabodies” y otros constructos multiespedficos. Por ejemplo, se hace referencia a la revision en Holliger y Hudson, Nat Biotechnol. sep. de 2005;23(9): 1126-36).
Ademas, una secuencia de aminoacidos de la invencion puede contener opcionalmente, y ademas del al menos un sitio de union para la union a una protema de la envuelta de un virus, uno o mas sitios de union adicionales para la union a otros antigenos, protemas o dianas.
La eficacia de las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos de la invencion, y de composiciones que comprenden los mismos, puede someterse a prueba usando cualquier ensayo adecuado in vitro, ensayo basado en celulas, ensayo in vivo y/o modelo animal conocido per se, o cualquier combinacion de los mismos, dependiendo de la enfermedad o el trastorno espedfico implicado. Los ensayos y modelos animales adecuados le quedaran claros al experto y, por ejemplo, incluyen un ensayo Biacore; mapeo de epítopos por ejemplo usando anticuerpos monoclonales que reconocen epítopos conocidos; ensayos de neutralizacion basados en celulas para las diferentes cepas virales (por ejemplo, investigar ADEI en lmeas celulares de macrofagos y macrofagos primarios y comparar las tasas de infeccion con y sin preincubacion del virus con anticuerpos y secuencias de aminoacidos y polipeptidos de la invencion (Tirado et al. Viral Immunol. 16: 69-86 (2003)); modelo de rata algodonera para estudios sobre VRS (Murphy et al. Virus Res. 11: 1-15 (1988)); asf como los ensayos y modelos animales usados en la parte experimental a continuacion y en la tecnica anterior citada en el presente documento.
Ademas, segun la invencion, secuencias de aminoacidos y polipeptidos que estan dirigidos contra una protema de la envuelta de un virus que es la protema F de VRS que es capaz de infectar una primera especie de animal de sangre caliente pueden mostrar o no reactividad cruzada con una protema de la envuelta de un virus que es capaz de infectar una o mas de otras especies de animal de sangre caliente. Por ejemplo, secuencias de aminoacidos y polipeptidos dirigidas contra una protema de la envuelta de un virus que es capaz de infectar humanos pueden mostrar o no reactividad cruzada con una protema de la envuelta de un virus que es capaz de infectar una o mas de otras especies de primates (tales como, sin limitacion, monos del genero Macaca (tales como y, en particular, macacos cangrejeros (Macaca fascicularis) y/o monos rhesus (Macaca mulatta)) y babuinos (Papio ursinus)) y/o con una protema de la envuelta de un virus que es capaz de infectar una o mas especies de animales que se usan a menudo en modelos animales para enfermedades (por ejemplo, raton, rata, conejo, cerdo o perro) y, en particular, en modelos animales para enfermedades y trastornos asociados con la entrada viral y/o la replicacion viral y/o mediados por una protema de la envuelta de un virus y/o su receptor viral (tales como las especies y los modelos animales mencionados en el presente documento). A este respecto, le quedara claro al experto que tal reactividad cruzada, cuando esta presente, puede tener ventajas desde un punto de vista de desarrollo de farmacos, puesto que permite que se sometan a prueba las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos contra una protema de la envuelta de un virus que es capaz de infectar humanos en tales modelos de enfermedad.
Mas generalmente, secuencias de aminoacidos y polipeptidos de la invencion que producen reaccion cruzada con dos o mas protemas de la envuelta homologas de un virus que es capaz de infectar multiples especies de mairnfero seran ventajosas habitualmente para su uso en aplicaciones veterinarias, puesto que se permitira que se use la misma secuencia de aminoacidos o polipeptido a traves de multiples especies. Por tanto, tambien esta englobado dentro del alcance de la invencion que secuencias de aminoacidos y polipeptidos dirigidos contra una protema de la envuelta de un virus que es capaz de infectar una especie de animal (tales como secuencias de aminoacidos y polipeptidos contra una protema de la envuelta de un virus que es capaz de infectar humanos) pueden usarse en el tratamiento de otra especie de animal, siempre que el uso de las secuencias de aminoacidos y/o polipeptidos proporcionen los efectos deseados en la especie que va a tratarse.
Las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos estan dirigidas contra la protema F del virus VRS.
Las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos de la invencion estan dirigidos contra y/o se unen espedficamente a una protema de la envuelta de un virus que es la protema F de VRS, que es una protema de fusion viral (tal como se define adicionalmente en el presente documento).
Se conocen protemas de fusion viral en la tecnica y, por ejemplo, incluyen pero no se limitan a: la protema F del virus VRS, la protema HA de virus influenza A, la protema HEF de virus influenza C, la protema 5 F del virus parainfluenza de simio, la protema F del virus parainfluenza humano, la protema F del virus de la enfermedad de Newcastle, la protema F2 del sarampion, la protema F2 del virus Sendai, la protema gp2 del virus del Ebola, la protema TM del virus de la leucemia murina de Moloney, la protema gp41 del virus de inmunodeficiencia humana 1, la protema gp41 del virus de inmunodeficiencia del simio, la protema gp21 del virus de leucemia de celulas T humana 1, la protema TM de sincitina 2 humana, la protema TM del virus Visna, la protema S2 del virus de hepatitis de raton, la protema E2 del coronavirus de SRAG, la protema E del virus de encefalitis transmitida por garrapatas, la protema E2 del virus del dengue 2 y 3, la protema E del virus de la fiebre amarilla, la protema E del virus del Nilo Occidental, la protema E1 del virus del bosque de Semliki, la protema E1 del virus Sindbis, la protema G del virus de la rabia, la protema G del virus de estomatitis vesicular y la protema gB del virus del herpes simple.
Otros ejemplos de protemas de fusion viral le quedaran claros al experto; por ejemplo, las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos segun la invencion pueden estar dirigidos contra cualquiera de las protemas de fusion viral que se divulgan en el manual “Fields Virology”, 5a edicion (2007) de David M. Knipe, PhD; Peter M. Howley, MD; Diane E. Griffin, MD, PhD; Robert A. Lamb, PhD, ScD; Malcolm A. Martin, MD; Bernard Roizman, ScD; Stephen E. Straus, MD (ISBN-10: 0781760607; ISBN-13: 9780781760607).
Se conocen en la tecnica las caractensticas estructurales y funcionales y los mecanismos de accion de una variedad de protemas de fusion viral y se describen, por ejemplo, en detalle en la siguiente bibliograffa: Baker et al. Mol. Cell 3: 309-319 (1999); Chen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 8967-8972 (1999); Earp et al. Curr. Topics Microbiol. Immunol. 285, 25-66 (2005); Heldwein et al. Science 313: 217-220 (2006); Helenius et al. J. Cell Biol. 84, 404-420 (1980); Kielian et al. Nat. Rev. Microbiol. 4: 67-76 (2006); Lescar et al. Cell 105: 137-148 (2001); Modis Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 6986-6991 (2003); Moore y Doms Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100: 10598-10602 (2003); Rey 375: 291-298 (1995); Roche et al. Science 313: 187-191 (2006); Sieczkarski et al. Curr. Topics Microbiol. Immunol.
285, 1-23 (2005); Smith et al. Science 304, 237-242 (2004); Skehel et al. Cell 95: 871-874 (1998); Weissenhorn et al. FEBS Lett. 581, 2150-2155 (2007); Wilson et al. Nature 289: 366-373 (1981) y Yin et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 9288-9293 (2005); Handbook “Fields Virology”, 5.a edicion (2007) de David M. Knipe, PhD; Peter M. Howley, MD; Diane E. Griffin, MD, PhD; Robert A. Lamb, PhD, ScD; Malcolm A. Martin, MD; Bernard Roizman, ScD; Stephen E. Straus, MD (ISBN-10: 0781760607; ISBN-13: 9780781760607).
La presente invencion no esta limitada particularmente a o definida por una conformacion y/o estructura secundaria y/o terciaria y/o cuaternaria espedficas de dicha protema de la envuelta contra la que se dirigen las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos de la invencion. Por tanto, dicha protema de la envuelta puede caracterizarse por cualquier conformacion y/o estructura secundaria y/o terciaria y/o cuaternaria. Por ejemplo, cuando una protema de la envuelta de un virus existe en una conformacion activada y en una conformacion inactiva o en una conformacion o un estado previo a la fusion y otro posterior a la fusion, las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos de la invencion pueden unirse a una cualquiera de estas conformaciones, o pueden unirse a ambas de estas conformaciones (es decir, con una afinidad y/o especificidad que pueden ser iguales o diferentes).
Ademas, por ejemplo, las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos de la invencion pueden unirse a una conformacion de una protema de la envuelta de un virus en la que se une a una pareja de union (tal como se define adicionalmente en el presente documento), pueden unirse a una conformacion de una protema de la envuelta de un virus en la que no se une a una pareja de union, o pueden unirse a ambas de tales conformaciones (de nuevo con una afinidad y/o especificidad que pueden ser iguales o diferentes).
Mas espedficamente, dicha protema de la envuelta puede caracterizarse por un estado conformacional previo a la fusion (tal como se define adicionalmente en el presente documento) y/o un estado conformacional intermedio (tal como se define adicionalmente en el presente documento) y/o un estado conformacional posterior a la fusion (tal como se define adicionalmente en el presente documento). Dicha protema de la envuelta, que se caracteriza por un estado conformacional previo a la fusion y/o un estado conformacional intermedio y/o un estado conformacional posterior a la fusion puede ser una protema de fusion viral (tal como se define en el presente documento).
En casos en los que dicha al menos una protema de fusion se caracteriza por un estado conformacional previo a la fusion, dicho estado conformacional previo a la fusion puede ser un tnmero de protema de fusion, tal como por ejemplo (pero sin limitarse a) un tnmero de horquillas o un haz de seis helices. Cuando dicho estado conformacional previo a la fusion de una protema de fusion viral es un tnmero de protema de fusion, estan comprendidas tres subunidades de protema en dicho tnmero de protema, que son preferiblemente identicas pero tambien pueden ser diferentes entre sf. Ademas, una subunidad de protema particular de dicho tnmero de protema de fusion o bien puede permanecer intacto o sin escindir antes, durante y despues del proceso de fusion entre un virion y su celula huesped diana (tal como se define en el presente documento) o bien puede escindirse (por ejemplo, por una o mas enzimas, tales como proteasas) antes, durante o despues del proceso de fusion para formar al menos dos restos de protema principales que se originan a partir de dicha subunidad de dicho tnmero de protema. En el caso en que dicha subunidad de protema de dicho tnmero de protema de fusion se escinde tal como se describio anteriormente, dichos al menos dos restos de protema principales o bien pueden permanecer fijados unos a otros (tal como mediante enlaces covalentes, por ejemplo mediante uno o mas puentes disulfuro, o enlaces no covalentes, por ejemplo formando un complejo de protema) o bien pueden ser restos de protema completamente independientes, que se originan a partir de la misma subunidad; en ambos casos, sin embargo, o bien permaneciendo fijados unos a otros o bien estando completamente separados entre sf, puede ser que solamente uno, o al menos dos, o dos o mas o todos de dichos restos de protemas principales (que se originan a partir de la misma subunidad de dicho tnmero de protema de fusion) participan directamente en el proceso de fusion entre un virion y su celula huesped diana (tal como se define en el presente documento). Sin embargo, preferiblemente, solamente uno de dichos restos de protemas principales (que se originan a partir de la misma subunidad de dicho tnmero de protema de fusion) participa directamente en el proceso de fusion entre un virion y su celula huesped diana (tal como se define en el presente documento). Ejemplos de tales partes de protema principales que participan directamente en el proceso de fusion entre un virion y su celula huesped diana incluyen pero no se limitan a la protema F2 del virus VRS y la subunidad HA2 de la protema HA del virus influenza.
Ejemplos de protemas de fusion viral que se caracterizan por un estado conformacional previo a la fusion, que es un tnmero de protema de fusion, tal como por ejemplo un tnmero de horquillas o un haz de seis helices incluyen pero no se limitan a protema HA de virus influenza A, protema HEF de virus influenza C, protema F de virus parainfluenza de simio 5, protema F de virus parainfluenza humano, protema F de virus de enfermedad de Newcastle, protema F de virus respiratorio sincitial, protema F2 de sarampion, protema F2 de Sendai, protema gp2 de virus del Ebola, protema TM de virus de leucemia murina de Moloney, protema gp41 de virus de inmunodeficiencia humana 1, protema gp41 de virus de inmunodeficiencia del simio, protema gp21 de virus de leucemia de celulas T humana 1, protema TM de sincitina 2 humana, protema TM de virus Visna, protema S2 virus de hepatitis de raton y protema E2 de coronavirus de SRAG.
En casos en los que dicha al menos una protema de fusion se caracteriza por un estado conformacional posterior a la fusion, dicho estado conformacional posterior a la fusion pueden ser un tnmero de protema de fusion, tal como por ejemplo (pero sin limitarse a) un tnmero de horquillas o un haz de seis helices. Mas espedficamente, dicho estado conformacional posterior a la fusion de protemas de fusion viral pueden ser un tnmero de protema de fusion, que comprende estructuras p y/o de superenrollamiento de helice a y/o estructuras de superenrollamiento de helice a y/o P.
Ejemplos de protemas de fusion viral que se caracterizan por un estado conformacional posterior a la fusion, que es un tnmero de horquillas que comprenden una estructura de superenrollamiento de helice a incluyen pero no se limitan a protema HA de virus influenza A, protema HEF de virus influenza C, protema F de virus parainfluenza de simio 5, protema F de virus parainfluenza humano, protema F de virus de enfermedad de Newcastle, protema F de virus respiratorio sincitial humano, protema F2 de sarampion, protema F2 de Sendai, protema gp2 de virus del Ebola, protema TM de virus de leucemia murina de Moloney, protema gp41 de virus de inmunodeficiencia humana 1, protema gp41 de virus de inmunodeficiencia del simio, protema gp21 de virus de leucemia de celulas T humana 1, protema TM de sincitina 2 humana, protema TM de virus Visna, protema S2 virus de hepatitis de raton y protema E2 de coronavirus de SRAG.
Por tanto, la presente invencion proporciona generalmente secuencias de aminoacidos y polipeptidos que pueden estar dirigidos a y/o pueden unirse espedficamente a cualquier conformacion y/o estructura secundaria y/o terciaria y/o cuaternaria (cuando sea aplicable) de dicha protema de la envuelta.
En un segundo aspecto espedfico y preferido, la presente invencion proporciona secuencias de aminoacidos y polipeptidos que estan dirigidos a y/o se unen espedficamente al estado conformacional previo a la fusion (tal como se define en el presente documento) de una protema de la envuelta, que es una protema de fusion viral (tal como se define en el presente documento), tales como, por ejemplo, (pero sin limitarse a) secuencias de aminoacidos y polipeptidos que estan dirigidos a y/o se unen espedficamente al estado conformacional previo a la fusion de una protema de fusion viral, en el que dicho estado conformacional previo a la fusion se caracteriza por un tnmero de horquillas o un haz de seis helices; ademas, la presente invencion proporciona secuencias de aminoacidos y polipeptidos que estan dirigidos a y/o se unen espedficamente al estado conformacional intermedio (tal como se define en el presente documento) de una protema de la envuelta, que es una protema de fusion viral; finalmente, la presente invencion proporciona secuencias de aminoacidos y polipeptidos que estan dirigidos a y/o se unen espedficamente al estado conformacional posterior a la fusion (tal como se define en el presente documento) de una protema de la envuelta, que es una protema de fusion viral, tal como por ejemplo (pero sin limitarse a) secuencias de aminoacidos y polipeptidos que estan dirigidos a y/o se unen espedficamente al estado conformacional posterior a la fusion de una protema de fusion viral, en el que dicho estado conformacional posterior a la fusion se caracteriza por un tnmero de horquillas que comprende una estructura de superenrollamiento de helice a o que comprende estructuras p y/o de superenrollamiento de helice a.
En este aspecto de la invencion, tambien esta englobado que las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos pueden estar dirigidos a y/o pueden unirse espedficamente al estado conformacional previo a la fusion y al estado conformacional intermedio de dicha protema de fusion viral; ademas, las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos de la invencion pueden estar dirigidos a y/o pueden unirse espedficamente al estado conformacional previo a la fusion y al estado conformacional posterior a la fusion de dicha protema de fusion viral; ademas, las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos de la invencion pueden estar dirigidos a y/o pueden unirse espedficamente al estado conformacional intermedio y al estado conformacional posterior a la fusion de dicha protema de fusion viral.
Ademas, esta englobado en este aspecto espedfico de la presente invencion que las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos pueden estar dirigidos a y/o pueden unirse espedficamente al estado conformacional previo a la fusion y al estado conformacional intermedio y al estado conformacional posterior a la fusion de dicha protema de fusion viral.
Tal como se describe adicionalmente en el presente documento, un polipeptido puede ser bivalente y/o multivalente (tal como se define en el presente documento) y contener dos o mas secuencias de aminoacidos descritas en el presente documento que estan dirigidas contra una protema de la envuelta de un virus. Generalmente, tales polipeptidos se uniran a una protema de la envuelta de un virus con avidez aumentada en comparacion con una unica secuencia de aminoacidos de la invencion. Tambien se ha observado que tales polipeptidos muestran (de manera sinergica) aumento de la union, competencia y/o neutralizacion in vitro y/o in vivo de diferentes genotipos, subtipos, mutantes de escape y/o cepas de un virus.
Un polipeptido de este tipo puede comprender, por ejemplo, dos secuencias de aminoacidos descritas en el presente documento que estan dirigidas contra el mismo determinante antigenico, epítopo, parte, dominio, subunidad o conformacion (cuando sea aplicable) de una protema de la envuelta de un virus (que puede ser o no un sitio de interaccion); o un polipeptido de este tipo puede ser biparatopico y/o multiparatopico (tal como se define en el presente documento) y comprender al menos una “primera” secuencia de aminoacidos descrita en el presente documento que esta dirigida contra un primer determinante antigenico, epítopo, parte, dominio, subunidad o conformacion (cuando sea aplicable) de una protema de la envuelta de un virus (que puede ser o no un sitio de interaccion); y al menos una “segunda” secuencia de aminoacidos descrita en el presente documento que esta dirigida contra un segundo determinante antigenico, epítopo, parte, dominio, subunidad o conformacion (cuando sea aplicable) de dicha protema de la envuelta de un virus, en el que dicho segundo determinante antigenico, epítopo, parte, dominio, subunidad o conformacion es diferente del primero (y de nuevo puede ser o no un sitio de interaccion). Preferiblemente, en tales polipeptidos “bi y/o multiparatopicos” descritos en el presente documento, al menos una secuencia de aminoacidos de la invencion esta dirigida contra un sitio de interaccion (tal como se define en el presente documento), aunque la invencion en su sentido mas amplio no se limita a ello.
Un polipeptido descrito en el presente documento puede unirse a dos o mas determinantes antigenicos, epítopos, partes, dominios, subunidades o conformaciones de una protema de la envuelta de un virus. En tal caso, los determinantes antigenicos, epítopos, partes, dominios o subunidades de dicha protema de la envuelta de un virus a los que se unen las secuencias de aminoacidos y/o polipeptidos descritos en el presente documento pueden ser esencialmente iguales (por ejemplo, si una protema de la envuelta de un virus contiene motivos estructurales repetidos o se produce en una forma multimerica) o pueden ser diferentes (y en este ultimo caso, las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos descritos en el presente documento se dice que son “bi y/o multiparatopicos” y pueden unirse a tales diferentes determinantes antigenicos, epítopos, partes, dominios, subunidades de dicha protema de la envuelta de un virus con una afinidad y/o especificidad que pueden ser iguales o diferentes). Por consiguiente, los polipeptidos bi o multiparatopicos descritos en el presente documento estan dirigidos contra y/o se unen espedficamente a al menos dos epítopos de una protema de la envuelta de un virus, y son por ejemplo (pero sin limitarse a) polipeptidos que estan dirigidos contra y/o pueden unirse espedficamente a tres o incluso mas epítopos de la misma protema de la envuelta de un virus.
Por ejemplo, y generalmente, un polipeptido bivalente descrito en el presente documento puede comprender dos secuencias de aminoacidos descritas en el presente documento dirigidas contra un determinante antigenico, epítopo, parte o dominio de la protema de la envuelta viral que pueden ligarse de manera adecuada, por ejemplo mediante un ligador adecuado tal como se describe adicionalmente en el presente documento. Preferiblemente, tal polipeptido bivalente descrito en el presente documento es ademas tal que, cuando se une a la protema de la envuelta viral, es capaz de unirse simultaneamente a ambos determinantes antigenicos, epítopos, partes o dominios (es decir, mediante las dos secuencias de aminoacidos de la invencion capaces de unirse a dicho determinantes antigenicos, epítopos, partes o dominios). Ejemplos de tales polipeptidos bivalentes descritos en el presente documento quedaran claros a partir de la descripcion adicional en el presente documento. Los polipeptidos bivalentes no forman parte de la invencion reivindicada.
Un polipeptido trivalente de la invencion puede comprender tres secuencias de aminoacidos descritas en el presente documento dirigidas contra un determinante antigenico, epítopo, parte o dominio de la protema de la envuelta viral. Los polipeptidos multivalentes descritos en el presente documento pueden contener al menos dos secuencias de aminoacidos descritas en el presente documento dirigidas contra unos determinantes antigenicos, epítopos, partes o dominios de la protema de la envuelta viral. Generalmente, tales polipeptidos bivalentes, trivalentes y multivalentes pueden ser tal como se describen adicionalmente en el presente documento, y los diversos aspectos preferidos de la invencion tal como se describen en el presente documento tambien se aplican a estos polipeptidos bivalentes, trivalentes y multivalentes (por ejemplo, estos polipeptidos bivalentes, trivalentes y multivalentes comprenden preferiblemente dominios variables individuales y mas preferiblemente Nanobodies).
Las secuencias de aminoacidos y (en particular) los polipeptidos descritos en el presente documento son capaces de unirse a dos o mas determinantes antigenicos, epítopos, partes, dominios de una protema de la envuelta de un virus que son esencialmente iguales. En este contexto, las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos descritos en el presente documento tambien se denominan secuencias de aminoacidos y polipeptidos “multivalentes (monoespedficos)” (tales como, por ejemplo, “bivalentes (monoespedficos)” o “trivalentes (monoespedficos)”, etc.). Las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos multivalentes descritos en el presente documento pueden estar dirigidos contra cualquier determinante antigenico, epítopo, parte y/o dominio de la protema de la envuelta de un virus.
Las secuencias de aminoacidos y (en particular) los polipeptidos de la invencion pueden ser capaces de unirse a dos o mas determinates antigenicos, epítopos, partes, dominios diferentes de una protema de la envuelta de un virus. En este contexto, las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos de la invencion tambien se denominan secuencias de aminoacidos y polipeptidos “multiparatopicos” (tales como, por ejemplo, “biparatopicos” o “triparatopicos”, etc.). Las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos multiparatopicos de la invencion pueden estar dirigidos contra cualquier determinante antigenico, epítopo, parte y/o dominio de la protema de la envuelta de un virus.
Por ejemplo, y generalmente, un polipeptido biparatopico de la invencion puede comprender al menos una secuencia de aminoacidos descrita en el presente documento dirigida contra un primer determinante antigenico, epítopo, parte o dominio de la protema de la envuelta viral y al menos una secuencia de aminoacidos descrita en el presente documento dirigida contra un segundo determinante antigenico, epítopo, parte o dominio de la protema de la envuelta viral diferente del primer determinante antigenico, epítopo, parte o dominio (en el que dichas secuencias de aminoacidos pueden ligarse de manera adecuada, por ejemplo mediante un ligador adecuado tal como se describe adicionalmente en el presente documento). Preferiblemente, tal polipeptido biparatopico de la invencion es ademas tal que, cuando se une a la protema de la envuelta viral, es capaz de unirse simultaneamente al primer determinante antigenico, epítopo, parte o dominio (es decir, mediante la al menos una secuencia de aminoacidos capaz de unirse a dicho primer determinante antigenico, epítopo, parte o dominio) y unirse a dicho segundo determinante antigenico, epítopo, parte o dominio (es decir, mediante la al menos una secuencia de aminoacidos capaz de unirse a dicho segundo determinante antigenico, epítopo, parte o dominio). Ejemplos de tales polipeptidos biparatopicos de la invencion quedaran claros a partir de la descripcion adicional en el presente documento. Ademas, un polipeptido triparatopico de la invencion puede comprender al menos una secuencia de aminoacidos adicional descrita en el presente documento dirigida contra un tercer determinante antigenico, epítopo, parte o dominio de la protema de la envuelta viral (diferente tanto del primer determinante antigenico, epítopo, parte o dominio como del segundo), y generalmente los polipeptidos multiparatopicos de la invencion pueden contener al menos dos secuencias de aminoacidos descritas en el presente documento dirigidas contra al menos dos determinantes antigenicos diferentes, epítopos, partes o dominios de la protema de la envuelta viral. Generalmente, tales polipeptidos biparatopicos, triparatopicos y multiparatopicos de la invencion pueden ser tal como se describen adicionalmente en el presente documento, y los diversos aspectos preferidos de la invencion tal como se describen en el presente documento tambien se aplican a estos polipeptidos biparatopicos, triparatopicos y multiparatopicos de la invencion (por ejemplo, estos polipeptidos biparatopicos, triparatopicos y multiparatopicos de la invencion comprenden preferiblemente dominios variables individuales y mas preferiblemente Nanobodies).
En un aspecto preferido, pero no limitativo, las secuencias de aminoacidos y (en particular) los polipeptidos de la invencion son biparatopicos (o multiparatopicos) y estan dirigidos contra el sitio de union a Synagis® en la protema F de VRS y/o son capaces de competir con Synagis® por la union a la protema F de VRS, asf como contra al menos otro determinante antigenico, epítopo, parte o dominio en la protema F de VRS. Las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos de la invencion pueden estar dirigidos contra el sitio antigenico II (tambien denominado sitio A) de la protema F de VRS asf como contra al menos otro determinante antigenico, epítopo, parte o dominio en la protema F de VRS. En un aspecto preferido, las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos de la invencion estan dirigidos contra la region de aa 250-275 de la protema F de VRS asf como contra al menos otro determinante antigenico, epítopo, parte o dominio en la protema F de VRS.
Generalmente, tal polipeptido biparatopico (o multiparatopico) de la invencion contendra al menos una secuencia de aminoacidos descrita en el presente documento que es capaz de unirse al sitio de union a Synagis® en la protema F de VRS y/o sera capaz de competir con Synagis® por la union a la protema F de VRS (y, en particular, contra el sitio antigenico II (tambien denominado sitio A) de la protema F de VRS y mas preferiblemente contra la region de aa 250-275 de la protema F de VRS), asf como al menos una secuencia de aminoacidos adicional descrita en el presente documento que es capaz de unirse a al menos otro determinante antigenico, epítopo, parte o dominio en la protema F de VRS. Generalmente, tales polipeptidos biparatopicos (o multiparatopicos) de la invencion pueden ser tal como se describen adicionalmente en el presente documento, y los diversos aspectos preferidos de la invencion tal como se describen en el presente documento tambien se aplican a estos polipeptidos biparatopicos (o multiparatopicos) de la invencion (por ejemplo, estos polipeptidos biparatopicos y multiparatopicos de la invencion pueden comprender ligadores adecuados; son preferiblemente tales que pueden unirse simultaneamente al sitio de union a Synagis® y a al menos otro determinante antigenico, epítopo, parte o dominio en la protema F de VRS; y comprenden preferiblemente dominios variables individuales y mas preferiblemente Nanobodies).
Las secuencias de aminoacidos y (en particular) los polipeptidos de la invencion son biparatopicos (o multiparatopicos) y son al menos capaces, tras la union a la protema F de VRS, de neutralizar un virus (tal como se definen en el presente documento); para modular, reducir y/o inhibir la infectividad de un virus (tal como se definen en el presente documento); para modular y, en particular, inhibir y/o impedir la entrada viral (tal como se define adicionalmente en el presente documento) en una celula huesped diana; y/o para modular y, en particular, inhibir y/o impedir la replicacion viral (tal como se define adicionalmente en el presente documento) en una celula huesped diana mediante el mismo mecanismo de accion que Synagis®.
En otro aspecto preferido, pero no limitativo, las secuencias de aminoacidos y (en particular) los polipeptidos de la invencion pueden ser biparatopicos y estan dirigidos al menos contra el sitio de union a Synagis® en la protema F de VRS asf como contra el sitio de union a 101F en la protema F de VRS. Las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos de la invencion pueden estar dirigidos contra el sitio antigenico II (tambien denominado sitio A) de la protema F de VRS. Las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos de la invencion pueden estar dirigidos contra el sitio antigenico IV-VI de la protema F de VRS. Las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos de la invencion pueden estar dirigidos contra el sitio antigenico II (tambien denominado sitio A) de la protema F de VRS asf como contra el sitio antigenico IV-VI de la protema F de VRS. En un aspecto preferido, las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos de la invencion estan dirigidos contra la region de aa 250-275 de la protema F de VRS. En otro aspecto preferido, las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos de la invencion estan dirigidos contra la region de aa 250-275 de la protema F de VRS asf como contra la region de aa 423-436 de la protema F de VRS. En otro aspecto preferido, las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos de la invencion estan dirigidos contra la region de aa 423-436 de la protema F de VRS. En otro aspecto preferido, las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos de la invencion estan dirigidos contra el sitio antigenico II (tambien denominado sitio A) de la protema F de v Rs asf como contra la region de aa 423-436 de la protema F de VRS. En otro aspecto preferido, las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos de la invencion estan dirigidos contra la region de aa 250-275 de la protema F de VRS asf como contra el sitio antigenico IV-VI de la protema F de VRS.
Generalmente, tal polipeptido biparatopico (o multiparatopico) de la invencion contendra al menos una secuencia de aminoacidos de la invencion que es capaz de unirse al sitio de union a Synagis® en la protema F de VRS y/o sera capaz de competir con Synagis® por la union a la protema F de VRS (y, en particular, contra el sitio antigenico II (tambien denominado sitio A) de la protema F de VRS y mas preferiblemente contra la region de aa 250-275 de la protema F de VRS), asf como al menos una secuencia de aminoacidos descrita en el presente documento que es capaz de unirse al sitio de union a 101F en la protema F de VRS y/o sera capaz de competir con 101F por la union a la protema F de VRS (y, en particular, contra el sitio antigenico IV-VI de la protema F de VRS y mas preferiblemente contra la region de aa 423-436 de la protema F de VRS). Generalmente, tales polipeptidos biparatopicos (o multiparatopicos) de la invencion pueden ser tal como se describen adicionalmente en el presente documento, y los diversos aspectos preferidos de la invencion tal como se describen en el presente documento tambien se aplican a estos polipeptidos biparatopicos (o multiparatopicos) de la invencion (por ejemplo, estos polipeptidos biparatopicos y multiparatopicos de la invencion pueden comprender ligadores adecuados; son preferiblemente tales que pueden unirse simultaneamente al sitio de union a Synagis® y al sitio de union a l0 lF en la protema F de VRS; y comprenden preferiblemente dominios variables individuales y mas preferiblemente Nanobodies).
En otro aspecto preferido, pero no limitativo, las secuencias de aminoacidos y (en particular) los polipeptidos de la invencion son biparatopicos (o multiparatopicos) y son al menos capaces, tras la union a la protema F de VRS, de neutralizar un virus (tal como se definen en el presente documento); para modular, reducir y/o inhibir la infectividad de un virus (tal como se definen en el presente documento); para modular y, en particular, inhibir y/o impedir la entrada viral (tal como se define adicionalmente en el presente documento) en una celula huesped diana; y/o para modular y, en particular, inhibir y/o impedir la replicacion viral (tal como se define adicionalmente en el presente documento) en una celula huesped diana mediante el mismo mecanismo de accion que Synagis® y 101F.
De nuevo, los polipeptidos biparatopicos (o multiparatopicos) anteriores de la invencion pueden ser tal como se describen adicionalmente en el presente documento, y los diversos aspectos preferidos de la invencion tal como se describen en el presente documento tambien se aplican a estos polipeptidos biparatopicos (o multiparatopicos) de la invencion (por ejemplo, estos polipeptidos biparatopicos y multiparatopicos de la invencion pueden comprender ligadores adecuados; son preferiblemente tales que pueden unirse simultaneamente al sitio de union a Synagis® y al sitio de union a 101F; y comprenden preferiblemente dominios variables individuales y mas preferiblemente Nanobodies).
En otro aspecto preferido, pero no limitativo, las secuencias de aminoacidos y (en particular) los polipeptidos de la invencion pueden ser biparatopicos con ambos paratopos dirigidos contra el sitio de union a Synagis® en la protema F de VRS. Las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos de la invencion pueden estar dirigidos contra el sitio antigenico II (tambien denominado sitio A) de la protema F de VRS (un paratopo o ambos paratopos). En un aspecto preferido, las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos de la invencion estan dirigidos contra la region de aa 250-275 de la protema F de VRS (un paratopo o ambos paratopos).
De nuevo, los polipeptidos biparatopicos (o multiparatopicos) anteriores de la invencion pueden ser tal como se describen adicionalmente en el presente documento, y los diversos aspectos preferidos de la invencion tal como se describen en el presente documento tambien se aplican a estos polipeptidos biparatopicos (o multiparatopicos) de la invencion (por ejemplo, estos polipeptidos biparatopicos y multiparatopicos de la invencion pueden comprender ligadores adecuados; son preferiblemente tales que pueden unirse simultaneamente a ambos sitios de union; y comprenden preferiblemente dominios variables individuales y mas preferiblemente Nanobodies).
Ademas, los polipeptidos de la presente invencion tambien pueden estar dirigidos contra y/o pueden unirse espedficamente a al menos una protema de la envuelta particular de un virus que es la protema F de VRS y al menos un epítopo adicional de otra diana, que es diferente de dicha al menos una protema de la envuelta particular. Por ejemplo (pero sin limitarse a), los polipeptidos de la presente invencion pueden estar dirigidos contra y/o pueden unirse espedficamente a al menos una protema de la envuelta particular de un virus que es la protema F de VRS y al menos un epítopo adicional de un virus, por ejemplo al menos un epítopo adicional de una protema viral, tal como al menos un epítopo adicional de otra protema de la envuelta viral particular. Por tanto, los polipeptidos segun la invencion pueden estar dirigidos contra y/o pueden unirse espedficamente a al menos dos (o incluso mas) epítopos de al menos dos protemas de la envuelta diferentes. Ademas, dicho al menos un epítopo adicional de un virus puede participar o no en una o mas de las rutas biologicas mediadas por virus, en las que participa una protema de la envuelta de un virus y/o su receptor viral; mas espedficamente dicho al menos un epítopo adicional de un virus puede participar o no en la entrada viral en una celula huesped diana, tal como la fijacion del virion a una celula huesped diana y/o la fusion viral con una celula huesped diana o dicho al menos un epítopo adicional de un virus puede participar o no en la replicacion viral en una celula huesped diana, tal como la transcripcion viral y/o la traduccion viral y/o el empaquetamiento viral y/o la formacion de viriones funcionales y/o la gemacion de viriones nacientes desde la membrana de la celula huesped diana.
Generalmente, los polipeptidos multivalentes (tal como se definen en el presente documento), bi y multiespedficos (tal como se definen en el presente documento) y bi y multiparatopicos (tal como se definen en el presente documento) segun la invencion pueden ser utiles para la prevencion y/o el tratamiento de enfermedades virales al unirse espedficamente a al menos un epítopo de una protema de la envuelta de un virus que es la protema F de VRS y al menos un epítopo adicional (que puede ser diferente o no de dicho al menos un epítopo) de una diana, en los que dicha diana puede ser diferente o no de dicha protema de la envuelta.
Preferiblemente, los polipeptidos bi y multiparatopicos (tal como se definen en el presente documento) segun la invencion pueden ser utiles para la prevencion y/o el tratamiento de enfermedades virales al unirse espedficamente a al menos dos (o incluso mas) epítopos (que pueden ser iguales o diferentes) en la misma protema de la envuelta de un virus.
Alternativamente, los polipeptidos de la presente invencion pueden estar dirigidos contra y/o pueden unirse espedficamente a al menos un epítopo de una protema de la envuelta de un virus que es la protema F de VRS y al menos un epítopo adicional de otra diana, que es diferente de dicha protema de la envuelta particular y que es, por ejemplo, un epítopo adicional de un virus, tales como un epítopo adicional de una protema viral o un epítopo adicional de otra protema de la envuelta viral particular.
En otro aspecto preferido, las secuencias de aminoacidos y (en particular) los polipeptidos de la invencion son capaces de unirse a tres determinantes antigenicos, epítopos, partes, dominios de una protema de la envuelta de un virus. En este contexto, las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos de la invencion tambien se denominan secuencias de aminoacidos y polipeptidos “trivalentes”.
Por ejemplo, y generalmente, un polipeptido trivalente de la invencion puede comprender tres secuencias de aminoacidos descritas en el presente documento dirigidas contra el mismo determinante antigenico, epítopo, parte o dominio de la protema de la envuelta viral (en el que dichas secuencias de aminoacidos pueden ligarse de manera adecuada, por ejemplo mediante un ligador adecuado tal como se describe adicionalmente en el presente documento). Preferiblemente, tal polipeptido trivalente de la invencion es ademas tal que, cuando se une a la protema de la envuelta viral, es capaz de unirse simultaneamente al primer determinante antigenico, epítopo, parte o dominio (es decir, mediante la al menos una secuencia de aminoacidos capaz de unirse a dicho primer determinante antigenico, epítopo, parte o dominio), unirse a dicho segundo determinante antigenico, epítopo, parte o dominio (es decir, mediante la al menos una secuencia de aminoacidos capaz de unirse a dicho segundo determinante antigenico, epítopo, parte o dominio) y unirse a dicho tercer determinante antigenico, epítopo, parte o dominio (es decir, mediante la al menos una secuencia de aminoacidos capaz de unirse a dicho tercer determinante antigenico, epítopo, parte o dominio). Ejemplos de tales polipeptidos trivalentes de la invencion quedaran claros a partir de la descripcion adicional en el presente documento. Generalmente, tales polipeptidos trivalentes de la invencion pueden ser tal como se describen adicionalmente en el presente documento, y los diversos aspectos preferidos de la invencion tal como se describen en el presente documento tambien se aplican a estos polipeptidos trivalentes de la invencion (por ejemplo, estos polipeptidos trivalentes de la invencion comprenden preferiblemente dominios variables individuales y mas preferiblemente Nanobodies).
Las secuencias de aminoacidos y (en particular) los polipeptidos de la invencion son trivalentes y comprenden tres secuencias de aminoacidos descritas en el presente documento dirigidas contra el sitio de union a Synagis® en la protema F de VRS y/o son capaces de competir con Synagis por la union a la protema F de VRS. Las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos que estan dirigidos contra el sitio de union a Synagis® en la protema F de VRS pueden estar dirigidos contra el sitio antigenico II (tambien denominado sitio A) de la protema F de VRS. En un aspecto preferido, las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos que estan dirigidos contra el sitio de union a Synagis® en la protema F de VRS estan dirigidas contra la region de aa 250-275 de la protema F de VRS. Generalmente, tal polipeptido trivalente de la invencion contendra tres secuencias de aminoacidos descritas en el presente documento que son capaces de unirse al sitio de union a Synagis® en la protema F de VRS y/o son capaces de competir con Synagis® por la union a la protema F de VRS (y, en particular, contra el sitio antigenico II (tambien denominado sitio A) de la protema F de VRS y mas preferiblemente contra la region de aa 250-275 de la protema F de VRS). Generalmente, tales polipeptidos trivalentes de la invencion pueden ser tal como se describen adicionalmente en el presente documento, y los diversos aspectos preferidos de la invencion tal como se describen en el presente documento tambien se aplican a estos polipeptidos trivalentes de la invencion (por ejemplo, estos polipeptidos trivalentes de la invencion pueden comprender ligadores adecuados; son preferiblemente tales que pueden unirse simultaneamente al sitio de union a Synagis®; y comprenden preferiblemente dominios variables individuales y mas preferiblemente Nanobodies).
Las secuencias de aminoacidos y (en particular) los polipeptidos de la invencion son trivalentes y son al menos capaces, tras la union a la protema F de VRS, de neutralizar un virus (tal como se definen en el presente documento); para modular, reducir y/o inhibir la infectividad de un virus (tal como se definen en el presente documento); para modular y, en particular, inhibir y/o impedir la entrada viral (tal como se define adicionalmente en el presente documento) en una celula huesped diana; y/o para modular y, en particular, inhibir y/o impedir la replicacion viral (tal como se define adicionalmente en el presente documento) en una celula huesped diana mediante el mismo mecanismo de accion que Synagis®.
Se facilitan constructos bivalentes y trivalentes preferidos descritos en el presente documento en la tabla C-6 y la tabla A-2.
Preferiblemente, tales polipeptidos bi, tri y multivalentes, bi, tri y multiespedficos, y/o bi, tri y multiparatopicos, tal como se comento anteriormente en el presente documento, se uniran a una protema de la envuelta de un virus con avidez aumentada en comparacion con una unica secuencia de aminoacidos.
Mas espedficamente, los polipeptidos bi, tri y multiparatopicos y/o polipeptidos bi, tri y multiespedficos segun la invencion pueden ser utiles en la seleccion como diana de multiples sitios de union a receptor viral en los mismos y en diferentes protemas de la envuelta, respectivamente, lo que puede dar como resultado una potencia aumentada de neutralizacion viral (tal como se define en el presente documento) en comparacion con una unica secuencia de aminoacidos descrita en el presente documento. Ademas, los polipeptidos tri y multivalentes, bi, tri y multiespedficos y/o bi, tri y multiparatopicos segun la invencion pueden ser utiles en la union a diferentes genotipos, diferentes subtipos y/o diferentes cepas de un determinado virus. Ademas, los polipeptidos tri y multivalentes, bi, tri y multiespedficos y/o tri y multiparatopicos segun la invencion pueden ser utiles en impedir el escape viral y/o la evasion viral.
Finalmente, los polipeptidos tri y multivalentes, bi, tri y multiespedficos y/o bi, tri y multiparatopicos segun la invencion pueden ser utiles en la prevencion y/o la inhibicion de la infeccion viral y/o la fusion viral de un virion con su celula huesped diana (tal como se define en el presente documento) o pueden ser utiles en la neutralizacion de un virus induciendo la agregacion de viriones de dicho virus.
Generalmente, las secuencias de aminoacidos segun la presente invencion pueden usarse para modular, y, en particular, inhibir y/o impedir, la interaccion entre una protema de la envuelta de un virus y una pareja de union (por ejemplo, receptor viral, celula huesped diana, un componente de membrana celular particular u otra pareja de union, segun sea aplicable) y, por tanto, para modular y, en particular, inhibir, impedir o modular ruta(s) biologica(s) mediada(s) por virus en las que participan una protema de la envuelta de un virus y/o un receptor viral. Por tanto, por ejemplo, cuando dicha protema de la envuelta forma parte de un par de union, las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos pueden ser tales que compiten con la pareja de union (por ejemplo, receptor viral u otra pareja de union, segun sea aplicable) por la union a dicha protema de la envuelta, y/o tales que neutralizan (completa o parcialmente) la union de la pareja de union a dicha protema de la envuelta.
En este contexto, se prefiere que las secuencias de aminoacidos segun la invencion puedan competir con una celula huesped diana por la union a dicha protema de la envuelta.
Cuando las secuencias de aminoacidos segun la invencion compiten con una celula huesped diana por la union a dicha protema de la envuelta, dichas secuencias de aminoacidos segun la invencion pueden competir, por ejemplo, con componentes de membrana celular particulares de dicha celula huesped diana, tales como receptores virales, fosfolfpidos, protemas y/o glicoprotemas, por la union a dicha protema de la envuelta.
Las secuencias de aminoacidos segun la presente invencion pueden usarse generalmente para modular, y, en particular, inhibir y/o impedir, la interaccion entre una protema de la envuelta de un virus que es la protema F de VRS y una celula huesped diana.
Cuando las secuencias de aminoacidos segun la invencion modulan, y, en particular, inhiben y/o impiden, la interaccion entre una protema de la envuelta de un virus y una celula huesped diana, dichas secuencias de aminoacidos segun la invencion pueden modular, por ejemplo, y, en particular, inhiben y/o impiden, la interaccion entre una protema de la envuelta de un virus y componentes de membrana celular particulares de dicha celula huesped diana, tales como receptores virales, fosfolfpidos, protemas y/o glicoprotemas, por la union a dicha protema de la envuelta.
Las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos de la invencion pueden usarse generalmente para modular, y, en particular, inhibir y/o impedir cualquiera de las interacciones anteriores entre una protema de la envuelta de un virus y componentes de membrana celular particulares de dicha celula huesped diana, tales como receptores virales, fosfoftpidos, protemas y/o glicoprotemas.
Ademas, las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos segun la invencion tambien pueden competir con al menos una pareja de union de una protema de la envuelta de un virus (que es diferente de su receptor viral natural) por la union a dicha protema de la envuelta. Con al menos una pareja de union de una protema de la envuelta quiere decirse generalmente cualquier molecula que esta dirigida contra y/o se une espedficamente a dicha protema de la envuelta. Por ejemplo, una pareja de union de una protema de la envuelta puede ser una inmunoglobulina, tal como un anticuerpo y puede ser mas espedficamente un anticuerpo monoclonal o cualquier fragmento del mismo que pueda unirse espedficamente a dicha protema de la envuelta. En este contexto, las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos segun la invencion pueden competir con un anticuerpo monoclonal que esta dirigido contra y/o se une espedficamente a una protema de la envuelta por la union a dicha protema de la envuelta. Por ejemplo, las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos segun la invencion pueden competir con el anticuerpo monoclonal Synagis® (Zhao y Sullender J. Virol. 79: 396 (2005)) que esta dirigido contra y/o se une espedficamente al sitio antigenico A y/o los aminoacidos 255 a 280 de la protema F del virus VRS por la union a dicha protema F del virus VRS; y/o las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos descritos en el presente documento pueden competir con el anticuerpo monoclonal 9C5 (Krivitskaia et al., Vopr. Virusol. 44: 279 (1999)) que esta dirigida contra y/o se une espedficamente al sitio F1a y/o la region que comprende el aminoacido 389 de la protema F del virus VRS por la union a dicha protema F del virus VRS; y/o las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos descritos en el presente documento pueden competir con el fragmento Fab, 101F (Wu et al., J. Gen Virol. 88: 2719 (2007)) que esta dirigido contra y/o se une espedficamente a los aminoacidos 422 a 438 de la protema F del virus VRS por la union a dicha protema F del virus v Rs .
En este contexto, los polipeptidos bi, tri y multiparatopicos tal como se describio anteriormente, pueden competir con al menos una, al menos dos, al menos tres (o incluso mas) parejas de union de al menos una, al menos dos, al menos tres (o incluso mas) protemas de la envuelta de un virus por la union a dichas protemas de la envuelta, en el que dichas parejas de union pueden ser cualquier molecula que este dirigida contra y/o se una espedficamente a dichas protemas de la envuelta, tales como por ejemplo, una inmunoglobulina, tal como un anticuerpo y mas espedficamente un anticuerpo monoclonal o cualquier fragmento del mismo que pueda unirse espedficamente a dicha protema de la envuelta. Por ejemplo, dichos polipeptidos bi, tri o multiparatopicos pueden competir con el anticuerpo monoclonal Synagis® (tal como se describio anteriormente) y/o el anticuerpo monoclonal 9C5 (tal como se describio anteriormente) y/o el fragmento Fab, 101F Fab o cualquier combinacion adecuada de los mismos, por la union a la protema F del virus VRS.
Las secuencias de aminoacidos, los polipeptidos y las composiciones de la presente invencion estan dirigidos contra un epítopo de una protema de la envuelta de un virus que es la protema F de VRS, de tal manera que se inhibe, se impide y/o se modula la entrada viral en una celula huesped diana (tal como por ejemplo la fusion viral con una celula huesped diana).
Ademas, en particular, las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos de la invencion pueden estar dirigidos preferiblemente contra un sitio de interaccion, que se elige del grupo que consiste en el sitio antigenico A y/o los aminoacidos 255 a 280 de la protema F del virus VRS.
Los aminoacidos y polipeptidos de la invencion estan dirigidos contra el sitio de union a Synagis® en la protema F de VRS y/o son capaces de competir con Synagis® por la union a la protema F de VRS. En particular, pueden estar dirigidos contra el sitio antigenico II (tambien denominado sitio A) de la protema F de VRS y mas preferiblemente contra la region de aa 250-275 de la protema F de VRS.
Las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos de la invencion estan dirigidos generalmente contra el epítopo mencionado anteriormente de una protema de la envuelta de un virus, y son tal como se definen adicionalmente en el presente documento. Dicho epítopo esta presente en una protema de la envuelta de un virus que es la protema F del virus VRS.
Tambien esta dentro del alcance de la invencion que, cuando sea aplicable, una secuencia de aminoacidos de la invencion puede unirse a dos o mas determinantes antigenicos, epítopos, partes, dominios, subunidades o conformaciones de dicha protema de la envuelta de un virus. En tal caso, los determinantes antigenicos, epítopos, partes, dominios o subunidades de dicha protema de la envuelta de un virus a los que se unen las secuencias de aminoacidos y/o polipeptidos de la invencion pueden ser esencialmente iguales (por ejemplo, si dicha protema de la envuelta de un virus contiene motivos estructurales repetidos o se produce en una forma multimerica). Ademas, por ejemplo, cuando dicha protema de la envuelta de un virus existe en una conformacion activada y en una conformacion inactiva o una conformacion o un estado previo a la fusion y otro posterior a la fusion, las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos de la invencion pueden unirse a una cualquiera de estas conformaciones o estados, o pueden unirse a ambos estas conformaciones o estados (es decir, con una afinidad y/o especificidad que pueden ser iguales o diferentes).
Tambien se espera que las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos de la invencion se uniran generalmente a todos los analogos, variantes, mutantes, alelos, partes y fragmentos que se producen de manera natural o sinteticos de dicha protema de la envuelta de un virus; o al menos a aquellos analogos, variantes, mutantes, alelos, partes y fragmentos de dicha protema de la envuelta de un virus que contienen uno o mas determinates antigenicos o epttopos que son esencialmente iguales al/a los determinante(s) antigenico(s) o epítopo(s) a los que unen las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos de la invencion a dicha protema de la envuelta de un virus (por ejemplo, en protemas de la envuelta viral de tipo natural). De nuevo, en tal caso, las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos de la invencion pueden unirse a tales analogos, variantes, mutantes, alelos, partes y fragmentos con una afinidad y/o especificidad que son iguales que, o que son diferentes de (es decir, mayores que o menores que), la afinidad y especificidad con que las secuencias de aminoacidos de la invencion se unen a dicha protema de la envuelta (de tipo natural) de un virus. Tambien esta incluido dentro del alcance de la invencion que las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos de la invencion se unan a algunos analogos, variantes, mutantes, alelos, partes y fragmentos de dicha protema de la envuelta de un virus, pero a otros no.
En un aspecto espedfico de la invencion, las secuencias de aminoacidos son multivalentes (tales como trivalentes) y muestran afinidad mejorada y/o reactividad cruzada mejorada para diferentes genotipos, subtipos, mutantes de escape virales y/o cepas de un determinado virus en comparacion con la secuencia de aminoacidos monovalente. En aun otro aspecto, las secuencias de aminoacidos estan dirigidas contra VRS y pueden unirse a diferentes cepas de VRS (tales como, por ejemplo, Long, A-2 y/o B-1). En aun otro aspecto, las secuencias de aminoacidos estan dirigidas contra VRS y pueden unirse a diferentes mutantes de escape de VRS (tales como, por ejemplo, los descritos en Lopez et al. 1998, J. Virol. 72: 6922-6928) y/o mutantes de escape espedficos para el sitio antigenico II, el sitio antigenico IV-VI o la combinacion de ambos sitios antigenicos.
Cuando dicha protema de la envuelta de un virus existe en una forma monomerica y en una o mas formas multimericas, esta dentro del alcance de la invencion que las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos de la invencion solamente se unan a dicha protema de la envuelta de un virus en forma monomerica, solamente se unan a dicha protema de la envuelta de un virus en forma multimerica, o se unan tanto a la forma monomerica como a la forma multimerica. De nuevo, en tal caso, las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos de la invencion pueden unirse a la forma monomerica con una afinidad y/o especificidad que son iguales que, o que son diferentes de (es decir, mayores que o menores que), la afinidad y especificidad con que las secuencias de aminoacidos de la invencion se unen a la forma multimerica.
Por ejemplo, cuando la protema de la envuelta de un virus existe en una forma monomerica y en formas trimericas, esta dentro del alcance de la invencion que las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos de la invencion solamente se unan a dicha protema de la envuelta de un virus en forma monomerica, solamente se unan a dicha protema de la envuelta de un virus en forma trimerica, o se unan tanto a la forma monomerica como a la forma trimerica. De nuevo, en tal caso, las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos de la invencion pueden unirse a la forma monomerica con una afinidad y/o especificidad que son iguales que, o que son diferentes de (es decir, mayores que o menores que), la afinidad y especificidad con que las secuencias de aminoacidos de la invencion se unen a la forma trimerica.
Ademas, cuando dicha protema de la envuelta de un virus puede asociarse con otras protemas o polipeptidos para formar complejos de protema (por ejemplo, con multiples subunidades), esta dentro del alcance de la invencion que las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos de la invencion se unan a dicha protema de la envuelta de un virus en su estado no asociado, se unan a dicha protema de la envuelta de un virus en su estado asociado, o se unan a ambos.
En todos estos casos, las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos de la invencion pueden unirse a tales multfmeros o complejos de protema asociados con una afinidad y/o especificidad que pueden ser iguales que o diferentes de (es decir, mayores que o menores que) la afinidad y/o especificidad con que las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos de la invencion se unen a dicha protema de la envuelta de un virus en su estado monomerico y no asociado.
Ademas, tal como le quedara claro al experto, protemas o polipeptidos que contienen dos o mas secuencias de aminoacidos dirigidas contra dicha protema de la envuelta de un virus pueden unirse con mayor avidez a dicha protema de la envuelta de un virus que la(s) secuencia(s) de aminoacidos monomerica(s) correspondiente(s). Por ejemplo, y sin limitacion, protemas o polipeptidos que contienen dos o mas secuencias de aminoacidos dirigidas contra diferentes epítopos de dicha protema de la envuelta de un virus pueden unirse (y habitualmente se uniran) con mayor avidez que cada uno de los diferentes monomeros, y protemas o polipeptidos que contienen dos o mas secuencias de aminoacidos dirigidas contra dicha protema de la envuelta de un virus pueden unirse (y habitualmente se uniran) tambien con mayor avidez a un multimero (tal como, por ejemplo, un tnmero) de dicha protema de la envuelta de un virus.
Generalmente, se uniran secuencias de aminoacidos y polipeptidos de la invencion al menos a aquellas formas de dicha protema de la envuelta de un virus (incluyendo formas monomericas, multimericas y asociadas) que son las mas relevantes desde un punto de vista biologico y/o terapeutico, tal como le quedara claro al experto.
Tambien esta dentro del alcance de la invencion usar derivados de las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos de la invencion, y/o usar protemas o polipeptidos que comprenden o que consisten esencialmente en uno o mas de tales derivados, siempre que estos sean adecuados para los usos previstos en el presente documento. Tales derivados contendran habitualmente (al menos parte de) un sitio de union a antigeno funcional para la union a dicha protema de la envuelta de un virus; y mas preferiblemente seran capaces de unirse de manera espedfica a dicha protema de la envuelta de un virus, y incluso mas preferiblemente capaces de unirse a dicha protema de la envuelta de un virus con una afinidad (de manera adecuada medida y/o expresada como un valor de Kd (real o aparente), un valor de Ka (real o aparente), una velocidad de asociacion y/o una velocidad de disociacion, o alternativamente como valor de CI50, tal como se describe adicionalmente en el presente documento) que es tal como se define en el presente documento. Algunos ejemplos no limitativos de tales derivados, protemas y/o polipeptidos quedaran claros a partir de la descripcion adicional en el presente documento.
En un aspecto espedfico, pero no limitativo de la invencion, que se describira adicionalmente en el presente documento, tales derivados tienen una semivida en suero aumentada (tal como se describe adicionalmente en el presente documento) en comparacion con la secuencia de aminoacidos de la que derivan. Por ejemplo, una secuencia de aminoacidos de la invencion pueden ligarse (qmmicamente o de otro modo) a uno o mas grupos o restos que prolongan la semivida (tales como PEG), para proporcionar un derivado de una secuencia de aminoacidos de la invencion con semivida aumentada.
En un aspecto espedfico, pero no limitativo, la secuencia de aminoacidos de la invencion pueden ser una secuencia de aminoacidos que comprende un plegamiento de inmunoglobulina o puede ser una secuencia de aminoacidos que, en condiciones adecuadas (tales como condiciones fisiologicas) es capaz de formar un plegamiento de inmunoglobulina (es decir, mediante plegamiento). Se hace referencia, entre otros, a la revision en Halaby et al. (1999, Protein Eng. 12: 563-71). Preferiblemente, cuando se pliega apropiadamente para formar un plegamiento de inmunoglobulina, tal secuencia de aminoacidos es capaz de unirse de manera espedfica (tal como se define en el presente documento) a dicha protema de la envuelta de un virus; y mas preferiblemente capaz de unirse a dicha protema de la envuelta de un virus con una afinidad (de manera adecuada medida y/o expresada como un valor de Kd (real o aparente), un valor de Ka (real o aparente), una velocidad de asociacion y/o una velocidad de disociacion, o alternativamente como valor de CI50, tal como se describe adicionalmente en el presente documento) que es tal como se define en el presente documento. Ademas, partes, fragmentos, analogos, mutantes, variantes, alelos y/o derivados de tales secuencias de aminoacidos son preferiblemente tales que comprenden un plegamiento de inmunoglobulina o son capaces de formar, en condiciones adecuadas, un plegamiento de inmunoglobulina.
En particular, las secuencias de aminoacidos de la invencion pueden ser secuencias de aminoacidos que consisten esencialmente en 4 regiones de entramado (FR1 a FR4 respectivamente) y 3 regiones determinantes de complementariedad (CDR1 a CDR3 respectivamente).
Las secuencias de aminoacidos de la invencion pueden ser en particular una secuencia de inmunoglobulina o un fragmento adecuado de la misma y, mas en particular, ser una secuencia de dominio variable de inmunoglobulina, tal como una secuencia de dominio variable de cadena pesada (por ejemplo, una secuencia de Vh). Cuando la secuencia de aminoacidos de la invencion es una secuencia de dominio variable de cadena pesada, puede ser una secuencia de dominio variable de cadena pesada que deriva de un anticuerpo de cuatro cadenas convencional (tal como, sin limitacion, una secuencia de Vh que deriva de un anticuerpo humano) o ser una denominada secuencia de Vhh (tal como se define en el presente documento) que deriva de un denominado “anticuerpo de cadena pesada” (tal como se define en el presente documento).
Sin embargo, debe indicarse que la invencion no esta limitada en cuanto al origen de la secuencia de aminoacidos de la invencion (o de la secuencia de nucleotidos de la invencion usada para expresarla), ni en cuanto al modo en que se genera u obtiene (o se ha generado u obtenido) la secuencia de aminoacidos o secuencia de nucleotidos de la invencion. Por tanto, las secuencias de aminoacidos de la invencion pueden ser secuencias de aminoacidos que se producen de manera natural (a partir de cualquier especie adecuada) o secuencias de aminoacidos sinteticas o semisinteticas. En un aspecto espedfico pero no limitativo de la invencion, la secuencia de aminoacidos es una secuencia de inmunoglobulina que se produce de manera natural (a partir de cualquier especie adecuada) o una secuencia de inmunoglobulina sintetica o semisintetica, incluyendo pero sin limitarse a secuencias de inmunoglobulina “humanizadas” (tal como se define en el presente documento) (tales como secuencias de inmunoglobulina de raton o conejo parcial o completamente humanizadas y, en particular, secuencias de Vhh parcial o completamente humanizadas o Nanobodies), secuencias de inmunoglobulina “camelizadas” (tal como se define en el presente documento), asf como secuencias de inmunoglobulina que se han obtenido mediante tecnicas tales como maduracion por afinidad (por ejemplo, partiendo de secuencias de inmunoglobulina sinteticas, al azar o que se producen de manera natural), injerto de CDR, remodelacion, combinacion de fragmentos derivados de diferentes secuencias de inmunoglobulina, ensamblaje por PCR usando cebadores solapantes, y tecnicas similares para modificar por ingeniena genetica secuencias de inmunoglobulina que conoce bien el experto; o cualquier combinacion adecuada de cualquiera de los anteriores. Por ejemplo, se hace referencia a los manuales convencionales, asf como a la descripcion adicional y tecnica anterior mencionada en el presente documento.
De manera similar, las secuencias de nucleotidos de la invencion pueden ser secuencias de nucleotidos que se producen de manera natural o secuencias sinteticas o semisinteticas y pueden ser, por ejemplo, secuencias que se afslan mediante PCR a partir de una plantilla adecuada que se produce de manera natural (por ejemplo, ADN o ARN aislado de una celula), secuencias de nucleotidos que se han aislado de una biblioteca (y en particular, una biblioteca de expresion), secuencias de nucleotidos que se han preparado introduciendo mutaciones en una secuencia de nucleotidos que se produce de manera natural (usando cualquier tecnica adecuada conocida per se, tal como PCR de apareamiento erroneo), secuencias de nucleotidos que se han preparado mediante PCR usando cebadores solapantes, o secuencias de nucleotidos que se han preparado usando tecnicas para smtesis de ADN conocidas per se.
La secuencia de aminoacidos puede ser en particular un anticuerpo de dominios (o una secuencia de aminoacidos que es adecuada para su uso como anticuerpo de dominios), un anticuerpo de un solo dominio (o una secuencia de aminoacidos que es adecuada para su uso como anticuerpo de un solo dominio), un “dAb” (o una secuencia de aminoacidos que es adecuada para su uso como dAb) o un Nanobody (tal como se define en el presente documento, e incluyendo pero sin limitarse a una secuencia de Vhh), otros dominios variables individuales, o cualquier fragmento adecuado de uno cualquiera de los mismos. Para una descripcion general de anticuerpos de dominios (o un solo dominio), tambien se hace referencia a la tecnica anterior citada anteriormente, asf como al documento EP 0368684. Para el termino “dAb”, por ejemplo, se hace referencia a Ward et al. (Nature 12 de oct. de 1989; 341 (6242): 544-6), a Holt et al., Trends Biotechnol., 2003, 21(11):484-490; asf como, por ejemplo, a los documentos WO 06/030220, WO 06/003388 y otras solicitudes de patente publicadas de Domantis Ltd. Tambien debe observarse que, aunque se prefiere menos en el contexto de la presente invencion porque no se originan a partir de mairnferos, los anticuerpos de un solo dominio o dominios variables individuales pueden derivar de determinadas especies de tiburon (por ejemplo, los denominados “dominios IgNAR”, vease por ejemplo el documento WO 05/18629).
En particular, la secuencia de aminoacidos puede ser un Nanobody®. [Nota: Nanobody®, Nanobodies® y Nanoclone® son marcas registradas de Ablynx N. V.]
Para una descripcion general de los Nanobodies, se hace referencia a la descripcion adicional a continuacion, asf como a la tecnica anterior citada en el presente documento. A este respecto, debe observarse sin embargo que esta descripcion y la tecnica anterior describieron principalmente Nanobodies de la denominada “clase Vh3” (es decir, Nanobodies con un alto grado de homologfa de secuencia con secuencias de lmea germinal humana de la clase Vh3 tales como DP-47, DP-51 o DP-29). Debe observarse sin embargo que la divulgacion cubre generalmente cualquier tipo de Nanobody dirigido contra una protema de la envuelta de un virus y, por ejemplo, tambien cubre los Nanobodies pertenecientes a la denominada “clase Vh4” (es decir, Nanobodies con un alto grado de homologfa de secuencia con secuencias de lmea germinal humana de la clase Vh4 tales como DP-78), tal como se describe, por ejemplo, en el documento WO 07/118670.
Generalmente, los Nanobodies (en particular secuencias de Vhh y Nanobodies parcialmente humanizados) pueden caracterizarse en particular por la presencia de uno o mas “residuos distintivos” (tal como se describe en el presente documento) en una o mas de las secuencias de entramado (de nuevo tal como se describe adicionalmente en el presente documento).
Por tanto, generalmente, un Nanobody puede definirse como una secuencia de aminoacidos con la estructura (general)
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
en la que FR1 a FR4 se refieren a las regiones de entramado 1 a 4, respectivamente, y en la que CDR1 a CDR3 se refieren a las regiones determinantes de complementariedad 1 a 3, respectivamente, y en la que uno o mas de los residuos distintivos son tal como se definen adicionalmente en el presente documento.
En particular, un Nanobody puede ser una secuencia de aminoacidos con la estructura (general)
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
en la que FR1 a FR4 se refieren a las regiones de entramado 1 a 4, respectivamente, y en la que CDR1 a CDR3 se refieren a las regiones determinantes de complementariedad 1 a 3, respectivamente, y en la que las secuencias de entramado son tal como se definen adicionalmente en el presente documento.
Mas en particular, un Nanobody puede ser una secuencia de aminoacidos con la estructura (general)
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
en la que FR1 a FR4 se refieren a las regiones de entramado 1 a 4, respectivamente, y en la que CDR1 a CDR3 se refieren a las regiones determinantes de complementariedad 1 a 3, respectivamente, y en la que:
i) preferiblemente uno o mas de los residuos de aminoacido en las posiciones 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 y 108 segun la numeracion de Kabat se eligen de los residuos distintivos mencionados en la tabla B-2 a continuacion; y en la que:
ii) dicha secuencia de aminoacidos tiene una identidad de aminoacidos de al menos el 80 % con al menos una de las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 1 a 22, en la que con los propositos de determinar el grado de identidad de aminoacidos, los residuos de aminoacido que forman las secuencias de CDR (indicadas con X en las secuencias de las SEQ ID NO: 1 a 22) no se tienen en cuenta.
En estos Nanobodies, las secuencias de CDR son generalmente tal como se definen adicionalmente en el presente documento.
Por tanto, la divulgacion tambien se refiere a tales Nanobodies que pueden unirse a (tal como se define en el presente documento) y/o estan dirigidos contra una protema de la envuelta de un virus, a fragmentos adecuados de los mismos, asf como a polipeptidos que comprenden o consisten esencialmente en uno o mas de tales Nanobodies y/o fragmentos adecuados.
Las SEQ ID NO 158 a 236, 248 a 407, 2448 y 2574 a 2581 (vease la tabla A-1) facilitan las secuencias de aminoacidos de varias secuencias de Vhh que se han producido contra la protema F de VRS.
Tabla A-1: Secuencias de Vhh o secuencias de Nanobody preferidas (tambien denominadas en el presente documento secuencia con un nombre particular o SEQ ID NO: X, en la que X es un numero que hace referencia a la secuencia de aminoacidos relevante):
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En la tabla A-1 anterior, las SEQ ID NO: 158 a 236, 248 a 407, 2448 y 2574 a 2581 se refieren a secuencias de aminoacidos que estan dirigidas a y/o se unen espedficamente a la protema F de VRSh.
Por consiguiente, algunos Nanobodies son Nanobodies que pueden unirse (tal como se define adicionalmente en el presente documento) a y/o estan dirigidos contra una protema de la envuelta de un virus y que:
i) tienen una identidad de aminoacidos de al menos el 80 % con al menos una de las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 158 a 236, 248 a 407, 2448 y 2574 a 2581 (vease la tabla A-1), en los que con los propositos de determinar el grado de identidad de aminoacidos, no se tienen en cuenta los residuos de aminoacido que forman las secuencias de CDR. A este respecto, tambien se hace referencia a la tabla B-1, que enumera las secuencias de entramado 1 (las SEQ ID NO: 439 a 518, 530 a 689, 2466 y 2582 a 2589), las secuencias de entramado 2 (las SEQ ID NO: 1004 a 1082, 1094 a 1253, 2502 y 2598 a 2605), las secuencias de entramado 3 (las SEQ ID NO: 1568 a 1646, 1658 a 1817, 2538 y 2614 a 2621) y las secuencias de entramado 4 (las SEQ ID NO: 2132 a 2210, 2222 a 2381, 2573 y 2630 a 2637) de los Nanobodies de las SEQ ID NO: 158 a 236, 248 a 407, 2448 y 2574 a 2581 (vease la tabla A-1) (con respecto a los residuos de aminoacido en las posiciones 1 a 4 y 27 a 30 de las secuencias de entramado 1, tambien se hace referencia a los comentarios realizados a continuacion. Por tanto, para determinar el grado de identidad de aminoacidos, preferiblemente no se tienen en cuenta estos residuos);
y en los que:
ii) preferiblemente uno o mas de los residuos de aminoacido en las posiciones 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 y 108 segun la numeracion de Kabat se eligen de los residuos distintivos mencionados en la tabla B-2 a continuacion. En estos Nanobodies, las secuencias de CDR son generalmente tal como se definen adicionalmente en las reivindicaciones.
De nuevo, tales Nanobodies pueden derivar de cualquier manera adecuada y de cualquier fuente adecuada y pueden ser, por ejemplo, secuencias de Vhh que se producen de manera natural (es decir, de una especie adecuada de camelido) o secuencias de aminoacidos sinteticas o semisinteticas, incluyendo pero sin limitarse a Nanobodies “humanizados” (tal como se define en el presente documento), secuencias de inmunoglobulina “camelizadas” (tal como se define en el presente documento) (y, en particular, secuencias de dominio variable de cadena pesada camelizadas), asf como Nanobodies que se han obtenido mediante tecnicas tales como maduracion por afinidad (por ejemplo, partiendo de secuencias de inmunoglobulina sinteticas, al azar o que se producen de manera natural), injerto de CDR, remodelacion, combinacion de fragmentos derivados de diferentes secuencias de inmunoglobulina, ensamblaje por PCR usando cebadores solapantes, y tecnicas similares para modificar por ingeniena genetica secuencias de inmunoglobulina que conoce bien el experto; o cualquier combinacion adecuada de cualquiera de los anteriores tal como se describe adicionalmente en el presente documento. Ademas, cuando un Nanobody comprende una secuencia de Vhh, dicho Nanobody puede humanizarse de manera adecuada, tal como se describe adicionalmente en el presente documento, para proporcionar uno o mas Nanobodies adicionales (parcial o completamente) humanizados de la invencion. De manera similar, cuando un Nanobody comprende una secuencia sintetica o semisintetica (tal como una secuencia parcialmente humanizada), dicho Nanobody puede opcionalmente humanizarse ademas de manera adecuada, de nuevo tal como se describe en el presente documento, de nuevo para proporcionar uno o mas Nanobodies adicionales (parcial o completamente) humanizados.
En particular, los Nanobodies humanizados pueden ser secuencias de aminoacidos que son tal como se definieron generalmente para Nanobodies en los parrafos anteriores, pero en las que al menos un residuo de aminoacido esta presente (y en particular, en al menos uno de los residuos de entramado) que es y/o que corresponde a una sustitucion de humanizacion (tal como se define en el presente documento). Algunas sustituciones de humanizacion preferidas, pero no limitativas (y combinaciones adecuadas de las mismas) le quedaran claras al experto basandose en la divulgacion en el presente documento. Ademas, o alternativamente, pueden determinarse otras sustituciones de humanizacion potencialmente utiles comparando la secuencia de las regiones de entramado de una secuencia de Vhh que se produce de manera natural con la secuencia de entramado correspondiente de una o mas secuencias de Vh humanas estrechamente relacionadas, despues de que una o mas de las sustituciones de humanizacion potencialmente utiles (o combinaciones de las mismas) as ^determinadas puedan introducirse en dicha secuencia de Vhh (de cualquier manera conocida per se, tal como se describe adicionalmente en el presente documento) y las secuencias de Vhh humanizadas resultantes pueden someterse a prueba para determinar la afinidad por la diana, para determinar la estabilidad, para determinar la facilidad y el nivel de expresion, y/o para determinar otras propiedades deseadas. De este modo, por medio de un grado limitado de ensayo y error, el experto puede determinar otras sustituciones de humanizacion adecuadas (o combinaciones adecuadas de las mismas) basandose en la divulgacion en el presente documento. Ademas, basandose en lo anterior, (las regiones de entramado de) un Nanobody pueden humanizarse parcialmente o humanizarse completamente.
Algunos Nanobodies humanizados particularmente preferidos son variantes humanizadas de los Nanobodies de las SEQ ID NO: 158 a 236, 248 a 407, 2448 y 2574 a 2581 (vease la tabla A-1), de que las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 2999 a 3015 (vease la tabla A-6) son algunos ejemplos especialmente preferidos.
Por tanto, algunos de otros Nanobodies preferidos son Nanobodies que pueden unirse (tal como se define adicionalmente en el presente documento) a una protema de la envuelta de un virus y que:
i) son una variante humanizada de una de las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 158 a 236, 248 a 407, 2448 y 2574 a 2581 (vease la tabla A-1); y/o
ii) tienen una identidad de aminoacidos de al menos el 80 % con al menos una de las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 158 a 236, 248 a 407, 2448 y 2574 a 2581 (vease la tabla A-1) y/o al menos una de las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 2999 a 3015 (vease la tabla A-6), en los que con los propositos de determinar el grado de identidad de aminoacidos, no se tienen en cuenta los residuos de aminoacido que forman las secuencias de CDR; y en los que:
iii) preferiblemente uno o mas de los residuos de aminoacido en las posiciones 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 y 108 segun la numeracion de Kabat se eligen de los residuos distintivos mencionados en la tabla B-2 a continuacion. Segun otro aspecto espedfico de la invencion, la invencion proporciona varios tramos de residuos de aminoacido (es decir, peptidos pequenos) que son particularmente adecuados para la union a una protema de la envuelta de un virus. Estos tramos de residuos de aminoacido pueden estar presentes en, y/o pueden incorporarse en, una secuencia de aminoacidos de la invencion, en particular de tal modo que formen (parte de) el sitio de union a antígeno de una secuencia de aminoacidos de la invencion. Como estos tramos de residuos de aminoacido se generaron en primer lugar como secuencias de CDR de anticuerpos de cadena pesada o secuencias de Vhh que se produjeron contra una protema de la envuelta de un virus (o pueden basarse en y/o derivar de tales secuencias de CDR, tal como se describe adicionalmente en el presente documento), tambien se denominaran generalmente en el presente documento “secuencias de CDR” (es decir, secuencias de CDR1, secuencias de CDR2 y secuencias de CDR3, respectivamente).
De nuevo, cualquier secuencia de aminoacidos descrita en el presente documento que comprende una o mas de estas secuencias de CDR es preferiblemente tal que puede unirse espedficamente (tal como se define en el presente documento) a una protema de la envuelta de un virus y, mas en particular, tal que puede unirse a una protema de la envuelta de un virus con una afinidad (de manera adecuada medida y/o expresada como un valor de Kd (real o aparente), un valor de Ka (real o aparente), una velocidad de asociacion y/o una velocidad de disociacion, o alternativamente como valor de CI50, tal como se describe adicionalmente en el presente documento), que es tal como se define en el presente documento.
Las secuencias de aminoacidos descritas en el presente documento pueden ser secuencias de aminoacidos que comprenden al menos un sitio de union a antígeno, en las que dicho sitio de union a antígeno comprende al menos tres secuencias de aminoacidos que se eligen del grupo que consiste en las secuencias de CDR1 descritas en el presente documento, las secuencias de CDR2 descritas en el presente documento y las secuencias de CDR3 descritas en el presente documento, de tal manera que la primera secuencia de aminoacidos se elige de las secuencias de CDR1 descritas en el presente documento, la segunda secuencia de aminoacidos se elige de las secuencias de CDR2 descritas en el presente documento, y la tercera secuencia de aminoacidos se elige de las secuencias de CDR3 descritas en el presente documento. Combinaciones preferidas de secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 quedaran claras a partir de la descripcion adicional en el presente documento. Tal como le quedara claro al experto, tal secuencia de aminoacidos es preferiblemente una secuencia de inmunoglobulina (tal como se describe adicionalmente en el presente documento), pero tambien puede ser, por ejemplo, cualquier otra secuencia de aminoacidos que comprenda un andamiaje adecuado para presentar dichas secuencias de c Dr .
Sin formar parte de la invencion reivindicada, la solicitud describe una secuencia de aminoacidos dirigida contra la protema F del virus VRS humano, que comprende tres o mas tramos de residuos de aminoacido, en la que el primer tramo de residuos de aminoacido se elige del grupo que consiste en:
a) las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 722 a 800, 812 a 971, 2484 y 2590 a 2597;
b) secuencias de aminoacidos que tienen una identidad de aminoacidos de al menos el 80 % con al menos una de las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 722 a 800, 812 a 971, 2484 y 2590 a 2597;
c) secuencias de aminoacidos que tienen una diferencia de 3, 2 o 1 aminoacido(s) con al menos una de las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 722 a 800, 812 a 971,2484 y 2590 a 2597
el segundo tramo de residuos de aminoacido se elige del grupo que consiste en:
d) las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 1286 a 1364, 1376 a 1535, 2520 y 2606 a 2613;
e) secuencias de aminoacidos que tienen una identidad de aminoacidos de al menos el 80 % con al menos una de las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 1286 a 1364, 1376 a 1535, 2520 y 2606 a 2613;
f) secuencias de aminoacidos que tienen una diferencia de 3, 2 o 1 aminoacido(s) con al menos una de las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 1286 a 1364, 1376 a 1535, 2520 y 2606 a 2613;
y el tercer tramo de residuos de aminoacido se elige del grupo que consiste en:
g) las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 1850 a 1928, 1940 a 2099, 2556 y 2622 a 2629;
h) secuencias de aminoacidos que tienen una identidad de aminoacidos de al menos el 80 % con al menos una de las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 1850 a 1928, 1940 a 2099, 2556 y 2622 a 2629;
i) secuencias de aminoacidos que tienen una diferencia de 3, 2 o 1 aminoacido(s) con al menos una de las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 1850 a 1928, 1940 a 2099, 2556 y 2622 a 2629.
Preferiblemente, en este aspecto espedfico, el primer tramo de residuos de aminoacido se elige del grupo que consiste en las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 722 a 800, 812 a 971, 2484 y 2590 a 2597; el segundo tramo de residuos de aminoacido se elige del grupo que consiste en las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 1286 a 1364, 1376 a 1535, 2520 y 2606 a 2613; y el tercer tramo de residuos de aminoacido se elige del grupo que consiste en las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 1850 a 1928, 1940 a 2099, 2556 y 2622 a 2629.
De nuevo, preferiblemente, en tal secuencia de aminoacidos, los al menos tres tramos de residuos de aminoacido forman parte del sitio de union a antígeno para la union a la protema F del virus VRS humano.
Combinaciones preferidas de tales tramos de secuencias de aminoacidos quedaran claras a partir de la divulgacion adicional en el presente documento.
Preferiblemente, en tales secuencias de aminoacidos las secuencias de CDR tienen una identidad de aminoacidos de al menos el 70 %, preferiblemente una identidad de aminoacidos de al menos el 80 %, mas preferiblemente una identidad de aminoacidos de al menos el 90 %, tal como una identidad de aminoacidos del 95 % o mas o incluso una identidad de aminoacidos de esencialmente el 100% con las secuencias de CDR de al menos una de las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 158 a 236, 248 a 407, 2448 y 2574 a 2581 (vease la tabla A-1). Este grado de identidad de aminoacidos puede determinarse, por ejemplo, determinando el grado de identidad de aminoacidos (de una manera descrita en el presente documento) entre dicha secuencia de aminoacidos y una o mas de las secuencias de las SEQ ID NO: 158 a 236, 248 a 407, 2448 y 2574 a 2581 (vease la tabla A-1), en las que no se tienen en cuenta los residuos de aminoacido que forman las regiones de entramado. Ademas, tales secuencias de aminoacidos pueden ser tal como se describen adicionalmente en el presente documento.
Ademas, tales secuencias de aminoacidos son preferiblemente tales que pueden unirse espedficamente (tal como se define en el presente documento) a la protema F del virus VRS humano; y mas en particular se unen a la protema F del virus VRS humano con una afinidad (de manera adecuada medida y/o expresada como un valor de Kd (real o aparente), un valor de Ka (real o aparente), una velocidad de asociacion y/o una velocidad de disociacion, o alternativamente como valor de CI50, tal como se describe adicionalmente en el presente documento) que es tal como se define en el presente documento.
Cuando la secuencia de aminoacidos descrita en el presente documento consiste esencialmente en 4 regiones de entramado (FR1 a FR4, respectivamente) y 3 regiones determinantes de complementariedad (CDR1 a CDR3, respectivamente), la secuencia de aminoacidos descrita en el presente documento es preferiblemente tal que:
- CDR1 se elige del grupo que consiste en:
a) las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 722 a 800, 812 a 971, 2484 y 2590 a 2597;
b) secuencias de aminoacidos que tienen una identidad de aminoacidos de al menos el 80 % con al menos una de las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 722 a 800, 812 a 971, 2484 y 2590 a 2597;
c) secuencias de aminoacidos que tienen una diferencia de 3, 2 o 1 aminoacido(s) con al menos una de las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 722 a 800, 812 a 971,2484 y 2590 a 2597;
y/o
- CDR2 se elige del grupo que consiste en:
d) las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 1286 a 1364, 1376 a 1535, 2520 y 2606 a 2613;
e) secuencias de aminoacidos que tienen una identidad de aminoacidos de al menos el 80 % con al menos una de las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 1286 a 1364, 1376 a 1535, 2520 y 2606 a 2613;
f) secuencias de aminoacidos que tienen una diferencia de 3, 2 o 1 aminoacido(s) con al menos una de las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 1286 a 1364, 1376 a 1535, 2520 y 2606 a 2613;
y/o
- CDR3 se elige del grupo que consiste en:
g) las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 1850 a 1928, 1940 a 2099, 2556 y 2622 a 2629;
h) secuencias de aminoacidos que tienen una identidad de aminoacidos de al menos el 80 % con al menos una de las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 1850 a 1928, 1940 a 2099, 2556 y 2622 a 2629;
i) secuencias de aminoacidos que tienen una diferencia de 3, 2 o 1 aminoacido(s) con al menos una de las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 1850 a 1928, 1940 a 2099, 2556 y 2622 a 2629.
En particular, tal secuencia de aminoacidos descrita en el presente documento puede ser tal que CDR1 se elige del grupo que consiste en las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 722 a 800, 812 a 971, 2484 y 2590 a 2597; y/o CDR2 se elige del grupo que consiste en las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 1286 a 1364, 1376 a 1535, 2520 y 2606 a 2613; y/o CDR3 se elige del grupo que consiste en las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 1850 a 1928, 1940 a 2099, 2556 y 2622 a 2629.
En particular, cuando la secuencia de aminoacidos descrita en el presente documento consiste esencialmente en 4 regiones de entramado (FR1 a FR4, respectivamente) y 3 regiones determinantes de complementariedad (CDR1 a CDR3, respectivamente), la secuencia de aminoacidos es preferiblemente tal que:
- CDR1 se elige del grupo que consiste en:
a) las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 722 a 800, 812 a 971, 2484 y 2590 a 2597;
b) secuencias de aminoacidos que tienen una identidad de aminoacidos de al menos el 80 % con al menos una de las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 722 a 800, 812 a 971, 2484 y 2590 a 2597;
c) secuencias de aminoacidos que tienen una diferencia de 3, 2 o 1 aminoacido(s) con al menos una de las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 722 a 800, 812 a 971, 2484 y 2590 a 2597; y
- CDR2 se elige del grupo que consiste en:
d) las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 1286 a 1364, 1376 a 1535, 2520 y 2606 a 2613;
e) secuencias de aminoacidos que tienen una identidad de aminoacidos de al menos el 80 % con al menos una de las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 1286 a 1364, 1376 a 1535, 2520 y 2606 a 2613;
f) secuencias de aminoacidos que tienen una diferencia de 3, 2 o 1 aminoacido(s) con al menos una de las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 1286 a 1364, 1376 a 1535, 2520 y 2606 a 2613; y
- CDR3 se elige del grupo que consiste en:
g) las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 1850 a 1928, 1940 a 2099, 2556 y 2622 a 2629;
h) secuencias de aminoacidos que tienen una identidad de aminoacidos de al menos el 80 % con al menos una de las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 1850 a 1928, 1940 a 2099, 2556 y 2622 a 2629; i) secuencias de aminoacidos que tienen una diferencia de 3, 2 o 1 aminoacido(s) con al menos una de las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 1850 a 1928, 1940 a 2099, 2556 y 2622 a 2629; o cualquier fragmento adecuado de tal secuencia de aminoacidos
En particular, tal secuencia de aminoacidos puede ser tal que CDR1 se elige del grupo que consiste en las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 722 a 800, 812 a 971, 2484 y 2590 a 2597; y CDR2 se elige del grupo que consiste en las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 1286 a 1364, 1376 a 1535, 2520 y 2606 a 2613; y CDR3 se elige del grupo que consiste en las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 1850 a 1928, 1940 a 2099,2556 y 2622 a 2629.
De nuevo, combinaciones preferidas de secuencias de CDR quedaran claras a partir de la descripcion adicional en el presente documento.
Como parte de la invencion reivindicada, la solicitud proporciona un constructo trivalente que consiste esencialmente en tres dominios variables individuales de inmunoglobulina que pueden unirse espedficamente a la protema F de VRS, en el que los dominios variables individuales de inmunoglobulina se unen espedficamente al mismo determinante antigenico, epítopo, parte o dominio de la protema F de VRS y consisten esencialmente en 4 regiones de entramado (FR1 a FR4, respectivamente) y 3 regiones determinantes de complementariedad (CDR1 a CDR3, respectivamente), en el que:
(A)
- CDR1 es la secuencia de aminoacidos NYVLG (SEQ ID NO: 2595); y
- CDR2 es la secuencia de aminoacidos AINWRGDITIGPPNVEG (SEQ ID NO: 2611); y
- CDR3 es la secuencia de aminoacidos GTPLNPGAYIYDWSYDY (SEQ ID NO: 2627); o
(B)
- CDR1 es la secuencia de aminoacidos NYVLG (SEQ ID NO: 935); y
- CDR2 es la secuencia de aminoacidos AISFRGDSAIGAPSVEG (SEQ ID NO: 1499); y
- CDR3 es la secuencia de aminoacidos GTPLNPGAYIYDWSYDY (SEQ ID NO: 2063); o
(C)
- CDR1 es la secuencia de aminoacidos SYAMG (SEQ ID NO: 918); y
- CDR2 es la secuencia de aminoacidos AISWSDGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 1482); y
- CDR3 es la secuencia de aminoacidos DLTSTNPGSYIYIWAYDY (SEQ ID NO: 2046).
Ademas, tales secuencias de aminoacidos son preferiblemente tales que pueden unirse espedficamente (tal como se define en el presente documento) a al menos un epítopo de la protema F del virus VRS humano; y mas en particular se unen a la protema F del virus VRS humano con una afinidad (de manera adecuada medida y/o expresada como un valor de Kd (real o aparente), un valor de Ka (real o aparente), una velocidad de asociacion y/o una velocidad de disociacion, o alternativamente como valor de CI50, tal como se describe adicionalmente en el presente documento) que es tal como se define en el presente documento.
Sin formar parte de la invencion reivindicada, la solicitud describe una secuencia de aminoacidos que consiste esencialmente en 4 regiones de entramado (FR1 a FR4, respectivamente) y 3 regiones determinantes de complementariedad (CDR1 a CDR3, respectivamente), en la que las secuencias de CDR de dicha secuencia de aminoacidos tienen una identidad de aminoacidos de al menos el 70 %, preferiblemente una identidad de aminoacidos de al menos el 80 %, mas preferiblemente una identidad de aminoacidos de al menos el 90 %, tal como una identidad de aminoacidos del 95% o mas o incluso una identidad de aminoacidos de esencialmente el 100% con las secuencias de CDR de al menos una de las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 158 a 236, 248 a 407, 2448 y 2574 a 2581. Este grado de identidad de aminoacidos puede determinarse, por ejemplo, determinando el grado de identidad de aminoacidos (de una manera descrita en el presente documento) entre dicha secuencia de aminoacidos y una o mas de las secuencias de las SEQ ID NO: 158 a 236, 248 a 407, 2448 y 2574 a 2581, en la que no se tienen en cuenta los residuos de aminoacido que forman las regiones de entramado. Tales secuencias de aminoacidos de la invencion pueden ser tal como se describen adicionalmente en el presente documento.
En tal secuencia de aminoacidos de la invencion, las secuencias de entramado pueden ser cualquier secuencia de entramado adecuada, y ejemplos de secuencias de entramado adecuadas le quedaran claros al experto, por ejemplo basandose en los manuales convencionales y la divulgacion adicional y tecnica anterior mencionada en el presente documento.
Las secuencias de entramado son preferiblemente (una combinacion adecuada de) secuencias de entramado de inmunoglobulina o secuencias de entramado que derivan de secuencias de entramado de inmunoglobulina (por ejemplo, mediante humanizacion o camelizacion). Por ejemplo, las secuencias de entramado pueden ser secuencias de entramado derivadas de un dominio variable de cadena pesada (por ejemplo, una secuencia de Vh). En un aspecto particularmente preferido, las secuencias de entramado o bien son secuencias de entramado que derivan de una secuencia de Vhh (en las que dichas secuencias de entramado opcionalmente pueden haberse humanizado parcial o completamente) o bien son secuencias de Vh convencionales que se han camelizado (tal como se define en el presente documento).
Las secuencias de entramado son preferiblemente tales que la secuencia de aminoacidos de la invencion es un anticuerpo de dominios (o una secuencia de aminoacidos que es adecuada para su uso como anticuerpo de dominios); es un anticuerpo de un solo dominio (o una secuencia de aminoacidos que es adecuada para su uso como anticuerpo de un solo dominio); es un “dAb” (o una secuencia de aminoacidos que es adecuada para su uso como dAb); o es un Nanobody (incluyendo pero sin limitarse a secuencia de Vhh). De nuevo, secuencias de entramado adecuadas le quedaran claras al experto, por ejemplo basandose en los manuales convencionales y la divulgacion adicional y tecnica anterior mencionada en el presente documento.
En particular, las secuencias de entramado presentes en las secuencias de aminoacidos de la invencion pueden contener uno o mas de residuos distintivos (tal como se definen en el presente documento), de tal manera que la secuencia de aminoacidos de la invencion es un Nanobody. Algunos ejemplos preferidos, pero no limitativos de (combinaciones adecuadas de) tales secuencias de entramado quedaran claros a partir de la divulgacion adicional en el presente documento.
En otro aspecto, la invencion se refiere a un compuesto o constructo y, en particular, una protema o un polipeptido (tambien denominados en el presente documento un “compuesto de la invencion” o “polipeptido de la invencion”, respectivamente) que comprende o consiste esencialmente en una o mas secuencias de aminoacidos de la invencion (o fragmentos adecuados de las mismas), y opcionalmente comprende ademas uno o mas de otros grupos, residuos, restos o unidades de union. Como le quedara claro al experto a partir de la divulgacion adicional en el presente documento, tales grupos, residuos, restos, unidades de union o secuencias de aminoacidos adicionales pueden proporcionar o no una funcionalidad adicional a la secuencia de aminoacidos de la invencion (y/o al compuesto o constructo en el que esta presente) y pueden modificar o no las propiedades de la secuencia de aminoacidos de la invencion.
Por ejemplo, tales grupos, residuos, restos o unidades de union adicionales pueden ser una o mas secuencias de aminoacidos adicionales, de tal manera que el compuesto o constructo es una protema (de fusion) o un polipeptido (de fusion). En un aspecto preferido pero no limitativo, dicho uno o mas de otros grupos, residuos, restos o unidades de union son secuencias de inmunoglobulina. Incluso mas preferiblemente, dicho uno o mas de otros grupos, residuos, restos o unidades de union se eligen del grupo que consiste en anticuerpos de dominios, secuencias de aminoacidos que son adecuadas para su uso como anticuerpo de dominios, anticuerpos de un solo dominio, secuencias de aminoacidos que son adecuadas para su uso como anticuerpo de un solo dominio, “dAb”, secuencias de aminoacidos que son adecuadas para su uso como dAb, o Nanobodies.
Alternativamente, tales grupos, residuos, restos o unidades de union pueden ser, por ejemplo, grupos qmmicos, residuos, restos, que pueden ser o no por sf mismos biologica y/o farmacologicamente activos. Por ejemplo, y sin limitacion, tales grupos pueden ligarse a la una o mas secuencias de aminoacidos de la invencion para proporcionar un “derivado” de una secuencia de aminoacidos o un polipeptido de la invencion, tal como se describe adicionalmente en el presente documento.
Tambien estan dentro del alcance de la presente invencion compuestos o constructos, que comprenden o consisten esencialmente en uno o mas derivados tal como se describe en el presente documento, y opcionalmente comprenden ademas uno o mas de otros grupos, residuos, restos o unidades de union, opcionalmente unidos mediante uno o mas ligadores. Preferiblemente, dicho uno o mas de otros grupos, residuos, restos o unidades de union son secuencias de aminoacidos.
En los compuestos o constructos descritos anteriormente, la una o mas secuencias de aminoacidos de la invencion y el uno o mas grupos, residuos, restos o unidades de union pueden ligarse directamente entre sf y/o mediante uno o mas ligadores o espaciadores adecuados. Por ejemplo, cuando el uno o mas grupos, residuos, restos o unidades de union son secuencias de aminoacidos, los ligadores tambien pueden ser secuencias de aminoacidos, de modo que el compuesto o constructo resultante es una (protema de) fusion o (polipeptido de) fusion.
Tal como quedara claro a partir de la descripcion adicional anteriormente y en el presente documento, esto significa que las secuencias de aminoacidos de la invencion pueden usarse como “elementos estructurales” para formar polipeptidos de la invencion, es decir combinandolos de manera adecuada con otros grupos, residuos, restos o unidades de union, para formar compuestos o constructos tal como se describe en el presente documento (tal como, sin limitaciones, los polipeptidos bi, tri, multiparatopicos, bi, tri, multivalentes y bi, tri, multiespedficos de la invencion descritos en el presente documento) que combinan dentro de una molecula uno o mas propiedades o funciones biologicas deseadas.
Los compuestos o polipeptidos de la invencion pueden prepararse generalmente mediante un metodo que comprende al menos una etapa de ligar de manera adecuada la una o mas secuencias de aminoacidos de la invencion al uno o mas grupos, residuos, restos o unidades de union adicionales, opcionalmente mediante el uno o mas ligadores adecuados, para proporcionar el compuesto o polipeptido de la invencion. Tambien pueden prepararse polipeptidos de la invencion mediante un metodo que comprende generalmente al menos las etapas de proporcionar un acido nucleico que codifica un polipeptido de la invencion, expresar dicho acido nucleico de manera adecuada, y recuperar el polipeptido expresado de la invencion. Tales metodos pueden realizarse de una manera conocida per se, lo que le quedara claro al experto, por ejemplo basandose en los metodos y las tecnicas descritos adicionalmente en el presente documento.
El procedimiento de diseno/seleccion y/o preparacion de un compuesto o polipeptido de la invencion, partiendo de una secuencia de aminoacidos de la invencion, tambien se denomina en el presente documento “formateado" de dicha secuencia de aminoacidos de la invencion; y un aminoacido de la invencion que se hace que forme parte de un compuesto o polipeptido de la invencion se dice que se ha “formateado" o que esta “en el formato de" dicho compuesto o polipeptido de la invencion. Ejemplos de modos en los que puede formatearse una secuencia de aminoacidos de la invencion y ejemplos de tales formatos le quedaran claros al experto basandose en la divulgacion en el presente documento; y tales secuencias de aminoacidos formateadas forman un aspecto adicional de la invencion.
En un aspecto espedfico de la invencion, un compuesto de la invencion o un polipeptido de la invencion puede tener una semivida aumentada, en comparacion con la secuencia de aminoacidos correspondiente de la invencion. Algunos ejemplos preferidos, pero no limitativos de tales compuestos y polipeptidos le quedaran claros al experto basandose en la divulgacion adicional en el presente documento y, por ejemplo, comprenden secuencias de aminoacidos o polipeptidos de la invencion que se han modificado qmmicamente para aumentar la semivida de los mismos (por ejemplo, por medio de pegilacion); secuencias de aminoacidos de la invencion que comprenden al menos un sitio de union adicional para la union a una protema serica (tal como albumina serica); o polipeptidos de la invencion que comprenden al menos una secuencia de aminoacidos de la invencion que se liga a al menos un resto (y, en particular, al menos una secuencia de aminoacidos) que aumenta la semivida de la secuencia de aminoacidos de la invencion. Ejemplos de polipeptidos de la invencion que comprenden tales secuencias de aminoacidos o restos que prolongan la semivida le quedaran claros al experto basandose en la divulgacion adicional en el presente documento; y por ejemplo incluyen, sin limitacion, polipeptidos en los que la una o mas secuencias de aminoacidos de la invencion se ligan de manera adecuada a una o mas protemas sericas o fragmentos de las mismas (tal como albumina serica (humana) o fragmentos adecuados de la misma) o a una o mas unidades de union que pueden unirse a protemas sericas (tales como, por ejemplo, anticuerpos de dominios, secuencias de aminoacidos que son adecuadas para su uso como anticuerpo de dominios, anticuerpos de un solo dominio, secuencias de aminoacidos que son adecuadas para su uso como anticuerpo de un solo dominio, “dAb”, secuencias de aminoacidos que son adecuadas para su uso como dAb, o Nanobodies que pueden unirse a protemas sericas tales como albumina serica (tal como albumina serica humana), inmunoglobulinas sericas tales como IgG, o transferrina; se hace referencia a la descripcion adicional y la bibliograffa mencionada en el presente documento); polipeptidos en los que una secuencia de aminoacidos de la invencion se liga a una porcion Fc (tal como un Fc humano) o una parte o un fragmento adecuado del mismo; o polipeptidos en los que la una o mas secuencias de aminoacidos de la invencion se ligan de manera adecuada a una o mas protemas o peptidos pequenos que pueden unirse a protemas sericas (tales como, sin limitacion, las protemas y los peptidos descritos en los documentos WO 91/01743, WO 01/45746, w O 02/076489 y en el documento WO 08/068280.
Generalmente, los compuestos o polipeptidos de la invencion con semivida aumentada tienen preferiblemente una semivida que es al menos 1,5 veces, preferiblemente al menos 2 veces, tal como al menos 5 veces, por ejemplo al menos 10 veces o mas de 20 veces, mayor que la semivida de la secuencia de aminoacidos correspondiente de la invencion per se.
En un aspecto preferido, pero no limitativo de la invencion, tales compuestos o polipeptidos de la invencion tienen una semivida serica que esta aumentada en mas de 1 hora, preferiblemente mas de 2 horas, mas preferiblemente mas de 6 horas, tal como mas de 12 horas, o incluso mas de 24, 48 o 72 horas, en comparacion con la secuencia de aminoacidos correspondiente de la invencion per se.
En otro aspecto preferido, pero no limitativo de la invencion, tales compuestos o polipeptidos de la invencion presentan una semivida serica en humanos de al menos aproximadamente 12 horas, preferiblemente al menos 24 horas, mas preferiblemente al menos 48 horas, incluso mas preferiblemente al menos 72 horas o mas. Por ejemplo, compuestos o polipeptidos de la invencion pueden tener una semivida de al menos 5 dfas (tal como de aproximadamente 5 a 10 dfas), preferiblemente al menos 9 d^as (tal como de aproximadamente 9 a 14 dfas), mas preferiblemente al menos aproximadamente 10dfas (tal como de aproximadamente 10 a 15dfas), o al menos aproximadamente 11 dfas (tal como de aproximadamente 11 a 16dfas), mas preferiblemente al menos aproximadamente 12 dfas (tal como de aproximadamente 12 a 18dfas o mas) o mas de 14 dfas (tal como de aproximadamente 14 a 19 dfas).
En otro aspecto, la invencion se refiere a un acido nucleico que codifica una secuencia de aminoacidos de la invencion o un polipeptido de la invencion (o un fragmento adecuado del mismo). Tal acido nucleico tambien se denominara en el presente documento “acido nucleico de la invencion” y puede estar, por ejemplo, en forma de un constructo genetico, tal como se describe adicionalmente en el presente documento.
En otro aspecto, la invencion se refiere a un huesped o una celula huesped que expresa (o que en circunstancias adecuadas es capaz de expresar) una secuencia de aminoacidos de la invencion y/o un polipeptido de la invencion; y/o que contiene un acido nucleico de la invencion. Algunos ejemplos preferidos pero no limitativos de tales huespedes o celulas huesped quedaran claros a partir de la descripcion adicional en el presente documento.
La invencion se refiere ademas a un producto o una composicion que contiene o que comprende al menos una secuencia de aminoacidos de la invencion, al menos un polipeptido de la invencion (o un fragmento adecuado del mismo), al menos un compuesto de la invencion y/o al menos un acido nucleico de la invencion, y opcionalmente uno o mas componentes adicionales de tales composiciones conocidos per se, es decir que dependen del uso pretendido de la composicion. Tal producto o composicion puede ser, por ejemplo, una composicion farmaceutica (tal como se describe en el presente documento), una composicion veterinaria o un producto o una composicion para uso diagnostico (tal como se describe tambien en el presente documento). Algunos ejemplos preferidos pero no limitativos de tales productos o composiciones quedaran claros a partir de la descripcion adicional en el presente documento.
La invencion tambien se refiere al uso de una secuencia de aminoacidos, un Nanobody, compuesto o polipeptido de la invencion, o de una composicion que comprende los mismos, en (metodos o composiciones para) la modulacion de la entrada viral y/o la replicacion viral y/o para la modulacion de las rutas biologicas que estan mediadas por una protema de la envuelta de un virus (y/o su receptor viral) o bien in vitro (por ejemplo, en un ensayo in vitro o celular) o bien in vivo (por ejemplo, en una unica celula o en un organismo pluricelular y, en particular, en un mairnfero y, mas en particular, en un ser humano, tal como en un ser humano que corre el riesgo de padecer o padece una enfermedad viral).
La invencion tambien se refiere a metodos para la modulacion de la entrada viral y/o la replicacion viral y/o para la modulacion de las rutas biologicas que estan mediadas por una protema de la envuelta de un virus (y/o su receptor viral) o bien in vitro (por ejemplo, en un ensayo in vitro o celular) o bien in vivo (por ejemplo, en una unica celula o un organismo pluricelular y, en particular, en un marnffero y, mas en particular, en un ser humano, tal como en un ser humano que corre el riesgo de padecer o padece una enfermedad viral), metodo que comprende al menos la etapa de poner en contacto una protema de la envuelta de un virus con al menos una secuencia de aminoacidos, el Nanobody, compuesto o polipeptido de la invencion, o con una composicion que comprende los mismos, de una manera y en una cantidad adecuadas para la modulacion de la entrada viral y/o la replicacion viral y/o para la modulacion de las rutas biologicas que estan mediadas por una protema de la envuelta de un virus y/o su receptor viral, con al menos una secuencia de aminoacidos, un Nanobody, compuesto o polipeptido de la invencion.
La invencion tambien se refiere al uso de una secuencia de aminoacidos, un Nanobody, compuesto o polipeptido de la invencion en la preparacion de una composicion (tal como, sin limitacion, una composicion farmaceutica o preparacion tal como se describe adicionalmente en el presente documento) para la modulacion de la entrada viral y/o la replicacion viral y/o para la modulacion de las rutas biologicas que estan mediadas por una protema de la envuelta de un virus (y/o su receptor viral), o bien in vitro (por ejemplo, en un ensayo in vitro o celular) o bien in vivo (por ejemplo, en una unica celula o un organismo pluricelular y, en particular, en un marnffero y, mas en particular, en un ser humano, tal como en un ser humano que corre el riesgo de padecer o padece una enfermedad viral. En el contexto de la presente invencion, “modulacion” o “modular” significa generalmente o bien reducir, impedir o bien inhibir la entrada viral y/o la replicacion viral y/o reducir, impedir o inhibir las rutas biologicas que estan mediadas por una protema de la envuelta de un virus y/o su receptor viral, tal como se mide usando un ensayo in vitro, celular o in vivo adecuado (tales como los mencionados en el presente documento). En particular, “modulacion” o “modular” pueden significar o bien reducir, impedir o bien inhibir la entrada viral y/o la replicacion viral y/o reducir, impedir o inhibir las rutas biologicas que estan mediadas por una protema de la envuelta de un virus y/o su receptor viral tal como se mide usando un ensayo in vitro, celular o in vivo adecuado (tales como los mencionados en el presente documento), en al menos el 1 %, preferiblemente al menos el 5 %, tal como al menos el 10 % o al menos el 25 %, por ejemplo en al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 % o el 90 % o mas, en comparacion con la entrada viral y/o la replicacion viral normales (es decir, que se producen de manera natural) y/o rutas biologicas normales (es decir, que se producen de manera natural) que estan mediadas por una protema de la envuelta de un virus y/o su receptor viral en el mismo ensayo en las mismas condiciones pero sin la presencia de la secuencia de aminoacidos, el compuesto o polipeptido de la invencion.
Tal como le quedara claro al experto, “modulacion” tambien puede implicar realizar un cambio (que puede ser o bien un aumento o bien una disminucion) en la especificidad de union y/o selectividad de una protema de la envuelta de un virus por una o mas de sus parejas de union; y/o realizar un cambio (que puede ser o bien un aumento o bien una disminucion) en la sensibilidad de una protema de la envuelta de un virus para una o mas condiciones en el medio o los alrededores en los que esta presente una protema de la envuelta de un virus (tales como pH, fuerza ionica, la presencia de cofactores, etc.), en comparacion con las mismas condiciones pero sin la presencia de la secuencia de aminoacidos, el compuesto o polipeptido de la invencion. Tal como le quedara claro al experto, esto puede determinarse de nuevo de cualquier manera adecuada y/o usando cualquier ensayo adecuado conocido per se, tales como los ensayos descritos en el presente documento o en la tecnica anterior citada en el presente documento.
“Modulacion” tambien puede significar realizar un cambio con respecto a uno o mas efectos, respuestas, funciones, rutas, actividades o mecanismos biologicos o fisiologicos en los que participa una protema de la envuelta de un virus (o en los que participan sus parejas de union o ruta(s)). De nuevo, tal como le quedara claro al experto esto puede determinarse de cualquier manera adecuada y/o usando cualquier ensayo adecuado (ensayo in vitro y habitualmente celular o in vivo) conocido per se, tales como los ensayos descritos en el presente documento o en la tecnica anterior citada en el presente documento. En particular, con respecto a uno o mas efectos, respuestas, funciones, rutas, actividades o mecanismos biologicos o fisiologicos en los que participa una protema de la envuelta de un virus y/o su receptor viral, realizar un cambio puede significar un cambio en al menos el 1 %, preferiblemente al menos el 5 %, tal como al menos el 10 % o al menos el 25 %, por ejemplo en al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 % o el 90 % o mas, en comparacion con los efectos, las respuestas, funciones, rutas, actividades o los mecanismos biologicos o fisiologicos en el mismo ensayo en las mismas condiciones pero sin la presencia de la secuencia de aminoacidos, el compuesto o polipeptido de la invencion.
La modulacion puede implicar, por ejemplo, reducir, impedir o inhibir la union de una protema de la envuelta de un virus a una de sus parejas de union y/o competir con una pareja de union natural por la union a una protema de la envuelta de un virus. La modulacion puede ser reversible o irreversible, pero con propositos farmaceuticos y farmacologicos sera habitualmente de manera reversible.
Por consiguiente, la presente invencion tambien se refiere a secuencias de aminoacidos y polipeptidos que pueden usarse para modular y, en particular, para inhibir y/o para impedir las rutas biologicas mediadas por virus en las que participan una protema de la envuelta de un virus y/o un receptor viral. En particular, las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos de la presente invencion pueden usarse para neutralizar un virus (tal como se definen en el presente documento) y/o para modular, reducir y/o inhibir la infectividad de un virus (tal como se define en el presente documento).
Mas espedficamente, las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos segun la presente invencion pueden neutralizar un virus (tal como se definen en el presente documento) y/o para modular, reducir y/o inhibir la infectividad de un virus (tal como se define en el presente documento) en la fase previa a la entrada de la infeccion viral (es decir, antes de tener lugar y/o durante la entrada viral en una celula huesped diana). Por consiguiente, las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos de la presente invencion que neutralizan un virus (tal como se definen en el presente documento) y/o modulan, reducen y/o inhiben la infectividad de un virus (tal como se define en el presente documento) en la fase previa a la entrada de la infeccion viral (es decir, antes de tener lugar y/o durante la entrada viral en una celula huesped diana), se dice en el presente documento que modulan y, en particular, inhiben y/o impiden la entrada viral (tal como se define adicionalmente en el presente documento) en una celula huesped diana.
En un aspecto espedfico, la presente invencion se refiere a secuencias de aminoacidos y polipeptidos multivalentes (tales como biparatopicos, biespedficos, trivalentes, triparatopicos, triespedficos, tal como se define adicionalmente en el presente documento) que modulan y, en particular, para inhibir y/o para impedir las rutas biologicas mediadas por virus en las que participan una protema de la envuelta de un virus y/o un receptor viral. En particular, secuencias de aminoacidos y polipeptidos multivalentes (trivalentes) de la presente invencion puede neutralizan un virus (tal como se definen en el presente documento) y/o modular, reducir y/o inhibir la infectividad de un virus (tal como se define en el presente documento). Estas secuencias de aminoacidos y polipeptidos multivalentes (trivalentes) estan dirigidos contra la protema F de VRS y muestran neutralizacion aumentada in vitro y/o in vivo de VRS en comparacion con la secuencia de aminoacidos monovalente correspondiente. La neutralizacion puede estar aumentada en al menos 2 veces, preferiblemente al menos 3 veces, tal como al menos 5 veces o al menos 10 veces, por ejemplo en al menos 15 veces, al menos 20 veces, al menos 30 veces, al menos 50 veces o 100 veces o mas, en comparacion con la neutralizacion en el mismo ensayo en las mismas condiciones por la secuencia de aminoacidos monovalente correspondiente. En aun otro aspecto, estas secuencias de aminoacidos y polipeptidos multivalentes (trivalentes) muestran reactividad cruzada y/o neutralizacion aumentadas de diferentes genotipos, subtipos, mutantes de escape y/o cepas de un determinado virus. Estas secuencias de aminoacidos y polipeptidos multivalentes (trivalentes) estan dirigidas contra la protema F de VRS y muestran reactividad cruzada y/o neutralizacion de diferentes cepas (tales como, por ejemplo, Long y A-2, Long y B-1, A-2 y B-1, Long, A-2 y B-1) de VRS. En aun otro aspecto, estas secuencias de aminoacidos y polipeptidos multivalentes (trivalentes) estan dirigidas contra la protema F de VRS y muestran reactividad cruzada y/o neutralizacion de diferentes mutantes de escape de VRS (tales como, por ejemplo, mutantes de escape en el sitio antigenico II, mutantes de escape en el sitio antigenico IV-VI y/o mutantes de escape en tanto el sitio antigenico II como el sitio antigenico IV-VI).
Por consiguiente, las secuencias de aminoacidos y polipeptidos (multivalentes) de la presente invencion pueden modular y, en particular, inhibir y/o impedir la entrada viral y/o la replicacion viral en una celula huesped diana al unirse espedficamente a una protema de la envuelta de un virus en cualquier etapa adecuada de dicha(s) ruta(s) biologica(s); preferiblemente, las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos de la presente invencion pueden modular y, en particular, inhibir y/o impedir la entrada viral en una celula huesped diana al unirse a una protema de la envuelta de un virus, de tal manera que se modula, se inhibe y/o se impide la fusion viral con dicha celula huesped diana (por ejemplo, en la membrana de la celula huesped diana o dentro de un compartimento endosomico y/o lisosomico de dicha celula huesped diana), por ejemplo impidiendo que dicha protema de la envuelta de un virus experimente un cambio conformacional.
Tambien segun este aspecto, los polipeptidos bi y multivalentes (tal como se definen en el presente documento), bi y multiespedficos (tal como se definen en el presente documento) y bi y multiparatopicos (tal como se definen en el presente documento) descritos en el presente documento pueden ser utiles para la prevencion y/o el tratamiento de enfermedades virales al unirse espedficamente a al menos un epttopo de una protema de la envuelta de un virus y al menos un epttopo adicional (que puede ser diferente o no de dicho al menos un epítopo) de una diana, en los que dicha diana puede ser diferente o no de dicha protema de la envuelta.
Por consiguiente, la presente invencion tambien se refiere a secuencias de aminoacidos y polipeptidos biparatopicos segun la invencion o composiciones que comprenden los mismos, que combinan dos modos de accion diferentes, por ejemplo reducir, impedir y/o inhibir la entrada viral (tal como, por ejemplo, en la etapa de fijacion viral, fusion viral, etc.) y/o la replicacion viral (tal como, por ejemplo, en la etapa de transcripcion, traduccion, empaquetamiento viral, gemacion, etc.), mediadas, cada una, por una de las unidades de union de la secuencia de aminoacidos y/o el polipeptido biparatopicos de la invencion, en los que cada unidad de union se une a un sitio diferente de dicha protema de la envuelta de un virus.
Ademas, la presente invencion tambien se refiere a secuencias de aminoacidos y polipeptidos triparatopicos segun la invencion o composiciones que comprenden los mismos, que combinan dos o tres modos de accion diferentes, tales como reducir, impedir y/o inhibir la entrada viral (tal como, por ejemplo, en la etapa de fijacion viral, fusion viral, etc.) y/o la replicacion viral (tal como, por ejemplo, en la etapa de transcripcion, traduccion, empaquetamiento viral, gemacion, etc.), mediadas, cada una, por una de las unidades de union de la secuencia de aminoacidos y/o el polipeptido triparatopicos de la invencion, en los que cada unidad de union se une a un sitio diferente de dicha protema de la envuelta de un virus.
Mas generalmente, la presente invencion se refiere a secuencias de aminoacidos y polipeptidos multiparatopicos segun la invencion o composiciones que comprenden los mismos, que combinan dos o mas modos de accion diferentes, tales como reducir, impedir y/o inhibir la entrada viral (tal como, por ejemplo, en la etapa de fijacion viral, fusion viral, etc.) y/o la replicacion viral (tal como, por ejemplo, en la etapa de transcripcion, traduccion, empaquetamiento viral, gemacion, etc.), mediadas, cada una, por una de las unidades de union de la secuencia de aminoacidos y/o el polipeptido multiparatopicos de la invencion, en los que cada unidad de union se une a un sitio diferente de dicha protema de la envuelta de un virus.
La invencion se refiere ademas a metodos para preparar o generar las secuencias de aminoacidos, los polipeptidos, acidos nucleicos, las celulas huesped, los productos y las composiciones descritos en el presente documento. Algunos ejemplos preferidos pero no limitativos de tales metodos quedaran claros a partir de la descripcion adicional en el presente documento.
Ademas, tras las etapas anteriormente, pueden humanizarse de manera adecuada (o alternativamente camelizarse) una o mas secuencias de aminoacidos de la invencion; y/o la(s) secuencia(s) de aminoacidos asf obtenida(s) puede(n) ligarse unas a otras o a una o mas de otras secuencias de aminoacidos adecuadas (opcionalmente mediante uno o mas ligadores adecuados) para proporcionar un polipeptido de la invencion. Ademas, una secuencia de acido nucleico que codifica una secuencia de aminoacidos de la invencion puede humanizarse de manera adecuada (o alternativamente camelizarse) y expresarse de manera adecuada; y/o una o mas secuencias de acido nucleico que codifican una secuencia de aminoacidos de la invencion pueden ligarse unas a otras o a una o mas secuencias de acido nucleico que codifican otras secuencias de aminoacidos adecuadas (opcionalmente mediante secuencias de nucleotidos que codifican uno o mas ligadores adecuados), despues de que la secuencia de nucleotidos asf obtenida pueda expresarse de manera adecuada para proporcionar un polipeptido de la invencion. Tambien estan englobados dentro de la presente invencion metodos para preparar y generar aminoacidos multivalentes (tal como por ejemplo trivalentes, etc.), multiparatopicos (tales como, por ejemplo, biparatopicos, triparatopicos, etc.) y/o multiespedficos (tales como, por ejemplo, biespedficos, triespedficos, etc.) de la invencion. Un metodo para preparar aminoacidos o constructos multivalentes, multiparatopicos y/o multiespedficos de la invencion puede comprender al menos las etapas de ligar dos o mas secuencias de aminoacidos monovalentes o los constructos monovalentes descritos en el presente documento y por ejemplo uno o mas ligadores conjuntamente de manera adecuada. Los constructos (y ligadores) monovalentes pueden acoplarse mediante cualquier metodo conocido en la tecnica y tal como se describe adicionalmente en el presente documento. Las tecnicas preferidas incluyen el ligado de las secuencias de acido nucleico que codifican los constructos (y ligadores) monovalentes para preparar un constructo genetico que expresa el aminoacido o constructo multivalente, multiparatopico y/o multiespedfico. Las tecnicas para ligar secuencias de aminoacidos o secuencias de acido nucleico le quedaran claras al experto, y se hace referencia de nuevo a los manuales convencionales, tales como Sambrook et al. y Ausubel et al., mencionados anteriormente, asf como a los ejemplos a continuacion.
Por consiguiente, la presente invencion tambien se refiere al uso de un constructo monovalente (que puede comprender o consistir esencialmente en una secuencia de aminoacidos descrita en el presente documento tal como un anticuerpo de dominios, una secuencia de aminoacidos que es adecuada para su uso como anticuerpo de dominios, un anticuerpo de un solo dominio, una secuencia de aminoacidos que es adecuada para su uso como anticuerpo de un solo dominio, un “dAb”, una secuencia de aminoacidos que es adecuada para su uso como dAb, o un Nanobody) en la provision y/o preparacion de un compuesto o constructo multivalente (tal como multiespedfico, multiparatopico, y preferiblemente triparatopico, biparatopico, triespedfico, biespedfico, etc.). El constructo monovalente se usa entonces como dominio de union o unidad de union en la provision y/o preparacion del constructo multivalente (tal como multiespedfico, multiparatopico, y preferiblemente trivalente, triparatopico, biparatopico, triespedfico, biespedfico, etc.) que comprende tres unidades de union (por ejemplo, en un constructo trivalente) o mas (por ejemplo, en un constructo multivalente y/o multiparatopico). A este respecto, el constructo monovalente puede usarse como dominio de union o unidad de union en la provision y/o preparacion de un constructo multivalente y preferiblemente trivalente de la invencion que comprende tres o mas unidades de union.
En un aspecto, la invencion se refiere a polipeptidos multivalentes dirigidos contra la protema F de VRS, en los que se usa al menos un constructo monovalente descrito en el presente documento (y, en particular, al menos un Nanobody) que esta dirigido contra el sitio de union a Synagis® en la protema F de VRS (y, en particular, contra el sitio antigenico II de la protema F de VRS y, mas en particular, contra la region de aa 250-275 de la protema F de VRS) y/o que es capaz de competir con Synagis® por la union a la protema F de VRS.
En otro aspecto, la invencion se refiere a polipeptidos multivalentes dirigidos contra la protema F de VRS, en los que se usa al menos un constructo monovalente descrito en el presente documento (y, en particular, al menos un Nanobody) que esta dirigido contra el sitio de union a Synagis® en la protema F de VRS (y, en particular, contra el sitio antigenico II de la protema F de VRS y, mas en particular, contra la region de aa 250-275 de la protema F de VRS) y/o que es capaz de competir con Synagis® por la union a la protema F de VRS; y se usa al menos una secuencia de aminoacidos descrita en el presente documento (y, en particular, al menos un Nanobody) que esta dirigida contra otro determinante antigenico, epítopo, parte o dominio de la protema F de VRS. En un constructo multiparatopico preferido de este tipo de la invencion, el ligador es lo mas preferiblemente tal que el constructo multiparatopico de la invencion es capaz de unirse (simultaneamente) tanto al sitio de union a Synagis® en la protema F de VRS (y, en particular, contra el sitio antigenico II de la protema F de VRS y, mas en particular, contra la region de aa 250-275 de la protema F de VRS) asf como al otro determinante antigenico, epítopo, parte o dominio de la protema F de VRS, de nuevo lo mas preferiblemente para permitir la union con avidez aumentada y tambien la union y/o el reconocimiento intramoleculares.
Por consiguiente, tambien esta englobado en la presente invencion el uso de un constructo monovalente que comprende un aminoacido descrito en el presente documento (y, en particular, un Nanobody) que esta dirigido contra el sitio de union a Synagis® en la protema F de VRS (y, en particular, contra el sitio antigenico II de la protema F de VRS y, mas en particular, contra la region de aa 250-275 de la protema F de VRS) y/o que es capaz de competir con Synagis® por la union a la protema F de VRS, como dominio de union o unidad de union en la provision y/o preparacion de un constructo multivalente o multiparatopico (tal como multiespedfico, multiparatopico, y preferiblemente trivalente, triparatopico, biparatopico, triespedfico, biespedfico, etc.), en el que los dominios de union o las unidades de union se ligan mediante un ligador de tal manera que el constructo multivalente o multiparatopico (tal como multiespedfico, multiparatopico, y preferiblemente trivalente, bivalente, triparatopico, biparatopico, triespedfico, biespedfico, etc.) presenta preferiblemente union intramolecular en comparacion con union intermolecular.
En aun otro aspecto, la invencion se refiere a polipeptidos multivalentes dirigidos contra la protema F de VRS, en los que se usa al menos un constructo monovalente descrito en el presente documento (y, en particular, al menos un Nanobody) que esta dirigido contra el sitio de union a Synagis® en la protema F de v Rs (y, en particular, contra el sitio antigenico II de la protema F de VRS y, mas en particular, contra la region de aa 250-275 de la protema F de VRS) y/o que es capaz de competir con Synagis® por la union a la protema F de VRS; y se usa al menos un constructo monovalente descrito en el presente documento (y, en particular, al menos un Nanobody) que esta dirigido contra el sitio de union a 101F en la protema F de VRS (y, en particular, contra el sitio antigenico IV-VI de la protema F de VRS y, mas en particular, contra la region de aa 423-436 de la protema F de VRS) y/o que es capaz de competir con 101F por la union a la protema F de VRS. En tal constructo multiparatopico, el ligador es lo mas preferiblemente tal que el constructo multiparatopico es capaz de unirse (simultaneamente) tanto al sitio de union a Synagis® en la protema F de VRS (y, en particular, contra el sitio antigenico II de la protema F de VRS, como mas en particular contra la region de aa 250-275 de la protema F de VRS) asf como el sitio de union a 101F en la protema F de VRS (y, en particular, contra el sitio antigenico IV-VI de la protema F de VRS y, mas en particular, contra la region de aa 423-436 de la protema F de VRS), de nuevo lo mas preferiblemente para permitir la union con avidez aumentada y tambien la union y/o el reconocimiento intramoleculares.
Por consiguiente, tambien esta englobado en la presente invencion el uso de un constructo monovalente que comprende una secuencia de aminoacidos descrita en el presente documento (y, en particular, al menos un Nanobody) que esta dirigida contra el sitio de union a 101F en la protema F de VRS (y, en particular, contra el sitio antigenico IV de la protema F de VRS y, mas en particular, contra la region de aa 423-436 de la protema F de VRS) y/o que es capaz de competir con 101F por la union a la protema F de VRS, y un constructo monovalente que comprende un aminoacido descrito en el presente documento (y, en particular, al menos un Nanobody) que esta dirigido contra el sitio de union a Synagis® en la protema F de v Rs (y, en particular, contra el sitio antigenico II de la protema F de VRS y, mas en particular, contra la region de aa 250-275 de la protema F de VRS) y/o que es capaz de competir con Synagis® por la union a la protema F de VRS, como dominios de union o unidades de union en la provision y/o preparacion de un constructo multiparatopico (tal como uno biparatopico), en el que los dominios de union o las unidades de union se ligan mediante un ligador de tal manera que el constructo multiparatopico (tal como biparatopico) presenta preferiblemente union intramolecular en comparacion con union intermolecular.
En algunos de los polipeptidos biparatopicos mas preferidos de la invencion, se usa al menos un constructo monovalente descrito en el presente documento (y, en particular, al menos un Nanobody) que esta dirigido contra el sitio de union a Synagis® en la protema F de VRS (y, en particular, contra el sitio antigenico II de la protema F de VRS y, mas en particular, contra la region de aa 250-275 de la protema F de VRS) y/o que es capaz de competir con Synagis® por la union a la protema F de VRS; y se usa al menos una secuencia de aminoacidos descrita en el presente documento (y, en particular, al menos un Nanobody) que esta dirigida contra otro determinante antigenico, epttopo, parte o dominio de la protema F de VRS. En tal constructo biparatopico preferido de la invencion, el ligador es lo mas preferiblemente tal que el constructo biparatopico de la invencion es capaz de unirse (simultaneamente) tanto al sitio de union a Synagis® en la protema F de VRS (y, en particular, contra el sitio antigenico II de la protema F de VRS, como mas en particular contra la region de aa 250-275 de la protema F de VRS) asf como al otro determinante antigenico, epítopo, parte o dominio de la protema F de VRS, de nuevo lo mas preferiblemente para permitir la union con avidez aumentada y tambien la union y/o el reconocimiento intramoleculares.
Por consiguiente, tambien esta englobado en la presente invencion el uso de un constructo monovalente que comprende un aminoacido descrito en el presente documento (y, en particular, un Nanobody) que esta dirigido contra el sitio de union a Synagis® en la protema F de VRS (y, en particular, contra el sitio antigenico II de la protema F de VRS y, mas en particular, contra la region de aa 250-275 de la protema F de VRS) y/o que es capaz de competir con Synagis® por la union a la protema F de VRS, como dominio de union o unidad de union en la provision y/o preparacion de un constructo biparatopico, en el que los dominios de union o las unidades de union se ligan mediante un ligador de tal manera que el constructo biparatopico presenta preferiblemente union intramolecular en comparacion con union intermolecular.
En algunos de los polipeptidos biparatopicos mas preferidos de la invencion, se usa al menos un constructo monovalente descrito en el presente documento (y, en particular, al menos un Nanobody) que esta dirigido contra el sitio de union a Synagis® en la protema F de VRS (y, en particular, contra el sitio antigenico II de la protema F de VRS y, mas en particular, contra la region de aa 250-275 de la protema F de VRS) y/o que es capaz de competir con Synagis® por la union a la protema F de VRS; y se usa al menos un constructo monovalente descrito en el presente documento (y, en particular, al menos un Nanobody) que esta dirigido contra el sitio de union a 101F en la protema F de VRS (y, en particular, contra el sitio antigenico IV-VI de la protema F de VRS y, mas en particular, contra la region de aa 423-436 de la protema F de VRS) y/o que es capaz de competir con 101F por la union a la protema F de VRS. En tal constructo biparatopico preferido de la invencion, el ligador es lo mas preferiblemente tal que el constructo biparatopico de la invencion es capaz de unirse (simultaneamente) tanto al sitio de union a Synagis® en la protema F de VRS (y, en particular, contra el sitio antigenico II de la protema F de VRS, como mas en particular contra la region de aa 250-275 de la protema F de VRS) asf como el sitio de union a 101F en la protema F de VRS (y, en particular, contra el sitio antigenico IV-VI de la protema F de VRS y, mas en particular, contra la region de aa 423­ 436 de la protema F de VRS), de nuevo lo mas preferiblemente para permitir la union con avidez aumentada y tambien la union y/o el reconocimiento intramoleculares.
En algunos de los polipeptidos trivalentes mas preferidos de la invencion, se usa al menos un constructo monovalente descrito en el presente documento que esta dirigido contra el sitio de union a Synagis® en la protema F de VRS (y, en particular, contra el sitio antigenico II de la protema F de VRS y, mas en particular, contra la region de aa 250-275 de la protema F de VRS) y/o que es capaz de competir con Synagis® por la union a la protema F de VRS.
Por consiguiente, tambien esta englobado en la presente invencion el uso de un constructo monovalente que comprende un aminoacido descrito en el presente documento que esta dirigido contra el sitio de union a Synagis® en la protema F de VRS (y, en particular, contra el sitio antigenico II de la protema F de VRS y, mas en particular, contra la region de aa 250-275 de la protema F de VRS) y/o que es capaz de competir con Synagis® por la union a la protema F de VRS, como dominio de union o unidad de union en la provision y/o preparacion de un constructo trivalente, en el que los dominios de union o las unidades de union se ligan mediante un ligador de tal manera que el constructo trivalente presenta preferiblemente union intramolecular en comparacion con union intermolecular.
En los polipeptidos trivalentes de la invencion, se usan al menos tres constructos monovalentes descritos en el presente documento que estan dirigidos contra el sitio de union a Synagis® en la protema F de VRS (y, en particular, contra el sitio antigenico II de la protema F de VRS y, mas en particular, contra la region de aa 250-275 de la protema F de VRS) y/o que son capaces de competir con Synagis® por la union a la protema F de VRS. En tal constructo trivalente preferido de la invencion, el ligador es lo mas preferiblemente tal que el constructo trivalente de la invencion es capaz de unirse (simultaneamente) a tres sitios de union a Synagis® en la protema F de VRS (y, en particular, contra el sitio antigenico II de la protema F de VRS y, mas en particular, contra la region de aa 250-275 de la protema F de VRS), de nuevo lo mas preferiblemente para permitir la union con avidez aumentada y tambien la union y/o el reconocimiento intramoleculares.
Por consiguiente, tambien esta englobado en la presente invencion el uso de tres constructos monovalentes que comprenden una secuencia de aminoacidos descrita en el presente documento que esta dirigida contra el sitio de union a Synagis® en la protema F de VRS (y, en particular, contra el sitio antigenico II de la protema F de VRS y, mas en particular, contra la region de aa 250-275 de la protema F de VRS) y/o que es capaz de competir con Synagis® por la union a la protema F de VRS, como dominios de union o unidades de union en la provision y/o preparacion de un constructo trivalente, en el que los dominios de union o las unidades de union se ligan mediante un ligador de tal manera que el constructo trivalente presenta preferiblemente union intramolecular en comparacion con union intermolecular.
La invencion se refiere ademas a las aplicaciones y los usos de las secuencias de aminoacidos, los compuestos, constructos, polipeptidos, acidos nucleicos, las celulas huesped, los productos y las composiciones descritos en el presente documento, asf como a los compuestos, constructos, polipeptidos para su uso en metodos para la prevencion y/o el tratamiento para enfermedades y trastornos asociados con la entrada viral y/o mediados por una protema de la envuelta de un virus. Algunas aplicaciones y usos preferidos pero no limitativos quedaran claros a partir de la descripcion adicional en el presente documento.
La invencion tambien se refiere a las secuencias de aminoacidos, los compuestos, constructos, polipeptidos, acidos nucleicos, las celulas huesped, los productos y las composiciones descritos en el presente documento para su uso en terapia.
En particular, la invencion tambien se refiere a las secuencias de aminoacidos, los compuestos, constructos, polipeptidos, acidos nucleicos, las celulas huesped, los productos y las composiciones descritos en el presente documento para su uso en la terapia de una enfermedad o un trastorno que puede prevenirse o tratarse mediante la administracion, a un sujeto que lo necesita, de (una cantidad farmaceuticamente eficaz de) una secuencia de aminoacidos, un compuesto, constructo o polipeptido tal como se describe en el presente documento.
Mas en particular, la invencion se refiere a las secuencias de aminoacidos, los compuestos, constructos, polipeptidos, acidos nucleicos, las celulas huesped, los productos y las composiciones descritos en el presente documento para su uso en la terapia de enfermedades virales.
Otros aspectos, realizaciones, ventajas y aplicaciones de la invencion tambien quedaran claros a partir de la descripcion adicional en el presente documento, en los que la invencion se describira y comentara en mas detalle con referencia a los Nanobodies de la invencion y polipeptidos de la invencion que comprenden los mismos, que forman algunos de los aspectos preferidos de la invencion.
Tal como quedara claro a partir de la descripcion adicional en el presente documento, los Nanobodies ofrecen generalmente determinadas ventajas (expuestas en el presente documento) en comparacion con los “dAb” o anticuerpos de dominios (o un solo dominio) similares o secuencias de inmunoglobulina. Sin embargo, le quedara claro al experto que los aspectos mas generales de las siguientes ensenanzas tambien pueden aplicarse (o bien directamente o bien de manera analoga) a otras secuencias de aminoacidos de la invencion.
Descripcion detallada de la invencion
En la presente descripcion, los ejemplos y las reivindicaciones:
a) A menos que se indiquen o definan de otro modo, todos los terminos usados tienen su significado habitual en la tecnica, lo que le quedara claro al experto. Por ejemplo, se hace referencia a los manuales convencionales mencionados en el parrafo a) en la pagina 46 del documento WO 08/020079.
b) A menos que se indiquen de otro modo, los terminos “secuencia de inmunoglobulina”, “secuencia”, “secuencia de nucleotidos” y “acido nucleico” son tal como se describen en el parrafo b) en la pagina 46 del documento WO 08/020079
c) A menos que se indiquen de otro modo, todos los metodos, etapas, tecnicas y manipulaciones que no se describen espedficamente en detalle pueden realizarse y se han realizado de una manera conocida per se, tal como le quedara claro al experto. Se hace referencia de nuevo, por ejemplo, a los manuales convencionales y los antecedentes generales de la tecnica mencionados en el presente documento y a la bibliograffa adicional citada en los mismos; as ^como, por ejemplo, a las siguientes revisiones Presta, Adv. Drug Deliv. Rev. 2006, 58 (5-6): 640-56; Levin y Weiss, Mol. Biosyst. 2006, 2(1): 49-57; Irving et al., J. Immunol. Methods, 2001, 248(1-2), 31-45; Schmitz et al., Placenta, 2000, 21 Supl. A, S106-12, Gonzales et al., Tumour Biol., 2005, 26(1), 31-43, que describen tecnicas para la modificacion por ingeniena genetica de protemas, tales como maduracion por afinidad y otras tecnicas para mejorar la especificidad y otras propiedades deseadas de protemas tales como inmunoglobulinas.
d) Se indicaran los residuos de aminoacido segun el codigo de aminoacidos convencional de tres letras o de una letra. Se hace referencia a la tabla A-2 en la pagina 48 de la solicitud internacional WO 08/020079 de Ablynx N.V. titulada “Amino acid sequences directed against IL-6R and polypeptides comprising the same for the treatment of diseases and disorders associated with Il-6 mediated signalling”.
e) Con los propositos de comparar dos o mas secuencias de nucleotidos, puede calcularse o determinarse el porcentaje de “identidad de secuencia” entre una primera secuencia de nucleotidos y una segunda secuencia de nucleotidos tal como se describe en el parrafo c) en la pagina 49 del documento WO 08/020079, tal como dividiendo [el numero de nucleotidos en la primera secuencia de nucleotidos que son identicos a los nucleotidos en las posiciones correspondientes en la segunda secuencia de nucleotidos] entre [el numero total de nucleotidos en la primera secuencia de nucleotidos] y multiplicando por [700%], en las que cada delecion, insercion, sustitucion o adicion de un nucleotido en la segunda secuencia de nucleotidos (en comparacion con la primera secuencia de nucleotidos) se considera una diferencia en un unico nucleotido (posicion); o usando una tecnica o un algoritmo informatico adecuado, de nuevo tal como se describe en el parrafo c) en la pagina 49 del documento WO 08/020079. f) Con los propositos de comparar dos o mas secuencias de aminoacidos, puede calcularse o determinarse el porcentaje de “identidad de secuencia” entre una primera secuencia de aminoacidos y una segunda secuencia de aminoacidos (tambien denominado en el presente documento “identidad de aminoacidos”) tal como se describe en el parrafo f) en las paginas 49 y 50 del documento WO 08/020079, tal como dividiendo [el numero de residuos de aminoacido en la primera secuencia de aminoacidos que son identicos a los residuos de aminoacido en las posiciones correspondientes en la segunda secuencia de aminoacidos] entre [el numero total de residuos de aminoacido en la primera secuencia de aminoacidos] y multiplicando por [700%], en las que cada delecion, insercion, sustitucion o adicion de un residuo de aminoacido en la segunda secuencia de aminoacidos (en comparacion con la primera secuencia de aminoacidos) se considera una diferencia en un unico residuo de aminoacido (posicion), es decir una “diferencia de aminoacido” tal como se define en el presente documento; o usando una tecnica o un algoritmo informatico adecuado, de nuevo tal como se describe en el parrafo f) en las paginas 49 y 50 del documento WO 08/020079.
Ademas, al determinar el grado de identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoacidos, el experto puede tener en cuenta las denominadas sustituciones de aminoacido “conservativas”, tal como se describe en la pagina 50 del documento WO 08/020079.
Cualquier sustitucion de aminoacido aplicada a los polipeptidos descritos en el presente documento tambien pueden basarse en el analisis de las frecuencias de variaciones de aminoacido entre protemas homologas de diferentes especies desarrolladas por Schulz et al., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, 1978, con los analisis de potenciales de formacion de estructura desarrollados por Chou y Fasman, Biochemistry 13: 211, 1974 y Adv. Enzymol., 47: 45-149, 1978, y con el analisis de patrones de hidrofobicidad en protemas desarrollado por Eisenberg et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81: 140-144, 1984; Kyte & Doolittle; J Molec. Biol. 157: 105-132, 1981, y Goldman et al., Ann. Rev. Biophys. Chem. 15: 321-353, 1986. Se facilita informacion sobre la estructura primaria, secundaria y terciaria de Nanobodies en la descripcion en el presente documento y en los antecedentes generales de la tecnica citados anteriormente. Ademas, con este proposito, la estructura cristalina de un dominio Vhh de llama se facilita, por ejemplo, por Desmyter et al., Nature Structural Biology, Vol. 3, 9, 803 (1996); Spinelli et al., Natural Structural Biology (1996); 3, 752-757; y Decanniere et al., Structure, Vol. 7, 4, 361 (1999). Puede hallarse informacion adicional sobre algunos de los residuos de aminoacido que en dominios Vh convencionales forman la superficie de contacto Vh/Vl y posibles sustituciones de camelizacion en estas posiciones en la tecnica anterior citada anteriormente.
g) Secuencias de aminoacidos y secuencias de acido nucleico se dice que son “exactamente iguales” si tienen una identidad de secuencia del 100 % (tal como se define en el presente documento) por toda su longitud;
h) Cuando se comparan dos secuencias de aminoacidos, el termino “diferencia de aminoacido” se refiere a una insercion, delecion o sustitucion de un unico residuo de aminoacido en una posicion de la primera secuencia, en comparacion con la segunda secuencia; entendiendose que dos secuencias de aminoacidos pueden contener una, dos o mas de tales diferencias de aminoacido;
i) Cuando se dice que una secuencia de nucleotidos o secuencia de aminoacidos “comprende” otra secuencia de nucleotidos o secuencia de aminoacidos, respectivamente, o que “consiste esencialmente en” otra secuencia de nucleotidos o secuencia de aminoacidos, esto tiene el significado facilitado en el parrafo i) en las paginas 51-52 del documento WO 08/020079.
j) El termino “esencialmente en forma aislada” tiene el significado facilitado al mismo en el parrafo j) en las paginas 52 y 53 del documento WO 08/020079.
k) Los terminos “dominio” y “dominio de union” tienen los significados facilitados a los mismos en el parrafo k) en la pagina 53 del documento Wo 08/020079.
l) Los terminos “determinante antigenico” y “ epítopo”, que tambien pueden usarse de manera intercambiable en el presente documento, tienen los significados facilitados a los mismos en el parrafo l) en la pagina 53 del documento WO 08/020079.
m) Tal como se describe adicionalmente en el parrafo m) en la pagina 53 del documento WO 08/020079, una secuencia de aminoacidos (tal como un Nanobody, un anticuerpo, un polipeptido de la invencion, o generalmente una protema o un polipeptido de union a antígeno o un fragmento de los mismos) que pueden unirse (espedficamente) a, que tienen afinidad por y/o que tienen especificidad por un determinante antigenico, epítopo, antígeno o una protema espedficos (o por al menos una parte, un fragmento o epítopo de los mismos) se dice que esta “contra” o “dirigida contra" dicho determinante antigenico, epítopo, antígeno o protema.
n) El termino “especificidad" tiene el significado facilitado al mismo en el parrafo n) en las paginas 53-56 del documento WO 08/020079; y tal como se menciona en ese documento se refiere al numero de tipos diferentes de antígenos o determinantes antigenicos a los que puede unirse una molecula de union a antígeno o molecula de protema de union a antígeno (tal como un Nanobody o un polipeptido de la invencion) particular. La especificidad de una protema de union a antígeno puede determinarse basandose en la afinidad y/o avidez, tal como se describe en las paginas 53-56 del documento WO 08/020079, que tambien describen algunas tecnicas preferidas para medir la union entre una molecula de union a antígeno (tal como un Nanobody o polipeptido de la invencion) y el antígeno pertinente. Normalmente, las protemas de union a antígeno (tales como las secuencias de aminoacidos, los Nanobodies y/o polipeptidos de la invencion) se uniran a su antígeno con una constante de disociacion (Kd) de 10-5 a 10-12 moles/litro o menos, y preferiblemente de 10-7 a 10-12 moles/litro o menos y mas preferiblemente de 10-8 a 10' 12 moles/litro (es decir, con una constante de asociacion (KA) de 105 a 1012 litros/mol o mas, y preferiblemente de 107 a 1012 litros/mol o mas, y mas preferiblemente de 108 a 1012 litros/mol). Cualquier valor de Kd mayor de 104 mol/litro (o cualquier valor de Ka menor que 104 M'1) litros/mol se considera generalmente que indica union no espedfica. Preferiblemente, una secuencia de inmunoglobulina monovalente descrita en el presente documento se unira al antígeno deseado con una afinidad menor de 500 nM, preferiblemente menor de 200 nM, mas preferiblemente menor de 10 nM, tal como menor de 500 pM. Puede determinarse la union espedfica de una protema de union a antígeno a un antígeno o determinante antigenico de cualquier manera adecuada conocida per se, incluyendo, por ejemplo, analisis de Scatchard y/o ensayos de union competitiva, tales como radioinmunoensayos (RIA), inmunoensayos enzimaticos (EIA) y ensayos de competencia de tipo sandwich, y las diferentes variantes de los mismos conocidas per se en la tecnica; asf como las demas tecnicas mencionadas en el presente documento. Tal como le quedara claro al experto, y tal como se describe en las paginas 53-56 del documento WO 08/020079, la constante de disociacion puede ser la constante de disociacion real o aparente. Los metodos para determinar la constante de disociacion le quedaran claros al experto y, por ejemplo, incluyen las tecnicas mencionadas en las paginas 53-56 del documento WO 08/020079.
o) La semivida de una secuencia de aminoacidos, un compuesto o polipeptido de la invencion puede definirse generalmente tal como se describe en el parrafo o) en la pagina 57 del documento WO 08/020079 y tal como se menciona en ese documento se refiere al tiempo que lleva que la concentracion serica de la secuencia de aminoacidos, el compuesto o polipeptido se reduzca en el 50 %, in vivo, por ejemplo debido a la degradacion de la secuencia o el compuesto y/o el aclaramiento o secuestro de la secuencia o el compuesto mediante mecanismos naturales. La semivida in vivo de una secuencia de aminoacidos, un compuesto o polipeptido de la invencion puede determinarse de cualquier manera conocida per se, tal como mediante analisis farmacocinetico. Las tecnicas adecuadas estaran claras para el experto en la tecnica y pueden ser, por ejemplo, generalmente tal como se describen en el parrafo o) en la pagina 57 del documento Wo 08/020079. Tal como se menciona tambien en el parrafo o) en la pagina 57 del documento WO 08/020079, la semivida puede expresarse usando parametros tales como el ti/2-alfa, t1/2-beta y el area bajo la curva (AUC). Por ejemplo, se hace referencia a la Parte experimental a continuacion, asf como a los manuales convencionales, tales como Kenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists y Peters et al, Pharmacokinetic analysis: A Practical Approach (1996). Tambien se hace referencia a “Pharmacokinetics”, M Gibaldi & D Perron, publicado por Marcel Dekker, 2.a edicion rev. (1982). Los terminos “aumento de la semivida” o “semivida aumentada” tal como se definen tambien en el parrafo o) en la pagina 57 del documento WO 08/020079 y, en particular, se refieren a un aumento de ti/2-beta, o bien con o bien sin un aumento de ti/2-alfa y/o la AUC o ambos.
p) En el contexto de la presente invencion, “modulacion” o “modular” significa generalmente o bien reducir o bien inhibir la actividad de, o alternativamente aumentar la actividad de, una diana o un antigeno, tal como se mide usando un ensayo in vitro, celular o in vivo adecuado. En particular, “modulacion” o “modular” puede significar o bien reducir o bien inhibir la actividad de, o alternativamente aumentar una actividad biologica (relevante o pretendida) de, una diana o un antigeno, tal como se mide usando un ensayo in vitro, celular o in vivo adecuado (que dependera habitualmente de la diana o el antígeno implicado), en al menos el 1 %, preferiblemente al menos el 5 %, tal como al menos el 10 % o al menos el 25 %, por ejemplo en al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 % o el 90 % o mas, en comparacion con actividad de la diana o el antigeno en el mismo ensayo en las mismas condiciones pero sin la presencia del constructo de la invencion.
Tal como le quedara claro al experto, “modulacion” tambien puede implicar realizar un cambio (que puede ser o bien un aumento o bien una disminucion) en la afinidad, avidez, especificidad y/o selectividad de una diana o un antígeno por una o mas de sus parejas de union, parejas para la asociacion en una forma homomultimerica o heteromultimerica; y/o realizar un cambio (que puede ser o bien un aumento o bien una disminucion) en la sensibilidad de la diana o el antigeno para una o mas condiciones en el medio o los alrededores en los que esta presente la diana o el antigeno (tales como pH, fuerza ionica, la presencia de cofactores, etc.), en comparacion con las mismas condiciones pero sin la presencia del constructo de la invencion. Tal como le quedara claro al experto, esto puede determinarse de nuevo de cualquier manera adecuada y/o usando cualquier ensayo adecuado conocido per se, dependiendo de la diana o el antigeno implicado. “Modulacion” tambien puede significar realizar un cambio (es decir, una actividad como agonista, como antagonista o como agonista inverso, respectivamente, dependiendo de la diana o el antígeno y el efecto biologico o fisiologico deseado) con respecto a uno o mas efectos, respuestas, funciones, rutas, actividades o mecanismos biologicos o fisiologicos en los que participa la diana o el antígeno (o en las que participan sus parejas de union o ruta(s), tales como su ruta de senalizacion o ruta metabolica y sus efectos biologicos o fisiologicos asociados). De nuevo, tal como le quedara claro al experto, tal accion como agonista o antagonista puede determinarse de cualquier manera adecuada y/o usando cualquier ensayo adecuado (ensayo in vitro y habitualmente celular o in vivo) conocido per se, dependiendo de la diana o el antígeno implicado. En particular, una accion como agonista o antagonista puede ser tal que una actividad biologica o fisiologica pretendida este aumentada o disminuida, respectivamente, en al menos el 1 %, preferiblemente al menos el 5 %, tal como al menos el 10 % o al menos el 25 %, por ejemplo en al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 % o el 90 % o mas, en comparacion con la actividad biologica o fisiologica en el mismo ensayo en las mismas condiciones pero sin la presencia del constructo de la invencion. Modulacion tambien puede implicar, por ejemplo, modulacion alosterica de la diana o el antígeno; y/o reducir o inhibir la union de la diana o el antígeno a una de sus parejas de union y/o competir con una pareja de union natural por la union a la diana o el antígeno. Modulacion tambien puede implicar activar la diana o el antígeno o el mecanismo o la ruta en los que participa. Modulacion tambien puede implicar, por ejemplo, realizar un cambio con respecto al plegamiento o la conformacion de la diana o el antígeno, o con respecto a la capacidad para plegarse de la diana o el antígeno, para cambiar su conformacion (por ejemplo, tras la union de una pareja de union), para asociarse con otras (sub)unidades, o para disociarse. Modulacion tambien puede implicar, por ejemplo, realizar un cambio en la capacidad de la diana o el antígeno para transportar otros compuestos o servir como canal para otros compuestos (tales como iones).
La modulacion puede ser reversible o irreversible, pero con propositos farmaceuticos y farmacologicos sera habitualmente de manera reversible.
q) Con respecto a una diana o un antígeno, el termino “sitio de interaccion” en la diana o el antígeno significa un sitio, epítopo, determinante antigenico, parte, dominio o tramo de residuos de aminoacido en la diana o el antígeno que es un sitio para la union a un receptor u otra pareja de union, un sitio catalftico, un sitio de escision, un sitio para interaccion alosterica, un sitio implicado en multimerizacion (tal como homomerizacion o heterodimerizacion) de la diana o el antígeno; o cualquier otros sitio, epítopo, determinante antigenico, parte, dominio o tramo de residuos de aminoacido en la diana o el antígeno que participa en una accion o un mecanismo biologico de la diana o el antígeno. Mas generalmente, un “sitio de interaccion” puede ser cualquier sitio, epítopo, determinante antigenico, parte, dominio o tramo de residuos de aminoacido en la diana o el antígeno al que puede unirse una secuencia de aminoacidos o un polipeptido de la invencion de tal manera que se modula (tal como se define en el presente documento) la diana o el antígeno (y/o cualquier ruta, interaccion, senalizacion, mecanismo biologico o efecto biologico en el que participa la diana o el antígeno).
r) Una secuencia de aminoacidos o un polipeptido se dice que es “espedfico para” una primera diana o antígeno en comparacion con una segunda diana o antígeno cuando se une al primer antígeno con una afinidad (tal como se describio anteriormente, y se expresa de manera adecuada como valor de Kd, valor de Ka, velocidad de disociacion y/o velocidad de asociacion) que es al menos 10 veces, tal como al menos 100 veces, y preferiblemente al menos 1000 veces, y hasta 10000 veces o mas, mejor que la afinidad con la que dicha secuencia de aminoacidos o polipeptido se une a la segunda diana o polipeptido. Por ejemplo, el primer antígeno puede unirse a la diana o el antígeno con un valor de Kd que es al menos 10 veces menor, tal como al menos 100 veces menor, y preferiblemente al menos 1000 veces menor, tal como 10000 veces menor o incluso menos de eso, que la Kd con la que dicha secuencia de aminoacidos o polipeptido se une a la segunda diana o polipeptido. Preferiblemente, cuando una secuencia de aminoacidos o un polipeptido es “espedfico para” una primera diana o antígeno en comparacion con una segunda diana o antígeno, esta dirigido contra (tal como se define en el presente documento) dicha primera diana o antígeno, pero no dirigido contra dicha segunda diana o antígeno.
s) Los terminos “bloqueo cruzado”, “bloqueado de manera cruzada” y “que produce bloqueo cruzado” se usan de manera intercambiable en el presente documento para significar la capacidad de una secuencia de aminoacidos u otro agente de union (tal como un polipeptido de la invencion) para interferir en la union de otras secuencias de aminoacidos o agentes de union de la invencion a una diana dada. El grado en que una secuencia de aminoacidos u otros agentes de union de la invencion son capaces de interferir en la union de otro elemento a la diana y, por tanto, si puede decirse que produce bloqueo cruzado segun la invencion, puede determinarse usando ensayos de union de competencia. Un ensayo de bloqueo cruzado cuantitativo particularmente adecuado usa una maquina Biacore que puede medir el grado de las interacciones usando la tecnologfa de resonancia de plasmon superficial. Otro ensayo de bloqueo cruzado cuantitativo adecuado usa un enfoque basado en ELISA para medir la competencia entre secuencias de aminoacidos u otros agentes de union en cuanto a su union a la diana.
Lo siguiente describe generalmente un ensayo Biacore adecuado para determinar si una secuencia de aminoacidos u otro agente de union produce bloqueo cruzado o es capaz de producir bloqueo cruzado segun la invencion. Se apreciara que puede usarse el ensayo con cualquiera de las secuencias de aminoacidos u otros agentes de union descritos en el presente documento. La maquina Biacore (por ejemplo, Biacore 3000) se hace funcionar en lmea con las recomendaciones del fabricante. Por tanto en un ensayo de bloqueo cruzado, la protema diana se acopla a un chip CM5 Biacore usando qmmica de acoplamiento de amina convencional para generar una superficie que se recubre con la diana. Normalmente se acoplaran 200-800 unidades de resonancia de la diana al chip (una cantidad que proporciona niveles facilmente medibles de union pero que puede saturarse rapidamente por las concentraciones de reactivo de prueba que se usan). Se mezclan dos secuencias de aminoacidos de prueba (denominadas A* y B*) que van a evaluarse para determinar su capacidad para producir bloqueo cruzado entre sf, a una razon molar de uno a uno de sitios de union en un tampon adecuado para crear la mezcla de prueba. Cuando se calculan las concentraciones basandose en el sitio de union, se supone que el peso molecular de una secuencia de aminoacidos es el peso molecular total de la secuencia de aminoacidos dividido entre el numero de sitios de union diana en esa secuencia de aminoacidos. La concentracion de cada secuencia de aminoacidos en la mezcla de prueba debe ser lo suficientemente alta como para saturar rapidamente los sitios de union para esa secuencia de aminoacidos en las moleculas diana capturadas en el chip Biacore. Las secuencias de aminoacidos en la mezcla esta a la misma concentracion molar (basado en la union) y esa concentracion estara normalmente entre 1,00 y 1,5 micromolar (basado en el sitio de union). Tambien se preparan disoluciones independientes que contienen A* solo y B* solo. A* y B* en estas disoluciones deben estar en el mismo tampon y a la misma concentracion que en la mezcla de prueba. La mezcla de prueba se hace pasar por el chip Biacore recubierto con diana y se registra la cantidad total de union. Entonces se trata el chip de tal modo que se retiren las secuencias de aminoacidos unidas sin danar la diana unida al chip. Normalmente esto se realiza tratando el chip con HCl 30 mM durante 60 segundos. La disolucion de A* solo se hace pasar entonces por la superficie recubierta con diana y se registra la cantidad de union. Se trata de nuevo el chip para retirar todas las secuencias de aminoacidos unidas sin danar la diana unida al chip. La disolucion de B* solo se hace pasar entonces por la superficie recubierta con diana y se registra la cantidad de union. La maxima union teorica de la mezcla de A* y B* se calcula a continuacion, y es la suma de la union de cada secuencia de aminoacidos cuando se hace pasar por la superficie de la diana sola. Si la union registrada real de la mezcla es menor que este maximo teorico, entonces las dos secuencias de aminoacidos estan produciendo bloqueo cruzado entre sf Por tanto, en general, una secuencia de aminoacidos u otro agente de union de bloqueo cruzado segun la invencion es uno que se unira a la diana en el ensayo Biacore de bloqueo cruzado anterior de tal manera que durante el ensayo y en presencia de una segunda secuencia de aminoacidos u otro agente de union de la invencion la union registrada es de entre el 80 % y el 0,1 % (por ejemplo, del 80 % al 4 %) de la maxima union teorica, espedficamente entre el 75 % y el 0,1 % (por ejemplo, del 75 % al 4 %) de la maxima union teorica, y mas espedficamente entre el 70 % y el 0,1 % (por ejemplo, del 70 % al 4 %) de la maxima union teorica (tal como acaba de definirse anteriormente) de las dos secuencias de aminoacidos o agentes de union en combinacion. El ensayo Biacore descrito anteriormente es un ensayo primario usado para determinar si secuencias de aminoacidos u otros agentes de union producen bloqueo cruzado entre sf segun la invencion. En raras ocasiones, secuencias de aminoacidos u otros agentes de union particulares pueden no unirse a una diana acoplada mediante qmmica de aminas a un chip CM5 Biacore (esto sucede habitualmente cuando el sitio de union relevante en la diana esta enmascarado o se destruye por el acoplamiento al chip). En tales casos, puede determinarse el bloqueo cruzado usando una version etiquetada de la diana, por ejemplo una version etiquetada con cola de His de manera N-terminal. En este formato particular, una secuencia de aminoacidos anti-His se acoplara al chip Biacore y luego se hara pasar la diana con cola de His por la superficie del chip y se capturara por la secuencia de aminoacidos anti-His. Se llevara a cabo el analisis de bloqueo cruzado esencialmente tal como se describio anteriormente, excepto en que despues de cada ciclo de regeneracion del chip, se cargara nueva diana con cola de His de vuelta sobre la superficie recubierta con la secuencia de aminoacidos anti-His. Ademas del ejemplo facilitado que usa diana con cola de His N-terminal, podna usarse alternativamente diana con cola de His C-terminal. Ademas, podnan usarse otras diversas combinaciones de etiquetas y protemas de union a etiqueta que se conocen en la tecnica para tal analisis de bloqueo cruzado (por ejemplo, etiqueta de HA con anticuerpos anti-HA; etiqueta FLAG con anticuerpos anti-FLAG; etiqueta de biotina con estreptavidina).
Lo siguiente describe generalmente un ensayo ELISA para determinar si una secuencia de aminoacidos u otro agente de union dirigido contra una diana produce bloqueo cruzado o es capaz de producir bloqueo cruzado tal como se define en el presente documento. Se apreciara que puede usarse el ensayo con cualquiera de las secuencias de aminoacidos (u otros agentes de union tales como polipeptidos de la invencion) descritas en el presente documento. El principio general del ensayo es tener una secuencia de aminoacidos o un agente de union que esta dirigido contra la diana recubierta sobre los pocillos de una placa para ELISA. Se anade una cantidad en exceso de una segunda secuencia de aminoacidos anti-diana, potencialmente de bloqueo cruzado, en disolucion (es decir, no unida a la placa para ELISA). Se anade entonces una cantidad limitada de la diana a los pocillos. La secuencia de aminoacidos recubierta y la secuencia de aminoacidos en disolucion compiten por la union del numero limitado de moleculas diana. Se lava la placa para retirar la diana en exceso que no se ha unido por la secuencia de aminoacidos recubierta y tambien para retirar la segunda secuencia de aminoacidos en fase de disolucion asf como cualquier complejo formado entre la segunda secuencia de aminoacidos en fase de disolucion y la diana. La cantidad de diana unida se mide entonces usando un reactivo que es apropiado para detectar la diana. Una secuencia de aminoacidos en disolucion que es capaz de producir bloqueo cruzado de la secuencia de aminoacidos recubierta sera capaz de provocar una disminucion del numero de moleculas diana a la que puede unirse la secuencia de aminoacidos recubierta con relacion al numero de moleculas diana a las que puede unirse la secuencia de aminoacidos recubierta en ausencia de la segunda secuencia de aminoacidos en fase de disolucion. En el caso en el que se elige la primera secuencia de aminoacidos, por ejemplo un Ab-X, para que sea la secuencia de aminoacidos inmovilizada, se recubre sobre los pocillos de la placa para ELISA, despues de que las placas se bloqueen con una disolucion de bloqueo adecuada para minimizar la union no espedfica de reactivos que se anaden posteriormente. Se anade entonces una cantidad en exceso de la segunda secuencia de aminoacidos, es decir Ab-Y, a la placa para ELISA de tal manera que los moles de sitios de union a diana de Ab-Y por pocillo son al menos 10 veces mas que los moles de sitios de union a diana de Ab-X que se usaron, por pocillo, durante el recubrimiento de la placa para ELISA. Se anade entonces la diana de tal manera que los moles de diana anadida por pocillo son al menos 25 veces menos que los moles de sitios de union a diana de Ab-X que se usaron para el recubrimiento de cada pocillo. Tras un periodo de incubacion adecuado, se lava la placa para ELISA y se anade un reactivo para detectar la diana, para medir la cantidad de diana unida de manera espedfica por la secuencia de aminoacidos antidiana recubierta (en este caso, Ab-X). La senal de fondo para el ensayo se define como la senal obtenida en pocillos con la secuencia de aminoacidos recubierta (en este caso, Ab-X), la segunda secuencia de aminoacidos en fase de disolucion (en este caso, Ab-Y), tampon de diana solamente (es decir, sin diana) y reactivos de deteccion de diana. La senal de control positivo para el ensayo se define como la senal obtenida en pocillos con la secuencia de aminoacidos recubierta (en este caso, Ab-X), tampon para la segunda secuencia de aminoacidos en fase de disolucion solamente (es decir, sin la segunda secuencia de aminoacidos en fase de disolucion), diana y reactivos de deteccion de diana. El ensayo ELISA puede ejecutarse de tal manera que se tenga una senal de control positivo que es al menos 6 veces la senal de fondo. Para evitar cualquier artefacto (por ejemplo, afinidades significativamente diferentes entre Ab-X y Ab-Y por la diana) que resulte de la eleccion de que secuencia de aminoacidos usar como secuencia de aminoacidos de recubrimiento y cual usar como segunda secuencia de aminoacidos (competidora), puede ejecutarse el ensayo de bloqueo cruzado en dos formatos: 1) el formato 1 es cuando Ab-X es la secuencia de aminoacidos que se recubre sobre la placa para ELISA y Ab-Y es la secuencia de aminoacidos competidora que esta en disolucion y 2) el formato 2 es cuando Ab-Y es la secuencia de aminoacidos que se recubre sobre la placa para ELISA y Ab-X es la secuencia de aminoacidos competidora que esta en disolucion. Ab-X y Ab-Y se definen como que producen bloqueo cruzado si, o bien en el formato 1 o bien en el formato 2, la secuencia de aminoacidos anti-diana en fase de disolucion es capaz de provocar una reduccion de entre el 60 % y el 100 %, espedficamente entre el 70 % y el 100 %, y mas espedficamente entre el 80 % y el 100%, de la senal de deteccion de diana {es decir la cantidad de diana unida por la secuencia de aminoacidos recubierta) en comparacion con la senal de deteccion de diana obtenida en ausencia de la secuencia de aminoacidos anti-diana en fase de disolucion (es decir, los pocillos de control positivo).
t) Una secuencia de aminoacidos se dice que "produce reaccion cruzada” para dos antígenos diferentes o determinantes antigenicos (tales como, por ejemplo, albumina serica de dos especies de mairnfero diferentes, tales como, por ejemplo, albumina serica humana y albumina serica de macaco, tales como, por ejemplo, las mismas protemas de la envuelta de diferentes cepas de un virus, tales como, por ejemplo, las mismas protemas de la envuelta de diferentes genotipos de un virus) si es espedfico para (tal como se define en el presente documento) ambos de estos antígenos o determinantes antigenicos diferentes.
u) Tal como se describe adicionalmente en el presente documento, el numero total de residuos de aminoacido en un Nanobody puede estar en la region de 110-120, esta preferiblemente en 112-115, y es lo mas preferiblemente 113. Debe observarse sin embargo que partes, fragmentos, analogos o derivados (tal como se describe adicionalmente en el presente documento) de un Nanobody no estan limitados particularmente en cuanto a su longitud y/o tamano, siempre que tales partes, fragmentos, analogos o derivados satisfagan los requisitos adicionales expuestos en el presente documento y tambien son adecuados preferiblemente con los propositos descritos en el presente documento;
v) Tal como se describe adicionalmente en el parrafo q) en las paginas 58 y 59 del documento WO 08/020079, los residuos de aminoacido de un Nanobody se numeran segun la numeracion general para dominios Vh facilitada por Kabat et al. (“Sequences of proteins of immunological interest”, US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, publicacion n.° 91), aplicada a dominios Vhh de camelidos en el artmulo de Riechmann y Muyldermans, J. Immunol. Methods 23 de jun. de 2000; 240 (1-2): 185-195 (vease por ejemplo la figura 2 de esta publicacion), y por consiguiente FR1 de un Nanobody comprende los residuos de aminoacido en las posiciones 1-30, CDR1 de un Nanobody comprende los residuos de aminoacido en las posiciones 31-35, FR2 de un Nanobody comprende los aminoacidos en las posiciones 36-49, CDR2 de un Nanobody comprende los residuos de aminoacido en las posiciones 50-65, FR3 de un Nanobody comprende los residuos de aminoacido en las posiciones 66-94, CDR3 de un Nanobody comprende los residuos de aminoacido en las posiciones 95-102, y FR4 de un Nanobody comprende los residuos de aminoacido en las posiciones 103-113.
w) En el contexto de la presente invencion “celula huesped diana (de un virus)” se refiere generalmente a una celula particular, que es o deriva de un sujeto vivo, que es susceptible de infeccion con dicho virus.
x) El termino “infectividad de un virus”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la proporcion de sujetos vivos que, cuando se exponen a dicho virus, llegan a infectarse realmente por dicho virus.
y) El termino “neutralizacion de un virus”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la modulacion y/o reduccion y/o prevencion y/o inhibicion de la infectividad (tal como se define en el presente documento) de un virus mediante la union de un compuesto neutralizante al virion, tal como se mide usando un ensayo in vitro, celular o in vivo adecuado (tales como los mencionados en el presente documento). En particular, “neutralizacion de (un virus)” o “neutralizar (un virus)” puede significar o bien modular, reducir, prevenir o bien inhibir la infectividad (tal como se define en el presente documento) de un virus, que puede estar mediado por una protema de la envuelta de un virus y/o su receptor viral tal como se mide usando un ensayo in vitro, celular o in vivo adecuado (tales como los mencionados en el presente documento), en al menos el 1 %, preferiblemente al menos el 5 %, tal como al menos el 10 % o al menos el 25 %, por ejemplo en al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 % o el 90 % o mas, en comparacion con infectividad normal (es decir, que se produce de manera natural) (tal como se define en el presente documento) de un virus, que esta mediado por una protema de la envuelta de un virus y/o su receptor viral en el mismo ensayo en las mismas condiciones pero sin la presencia de la secuencia de aminoacidos, el Nanobody o polipeptido de la invencion.
z) El termino “protema de fijacion viral”, tal como se usa en el presente documento, es cualquier protema que esta presente en la superficie del virion y que es capaz de mediar directamente (por ejemplo, mediante la interaccion con un receptor viral) o indirectamente (por ejemplo, mediante la mediacion en la interaccion de una o mas de otras protemas o moleculas con un receptor viral) en la fijacion viral a una celula huesped diana.
aa) El termino “protema de fusion viral”, tal como se usa en el presente documento, es cualquier protema que esta presente en la superficie del virion y que es capaz de mediar directamente (por ejemplo, mediante la interaccion con compuestos de membrana de la celula huesped diana) o indirectamente (por ejemplo, mediante la mediacion en la interaccion de una o mas de otras protemas o moleculas con compuestos de membrana de la celula huesped diana) en la fusion viral a una celula huesped diana.
bb) El termino “fijacion viral y protema de fusion viral”, tal como se usan en el presente documento es cualquier protema que esta presente en la superficie del virion y que es capaz de mediar directamente (por ejemplo, mediante la interaccion con un receptor viral y/o compuestos de membrana de la celula huesped diana) o indirectamente (por ejemplo, mediante la mediacion en la interaccion de una o mas de otras protemas o moleculas con un receptor viral y/o una o mas de otras protemas o moleculas con compuestos de membrana de la celula huesped diana) en la fijacion viral y la fusion viral a una celula huesped diana.
cc) El termino “estado conformacional previo a la fusion, (de una protema (de fijacion, fusion, o tanto fijacion como fusion) viral)”, tal como se usa en el presente documento, se refiere al estado conformacional primario y/o secundario y/o terciario y/o cuaternario de una protema (de fijacion, fusion, o tanto fijacion como fusion) viral antes y/o durante el proceso de fusion de un virion con su celula huesped diana, en el que dicho virion tiene dicha protema (de fijacion, fusion, o tanto fijacion como fusion) viral expuesta en su superficie.
dd) El termino “estado conformacional de fusion intermedio (de una protema (de fijacion, fusion, o tanto fijacion como fusion) viral)”, tal como se usa en el presente documento, se refiere al estado conformacional primario y/o secundario y/o terciario y/o cuaternario de una protema (de fijacion, fusion, o tanto fijacion como fusion) viral durante el proceso de fusion de un virion con su celula huesped diana, en el que dicho virion tiene dicha protema (de fijacion, fusion, o tanto fijacion como fusion) viral expuesta en su superficie.
ee) El termino “estado conformacional posterior a la fusion (de una protema (de fijacion, fusion, o tanto fijacion como fusion) viral)”, tal como se usa en el presente documento, se refiere al estado conformacional primario y/o secundario y/o terciario y/o cuaternario de una protema (de fijacion, fusion, o tanto fijacion como fusion) viral durante y/o despues del proceso de fusion de un virion con su celula huesped diana, en el que dicho virion tiene dicha protema (de fijacion, fusion, o tanto fijacion como fusion) viral expuesta en su superficie.
ff) El termino “receptor viral”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un componente molecular espedfico de la celula, que es capaz de reconocer e interaccionar con un virus, y que, despues de unirse a dicho virus, es capaz de generar una serial que inicia una cadena de acontecimientos que conduce a una respuesta biologica.
gg) El termino “entrada viral” usado en el presente documento engloba cualquier ruta biologica mediada por virus que es necesaria para lograr la fijacion del virion a una celula huesped diana y/o la fusion viral con una celula huesped diana. Esta englobado en la presente invencion que la entrada viral, que puede ser cualquier ruta biologica mediada por virus que es necesaria para lograr la fijacion del virion a una celula huesped diana y/o la fusion viral con una celula huesped diana, puede modularse y/o reducirse y/o impedirse y/o inhibirse mediante la union espedfica de las secuencias de aminoacidos, los Nanobodies, polipeptidos y/o compuestos de la invencion a una proterna de la envuelta de un virus, tal como se mide usando un ensayo in vitro, celular o in vivo adecuado (tales como los mencionados en el presente documento). En particular, la entrada viral, que puede estar mediada por una proterna de la envuelta de un virus y/o su receptor viral, puede modularse, reducirse, impedirse o inhibirse mediante la union espedfica de las secuencias de aminoacidos, los Nanobodies, polipeptidos y/o compuestos de la invencion a una proterna de la envuelta de un virus, tal como se mide usando un ensayo in vitro, celular o in vivo adecuado (tales como los mencionados en el presente documento), en al menos el 1 %, preferiblemente al menos el 5 %, tal como al menos el 10 % o al menos el 25 %, por ejemplo en al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 % o el 90 % o mas, en comparacion con la entrada viral normal (es decir, que se produce de manera natural) (tal como se define en el presente documento), que puede estar mediada por una proterna de la envuelta de un virus y/o su receptor viral en el mismo ensayo en las mismas condiciones pero sin la presencia de la secuencia de aminoacidos, el Nanobody, polipeptido y/o compuesto de la invencion. Por tanto, tambien esta englobado que la fijacion viral y/o la fusion viral pueden modularse y/o reducirse y/o impedirse y/o inhibirse mediante la union espedfica de las secuencias de aminoacidos, los Nanobodies, polipeptidos y/o compuestos de la invencion a una proterna de la envuelta de un virus, tal como se mide usando un ensayo in vitro, celular o in vivo adecuado (tales como los mencionados en el presente documento). En particular, la fijacion viral y/o la fusion viral, que pueden estar mediadas por una proterna de la envuelta de un virus y/o su receptor viral, pueden modularse, reducirse, impedirse o inhibirse mediante la union espedfica de las secuencias de aminoacidos, los Nanobodies, polipeptidos y/o compuestos de la invencion a una proterna de la envuelta de un virus, tal como se mide usando un ensayo in vitro, celular o in vivo adecuado (tales como los mencionados en el presente documento), en al menos el 1 %, preferiblemente al menos el 5 %, tal como al menos el 10 % o al menos el 25 %, por ejemplo en al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 % o el 90 % o mas, en comparacion con la fijacion viral y/o la fusion viral normales (es decir, que se producen de manera natural), que pueden estar mediadas por una proterna de la envuelta de un virus y/o su receptor viral en el mismo ensayo en las mismas condiciones pero sin la presencia de la secuencia de aminoacidos, el Nanobody, polipeptido y/o compuesto de la invencion.
hh) El termino “replicacion viral” usado en el presente documento engloba cualquier ruta biologica mediada por virus que es necesaria para lograr la transcripcion y/o traduccion del genoma viral y/o el empaquetamiento viral y/o la formacion de viriones funcionales y/o la gemacion de viriones nacientes desde la membrana de la celula huesped diana. Esta englobado en la presente invencion que la replicacion viral, que puede ser cualquier ruta biologica mediada por virus que es necesaria para lograr la transcripcion y/o traduccion del genoma viral y/o el empaquetamiento viral y/o la formacion de viriones funcionales y/o la gemacion de viriones nacientes desde la membrana de la celula huesped diana, puede modularse y/o reducirse y/o impedirse y/o inhibirse mediante la union espedfica de las secuencias de aminoacidos, los Nanobodies, polipeptidos y/o compuestos descritos en el presente documento a una proterna de la envuelta de un virus, tal como se mide usando un ensayo in vitro, celular o in vivo adecuado (tales como los mencionados en el presente documento). En particular, la replicacion viral, que puede estar mediada por una proterna de la envuelta de un virus y/o su receptor viral, puede modularse, reducirse, impedirse o inhibirse mediante la union espedfica de las secuencias de aminoacidos, los Nanobodies, polipeptidos y/o compuestos descritos en el presente documento a una proterna de la envuelta de un virus, tal como se mide usando un ensayo in vitro, celular o in vivo adecuado (tales como los mencionados en el presente documento), en al menos el 1 %, preferiblemente al menos el 5 %, tal como al menos el 10 % o al menos el 25 %, por ejemplo en al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 % o el 90 % o mas, en comparacion con la replicacion viral normal (es decir, que se produce de manera natural) (tal como se define en el presente documento), que puede estar mediada por una proterna de la envuelta de un virus y/o su receptor viral, en el mismo ensayo en las mismas condiciones pero sin la presencia de la secuencia de aminoacidos, el Nanobody, polipeptido y/o compuesto descritos en el presente documento. Por tanto, tambien esta englobado que la transcripcion y/o traduccion del genoma viral y/o el empaquetamiento viral y/o la formacion de viriones funcionales y/o la gemacion de viriones nacientes desde la membrana de la celula huesped diana pueden modularse y/o reducirse y/o impedirse y/o inhibirse mediante la union espedfica de las secuencias de aminoacidos, los Nanobodies, polipeptidos y/o compuestos descritos en el presente documento a una proterna de la envuelta de un virus, tal como se mide usando un ensayo in vitro, celular o in vivo adecuado (tales como los mencionados en el presente documento). En particular, la transcripcion y/o traduccion del genoma viral y/o el empaquetamiento viral y/o la formacion de viriones funcionales y/o la gemacion de viriones nacientes desde la membrana de la celula huesped diana, que pueden estar mediados por una proterna de la envuelta de un virus y/o su receptor viral, pueden modularse, reducirse, impedirse o inhibirse mediante la union espedfica de las secuencias de aminoacidos, los Nanobodies, polipeptidos y/o compuestos descritos en el presente documento a una proterna de la envuelta de un virus, tal como se mide usando un ensayo in vitro, celular o in vivo adecuado (tales como los mencionados en el presente documento), en al menos el 1 %, preferiblemente al menos el 5 %, tal como al menos el 10 % o al menos el 25 %, por ejemplo en al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 % o el 90 % o mas, en comparacion con la transcripcion y/o traduccion normales (es decir, que se produce de manera natural) del genoma viral y/o el empaquetamiento viral y/o la formacion de viriones funcionales y/o la gemacion de viriones nacientes desde la membrana de la celula huesped diana, que pueden estar mediados por una protema de la envuelta de un virus y/o su receptor viral en el mismo ensayo en las mismas condiciones pero sin la presencia de la secuencia de aminoacidos, el Nanobody, polipeptido y/o compuesto descritos en el presente documento.
ii) En el contexto de la presente invencion “un virus” pueden ser cualquier virus que se conoce generalmente en la tecnica. En particular, dicho virus puede elegirse del grupo que consiste en un virus de ADN (tal como pero sin limitarse a un virus de ADNbc o un virus de ADNmc), un virus de ARN (tal como pero sin limitarse a un virus de ARNbc, un virus de ARNmc de sentido positivo o un virus de ARNmc de sentido negativo) y un virus de transcriptasa inversa (RT) (tal como pero sin limitarse un virus de ADNbc-RT y un virus de ARNmc-RT. Por ejemplo, dicho virus puede pertenecer a una familia viral elegida del grupo que consiste en Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Filoviridae, Retroviridae, Coronaviridae, Togaviridae y Flaviviridae, Rhabdoviridae, Herpesviridae, Arenaviridae, Bornaviridae, Bunyaviridae, Hepadnaviridae y Poxviridae; y dicho virus puede pertenecer, por ejemplo, a un genero viral elegido del grupo que consiste en alfavirus y flavivirus.
jj) Las figuras, la lista de secuencias y la Parte experimental/ejemplos se facilitan solamente para ilustrar adicionalmente la invencion .
Para una descripcion general de anticuerpos de cadena pesada y los dominios variables de los mismos, se hace referencia, entre otros, a la tecnica anterior citada en el presente documento, el documento WO 2008/077945, asf como a la tecnica anterior mencionada en la pagina 59 del documento WO 08/020079 y a la lista de bibliograffa mencionada en las paginas 41-43 de la solicitud internacional WO 06/040153.
Segun la terminologfa usada en la tecnica (vease la bibliograffa anterior), los dominios variables presentes en anticuerpos de cadena pesada que se producen de manera natural tambien se denominaran “dominios Vhh”, para distinguirlos de los dominios variables de cadena pesada que estan presentes en anticuerpos de 4 cadenas convencionales (que se denominaran a continuacion en el presente documento “dominios VH’) y de los dominios variables de cadena ligera que estan presentes en anticuerpos de 4 cadenas convencionales (que se denominaran a continuacion en el presente documento “dominios V.”).
Tal como se menciona en la tecnica anterior a la que se hizo referencia anteriormente, los dominios Vhh tienen varias caractensticas estructurales y propiedades funcionales unicas que hace que los dominios Vhh aislados (asi como los Nanobodies basados en los mismos, que comparten estas caractensticas estructurales y propiedades funcionales con los dominios Vhh que se producen de manera natural) y protemas que contienen los mismos sean altamente ventajosos para su uso como protemas o dominios de union a antígeno funcionales. En particular, y sin limitarse a ello, los dominios Vhh (que se han “disenado” por la naturaleza para unirse funcionalmente a un antígeno sin la presencia de, y sin ninguna interaccion con, un dominio variable de cadena ligera) y los Nanobodies pueden funcionar como una unica protema, dominio o unidad estructural de union a antígeno funcional, de tamano relativamente pequeno. Esto distingue los dominios Vhh de los dominios Vh y Vl de anticuerpos de 4 cadenas convencionales, que por si mismos generalmente no son adecuados para su aplicacion practica como protemas o dominios de union a antígeno individuales, sino que es necesario combinarlos de alguna forma u otra para proporcionar una unidad de union a antígeno funcional (como, por ejemplo, en fragmentos de anticuerpo convencionales tales como fragmentos Fab; en fragmentos ScFv, que consisten en un dominio Vh ligado covalentemente a un dominio Vl).
Debido a estas propiedades unicas, el uso de dominios Vhh y Nanobodies como protemas de union a antígeno o como dominios de union a antígeno individuales (es decir, como parte de una protema o un polipeptido mas grande) ofrece varias ventajas importantes con respecto al uso de dominios Vh y Vl convencionales, scFv o fragmentos de anticuerpo convencionales (tales como fragmentos Fab o F(ab')2), incluyendo las ventajas que se enumeran en las paginas 60 y 61 del documento WO 08/020079.
En un aspecto espedfico y preferido, la invencion proporciona Nanobodies contra una protema de la envuelta de un virus y, en particular, Nanobodies contra una protema de la envuelta de un virus que es capaz de infectar un animal de sangre caliente y, mas en particular, Nanobodies contra una protema de la envuelta de un virus que es capaz de infectar un mairnfero, y especialmente Nanobodies contra una protema de la envuelta de un virus humano; asf como protemas y/o polipeptidos que comprenden al menos uno de tales Nanobodies.
En particular, la invencion proporciona Nanobodies contra una protema de la envuelta de un virus, y protemas y/o polipeptidos que comprenden los mismos, que tienen propiedades terapeuticas y/o farmacologicas mejoradas y/u otras propiedades ventajosas (tales como, por ejemplo, facilidad de preparacion mejorada y/o costes reducidos de las mercandas), en comparacion con anticuerpos convencionales contra una protema de la envuelta de un virus o fragmentos de la misma, en comparacion con constructos que podnan basarse en tales anticuerpos o fragmentos de anticuerpo convencionales (tal como fragmentos Fab', fragmentos F(ab')2, constructos ScFv, “diabodies” y otros constructos multiespedficos (vease por ejemplo la revision en Holliger y Hudson, Nat. Biotechnol. 2005 Sep;23(9):1126-36)), y tambien en comparacion con los denominados “dAb” o anticuerpos de dominios (o de un solo dominio) similares que pueden derivar de dominios variables de anticuerpos convencionales. Estas propiedades mejoradas y ventajosas quedaran claras a partir de la descripcion adicional en el presente documento y, por ejemplo, incluyen sin limitacion uno o mas de:
- afinidad y/o avidez aumentada por una protema de la envuelta de un virus, o bien en un formato monovalente, en un formato multivalente (por ejemplo, en un formato bivalente o trivalente) y/o bien en un formato multiespedfico (por ejemplo, uno de los formatos multiespedficos descritos en el presente documento);
- mejor idoneidad para el formateo en un formato multivalente (por ejemplo, en un formato bivalente o trivalente); - mejor idoneidad para el formateo en un formato multiespedfico (por ejemplo, uno de los formatos multiespedficos descritos en el presente documento);
- idoneidad o susceptibilidad mejorada para sustituciones de “humanizacion” (tal como se define en el presente documento);
- menor inmunogenicidad, o bien en un formato monovalente, en un formato multivalente (por ejemplo, en un formato bivalente o trivalente) y/o bien en un formato multiespedfico (por ejemplo, uno de los formatos multiespedficos descritos en el presente documento);
- estabilidad aumentada, o bien en un formato monovalente, en un formato multivalente (por ejemplo, en un formato bivalente o trivalente) y/o bien en un formato multiespedfico (por ejemplo, uno de los formatos multiespedficos descritos en el presente documento);
- especificidad aumentada hacia una protema de la envuelta de un virus, o bien en un formato monovalente, en un formato multivalente (por ejemplo, en un formato bivalente o trivalente) y/o bien en un formato multiespedfico (por ejemplo, uno de los formatos multiespedficos descritos en el presente documento);
- reactividad cruzada disminuida o, cuando se desee, aumentada con una protema de la envuelta de un virus de diferentes especies; y/o
- una o mas de otras propiedades mejoradas deseadas para uso farmaceutico (incluyendo uso profilactico y/o uso terapeutico) y/o para uso diagnostico (incluyendo pero sin limitarse a uso con propositos de obtencion de imagenes), o bien en un formato monovalente, en un formato multivalente (por ejemplo, en un formato bivalente o trivalente) y/o bien en un formato multiespedfico (por ejemplo, uno de los formatos multiespedficos descritos a continuacion en el presente documento).
Tal como se describe generalmente en el presente documento para las secuencias de aminoacidos de la invencion, los Nanobodies estan preferiblemente en forma esencialmente aislada (tal como se define en el presente documento), o forman parte de una protema o un polipeptido de la invencion (tal como se define en el presente documento), que puede comprender o consistir esencialmente en uno o mas Nanobodies y que puede comprender opcionalmente ademas una o mas secuencias de aminoacidos adicionales (todas unidas opcionalmente mediante uno o mas ligadores adecuados). Por ejemplo, y sin limitacion, la una o mas secuencias de aminoacidos pueden usarse como unidad de union en tal protema o polipeptido, que puede contener opcionalmente una o mas secuencias de aminoacidos adicionales que pueden servir como unidad de union (es decir, contra una o mas de otras dianas distintas a una protema de la envuelta de un virus), para proporcionar un polipeptido multivalente o multiespedfico de la invencion, respectivamente, todos tal como se describen en el presente documento. En particular, tal protema o polipeptido puede comprender o consistir esencialmente en uno o mas Nanobodies y opcionalmente uno o mas (de otros) Nanobodies (es decir, dirigidos contra otras dianas distintas de una protema de la envuelta de un virus), todos unidos opcionalmente mediante uno o mas ligadores adecuados, para proporcionar un constructo de Nanobody multivalente o multiespedfico, respectivamente, tal como se describe adicionalmente en el presente documento. Tales protemas o polipeptidos tambien pueden estar en forma esencialmente aislada (tal como se define en el presente documento).
Tal como se describe generalmente en el presente documento para las secuencias de aminoacidos de la invencion, cuando un Nanobody (o un polipeptido de la invencion que comprende el mismo) esta destinado para la administracion a un sujeto (por ejemplo, con propositos profilacticos, terapeuticos y/o de diagnostico tal como se describe en el presente documento), esta dirigido preferiblemente contra una protema de la envuelta de un virus que es capaz de infectar humanos; mientras que con propositos veterinarios, esta dirigido preferiblemente contra una protema de la envuelta de un virus que es capaz de infectar la especie que va a tratarse. Ademas, como con las secuencias de aminoacidos de la invencion, un Nanobody puede producir o no reaccion cruzada (es decir, estar dirigido contra dos o mas protemas de la envuelta homologas de un virus que es capaz de infectar dos o mas especies de mairnfero, tal como contra dos o mas protemas de la envuelta homologas de un virus que es tanto capaz de infectar humanos como al menos una de las especies de marnffero mencionadas en el presente documento).
Un Nanobody puede producir o no reaccion cruzada para dos o mas genotipos, subtipos, mutantes de escape virales y/o cepas diferentes de un determinado virus. A este respecto, la presente invencion proporciona Nanobodies o polipeptidos multivalentes que muestran reactividad cruzada aumentada para diferentes genotipos, subtipos, mutantes de escape virales y/o cepas de un determinado virus en comparacion con el Nanobody monovalente correspondiente. En aun otro aspecto, los Nanobodies (multivalentes) estan dirigidos contra VRS y pueden unirse a diferentes cepas de VRS (tales como, por ejemplo, Long, A-2 y/o B-1). En aun otro aspecto, los Nanobodies (multivalentes) estan dirigidos contra VRS y pueden unirse a diferentes mutantes de escape de VRS (tales como, por ejemplo, los descritos en Lopez et al. 1998, J. Virol. 72: 6922-6928) y/o mutantes de escape espedficos para el sitio antigenico II, el sitio antigenico IV-VI o la combinacion de ambos sitios antigenicos.
Ademas, de nuevo tal como se describe generalmente en el presente documento para las secuencias de aminoacidos descritas en el presente documento, los Nanobodies descritos en el presente documento pueden estar dirigidos generalmente contra una protema de la envuelta de un virus que es la protema F de VRS.
Sin embargo, se supone y prefiere generalmente que los Nanobodies descritos en el presente documento y los polipeptidos de la invencion estan dirigidos preferiblemente contra un sitio de interaccion (tal como se define en el presente documento) y, en particular, contra al menos un epítopo de una protema de la envuelta de un virus, de tal manera que se inhibe, impide y/o modula al menos un ruta biologica mediada por virus en la que participa una protema de la envuelta de un virus y/o un receptor viral.
En particular, se supone y prefiere que los Nanobodies descritos en el presente documento y los polipeptidos y las composiciones de la presente invencion estan dirigidos contra al menos un epítopo de una protema de la envuelta de un virus que es la protema F de VRS, de tal manera que se inhibe, se impide y/o se modula la entrada viral en una celula huesped diana (tal como por ejemplo la fusion viral con una celula huesped diana).
Los Nanobodies y polipeptidos pueden estar dirigidos contra al menos un epítopo de una protema de la envuelta de un virus que esta expuesto en superficie o que esta ubicado en una cavidad o hendidura formada por una protema de la envuelta de un virus. Preferiblemente, los Nanobodies descritos en el presente documento y polipeptidos de la invencion estan dirigidos contra un sitio de interaccion (tal como se define en el presente documento) y, en particular, contra un epítopo que esta ubicado en una cavidad o hendidura formada por un tnmero de las protemas de fusion (tal como un tnmero de protema de fusion que es un tnmero de horquillas o un haz de seis helices) o un dfmero de las protemas de fusion, en el que dichas protemas de fusion pueden estar en su estado conformacional previo a, intermedio o posterior a la fusion.
Ademas, en particular, los Nanobodies descritos en el presente documento y polipeptidos de la invencion pueden estar dirigidos preferiblemente contra un sitio de interaccion, que se elige del grupo que consiste en el sitio antigenico A y/o aminoacidos 255 a 280 de la protema F del virus VRS.
Finalmente, los Nanobodies y polipeptidos descritos en el presente documento pueden estar dirigidos contra cualquier epítopo que esta ubicado en la region C-terminal de una protema de fusion y/o en el dominio N-terminal de una protema de fusion y/o en o que comprende el peptido de fusion de una protema de fusion y/o en el dominio transmembrana de una protema de fusion y/o en un superenrollamiento de helicea de una protema de fusion de una protema de fusion.
Los Nanobodies descritos en el presente documento y polipeptidos de la invencion estan dirigidos contra el sitio de union a Synagis® en la protema F de VRS y/o son capaces de competir con Synagis® por la union a la protema F de VRS. En particular, pueden estar dirigidos contra el sitio antigenico II (tambien denominado sitio A) de la protema F de VRS y mas preferiblemente contra la region de aa 250-275 de la protema F de VRS.
Por tanto, en un aspecto preferido, pero no limitativo, los Nanobodies descritos en el presente documento y polipeptidos de la invencion estan dirigidos generalmente contra cualquier epítopo o en particular contra uno de los epítopos mencionados anteriormente de una protema de la envuelta de un virus, y son tal como se definen adicionalmente en el presente documento. Dicho epítopo esta presente en una protema de la envuelta de un virus que es la protema F del virus VRS.
Tal como se describio ya en el presente documento, la secuencia de aminoacidos y la estructura de un Nanobody puede considerarse (sin limitarse a ello sin embargo) que se compone de cuatro regiones de entramado o “FR” (o a veces tambien denominadas “FW”), que se denominan en la tecnica y en el presente documento “region de entramado 1” o “FR1”; “region de entramado 2” o “FR2”; “region de entramado 3” o “FR3”; y “region de entramado 4” o “FR4”, respectivamente; regiones de entramado que estan interrumpidas por tres regiones determinantes de complementariedad o “CDR”, que se denominan en la tecnica “region determinante de complementariedad 1” o “CDRl”; “region determinante de complementariedad 2” o “CDR2”; y “region determinante de complementariedad 3” o “CDR3”, respectivamente. Algunas secuencias de entramado y CDR preferidas (y combinaciones de las mismas) que estan presentes en los Nanobodies de la invencion son tal como se describen en el presente documento. Otras secuencias de CDR adecuadas pueden obtenerse mediante los metodos descritos en el presente documento.
Segun un aspecto no limitativo pero preferido de la divulgacion, (las secuencias de CDR presentes en) los Nanobodies de la divulgacion son tales que:
- locs Nan1oobodies pueden unirse a una1 protema de la env7uelta die0 un virus con una constante de disociacion ('Kd') deq 10" a 10" moles/litro o menos, y preferiblemente de 10" a 10" moles/litro o menos y mas preferiblemente de 10" a 10"12 moles/litro (es decir, con una constante de asociacion (Ka) de 105 a 1012 litros/mol o mas, y preferiblemente de 107 a 1012 litros/mol o mas y mas preferiblemente de 108 a 1012 litros/mol);
y/o tales que:
" lo2s N 1a1nobodies 1 pueden unirs una 1 p1rotema de la envuelta de un 3 vir 1us 1 con 7 un 1a v 1elocidad de asociacion de entre 10 M s y aproximadamente e a 710 M s , preferiblemente entre 10 M s y 10 M s , mas preferiblemente entre 104 M"1s"1 y 107 M"1s"1, tal como entre 105 M"1s"1 y 107 M"1s"1;
y/o tales que:
" los Nanobodies pueden unirse a una protema de la envuelta de un virus con una velocidad de disociacion de entre 1s"1 (t1/2 = 0,69 s) y 10"6 s"1 (proporcionando un complejo casi irreversible con un t1/2 de multiples dfas) preferiblemente entre 10"2 s"1 y 10"6 s"1, mas preferiblemente entre 10"3 s"1 y 10"6 s"1, tal como entre 10"4 s"1 y 10"6 s"1. Preferiblemente, (las secuencias de CDR presentes en) los Nanobodies son tales que: un Nanobody monovalente (o un polipeptido que contiene solamente un Nanobody) es preferiblemente tal que se unira a una protema de la envuelta de un virus con una afinidad menor de 500 nM, preferiblemente menor de 200 nM, mas preferiblemente menor de 10 nM, tal como menor de 500 pM.
La afinidad del Nanobody contra una protema de la envuelta de un virus puede determinarse de una manera conocida per se, por ejemplo usando las tecnicas generales para medir Kd, Ka, koff o kon mencionados en el presente documento, asf como algunos de los ensayos espedficos descritos en el presente documento.
Algunos valores de CI50 preferidos para la union de los Nanobodies (y de polipeptidos que comprenden los mismos) a una protema de la envuelta de un virus quedaran claros a partir de la descripcion adicional y los ejemplos en el presente documento.
En un aspecto mas preferido espedficamente pero no limitativo, que no forma parte de la invencion reivindicada, la solicitud describe un Nanobody (tal como se define en el presente documento) contra la protema F del virus VRS humano, que consiste en 4 regiones de entramado (FR1 a FR4 respectivamente) y 3 regiones determinantes de complementariedad (CDR1 a CDR3 respectivamente), en las que:
" CDR1 se elige del grupo que consiste en:
a) las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 722 a 800, 812 a 971, 2484 y 2590 a 2597;
b) secuencias de aminoacidos que tienen una identidad de aminoacidos de al menos el 80 % con al menos una de las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 722 a 800, 812 a 971, 2484 y 2590 a 2597;
c) secuencias de aminoacidos que tienen una diferencia de 3, 2 o 1 aminoacido(s) con al menos una de las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 722 a 800, 812 a 971, 2484 y 2590 a 2597;
y/o
" CDR2 se elige del grupo que consiste en:
d) las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 1286 a 1364, 1376 a 1535, 2520 y 2606 a 2613;
e) secuencias de aminoacidos que tienen una identidad de aminoacidos de al menos el 80 % con al menos una de las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 1286 a 1364, 1376 a 1535, 2520 y 2606 a 2613;
f) secuencias de aminoacidos que tienen una diferencia de 3, 2 o 1 aminoacido(s) con al menos una de las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 1286 a 1364, 1376 a 1535, 2520 y 2606 a 2613;
y/o
" CDR3 se elige del grupo que consiste en:
g) las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 1850 a 1928, 1940 a 2099, 2556 y 2622 a 2629;
h) secuencias de aminoacidos que tienen una identidad de aminoacidos de al menos el 80 % con al menos una de las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 1850 a 1928, 1940 a 2099, 2556 y 2622 a 2629;
i) secuencias de aminoacidos que tienen una diferencia de 3, 2 o 1 aminoacido(s) con al menos una de las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 1850 a 1928, 1940 a 2099, 2556 y 2622 a 2629; o cualquier fragmento adecuado de tal secuencia de aminoacidos.
En particular, segun este aspecto preferido pero no limitativo, la solicitud describe un Nanobody (tal como se define en el presente documento) contra la protema F del virus VRS humano, que consiste en 4 regiones de entramado (FR1 a FR4 respectivamente) y 3 regiones determinantes de complementariedad (CDR1 a CDR3 respectivamente), en las que:
- CDR1 se elige del grupo que consiste en:
a) las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 722 a 800, 812 a 971, 2484 y 2590 a 2597;
b) secuencias de aminoacidos que tienen una identidad de aminoacidos de al menos el 80 % con al menos una de las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 722 a 800, 812 a 971, 2484 y 2590 a 2597;
c) secuencias de aminoacidos que tienen una diferencia de 3, 2 o 1 aminoacido(s) con al menos una de las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 722 a 800, 812 a 971, 2484 y 2590 a 2597;
y
- CDR2 se elige del grupo que consiste en:
d) las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 1286 a 1364, 1376 a 1535, 2520 y 2606 a 2613;
e) secuencias de aminoacidos que tienen una identidad de aminoacidos de al menos el 80 % con al menos una de las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 1286 a 1364, 1376 a 1535, 2520 y 2606 a 2613;
f) secuencias de aminoacidos que tienen una diferencia de 3, 2 o 1 aminoacido(s) con al menos una de las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 1286 a 1364, 1376 a 1535, 2520 y 2606 a 2613;
y
- CDR3 se elige del grupo que consiste en:
g) las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 1850 a 1928, 1940 a 2099, 2556 y 2622 a 2629;
h) secuencias de aminoacidos que tienen una identidad de aminoacidos de al menos el 80 % con al menos una de las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 1850 a 1928, 1940 a 2099, 2556 y 2622 a 2629;
i) secuencias de aminoacidos que tienen una diferencia de 3, 2 o 1 aminoacido(s) con al menos una de las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 1850 a 1928, 1940 a 2099, 2556 y 2622 a 2629; o cualquier fragmento adecuado de tal secuencias de aminoacidos.
Tal como se menciona generalmente en el presente documento para las secuencias de aminoacidos descritas en el presente documento, cuando un Nanobody descrito en el presente documento contiene una o mas secuencias de CDR1 segun b) y/o c):
i) cualquier sustitucion de aminoacido en tal CDR segun b) y/o c) es preferiblemente, y en comparacion con la CDR correspondiente segun a), una sustitucion de aminoacido conservativa (tal como se define en el presente documento);
y/o
ii) la CDR segun b) y/o c) solo contiene preferiblemente sustituciones de aminoacido, y no deleciones o inserciones de aminoacido, en comparacion con la CDR correspondiente segun a);
y/o
iii) la CDR segun b) y/o c) pueden ser una CDR que deriva de una CDR segun a) por medio de maduracion por afinidad usando una o mas tecnicas de maduracion por afinidad conocidas per se.
De manera similar, cuando un Nanobody descrito en el presente documento contiene una o mas secuencias de CDR2 segun e) y/o f):
i) cualquier sustitucion de aminoacido en tal CDR segun e) y/o f) es preferiblemente, y en comparacion con la CDR correspondiente segun d), una sustitucion de aminoacido conservativa (tal como se define en el presente documento);
y/o
ii) la CDR segun e) y/o f) solo contiene preferiblemente sustituciones de aminoacido, y no deleciones o inserciones de aminoacido, en comparacion con la CDR correspondiente segun d);
y/o
iii) la CDR segun e) y/o f) pueden ser una CDR que deriva de una CDR segun d) por medio de maduracion por afinidad usando una o mas tecnicas de maduracion por afinidad conocidas per se.
Ademas, de manera similar, cuando un Nanobody descrito en el presente documento contiene una o mas secuencias de CDR3 segun h) y/o i):
i) cualquier sustitucion de aminoacido en tal CDR segun h) y/o i) es preferiblemente, y en comparacion con la CDR correspondiente segun g), una sustitucion de aminoacido conservativa (tal como se define en el presente documento);
y/o
ii) la CDR segun h) y/o i) solo contiene preferiblemente sustituciones de aminoacido, y no deleciones o inserciones de aminoacido, en comparacion con la CDR correspondiente segun g);
y/o
iii) la CDR segun h) y/o i) pueden ser una CDR que deriva de una CDR segun g) por medio de maduracion por afinidad usando una o mas tecnicas de maduracion por afinidad conocidas per se.
Debe entenderse que los ultimos tres parrafos se aplican generalmente a cualquier Nanobody descrito en el presente documento que comprenda una o mas secuencias de CDR1, secuencias de CDR2 y/o secuencias de CDR3 segun b), c), e), f), h) o i), respectivamente.
De los Nanobodies descritos en el presente documento, los Nanobodies que comprenden una o mas de las CDR enumeradas de manera explfcita anteriormente se prefieren particularmente; los Nanobodies que comprenden dos o mas de las CDR enumeradas de manera explfcita anteriormente se prefieren mas particularmente; y los Nanobodies que comprenden tres de las CDR enumeradas de manera explfcita anteriormente son los mas preferidos particularmente.
Algunas combinaciones particularmente preferidas, pero no limitativas de secuencias de CDR, asf como combinaciones preferidas de secuencias de CDR y secuencias de entramado, se mencionan en la tabla B-1 a continuacion, que enumera las secuencias de CDR y secuencias de entramado que estan presentes en varios Nanobodies preferidos (pero no limitativos). Tal como le quedara claro al experto, una combinacion de secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 que aparecen en el mismo clon (es decir, secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 que se mencionan en la misma lmea en la tabla B-1) se preferiran habitualmente (aunque la invencion en su sentido mas amplio no se limita a ello, y tambien comprende otras combinaciones adecuadas de las secuencias de CDR mencionadas en la tabla B-1). Ademas, una combinacion de secuencias de CDR y secuencias de entramado que aparecen en el mismo clon (es decir, secuencias de CDR y secuencias de entramado que se mencionan en la misma lmea en la tabla B-1) se preferiran habitualmente (aunque la invencion en su sentido mas amplio no se limita a ello, y tambien comprende otras combinaciones adecuadas de las secuencias de CDR y secuencias de entramado mencionadas en la tabla B-1, asf como combinaciones de tales secuencias de c Dr y otras secuencias de entramado adecuadas, por ejemplo tal como se describe adicionalmente en el presente documento).
Ademas, en los Nanobodies descritos en el presente documento que comprenden las combinaciones de CDR mencionadas en la tabla B-1, cada CDR puede reemplazarse por una CDR elegida del grupo que consiste en secuencias de aminoacidos que tienen una identidad de secuencia de al menos el 80 %, preferiblemente al menos 90 %, mas preferiblemente al menos el 95 %, incluso mas preferiblemente al menos el 99 % (tal como se define en el presente documento) con las CDR mencionadas; en las que:
i) cualquier sustitucion de aminoacido en tal CDR es preferiblemente, y en comparacion con la secuencia de CDR correspondiente mencionada en la tabla B-1, una sustitucion de aminoacido conservativa (tal como se define en el presente documento);
y/o
ii) cualquiera de tales secuencias de CDR solo contiene preferiblemente sustituciones de aminoacido, y no deleciones o inserciones de aminoacido, en comparacion con la secuencia de CDR correspondiente mencionada en la tabla B-1;
y/o
iii) cualquiera de tales secuencias de CDR es una CDR que deriva por medio de una tecnica para maduracion por afinidad conocida per se y, en particular, partiendo de la secuencia de CDR correspondiente mencionada en la tabla B-1.
Sin embargo, tal como le quedara claro al experto, las (combinaciones de) secuencias de CDR, asf como (las combinaciones de) secuencias de CDR y secuencias de entramado mencionadas en la tabla B-1 se preferiran generalmente.
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Lo mas preferiblemente, en los Nanobodies descritos en el presente documento, las tres secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 presentes se eligen de manera adecuada del grupo que consiste en las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, enumeradas en la tabla B-1 o del grupo de secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, que tienen una identidad de secuencia de al menos el 80 %, preferiblemente al menos 90 %, mas preferiblemente al menos el 95 %, incluso mas preferiblemente al menos el 99 % con al menos una de las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, enumeradas en la tabla B-1; y/o del grupo que consiste en las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, que tienen 3, 2 o solamente 1 diferencia(s) de aminoacido con al menos una de las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, enumeradas en la tabla B-1.
Incluso mas preferiblemente, en los Nanobodies descritos en el presente documento, al menos una de las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 presentes se elige de manera adecuada del grupo que consiste en las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, enumeradas en la tabla B-1. Preferiblemente, en este aspecto, al menos una o preferiblemente ambas de las otras dos secuencias de CDR presentes se eligen de manera adecuada de secuencias de CDR que tienen una identidad de secuencia de al menos el 80 %, preferiblemente al menos 90 %, mas preferiblemente al menos el 95 %, incluso mas preferiblemente al menos el 99 % con al menos una de las secuencias de CDR correspondientes, respectivamente, enumeradas en la tabla B-1; y/o del grupo que consiste en las secuencias de CDR que tienen 3, 2 o solamente 1 diferencia(s) de aminoacido con al menos una de las secuencias correspondientes, respectivamente, enumeradas en la tabla B-1.
En particular, en los Nanobodies descritos en el presente documento, al menos la secuencia de CDR3 presente se elige de manera adecuada del grupo que consiste en las CDR3 enumeradas en la tabla B-1. Preferiblemente, en este aspecto, al menos una y preferiblemente ambas de las secuencias de CDR1 y de CDR2 presentes se eligen de manera adecuada de los grupos de secuencias de CDR1 y de CDR2, respectivamente, que tienen una identidad de secuencia de al menos el 80 %, preferiblemente al menos 90 %, mas preferiblemente al menos el 95 %, incluso mas preferiblemente al menos el 99 % con las secuencias de CDR1 y de CDR2, respectivamente, enumeradas en la tabla B-1; y/o del grupo que consiste en las secuencias de CDR1 y de CDR2, respectivamente, que tienen 3, 2 o solamente 1 diferencia(s) de aminoacido con al menos una de las secuencias de CDR1 y de CDR2, respectivamente, enumeradas en la tabla B-1.
Incluso mas preferiblemente, en los Nanobodies descritos en el presente documento, al menos dos de las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 presentes se eligen de manera adecuada del grupo que consiste en las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, enumeradas en la tabla B-1. Preferiblemente, en este aspecto, la secuencia de CDR restante presente se elige de manera adecuada del grupo de secuencias de CDR que tienen una identidad de secuencia de al menos el 80 %, preferiblemente al menos 90 %, mas preferiblemente al menos el 95 %, incluso mas preferiblemente al menos el 99 % con al menos una de las secuencias de CDR correspondientes enumeradas en la tabla B-1; y/o del grupo que consiste en secuencias de CDR que tienen 3, 2 o solamente 1 diferencia(s) de aminoacido con al menos una de las secuencias correspondientes enumeradas en la tabla B-1.
En particular, en los Nanobodies descritos en el presente documento, al menos la secuencia de CDR3 se elige de manera adecuada del grupo que consiste en las secuencias de CDR3 enumeradas en la tabla B-1, y o bien la secuencia de CDR1 o bien la secuencia de CDR2 se elige de manera adecuada del grupo que consiste en las secuencias de CDR1 y de CDR2, respectivamente, enumeradas en la tabla B-1. Preferiblemente, en este aspecto, la secuencia de CDR restante presente se elige de manera adecuada del grupo de secuencias de CDR que tienen una identidad de secuencia de al menos el 80 %, preferiblemente al menos 90 %, mas preferiblemente al menos el 95 %, incluso mas preferiblemente al menos el 99 % con al menos una de las secuencias de CDR correspondientes enumeradas en la tabla B-1; y/o del grupo que consiste en secuencias de CDR que tienen 3, 2 o solamente 1 diferencia(s) de aminoacido con las secuencias correspondientes de CDR enumeradas en la tabla B-1.
Incluso mas preferiblemente, en los Nanobodies descritos en el presente documento, las tres secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 presentes se eligen de manera adecuada del grupo que consiste en las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, enumeradas en la tabla B-1.
Ademas, generalmente, las combinaciones de las CDR enumeradas en la tabla B-1 (es decir, las mencionadas en la misma lmea en la tabla B-1) se prefieren. Por tanto, se prefiere generalmente que, cuando una CDR en un Nanobody descrito en el presente documento es una secuencia de CDR mencionada en la tabla B-1 o se elige de manera adecuada del grupo de secuencias de CDR que tienen una identidad de secuencia de al menos el 80 %, preferiblemente al menos 90 %, mas preferiblemente al menos el 95 %, incluso mas preferiblemente al menos el 99 % con una secuencia de CDR enumerada en la tabla B-1; y/o del grupo que consiste en secuencias de CDR que tienen 3, 2 o solamente 1 diferencia(s) de aminoacido con una secuencia de CDR enumerada en la tabla B-1, que al menos una y preferiblemente ambas de las otras CDR se eligen de manera adecuada de las secuencias de CDR que pertenecen a la misma combinacion en la tabla B-1 (es decir, mencionadas en la misma lmea en la tabla B-1) o se eligen de manera adecuada del grupo de secuencias de CDR que tienen una identidad de secuencia de al menos el 80 %, preferiblemente al menos 90 %, mas preferiblemente al menos el 95 %, incluso mas preferiblemente al menos el 99 % con la(s) secuencia(s) de CDR que pertenece(n) a la misma combinacion y/o del grupo que consiste en secuencias de CDR que tienen 3, 2 o solamente 1 diferencia(s) de aminoacido con la(s) secuencia(s) de CDR que pertenece(n) a la misma combinacion. Las demas preferencias indicadas en los parrafos anteriores tambien se aplican a las combinaciones de las CDR mencionadas en la tabla B-1.
Por tanto, a modo de ejemplos no limitativos, un Nanobody descrito en el presente documento puede comprender, por ejemplo, una secuencia de CDR1 que tiene una identidad de secuencia de mas del 80 % con una de las secuencias de CDR1 mencionadas en la tabla B-1, una secuencia de CDR2 que tiene 3, 2 o 1 diferencia(s) de aminoacido con una de las secuencias de CDR2 mencionadas en la tabla B-1 (pero que pertenecen a una combinacion diferente), y una secuencia de CDR3.
Algunos Nanobodies preferidos descritos en el presente documento pueden comprender, por ejemplo: (1) una secuencia de CDR1 que tiene una identidad de secuencia de mas del 80 % con una de las secuencias de CDR1 mencionadas en la tabla B-1; una secuencia de CDR2 que tiene 3, 2 o 1 diferencia(s) de aminoacido con una de las secuencias de CDR2 mencionadas en la tabla B-1 (pero que pertenecen a una combinacion diferente); y una secuencia de CDR3 que tiene una identidad de secuencia de mas del 80 % con una de las secuencias de CDR3 mencionadas en la tabla B-1 (pero que pertenecen a una combinacion diferente); o (2) una secuencia de CDR1 que tiene una identidad de secuencia de mas del 80 % con una de las secuencias de CDR1 mencionadas en la tabla B-1; una secuencia de CDR2, y una de las secuencias de CDR3 enumeradas en la tabla B-1; o (3) una secuencia de CDR1; una secuencia de CDR2 que tiene una identidad de secuencia de mas del 80 % con una de la secuencia de CDR2 enumeradas en la tabla B-1; y una secuencia de CDR3 que tiene 3, 2 o 1 diferencia(s) de aminoacido con la secuencia de CDR3 mencionada en la tabla B-1 que pertenece a la misma combinacion que la secuencia de CDR2.
Algunos Nanobodies particularmente preferidos descritos en el presente documento pueden comprender, por ejemplo: (1) una secuencia de CDR1 que tiene una identidad de secuencia de mas del 80% con una de las secuencias de CDR1 mencionadas en la tabla B-1; una secuencia de CDR2 que tiene 3, 2 o 1 diferencia(s) de aminoacido con la secuencia de CDR2 mencionada en la tabla B-1 que pertenece a la misma combinacion; y una secuencia de CDR3 que tiene una identidad de secuencia de mas del 80 % con la secuencia de CDR3 mencionada en la tabla B-1 que pertenece a la misma combinacion; (2) una secuencia de CDR1; una CDR 2 enumerada en la tabla B-1 y una secuencia de CDR3 enumerada en la tabla B-1 (en las que la secuencia de CDR2 y la secuencia de CDR3 pueden pertenecer a diferentes combinaciones).
Algunos Nanobodies incluso mas preferidos descritos en el presente documento pueden comprender, por ejemplo: (1) una secuencia de CDR1 que tiene una identidad de secuencia de mas del 80 % con una de las secuencias de CDR1 mencionadas en la tabla B-1; la secuencia de CDR2 enumerada en la tabla B-1 que pertenece a la misma combinacion; y una secuencia de CDR3 mencionada en la tabla B-1 que pertenece a una combinacion diferente; o (2) una secuencia de CDR1 mencionada en la tabla B-1; una secuencia de CDR2 que tiene 3, 2 o 1 diferencia(s) de aminoacido con la secuencia de CDR2 mencionada en la tabla B-1 que pertenece a la misma combinacion; y una secuencia de CDR3 que tiene una identidad de secuencia de mas del 80 % con la secuencia de CDR3 enumerada en la tabla B-1 que pertenece a la misma combinacion o una diferente.
Nanobodies particularmente preferidos descritos en el presente documento pueden comprender, por ejemplo, una secuencia de CDR1 mencionada en la tabla B-1, una secuencia de CDR2 que tiene una identidad de secuencia de mas del 80 % con la secuencia de CDR2 mencionada en la tabla B-1 que pertenece a la misma combinacion; y la secuencia de CDR3 mencionada en la tabla B-1 que pertenece a la misma combinacion.
En los Nanobodies mas preferidos descritos en el presente documento, las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 presentes se eligen de manera adecuada de una de las combinaciones de secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, enumeradas en la tabla B-1.
Segun otro aspecto preferido, pero no limitativo de la invencion (a) CDR1 tiene una longitud de entre 1 y 12 residuos de aminoacido, y habitualmente entre 2 y 9 residuos de aminoacido, tales como 5, 6 o 7 residuos de aminoacido; y/o (b) CDR2 tiene una longitud de entre 13 y 24 residuos de aminoacido, y habitualmente entre 15 y 21 residuos de aminoacido, tales como 16 y 17 residuos de aminoacido; y/o (c) CDR3 tiene una longitud de entre 2 y 35 residuos de aminoacido, y habitualmente entre 3 y 30 residuos de aminoacido, tales como entre 6 y 23 residuos de aminoacido.
Generalmente, los Nanobodies con las secuencias de CDR tal como se definen en el presente documento pueden ser tal como se describen adicionalmente en el presente documento, y tienen preferiblemente secuencias de entramado que tambien son tal como se describen adicionalmente en el presente documento. Por tanto, por ejemplo y tal como se menciona en el presente documento, tales Nanobodies pueden ser Nanobodies que se producen de manera natural (a partir de cualquier especie adecuada), secuencias de Vhh que se producen de manera natural (es decir, de una especie adecuada de camelido) o secuencias de aminoacidos sinteticas o semisinteticas o Nanobodies, incluyendo pero sin limitarse a secuencias de Vhh o Nanobodies parcialmente humanizados, secuencias de Vhh o Nanobodies completamente humanizados, secuencias de dominio variable de cadena pesada camelizadas, asf como Nanobodies que se han obtenido mediante las tecnicas mencionadas en el presente documento.
Por tanto, en un aspecto espedfico, pero no limitativo, la divulgacion se refiere a un Nanobody humanizado, que consiste en 4 regiones de entramado (FR1 a FR4 respectivamente) y 3 regiones determinates de complementariedad (CDR1 a CDR3 respectivamente), en las que CDR1 a CDR3 son tal como se definen en el presente documento y en el que dicho Nanobody humanizado comprende al menos una sustitucion de humanizacion (tal como se define en el presente documento) y, en particular, al menos una sustitucion de humanizacion en al menos una de sus secuencias de entramado (tal como se define en el presente documento).
En un aspecto preferido, la divulgacion se refiere a un Nanobody en el que las secuencias de CDR tienen una identidad de aminoacidos del 100 % con las secuencias de CDR de al menos una de las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 354, 371 y 2579 (vease la tabla A-1).
En otro aspecto preferido, pero no limitativo, la divulgacion se refiere a un Nanobody con una secuencia de aminoacidos que se elige del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 354, 371 y 2579 (vease la tabla A-1).
Otro aspecto preferido, pero no limitativo de la divulgacion se refiere a variantes humanizadas de los Nanobodies de las SEQ ID NO: 354, 371 y 2579 (vease la tabla A-1), que comprenden, en comparacion con la secuencia de Vhh nativa correspondiente, al menos una sustitucion de humanizacion (tal como se define en el presente documento) y, en particular, al menos una sustitucion de humanizacion en al menos una de sus secuencias de entramado (tal como se define en el presente documento). Algunos ejemplos preferidos, pero no limitativos de tales variantes humanizadas son los Nanobodies humanizados de las s Eq ID NO: 2999 a 3015 (vease la tabla A-68). Por tanto, la divulgacion tambien se refiere a un Nanobody humanizado con una secuencia de aminoacidos que se elige del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2999 a 3015 (vease la tabla A-6) o del grupo que consiste en secuencias de aminoacidos que tienen una identidad de secuencia de mas del 80 %, preferiblemente mas del 90 %, mas preferiblemente mas del 95 %, tal como el 99 % o mas (tal como se definen en el presente documento) con al menos una de las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 2999 a 3015 (vease la tabla A-6) (en las que las secuencias de aminoacidos que se eligen de este ultimo grupo de secuencias de aminoacidos pueden contener un mayor numero o un menor numero de sustituciones de humanizacion en comparacion con la secuencia correspondiente de las SEQ ID NO: 2999 a 3015 (vease la tabla A-6), siempre que conserven al menos una de las sustituciones de humanizacion presentes en la secuencia correspondiente de las SEQ ID NO: 2999 a 3015 (vease la tabla A-6)).
Los polipeptidos de la divulgacion comprenden o consisten esencialmente en al menos un Nanobody tal como se describio anteriormente. Algunos ejemplos preferidos, pero no limitativos de polipeptidos de la invencion se facilitan en las SEQ ID NO: 2408, 2412, 2989 a 2991, 2996 a 2998, 3042, 3046 y 3049 a 3052 (vease la tabla A-2, la tabla A-7, la tabla A-8).
Le quedara claro al experto que los Nanobodies que se mencionan en el presente documento como “preferidos” (o “mas preferidos”, “incluso mas preferidos”, etc.) tambien se prefieren (o se prefieren mas, o se prefieren incluso mas, etc.) para su uso en los polipeptidos descritos en el presente documento. Por tanto, los polipeptidos que comprenden o consisten esencialmente en uno o mas Nanobodies “preferidos” se preferiran generalmente, y los polipeptidos que comprenden o consisten esencialmente en uno o mas Nanobodies “mas preferidos” se preferiran mas generalmente, etc.
Generalmente, las protemas o los polipeptidos que comprenden o consisten esencialmente en un unico Nanobody (tal como un unico Nanobody descrito en el presente documento) se denominaran en el presente documento protemas o polipeptidos “monovalentes” o “constructos monovalentes”. Las protemas y los polipeptidos que comprenden o consisten esencialmente en dos o mas Nanobodies (tales como al menos dos Nanobodies descritos en el presente documento o al menos un Nanobody descrito en el presente documento y al menos otro Nanobody) se denominaran en el presente documento protemas o polipeptidos “multivalentes” o “constructos multivalentes”, y estos pueden proporcionar determinadas ventajas en comparacion con los Nanobodies monovalentes correspondientes. Algunos ejemplos no limitativos de tales constructos multivalentes quedaran claros a partir de la descripcion adicional en el presente documento.
En un aspecto preferido, los polipeptidos de la invencion son capaces de unirse a dos o mas determinantes antigenicos, epítopos, partes, dominios diferentes de una protema de la envuelta de un virus. En este contexto, los polipeptidos de la invencion tambien se denominan polipeptidos “multiparatopicos” (tales como, por ejemplo, “biparatopicos” o “triparatopicos”, etc.). Los polipeptidos multiparatopicos de la invencion pueden estar dirigidos contra cualquier determinante antigenico, epítopo, parte y/o dominio de la protema de la envuelta de un virus.
Por ejemplo, y generalmente, un polipeptido biparatopico de la invencion puede comprender al menos un Nanobody descrito en el presente documento dirigido contra un primer determinante antigenico, epítopo, parte o dominio de la protema de la envuelta viral y al menos un Nanobody descrito en el presente documento dirigido contra un segundo determinante antigenico, epítopo, parte o dominio de la protema de la envuelta viral diferente del primer determinante antigenico, epítopo, parte o dominio (en los que dichos Nanobodies pueden ligarse de manera adecuada, por ejemplo mediante un ligador adecuado tal como se describe adicionalmente en el presente documento). Preferiblemente, tal polipeptido biparatopico de la invencion es ademas tal que, cuando se une a la protema de la envuelta viral, es capaz de unirse simultaneamente al primer determinante antigenico, epítopo, parte o dominio (es decir, mediante el al menos un Nanobody capaz de unirse a dicho primer determinante antigenico, epítopo, parte o dominio) y unirse a dicho segundo determinante antigenico, epítopo, parte o dominio (es decir, mediante el al menos un Nanobody capaz de unirse a dicho segundo determinante antigenico, epítopo, parte o dominio). Ejemplos de tales polipeptidos biparatopicos de la invencion quedaran claros a partir de la descripcion adicional en el presente documento. Ademas, un polipeptido triparatopico de la invencion puede comprender al menos un Nanobody adicional descrito en el presente documento dirigido contra un tercer determinante antigenico, epítopo, parte o dominio de la protema de la envuelta viral (diferente tanto del primer determinante antigenico, epítopo, parte o dominio como del segundo), y generalmente los polipeptidos multiparatopicos de la invencion pueden contener al menos dos Nanobodies descritos en el presente documento dirigidos contra al menos dos determinantes antigenicos, epítopos, partes o dominios diferentes de la protema de la envuelta viral. Generalmente, tales polipeptidos biparatopicos, triparatopicos y multiparatopicos de la invencion pueden ser tal como se describen adicionalmente en el presente documento.
En un aspecto preferido, pero no limitativo, los polipeptidos de la invencion son biparatopicos (o multiparatopicos) y estan dirigidos contra el sitio de union a Synagis® en la protema F de VRS y/o son capaces de competir con Synagis® por la union a la protema F de VRS, asf como contra al menos otro determinante antigenico, epítopo, parte o dominio en la protema F de VRS. Los polipeptidos de la invencion pueden estar dirigidos contra el sitio antigenico II (tambien denominado sitio A) de la protema F de VRS asf como contra al menos otro determinante antigenico, epítopo, parte o dominio en la protema F de VRS. En un aspecto preferido, los polipeptidos de la invencion estan dirigidos contra la region de aa 250-275 de la protema F de VRS asf como contra al menos otro determinante antigenico, epítopo, parte o dominio en la protema F de VRS.
Generalmente, tal polipeptido biparatopico (o multiparatopico) de la invencion contendra al menos un Nanobody descrito en el presente documento que es capaz de unirse al sitio de union a Synagis® en la protema F de VRS y/o capaz de competir con Synagis® por la union a la protema F de VRS (y, en particular, contra el sitio antigenico II (tambien denominado sitio A) de la protema F de VRS y mas preferiblemente contra la region de aa 250-275 de la protema F de VRS), asf como al menos un Nanobody adicional descrito en el presente documento que es capaz de unirse a al menos otro determinante antigenico, epítopo, parte o dominio en la protema F de VRS. Generalmente, tales polipeptidos biparatopicos (o multiparatopicos) de la invencion pueden ser tal como se describen adicionalmente en el presente documento, y los diversos aspectos preferidos de la invencion tal como se describen en el presente documento tambien se aplican a estos polipeptidos biparatopicos (o multiparatopicos) de la invencion (por ejemplo, estos polipeptidos biparatopicos y multiparatopicos de la invencion pueden comprender ligadores adecuados; y son preferiblemente tales que pueden unirse simultaneamente al sitio de union a Synagis® y a al menos otro determinante antigenico, epítopo, parte o dominio en la protema F de VRS).
En otro aspecto preferido, pero no limitativo, los polipeptidos de la invencion son biparatopicos y estan dirigidos al menos contra el sitio de union a Synagis® en la protema F de VRS asf como contra el sitio de union a 101F en la protema F de VRS. Los polipeptidos de la invencion pueden estar dirigidos contra el sitio antigenico II (tambien denominado sitio A) de la protema F de VRS. Los polipeptidos de la invencion pueden estar dirigidos contra el sitio antigenico IV-VI de la protema F de VRS. Los polipeptidos de la invencion pueden estar dirigidos contra el sitio antigenico II (tambien denominado sitio A) de la protema F de VRS asf como contra el sitio antigenico IV-VI de la protema F de VRS. En un aspecto preferido, los polipeptidos de la invencion estan dirigidos contra la region de aa 250-275 de la protema F de VRS. En otro aspecto preferido, los polipeptidos de la invencion estan dirigidos contra la region de aa 250-275 de la protema F de VRS asf como contra la region de aa 423-436 de la protema F de VRS. En otro aspecto preferido, los polipeptidos de la invencion estan dirigidos contra la region de aa 423-436 de la protema F de VRS. En otro aspecto preferido, los polipeptidos de la invencion estan dirigidos contra el sitio antigenico II (tambien denominado sitio A) de la protema F de VRS asf como contra la region de aa 423-436 de la protema F de VRS. En otro aspecto preferido, los polipeptidos de la invencion estan dirigidos contra la region de aa 250-275 de la protema F de VRS asf como contra el sitio antigenico IV-VI de la protema F de VRS.
Generalmente, tal polipeptido biparatopico (o multiparatopico) de la invencion contendra al menos un Nanobody que es capaz de unirse al sitio de union a Synagis® en la protema F de VRS y/o es capaz competir con Synagis® por la union a la protema F de VRS (y, en particular, contra el sitio antigenico II (tambien denominado sitio A) de la protema F de VRS y mas preferiblemente contra la region de aa 250-275 de la protema F de VRS), asf como al menos un Nanobody descrito en el presente documento que es capaz de unirse al sitio de union a 101F en la protema F de VRS y/o es capaz de competir con 101F por la union a la protema F de VRS (y, en particular, contra el sitio antigenico IV-VI de la protema F de VRS y mas preferiblemente contra la region de aa 423-436 de la protema F de VRS). Generalmente, tales polipeptidos biparatopicos (o multiparatopicos) de la invencion pueden ser tal como se describen adicionalmente en el presente documento, y los diversos aspectos preferidos de la invencion tal como se describen en el presente documento tambien se aplican a estos polipeptidos biparatopicos (o multiparatopicos) de la invencion (por ejemplo, estos polipeptidos biparatopicos y multiparatopicos de la invencion pueden comprender ligadores adecuados; y son preferiblemente tales que pueden unirse simultaneamente al sitio de union a Synagis® y al sitio de union a 10lF en la protema F de VRS).
En otro aspecto preferido, pero no limitativo, los polipeptidos de la invencion son biparatopicos (o multiparatopicos) y son al menos capaces, tras la union a la protema F de VRS, de neutralizar un virus (tal como se definen en el presente documento); para modular, reducir y/o inhibir la infectividad de un virus (tal como se define en el presente documento); para modular y, en particular, inhibir y/o impedir la entrada viral (tal como se define adicionalmente en el presente documento) en una celula huesped diana; mediante el mismo mecanismo de accion que Synagis®. En otro aspecto preferido, pero no limitativo, los polipeptidos de la invencion son biparatopicos con ambos paratopos dirigidos contra el sitio de union a Synagis® en la protema F de VRS. Los polipeptidos de la invencion pueden estar dirigidos contra el sitio antigenico II (tambien denominado sitio A) de la protema F de VRS (un paratopo o ambos paratopos). En un aspecto preferido, los polipeptidos de la invencion estan dirigidos contra la region de aa 250-275 de la protema F de v Rs (un paratopo o ambos paratopos).
De nuevo, los polipeptidos biparatopicos (o multiparatopicos) anteriores de la invencion pueden ser tal como se describen adicionalmente en el presente documento, y los diversos aspectos preferidos de la invencion tal como se describen en el presente documento tambien se aplican a estos polipeptidos biparatopicos (o multiparatopicos) de la invencion (por ejemplo, estos polipeptidos biparatopicos y multiparatopicos de la invencion pueden comprender ligadores adecuados; y son preferiblemente tales que pueden unirse simultaneamente a ambos sitios de union). En otro aspecto preferido, los polipeptidos de la invencion son capaces de unirse a tres (diferentes) determinantes antigenicos, epítopos, partes, dominios de una protema de la envuelta de un virus. En este contexto, los polipeptidos de la invencion tambien se denominan secuencias de aminoacidos y polipeptidos “trivalentes”. Los polipeptidos trivalentes de la invencion pueden estar dirigidos contra cualesquiera determinantes antigenicos, epítopos, partes y/o dominios de la protema de la envuelta del virus.
Por ejemplo, y generalmente, un polipeptido trivalente de la divulgacion puede comprender tres Nanobodies descritos en el presente documento dirigidos contra el mismo determinante antigenico, epítopo, parte o dominio de la protema de la envuelta viral (en el que los Nanobodies pueden ligarse de manera adecuada, por ejemplo mediante un ligador adecuado tal como se describe adicionalmente en el presente documento). Preferiblemente, tal polipeptido trivalente de la invencion es ademas tal que, cuando se une a la protema de la envuelta viral, es capaz de unirse simultaneamente al primer determinante antigenico, epítopo, parte o dominio (es decir, mediante el al menos un Nanobody descrito en el presente documento capaz de unirse a dicho primer determinante antigenico, epítopo, parte o dominio), unirse a dicho segundo determinante antigenico, epítopo, parte o dominio (es decir, mediante el al menos un Nanobody descrito en el presente documento capaz de unirse a dicho segundo determinante antigenico, epítopo, parte o dominio) y unirse a dicho tercer determinante antigenico, epítopo, parte o dominio (es decir, mediante el al menos un Nanobody descrito en el presente documento capaz de unirse a dicho tercer determinante antigenico, epítopo, parte o dominio). Ejemplos de tales polipeptidos trivalentes quedaran claros a partir de la descripcion adicional en el presente documento. Generalmente, tales polipeptidos trivalentes pueden ser tal como se describen adicionalmente en el presente documento.
En otro aspecto preferido, pero no limitativo, los polipeptidos de la divulgacion son trivalentes y comprenden tres Nanobodies descritos en el presente documento dirigidos contra el sitio de union a Synagis® en la protema F de VRS y/o son capaces de competir con Synagis por la union a la protema F de VRS. Los polipeptidos de la invencion que estan dirigidos contra el sitio de union a Synagis® en la protema F de VRS pueden estar dirigidos contra el sitio antigenico II (tambien denominado sitio A) de la protema F de VRS. En un aspecto preferido, los polipeptidos de la invencion que estan dirigidos contra el sitio de union a Synagis® en la protema F de VRS estan dirigidos contra la region de aa 250-275 de la protema F de VRS. Generalmente, tal polipeptido trivalente contendra tres Nanobodies descritos en el presente documento que son capaces de unirse al sitio de union a Synagis® en la protema F de VRS y/o son capaces de competir con Synagis® por la union a la protema F de VRS (y, en particular, contra el sitio antigenico II (tambien denominado sitio A) de la protema F de VRS y mas preferiblemente contra la region de aa 250-275 de la protema F de VRS). Generalmente, tales polipeptidos trivalentes de la invencion pueden ser tal como se describen adicionalmente en el presente documento, y los diversos aspectos preferidos de la invencion tal como se describen en el presente documento tambien se aplican a estos polipeptidos trivalentes de la invencion (por ejemplo, estos polipeptidos trivalentes de la invencion pueden comprender ligadores adecuados; y son preferiblemente tales que pueden unirse simultaneamente al sitio de union a Synagis®).
En otro aspecto preferido, pero no limitativo, los polipeptidos de la invencion son trivalentes y son al menos capaces, tras la union a la protema F de VRS, de neutralizar un virus (tal como se definen en el presente documento); para modular, reducir y/o inhibir la infectividad de un virus (tal como se define en el presente documento); para modular y, en particular, inhibir y/o impedir la entrada viral (tal como se define adicionalmente en el presente documento) en una celula huesped diana mediante el mismo mecanismo de accion que Synagis®.
En otro aspecto preferido, pero no limitativo, los polipeptidos de la invencion son trivalentes y son al menos capaces, tras la union a la protema F de VRS, de neutralizar un virus (tal como se definen en el presente documento); para modular, reducir y/o inhibir la infectividad de un virus (tal como se define en el presente documento); para modular y, en particular, inhibir y/o impedir la entrada viral (tal como se define adicionalmente en el presente documento) en una celula huesped diana; mediante el mismo mecanismo de accion que Synagis®.
Se facilitan polipeptidos trivalentes en las tablas C-6, la tabla A-2, la tabla A-7 y la tabla A-8.
Ejemplos preferidos, pero no limitativos de constructos de Nanobody multivalentes (trivalentes) son los polipeptidos de las SEQ ID NO: 2408, 2412, 2415, 2989 a 2991,2996 a 2998, 3042, 3046 y 3049 a 3052.
Segun otro aspecto espedfico, pero no limitativo, un polipeptido comprende o consiste esencialmente en al menos un Nanobody descrito en el presente documento y al menos otra unidad de union (es decir, dirigida contra otro epítopo, antigeno, diana, protema o polipeptido), que es preferiblemente tambien un Nanobody. Tales protemas o polipeptidos tambien se denominan en el presente documento protemas o polipeptidos “multiespedficos” o “constructos multiespedficos”.
Segun aun otro aspecto espedfico, pero no limitativo, un polipeptido comprende o consiste esencialmente en al menos un Nanobody, opcionalmente uno o mas Nanobodies adicionales, y al menos otra secuencia de aminoacidos (tal como una protema o un polipeptido) que confiere al menos una propiedad deseada al Nanobody y/o a la protema de fusion resultante. Algunos ejemplos no limitativos de tales secuencias de aminoacidos y de tales constructos de fusion quedaran claros a partir de la descripcion adicional en el presente documento.
Tambien es posible combinar dos o mas de los aspectos anteriores, por ejemplo para proporcionar un constructo biespedfico trivalente que comprende dos Nanobodies y otro Nanobody, y opcionalmente una o mas de otras secuencias de aminoacidos. Ejemplos no limitativos adicionales de tales constructos, asf como algunos constructos que se prefieren particularmente dentro del contexto de la presente invencion, quedaran claros a partir de la descripcion adicional en el presente documento.
En los constructos anteriores, el uno o mas Nanobodies y/u otras secuencias de aminoacidos pueden ligarse directamente unas a otras y/o ligarse de manera adecuada unas a otras mediante una o mas secuencias ligadoras. Algunos ejemplos adecuados pero no limitativos de tales ligadores quedaran claros a partir de la descripcion adicional en el presente documento.
En un aspecto espedfico de la invencion, un Nanobody o un compuesto, constructo o polipeptido de la invencion que comprende al menos un Nanobody puede tener una semivida aumentada, en comparacion con la secuencia de aminoacidos o Nanobody correspondiente de la invencion. Algunos ejemplos preferidos, pero no limitativos de tales Nanobodies, compuestos y polipeptidos le quedaran claros al experto basandose en la divulgacion adicional en el presente documento y, por ejemplo, comprenden secuencias de Nanobodies descritas en el presente documento o polipeptidos de la invencion que se han modificado qdmicamente para aumentar la semivida de los mismos (por ejemplo, por medio de pegilacion); secuencias de aminoacidos o Nanobodies que comprenden al menos un sitio de union adicional para la union a una protema serica (tal como albumina serica, vease por ejemplo el documento EP 0 368 684 B1, pagina 4); o polipeptidos de la invencion que comprenden al menos un Nanobody que se liga a al menos un resto (y, en particular, al menos una secuencia de aminoacidos) que aumenta la semivida del Nanobody. Ejemplos de polipeptidos de la invencion que comprenden tales secuencias de aminoacidos o restos que prolongan la semivida le quedaran claros al experto basandose en la divulgacion adicional en el presente documento; y por ejemplo incluyen, sin limitacion, polipeptidos en los que el uno o mas Nanobodies se ligan de manera adecuada a una o mas protemas sericas o fragmentos de las mismas (tales como albumina serica o fragmentos adecuados de la misma) o a una o mas unidades de union que pueden unirse a protemas sericas (tales como, por ejemplo, los Nanobodies o anticuerpos de dominios (o de un solo dominio) que pueden unirse a protemas sericas tales como albumina serica, inmunoglobulinas sericas tales como IgG, o transferrina); polipeptidos en los que un Nanobody se liga a una parte de Fc (tal como un Fc humano) o una parte o un fragmento adecuado del mismo; o polipeptidos en los que el uno o mas Nanobodies se ligan de manera adecuada a una o mas protemas o peptidos pequenos que pueden unirse a protemas sericas (tales como, sin limitacion, las protemas y los peptidos descritos en los documentos WO 91/01743, WO 01/45746, WO 02/076489 y WO 08/068280).
De nuevo, tal como le quedara claro al experto, tales Nanobodies, compuestos, constructos o polipeptidos pueden contener uno o mas grupos, residuos, restos o unidades de union adicionales, tales como una o mas secuencias de aminoacidos adicionales y, en particular, uno o mas Nanobodies adicionales (es decir, no dirigidos contra una protema de la envuelta de un virus), para proporcionar un constructo de Nanobody tri o multiespedfico.
Generalmente, los Nanobodies (o compuestos, constructos o polipeptidos que comprenden los mismos) con semivida aumentada tienen preferiblemente una semivida que es al menos 1,5 veces, preferiblemente al menos 2 veces, tal como al menos 5 veces, por ejemplo al menos 10 veces o mas de 20 veces, mayor que la semivida del Nanobody correspondiente per se. Por ejemplo, los Nanobodies descritos en el presente documento, compuestos, constructos o polipeptidos de la invencion con semivida aumentada pueden tener una semivida que esta aumentada en mas de 1 hora, preferiblemente mas de 2 horas, mas preferiblemente mas de 6 horas, tal como mas de 12 horas, o incluso mas de 24, 48 o 72 horas, en comparacion con el Nanobody correspondiente per se.
En un aspecto preferido, pero no limitativo de la invencion, tales Nanobodies descritos en el presente documento, compuestos, constructos o polipeptidos de la invencion presentan una semivida serica en humanos de al menos aproximadamente 12 horas, preferiblemente al menos 24 horas, mas preferiblemente al menos 48 horas, incluso mas preferiblemente al menos 72 horas o mas. Por ejemplo, los compuestos o polipeptidos de la invencion pueden tener una semivida de al menos 5 dfas (tal como de aproximadamente 5 a 10 dfas), preferiblemente al menos 9 dfas (tal como de aproximadamente 9 a 14 dfas), mas preferiblemente al menos aproximadamente 10 dfas (tal como de aproximadamente 10 a 15 dfas), o al menos aproximadamente 11 dfas (tal como de aproximadamente 11 a 16 dfas), mas preferiblemente al menos aproximadamente 12 dfas (tal como de aproximadamente 12 a 18 dfas o mas), o mas de 14 dfas (tal como de aproximadamente 14 a 19 dfas).
En otro aspecto de la invencion, un polipeptido de la invencion comprende uno o mas Nanobodies (tal como dos o preferiblemente uno) ligados (opcionalmente mediante una o mas secuencias ligadoras adecuadas) a una o mas secuencias de aminoacidos (tal como dos y preferiblemente una) que permiten que el polipeptido de la invencion resultante atraviese la barrera hematoencefalica. En particular, dicha una o mas secuencias de aminoacidos que permiten que los polipeptidos de la invencion resultantes atraviesen la barrera hematoencefalica pueden ser uno o mas Nanobodies (tal como dos y preferiblemente uno), tales como los Nanobodies descritos en el documento WO 02/057445, de los que son ejemplos preferidos FC44 (SEQ ID NO: 189 del documento WO 06/040153) y FC5 (SEQ
ID NO: 190 del documento WO 06/040154).
En particular, los polipeptidos que comprenden uno o mas Nanobodies son preferiblemente tales que:
- se unen a una protema de la envuelta de un virus con una constante de disociacion (Kd) de 10"5 a 10"12 moles/litro o menos, y preferiblemente de 10"7 a 10"12 moles/litro o menos y mas preferiblemente de 10"8 a 10"12 moles/litro (es decir, con una constante de asociacion (Ka) de 105 a 1012 litros/mol o mas, y preferiblemente de 107 a 1012 litros/mol o mas, y mas preferiblemente de 108 a 1012 litros/mol); y/o tales que:
- se unen a una pro e
aproximadamente 1*07t
M 1m e la envuelta de un viru
' 1a d
s' preferiblemente entre 103s c
M 1on
s 1 un
y 7a v
101elo
M 1cidad de asociacion de entre 102
s , mas preferiblemente entre 104M"1
M 1s s1"1 y
y 107 M'1s'1, tal como entre 105 M'1s'1 y 107 M'1s'1; y/o tales que:
- se unen a una protema de la envuelta de un virus con una velocidad de disociacion de entre 1 s'1 (t-i/2 = 0,69 s) y 10'6 s'1 (proporcionando un complejo casi irreversible con un t-i/2 de multiples dias), preferiblemente entre 10'2 s'1 y 10'6 s'1, mas preferiblemente entre 10'3 s'1 y 10'6 s'1, tal como entre 10'4 s'1 y 10'6 s'1.
Preferiblemente, un polipeptido que contiene solamente una secuencia de aminoacidos o Nanobody es preferiblemente tal que se unira a una protema de la envuelta de un virus con una afinidad menor de 500 nM, preferiblemente menor de 200 nM, mas preferiblemente menor de 10 nM, tal como menor de 500 pM. A este respecto, le quedara claro al experto que un polipeptido que contiene dos o mas Nanobodies puede unirse a una protema de la envuelta de un virus con una avidez aumentada, en comparacion con un polipeptido que contiene solamente una secuencia de aminoacidos o Nanobody.
Algunos valores de CI50 preferidos para la union de las secuencias de aminoacidos, los Nanobodies descritos en el presente documento o polipeptidos de la invencion a una protema de la envuelta de un virus quedaran claros a partir de la descripcion adicional y los ejemplos en el presente documento.
Otros polipeptidos descritos en la solicitud pueden elegirse, por ejemplo, del grupo que consiste en secuencias de aminoacidos que tienen una “identidad de secuencia” de mas del 80 %, preferiblemente mas del 90 %, mas preferiblemente mas del 95 %, tal como el 99 % o mas (tal como se define en el presente documento) con una o mas de las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 2408, 2412, 2415, 2989 a 2991, 2996 a 2998, 3042, 3046, 3049 a 3052 (veanse la tabla A~2, la tabla A~7 y la tabla A~8), en las que los Nanobodies comprendidos dentro de dichas secuencias de aminoacidos son preferiblemente tal como se definen adicionalmente en el presente documento.
Otro aspecto de esta invencion se refiere a un acido nucleico que codifica una secuencia de aminoacidos de la invencion o un polipeptido de la invencion que comprende la misma. De nuevo, tal como se describe generalmente en el presente documento para los acidos nucleicos de la invencion, tal acido nucleico puede estar en forma de un constructo genetico, tal como se define en el presente documento.
En otro aspecto, la invencion se refiere a un huesped o una celula huesped que expresa o que es capaz de expresar una secuencia de aminoacidos de la invencion y/o un polipeptido de la invencion que comprende la misma; y/o que contiene un acido nucleico de la invencion. Algunos ejemplos preferidos pero no limitativos de tales huespedes o celulas huesped quedaran claros a partir de la descripcion adicional en el presente documento.
Otro aspecto de la invencion se refiere a un producto o una composicion que contiene o que comprende al menos un polipeptido de la invencion y/o al menos un acido nucleico de la invencion, y opcionalmente uno o mas componentes adicionales de tales composiciones conocidas per se, es decir que dependen del uso pretendido de la composicion.
Tal producto o composicion puede ser, por ejemplo, una composicion farmaceutica (tal como se describe en el presente documento), una composicion veterinaria o un producto o una composicion para uso diagnostico (tal como se describe tambien en el presente documento). Algunos ejemplos preferidos pero no limitativos de tales productos o composiciones quedaran claros a partir de la descripcion adicional en el presente documento.
La invencion se refiere ademas a metodos para preparar o generar las secuencias de aminoacidos, los compuestos, constructos, polipeptidos, acidos nucleicos, las celulas huesped, los productos y las composiciones descritos en el presente documento. Algunos ejemplos preferidos pero no limitativos de tales metodos quedaran claros a partir de la descripcion adicional en el presente documento.
La invencion se refiere ademas a aplicaciones y usos de las secuencias de aminoacidos, los compuestos, constructos, polipeptidos, acidos nucleicos, las celulas huesped, los productos y las composiciones descritos en el presente documento, asf como a metodos para la prevencion y/o el tratamiento para enfermedades y trastornos asociados con la entrada viral y/o la replicacion viral y/o mediados por una protema de la envuelta de un virus y/o su receptor viral. Algunas aplicaciones y usos preferidos pero no limitativos quedaran claros a partir de la descripcion adicional en el presente documento.
Otros aspectos, realizaciones, ventajas y aplicaciones de la invencion tambien quedaran claros a partir de la descripcion adicional a continuacion en el presente documento.
Generalmente, debe indicarse que el termino Nanobody tal como se usa en el presente documento en su sentido mas amplio no esta limitado a una fuente biologica espedfica o a un metodo de preparacion espedfico. Por ejemplo, tal como se comentara en mas detalle a continuacion, los Nanobodies pueden obtenerse generalmente mediante cualquiera de las tecnicas (1) a (8) mencionadas en las paginas 61 y 62 del documento WO 08/020079, o cualquier otra tecnica adecuada conocida per se. Una clase preferida de Nanobodies corresponden a los dominios Vhh de anticuerpos de cadena pesada que se producen de manera natural dirigidas contra una protema de la envuelta de un virus. Tal como se describe adicionalmente en el presente documento, tales secuencias de Vhh pueden generarse u obtenerse generalmente mediante la inmunizacion de manera adecuada de una especie de camelido con una protema de la envuelta de un virus (es decir, de modo que se produzca una respuesta inmunitaria y/o anticuerpos de cadena pesada dirigidos contra una protema de la envuelta de un virus), mediante la obtencion de una muestra biologica adecuada a partir de dicho camelido (tal como una muestra de sangre, muestra de suero o muestra de celulas B), y mediante la generacion de secuencias de Vhh dirigidas contra una protema de la envuelta de un virus, partiendo de dicha muestra, usando cualquier tecnica adecuada conocida per se. Tales tecnicas le quedaran claras al experto y/o se describen adicionalmente en el presente documento.
Alternativamente, tales dominios Vhh que se producen de manera natural contra una protema de la envuelta de un virus, pueden obtenerse a partir de bibliotecas no expuestas previamente de secuencias de Vhh de camelido, por ejemplo mediante el examen de tal biblioteca usando una protema de la envuelta de un virus, o al menos una parte, un fragmento, determinante antigenico o epttopo de la misma usando una o mas tecnicas de examen conocidas per se. Tales bibliotecas y tecnicas se describen, por ejemplo, en los documentos WO 99/37681, WO 01/90190, Wo 03/025020 y WO 03/035694. Alternativamente, pueden usarse bibliotecas sinteticas o semisinteticas mejoradas derivadas de bibliotecas de VHH no expuestas previamente, tales como bibliotecas de VHH obtenidas a partir de bibliotecas de Vhh no expuestas previamente mediante tecnicas tales como mutagenesis al azar y/o intercambio de CDR tal como se describe, por ejemplo, en el documento WO 00/43507.
Tal como se menciona en el presente documento, una clase particularmente preferida de Nanobodies comprende Nanobodies con una secuencia de aminoacidos que corresponde a la secuencia de aminoacidos de un dominio VHH que se produce de manera natural, pero que se ha “humanizado”, es decir reemplazando uno o mas residuos de aminoacido en la secuencia de aminoacidos de dicha secuencia de Vhh que se produce de manera natural (y, en particular, en las secuencias de entramado) por uno o mas de los residuos de aminoacido que aparece(n) en la(s) posicion/posiciones correspondiente(s) en un dominio Vh de un anticuerpo de 4 cadenas convencional de un ser humano (por ejemplo, indicado anteriormente), tal como se describe adicionalmente en, y usando las tecnicas mencionadas en, la pagina 63 del documento WO 08/020079. Otra clase particularmente preferida de Nanobodies comprende Nanobodies con una secuencia de aminoacidos que corresponde a la secuencia de aminoacidos de un dominio Vh que se produce de manera natural, pero que se ha “camelizado”, es decir reemplazando uno o mas residuos de aminoacido en la secuencia de aminoacidos de un dominio Vh que se produce de manera natural de un anticuerpo de 4 cadenas convencional por uno o mas de los residuos de aminoacido que aparece(n) en la(s) posicion/posiciones correspondiente(s) en un dominio Vhh de un anticuerpo de cadena pesada, tal como se describe adicionalmente en, y usando las tecnicas mencionadas en, la pagina 63 del documento WO 08/020079.
Otras tecnicas y metodos adecuados para obtener los Nanobodies y/o acidos nucleicos que codifican los mismos, partiendo de secuencias de Vh que se producen de manera natural o preferiblemente secuencias de Vhh, quedaran claros para el experto y, por ejemplo, pueden incluir las tecnicas que se mencionan en la pagina 64 del documento WO 08/00279. Tal como se menciona en el presente documento, los Nanobodies pueden caracterizarse en particular por la presencia de uno o mas “residuos distintivos” (tal como se describen en el presente documento) en una o mas de las secuencias de entramado.
Por tanto, segun un aspecto preferido, pero no limitativo de la invencion, un Nanobody en su sentido mas amplio puede definirse generalmente como un polipeptido que comprende:
a) una secuencia de aminoacidos que se compone de cuatro secuencias/regiones de entramado interrumpidas por tres secuencias/regiones determinates de complementariedad, en la que el residuo de aminoacido en la posicion 108 segun la numeracion de Kabat es Q;
y/o:
b) una secuencia de aminoacidos que se compone de cuatro secuencias/regiones de entramado interrumpidas por tres secuencias/regiones determinantes de complementariedad, en la que el residuo de aminoacido en la posicion 45 segun la numeracion de Kabat es un aminoacido con carga (tal como se define en el presente documento) o un residuo de cistema, y la posicion 44 es preferiblemente una E;
y/o:
c) una secuencia de aminoacidos que se compone de cuatro secuencias/regiones de entramado interrumpidas por tres secuencias/regiones determinantes de complementariedad, en la que el residuo de aminoacido en la posicion 103 segun la numeracion de Kabat se elige del grupo que consiste en P, R y S, y se elige, en particular, del grupo que consiste en R y S.
Por tanto, en un primer aspecto preferido, pero no limitativo, un Nanobody puede tener la estructura
FR1 - CDR1- FR2- CDR2- FR3- CDR3- FR4
en la que FR1 a FR4 se refieren a las regiones de entramado 1 a 4, respectivamente, y en la que CDR1 a CDR3 se refieren a las regiones determinantes de complementariedad 1 a 3, respectivamente, y en la que
a) el residuo de aminoacido en la posicion 108 segun la numeracion de Kabat es Q;
y/o en la que:
b) el residuo de aminoacido en la posicion 45 segun la numeracion de Kabat es un aminoacido con carga o una cistema y el residuo de aminoacido en la posicion 44 segun la numeracion de Kabat es preferiblemente E;
y/o en la que:
c) el residuo de aminoacido en la posicion 103 segun la numeracion de Kabat se elige del grupo que consiste en P, R y S, y se elige, en particular, del grupo que consiste en R y S;
y en la que:
d) CDR1, CDR2 y CDR3 son tal como se definen en el presente documento, y son preferiblemente tal como se definen segun uno de los aspectos preferidos en el presente documento, y son mas preferiblemente tal como se define segun uno de los aspectos mas preferidos en el presente documento.
En particular, un Nanobody en su sentido mas amplio puede definirse generalmente como un polipeptido que comprende:
a) una secuencia de aminoacidos que se compone de cuatro secuencias/regiones de entramado interrumpidas por tres secuencias/regiones determinantes de complementariedad, en la que el residuo de aminoacido en la posicion 108 segun la numeracion de Kabat es Q;
y/o:
b) una secuencia de aminoacidos que se compone de cuatro secuencias/regiones de entramado interrumpidas por tres secuencias/regiones determinantes de complementariedad, en la que el residuo de aminoacido en la posicion 44 segun la numeracion de Kabat es E y en la que el residuo de aminoacido en la posicion 45 segun la numeracion de Kabat es una R;
y/o:
c) una secuencia de aminoacidos que se compone de cuatro secuencias/regiones de entramado interrumpidas por tres secuencias/regiones determinantes de complementariedad, en la que el residuo de aminoacido en la posicion 103 segun la numeracion de Kabat se elige del grupo que consiste en P, R y S, y se elige, en particular, del grupo que consiste en R y S.
Por tanto, segun un aspecto preferido, pero no limitativo, un Nanobody de la invencion puede tener la estructura FR1 - CDR1- FR2- CDR2- FR3- CDR3- FR4
en la que FR1 a FR4 se refieren a las regiones de entramado 1 a 4, respectivamente, y en la que CDR1 a CDR3 se refieren a las regiones determinates de complementariedad 1 a 3, respectivamente, y en la que
a) el residuo de aminoacido en la posicion 108 segun la numeracion de Kabat es Q;
y/o en la que:
b) el residuo de aminoacido en la posicion 44 segun la numeracion de Kabat es E y en la que el residuo de aminoacido en la posicion 45 segun la numeracion de Kabat es una R;
y/o en la que:
c) el residuo de aminoacido en la posicion 103 segun la numeracion de Kabat se elige del grupo que consiste en P, R y S, y se elige, en particular, del grupo que consiste en R y S;
y en la que:
d) CDR1, CDR2 y CDR3 son tal como se definen en el presente documento, y son preferiblemente tal como se definen segun uno de los aspectos preferidos en el presente documento, y son mas preferiblemente tal como se definen segun uno de los aspectos mas preferidos en el presente documento.
En particular, un Nanobody contra una protema de la envuelta de un virus segun la invencion puede tener la estructura:
FR1 - CDR1 -FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
en la que FR1 a FR4 se refieren a las regiones de entramado 1 a 4, respectivamente, y en la que CDR1 a CDR3 se refieren a las regiones determinantes de complementariedad 1 a 3, respectivamente, y en la que
a) el residuo de aminoacido en la posicion 108 segun la numeracion de Kabat es Q;
y/o en la que:
b) el residuo de aminoacido en la posicion 44 segun la numeracion de Kabat es E y en la que el residuo de aminoacido en la posicion 45 segun la numeracion de Kabat es una R;
y/o en la que:
c) el residuo de aminoacido en la posicion 103 segun la numeracion de Kabat se elige del grupo que consiste en P, R y S, y se elige, en particular, del grupo que consiste en R y S;
y en la que:
d) CDR1, CDR2 y CDR3 son tal como se definen en el presente documento, y son preferiblemente tal como se definen segun uno de los aspectos preferidos en el presente documento, y son mas preferiblemente tal como se definen segun uno de los aspectos mas preferidos en el presente documento.
En particular, segun un aspecto preferido, pero no limitativo de la invencion, un Nanobody puede definirse generalmente como un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos que se compone de cuatro secuencias/regiones de entramado interrumpidas por tres secuencias/regiones determinantes de complementariedad, en la que;
a-1) el residuo de aminoacido en la posicion 44 segun la numeracion de Kabat se elige del grupo que consiste en A, G, E, D, G, Q, R, S, L; y se elige preferiblemente del grupo que consiste en G, E o Q; y
a-2) el residuo de aminoacido en la posicion 45 segun la numeracion de Kabat se elige del grupo que consiste en L, R o C; y se elige preferiblemente del grupo que consiste en L o R; y
a-3) el residuo de aminoacido en la posicion 103 segun la numeracion de Kabat se elige del grupo que consiste en W, R o S; y es preferiblemente W o R, y es lo mas preferiblemente W;
a-4) el residuo de aminoacido en la posicion 108 segun la numeracion de Kabat es Q;
o en la que:
b-1) el residuo de aminoacido en la posicion 44 segun la numeracion de Kabat se elige del grupo que consiste en E y Q; y
b-2) el residuo de aminoacido en la posicion 45 segun la numeracion de Kabat es R; y
b-3) el residuo de aminoacido en la posicion 103 segun la numeracion de Kabat se elige del grupo que consiste en W, R y S; y es preferiblemente W;
b-4) el residuo de aminoacido en la posicion 108 segun la numeracion de Kabat se elige del grupo que consiste en Q y L; y es preferiblemente Q;
o en la que:
c-1) el residuo de aminoacido en la posicion 44 segun la numeracion de Kabat se elige del grupo que consiste en A, G, E, D, Q, R, S y L; y se elige preferiblemente del grupo que consiste en G, E y Q; y
c-2) el residuo de aminoacido en la posicion 45 segun la numeracion de Kabat se elige del grupo que consiste en L, R y C; y se elige preferiblemente del grupo que consiste en L y R; y
c-3) el residuo de aminoacido en la posicion 103 segun la numeracion de Kabat se elige del grupo que consiste en P, R y S; y se elige, en particular, del grupo que consiste en R y S; y
c-4) el residuo de aminoacido en la posicion 108 segun la numeracion de Kabat se elige del grupo que consiste en Q y L; es preferiblemente Q;
y en la que:
d) CDR1, CDR2 y CDR3 son tal como se definen en el presente documento, y son preferiblemente tal como se definen segun uno de los aspectos preferidos en el presente documento, y son mas preferiblemente tal como se definen segun uno de los aspectos mas preferidos en el presente documento.
Por tanto, en otro aspecto preferido, pero no limitativo, un Nanobody de la invencion puede tener la estructura FR1 - CDR1- FR2- CDR2- FR3- CDR3- FR4
en la que FR1 a FR4 se refieren a las regiones de entramado 1 a 4, respectivamente, y en la que CDR1 a CDR3 se refieren a las regiones determinantes de complementariedad 1 a 3, respectivamente, y en la que:
a-1) el residuo de aminoacido en la posicion 44 segun la numeracion de Kabat se elige del grupo que consiste en A, G, E, D, G, Q, R, S, L; y se elige preferiblemente del grupo que consiste en G, E o Q;
y en la que:
a-2) el residuo de aminoacido en la posicion 45 segun la numeracion de Kabat se elige del grupo que consiste en L, R o C; y se elige preferiblemente del grupo que consiste en L o R;
y en la que:
a-3) el residuo de aminoacido en la posicion 103 segun la numeracion de Kabat se elige del grupo que consiste en W, R o S; y es preferiblemente W o R, y es lo mas preferiblemente W;
y en la que:
a-4) el residuo de aminoacido en la posicion 108 segun la numeracion de Kabat es Q;
y en la que:
d) CDR1, CDR2 y CDR3 son tal como se definen en el presente documento, y son preferiblemente tal como se definen segun uno de los aspectos preferidos en el presente documento, y son mas preferiblemente tal como se definen segun uno de los aspectos mas preferidos en el presente documento.
En otro aspecto preferido, pero no limitativo, un Nanobody puede tener la estructura
FR1 - CDR1- FR2- CDR2- FR3- CDR3- FR4
en la que FR1 a FR4 se refieren a las regiones de entramado 1 a 4, respectivamente, y en la que CDR1 a CDR3 se refieren a las regiones determinates de complementariedad 1 a 3, respectivamente, y en la que:
b-1) el residuo de aminoacido en la posicion 44 segun la numeracion de Kabat se elige del grupo que consiste en E y Q;
y en la que:
b-2) el residuo de aminoacido en la posicion 45 segun la numeracion de Kabat es R;
y en la que:
b-3) el residuo de aminoacido en la posicion 103 segun la numeracion de Kabat se elige del grupo que consiste en W, R y S; y es preferiblemente W;
y en la que:
b-4) el residuo de aminoacido en la posicion 108 segun la numeracion de Kabat se elige del grupo que consiste en Q y L; y es preferiblemente Q;
y en la que:
d) CDR1, CDR2 y CDR3 son tal como se definen en el presente documento, y son preferiblemente tal como se definen segun uno de los aspectos preferidos en el presente documento, y son mas preferiblemente tal como se definen segun uno de los aspectos mas preferidos en el presente documento.
En otro aspecto preferido, pero no limitativo, un Nanobody puede tener la estructura
FR1 - CDR1- FR2- CDR2- FR3- CDR3- FR4
en la que FR1 a FR4 se refieren a las regiones de entramado 1 a 4, respectivamente, y en la que CDR1 a CDR3 se refieren a las regiones determinantes de complementariedad 1 a 3, respectivamente, y en la que:
c-1) el residuo de aminoacido en la posicion 44 segun la numeracion de Kabat se elige del grupo que consiste en A, G, E, D, Q, R, S y L; y se elige preferiblemente del grupo que consiste en G, E y Q;
y en la que:
c-2) el residuo de aminoacido en la posicion 45 segun la numeracion de Kabat se elige del grupo que consiste en L, R y C; y se elige preferiblemente del grupo que consiste en L y R;
y en la que:
c-3) el residuo de aminoacido en la posicion 103 segun la numeracion de Kabat se elige del grupo que consiste en P, R y S; y se elige, en particular, del grupo que consiste en R y S;
y en la que:
c-4) el residuo de aminoacido en la posicion 108 segun la numeracion de Kabat se elige del grupo que consiste en Q y L; es preferiblemente Q;
y en la que:
d) CDR1, CDR2 y CDR3 son tal como se definen en el presente documento, y son preferiblemente tal como se definen segun uno de los aspectos preferidos en el presente documento, y son mas preferiblemente tal como se definen segun uno de los aspectos mas preferidos en el presente documento.
Dos grupos particularmente preferidos, pero no limitativos de los Nanobodies son aquellos segun a) anteriormente; segun (a-1) a (a-4) anteriormente; segun b) anteriormente; segun (b-1) a (b-4) anteriormente; segun (c) anteriormente; y/o segun (c-1) a (c-4) anteriormente, en los que o bien:
i) los residuos de aminoacido en las posiciones 44-47 segun la numeracion de Kabat forman la secuencia GLEW (o una secuencia similar a GLEW tal como se describe en el presente documento) y el residuo de aminoacido en la posicion 108 es Q;
o bien en los que:
ii) los residuos de aminoacido en las posiciones 43-46 segun la numeracion de Kabat forman la secuencia KERE o KQRE (o una secuencia similar a KERe tal como se describe) y el residuo de aminoacido en la posicion 108 es Q o L, y es preferiblemente Q.
Por tanto, en otro aspecto preferido, pero no limitativo, un Nanobody puede tener la estructura
FR1 - CDR1- FR2- CDR2- FR3- CDR3- FR4
en la que FR1 a FR4 se refieren a las regiones de entramado 1 a 4, respectivamente, y en la que CDR1 a CDR3 se refieren a las regiones determinantes de complementariedad 1 a 3, respectivamente, y en la que:
i) los residuos de aminoacido en las posiciones 44-47 segun la numeracion de Kabat forman la secuencia GLEW (o una secuencia similar a GLEW tal como se define en el presente documento) y el residuo de aminoacido en la posicion 108 es Q;
y en la que:
ii) CDR1, CDR2 y CDR3 son tal como se definen en el presente documento, y son preferiblemente tal como se definen segun uno de los aspectos preferidos en el presente documento, y son mas preferiblemente tal como se definen segun uno de los aspectos mas preferidos en el presente documento.
En otro aspecto preferido, pero no limitativo, un Nanobody puede tener la estructura
FR1 - CDR1- FR2- CDR2- FR3- CDR3- FR4
en la que FR1 a FR4 se refieren a las regiones de entramado 1 a 4, respectivamente, y en la que CDR1 a CDR3 se refieren a las regiones determinantes de complementariedad 1 a 3, respectivamente, y en la que:
i) los residuos de aminoacido en las posiciones 43-46 segun la numeracion de Kabat forman la secuencia KERE o KQRE (o una secuencia similar a KERE) y el residuo de aminoacido en la posicion 108 es Q o L, y es preferiblemente Q;
y en la que:
ii) CDR1, CDR2 y CDR3 son tal como se definen en el presente documento, y son preferiblemente tal como se definen segun uno de los aspectos preferidos en el presente documento, y son mas preferiblemente tal como se definen segun uno de los aspectos mas preferidos en el presente documento.
En los Nanobodies en los que los residuos de aminoacido en las posiciones 43-46 segun la numeracion de Kabat forman la secuencia KERE o KQRE, el residuo de aminoacido en la posicion 37 es lo mas preferiblemente F. En los Nanobodies en los que los residuos de aminoacido en las posiciones 44-47 segun la numeracion de Kabat forman la secuencia GLEW, el residuo de aminoacido en la posicion 37 se elige del grupo que consiste en Y, H, I, L, V o F, y es lo mas preferiblemente V.
Por tanto, sin limitarse a ello en modo alguno, basandose en los residuos de aminoacido presentes en las posiciones mencionadas anteriormente, los Nanobodies pueden clasificarse generalmente basandose en los siguientes tres grupos:
i) El “grupo de GLEW”: Nanobodies con la secuencia de aminoacidos GLEW en las posiciones 44-47 segun la numeracion de Kabat y Q en la posicion 108 segun la numeracion de Kabat. Tal como se describe adicionalmente en el presente documento, los Nanobodies dentro de este grupo tienen habitualmente una V en la posicion 37, y pueden tener una W, P, R o S en la posicion 103, y tienen preferiblemente una W en la posicion 103. El grupo de GLEW tambien comprende algunas secuencias similares a GLEW tales como las mencionadas en la tabla B-2 a continuacion. Mas generalmente, y sin limitacion, los Nanobodies que pertenecen al grupo de GLEW pueden definirse como Nanobodies con una G en la posicion 44 y/o con una W en la posicion 47, en los que la posicion 46 es habitualmente E y en los que preferiblemente la posicion 45 no es un residuo de aminoacido con carga y no es cistema;
ii) El "grupo de KERE”: Nanobodies con la secuencia de aminoacidos KERE o KQRE (u otra secuencia similar a KERE) en las posiciones 43-46 segun la numeracion de Kabat y Q o L en la posicion 108 segun la numeracion de Kabat. Tal como se describe adicionalmente en el presente documento, los Nanobodies dentro de este grupo tienen habitualmente una F en la posicion 37, una L o F en la posicion 47; y pueden tener una W, P, R o S en la posicion 103, y tienen preferiblemente una W en la posicion 103. Mas generalmente, y sin limitacion, los Nanobodies que pertenecen al grupo de KERE pueden definirse como Nanobodies con una K, Q o R en la posicion 44 (habitualmente K) en los que la posicion 45 es un residuo de aminoacido con carga o una cistema, y la posicion 47 es tal como se define adicionalmente en el presente documento;
iii) El “grupo de P, R, S en 103”: Nanobodies con una P, R o S en la posicion 103. Estos Nanobodies pueden tener o bien la secuencia de aminoacidos GLEW en las posiciones 44-47 segun la numeracion de Kabat o bien la secuencia de aminoacidos KERE o KQRE en las posiciones 43-46 segun la numeracion de Kabat, siendo esto ultimo lo mas preferido en combinacion con una F en la posicion 37 y una L o una F en la posicion 47 (tal como se define para el grupo de KERE); y pueden tener Q o L en la posicion 108 segun la numeracion de Kabat, y tienen preferiblemente Q.
Ademas, cuando sea apropiado, los Nanobodies pueden pertenecer a (es decir, tienen caractensticas de) dos o mas de estas clases. Por ejemplo, un grupo preferido espedficamente de Nanobodies tiene GLEW o una secuencia similar a GLEW en las posiciones 44-47; P, R o S (y, en particular, R) en la posicion 103; y Q en la posicion 108 (que puede humanizarse a L).
Mas generalmente, debe indicarse que las definiciones a las que se hizo referencia anteriormente describen y se aplican a Nanobodies en forma de una secuencia de Vhh nativa (es decir, no humanizada), y que variantes humanizadas de estos Nanobodies pueden contener otros residuos de aminoacido distintos a los indicados anteriormente (es decir, una o mas sustituciones de humanizacion tal como se definen en el presente documento). Por ejemplo, y sin limitacion, en algunos Nanobodies humanizados del grupo de GLEW o el grupo de P, R, S en 103, Q en la posicion 108 puede humanizarse a 108L. Tal como se menciono ya en el presente documento, otras sustituciones de humanizacion (y combinaciones adecuadas de las mismas) le quedaran claras al experto basandose en la divulgacion en el presente documento. Ademas, o alternativamente, pueden determinarse otras sustituciones de humanizacion potencialmente utiles comparando la secuencia de las regiones de entramado de una secuencia de Vhh que se produce de manera natural con la secuencia de entramado correspondiente de una o mas secuencias de Vh humanas estrechamente relacionadas, despues de que una o mas de las sustituciones de humanizacion potencialmente utiles (o combinaciones de las mismas) asf determinadas puedan introducirse en dicha secuencia de Vhh (de cualquier manera conocida per se, tal como se describe adicionalmente en el presente documento) y las secuencias de Vhh humanizadas resultantes puedan someterse a prueba para determinar la afinidad por la diana, para determinar la estabilidad, para determinar la facilidad y el nivel de expresion, y/o para determinar otras propiedades deseadas. De este modo, por medio de un grado limitado de ensayo y error, el experto puede determinar otras sustituciones de humanizacion adecuadas (o combinaciones adecuadas de las mismas) basandose en la divulgacion en el presente documento. Ademas, basandose en lo anterior, puede humanizarse parcialmente o humanizarse completamente (las regiones de entramado de) un Nanobody.
Por tanto, en otro aspecto preferido, pero no limitativo, un Nanobody puede ser un Nanobody que pertenece al grupo de GLEW (tal como se define en el presente documento), y en el que CDR1, CDR2 y CDR3 son tal como se definen en el presente documento, y son preferiblemente tal como se definen segun uno de los aspectos preferidos en el presente documento, y son mas preferiblemente tal como se definen segun uno de los aspectos mas preferidos en el presente documento.
En otro aspecto preferido, pero no limitativo, un Nanobody puede ser un Nanobody que pertenece al grupo de KERE (tal como se define en el presente documento), y CDR1, CDR2 y CDR3 son tal como se definen en el presente documento, y son preferiblemente tal como se definen segun uno de los aspectos preferidos en el presente documento, y son mas preferiblemente tal como se definen segun uno de los aspectos mas preferidos en el presente documento.
Por tanto, en otro aspecto preferido, pero no limitativo, un Nanobody puede ser un Nanobody que pertenece al grupo de P, R, S en 103 (tal como se define en el presente documento), y en el que CDR1, CDR2 y CDR3 son tal como se definen en el presente documento, y son preferiblemente tal como se definen segun uno de los aspectos preferidos en el presente documento, y son mas preferiblemente tal como se definen segun uno de los aspectos mas preferidos en el presente documento.
Ademas, mas generalmente y ademas de los residuos 108Q, 43E/44R y P, R, S en 103 mencionados anteriormente, los Nanobodies pueden contener, en una o mas posiciones que en un dominio Vh convencional formanan (parte de) la superficie de contacto Vh/Vl, uno o mas residuos de aminoacido que tiene mayor carga que los residuos de aminoacido que aparecen de manera natural en la(s) misma(s) posicion/posiciones en la secuencia de Vh que se produce de manera natural correspondiente y, en particular, uno o mas residuos de aminoacido con carga (tal como se menciona en la tabla A-2 en la pagina 48 de la solicitud internacional WO 08/020079). Tales sustituciones incluyen, pero no se limitan a, las secuencias similares a GLEW mencionadas en la tabla B-2 a continuacion; asf como las sustituciones que se describen en la solicitud internacional WO 00/29004 para los denominados “microbodies”, por ejemplo para obtener un Nanobody con Q en la posicion 108 en combinacion con KLEW en las posiciones 44-47. Otras posibles sustituciones en estas posiciones le quedaran claras al experto basandose en la divulgacion en el presente documento.
En un aspecto de los Nanobodies, el residuo de aminoacido en la posicion 83 se elige del grupo que consiste en L, M, S, V y W; y es preferiblemente L.
Ademas, en un aspecto de los Nanobodies, el residuo de aminoacido en la posicion 83 se elige del grupo que consiste en R, K, N, E, G, I, T y Q; y es lo mas preferiblemente o bien K o bien E (para Nanobodies correspondientes a dominios Vhh que se producen de manera natural) o R (para Nanobodies “humanizados”, tal como se describen en el presente documento). El residuo de aminoacido en la posicion 84 se elige del grupo que consiste en P, A, R, S, D T y V en un aspecto, y es lo mas preferiblemente P (para Nanobodies correspondientes a dominios Vhh que se producen de manera natural) o R (para Nanobodies “humanizados”, tal como se describen en el presente documento).
Ademas, en un aspecto de los Nanobodies, el residuo de aminoacido en la posicion 104 se elige del grupo que consiste en G y D; y es lo mas preferiblemente G.
Colectivamente, los residuos de aminoacido en las posiciones 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 y 108, que en los Nanobodies son tal como se menciono anteriormente, tambien se denominaran en el presente documento los “residuos distintivos”. Los residuos distintivos y los residuos de aminoacido en las posiciones correspondientes del dominio Vh humano mas estrechamente relacionado, Vh3, se resumen en la tabla B-2.
Algunas combinaciones especialmente preferidas pero no limitativas de estos residuos distintivos tal como aparecen en dominios Vhh que se producen de manera natural se mencionan en la tabla B-3. Para su comparacion, los residuos de aminoacido correspondientes de Vh3 humano denominados DP-47 se han indicado en cursiva.
Tabla B-2: Residuos distintivos en Nanobodies
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En los Nanobodies, cada residuo de aminoacido en cualquier otra posicion distinta a los residuos distintivos puede ser cualquier residuo de aminoacido que aparece de manera natural en la posicion correspondiente (segun la numeracion de Kabat) de un dominio Vhh que se produce de manera natural.
Tales residuos de aminoacido le quedaran claros al experto. Las tablas B-4 a B-7 mencionan algunos residuos no limitativos que pueden estar presentes en cada posicion (segun la numeracion de Kabat) de FR1, FR2, FR3 y FR4 de dominios Vhh que se producen de manera natural. Para cada posicion, el residuo de aminoacido que aparece con la mayor frecuencia en cada posicion de un dominio Vhh que se produce de manera natural (y que es el residuo de aminoacido mas preferido para dicha posicion en un Nanobody) se indica en negrita; y otros residuos de aminoacido preferidos para cada posicion se han subrayado (nota: el numero de residuos de aminoacido que se hallan en las posiciones 26-30 de dominios Vhh que se producen de manera natural respalda la hipotesis subyacente a la numeracion segun Chothia (citado anteriormente) de que los residuos en estas posiciones ya forman parte de CDR1.)
En las tablas B-4 a B-7, tambien se han mencionados algunos de los residuos no limitativos que pueden estar presentes en cada posicion de un dominio Vh 3 humano. De nuevo, para cada posicion, el residuo de aminoacido que aparece con la mayor frecuencia en cada posicion de un dominio Vh 3 humano que se produce de manera natural se indica en negrita; y se han subrayado otros residuos de aminoacido preferidos.
Para referencia solamente, las tablas B-4 a B-7 tambien contienen datos sobre la entropfa de Vh h (“Ent. de Vh h ”) y la variabilidad de Vh h (“Var. de Vh h ") en cada posicion de aminoacido para una muestra representativa de l1 l8 secuencias de Vh h (datos proporcionados amablemente por David Lutje Hulsing y Prof. Theo Verrips de la Universidad de Utrecht). Los valores para la entropfa de Vh h y la variabilidad de Vh h proporcionan una medida para la variabilidad y el grado de conservacion de residuos de aminoacido entre las 1118 secuencias de Vh h analizadas: valores bajos (es decir, <1, tal como < 0,5) indican que un residuo de aminoacido esta altamente conservado entre las secuencias de Vh h (es decir, escasa variabilidad). Por ejemplo, la G en la posicion 8 y la G en la posicion 9 tienen valores para la entropfa de Vh h de 0,1 y 0 respectivamente, lo que indica que estos residuos estan altamente conservados y tienen escasa variabilidad (y en el caso de la posicion 9 es G en todas de las 1118 secuencias analizadas), mientras que para residuos que forman parte de las CDR generalmente se hallan valores de 1,5 o mas (datos no mostrados). Observese que (1) los residuos de aminoacido enumerados en la segunda columna de las tablas B-4 a B-7 se basan en una muestra mas grande que las 1118 secuencias de Vh h que se analizaron para determinar la entropfa de Vh h y la variabilidad de Vh h a las que se hace referencia en las ultimas dos columnas; y (2) los datos representados a continuacion respaldan la hipotesis de que los residuos de aminoacido en las posiciones 27-30 y puede ser que incluso tambien en las posiciones 93 y 94 ya forman parte de las CDR (aunque la invencion no esta limitada a ninguna hipotesis o explicacion espedfica, y tal como se menciono anteriormente, en el presente documento se usa la numeracion segun Kabat). Para una explicacion general de la entropfa de secuencia, variabilidad de secuencia y la metodologfa para determinar las mismas, vease Oliveira et al., PROTEINS: Structure, Function and Genetics, 52: 544-552 (2003).
Tabla B-4: Ejemplos no limitativos de residuos de aminoacido en FR1 (para las notas al pie, veanse las notas al pie de la tabla B-2)
Figure imgf000102_0001
Tabla B-5: Ejemplos no limitativos de residuos de aminoacido en FR2 (para las notas al pie, veanse las notas al pie de la tabla B-2)
Figure imgf000103_0002
Tabla B-6: Ejemplos no limitativos de residuos de aminoacido en FR3 (para las notas al pie, veanse las notas al pie de la tabla B-2)
Figure imgf000103_0001
Tabla B-7: Ejemplos no limitativos de residuos de aminoacido en FR4 (para las notas al pie, veanse las notas al pie de la tabla B-2)
Figure imgf000104_0001
Por tanto, en otro aspecto preferido, pero no limitativo, un Nanobody puede definirse como una secuencia de aminoacidos con laestructura (general)
FR1 -CDR1 -FR2 -CDR2 -FR3 -CDR3 -FR4
en la que FR1 a FR4 se refieren a las regiones de entramado 1 a 4, respectivamente, y en la que CDR1 a CDR3 se refieren a las regiones determinates de complementariedad 1 a 3, respectivamente, y en la que:
i)uno o mas de los residuos de aminoacido en las posiciones 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 y 108 segun la numeracion de Kabat se eligen de los residuos distintivos mencionados en latabla B-2;
y en laque:
ii) CDR1, CDR2 y CDR3 son tal como se definen en el presente documento, y son preferiblemente tal como se definen segun uno de los aspectos preferidos en el presente documento, y son mas preferiblemente tal como se definen segun uno de los aspectos mas preferidos en el presente documento.
Los Nanobodies anteriores pueden ser, por ejemplo, secuencias de V hh o pueden ser Nanobodies humanizados. Cuando las secuencias de Nanobodies anteriores son secuencias de V hh, pueden humanizarse de manera adecuada, tal como se describe adicionalmente en el presente documento. Cuando los Nanobodies son Nanobodies parcialmente humanizados, pueden opcionalmente humanizarse adicionalmente de manera adecuada, de nuevo tal como se describe en el presente documento.
En particular, un Nanobody puede ser una secuencia de aminoacidos con la estructura (general)
FR1 -C D R 1 -F R 2 -C D R 2 -F R 3 -C D R 3 - FR4
en la que FR1 a FR4 se refieren a las regiones de entramado 1 a 4, respectivamente, y en la que CDR1 a CDR3 se refieren a las regiones determinantes de complementariedad 1 a 3, respectivamente, y en la que:
i)(preferiblemente) uno o mas de los residuos de aminoacido en las posiciones 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 y 108 segun la numeracion de Kabat se eligen de los residuos distintivos mencionados en latabla B-2 (entendiendose que las secuencias de V hh contendran uno o mas residuos distintivos; y que Nanobodies parcialmente humanizados contendran habitualmente, y [todavfa] preferiblemente, uno o mas residuos distintivos; y que en Nanobodies totalmente humanizados, todos los residuos de aminoacido en las posiciones de los residuos distintivos seran residuos de aminoacido que aparecen en una de secuencia V h3 humano);
y en laque:
ii)dicha secuencia de aminoacidos tiene una identidad de aminoacidos de al menos el 80 % con al menos una de las secuencias de aminoacidos de las S E Q ID NO: 1 a 22, en la que con los propositos de determinar el grado de identidad de aminoacidos, los residuos de aminoacido que forman las secuencias de C D R (indicadas con X en las secuencias de las S EQ ID NO: 1 a 22) no se tienen en cuenta;
y en laque:
iii) CDR1, CDR2 y CDR3 son tal como se definen en el presente documento, y son preferiblemente tal como se definen segun uno de los aspectos preferidos en el presente documento, y son mas preferiblemente tal como se definen segun uno de los aspectos mas preferidos en el presente documento.
Los Nanobodies anteriores pueden ser, por ejemplo, secuencias de V hh o pueden ser Nanobodies humanizados.
Cuando las secuencias de Nanobodies anteriores son secuencias de Vhh, pueden humanizarse de manera adecuada, tal como se describe adicionalmente en el presente documento. Cuando los Nanobodies son Nanobodies parcialmente humanizados, pueden opcionalmente humanizarse adicionalmente de manera adecuada, de nuevo tal como se describe en el presente documento.
Figure imgf000105_0001
Figure imgf000106_0001
En particular, un Nanobody del grupo de KERE puede ser una secuencia de aminoacidos con la estructura (general) FR1 - CDR1- FR2- CDR2- FR3- CDR3- FR4
en la que:
i) el residuo de aminoacido en la posicion 45 segun la numeracion de Kabat es un aminoacido con carga (tal como se define en el presente documento) o un residuo de cistema, y la posicion 44 es preferiblemente una E;
y en la que:
ii) FR1 es una secuencia de aminoacidos que tiene una identidad de aminoacidos de al menos el 80 % con al menos una de las siguientes secuencias de aminoacidos:
Tabla B-9: Secuencias de FW1 representativas para Nanobodies del grupo de KERE.
Figure imgf000107_0001
y en la que:
iii) FR2 es una secuencia de aminoacidos que tiene una identidad de aminoacidos de al menos el 80 % con al menos una de las siguientes secuencias de aminoacidos:
Tabla B-10: Secuencias de FW2 representativas para Nanobodies del grupo de KERE.
Figure imgf000107_0002
y en la que:
iv) FR3 es una secuencia de aminoacidos que tiene una identidad de aminoacidos de al menos el 80 % con al menos una de las siguientes secuencias de aminoacidos:
Tabla B-11: Secuencias de FW3 representativas para Nanobodies del grupo de KERE.
Figure imgf000107_0003
y en la que:
v) FR4 es una secuencia de aminoacidos que tiene una identidad de aminoacidos de al menos el 80 % con al menos una de las siguientes secuencias de aminoacidos:
Tabla B-12: Secuencias de FW4 representativas para Nanobodies del grupo de KERE.
Figure imgf000107_0004
y en la que:
vi) CDR1, CDR2 y CDR3 son tal como se definen en el presente documento, y son preferiblemente tal como se definen segun uno de los aspectos preferidos en el presente documento, y son mas preferiblemente tal como se definen segun uno de los aspectos mas preferidos en el presente documento.
En los Nanobodies anteriores, uno o mas de los residuos distintivos adicionales son preferiblemente tal como se describen en el presente documento (por ejemplo, cuando son secuencias de Vhh o Nanobodies parcialmente humanizados).
Ademas, los Nanobodies anteriores pueden ser, por ejemplo, secuencias de Vhh o pueden ser Nanobodies humanizados. Cuando las secuencias de Nanobodies anteriores son secuencias de VHH, pueden humanizarse de manera adecuada, tal como se describe adicionalmente en el presente documento. Cuando los Nanobodies son Nanobodies parcialmente humanizados, pueden opcionalmente humanizarse adicionalmente de manera adecuada, de nuevo tal como se describe en el presente documento.
Con respecto a la region de entramado 1, le quedara claro al experto que, cuando se genera una secuencia de aminoacidos tal como se expuso anteriormente mediante la expresion de una secuencia de nucleotidos, las secuencias de los primeros cuatro aminoacidos (es decir, residuos de aminoacido 1-4 segun la numeracion de Kabat) pueden determinarse a menudo mediante el/los cebador(es) que se han usado para generar dicho acido nucleico. Por tanto, para determinar el grado de identidad de aminoacidos, no se tienen en cuenta preferiblemente los primeros cuatro residuos de aminoacido.
Ademas, con respecto a la region de entramado 1, y aunque se considera que las posiciones de aminoacido 27 a 30 segun la numeracion de Kabat forman parte de las regiones de entramado (y no las CDR), se ha hallado mediante analisis de una base de datos de mas de 1000 secuencias de Vhh que las posiciones 27 a 30 tienen una variabilidad (expresada en cuanto a la entropfa de Vhh y la variabilidad de Vhh (veanse las tablas B-4 a B-7) que es mucho mayor que la variabilidad en las posiciones 1 a 26. Debido a esto, para determinar el grado de identidad de aminoacidos, los residuos de aminoacido en las posiciones 27 a 30 preferiblemente tampoco se tienen en cuenta. En vista de esto, un Nanobody de la clase de KERE puede ser una secuencia de aminoacidos que se compone de cuatro secuencias/regiones de entramado interrumpidas por tres secuencias/regiones determinantes de complementariedad, en la que:
i) el residuo de aminoacido en la posicion 45 segun la numeracion de Kabat es un aminoacido con carga (tal como se define en el presente documento) o un residuo de cistema, y la posicion 44 es preferiblemente una E;
y en la que:
ii) FR1 es una secuencia de aminoacidos que, en las posiciones 5 a 26 de la numeracion de Kabat, tiene una identidad de aminoacidos de al menos el 80 % con al menos una de las siguientes secuencias de aminoacidos: Tabla B-13: Secuencias de FW1 representativas (residuos de aminoacido 5 a 26) para Nanobodies del grupo de KERE.
Figure imgf000108_0001
y en la que:
iii) FR2, FR3 y FR4 son tal como se mencionan en el presente documento para FR2, FR3 y FR4 de Nanobodies de la clase de KERE;
y en la que:
iv) CDR1, CDR2 y CDR3 son tal como se definen en el presente documento, y son preferiblemente tal como se definen segun uno de los aspectos preferidos en el presente documento, y son mas preferiblemente tal como se definen segun uno de los aspectos mas preferidos en el presente documento.
Los Nanobodies anteriores pueden ser, por ejemplo, secuencias de Vhh o pueden ser Nanobodies humanizados. Cuando las secuencias de Nanobodies anteriores son secuencias de Vhh, pueden humanizarse de manera adecuada, tal como se describe adicionalmente en el presente documento. Cuando los Nanobodies son Nanobodies parcialmente humanizados, pueden opcionalmente humanizarse adicionalmente de manera adecuada, de nuevo tal como se describe en el presente documento.
Un Nanobody de la clase de GLEW puede ser una secuencia de aminoacidos que se compone de cuatro secuencias/regiones de entramado interrumpidas por tres secuencias/regiones determinantes de complementariedad, en la que
i) preferiblemente, cuando el Nanobody de la clase de GLEW es un Nanobody no humanizado, el residuo de aminoacido en la posicion 108 es Q;
ii) FR1 es una secuencia de aminoacidos que tiene una identidad de aminoacidos de al menos el 80 % con al menos una de las siguientes secuencias de aminoacidos: y en la que:
Tabla B-14: Secuencias de FW1 representativas para Nanobodies del grupo de GLEW.
Figure imgf000109_0001
iii) FR2 es una secuencia de aminoacidos que tiene una identidad de aminoacidos de al menos el 80 % con al menos una de las siguientes secuencias de aminoacidos:
Tabla B-15: Secuencias de FW2 representativas para Nanobodies del grupo de GLEW.
Figure imgf000109_0002
y en la que:
iv) FR3 es una secuencia de aminoacidos que tiene una identidad de aminoacidos de al menos el 80 % con al menos una de las siguientes secuencias de aminoacidos:
Tabla B-16: Secuencias de FW3 representativas para Nanobodies del grupo de GLEW.
Figure imgf000109_0003
y en la que:
v) FR4 es una secuencia de aminoacidos que tiene una identidad de aminoacidos de al menos el 80 % con al menos una de las siguientes secuencias de aminoacidos:
Tabla B-17: Secuencias de FW4 representativas para Nanobodies del grupo de GLEW.
Figure imgf000109_0004
Figure imgf000110_0001
y en la que:
vi) CDR1, CDR2 y CDR3 son tal como se definen en el presente documento, y son preferiblemente tal como se definen segun uno de los aspectos preferidos en el presente documento, y son mas preferiblemente tal como se definen segun uno de los aspectos mas preferidos en el presente documento.
En los Nanobodies anteriores, uno o mas de los residuos distintivos adicionales son preferiblemente tal como se describen en el presente documento (por ejemplo, cuando son secuencias de Vhh o Nanobodies parcialmente humanizados).
Con respecto a la region de entramado 1, quedara claro de nuevo para el experto que, para determinar el grado de identidad de aminoacidos, los residuos de aminoacido en las posiciones 1 a 4 y 27 a 30 preferiblemente no se tienen en cuenta.
En vista de esto, un Nanobody de la clase de GLEW puede ser una secuencia de aminoacidos que se compone de cuatro secuencias/regiones de entramado interrumpidas por tres secuencias/regiones determinantes de complementariedad, en la que:
i) preferiblemente, cuando el Nanobody de la clase de GLEW es un Nanobody no humanizado, el residuo de aminoacido en la posicion 108 es Q;
y en la que:
ii) FR1 es una secuencia de aminoacidos que, en las posiciones 5 a 26 de la numeracion de Kabat, tiene una identidad de aminoacidos de al menos el 80 % con al menos una de las siguientes secuencias de aminoacidos: Tabla B-18: Secuencias de FW1 representativas (residuos de aminoacido 5 a 26) para Nanobodies del grupo de KERE.
Figure imgf000110_0002
y en la que:
iii) FR2, FR3 y FR4 son tal como se mencionan en el presente documento para FR2, FR3 y FR4 de Nanobodies de la clase de g LeW;
y en la que:
iv) CDR1, CDR2 y CDR3 son tal como se definen en el presente documento, y son preferiblemente tal como se definen segun uno de los aspectos preferidos en el presente documento, y son mas preferiblemente tal como se definen segun uno de los aspectos mas preferidos en el presente documento.
Los Nanobodies anteriores pueden ser, por ejemplo, secuencias de Vhh o pueden ser Nanobodies humanizados. Cuando las secuencias de Nanobodies anteriores son secuencias de Vhh, pueden humanizarse de manera adecuada, tal como se describe adicionalmente en el presente documento. Cuando los Nanobodies son Nanobodies parcialmente humanizados, pueden opcionalmente humanizarse adicionalmente de manera adecuada, de nuevo tal como se describe en el presente documento. En los Nanobodies anteriores, uno o mas de los residuos distintivos adicionales son preferiblemente tal como se describen en el presente documento (por ejemplo, cuando son secuencias de VHH o Nanobodies parcialmente humanizados).
Un Nanobody de la clase de P, R, S en 103 puede ser una secuencia de aminoacidos que se compone de cuatro secuencias/regiones de entramado interrumpidas por tres secuencias/regiones determinantes de complementariedad, en la que
i) el residuo de aminoacido en la posicion 103 segun la numeracion de Kabat es diferente de W;
y en la que:
ii) preferiblemente el residuo de aminoacido en la posicion 103 segun la numeracion de Kabat es P, R o S, y mas preferiblemente R;
y en la que:
iii) FR1 es una secuencia de aminoacidos que tiene una identidad de aminoacidos de al menos el 80 % con al menos una de las siguientes secuencias de aminoacidos:
Tabla B-19: Secuencias de FW1 representativas para Nanobodies del grupo de P,R,S en 103.
Figure imgf000111_0001
y en la que
iv) FR2 es una secuencia de aminoacidos que tiene una identidad de aminoacidos de al menos el 80 % con al menos una de las siguientes secuencias de aminoacidos:
Tabla B-20: Secuencias de FW2 representativas para Nanobodies del grupo de P,R,S en 103.
Figure imgf000111_0002
y en la que
v) FR3 es una secuencia de aminoacidos que tiene una identidad de aminoacidos de al menos el 80 % con al menos una de las siguientes secuencias de aminoacidos:
Tabla B-21: Secuencias de FW3 representativas para Nanobodies del grupo de P,R,S en 103.
Figure imgf000111_0003
y en la que:
vi) FR4 es una secuencia de aminoacidos que tiene una identidad de aminoacidos de al menos el 80 % con al menos una de las siguientes secuencias de aminoacidos:
Tabla B-22: Secuencias de FW4 representativas para Nanobodies del grupo de P,R,S en 103.
Figure imgf000111_0004
Secuencia de FW4 de P,R,S en 103 n.° 6 | SEQ ID NO:125 | RSRGIQVTVSS
y en la que
vii) CDR1, CDR2 y CDR3 son tal como se definen en el presente documento, y son preferiblemente tal como se definen segun uno de los aspectos preferidos en el presente documento, y son mas preferiblemente tal como se definen segun uno de los aspectos mas preferidos en el presente documento.
En los Nanobodies anteriores, uno o mas de los residuos distintivos adicionales son preferiblemente tal como se describen en el presente documento (por ejemplo, cuando son secuencias de Vhh o Nanobodies parcialmente humanizados).
Con respecto a la region de entramado 1, le quedara claro de nuevo al experto que, para determinar el grado de identidad de aminoacidos, los residuos de aminoacido en las posiciones 1 a 4 y 27 a 30 preferiblemente no se tienen en cuenta.
En vista de esto, un Nanobody de la clase de P,R,S en 103 puede ser una secuencia de aminoacidos que se compone de cuatro secuencias/regiones de entramado interrumpidas por tres secuencias/regiones determinantes de complementariedad, en la que:
i) el residuo de aminoacido en la posicion 103 segun la numeracion de Kabat es diferente de W;
y en la que:
ii) preferiblemente el residuo de aminoacido en la posicion 103 segun la numeracion de Kabat es P, R o S, y mas preferiblemente R;
y en la que:
iii) FR1 es una secuencia de aminoacidos que, en las posiciones 5 a 26 de la numeracion de Kabat, tiene una identidad de aminoacidos de al menos el 80 % con al menos una de las siguientes secuencias de aminoacidos: Tabla B-23: Secuencias de FW1 representativas (aminoacidos 5 a 26) para Nanobodies del grupo de P,R,S en 103.
Figure imgf000112_0001
y en la que:
iv) FR2, FR3 y FR4 son tal como se mencionan en el presente documento para FR2, FR3 y FR4 de Nanobodies de la clase de P,R,S en 103;
y en la que:
v) CDR1, CDR2 y CDR3 son tal como se definen en el presente documento, y son preferiblemente tal como se definen segun uno de los aspectos preferidos en el presente documento, y son mas preferiblemente tal como se definen segun uno de los aspectos mas preferidos en el presente documento.
Los Nanobodies anteriores pueden ser, por ejemplo, secuencias de Vhh o pueden ser Nanobodies humanizados. Cuando las secuencias de Nanobodies anteriores son secuencias de Vhh, pueden humanizarse de manera adecuada, tal como se describe adicionalmente en el presente documento. Cuando los Nanobodies son Nanobodies parcialmente humanizados, pueden opcionalmente humanizarse adicionalmente de manera adecuada, de nuevo tal como se describe en el presente documento.
En los Nanobodies anteriores, uno o mas de los residuos distintivos adicionales son preferiblemente tal como se describen en el presente documento (por ejemplo, cuando son secuencias de Vhh o Nanobodies parcialmente humanizados).
En otro aspecto que no forma parte de la invencion reivindicada, la solicitud describe un Nanobody tal como se describio anteriormente, en el que las secuencias de CDR tienen una identidad de aminoacidos de al menos el 70 %, preferiblemente una identidad de aminoacidos de al menos el 80 %, mas preferiblemente una identidad de aminoacidos de al menos el 90 %, tal como una identidad de aminoacidos del 95 % o mas o incluso una identidad de aminoacidos de esencialmente el 100% con las secuencias de CDR de al menos una de las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 158 a 236, 248 a 407, 2448 y 2574 a 2581 (vease la tabla A-1). Este grado de identidad de aminoacidos puede determinarse, por ejemplo, determinando el grado de identidad de aminoacidos (de una manera descrita en el presente documento) entre dicho Nanobody y una o mas de las secuencias de las SEQ ID NO: 158 a 236, 248 a 407, 2448 y 2574 a 2581 (vease la tabla A-1), no teniendose en cuenta los residuos de aminoacido que forman las regiones de entramado. Tales Nanobodies pueden ser tal como se describe adicionalmente en el presente documento.
Tal como se menciono ya en el presente documento, la solicitud describe un Nanobody con una secuencia de aminoacidos que se elige del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 158 a 236, 248 a 407, 2448 y 2574 a 2581 (vease la tabla A-1) o del grupo que consiste en las secuencias de aminoacidos que tienen una identidad de secuencia de mas del 80 %, preferiblemente mas del 90 %, mas preferiblemente mas del 95 %, tal como el 99 % o mas (tal como se definen en el presente documento) con al menos una de las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 158 a 236, 248 a 407, 2448 y 2574 a 2581 (vease la tabla A-1).
Ademas, en los Nanobodies anteriores:
i) cualquier sustitucion de aminoacido (cuando no es una sustitucion de humanizacion tal como se define en el presente documento) es preferiblemente, y en comparacion con la secuencia de aminoacidos correspondiente de las SEQ ID NO: 158 a 236, 248 a 407, 2448 y 2574 a 2581 (vease la tabla A-1), una sustitucion de aminoacido conservativa, (tal como se define en el presente documento);
y/o:
ii) su secuencia de aminoacidos preferiblemente contiene o bien solamente sustituciones de aminoacido, o bien si no preferiblemente no mas de 5 deleciones o inserciones de aminoacido, preferiblemente no mas de 3, y mas preferiblemente solamente 1 o 2, en comparacion con la secuencia de aminoacidos correspondiente de las SEQ ID NO: 158 a 236, 248 a 407, 2448 y 2574 a 2581 (vease la tabla A-1);
y/o
iii) las CDR pueden ser CDR que derivan por medio de maduracion por afinidad, por ejemplo partiendo de las CDR de la secuencia de aminoacidos correspondiente de las SEQ ID nO: 158 a 236, 248 a 407, 2448 y 2574 a 2581 (vease la tabla A-1).
Preferiblemente, las secuencias de CDR y secuencias de FR en los Nanobodies descritos en el presente documento son tales que los Nanobodies (y polipeptidos de la invencion que comprenden los mismos):
- se unen a una protema de la envuelta de un virus con una constante de disociacion (Kd) de 10-5 a 10-12 moles/litro o menos, y preferiblemente de 10-7 a 10-12 moles/litro o menos y mas preferiblemente de 10-8 a 10-12 moles/litro (es decir, con una constante de asociacion (Ka) de 105 a 1012 litros/mol o mas, y preferiblemente de 107 a 1012 litros/mol o mas y mas preferiblemente de 108 a 1012 litros/mol);
y/o son tales que:
- se unen a una p1ro 7tem 1a1 de la envuelta de un viru 3s c 1on 1 un 7a v 1 4M'11s1'1 y aproximadamente 10 M' s' preferiblemente entre 10 M s y 10 e
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1 0 0 2 M s y 107 M'1s'1, tal como entre 105 M'1s'1 y 107 M'1s'1;
y/o son tales que:
- se unen a una protema de la envuelta de un virus con una velocidad de disociacion de entre 1 s'1 (t-i/2 = 0,69 s) y 10-6 s-1 (proporcionando un complejo casi irreversible con un t-i/2 de multiples dias), preferiblemente entre 10-2 s-1 y 10-6 s-1, mas preferiblemente entre 10-3 s-1 y 10-6 s-1, tal como entre 10-4 s-1 y 10-6 s-1.
Preferiblemente, las secuencias de CDR y secuencias de FR presentes en los Nanobodies descritos en el presente documento son tales que los Nanobodies se uniran a una protema de la envuelta de un virus con una afinidad menor de 500 nM, preferiblemente menor de 200 nM, mas preferiblemente menor de 10 nM, tal como menor de 500 pM. Segun un aspecto no limitativo de la invencion, un Nanobody puede ser tal como se define en el presente documento, pero con la condicion de que tenga al menos “una diferencia de aminoacido” (tal como se define en el presente documento) en al menos una de las regiones de entramado en comparacion con la region de entramado correspondiente de un dominio Vh humano que se produce de manera natural y, en particular, en comparacion con la region de entramado correspondiente de DP-47. Mas espedficamente, segun un aspecto no limitativo de la invencion, un Nanobody puede ser tal como se define en el presente documento, pero con la condicion de que tenga al menos “una diferencia de aminoacido” (tal como se define en el presente documento) en al menos uno de los residuos distintivos (incluyendo aquellos en las posiciones 108, 103 y/o 45) en comparacion con la region de entramado correspondiente de un dominio Vh humano que se produce de manera natural y, en particular, en comparacion con la region de entramado correspondiente de DP-47. Habitualmente, un Nanobody tendra al menos una diferencia de aminoacido de este tipo con un dominio Vh que se produce de manera natural en al menos uno de FR2 y/o FR4 y, en particular, en al menos uno de los residuos distintivos en FR2 y/o FR4 (de nuevo, incluyendo aquellos en las posiciones 108, 103 y/o 45).
Ademas, un Nanobody humanizado puede ser tal como se define en el presente documento, pero con la condicion de que tenga al menos “una diferencia de aminoacido” (tal como se define en el presente documento) en al menos una de las regiones de entramado en comparacion con la region de entramado correspondiente de un dominio Vhh que se produce de manera natural. Mas espedficamente, segun un aspecto no limitativo de la invencion, un Nanobody humanizado puede ser tal como se define en el presente documento, pero con la condicion de que tenga al menos “una diferencia de aminoacido” (tal como se define en el presente documento) en al menos uno de los residuos distintivos (incluyendo aquellos en las posiciones 108, l03 y/o 45) en comparacion con la region de entramado correspondiente de un dominio Vhh que se produce de manera natural. Habitualmente, un Nanobody humanizado tendra al menos una diferencia de aminoacido de este tipo con un dominio Vhh que se produce de manera natural en al menos uno de FR2 y/o FR4 y, en particular, en al menos uno de los residuos distintivos en FR2 y/o FR4 (de nuevo, incluyendo aquellos en las posiciones 108, 103 y/o 45).
Tal como quedara claro a partir de la divulgacion en el presente documento, tambien esta dentro del alcance de la invencion usar analogos, mutantes, variantes, alelos, homologos y ortologos naturales o sinteticos (denominados colectivamente en el presente documento “analogos") de los Nanobodies descritos en el presente documento tal como se definen en el presente documento y, en particular, analogos de los Nanobodies de las SEQ ID NO: 158 a 236, 248 a 407, 2448 y 2574 a 2581 (vease la tabla A-1).
Generalmente, en tales analogos, pueden haberse reemplazado, delecionado y/o anadido uno o mas residuos de aminoacido, en comparacion con los Nanobodies tal como se definen en el presente documento. Tales sustituciones, inserciones o deleciones pueden realizarse en una o mas de las regiones de entramado. Cuando se realizan tales sustituciones, inserciones o deleciones en una o mas de las regiones de entramado, pueden realizarse en uno o mas de los residuos distintivos y/o en una o mas de las otras posiciones en los residuos de entramado, aunque generalmente se prefieren menos las sustituciones, inserciones o deleciones en los residuos distintivos (a menos que estas sean sustituciones de humanizacion adecuadas tal como se describe en el presente documento). Por medio de ejemplos no limitativos, una sustitucion puede ser, por ejemplo, una sustitucion conservativa (tal como se describe en el presente documento) y/o un residuo de aminoacido puede reemplazarse por otro residuo de aminoacido que aparece de manera natural en la misma posicion en otro dominio Vhh (veanse las tablas B-4 a B-7 para algunos ejemplos no limitativos de tales sustituciones), aunque la invencion no se limita generalmente a ello. Por tanto, una cualquiera o mas sustituciones, deleciones o inserciones, o cualquier combinacion de las mismas, que o bien mejoran las propiedades del Nanobody o bien que al menos no restan mucho de las propiedades deseadas o del equilibrio o la combinacion de propiedades deseadas del Nanobody (es decir, en la medida en que el Nanobody ya no es adecuado para su uso pretendido) estan incluidas dentro del alcance de la invencion. Un experto sera capaz generalmente de determinar y seleccionar sustituciones, deleciones o inserciones adecuadas, o combinaciones adecuadas de las mismas, basandose en la divulgacion en el presente documento y opcionalmente despues de un grado limitado de experimentacion de rutina, que puede implicar, por ejemplo, introducir un numero limitado de posibles sustituciones y determinar su influencia sobre las propiedades de los Nanobodies asf obtenidos. Por ejemplo, y dependiendo del organismo huesped usado para expresar el Nanobody descrito en el presente documento o polipeptido de la invencion, tales deleciones y/o sustituciones pueden disenarse de tal modo que se retiran uno o mas sitios para modificacion postraduccional (tales como uno o mas sitios de glicosilacion o sitios de miristilacion), tal como estara dentro de la capacidad del experto en la tecnica. Alternativamente, pueden disenarse sustituciones o inserciones para introducir uno o mas sitios para la fijacion de grupos funcionales (tal como se describe en el presente documento), por ejemplo para permitir la pegilacion espedfica de sitio (de nuevo tal como se describe en el presente documento).
Tal como puede observarse a partir de los datos sobre la entropfa de Vhh y la variabilidad de Vhh facilitados en las tablas B-4 a B-7 anteriormente, algunos residuos de aminoacido en las regiones de entramado estan mas conservados que otros. Generalmente, aunque la invencion en su sentido mas amplio no se limita a ello, se realiza preferiblemente cualquier sustitucion, delecion o insercion en las posiciones que estan menos conservadas. Ademas, generalmente, se prefieren sustituciones de aminoacido con respecto a deleciones o inserciones de aminoacido.
Los analogos son preferiblemente tales que pueden unirse a una protema de la envuelta de un virus con una afinidad (de manera adecuada medida y/o expresada como un valor de Kd (real o aparente), un valor de Ka (real o aparente), una velocidad de asociacion y/o una velocidad de disociacion, o alternativamente como valor de CI50, tal como se describe adicionalmente en el presente documento) que es tal como se define en el presente documento para los Nanobodies descritos en el presente documento.
Los analogos son preferiblemente tambien tales que conservan las propiedades favorables de los Nanobodies, tal como se describe en el presente documento.
Ademas, segun un aspecto preferido, los analogos tienen un grado de identidad de secuencia de al menos el 70 %, preferiblemente al menos el 80 %, mas preferiblemente al menos el 90 %, tal como al menos el 95 % o el 99 % o mas; y/o tienen preferiblemente como maximo 20 diferencias de aminoacido, preferiblemente como maximo 10, incluso mas preferiblemente como maximo 5, tal como 4, 3, 2 o solamente 1 diferencia de aminoacido (tal como se define en el presente documento), con uno de los Nanobodies de las SEQ ID NO: 158 a 236, 248 a 407, 2448 y 2574 a 2581 (vease la tabla A-1).
Ademas, las secuencias de entramado de los analogos son preferiblemente tales que son segun los aspectos preferidos definidos en el presente documento. Mas generalmente, tal como se describe en el presente documento, los analogos tendran (a) una Q en la posicion 108; y/o (b) un aminoacido con carga o un residuo de cistema en la posicion 45 y preferiblemente una E en la posicion 44, y mas preferiblemente E en la posicion 44 y R en la posicion 45; y/o (c) P, R o S en la posicion 103.
Una clase preferida de analogos de los Nanobodies comprenden Nanobodies que se han humanizado (es decir, en comparacion con la secuencia de un Nanobody que se produce de manera natural de la invencion). Tal como se menciona en los antecedentes de la tecnica citados en el presente documento, tal humanizacion implica generalmente reemplazar uno o mas residuos de aminoacido en la secuencia de un Vhh que se produce de manera natural por los residuos de aminoacido que aparecen en la misma posicion en un dominio Vh humano, tal como un dominio Vh3 humano. Ejemplos de posibles sustituciones de humanizacion o combinaciones de sustituciones de humanizacion le quedaran claros al experto, por ejemplo a partir de las tablas en el presente documento, a partir de las posibles sustituciones de humanizacion mencionadas en los antecedentes de la tecnica citados en el presente documento, y/o a partir de una comparacion entre la secuencia de un Nanobody y la secuencia de un dominio Vh humano que se produce de manera natural.
Las sustituciones de humanizacion deben elegirse de tal manera que los Nanobodies humanizados resultantes conserven todavfa las propiedades favorables de los Nanobodies tal como se definen en el presente documento, y mas preferiblemente tales que sean tal como se describen para analogos en los parrafos anteriores. Un experto sera capaz generalmente de determinar y seleccionar sustituciones de humanizacion adecuadas o combinaciones adecuadas de sustituciones de humanizacion, basandose en la divulgacion en el presente documento y opcionalmente despues de un grado limitado de experimentacion de rutina, que puede implicar, por ejemplo, introducir un numero limitado de posibles sustituciones de humanizacion y determinar su influencia sobre las propiedades de los Nanobodies asf obtenidos.
Generalmente, como resultado de la humanizacion, los Nanobodies pueden volverse mas “similares a los humanos”, mientras que conservan todavfa las propiedades favorables de los Nanobodies tal como se describe en el presente documento. Como resultado, tales Nanobodies humanizados pueden tener varias ventajas, tales como una inmunogenicidad reducida, en comparacion con los dominios Vhh que se producen de manera natural correspondientes. De nuevo, basandose en la divulgacion en el presente documento y opcionalmente despues de un grado limitado de experimentacion de rutina, el experto sera capaz de seleccionar sustituciones de humanizacion o combinaciones adecuadas de sustituciones de humanizacion que optimicen o logren un equilibrio deseado o adecuado entre las propiedades favorables proporcionadas por las sustituciones de humanizacion, por un lado, y las propiedades favorables de los dominios Vhh que se producen de manera natural, por otro lado.
Los Nanobodies pueden humanizarse de manera adecuada en cualquier residuo de entramado, tal como en uno o mas residuos distintivos (tal como se definen en el presente documento) o en uno o mas de otros residuos de entramado (es decir, residuos no distintivos) o cualquier combinacion adecuada de los mismos. Una sustitucion de humanizacion preferida para Nanobodies del “grupo de P,R,S en 103” o el “grupo de KERE” es Q108 a L108. Los Nanobodies de la “clase de GLEW” tambien pueden humanizarse mediante una sustitucion de Q108 a L108, siempre que al menos uno de los demas residuos distintivos contenga una sustitucion de camelido (camelizacion) (tal como se define en el presente documento). Por ejemplo, tal como se menciono anteriormente, una clase particularmente preferida de los Nanobodies humanizados tiene una secuencia de GLEW o similar a GLEW en las posiciones 44-47; P, R o S (y, en particular, R) en la posicion 103, y una L en la posicion 108.
Los analogos humanizados y otros, y secuencias de acido nucleico que codifican los mismos, pueden proporcionarse de cualquier manera conocida per se, por ejemplo usando una o mas de las tecnicas mencionadas en las paginas 103 y 104 del documento WO 08/020079.
Tal como se menciona en ese documento, tambien le quedara claro al experto que los Nanobodies pueden disenarse y/o prepararse partiendo de secuencias de Vh humano (es decir, secuencias de aminoacidos o las secuencias de nucleotidos correspondientes), tales como, por ejemplo, a partir de secuencias de Vh3 humano tales como DP-47, DP-51 o DP-29, es decir introduciendo una o mas sustituciones de camelizacion (es decir, cambiando uno o mas residuos de aminoacido en la secuencia de aminoacidos de dicho dominio Vh humano en los residuos de aminoacido que aparecen en la posicion correspondiente en un dominio Vhh), para proporcionar la secuencia de un Nanobody y/o para conferir las propiedades favorables de un Nanobody a la secuencia asf obtenida. De nuevo, esto puede realizarse generalmente usando los diversos metodos y tecnicas a los que se hace referencia en el parrafo anterior, usando una secuencia de aminoacidos y/o secuencia de nucleotidos para un dominio Vh humano como punto de partida.
Algunas sustituciones de camelizacion preferidas, pero no limitativas pueden derivar de las tablas B-4 a B-7. Tambien quedara claro que las sustituciones de camelizacion en uno o mas de los residuos distintivos tendran generalmente una mayor influencia sobre las propiedades deseadas que las sustituciones en una o mas de las otras posiciones de aminoacido, aunque ambas y cualquier combinacion adecuada de las mismas estan incluidas dentro del alcance de la invencion. Por ejemplo, es posible introducir una o mas sustituciones de camelizacion que ya confieren al menos algunas propiedades deseadas, y luego introducir sustituciones de camelizacion adicionales que o bien mejoran adicionalmente dichas propiedades y/o bien confieren propiedades favorables adicionales. De nuevo, el experto sera capaz generalmente de determinar y seleccionar sustituciones de camelizacion adecuadas o combinaciones adecuadas de sustituciones de camelizacion, basandose en la divulgacion en el presente documento y opcionalmente despues de un grado limitado de experimentacion de rutina, que puede implicar, por ejemplo, introducir un numero limitado de posible sustituciones de camelizacion y determinar si las propiedades favorables de los Nanobodies se obtienen o mejoran (es decir, en comparacion con el dominio Vh original).
Generalmente, sin embargo, tales sustituciones de camelizacion son preferiblemente tales que la secuencia de aminoacidos resultante contiene al menos (a) una Q en la posicion 108; y/o (b) un aminoacido con carga o un residuo de cistema en la posicion 45 y preferiblemente tambien una E en la posicion 44, y mas preferiblemente E en la posicion 44 y R en la posicion 45; y/o (c) P, R o S en la posicion 103; y opcionalmente uno o mas sustituciones de camelizacion adicionales. Mas preferiblemente, las sustituciones de camelizacion son tales que dan como resultado un Nanobody y/o en un analogo del mismo (tal como se define en el presente documento), tal como un analogo humanizado y/o preferiblemente un analogo que es tal como se define en los parrafos anteriores.
La invencion en su sentido mas amplio tambien comprende derivados de los Nanobodies. Tales derivados pueden obtenerse generalmente mediante modificacion y, en particular, mediante modificacion qmmica y/o biologica (por ejemplo, enzimatica), de los Nanobodies y/o de uno o mas de los residuos de aminoacido que forman los Nanobodies.
Ejemplos de tales modificaciones, asf como ejemplos de residuos de aminoacido dentro de la secuencia de Nanobody que pueden modificarse de tal manera (es decir, o bien en la estructura principal de protema pero preferiblemente en una cadena lateral), metodos y tecnicas que pueden usarse para introducir tales modificaciones y los usos y las ventajas potenciales de tales modificaciones le quedaran claros al experto.
Por ejemplo, tal modificacion puede implicar la introduccion (por ejemplo, mediante enlaces covalentes o de otra manera adecuada) de uno o mas grupos funcionales, residuos o restos en o sobre el Nanobody y, en particular, de uno o mas grupos funcionales, residuos o restos que confieren una o mas propiedades o funcionalidades deseadas al Nanobody. Los ejemplos de tales grupos funcionales le quedaran claros al experto.
Por ejemplo, tal modificacion puede comprender la introduccion (por ejemplo, mediante union covalente o de cualquier otra manera adecuada) de uno o mas grupos funcionales que aumentan la semivida, la solubilidad y/o la absorcion del Nanobody, que reducen la inmunogenicidad y/o la toxicidad del Nanobody, que eliminan o atenuan cualquier efecto secundario no deseado del Nanobody, y/o que confieren otras propiedades ventajosas a y/o reducen las propiedades no deseadas de los Nanobodies descritos en el presente documento y/o polipeptidos de la invencion; o cualquier combinacion de dos o mas de los anteriores. Los ejemplos de tales grupos funcionales y de las tecnicas para introducirlos le quedaran claros al experto, y pueden comprender generalmente todos los grupos funcionales y las tecnicas mencionados en los antecedentes generales de la tecnica citados anteriormente en el presente documento asf como los grupos funcionales y las tecnicas conocidos per se para la modificacion de protemas farmaceuticas y, en particular, para la modificacion de anticuerpos o fragmentos de anticuerpo (incluyendo ScFv y anticuerpos de un solo dominio), para los que, por ejemplo, se hace referencia a Remington's Pharmaceutical Sciences, 16.a ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa (1980). Tales grupos funcionales pueden enlazarse, por ejemplo, directamente (por ejemplo, covalentemente) a un Nanobody, u opcionalmente mediante un ligador o espaciador adecuado, tal como le quedara claro de nuevo al experto.
Una de las tecnicas mas ampliamente usadas para aumentar la semivida y/o reducir la inmunogenicidad de protemas farmaceuticas comprende la fijacion de un polfmero farmacologicamente aceptable adecuado, tal como polietilenglicol (PEG) o derivados del mismo (tales como metoxipolietilenglicol o mPEG). Generalmente, cualquier forma adecuada de pegilacion puede usarse, tal como la pegilacion usada en la tecnica para anticuerpos y fragmentos de anticuerpo (incluyendo pero sin limitarse a anticuerpos de dominios (o de un solo dominio) y ScFv); se hace referencia, por ejemplo, a Chapman, Nat. Biotechnol., 54, 531-545 (2002); Veronese y Harris (2002) Adv. Drug Deliv. Rev. 54: 453-456, Harris y Chess, Nat. Rev. Drug. Discov., 2, (2003) y al documento WO 04/060965. Tambien estan disponibles comercialmente reactivos para la pegilacion de protemas, por ejemplo de Nektar Therapeutics, EE.UU.
Preferiblemente, se usa pegilacion dirigida al sitio, en particular mediante un residuo de cistema (vease por ejemplo Yang et al., Protein Engineering, 16, 10, 761-770 (2003). Por ejemplo, con este proposito, PEG puede fijarse a un residuo de cistema que aparece de manera natural en un Nanobody, un Nanobody puede modificarse para introducir de manera adecuada uno o mas residuos de cistema para la fijacion de PEG, o puede fusionarse una secuencia de aminoacidos que comprende uno o mas residuos de cistema para la fijacion de PEG al extremo N y/o C-terminal de un Nanobody, todo ello usando tecnicas de modificacion por ingeniena genetica de protemas conocidas per se por el experto.
Preferiblemente, para los Nanobodies y las protemas, se usa un PEG con un peso molecular de mas de 5000, tal como de mas de 10000 y menos de 200000, tal como de menos de 100000; por ejemplo en el intervalo de 20000­ 80000.
Otra modificacion habitualmente menos preferida comprende glicosilacion ligada a N o ligada a O, habitualmente como parte de modificacion cotraduccional y/o postraduccional, dependiendo de la celula huesped usada para expresar el Nanobody o polipeptido.
Una modificacion tambien habitualmente menos preferida comprende miristilacion, habitualmente como parte de modificacion cotraduccional y/o postraduccional, dependiendo de la celula huesped usada para expresar el Nanobody o polipeptido.
Aun otra modificacion puede comprender la introduccion de uno o mas marcadores detectables u otros grupos o restos de generacion de senal, que dependen del uso pretendido del Nanobody marcado. Los marcadores adecuados y las tecnicas para su fijacion, uso y deteccion le quedaran claros al experto y, por ejemplo, incluyen, pero no se limitan a, los marcadores fluorescentes, marcadores fosforescentes, marcadores quimioluminiscentes, marcadores bioluminiscentes, radioisotopos, metales, quelatos de metales, cationes metalicos, cromoforos y enzimas, tales como los mencionados en la pagina 109 del documento WO 08/020079. Otros marcadores adecuados le quedaran claros al experto y, por ejemplo, incluyen restos que pueden detectarse usando espectroscopfa de ESR o RMN.
Tales Nanobodies y polipeptidos marcados pueden usarse, por ejemplo, para ensayos in vitro, in vivo o in situ (incluyendo inmunoensayos conocidos per se tal como ELISA, RIA, EIA y otros “ensayos de tipo sandwich”, etc.) asf como propositos de obtencion de imagenes y diagnostico in vivo, dependiendo de la eleccion del marcador espedfico.
Tal como le quedara claro al experto, otra modificacion puede implicar la introduccion de un grupo quelante, por ejemplo para quelar uno de los metales o cationes metalicos a los que se hizo referencia anteriormente. Los grupos quelantes adecuados por ejemplo incluyen, sin limitacion, acido dietilentriaminopentaacetico (DTPA) o acido etilendiaminotetraacetico (EDTA).
Aun otra modificacion puede comprender la introduccion de un grupo funcional que es parte de un par de union espedfica, tal como el par de union biotina-(estrept)avidina. Tal grupo funcional puede usarse para ligar el Nanobody a otra protema, polipeptido o compuesto qmmico que se une a la otra mitad del par de union, es decir a traves de la formacion del par de union. Por ejemplo, un Nanobody puede conjugarse a biotina, y ligarse a otra protema, polipeptido, compuesto o portador conjugado a avidina o estreptavidina. Por ejemplo, tal Nanobody conjugado puede usarse como indicador, por ejemplo en un sistema de diagnostico en el que se conjuga un agente de produccion de senal a avidina o estreptavidina. Tales pares de union tambien pueden usarse, por ejemplo, para unir el Nanobody a un portador, incluyendo portadores adecuados con propositos farmaceuticos. Un ejemplo no limitativo son las formulaciones liposomales descritas por Cao y Suresh, Journal of Drug Targetting, 8, 4, 257 (2000). Tales pares de union tambien pueden usarse para ligar un agente terapeuticamente activo al Nanobody.
Para algunas aplicaciones, en particular para aquellas aplicaciones en las que se pretende destruir una celula que expresa la diana contra la que estan dirigidos los Nanobodies (por ejemplo, en el tratamiento de cancer), o reducir o ralentizar el crecimiento y/o la proliferacion de tal celula, los Nanobodies tambien pueden ligarse a una toxina o a un residuo o resto toxico. Los ejemplos de restos, compuestos o residuos toxicos que pueden ligarse a un Nanobody para proporcionar, por ejemplo, un compuesto citotoxico le quedaran claros al experto y pueden hallarse, por ejemplo, en la tecnica anterior citada anteriormente y/o en la descripcion adicional en el presente documento. Un ejemplo es la denominada tecnologfa ADEPT™ descrita en el documento WO 03/055527.
Otras modificaciones qmmicas y enzimaticas potenciales le quedaran claras al experto. Tales modificaciones tambien pueden introducirse con propositos de investigacion (por ejemplo, para estudiar relaciones funcionactividad). Por ejemplo, se hace referencia a Lundblad y Bradshaw, Biotechnol. Appl. Biochem., 26, 143-151 (1997). Preferiblemente, los derivados son tales que se unen a una protema de la envuelta de un virus con una afinidad (de manera adecuada medida y/o expresada como un valor de Kd (real o aparente), un valor de Ka (real o aparente), una velocidad de asociacion y/o una velocidad de disociacion, o alternativamente como valor de CI50, tal como se describe adicionalmente en el presente documento) que es tal como se define en el presente documento para los Nanobodies.
Tal como se menciono anteriormente, la invencion tambien se refiere a protemas o polipeptidos que consisten esencialmente en o comprenden al menos un Nanobody. Por “consisten esencialmente en” quiere decirse que la secuencia de aminoacidos del polipeptido de la invencion o bien es exactamente igual a la secuencia de aminoacidos de un Nanobody o bien corresponde a la secuencia de aminoacidos de un Nanobody que tiene un numero limitado de residuos de aminoacido, tal como 1-20 residuos de aminoacido, por ejemplo 1-10 residuos de aminoacido y preferiblemente 1-6 residuos de aminoacido, tal como 1, 2, 3, 4, 5 o 6 residuos de aminoacido, anadidos en el extremo amino-terminal, en el extremo carboxilo-terminal, o en tanto en el extremo amino-terminal como en el extremo carboxilo-terminal de la secuencia de aminoacidos del Nanobody.
Dichos residuos de aminoacido pueden cambiar o no, alterar o influir de otro modo en las propiedades (biologicas) del Nanobody y pueden anadir o no funcionalidad adicional al Nanobody. Por ejemplo, tales residuos de aminoacido: - pueden comprender un residuo Met N-terminal, por ejemplo como resultado de la expresion en una celula huesped o un organismo huesped heterologos.
- pueden formar una secuencia senal o secuencia lfder que dirige la secrecion del Nanobody desde una celula huesped tras la smtesis. Los peptidos lfder secretores adecuados le quedaran claros al experto, y pueden ser tal como se describen adicionalmente en el presente documento. Habitualmente, tal secuencia lfder se ligara al extremo N-terminal del Nanobody, aunque la invencion en su sentido mas amplio no se limita a ello;
- pueden formar una secuencia o senal que permite que el Nanobody se dirija hacia y/o penetre o entre en organos, tejidos, celulas o partes o compartimentos espedficos de celulas, y/o que permite que el Nanobody penetre o atraviese una barrera biologica tal como una membrana celular, una capa celular tal como una capa de celulas epiteliales, un tumor incluyendo tumores solidos, o la barrera hematoencefalica. Los ejemplos de tales secuencias de aminoacidos le quedaran claros al experto e incluyen los mencionados en el parrafo c) en la pagina 112 del documento WO 08/020079.
- pueden formar una “etiqueta”, por ejemplo una secuencia de aminoacidos o residuo que permite o facilita la purificacion del Nanobody, por ejemplo usando tecnicas de afinidad dirigidas contra dicha secuencia o residuo. Despues de eso, puede retirarse dicha secuencia o residuo (por ejemplo, mediante escision qmmica o enzimatica) para proporcionar la secuencia de Nanobody (con este proposito, la etiqueta puede ligarse opcionalmente a la secuencia de Nanobody mediante una secuencia ligadora escindible o contener un motivo escindible). Algunos ejemplos preferidos, pero no limitativos de tales residuos son multiples residuos de histidina, residuos de glutation y una etiqueta myc (vease, por ejemplo, SEQ ID NO:31 del documento WO 06/12282).
- pueden ser uno o mas residuos de aminoacido que se han funcionalizado y/o que pueden servir como un sitio para la fijacion de grupos funcionales. Los residuos de aminoacido y grupos funcionales adecuados le quedaran claros al experto e incluyen, pero no se limitan a, los residuos de aminoacido y grupos funcionales mencionados en el presente documento para los derivados de los Nanobodies de la invencion.
Segun otro aspecto, un polipeptido de la invencion comprende un Nanobody, que se fusiona en su extremo aminoterminal, en su extremo carboxilo-terminal, o tanto en su extremo amino-terminal como en su extremo carboxiloterminal a al menos una secuencia de aminoacidos adicional, es decir para proporcionar una protema de fusion que comprende dicho Nanobody y la una o mas secuencias de aminoacidos adicionales. Tal fusion tambien se denominara en el presente documento una “fusion de Nanobody”.
La una o mas secuencias de aminoacidos adicionales pueden ser cualquier secuencia de aminoacidos adecuada y/o deseada. Las secuencias de aminoacidos adicionales pueden cambiar o no, alterar o influir de otro modo en las propiedades (biologicas) del Nanobody, y pueden anadir o no funcionalidad adicional al Nanobody descrito en el presente documento o el polipeptido de la invencion. Preferiblemente, la secuencia de aminoacidos adicional es tal que confiere una o mas propiedades o funcionalidades deseadas al Nanobody descrito en el presente documento o el polipeptido de la invencion.
Por ejemplo, la secuencia de aminoacidos adicional tambien puede proporcionar un segundo sitio de union, sitio de union que puede estar dirigido contra cualquiera protema, polipeptido, antígeno, determinante antigenico o epttopo deseado (incluyendo pero sin limitarse a la misma/al mismo protema, polipeptido, antígeno, determinante antigenico o epítopo contra la/el que se dirige el Nanobody, o una protema, un polipeptido, antígeno, determinante antigenico o epítopo diferente).
Los ejemplos de tales secuencias de aminoacidos le quedaran claros al experto, y pueden comprender generalmente todas las secuencias de aminoacidos que se usan en fusiones pepiticas basadas en anticuerpos convencionales y fragmentos de los mismos (incluyendo pero sin limitarse a ScFv y anticuerpos de un solo dominio). Por ejemplo, se hace referencia a la revision en Holliger y Hudson, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136 (2005). Por ejemplo, tal secuencia de aminoacidos puede ser una secuencia de aminoacidos que aumenta la semivida, la solubilidad o la absorcion, reduce la inmunogenicidad o la toxicidad, elimina o atenua efectos secundarios no deseados, y/o confiere otros propiedades ventajosas a y/o reduce las propiedades no deseadas de los polipeptidos de la invencion, en comparacion con el Nanobody per se. Algunos ejemplos no limitativos de tales secuencias de aminoacidos son protemas sericas, tales como albumina serica humana (vease, por ejemplo, el documento WO 00/27435) o moleculas haptenicas (por ejemplo, haptenos que se reconocen por anticuerpos circulantes, vease, por ejemplo, el documento w O 98/22141).
En particular, se ha descrito en la tecnica que ligar fragmentos de inmunoglobulinas (tales como dominios Vh) a albumina serica o a fragmentos de la misma puede usarse para aumentar la semivida. Se hace referencia a los documentos WO 00/27435 y WO 01/077137. Segun la invencion, el Nanobody preferiblemente se liga o bien directamente a albumina serica (o a un fragmento adecuado de la misma) o bien mediante un ligador adecuado y, en particular, mediante un peptido adecuado ligado de modo que el polipeptido de la invencion puede expresarse como fusion genetica (protema). Segun un aspecto espedfico, el Nanobody puede ligarse a un fragmento de albumina serica que comprende al menos el dominio III de albumina serica o parte del mismo. Por ejemplo, se hace referencia al documento Wo 07/112940 de Ablynx N.V.
Alternativamente, la secuencia de aminoacidos adicional puede proporcionar un segundo sitio de union o unidad de union que esta dirigida contra una protema serica (tal como, por ejemplo, albumina serica humana u otra protema serica tal como IgG), para proporcionar una semivida aumentada en suero. Tales secuencias de aminoacidos por ejemplo incluyen los Nanobodies descritos a continuacion, asf como las protemas de union y los peptidos pequenos descritos en los documentos WO 91/01743, WO 01/45746 y WO 02/076489 y los dAb descritos en los documentos WO 03/002609 y WO 04/003019. Tambien se hace referencia a Harmsen et al., Vaccine, 23 (41); 4926-42, 2005, asf como al documento EP 0368684, asf como a los documentos WO 08/028977, WO 08/043821, WO 08/043822 y WO 08/068280.
Tales secuencias de aminoacidos pueden estar dirigidas en particular contra albumina serica (y mas en particular albumina serica humana) y/o contra IgG (y mas en particular IgG humana). Por ejemplo, tales secuencias de aminoacidos pueden ser secuencias de aminoacidos que estan dirigidas contra albumina serica (humana) y secuencias de aminoacidos que pueden unirse a residuos de aminoacido en albumina serica (humana) que no participan en la union de albumina serica a FcRn (vease, por ejemplo, el documento WO 06/0122787) y/o secuencias de aminoacidos que son capaces de unirse a residuos de aminoacido en albumina serica que no forman parte del dominio III de albumina serica (vease de nuevo, por ejemplo, el documento WO 06/0122787); secuencias de aminoacidos que tienen o pueden proporcionar una semivida aumentada (vease, por ejemplo, el documento WO 08/028977 de Ablynx N.V.)); secuencias de aminoacidos contra albumina serica humana que producen reaccion cruzada con albumina serica de al menos una especie de mairnfero y, en particular, con al menos una especie de primate (tal como, sin limitacion, monos del genero Macaca (tales como y, en particular, macacos cangrejeros (Macaca fascicularis) y/o monos rhesus (Macaca mulatta)) y babuinos (Papio ursinus), se hace referencia de nuevo al documento WO 08/028977; secuencias de aminoacidos que pueden unirse a albumina serica de manera independiente del pH (vease, por ejemplo, el documento WO2008/043821) y/o secuencias de aminoacidos que son agentes de union condicionales (vease, por ejemplo, el documento WO 08/043822).
Segun otro aspecto, la una o mas secuencias de aminoacidos adicionales pueden comprender uno o mas partes, fragmentos o dominios de anticuerpos de 4 cadenas convencionales (y, en particular, anticuerpos humanos) y/o de anticuerpos de cadena pesada. Por ejemplo, aunque habitualmente se prefiere menos, un Nanobody de la invencion puede ligarse a un dominio Vh o Vl convencional (preferiblemente humano) o a un analogo natural o sintetico de un dominio Vh o Vl, de nuevo opcionalmente mediante una secuencia ligadora (incluyendo pero sin limitarse a otros anticuerpos de dominios (o de un solo dominio), tales como los dAb descritos por Ward et al.).
El al menos un Nanobody tambien puede ligarse a uno o mas dominios Ch1, Ch2 y/o Ch3 (preferiblemente humanos), opcionalmente mediante una secuencia ligadora. Por ejemplo, un Nanobody unido a un dominio Ch1 adecuado podria usarse por ejemplo (junto con cadenas ligeras adecuadas) para generar estructuras/fragmentos de anticuerpo analogos a fragmentos Fab o fragmentos F(ab')2 convencionales, pero en los que uno o (en caso de un fragmento F(ab')2) uno o ambos de los dominios Vh convencionales se han reemplazado por un Nanobody de la invencion. Ademas, dos Nanobodies podrian ligarse a un dominio Ch2 y/o Ch3 (opcionalmente mediante un ligador) para proporcionar un constructo con semivida aumentada in vivo.
Segun un aspecto espedfico de un polipeptido de la invencion, uno o mas Nanobodies pueden ligarse (opcionalmente mediante una region bisagra o un ligador adecuado) a uno o mas dominios constantes (por ejemplo, 2 o 3 dominios constantes que pueden usarse como parte de/para formar una parte de Fc), a una parte de Fc y/o a una o mas partes, fragmentos o dominios de anticuerpo que confieren una o mas funciones efectoras al polipeptido de la invencion y/o pueden conferir la capacidad de unirse a uno o mas receptores de Fc. Por ejemplo, con este proposito, y sin limitarse a ello, la una o mas secuencias de aminoacidos adicionales pueden comprender uno o mas dominios Ch2 y/o Ch3 de un anticuerpo, tal como de un anticuerpo de cadena pesada (tal como se describe en el presente documento) y mas preferiblemente de un anticuerpo de 4 cadenas humano convencional; y/o pueden formar (parte de) una region Fc, por ejemplo de IgG (por ejemplo, de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4), de IgE o de otra Ig humana tal como IgA, IgD o IgM. Por ejemplo, el documento Wo 94/04678 describe anticuerpos de cadena pesada que comprenden un dominio Vhh de camelido o un derivado humanizado del mismo (es decir, un Nanobody), en los que el dominio Ch2 y/o Ch3 de camelido se ha reemplazado por dominios Ch2 y Ch3 humanos, para proporcionar una inmunoglobulina que consiste en 2 cadenas pesadas que comprenden, cada una, un Nanobody y dominios Ch2 y Ch3 humanos (pero no un dominio Ch1), inmunoglobulina que tiene la funcion efectora proporcionada por los dominios Ch2 y Ch3 e inmunoglobulina que puede funcionar sin la presencia de ninguna cadena ligera. Otras secuencias de aminoacidos que pueden ligarse de manera adecuada a los Nanobodies para proporcionar una funcion efectora le quedaran claras al experto, y pueden elegirse basandose en la(s) funcion/funciones efectora(s) deseada(s). Por ejemplo, se hace referencia a los documentos WO 04/058820, WO 99/42077, WO 02/056910 y WO 05/017148, asf como la revision en Holliger y Hudson, citada anteriormente; y a la solicitud estadounidense provisional no publicada previamente de Ablynx N.V. titulada “Constructs comprising single variable domains and an Fc portion derived from IgE’ que tiene como fecha de presentacion el 4 de diciembre de 2007 (vease tambien el documento PCT/EP2008/066366). El acoplamiento de un Nanobody a una parte de Fc tambien puede conducir a una semivida aumentada, en comparacion con el Nanobody correspondiente. Para algunas aplicaciones, el uso de una parte de Fc y/o de dominios constantes (es decir, dominios Ch2 y/o Ch3) que confieren una semivida aumentada sin ninguna funcion efectora biologicamente significativa tambien puede ser adecuado o incluso preferido. Otros constructos adecuados que comprenden uno o mas Nanobodies y uno o mas dominios constantes con semivida aumentada in vivo le quedaran claros al experto, y pueden comprender, por ejemplo, dos Nanobodies ligados a un dominio Ch3, opcionalmente mediante una secuencia ligadora. Generalmente, cualquier protema de fusion o derivado con semivida aumentada tendra preferiblemente un peso molecular de mas de 50 kD, el valor de corte para la absorcion renal.
En otro aspecto espedfico, pero no limitativo, para formar un polipeptido de la invencion, pueden ligarse una o mas secuencias de aminoacidos de la invencion (opcionalmente mediante una region bisagra o un ligador adecuado) a dominios constantes que se producen de manera natural, sinteticos o semisinteticos (o analogos, variantes, mutantes, partes o fragmentos de los mismos) que tienen una tendencia reducida (o esencialmente sin tendencia) a autoasociarse para dar dfmeros (es decir, en comparacion con dominios constantes que aparecen de manera natural en anticuerpos de 4 cadenas convencionales). Tales variantes de cadena de Fc monomericas (es decir, sin autoasociacion), o fragmentos de las mismas, le quedaran claros al experto. Por ejemplo, Helm et al., J Biol Chem 1996 271 7494, describen variantes de cadena de Fc monomericas que pueden usarse en las cadenas de polipeptido de la invencion.
Ademas, tales variantes de cadena de Fc monomericas son preferiblemente tales que son todavfa capaces de unirse al complemento o el/los receptor(es) de Fc relevante(s) (dependiendo de la parte de Fc de la que derivan), y/o tales que todavfa tienen algunas o todas las funciones efectoras de la parte de Fc de la que derivan (o en un nivel reducido todavfa adecuado para el uso pretendido). Alternativamente, en una cadena de polipeptido de este tipo de la invencion, puede usarse la cadena de Fc monomerica para conferir una semivida aumentada a la cadena de polipeptido, en cuyo caso la cadena de Fc monomerica tambien puede no tener o esencialmente no tener funciones efectoras.
Los polipeptidos multivalentes, biespedficos/multiespedficos o biparatopicos/multiparatopicos de la invencion tambien pueden ligarse a partes de Fc, para proporcionar constructos de polipeptido del tipo que se describe en el documento WO 2009/068630 titulado “Immmunoglobulin constructs".
Las secuencias de aminoacidos adicionales tambien pueden formar una secuencia senal o secuencia lfder que dirige la secrecion del Nanobody o el polipeptido de la invencion de una celula huesped tras la smtesis (por ejemplo, para proporcionar una forma pre, pro o prepro del polipeptido de la invencion, dependiendo de la celula huesped usada para expresar el polipeptido de la invencion).
La secuencia de aminoacidos adicional tambien pueden formar una secuencia o senal que permite que el Nanobody o polipeptido de la invencion se dirija hacia y/o penetre o entre en organos, tejidos, celulas o partes o compartimentos espedficos de celulas, y/o que permite que el Nanobody o polipeptido penetre o atraviese una barrera biologica tal como una membrana celular, una capa celular tal como una capa de celulas epiteliales, un tumor incluyendo tumores solidos, o la barrera hematoencefalica. Los ejemplos adecuados de tales secuencias de aminoacidos le quedaran claros al experto y, por ejemplo, incluyen, pero no se limitan a, los mencionados en la pagina 118 del documento WO 08/020079.
Segun un aspecto preferido, pero no limitativo, dicha una o mas secuencias de aminoacidos adicionales comprenden al menos un Nanobody adicional, para proporcionar un polipeptido de la invencion que comprende al menos cuatro, cinco o mas Nanobodies, en las que dicho Nanobodies pueden unirse opcionalmente mediante una o mas secuencias ligadoras (tal como se definen en el presente documento). Tal como se describe en las paginas 119 y 120 del documento WO 08/020079, los polipeptidos descritos en el presente documento que comprenden dos o mas Nanobodies, de los que al menos uno es un Nanobody descrito en el presente documento, tambien se denominaran en el presente documento polipeptidos “multivalentes” descritos en el presente documento, y tambien se hara referencia a que los Nanobodies presentes en tales polipeptidos en el presente documento estan en un “formato multivalente”. Por ejemplo, los polipeptidos “bivalentes” y “trivalentes” descritos en el presente documento pueden ser tal como se describen adicionalmente en las paginas 119 y 120 del documento WO 08/020079.
Los polipeptidos descritos en el presente documento que contienen al menos dos Nanobodies, en los que al menos un Nanobody esta dirigido contra un primer antigeno (es decir, contra una protema de la envuelta de un virus) y al menos un Nanobody esta dirigido contra un segundo antígeno (es decir, diferente de una protema de la envuelta de un virus), tambien se denominaran polipeptidos “multiespedficos”, y tambien se hara referencia a que los Nanobodies presentes en tales polipeptidos en el presente documento estan en un “formato multiespedfico”. Por tanto, por ejemplo, un polipeptido “biespedfico” es un polipeptido que comprende al menos un Nanobody dirigido contra un primer antigeno (es decir, una protema de la envuelta de un virus) y al menos un Nanobody adicional dirigido contra un segundo antigeno (es decir, diferente de la protema de la envuelta de un virus), mientras que un polipeptido “triespedfico” es un polipeptido que comprende al menos un Nanobody dirigido contra un primer antigeno (es decir, una protema de la envuelta de un virus), al menos un Nanobody adicional dirigido contra un segundo antígeno (es decir, diferente de dicha protema de la envuelta de un virus) y al menos un Nanobody adicional dirigido contra un tercer antígeno (es decir, diferente tanto de dicha protema de la envuelta de un virus como del segundo antígeno); etc.
Por consiguiente, en su forma mas simple, un polipeptido biespedfico descrito en el presente documento es un polipeptido bivalente (tal como se define en el presente documento), que comprende un primer Nanobody dirigido contra una protema de la envuelta de un virus y un segundo Nanobody dirigido contra un segundo antígeno, en el que dicho primer Nanobody y dicho segundo Nanobody pueden unirse opcionalmente mediante una secuencia ligadora (tal como se define en el presente documento); mientras que un polipeptido triespedfico descrito en el presente documento en su forma mas simple es un polipeptido trivalente (tal como se define en el presente documento), que comprende un primer Nanobody dirigido contra una protema de la envuelta de un virus, un segundo Nanobody dirigido contra un segundo antígeno y un tercer Nanobody dirigido contra un tercer antígeno, en el que dicho primer Nanobody, segundo Nanobody y tercer Nanobody pueden unirse opcionalmente mediante una o mas secuencias ligadoras y, en particular, una y mas, en particular dos.
Sin embargo, tal como quedara claro a partir de la descripcion anterior en el presente documento, un polipeptido multiespedfico descrito en el presente documento puede comprender al menos un Nanobody contra una protema de la envuelta de un virus, y cualquier numero de Nanobodies dirigidos contra uno o mas antígenos diferentes de dicha protema de la envuelta de un virus.
Ademas, aunque la disposicion o el orden espedfico de los diversos Nanobodies en los polipeptidos de la invencion puede tener cierta influencia sobre las propiedades del polipeptido final de la invencion (incluyendo pero sin limitarse a la afinidad, especificidad o avidez para la protema de la envuelta de un virus, o contra el uno o mas de otros antígenos), dicha disposicion u orden habitualmente no es crftico y puede elegirse de manera adecuada por el experto, opcionalmente despues de algunos experimentos de rutina limitados basados en la divulgacion en el presente documento. Por tanto, cuando se hace referencia a un polipeptido multivalente o multiespedfico espedfico de la invencion, debe indicarse que esto engloba cualquier orden o disposicion de los Nanobodies relevantes, a menos que se indique expftcitamente de otro modo.
Tal como se describe adicionalmente en el presente documento, un polipeptido de la invencion puede contener dos o mas secuencias de aminoacidos y/o Nanobodies que estan dirigidos contra una protema de la envuelta de un virus. Generalmente, tales polipeptidos se uniran a una protema de la envuelta de un virus con avidez aumentada en comparacion con una unica secuencia de aminoacidos o Nanobody. Un polipeptido de este tipo puede comprender, por ejemplo, dos secuencias de aminoacidos y/o Nanobodies que estan dirigidos contra el mismo determinante antigenico, epítopo, parte, dominio, subunidad o conformacion (cuando sea aplicable) de una protema de la envuelta de un virus (que puede ser o no un sitio de interaccion); o comprender al menos una “primera” secuencia de aminoacidos de la invencion que esta dirigida contra un mismo primer determinante antigenico, epítopo, parte, dominio, subunidad o conformacion (cuando sea aplicable) de una protema de la envuelta de un virus (que puede ser o no un sitio de interaccion); y al menos una “segunda” secuencia de aminoacidos y/o Nanobody que esta dirigida contra un segundo determinante antigenico, epítopo, parte, dominio, subunidad o conformacion (cuando sea aplicable) diferente del primero (y que de nuevo puede ser o no un sitio de interaccion). En tales polipeptidos “biparatopicos” de la invencion, al menos una secuencia de aminoacidos y/o Nanobody esta dirigido contra un sitio de interaccion (tal como se define en el presente documento), aunque la invencion en su sentido mas amplio no se limita a ello.
Por tanto, tambien esta dentro del alcance de la invencion que, cuando sea aplicable, un polipeptido de la invencion puede unirse a dos o mas determinantes antigenicos, epítopos, partes, dominios, subunidades o conformaciones de una protema de la envuelta de un virus. En tal caso, los determinantes antigenicos, epítopos, partes, dominios o subunidades de dicha protema de la envuelta de un virus a los que se unen las secuencias de aminoacidos y/o polipeptidos de la invencion pueden ser esencialmente iguales (por ejemplo, si una protema de la envuelta de un virus contiene motivos estructurales repetidos o se produce en una forma multimerica) o pueden ser diferentes (y en este ultimo caso, las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos de la invencion se dice que son “bi y/o multiparatopicos” y pueden unirse a tales determinantes antigenicos, epítopos, partes, dominios, subunidades diferentes de dicha protema de la envuelta de un virus con una afinidad y/o especificidad que pueden ser iguales o diferentes). Por consiguiente, los polipeptidos bi o multiparatopicos de la presente invencion estan dirigidos contra y/o se unen espedficamente a al menos dos epítopos de una protema de la envuelta de un virus, y son por ejemplo (pero sin limitarse a) polipeptidos que estan dirigidos contra y/o pueden unirse espedficamente a tres epítopos o incluso mas de la misma protema de la envuelta de un virus.
Ademas, los polipeptidos de la presente invencion pueden estar dirigidos contra y/o pueden unirse espedficamente a al menos una protema de la envuelta particular de un virus y al menos un epítopo adicional de otra diana, que es diferente de dicha al menos una protema de la envuelta particular. Por ejemplo (pero sin limitarse a ello), los polipeptidos de la presente invencion pueden estar dirigidos contra y/o pueden unirse espedficamente a al menos una protema de la envuelta particular de un virus y al menos un epítopo adicional de un virus, por ejemplo al menos un epítopo adicional de una protema viral, tal como al menos un epítopo adicional de otra protema de la envuelta viral particular. Por tanto, los polipeptidos segun la invencion pueden estar dirigidos contra y/o pueden unirse espedficamente a al menos dos epítopos (o incluso mas) de al menos dos protemas de la envuelta diferentes. Ademas, dicho al menos un epítopo adicional de un virus puede participar o no en una o mas de las rutas biologicas mediadas por virus, en las que participa una protema de la envuelta de un virus y/o su receptor viral; mas espedficamente dicho al menos un epítopo adicional de un virus puede participar o no en la entrada viral en una celula huesped diana, tal como la fijacion del virion a una celula huesped diana y/o la fusion viral con una celula huesped diana o dicho al menos un epítopo adicional de un virus puede participar o no en la replicacion viral en una celula huesped diana, tal como la transcripcion viral y/o la traduccion viral y/o el empaquetamiento viral y/o la formacion de viriones funcionales y/o la gemacion de viriones nacientes desde la membrana de la celula huesped diana.
Generalmente, los polipeptidos tri y multivalentes (tal como se definen en el presente documento), bi, tri y multiespedficos (tal como se definen en el presente documento) y bi, tri y multiparatopicos (tal como se definen en el presente documento) segun la invencion pueden ser utiles para la prevencion y/o el tratamiento de enfermedades virales al unirse espedficamente a al menos un epítopo de una protema de la envuelta de un virus y al menos un epítopo adicional (que puede ser diferente o no de dicho al menos un epítopo) de una diana, en los que dicha diana puede ser diferente o no de dicha protema de la envuelta.
Preferiblemente, los polipeptidos tri y multivalentes (tal como se definen en el presente documento) y bi, tri y multiparatopicos (tal como se definen en el presente documento) segun la invencion pueden ser utiles para la prevencion y/o el tratamiento de enfermedades virales al unirse espedficamente a al menos dos epítopos (o incluso mas) (que pueden ser iguales o diferentes) en la misma protema de la envuelta de un virus.
Alternativamente, los polipeptidos de la presente invencion pueden estar dirigidos contra y/o pueden unirse espedficamente a al menos un epítopo de una protema de la envuelta de un virus y al menos un epítopo adicional de otra diana, que es diferente de dicha protema de la envuelta particular y que es, por ejemplo, un epítopo adicional de un virus, tales como un epítopo adicional de una protema viral o un epítopo adicional de otra protema de la envuelta viral particular.
Preferiblemente, tales polipeptidos tri y multivalentes, bi, tri y multiespedficos, y bi, tri y multiparatopicos, tal como se comento anteriormente en el presente documento, se uniran a (una protema de la envuelta de) un virus con avidez aumentada en comparacion con una unica secuencia de aminoacidos y/o Nanobody descrito en el presente documento.
Mas espedficamente, los polipeptidos tri y multivalentes, bi, tri y multiparatopicos y bi, tri y multiespedficos segun la invencion pueden ser utiles en la seleccion como diana de multiples sitios de union a receptor viral en los mismos y en diferentes protemas de la envuelta, respectivamente, lo que puede dar como resultado una potencia aumentada de neutralizacion viral (tal como se define en el presente documento) en comparacion con una unica secuencia de aminoacidos de la invencion. Ademas, los polipeptidos tri y multivalentes y bi, tri y multiparatopicos segun la invencion (es decir, que estan dirigidos contra y/o se unen espedficamente a al menos dos epítopos de la misma protema de la envuelta) pueden ser utiles en impedir el escape viral y/o la evasion viral.
Ademas, los polipeptidos tri y multivalentes, bi, tri y multiespedficos y/o bi, tri y multiparatopicos segun la invencion pueden ser utiles en la union a diferentes genotipos, diferentes subtipos y/o diferentes cepas y/o clados de un determinado virus. Ademas, los polipeptidos tri y multivalentes, bi, tri y multiespedficos y/o bi, tri y multiparatopicos segun la invencion pueden ser utiles en impedir el escape viral y/o la evasion viral.
En aun otro aspecto, los polipeptidos tri y multivalentes, bi, tri y multiespedficos y/o bi, tri y multiparatopicos segun la invencion pueden estar dirigidos contra VRS y pueden unirse a diferentes mutantes de escape de VRS (tales como, por ejemplo, los descritos en Lopez et al. 1998, J. Virol. 72: 6922-6928) y/o uno o mas mutantes de escape espedficos para el sitio antigenico II, espedficos para el sitio antigenico IV-VI y/o espedficos para la combinacion de ambos sitios antigenicos.
A este respecto se observo en la presente invencion que los polipeptidos tri y multivalentes, bi, tri y multiespedficos y/o bi, tri y multiparatopicos segun la invencion muestran una union y/o neutralizacion mejorada in vitro y/o in vivo de diferentes genotipos, diferentes subtipos y/o diferentes cepas y/o clados de un determinado virus. Ademas, los polipeptidos tri y multivalentes, bi, tri y multiespedficos y/o bi, tri y multiparatopicos segun la invencion mostraron una union y/o neutralizacion mejorada de mutantes de escape virales.
En aun otro aspecto, los polipeptidos tri y multivalentes, bi, tri y multiespedficos y/o bi, tri y multiparatopicos segun la invencion mostraron una union y/o neutralizacion mejorada de diferentes cepas de VRS (tales como Long, A-2 y B-1). Los polipeptidos tri y multivalentes, bi, tri y multiespedficos y/o bi, tri y multiparatopicos segun la invencion mostraron una union y/o neutralizacion mejorada de diferentes mutantes de escape de VRS (tales como, por ejemplo, los mutantes de escape descritos en Lopez et al. 1998, J. Virol. 72: 6922-6928, uno o mas mutantes de escape espedficos para el sitio antigenico II, mutantes de escape espedficos para el sitio antigenico IV-VI, mutantes de escape espedficos para la combinacion de ambos sitios antigenicos).
Finalmente, los polipeptidos tri y multivalentes, bi, tri y multiespedficos y bi, tri y multiparatopicos segun la invencion pueden ser utiles en la prevencion y/o la inhibicion de la infeccion viral y/o la fusion viral de un virion con su celula huesped diana (tal como se define en el presente documento) o pueden ser utiles en la neutralizacion de un virus induciendo la agregacion de viriones de dicho virus.
Para polipeptidos multivalentes y multiespedficos que contienen uno o mas dominios Vhh y su preparacion, tambien se hace referencia a Conrath et al., J. Biol. Chem., Vol. 276, 10. 7346-7350, 2001; Muyldermans, Reviews in Molecular Biotechnology 74 (2001), 277-302; asf como por ejemplo a los documentos WO 96/34103 y WO 99/23221. Pueden hallarse algunos otros ejemplos de algunos polipeptidos multiespedficos y/o multivalentes espedficos de la invencion en las solicitudes de Ablynx N.V. a las que se hace referencia en el presente documento.
En un aspecto, los Nanobodies pueden fijarse a polipeptidos distintos de Nanobody. Los polipeptidos distintos de Nanobody pueden ser polipeptidos que proporcionan a los Nanobodies una funcionalidad adicional. Por ejemplo, los polipeptidos distintos de Nanobody pueden proporcionar a los Nanobodies una estabilidad y/o semivida aumentada in vivo. En algunas realizaciones, el polipeptido distinto de Nanobody puede ser un fragmento distinto a de union de antígeno de un anticuerpo. En algunas realizaciones, el polipeptido distinto de Nanobody puede ser un fragmento Fc de IgG1 humana. En algunas realizaciones, el polipeptido distinto de Nanobody tambien puede comprende las regiones bisagra del fragmento Fc. En algunas realizaciones, el polipeptido distinto de Nanobody puede acoplarse al Nanobody mediante uno o mas ligadores. En algunas realizaciones, el polipeptido distinto de Nanobody puede acoplarse a multiples Nanobodies. En algunas realizaciones, los multiples Nanobodies se acoplan a ambos lados del polipeptido distinto de Nanobody (vease la figura 29). En algunas realizaciones, los multiples Nanobodies se acoplan en un lado del polipeptido distinto de Nanobody (vease la figura 30). En algunas realizaciones, el polipeptido distinto de Nanobody se acopla a un polipeptido tri o multivalente, bi, tri o multiparatopico o bi, tri o multiespedfico tal como se describio anteriormente. En algunas realizaciones, el polipeptido distinto de Nanobody se acopla, en un lado del polipeptido distinto de Nanobody, a un polipeptido tri o multivalente, bi, tri o multiparatopico o bi, tri o multiespedfico tal como se describio anteriormente (figuras 30 y 31). En algunas realizaciones, el polipeptido distinto de Nanobody se acopla, a ambos lados del polipeptido distinto de Nanobody, a un polipeptido tri o multivalente, bi, tri o multiparatopico o bi, tri o multiespedfico tal como se describio anteriormente (figuras 32). En algunas realizaciones, el polipeptido distinto de Nanobody se acopla, en un lado del polipeptido distinto de Nanobody, a un Nanobody tal como se describio anteriormente y, en un lado del polipeptido distinto de Nanobody, a un polipeptido tri o multivalente, bi, tri o multiparatopico o bi, tri o multiespedfico tal como se describio anteriormente (figuras 33). En algunas realizaciones, los multiples Nanobodies estan dirigidos contra el mismo antígeno. En algunas realizaciones, los multiples Nanobodies estan dirigidos contra un epttopo diferente en el mismo antígeno. En algunas realizaciones, los multiples Nanobodies estan dirigidos contra el mismo epítopo en el mismo antígeno. En algunas realizaciones, los multiples Nanobodies son identicos. Se proporcionan ejemplos no limitativos de constructos de Nanobody que comprenden fragmentos Fc de IgG1 en la figura 24, la tabla A-4 y el ejemplo 31. Nanobodies descritos en el presente documento que comprenden un fragmento Fc son las SEQ ID NO: 2641 a 2659 y 2978 a 2988 (tabla A-4).
A este respecto, la presente divulgacion tambien se refiere en general a constructos de Nanobody (tambien denominados “constructo de cadena de polipeptido de la invencion") que comprenden dos cadenas de polipeptido (cada una, una “cadena de polipeptido de la invencion"), en los que cada cadena de polipeptido comprende dos o mas dominios variables individuales que se ligan, habitualmente mediante una region bisagra o un ligador adecuado, a uno o mas dominios constantes que, en el constructo final, forman conjuntamente una parte de Fc. Los dominios variables individuales pueden ligarse en un lado del dominio constante o los dominios variables individuales pueden ligarse a ambos lados del dominio constante.
Por tanto, el constructo de cadena de polipeptido proporcionado mediante la invencion comprende generalmente una parte de Fc (tal como se define en el presente documento) en las que cada una de las dos cadenas de polipeptido que forman la parte de Fc se liga, opcionalmente mediante una region bisagra o un ligador adecuado, a dos o mas dominios variables individuales (tambien tal como se definen en el presente documento). Mas espedficamente, en un aspecto, un dominio variable puede ligarse a ambos lados de la parte de Fc. En otro aspecto, dos dominios variables pueden ligarse en un lado de la parte de Fc. En otro aspecto, tres dominios variables pueden ligarse en un lado de la parte de Fc. En otro aspecto, dos dominios variables pueden ligarse a ambos lados de la parte de Fc. En otro aspecto, tres dominios variables pueden ligarse a ambos lados de la parte de Fc. En otro aspecto, dos dominios variables pueden ligarse en un lado de la parte de Fc y un dominio variable puede ligarse en el otro lado de la parte de Fc.
Las cadenas de polipeptido de la invencion, y su uso en la formacion de los constructos de cadena de polipeptido de la invencion, forman aspectos adicionales de la invencion. Ademas, en un aspecto espedfico de la invencion, tal como se describe adicionalmente en el presente documento, estas cadenas de polipeptido de la invencion tambien pueden usarse tal cual (es decir, sin interaccion con otra cadena de polipeptido y/o no como parte de un constructo de la invencion).
Preferiblemente, en los constructos de cadena de polipeptido de la invencion, cada cadena de polipeptido de la invencion comprende tres o cuatro dominios variables individuales, y mas preferiblemente solamente tres dominios variables individuales. Dicho de otro modo, los constructos de cadena de polipeptido de la invencion comprenden preferiblemente seis dominios variables individuales (es decir, tres en cada cadena de polipeptido) u ocho (es decir, cuatro en cada cadena de polipeptido) y mas preferiblemente un total de seis (es decir, tres en cada cadena de polipeptido).
Ademas, cada cadena de polipeptido de la invencion comprendera habitualmente o bien dos dominios constantes (por ejemplo, en caso de una parte de Fc que deriva de IgG, IgA o IgD) o tres dominios constantes (por ejemplo, en caso de una parte de Fc que deriva de IgM o IgE), de tal manera que, en el constructo final, los dominios constantes de las dos cadenas de polipeptido forman una parte de Fc, por ejemplo una parte de Fc que deriva de IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4), IgA, IgD, IgE o IgM, o una variante, u analogo, mutante, una parte o un fragmento de la misma (incluyendo partes de Fc quimericas), que puede tener o no funciones efectoras, tal como se describe adicionalmente en el presente documento.
Por motivos de conveniencia, y como estos constructos de cadena de polipeptido se prefieren generalmente en la practica, la invencion se describira ahora en mas detalle con referencia a constructos de cadena de polipeptido que comprenden cuatro dominios constantes (es decir, dos en cada cadena de polipeptido), en los que los dominios variables se ligan unos a otros mediante un ligador adecuado y se ligan a los dominios constantes mediante una region bisagra o un ligador adecuado. Sin embargo, le quedara claro al experto que las ensenanzas de la presente invencion se aplican a constructos de cadena de polipeptido de la invencion que comprenden seis dominios constantes (por ejemplo, en caso de una parte de Fc que deriva de IgM o IgE), y/o en los que los dominios constantes se ligan directamente unos a otros y/o se ligan directamente a los dominios variables (por ejemplo, cuando la parte de Fc deriva de IgE, puede no requerirse una region bisagra entre la parte de Fc y los dominios variables).
Se muestran esquematicamente constructos de cadena de polipeptido con cuatro dominios variables individuales y cuatro dominios constantes (por ejemplo, que forman una parte de Fc derivada de una IgG o IgA, o un analogo, mutante o una variante de la misma) en las figuras 29 y 30 no limitativas.
En la figura 29, los constructos de cadena de polipeptido comprenden dos cadenas de polipeptido (1) y (2) que comprenden, cada una, dos dominios constantes (3) y (4), un “primer” dominio variable individual (5) y un “segundo” dominio variable individual (6). El primer dominio variable individual (5) se liga, opcionalmente mediante una region bisagra o un ligador adecuado (7) al dominio constante (3). El segundo dominio variable individual (6) se liga, opcionalmente mediante una region bisagra o un ligador adecuado (8) al dominio constante (4). Los dominios constantes (3) y (4) de la cadena de polipeptido (1) y los dominios constantes correspondientes (3) y (4) de la cadena de polipeptido (2) forman conjuntamente la parte de Fc (9).
En la figura 30, los constructos de cadena de polipeptido comprenden dos cadenas de polipeptido (1) y (2) que comprenden, cada una, dos dominios constantes (3) y (4), un “primer” dominio variable individual (5) y un “segundo” dominio variable individual (6). El primer dominio variable individual (5) se liga, opcionalmente mediante un ligador adecuado (7), al segundo dominio variable individual (6), y tambien se liga a los dominios constantes, opcionalmente (y de manera habitual) mediante una region bisagra o un ligador adecuado (8). Los dominios constantes (3) y (4) de la cadena de polipeptido (1) y los dominios constantes correspondientes (3) y (4) de la cadena de polipeptido (2) forman conjuntamente la parte de Fc (9).
Se muestra esquematicamente un ejemplo de un constructo de cadena de polipeptido de la invencion con mas de cuatro dominios variables individuales en las figuras 31, 32 y 33 no limitativas.
La figura 31 muestra un constructo de cadena de polipeptido de la invencion con seis dominios variables individuales y cuatro dominios constantes (por ejemplo, que forman una parte de Fc derivada de una IgG o IgA, o un analogo, mutante o una variante de la misma). El constructo comprende dos cadenas de polipeptido (1) y (2) que comprenden, cada una, dos dominios constantes (3) y (4), un “primer” dominio variable individual (5), un “segundo” dominio variable individual (6) y un “tercer” dominio variable individual (10). El primer dominio variable individual (5) se liga, opcionalmente mediante un ligador adecuado (7), al segundo dominio variable individual (6), y tambien se liga a los dominios constantes, opcionalmente (y de manera habitual) mediante una region bisagra o un ligador adecuado (8). El tercer dominio variable individual (11) se liga, opcionalmente mediante un ligador adecuado (12), al segundo dominio variable individual (6). Los dominios constantes (3) y (4) de la cadena de polipeptido (1) y los dominios constantes correspondientes (3) y (4) de la cadena de polipeptido (2) forman conjuntamente la parte de Fc (9).
La figura 32 muestra un constructo de cadena de polipeptido de la invencion con ocho dominios variables individuales y cuatro dominios constantes (por ejemplo, que forman una parte de Fc derivada de una IgG o IgA, o un analogo, mutante o una variante de la misma). El constructo comprende dos cadenas de polipeptido (1) y (2) que comprenden, cada una, dos dominios constantes (3) y (4), un “primer” dominio variable individual (5), un “segundo” dominio variable individual (6), un “tercer” dominio variable individual (10) y un “cuarto” dominio variable individual (13) . El primer dominio variable individual (5) se liga, opcionalmente mediante un ligador adecuado (7), al segundo dominio variable individual (6), y tambien se liga al dominio constante (3), opcionalmente (y de manera habitual) mediante una region bisagra o un ligador adecuado (8). El tercer dominio variable individual (10) se liga, opcionalmente mediante un ligador adecuado (12), al cuarto dominio variable individual (13), y tambien se liga al dominio constante (4), opcionalmente (y de manera habitual) mediante una region bisagra o un ligador adecuado (14) . Los dominios constantes (3) y (4) de la cadena de polipeptido (1) y los dominios constantes correspondientes (3) y (4) de la cadena de polipeptido (2) forman conjuntamente la parte de Fc (9).
La figura 33 muestra un constructo de cadena de polipeptido de la invencion con seis dominios variables individuales y cuatro dominios constantes (por ejemplo, que forman una parte de Fc derivada de una IgG o IgA, o un analogo, mutante o una variante de la misma). El constructo comprende dos cadenas de polipeptido (1) y (2) que comprenden, cada una, dos dominios constantes (3) y (4), un “primer” dominio variable individual (5), un “segundo” dominio variable individual (6) y un “tercer” dominio variable individual (10). El primer dominio variable individual (5) se liga, opcionalmente mediante un ligador adecuado (7), al segundo dominio variable individual (6), y tambien se liga al dominio constante (3), opcionalmente (y de manera habitual) mediante una region bisagra o un ligador adecuado (8). El tercer dominio variable individual (10) se liga al dominio constante (4), opcionalmente (y de manera habitual) mediante una region bisagra o un ligador adecuado (14). Los dominios constantes (3) y (4) de la cadena de polipeptido (1) y los dominios constantes correspondientes (3) y (4) de la cadena de polipeptido (2) forman conjuntamente la parte de Fc (9).
En constructos de cadena de polipeptido con mas de seis u ocho dominios variables individuales, cada cadena (1) y (2) pueden contener uno o mas dominios variables individuales adicionales (no mostrados), que pueden ligarse al presente dominio variable individual, de nuevo opcionalmente mediante ligadores adecuados.
En este aspecto de la invencion, los primeros dominios variables individuales y los segundos dominios variables individuales (y asf sucesivamente para los dominios variables individuales “tercero”, “cuarto” y adicionales) pueden estar dirigidos contra la misma diana o el mismo antígeno (de tal manera que todos los dominios variables individuales presentes en el constructo son capaces de unirse a la misma diana o el mismo antígeno).
Tal como se describe adicionalmente en el presente documento, cuando dos o mas dominios variables individuales en un constructo de cadena de polipeptido de la invencion son capaces de unirse a la misma diana o el mismo antígeno, se unen al mismo epttopo, determinante antigenico, parte, dominio o subunidad de la diana o el antígeno. Un ejemplo preferido, pero no limitativo de un polipeptido multiespedfico de la divulgacion comprende al menos un Nanobody de la invencion y al menos un Nanobody que proporciona una semivida aumentada. Tales Nanobodies pueden ser, por ejemplo, Nanobodies que estan dirigidos contra una protema serica y, en particular, una protema serica humana, tal como albumina serica humana, protema de union a tiroxina, transferrina (humana), fibrinogeno, una inmunoglobulina tal como IgG, IgE o IgM, o contra una de las protemas sericas enumeradas en el documento WO 04/003019. De estos, los Nanobodies que pueden unirse a albumina serica (y, en particular, albumina serica humana) o a IgG (y, en particular, IgG humana, vease por ejemplo el Nanobody VH-1 descrito en la revision de Muyldermans, citado anteriormente) se prefieren particularmente (aunque por ejemplo, para experimentos en ratones o primates, pueden usarse Nanobodies contra o que producen reaccion cruzada con albumina serica de raton (MSA) o albumina serica de dicho primate, respectivamente. Sin embargo, para uso farmaceutico, se preferiran habitualmente Nanobodies contra albumina serica humana o IgG humana). Los Nanobodies que proporcionan una semivida aumentada y que pueden usarse en los polipeptidos de la invencion incluyen los Nanobodies dirigidos contra albumina serica que se describen en el documento WO 04/041865, en el documento WO 06/122787 y en las solicitudes de patente adicionales de Ablynx N.V., tales como los mencionados anteriormente.
Por ejemplo, algunos Nanobodies preferidos que proporcionan una semivida aumentada incluyen Nanobodies que pueden unirse a residuos de aminoacido en albumina serica (humana) que no participan en la union de albumina serica a FcRn (vease, por ejemplo, el documento WO 06/0122787); Nanobodies que son capaces de unirse a residuos de aminoacido en albumina serica que no forman parte del dominio III de albumina serica (vease, por ejemplo, el documento WO 06/0122787); Nanobodies que tienen o pueden proporcionar una semivida aumentada (vease, por ejemplo, el documento WO 2008/028977); Nanobodies contra albumina serica humana que producen reaccion cruzada con albumina serica de al menos una especie de mamffero y, en particular, con al menos una especie de primate (tal como, sin limitacion, monos del genero Macaca (tales como y, en particular, macacos cangrejeros (Macaca fascicularis) y/o monos rhesus (Macaca mulatta)) y babuinos (Papio ursinus)) (vease, por ejemplo, el documento WO 2008/028977)); Nanobodies que pueden unirse a albumina serica de manera independiente del pH (vease, por ejemplo, el documento WO 08/043821) y/o Nanobodies que son agentes de union condicionales (vease, por ejemplo, el documento WO 08/043822).
Algunos Nanobodies particularmente preferidos que proporcionan una semivida aumentada y que pueden usarse en los polipeptidos de la invencion incluyen los Nanobodies ALB-1 a ALB-10 divulgados en el documento WO 06/122787 (veanse las tablas II y III) de los que se prefiere particularmente ALB-8 (SEQ ID NO: 62 en el documento WO 06/122787).
Segun un aspecto espedfico, pero no limitativo, los polipeptidos de la invencion contienen, ademas del uno o mas Nanobodies, al menos un Nanobody contra albumina serica humana.
Generalmente, cualquier polipeptido de la invencion con semivida aumentada que contiene uno o mas Nanobodies, y cualquier derivado de Nanobodies o de tales polipeptidos que tiene una semivida aumentada, tiene preferiblemente una semivida que es al menos 1,5 veces, preferiblemente al menos 2 veces, tal como al menos 5 veces, por ejemplo al menos 10 veces o mas de 20 veces, mayor que la semivida del Nanobody correspondiente per se. Por ejemplo, tal derivado o polipeptido con semivida aumentada puede tener una semivida que esta aumentada en mas de 1 hora, preferiblemente mas de 2 horas, mas preferiblemente mas de 6 horas, tal como mas de 12 horas, o incluso mas de 24, 48 o 72 horas, en comparacion con el Nanobody correspondiente per se.
En un aspecto preferido, pero no limitativo de la invencion, tales derivados o polipeptidos pueden presentar una semivida serica en humano de al menos aproximadamente 12 horas, preferiblemente al menos 24 horas, mas preferiblemente al menos 48 horas, incluso mas preferiblemente al menos 72 horas o mas. Por ejemplo, tales derivados o polipeptidos pueden tener una semivida de al menos 5 dfas (tal como de aproximadamente 5 a 10 dfas), preferiblemente al menos 9 dfas (tal como de aproximadamente 9 a 14 dfas), mas preferiblemente al menos aproximadamente 10 dfas (tal como de aproximadamente 10 a 15 dfas) o al menos aproximadamente 11 dfas (tal como de aproximadamente 11 a 16dfas), mas preferiblemente al menos aproximadamente 12 dfas (tal como de aproximadamente 12 a 18 dfas o mas) o mas de 14 dfas (tal como de aproximadamente 14 a 19 dfas).
Segun un aspecto de la invencion, los polipeptidos son capaces de unirse a una o mas moleculas que pueden aumentar la semivida del polipeptido in vivo.
Los polipeptidos de la invencion se estabilizan in vivo y aumenta su semivida al unirse a moleculas que resisten la degradacion y/o el aclaramiento o secuestro. Normalmente, tales moleculas son protemas que se producen de manera natural que tienen por sf mismas una larga semivida in vivo.
Otro ejemplo preferido, pero no limitativo de un polipeptido multiespedfico de la invencion comprende al menos un Nanobody y al menos un Nanobody que dirige el polipeptido de la invencion hacia, y/o que permite que el polipeptido de la invencion penetre o entre en organos, tejidos, celulas o partes o compartimentos espedficos de celulas, y/o que permite que el Nanobody penetre o atraviese una barrera biologica tal como una membrana celular, una capa celular tal como una capa de celulas epiteliales, un tumor incluyendo tumores solidos, o la barrera hematoencefalica. Los ejemplos de tales Nanobodies incluyen Nanobodies que estan dirigidos hacia protemas, marcadores o epítopos de superficie celular espedficos de la celula, el tejido u organo deseado (por ejemplo, marcadores de superficie celular asociados con celulas tumorales), y los fragmentos de anticuerpo de direccionamiento cerebral de un solo dominio descritos en los documentos WO 02/057445 y WO 06/040153, de los que son ejemplos preferidos FC44 (SEQ ID NO: 189 del documento WO 06/040153) y FC5 (SEQ ID NO: 190 del documento WO 06/040154).
En los polipeptidos de la invencion, el uno o mas Nanobodies y el uno o mas polipeptidos pueden ligarse directamente unos a otros (tal como se describe, por ejemplo, en el documento WO 99/23221) y/o pueden ligarse unos a otros mediante uno o mas espaciadores o ligadores adecuados, o cualquier combinacion de los mismos. Los espaciadores o ligadores adecuados para su uso en cadenas de polipeptido y polipeptidos multivalentes, multiparatopicos y multiespedficos le quedaran claros al experto, y pueden ser generalmente cualquier ligador o espaciador usado en la tecnica para ligar secuencias de aminoacidos. Preferiblemente, dicho ligador o espaciador es adecuado para su uso en la construccion de protemas o polipeptidos que estan destinados para uso farmaceutico.
Algunos espaciadores particularmente preferidos incluyen los espaciadores y ligadores que se usan en la tecnica para ligar fragmentos de anticuerpo o dominios de anticuerpo. Estos incluyen los ligadores mencionados en los antecedentes generales de la tecnica citados anteriormente, asf como por ejemplo ligadores que se usan en la tecnica para construir fragmentos de ScFv o diabodies (a este respecto, sin embargo, debe indicarse que, mientras que en diabodies y en fragmentos de ScFv, la secuencia ligadora usada debe tener una longitud, un grado de flexibilidad y otras propiedades que permitan que los dominios Vh y Vl pertinentes se acerquen para formar el sitio de union a antígeno completo, no existen ninguna limitacion particular sobre la longitud o flexibilidad del ligador usado en el polipeptido de la invencion, puesto que cada Nanobody forma por sf mismo un sitio de union a antígeno completo).
Por ejemplo, un ligador puede ser una secuencia de aminoacidos adecuada y, en particular, secuencias de aminoacidos de entre 1 y 50 residuos de aminoacido, preferiblemente entre 1 y 30, tal como entre 1 y 10. Algunos ejemplos preferidos de tales secuencias de aminoacidos incluyen ligadores de Gly-Ser, por ejemplo del tipo (GlyxSery)z, tal como (por ejemplo, (Gly4Ser)3 o (Gly3Ser2)3, tal como se describe en el documento WO 99/42077 y los ligadores GS30, GS15, GS9 y GS7 descritos en las solicitudes de Ablynx mencionadas en el presente documento (veanse, por ejemplo, los documentos WO 06/040153 y WO 06/122825), asf como regiones de tipo bisagra, tales como las regiones bisagra de anticuerpos de cadena pesada que se producen de manera natural o secuencias similares (tales como las descritas en el documento WO 94/04678).
Algunos otros ligadores particularmente preferidos son polialanina (tal como AAA), asf como los ligadores GS30 (SEQ ID NO: 85 en el documento WO 06/122825) y GS9 (SEQ ID NO: 84 en el documento WO 06/122825). Otros ligadores preferidos pueden comprender o consistir en una region bisagra, una repeticion (Glyx-Sery) o una combinacion de (Glyx-Sery) con una region bisagra (tal como, por ejemplo, la usada en los constructos de la tabla A-4 y/o representados en la tabla A-5).
Otros ligadores adecuados comprenden generalmente compuestos organicos o polfmeros, en particular aquellos adecuados para su uso en protemas para uso farmaceutico. Por ejemplo, se han usado restos de polietilenglicol para ligar dominios de anticuerpo, vease, por ejemplo, el documento WO 04/081026.
Esta englobado dentro del alcance de la invencion que la longitud, el grado de flexibilidad y/u otras propiedades del/de los ligador(es) usado(s) (aunque no son cnticos, como lo son habitualmente para los ligadores usados en fragmentos de ScFv) pueden tener cierta influencia sobre las propiedades del polipeptido final de la invencion, incluyendo pero sin limitarse a la afinidad, especificidad o avidez por la protema de la envuelta, o por uno o mas de los otros antigenos. Basandose en la divulgacion en el presente documento, el experto sera capaz de determinar el/los ligador(es) optimo(s) para su uso en un polipeptido espedfico de la invencion, opcionalmente despues de algunos experimentos de rutina limitados.
Por ejemplo, en polipeptidos multivalentes de la invencion que comprenden Nanobodies dirigidos contra un antígeno multimerico (tal como un receptor multimerico u otra protema), la longitud y flexibilidad del ligador son preferiblemente tales que permiten que cada Nanobody presente en el polipeptido se una al determinante antigenico en cada una de las subunidades del multfmero. De manera similar, en un polipeptido multiespedfico de la invencion que comprende Nanobodies dirigidos contra dos o mas determinantes antigenicos diferentes en el mismo antígeno (por ejemplo, contra diferentes epttopos de un antígeno y/o contra diferentes subunidades de una protema, un canal o receptor multimerico), la longitud y flexibilidad del ligador son preferiblemente tales que permiten que cada Nanobody se una a su determinante antigenico pretendido. De nuevo, basandose en la divulgacion en el presente documento, el experto sera capaz de determinar el/los ligador(es) optimo(s) para su uso en un polipeptido espedfico de la invencion, opcionalmente despues de algunos experimentos de rutina limitados.
Tambien esta dentro del alcance de la invencion que el/los ligador(es) usado(s) confiera(n) uno o mas de otras propiedades o funcionalidad favorables a los polipeptidos de la invencion, y/o proporcione(n) uno o mas sitios para la formacion de derivados y/o para la fijacion de grupos funcionales (por ejemplo, tal como se describe en el presente documento para los derivados de los Nanobodies). Por ejemplo, ligadores que contienen uno o mas residuos de aminoacido con carga (vease la tabla A-2 en la pagina 48 de la solicitud internacional WO 08/020079) pueden proporcionar propiedades hidrofilas mejoradas, mientras que ligadores que forman o contienen pequenos epítopos o etiquetas pueden usarse con los propositos de deteccion, identificacion y/o purificacion. De nuevo, basandose en la divulgacion en el presente documento, el experto sera capaz de determinar los ligadores optimos para su uso en un polipeptido espedfico de la invencion, opcionalmente despues de algunos experimentos de rutina limitados.
Finalmente, cuando se usan dos o mas ligadores en los polipeptidos de la invencion, estos ligadores pueden ser iguales o diferentes. De nuevo, basandose en la divulgacion en el presente documento, el experto sera capaz de determinar los ligadores optimos para su uso en un polipeptido espedfico de la invencion, opcionalmente despues de algunos experimentos de rutina limitados.
Habitualmente, para facilidad de expresion y produccion, un polipeptido de la invencion sera un polipeptido lineal. Sin embargo, la invencion en su sentido mas amplio no se limita a ello. Por ejemplo, cuando un polipeptido de la invencion comprende tres o mas Nanobodies, es posible ligarlos mediante el uso de un ligador con tres o mas “brazos”, ligandose cada “brazo” a un Nanobody, para proporcionar un constructo “en forma de estrella”. Tambien es posible, aunque habitualmente se prefiere menos, usar constructos circulares.
La invencion tambien comprende derivados de los polipeptidos de la invencion, que pueden ser esencialmente analogos a los derivados de los Nanobodies, es decir tal como se describen en el presente documento.
La invencion tambien comprende protemas o polipeptidos que “consisten esencialmente” en un polipeptido de la invencion (en los que la expresion “consisten esencialmente en” tiene esencialmente igual significado al indicado anteriormente en el presente documento).
Segun un aspecto de la invencion, el polipeptido de la invencion esta en forma esencialmente aislada, tal como se define en el presente documento.
Las secuencias de aminoacidos, los polipeptidos y las acidos nucleicos de la invencion pueden prepararse de una manera conocida per se, como le quedara claro al experto a partir de la descripcion adicional en el presente documento. Por ejemplo, los polipeptidos de la invencion pueden prepararse de cualquier manera conocida per se para la preparacion de anticuerpos y, en particular, para la preparacion de fragmentos de anticuerpo (incluyendo pero sin limitarse a anticuerpos de dominios (o de un solo dominio) y fragmentos de ScFv). Algunos metodos preferidos, pero no limitativos para preparar las secuencias de aminoacidos, los Nanobodies, polipeptidos y acidos nucleicos incluyen las tecnicas y los metodos descritos en el presente documento.
Tal como le quedara claro al experto, un metodo particularmente util para preparar una secuencia de aminoacidos, y/o un polipeptido de la invencion comprende generalmente las etapas de:
i) expresar, en una celula huesped o un organismo huesped adecuados (tambien denominado en el presente documento un “huesped de la invencion”) o en otro sistema de expresion adecuado, un acido nucleico que codifica dicha secuencia de aminoacidos o dicho polipeptido de la invencion (tambien denominado en el presente documento un “acido nucleico de la invencion”), opcionalmente seguido por:
ii) aislar y/o purificar la secuencia de aminoacidos o el polipeptido de la invencion asf obtenido.
En particular, tal metodo puede comprender las etapas de:
i) cultivar y/o mantener un huesped de la invencion en condiciones que son tales que dicho huesped de la invencion expresa y/o produce al menos una secuencia de aminoacidos y/o un polipeptido de la invencion; opcionalmente seguido por:
ii) aislar y/o purificar la secuencia de aminoacidos o el polipeptido de la invencion asf obtenido.
Un acido nucleico de la invencion puede estar en forma de ADN o ARN mono o bicatenario, y esta preferiblemente en forma de ADN bicatenario. Por ejemplo, las secuencias de nucleotidos de la invencion pueden ser ADN genomico, ADNc o ADN sintetico (tal como ADN con un uso de codones que se ha adaptado espedficamente para la expresion en la celula huesped o el organismo huesped pretendido).
Segun un aspecto de la invencion, el acido nucleico de la invencion esta en forma esencialmente aislada, tal como se define en el presente documento.
El acido nucleico de la invencion tambien puede estar en forma de, estar presente en y/o formar parte de un vector, tal como por ejemplo un plasmido, cosmido o YAC, que de nuevo pueden estar en forma esencialmente aislada. Los acidos nucleicos de la invencion pueden prepararse u obtenerse de una manera conocida per se, basandose en la informacion sobre las secuencias de aminoacidos para los polipeptidos de la invencion facilitada en el presente documento, y/o pueden aislarse de una fuente natural adecuada. Para proporcionar analogos, pueden someterse secuencias de nucleotidos que codifican dominios Vhh que se producen de manera natural, por ejemplo, a mutagenesis dirigida al sitio, para proporcionar un acido nucleico de la invencion que codifica dicho analogo. Ademas, tal como le quedara claro al experto, para preparar un acido nucleico de la invencion, tambien pueden ligarse conjuntamente de manera adecuada varias secuencias de nucleotidos, tales como al menos una secuencia de nucleotidos que codifica un Nanobody y, por ejemplo, acidos nucleicos que codifican uno o mas ligadores.
Las tecnicas para generar los acidos nucleicos de la invencion le quedaran claras al experto y pueden incluir por ejemplo, pero no se limitan a, la smtesis automatizada de ADN; mutagenesis dirigida al sitio; la combinacion de dos o mas secuencias que se producen de manera natural y/o sinteticas (o dos o mas partes de las mismas), la introduccion de mutaciones que conducen a la expresion de un producto de expresion truncado; la introduccion de uno o mas sitios de restriccion (por ejemplo, para crear casetes y/o regiones que pueden digerirse y/o ligarse facilmente usando enzimas de restriccion adecuadas), y/o la introduccion de mutaciones por medio de una reaccion PCR usando uno o mas cebadores “de apareamiento erroneo”, usando por ejemplo una secuencia de una forma que se produce de manera natural de una protema de la envuelta de un virus como molde. Estas y otros tecnicas le quedaran claras al experto, y se hace referencia de nuevo a los manuales convencionales, tales como Sambrook et al. y Ausubel et al., mencionados anteriormente, asf como a los ejemplos a continuacion.
El acido nucleico de la invencion tambien puede estar en forma de, estar presente en y/o formar parte de un constructo genetico, tal como le quedara claro al experto en la tecnica y tal como se describe en las paginas 131-134 del documento WO 08/020079 (incorporado al presente documento como referencia). Tales constructos geneticos comprenden generalmente al menos un acido nucleico de la invencion que se liga opcionalmente a uno o mas elementos de constructos geneticos conocidos per se, tales como, por ejemplo, uno o mas elementos reguladores adecuados (tales como un(os) promotor(es), potenciador(es), terminador(es) adecuado(s), etc.) y los elementos adicionales de constructos geneticos a los que se hace referencia en el presente documento. Tales constructos geneticos que comprenden al menos un acido nucleico de la invencion tambien se denominaran en el presente documento “constructos geneticos de la invencion”.
Los constructos geneticos de la invencion pueden ser ADN o ARN, y son preferiblemente ADN bicatenario. Los constructos geneticos de la invencion tambien pueden estar en una forma adecuada para la transformacion de la celula huesped o el organismo huesped pretendido, en una forma adecuada para la integracion en el ADN genomico de la celula huesped pretendida o en una forma adecuada para la replicacion, el mantenimiento y/o la herencia independientes en el organismo huesped pretendido. Por ejemplo, los constructos geneticos de la invencion pueden estar en forma de un vector, tal como, por ejemplo, un plasmido, cosmido, YAC, un vector viral o transposon. En particular, el vector puede ser un vector de expresion, es decir un vector que puede proporcionar la expresion in vitro y/o in vivo (por ejemplo, en una celula huesped, un organismo huesped y/o sistema de expresion adecuado).
En un aspecto preferido pero no limitativo, un constructo genetico de la invencion comprende
i) al menos un acido nucleico de la invencion; conectado operativamente a
ii) uno o mas elementos reguladores, tales como un promotor y opcionalmente un terminador adecuado; y opcionalmente tambien
iii) uno o mas elementos adicionales de constructos geneticos conocidos per se;
en el que los terminos “conectado operativamente” y “ligado operativamente” tienen el significado facilitado en las paginas 131-134 del documento WO 08/020079; y en el que los “elementos reguladores”, “promotor”, “terminador” y “elementos adicionales” son tal como se describen en las paginas 131-134 del documento WO 08/020079; y en el que los constructos geneticos pueden ser ademas tal como se describen en las paginas 131-134 del documento WO 08/020079.
Los acidos nucleicos de la invencion y/o los constructos geneticos de la invencion pueden usarse para transformar una celula huesped o un organismo huesped, es decir para la expresion y/o produccion de la secuencia de aminoacidos o el polipeptido de la invencion. Los huespedes o celulas huesped adecuados le quedaran claros al experto y pueden ser, por ejemplo, cualquier celula o lmea celular fungica, procariota o eucariota adecuada o cualquier organismo fungico, procariota o eucariota adecuado, por ejemplo los descritos en las paginas 134 y 135 del documento WO 08/020079.; asf como todos los demas huespedes o celulas huesped conocidos per se para la expresion y produccion de anticuerpos y fragmentos de anticuerpo (incluyendo pero sin limitarse a anticuerpos de dominios (o de un solo dominio) y fragmentos de ScFv), que le quedaran claros al experto. Tambien se hace referencia a los antecedentes generales de la tecnica citados anteriormente en el presente documento, asf como por ejemplo a los documentos WO 94/29457; WO 96/34103; WO 99/42077; Frenken et al., (1998), citado anteriormente; Riechmann y Muyldermans, (1999), citado anteriormente; van der Linden, (2000), citado anteriormente; Thomassen et al., (2002), citado anteriormente; Joosten et al., (2003), citado anteriormente; Joosten et al., (2005), citado anteriormente; y la bibliograffa adicional citada en el presente documento.
Las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos de la invencion tambien pueden introducirse o expresarse en una o mas celulas, tejidos u organos de un organismo pluricelular, por ejemplo con propositos profilacticos y/o terapeuticos (por ejemplo, como terapia genica), tal como se describe adicionalmente en las paginas 135 y 136 de en el documento WO 08/020079 y en la bibliograffa adicional citada en el documento WO 08/020079.
Para la expresion de los Nanobodies en una celula, tambien pueden expresarse como los denominados “intrabodies”, tal como se describe, por ejemplo, en los documentos Wo 94/02610, WO 95/22618 y US-A-7004940; WO 03/014960; en Cattaneo, A. & Biocca, S. (1997) Intracelular Antibodies: Development and Applications. Landes y Springer-Verlag; y en Kontermann, Methods 34, (2004), 163-170.
Las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos de la invencion tambien pueden producirse, por ejemplo, en la leche de mairnferos transgenicos, por ejemplo en la leche de conejos, vacas, cabras u ovejas (veanse, por ejemplo, los documentos US-A-6.741.957, US-A-6.304.489 y US-A-6.849.992 para tecnicas generales para introducir transgenes en mamfferos), en plantas o partes de plantas incluyendo pero sin limitarse a sus hojas, flores, frutos, semillas, rafces o tuberculos (por ejemplo, en tabaco, mafz, soja o alfalfa) o, por ejemplo, en pupas del gusano de seda Bombix mori.
Ademas, las secuencias de aminoacidos y los polipeptidos de la invencion tambien pueden expresarse y/o producirse en sistemas de expresion libres de celulas, y los ejemplos adecuados de tales sistemas le quedaran claros al experto. Algunos ejemplos preferidos, pero no limitativos incluyen la expresion en el sistema de germen de trigo; en lisados de reticulocitos de conejo; o en el sistema de Zubay de E. coli.
Tal como se menciono anteriormente, una de las ventajas del uso de Nanobodies es que los polipeptidos basados en los mismos pueden prepararse a traves de la expresion en un sistema bacteriano adecuado, y los sistemas de expresion bacterianos, vectores, celulas huesped, elementos reguladores adecuados, etc., le quedaran claros al experto, por ejemplo a partir de la bibliograffa citada anteriormente. Debe observarse sin embargo que la invencion en su sentido mas amplio no esta limitada a la expresion en sistemas bacterianos.
Preferiblemente, en la invencion, se usa un sistema de expresion (in vivo o in vitro), tal como un sistema de expresion bacteriano, que proporciona los polipeptidos de la invencion en una forma que es adecuada para uso farmaceutico, y tales sistemas de expresion le quedaran claros de nuevo al experto. Como tambien le quedara claro al experto, los polipeptidos de la invencion adecuados para uso farmaceutico pueden prepararse usando tecnicas para la smtesis peptfdica.
Para la produccion a escala industrial, los huespedes heterologos preferidos para la produccion (industrial) de Nanobodies o protemas terapeuticas que contienen Nanobody incluyen cepas de E. coli, Pichia pastoris, S. cerevisiae que son adecuadas para la expresion/produccion/fermentacion a gran escala y, en particular, para la expresion/produccion/fermentacion farmaceutica a gran escala (es decir, de calidad BPF). Los ejemplos adecuados de tales cepas le quedaran claros al experto. Tales cepas y sistemas de produccion/expresion tambien se ponen a disposicion por empresas tales como Biovitrum (Uppsala, Suecia).
Alternativamente, pueden usarse lmeas celulares de mairnfero, en particular celulas de ovario de hamster chino (CHO), para la expresion/produccion/fermentacion a gran escala y, en particular, para la expresion/produccion/fermentacion farmaceutica a gran escala. De nuevo, tales sistemas de expresion/produccion tambien se ponen a disposicion por algunas de las empresas mencionadas anteriormente.
La eleccion del sistema de expresion espedfico dependera en parte del requisito de determinadas modificaciones postraduccionales, mas espedficamente glicosilacion. La produccion de una protema recombinante que contiene Nanobody para la que se desea o requiere glicosilacion necesitara el uso de huespedes de expresion de mamffero que tienen la capacidad para glicosilar la protema expresada. A este respecto, le quedara claro al experto que el patron de glicosilacion obtenido (es decir, la clase, el numero y la posicion de residuos fijados) dependera de la celula o lmea celular que se usa para la expresion. Preferiblemente, se usa o bien una celula o bien una lmea celular humana (es decir, que conduce a una protema que tiene esencialmente un patron de glicosilacion humano) o se usa otra lmea celular de mamffero que puede proporcionar un patron de glicosilacion que es esencialmente y/o funcionalmente el igual que la glicosilacion humana o al menos imita la glicosilacion humana. Generalmente, los huespedes procariotas tales como E. coli no tienen la capacidad de glicosilar protemas, y el uso de eucariotas inferiores tales como levaduras conduce habitualmente a un patron de glicosilacion que difiere de la glicosilacion humana. No obstante, debe entenderse que todas las celulas huesped y los sistemas de expresion anteriores pueden usarse en la invencion, dependiendo de la secuencia de aminoacidos, el Nanobody o polipeptido deseado que ha de obtenerse.
Por tanto, segun un aspecto no limitativo de la invencion, la secuencia de aminoacidos, el Nanobody o polipeptido esta glicosilado. Segun otro aspecto no limitativo de la invencion, la secuencia de aminoacidos, el Nanobody o polipeptido no esta glicosilado.
Segun un aspecto preferido, pero no limitativo de la invencion, la secuencia de aminoacidos, el Nanobody o polipeptido se produce en una celula bacteriana, en particular una celula bacteriana adecuada para la produccion farmaceutica a gran escala, tal como celulas de las cepas mencionadas anteriormente.
Segun otro aspecto preferido, pero no limitativo de la invencion, la secuencia de aminoacidos, el Nanobody o polipeptido se produce en una celula de levadura, en particular una celula de levadura adecuada para la produccion farmaceutica a gran escala, tal como celulas de las especies mencionadas anteriormente.
Segun aun otro aspecto preferido, pero no limitativo de la invencion, la secuencia de aminoacidos, el Nanobody o polipeptido se produce en una celula de marnffero, en particular en una celula humana o en una celula de una lmea celular humana y, mas en particular, en una celula humana o en una celula de una lmea celular humana que es adecuada para la produccion farmaceutica a gran escala, tal como las lmeas celulares mencionadas anteriormente en el presente documento.
Tal como se describe adicionalmente en las paginas 138 y 139 del documento WO 08/020079, cuando se usa la expresion en una celula huesped para producir las secuencias de aminoacidos, los Nanobodies y los polipeptidos de la invencion, las secuencias de aminoacidos, los Nanobodies y polipeptidos o bien pueden producirse de manera intracelular (por ejemplo, en el citosol, en el periplasma o en cuerpos de inclusion) y luego aislarse de las celulas huesped y opcionalmente purificarse adicionalmente; o bien pueden producirse de manera extracelular (por ejemplo, en el medio en el que se cultivan las celulas huesped) y luego aislarse del medio de cultivo y opcionalmente purificarse adicionalmente. Por tanto, segun un aspecto no limitativo de la invencion, la secuencia de aminoacidos, el Nanobody o polipeptido es una secuencia de aminoacidos, un Nanobody o polipeptido que se ha producido de manera intracelular y que se ha aislado de la celula huesped y, en particular, de una celula bacteriana o de un cuerpo de inclusion en una celula bacteriana. Segun otro aspecto no limitativo de la invencion, la secuencia de aminoacidos, el Nanobody o polipeptido es una secuencia de aminoacidos, un Nanobody o polipeptido que se ha producido de manera extracelular, y que se ha aislado del medio en el que se cultiva la celula huesped.
Algunos promotores preferidos, pero no limitativos para su uso con estas celulas huesped incluyen los mencionados en las paginas 139 y 140 del documento WO 08/020079.
Algunas secuencias secretoras preferidas, pero no limitativas para su uso con estas celulas huesped incluyen las mencionadas en la pagina 140 del documento WO 08/020079.
Las tecnicas adecuadas para transformar un huesped o una celula huesped de la invencion le quedaran claras al experto y pueden depender de la celula huesped/organismo huesped pretendido y el constructo genetico que vaya a usarse. Se hace referencia de nuevo a las solicitudes de patente y los manuales mencionados anteriormente.
Despues de la transformacion, puede realizarse una etapa para detectar y seleccionar aquellas celulas huesped o aquellos organismos huesped que se han transformado satisfactoriamente con la secuencia de nucleotidos/constructo genetico de la invencion. Esto puede ser, por ejemplo, una etapa de seleccion etapa basada en un marcador seleccionable presente en el constructo genetico de la invencion o una etapa que implica la deteccion de la secuencia de aminoacidos de la invencion, por ejemplo usando anticuerpos espedficos.
La celula huesped transformada (que puede estar en forma de una lmea celular estable) o los organismos huesped (que pueden estar en forma de una cepa o lmea mutante estable) forman aspectos adicionales de la presente invencion.
Preferiblemente, estas celulas huesped u organismos huesped son tales que expresan, o son (al menos) capaces de expresar (por ejemplo, en condiciones adecuadas), una secuencia de aminoacidos, un Nanobody o polipeptido de la invencion (y en caso de un organismo huesped: en al menos una celula, parte, un tejido u organo del mismo). La invencion tambien incluye ademas generaciones, progenie y/o descendencia de la celula huesped o el organismo huesped de la invencion, que pueden obtenerse, por ejemplo, mediante division celular o mediante reproduccion sexual o asexual.
Para producir/obtener la expresion de las secuencias de aminoacidos de la invencion, la celula huesped transformada o el organismo huesped transformado generalmente puede guardarse, mantenerse y/o cultivarse en condiciones tales que se exprese/produzca la secuencia de aminoacidos, el Nanobody o polipeptido (deseado). Las condiciones adecuadas le quedaran claras al experto y dependeran habitualmente de la celula huesped/organismo huesped usado, asf como de los elementos reguladores que controlan la expresion de la secuencia de nucleotidos (relevante) de la invencion. De nuevo, se hace referencia a las solicitudes de patente y los manuales mencionados anteriormente en los parrafos sobre los constructos geneticos de la invencion.
Generalmente, las condiciones adecuadas pueden incluir el uso de un medio adecuado, la presencia de una fuente adecuada de alimentos y/o nutrientes adecuados, el uso de una temperatura adecuada, y opcionalmente la presencia de un compuesto o factor de induccion adecuado (por ejemplo, cuando las secuencias de nucleotidos de la invencion estan bajo el control de un promotor inducible); todas las cuales puede seleccionarlas el experto. De nuevo, en tales condiciones, las secuencias de aminoacidos de la invencion pueden expresarse de manera constitutiva, de manera transitoria, o solamente cuando se induce de manera adecuada.
Tambien le quedara claro al experto que la secuencia de aminoacidos o el polipeptido de la invencion puede generarse (en primer lugar) en una forma inmadura (tal como se menciono anteriormente), que puede someterse luego a modificacion postraduccional, dependiendo de la celula huesped/organismo huesped usado. Ademas, la secuencia de aminoacidos o el polipeptido puede glicosilarse, de nuevo dependiendo de la celula huesped/organismo huesped usado.
La secuencia de aminoacidos o el polipeptido de la invencion puede aislarse entonces de la celula huesped/organismo huesped y/o del medio en que se cultivo dicha celula huesped u organismo huesped, usando tecnicas de aislamiento y/o purificacion de protemas conocidas per se, tales como tecnicas de electroforesis y/o cromatograffa (preparativa), tecnicas de precipitacion diferencial, tecnicas de afinidad (por ejemplo, usando una secuencia de aminoacidos escindible, espedfica, fusionada con la secuencia de aminoacidos o el polipeptido de la invencion) y/o tecnicas inmunologicas preparativas (es decir, usando anticuerpos contra la secuencia de aminoacidos que va a aislarse).
Generalmente, para uso farmaceutico, los polipeptidos de la invencion pueden formularse como una preparacion o composiciones farmaceuticas que comprenden al menos un polipeptido de la invencion y al menos un portador, diluyente o excipiente y/o adyuvante farmaceuticamente aceptable, y opcionalmente uno o mas polipeptidos y/o compuestos farmaceuticamente activos adicionales. Por medio de ejemplos no limitativos, tal formulacion puede estar en una forma adecuada para administracion oral, para administracion parenteral (tal como mediante inyeccion intravenosa, intramuscular o subcutanea o infusion intravenosa), para administracion topica, para administracion mediante inhalacion, mediante un parche cutaneo, mediante un implante, mediante un supositorio, etc. Tales formas de administracion adecuadas, que pueden ser solidas, semisolidas o lfquidas, dependiendo del modo de administracion, asf como los metodos y portadores para su uso en la preparacion de las mismas, le quedaran claros al experto, y se describen adicionalmente en el presente documento.
Por tanto, en un aspecto adicional, la invencion se refiere a una composicion farmaceutica que contiene al menos un aminoacido de la invencion, al menos un Nanobody, al menos un compuesto o constructo de la invencion o al menos un polipeptido de la invencion y al menos un portador, diluyente o excipiente adecuado (es decir, adecuado para uso farmaceutico), y opcionalmente uno o mas principios activos adicionales.
Generalmente, las secuencias de aminoacidos, los compuestos, constructos y polipeptidos de la invencion pueden formularse y administrarse de cualquier manera adecuada conocida per se, para lo que por ejemplo, se hace referencia a los antecedentes generales de la tecnica citados anteriormente (y, en particular, a los documentos WO 04/041862, WO 04/041863, WO 04/041865, WO 04/041867 y WO 08/020079) asf como a los manuales convencionales, tales como Remington's Pharmaceutical Sciences, 18.a ed., Mack Publishing Company, EE. UU. (1990), Remington, the Science and Practice of Pharmacy, 21a edicion, Lippincott Williams y Wilkins (2005); o el manual de Therapeutic Antibodies (S. Dubel, Ed.), Wiley, Weinheim, 2007 (veanse, por ejemplo, las paginas 252­ 255).
Por ejemplo, las secuencias de aminoacidos, los compuestos, constructos y polipeptidos de la invencion pueden formularse y administrarse de cualquier manera conocida per se para anticuerpos y fragmentos de anticuerpo convencionales (incluyendo ScFv y diabodies) y otras protemas farmaceuticamente activas. Tales formulaciones y metodos para preparar los mismos le quedaran claros al experto y, por ejemplo, incluyen preparaciones adecuadas para administracion parenteral (por ejemplo, administracion intravenosa, intraperitoneal, subcutanea, intramuscular, intraluminal, intraarterial o intratecal) o para administracion topica (es decir, transdermica o intradermica).
Las preparaciones para administracion parenteral pueden ser, por ejemplo, disoluciones, suspensiones, dispersiones o emulsiones esteriles que son adecuadas para infusion o inyeccion. Los portadores o diluyentes adecuados para tales preparaciones por ejemplo incluyen, sin limitacion, los mencionados en la pagina 143 del documento WO 08/020079. Habitualmente, se preferiran disoluciones o suspensiones acuosas.
Las secuencias de aminoacidos, los compuestos, constructos y polipeptidos de la invencion tambien pueden administrarse usando metodos de terapia genica de insercion. Vease, por ejemplo, patente estadounidense n.° 5.399.346, que se incorpora como referencia en su totalidad. Usando un metodo de terapia genica de insercion, celulas primarias transfectadas con el gen que codifica una secuencia de aminoacidos, un Nanobody o polipeptido de la invencion pueden transfectarse adicionalmente con promotores espedficos de tejido para seleccionar como diana organos, celulas, tejidos, injertos o tumores espedficos y pueden transfectarse adicionalmente con secuencias senal y de estabilizacion para la expresion localizada de manera subcelular.
Por tanto, las secuencias de aminoacidos, los compuestos, constructos y polipeptidos de la invencion pueden administrarse por via sistemica, por ejemplo, por via oral, en combinacion con un vedculo farmaceuticamente aceptable tal como un diluyente inerte o un portador comestible asimilable. Pueden encerrarse en capsulas de gelatina de cubierta dura o blanda, pueden someterse a compresion para dar comprimidos o pueden incorporarse directamente con los alimentos de la dieta del paciente. Para administracion terapeutica oral, las secuencias de aminoacidos, los compuestos, constructos y polipeptidos de la invencion pueden combinarse con uno o mas excipientes y usarse en forma de comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, trociscos, capsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas, y similares. Tales composiciones y preparaciones deben contener al menos el 0,1 % de la secuencia de aminoacidos, los compuestos, constructos o polipeptidos de la invencion. Por supuesto, puede variarse su porcentaje en las composiciones y preparaciones y puede ser convenientemente de entre aproximadamente el 2 y aproximadamente el 60 % del peso de una forma de dosificacion unitaria dada. La cantidad de la secuencia de aminoacidos, los compuestos, constructos o polipeptidos de la invencion en tales composiciones terapeuticamente utiles es tal que se obtendra un nivel de dosificacion eficaz.
Los comprimidos, trociscos, las pastillas, capsulas, y similares tambien pueden contener aglutinantes, excipientes, agentes disgregantes, lubricantes y agentes edulcorantes o aromatizantes, por ejemplo los mencionados en las paginas 143-144 del documento WO 08/020079. Cuando la forma de dosificacion unitaria es una capsula, puede contener, ademas de materiales del tipo anterior, un portador lfquido, tal como un aceite vegetal o un polietilenglicol. Pueden estar presentes otros diversos materiales como recubrimientos o para modificar de otro modo la forma ffsica de la forma de dosificacion unitaria solida. Por ejemplo, pueden recubrirse comprimidos, pastillas o capsulas con gelatina, cera, goma laca o azucar y similares. Un jarabe o elixir puede contener las secuencias de aminoacidos, los compuestos, constructos y polipeptidos de la invencion, sacarosa o fructosa como agente edulcorante, metil y propilparabenos como conservantes, un colorante y aromatizante tal como aroma a cereza o a naranja. Por supuesto, cualquier material usado en la preparacion de cualquier forma de dosificacion unitaria debe ser farmaceuticamente aceptable y sustancialmente no toxico en las cantidades empleadas. Ademas, las secuencias de aminoacidos, los Nanobodies, compuestos, constructos y polipeptidos de la invencion pueden incorporarse en preparaciones y dispositivos de liberacion sostenida.
Las preparaciones y formulaciones para administracion oral tambien pueden dotarse de un recubrimiento enterico que permitira que los constructos de la invencion resistan el entorno gastrico y pasen al intestino. Mas generalmente, las preparaciones y formulaciones para administracion oral pueden formularse de manera adecuada para la administracion en cualquier parte deseada del tracto gastrointestinal. Ademas, pueden usarse supositorios adecuados para la administracion en el tracto gastrointestinal.
Las secuencias de aminoacidos, los compuestos, constructos y polipeptidos de la invencion tambien pueden administrarse por via intravenosa o por via intraperitoneal mediante infusion o inyeccion, tal como se describe adicionalmente en las paginas 144 y 145 del documento WO 08/020079.
Para administracion topica, las secuencias de aminoacidos, los compuestos, constructos y polipeptidos de la invencion pueden aplicarse en forma pura, es decir, cuando son lfquidos. Sin embargo, se deseara generalmente que se administren a la piel como composiciones o formulaciones, en combinacion con un portador dermatologicamente aceptable, que puede ser un solido o un lfquido, tal como se describe adicionalmente en la pagina 145 del documento WO 08/020079.
Generalmente, la concentracion de las secuencias de aminoacidos, los compuestos, constructos y polipeptidos de la invencion en una composicion lfquida, tal como una locion, sera de desde aproximadamente el 0,1-25% en peso, preferiblemente desde aproximadamente el 0,5-10% en peso. La concentracion en una composicion semisolida o solida tal como un gel o un polvo sera de aproximadamente el 0,1-5% en peso, preferiblemente de aproximadamente el 0,5-2,5 % en peso.
En un aspecto preferido, las secuencias de aminoacidos, los compuestos, constructos y/o polipeptidos de la invencion y/o composiciones que comprenden los mismos se administran al tejido pulmonar. En el contexto de la presente invencion, “tejido pulmonar” es equivalente, con los propositos de esta invencion, a tejido de pulmon o pulmon. El pulmon comprende 2 zonas diferenciadas: una zona de conduccion y otra de respiracion, dentro las que se encuentran las vfas respiratorias y los compartimentos vasculares (vease por ejemplo “Pulmonary Drug Delivery”, editado por Karoline Bechtold-Peters y Henrik Luessen, 2007, ISBN 978-3-87193-322-6 paginas 16-28).
Para la administracion pulmonar, las secuencias de aminoacidos, los compuestos, constructos y polipeptidos de la invencion pueden aplicarse en forma pura, es decir, cuando son lfquidos o un polvo seco. Sin embargo, se preferira que se administren al tejido pulmonar como una composicion o formulacion que comprende una secuencia de aminoacidos, un compuesto, constructo y/o polipeptido de la invencion y un portador adecuado para administracion pulmonar. Por consiguiente, la presente invencion tambien se refiere a una composicion farmaceutica que comprende la secuencia de aminoacidos, los compuestos, constructos y/o polipeptidos de la invencion y un portador adecuado para administracion pulmonar. Se conocen portadores adecuados para administracion pulmonar en la tecnica.
Las secuencias de aminoacidos, los compuestos, constructos y/o polipeptidos de la invencion tambien pueden administrarse como micro o nanopartfculas de farmacos puros con tamanos y distribuciones de partfcula favorables para administracion pulmonar.
Por consiguiente, la presente invencion tambien se refiere a un dispositivo farmaceutico adecuado para la administracion pulmonar de las secuencias de aminoacidos, los compuestos, constructos y/o polipeptidos de la invencion y adecuado en el uso de una composicion que comprende los mismos. Este dispositivo puede ser un inhalador para lfquidos (por ejemplo, una suspension de gotas o partfculas solidas finas) que comprende la secuencia de aminoacidos, los compuestos, constructos y/o polipeptidos de la invencion. Preferiblemente este dispositivo es un aerosol que comprende la secuencia de aminoacidos, el Nanobody, los compuestos, constructos y/o polipeptidos de la invencion. El dispositivo tambien puede ser un inhalador de polvo seco que comprende la secuencia de aminoacidos, los compuestos, constructos y/o polipeptidos de la invencion en forma de un polvo seco. En un metodo preferido, la administracion al tejido pulmonar se realiza mediante inhalacion de las secuencias de aminoacidos, los compuestos, constructos y/o polipeptidos de la invencion y/o la composicion que comprende los mismos en una neblina de aerosol. Segun la invencion, la inhalacion de la neblina de aerosol puede realizarse mediante un dispositivo inhalador. El dispositivo debe generar a partir de una formulacion que comprende las secuencias de aminoacidos, los compuestos, constructos y/o polipeptidos de la invencion y/o una composicion que comprende los mismos, una neblina de aerosol del tamano (distribucion) de partfcula deseado en el momento apropiado del ciclo de inhalacion del mairnfero, que contenga la dosis adecuada de las secuencias de aminoacidos, los compuestos, constructos y/o polipeptidos de la invencion (“Pulmonary drug delivery”, Bechtold-Peters y Luessen, eds., ISBN 978-3-87193-322-6, pagina 125).
En el contexto de la presente invencion, “aerosol’ indica una suspension de partfculas solidas finas o gotas de lfquido (o combinacion de las mismas) en un gas en el que, con los propositos de esta invencion, las partfculas y/o gotas comprenden las secuencias de aminoacidos, los compuestos, constructos y/o polipeptidos de la invencion. El dispositivo debe generar a partir de la formulacion, una neblina de aerosol del tamano (distribucion) de partfcula deseado en el momento apropiado del ciclo de inhalacion del mai^ero, que contenga la dosis adecuada de secuencias de aminoacidos, compuestos, constructos y/o polipeptidos de la invencion. Deben considerarse los siguientes 4 requisitos (formulacion, tamano de partfcula, tiempo y dosis) (“Pulmonary Drug Delivery ”, Bechtold-Peters y Luessen, eds., citado anteriormente, paginas 125 y 126):
- las formulaciones que se usan en los dispositivos pueden variar de las disoluciones o suspensiones acuosas 5 usadas en nebulizadores a las disoluciones o suspensiones basadas en propelente usadas en un inhalador de dosis medida o incluso mezclas de polvo modificadas por ingeniena especialmente para los inhaladores de polvo seco. Todas estas formulaciones diferentes requieren principios diferentes para la generacion de aerosoles, lo que hace hincapie en la dependencia mutua de dispositivo y formulacion;
10 - puesto que el sitio de deposicion de partfculas de aerosol depende de su velocidad y tamano (aerodinamico), el tamano de partfcula deseado de la neblina de aerosol vana dependiendo del sitio de deposicion deseado en el pulmon, que esta relacionado con el objetivo terapeutico de la administracion;
- como puede ajustarse la neblina de aerosol para liberarse en diferentes momentos durante el ciclo de inhalacion 15 generado por el mairnfero, se prefiere que para los agentes de la invencion (para que se depositen en las partes perifericas del pulmon) el aerosol se libere al comienzo del ciclo de inhalacion;
- las dosis pueden variar considerablemente y ,por ejemplo, pueden variar para un humano por ejemplo de unos pocos microgramos a varios cientos de microgramos o incluso miligramos, por ejemplo aproximadamente hasta 20 aproximadamente 10 miligramos.
Se describen diversos sistemas de inhalacion, por ejemplo, en las paginas 129 a 148 en la revision (“Pulmonary Drug Delivery ”, Bechtold-Peters y Luessen, eds., citado anteriormente) e incluyen, pero no se limitan a, nebulizadores, inhaladores de dosis medida, inhaladores de lfquido de dosis medida e inhaladores de polvo seco.
25 Tambien pueden usarse dispositivos que tienen en cuenta un patron de respiracion optimizado e individualizado para maniobras de inhalacion controlada (vease la tecnologfa AKITA® en la pagina 157 de “Pulmonary Drug Delivery ”,Bechtold-Peters y Luessen, eds., citado anteriormente).
Sin embargo, no solamente el dispositivo es importante para la administracion pulmonar de las secuencias de 30 aminoacidos, los compuestos, constructos y/o polipeptidos de la invencion sino que tambien es cntica laformulacion correcta para lograr una administracion eficaz. Esto puede lograrse en principio usando uno de los siguientes enfoques:
- administracion de disoluciones o suspensiones acuosas que comprenden las secuencias de aminoacidos, los 35 compuestos, constructos y/o polipeptidos de la invencion (por ejemplo, gotas nasales) en las fosas nasales;
- nebulizacion de disoluciones o suspensiones acuosas que comprenden las secuencias de aminoacidos, los compuestos, constructos y/o polipeptidos de la invencion;
40 -atomizacion por medio de propelentes licuados; y
-dispersion de polvos secos.
Asf, las formulaciones de las secuencias de aminoacidos, los compuestos, constructos y/o polipeptidos de la 45 invencion tienen que adoptarse y ajustarse al dispositivo de inhalacion elegido. Se describen formulaciones apropiadas, es decir los excipientes ademas de las secuencias de aminoacidos, los compuestos, constructos y/o polipeptidos de la invencion, por ejemplo, en el capftulo IV de “Pulmonary Drug Delivery ”, Bechtold-Peters y Luessen, eds., citado anteriormente.
50 La cantidad de las secuencias de aminoacidos, los compuestos, constructos y polipeptidos de la invencion requerida para su uso en tratamiento variara no solamente con la secuencia de aminoacidos, los compuestos, constructos o polipeptidos particulares seleccionados sino tambien con lavia de administracion, la naturaleza del estado que este tratandose y la edad y el estado del paciente y sera en ultima instancia segun el criterio del medico o facultativo asistente. Tambien vana la dosificacion de las secuencias de aminoacidos, los compuestos, constructos y 55 polipeptidos de la invencion dependiendo de la celula huesped, eltumor, tejido, injerto u organo diana.
La dosis deseada puede presentarse convenientemente en una unica dosis o como dosis divididas administradas en intervalos apropiados, por ejemplo, como dos, tres, cuatro o mas subdosis al dfa. La propia subdosis puede dividirse adicionalmente, por ejemplo, en varias administraciones diferenciadas espaciadas de manera holgada; tales como 60 multiples inhalaciones de un insuflador o mediante aplicacion de una pluralidad de gotas en el ojo.
Un regimen de administracion podna incluir tratamiento diario, a largo plazo. Por “a largo plazo ” quiere decirse al menos dos semanas y preferiblemente, varias semanas, meses o anos de duracion. Un experto habitual en la tecnica puede determinar las modificaciones necesarias en este intervalo de dosificacion usando solamente 65 experimentacion de rutina dadas las ensenanzas en el presente documento. Vease Remington's Pharmaceutical Sciences (Martin, E.W., ed. 4), Mack Publishing Co., Easton, PA. La dosificacion tambien puede ajustarla cada triparatopico, biparatopico) de la invencion, un compuesto o constructo multivalente (por ejemplo, trivalente, triparatopico, biparatopico) de la invencion y/o una composicion farmaceutica que comprende el mismo para su uso en un metodo para la prevencion y/o el tratamiento de infeccion por VRS.
Mas en particular, la presente invencion puede referirse a un compuesto o constructo o polipeptido trivalente de la invencion para su uso en un metodo para la prevencion y/o el tratamiento de infeccion por VRS. Mas en particular, la presente invencion puede referirse a un Nanobody trivalente elegido de las SEQ ID NO: 2415 y 2989 a 2991 y 2996 a 2998 para su uso en un metodo para la prevencion y/o el tratamiento de infeccion por VRS.
Mas en particular, la presente invencion puede referirse a un polipeptido de la invencion, y/o una composicion farmaceutica que comprende el mismo para su uso en un metodo para la prevencion y/o el tratamiento de infeccion por VRS, comprendiendo dicho metodo administrar al tejido pulmonar de un sujeto que lo necesita, una cantidad farmaceuticamente activa del polipeptido de la invencion, y/o de una composicion farmaceutica que comprende el mismo.
En los metodos anteriores, las secuencias de aminoacidos, los compuestos o constructos y/o polipeptidos de la invencion y/o las composiciones que comprenden los mismos pueden administrarse de cualquier manera adecuada, dependiendo de la composicion o formulacion farmaceutica espedfica que vaya a usarse. Por tanto, las secuencias de aminoacidos, y/o los polipeptidos de la invencion y/o las composiciones que comprenden los mismos pueden administrarse, por ejemplo, por via oral, por via intraperitoneal (por ejemplo, por via intravenosa, por via subcutanea, por via intramuscular, o mediante cualquier otra via de administracion que sortee el tracto gastrointestinal), por via intranasal, por via transdermica, de manera topica, por medio de un supositorio, mediante inhalacion, de nuevo dependiendo de la composicion o formulacion farmaceutica espedfica que vaya a usarse. El facultativo sera capaz de seleccionar una via de administracion adecuada y una composicion o formulacion farmaceutica adecuada que ha de usarse en tal administracion, dependiendo de la enfermedad o el trastorno que vaya a prevenirse o tratarse y otros factores que conoce bien el facultativo.
Por tanto, en general, las secuencias de aminoacidos, los compuestos o constructos y polipeptidos segun la invencion que estan dirigidos contra una protema de la envuelta de un virus y/o las composiciones que comprenden los mismos pueden administrarse de cualquier manera adecuada; por ejemplo pero sin limitarse a ello, las secuencias de aminoacidos, los compuestos o constructos y polipeptidos segun la invencion y las composiciones que comprenden los mismos que estan dirigidos contra una protema de la envuelta de un virus (virus VRS) pueden administrarse por via intranasal y/o mediante inhalacion y/o mediante cualquier otra forma adecuada de administracion pulmonar; los metodos para administracion pulmonar y/o administracion intranasal y/o administracion mediante inhalacion de una secuencia de aminoacidos, un compuesto o constructo y/o polipeptido de la invencion los conocera el experto y se describen, por ejemplo, en el manual “Drug Delivery: Principles and Applications” (2005) por Binghe Wang, Teruna Siahaan y Richard Soltero (Eds. Wiley Interscience (John Wiley & Sons)); en la solicitud internacional WO 08/049897 de Ablynx N.V. titulada “Intranasal delivery of polypeptides and proteins"; en “Pharmacology PreTest™ Self-Assessment and Review” (11.a edicion) de Rosenfeld G.C., Loose-Mitchell D.S.; y en “Pharmacology” (3.a edicion) de Lippincott Williams & Wilkins, Nueva York; Shlafer M. McGraw-Hill Medical Publishing Division, Nueva York; Yang K.Y., Graff L.R., Caughey A.B. Blueprints Pharmacology, Blackwell Publishing.
Por consiguiente, la presente invencion tambien se refiere a un compuesto o constructo y/o polipeptido de la invencion, dirigido contra la protema F del virus VRS y/o una composicion que comprende el mismo para su uso en un metodo para administrar una cantidad eficaz del compuesto o constructo y/o polipeptido de la invencion, dirigido contra el virus VRS y/o una composicion que comprende el mismo, en el que dicho metodo comprende la etapa de administrar el compuesto o constructo y/o polipeptido y/o la composicion que comprende el mismo al tejido pulmonar. En tal metodo, la secuencia de aminoacidos, el compuesto o constructo y/o polipeptido y/o una composicion que comprende el mismo puede administrarse mediante cualquier metodo conocido en la tecnica para administracion pulmonar tal como por ejemplo mediante el uso de un inhalador o dispositivo de administracion intranasal o aerosol.
En un aspecto de la invencion, la secuencia de aminoacidos, el compuesto o constructo y/o polipeptido se unira y/o neutralizara un virus presente en el tejido pulmonar. Preferiblemente en tal metodo para administracion pulmonar al menos el 5 %, preferiblemente al menos el 10 %, el 20 %, el 30 %, el 40 %, mas preferiblemente al menos el 50 %, el 60 %, el 70 %, y incluso mas preferiblemente al menos el 80 % o mas de la secuencia de aminoacidos, el compuesto o constructo y/o polipeptido de la invencion es estable en el tejido pulmonar durante al menos 24 horas, preferiblemente al menos 48 horas, mas preferiblemente al menos 72 horas.
Se ha hallado sorprendentemente que las secuencias de aminoacidos, los compuestos o constructos y/o polipeptidos de la invencion tienen una estabilidad de larga duracion en el tejido pulmonar. Por ejemplo, se ha hallado que un Nanobody dirigido contra VRS sigue siendo funcional en el pulmon durante al menos 48 horas (vease la parte experimental). Por tanto, se cree que son posibles realizaciones de la invencion con intervalos de tratamiento tales como una vez al dfa, una vez cada 2, 3, 4, 5, 6 dfas o una vez a la semana teniendo en cuenta la estabilidad de larga duracion estimada de las secuencias de aminoacidos, los compuestos o constructos y/o polipeptidos de la invencion.
Por consiguiente, la invencion se refiere a un compuesto o constructo y/o polipeptido de la invencion para su uso en un metodo para administrar un compuesto o constructo y/o polipeptido de la invencion al tejido pulmonar de un 5 sujeto sin inactivarse, comprendiendo dicho metodo la etapa de administrar por via pulmonar dicho compuesto o constructo y/o polipeptido de la invencion a dicho sujeto.
En otro aspecto de la invencion, la secuencia de aminoacidos, el compuesto o constructo y/o polipeptido es capaz de proporcionar una actividad biologica o terapeutica sistemica. En este aspecto, la secuencia de aminoacidos, el 10 compuesto o constructo y/o polipeptido entraran en el torrente sangumeo y se uniran y/o neutralizaran el virus presente en la sangre, tras administracion pulmonar de la secuencia de aminoacidos, el compuesto o constructo y/o polipeptido y/o una composicion que comprende el mismo. Preferiblemente en tal metodo de administracion pulmonar, la biodisponibilidad para la secuencia de aminoacidos, el compuesto o constructo y/o polipeptido de la invencion es de al menos el 1 %, preferiblemente al menos el 2 %, el 5 %, el 10 %, el 20 %, el 30 %, el 40 %, mas 15 preferiblemente al menos el 50 %, el 60 %, el 70 %, e incluso mas preferiblemente al menos el 80 % o mas en comparacion con la administracion parenteral de dicho polipeptido o protema.
Por consiguiente, la solicitud describe un metodo para administrar una secuencia de aminoacidos, un compuesto o constructo y/o polipeptido descrito en el presente documento al torrente sangumeo de un sujeto sin inactivarse, 20 comprendiendo dicho metodo laetapa de administrar por via pulmonar dicha secuencia de aminoacidos, compuesto o constructo y/o polipeptido de la invencion a dicho sujeto.
La invencion tambien se refiere a un polipeptido de la invencion, un compuesto o constructo de la invencion y/o una composicion farmaceutica que comprende el mismo para su uso en un metodo para la prevencion y/o eltratamiento 25 de al menos una infeccion viral, comprendiendo dicho metodo administrar al tejido pulmonar de un sujeto que lo necesita, una cantidad farmaceuticamente activa del polipeptido de la invencion, del compuesto o constructo de la invencion y/o de la composicion farmaceutica que comprende el mismo.
Mas en particular, la invencion se refiere a un polipeptido de la invencion, un compuesto o constructo de la invencion 30 y/o una composicion farmaceutica que comprende el mismo para su uso en un metodo para la prevencion y/o el tratamiento de al menos una enfermedad o un trastorno elegido del grupo que consiste en las enfermedades y los trastornos enumerados en el presente documento, comprendiendo dicho metodo administrar, al tejido pulmonar de un sujeto que lo necesita, una cantidad farmaceuticamente activa del polipeptido de la invencion, del compuesto o constructo de la invencion y/o de la composicion farmaceutica que comprende el mismo.
35
Mas en particular, la presente invencion puede referirse a un polipeptido de la invencion, un compuesto o constructo de la invencion y/o una composicion farmaceutica que comprende el mismo para su uso en un metodo para la prevencion y/o eltratamiento de infeccion por VRS, comprendiendo dicho metodo administrar, altejido pulmonar de un sujeto que lo necesita, una cantidad farmaceuticamente activa del polipeptido de la invencion, del compuesto o 40 constructo de la invencion y/o de la composicion farmaceutica que comprende el mismo.
Mas en particular, la presente invencion puede referirse a un polipeptido multivalente (por ejemplo, trivalente, triparatopico, biparatopico) de la invencion, un compuesto o constructo multivalente (por ejemplo, trivalente, triparatopico, biparatopico) de la invencion y/o una composicion farmaceutica que comprende el mismo para su uso 45 en un metodo para la prevencion y/o eltratamiento de infeccion por VRS, comprendiendo dicho metodo administrar, al tejido pulmonar de un sujeto que lo necesita, una cantidad farmaceuticamente activa del polipeptido multivalente (por ejemplo, trivalente, triparatopico, biparatopico) de la invencion, del compuesto o constructo multivalente (por ejemplo, trivalente, triparatopico, biparatopico) de la invencion y/o de una composicion farmaceutica que comprende el mismo. Mas en particular, la presente invencion puede referirse a un compuesto o constructo o polipeptido 50 trivalente de la invencion para su uso en un metodo para la prevencion y/o el tratamiento de infeccion por VRS, comprendiendo dicho metodo administrar, al tejido pulmonar de un sujeto que lo necesita, una cantidad farmaceuticamente activa del compuesto o constructo o polipeptido trivalente de la invencion. Mas en particular, la presente invencion puede referirse a un Nanobody NC41 trivalente (tal como por ejemplo una de las S EQ ID NO: 2415 y 2989 a 2991, 2996 a 2998) para su uso en un metodo para la prevencion y/o eltratamiento de infeccion por 55 VRS, comprendiendo dicho metodo administrar, al tejido pulmonar de un sujeto que lo necesita, una cantidad farmaceuticamente activa de un Nanobody NC41 trivalente (tal como por ejemplo una de las S EQ ID NO: 2415 y 2989 a 2991, 2996 a 2998).
Las secuencias de aminoacidos, los compuestos o constructos y/o polipeptidos de la invencion y/o las 60 composiciones que comprenden los mismos se administran segun un regimen de tratamiento que es adecuado para prevenir y/o tratar la enfermedad o el trastorno que vaya a prevenirse o tratarse. El facultativo sera capaz generalmente de determinar un regimen de tratamiento adecuado, dependiendo de factores tales como la enfermedad o eltrastorno que vaya a prevenirse o tratarse, la intensidad de la enfermedad que vaya a tratarse y/o la intensidad de los smtomas de la misma, la secuencia de aminoacidos, el compuesto o constructo o polipeptido 65 espedfico de la invencion que vaya a usarse, la via de administracion y composicion o formulacion farmaceutica espedficas que vayan a usarse, la edad, el sexo, peso, la dieta, el estado general del paciente, y factores similares que conoce bien elfacultativo.
Generalmente, el regimen de tratamiento comprendera la administracion de una o mas secuencias de aminoacidos, compuestos o constructos y/o polipeptidos de la invencion, o de una o mas composiciones que comprenden los 5 mismos, en una o mas dosis o cantidades farmaceuticamente eficaces. El facultativo puede determinar la(s) dosis o cantidad(es) espedfica(s) que han de administrarse, de nuevo basandose en los factores citados anteriormente.
Generalmente, para la prevencion y/o el tratamiento de las enfermedades y los trastornos mencionados en el presente documento y dependiendo de la enfermedad o eltrastorno espedfico que vaya a tratarse, la potencia de la 10 secuencia de aminoacidos, el compuesto o constructo y polipeptido espedfico de la invencion que va a usarse, la via de administracion espedfica y la composicion o formulacion farmaceutica espedfica usados, las secuencias de aminoacidos, los compuestos o constructos y polipeptidos de la invencion se administraran generalmente en una cantidad de entre 1 gramo y 0,01 microgramos por kg de peso corporal al dfa, preferiblemente entre 0,1 gramos y 0,1 microgramos por kg de peso corporal al dfa, tal como aproximadamente 1, 10, 100 o 1000 microgramos por kg 15 de peso corporal al dfa, o bien de manera continua (por ejemplo, mediante infusion), como una unica dosis diaria o bien como multiples dosis divididas durante el dfa. El facultativo sera capaz generalmente de determinar una dosis diaria adecuada, dependiendo de los factores mencionados en el presente documento. Tambien quedara claro que en casos espedficos, el facultativo puede elegir diferir de esas cantidades, por ejemplo basandose en los factores citados anteriormente y su criterio experto. Generalmente, puede obtenerse cierta orientacion sobre las cantidades 20 que han de administrarse a partir de las cantidades administradas habitualmente para anticuerpos o fragmentos de anticuerpo convencionales comparables contra la misma diana administrados esencialmente por la misma via, teniendo en cuenta sin embargo diferencias en afinidad/avidez, eficacia, biodistribucion, semivida y factores similares que conoce bien el experto.
25 Cuando la secuencia de aminoacidos, el compuesto o constructo y/o polipeptido y/o una composicion que comprende el mismo se administra altejido pulmonar el regimen de tratamiento puede ser una o dos veces al dfa, preferiblemente una vez al dfa, o una vez cada 2, 3, 4, 5, 6 o 7 dfas.
Habitualmente, en el metodo anterior, se usara una unica secuencia de aminoacidos, un compuesto o constructo, o 30 polipeptido de la invencion. Sin embargo, esta dentro del alcance de la invencion usar dos o mas secuencias de aminoacidos, compuestos o constructos y/o polipeptidos de la invencion en combinacion.
Las secuencias de aminoacidos, los compuestos o constructos y polipeptidos de la invencion tambien pueden usarse en combinacion con uno o mas compuestos o principios farmaceuticamente activos adicionales, es decir 35 como regimen de tratamiento combinado, que puede conducir o no a un efecto sinergico. De nuevo, el facultativo sera capaz de seleccionar tales compuestos o principios adicionales, asf como un regimen de tratamiento combinado adecuado, basandose en los factores citados anteriormente y su criterio experto.
En particular, las secuencias de aminoacidos, los compuestos o constructos, y polipeptidos de la invencion pueden 40 usarse en combinacion con otros compuestos o principios farmaceuticamente activos que se usan o pueden usarse para la prevencion y/o eltratamiento de las enfermedades y los trastornos citados en el presente documento, como resultado de los cuales puede obtenerse o no un efecto sinergico. Los ejemplos de tales compuestos y principios, asf como vfas, metodos y composiciones o formulaciones farmaceuticas para administrar los mismos le quedaran claros al facultativo.
45
Cuando van a usarse dos o mas sustancias o principios como parte de un regimen de tratamiento combinado, pueden administrarse por la misma via de administracion o por vfas de administracion diferentes, esencialmente en el mismo momento o en momentos diferentes (por ejemplo, esencialmente de manera simultanea, de manera consecutiva, o segun un regimen alternativo). Cuando van a administrarse las sustancias o los principios 50 simultaneamente por la misma via de administracion, pueden administrarse como composiciones o formulaciones farmaceuticas diferentes o como parte de una composicion o formulacion farmaceutica combinada, tal como le quedara claro al experto.
Ademas, cuando van a usarse dos o mas sustancias o principios activos como parte de un regimen de tratamiento 55 combinado, cada una de las sustancias o los principios pueden administrarse en la misma cantidad y segun el mismo regimen tal como se usa cuando el compuesto o principio se usa por sf solo, y tal uso combinado puede conducir o no a un efecto sinergico. Sin embargo, cuando el uso combinado de las dos o mas sustancias o principios activos conduce a un efecto sinergico, tambien puede ser posible reducir la cantidad de una, mas o todas las sustancias o los principios que van a administrarse, mientras que se logra todavfa la accion terapeutica deseada.
60 Esto puede ser, por ejemplo, util para evitar, limitar o reducir cualquier efecto secundario no deseado que se asocie con el uso de una o mas de las sustancias o los principios cuando se usan en sus cantidades habituales, mientras que se obtiene todavfa el efecto farmaceutico o terapeutico deseado.
La eficacia del regimen de tratamiento usado segun la invencion puede determinarse y/o realizarse un seguimiento 65 de la misma de cualquier manera conocida p e r s e para la enfermedad o eltrastorno implicado, tal como le quedara claro al facultativo. El facultativo tambien sera capaz, cuando sea apropiado y considerando cada caso por que no han recibido Nanobody (Synagis ® ahFcHRP).
Figura 2: Ensayo de union con una serie de dilucion de Nanobodies anti-protema F de VRSh purificados.
5 Figura 3: Competencia de Nanobodies purificados de la invencion con Synagis® por la union a la protema F de VRSh. Serie de dilucion de Nanobodies de union a Ftm-de VRSh 1,4 nM compiten con Synagis® 0,67 nM, tal como se describe en el ejemplo 6. Se determino la especificidad de union basandose en valores de D O en comparacion con controles que no han recibido Nanobody (Synagis®). Las barras indican la desviacion estandar de duplicados.
10 Figura 4: Protema Ftm-de VRSh con el sitio II(sitio de union Synagis®; residuos 255-280) y el sitio IV-VI (sitio de union 101F; residuos 422-438).
Figura 5: Competencia de Nanobodies de la invencion con 9C5 por la union a la protema F de VRSh. 20 ul de fracciones periplasmicas de union a Ftm-de VRSh compiten con 9C5 100 ng/ml, tal como se describe en el ejemplo 15 9. Se determino la especificidad de union basandose en valores de D O en comparacion con controles que no han recibido Nanobody (9C5 Rampo).
Figura 6: Competencia de Nanobodies de la invencion con Fab de 101F por la union a la protema F de VRSh. Nanobodies de union a Ftm-de VRSh compiten con Fab de 101F 3 nM, tal como se describe en el ejemplo 9. Se 20 detecto 101 Fab usando un anticuerpo anti-HA-HRP. Se determino la especificidad de union basandose en valores de D O en comparacion con controles que no han recibido Nanobody.
Figura 7: Dendrograma de Nanobodies de union a VRSh aislados. Pudieron distinguirse nueve familias de Nanobodies de union a VRSh:
25 La familia 1 comprende los siguientes Nanobodies: 192-C10, 206-11H, 206-12F
La familia 2 comprende los siguientes Nanobodies: 192-A8, 206-10F, 206-11D, 206-7E, 207-9G
La familia 3 comprende los siguientes Nanobodies: 192-C4, 206-6A, 206-5A, 206-3A, 206-3D, 206-4G, 192-F2, 206-
4D, 192-C6, 192-H2, 206-5E, 206-2A, 207-5D, 206-3E, 206-2G, 206-2H, 206-3C, 191-D3, 206-2F, 207-6B, 206-3F,
207-1D
30 La familia 4 comprende los siguientes Nanobodies: 191-B9, 207-9A, 207-9B, 207-9H, 206-10C, 206-10D, 192-D3,
206- 10B, 207-9D, 207-11D, 207-11E, 206-10E, 191-E4, 207-1C, 207-1F, 207-5C, 207-1E, 207-4D, 206-2E, 206-7H,
207- 11F, 207-9F, 207-11H, 192-B1, 206-3B, 207-11B, 207-4H, 192-H1, 206-6D, 206-7B, 207-11A, 207-1A, 207-5B,
207-4A, 207-4B, 207-6A, 207-6D, 207-1B, 207-5A, 207-6C, 207-5E, 207-6E, 207-6F, 207-11G
La familia 5 comprende los siguientes Nanobodies: 207-9C
35 La familia 6 comprende los siguientes Nanobodies: 206-7G
La familia 7 comprende los siguientes Nanobodies: 207-9E
La familia 8 comprende los siguientes Nanobodies: 206-2C
La familia 9 comprende los siguientes Nanobodies: 206-7C
40 Figura 8: Dendrograma de secuencias de CDR3 de Nanobodies de union a VRSh aislados.
Figura 9: Microneutralizacion de Long LM-2 de VRS por Nanobodies monovalentes y los Fab de control (se facilitan los v a l o r e s d e C I 50 e n |iM ) tal c o m o s e d e s c r i b e e n el e j e m p l o 11.
45 Figura 10: ELISA de competencia: Fab de Synagis® compite con Nanobodies de union a VRS purificados por la union a protema Ftm-tal como se describe en el ejemplo 18.
Figura 11: Union de Nanobodies monovalentes, bivalentes y trivalentes a protema Ftm-tal como se describe en el ejemplo 20.
50
Figuras 12A y B: Potencia de constructos monovalentes, bivalentes y trivalentes para neutralizar las cepas de VRS Long y B-1 tal como se describe en el ejemplo 21.
Figura 13: Neutralizacion de Long de VR S por Nanobodies 191D3 bivalentes con diferentes longitudes de ligadortal 55 como se describe en el ejemplo 21.
Figura 14: Neutralizacion de Long de VRS por Nanobodies biparatopicos de 191D3 (el sitio antigenico II)y 191E4 (el sitio antigenico IV-VI) tal como se describe en el ejemplo 22: efecto de la orientacion y las longitudes de ligador.
60 Figura 15: Neutralizacion de virus i n v i v o por el Nanobody RSV101. El Nanobody bivalente 191-D3 (RSV101), el Nanobody bivalente 12D2biv, palivisumab y PBS solamente se inocularon por via intranasal en ratones y 4 horas mas tarde se expusieron a la cepa A2 de VR S tal como se describe en el ejemplo 25. Se facilitan el virus infeccioso (ufp/pulmon) presente en los homogeneizados de pulmon 3 (figura 24A) y 5 (figura 24B) dfas despues de la exposicion viral y la media (figura 24C) de virus infeccioso (ufp/pulmon) para los 5 ratones.
65
Figura 16: Presencia del Nanobody RSV101 3 (figura 25A) y 5 (figura 25B) dfas tras la inoculacion intranasal en ratones.Se preincubaronhomogeneizadosdepulmonderatonestratadosconPBS conhomogeneizadodepulmon de ratones tratados con RSV101, ratonestratados con 12D2bivy ratonestratados con palivisumab talcomo se describeenelejemplo26.
Figura 17:Representacion graficade concentracion plasmaticaobservada individual-tiempode NB2 deVRS, ALX-0081 y RANKL008a despues de una unica dosis en bolo i.v.de NB2 de VRS (4mg/kg), ALX-0081 (5mg/kg) y RANKL008a (5mg/kg),respectivamentearatasWistarmacho.
Figura 18: Representacion graficade concentracion plasmatica observada individual(i.v.)y media (i.t.)-tiempode NB2 deVRS (4mg/kgporviai.v.;3,6mg/kgporviai.t.yajustea4mg/kg).
Figura 19: Representacion graficade concentracion plasmatica observada individual(i.v.)y media (i.t.)-tiempode ALX-0081 (5mg/kgporviai.v.;3,1mg/kg porviai.t.yajustea5mg/kg).
Figura20: Representacion graficade concentracion plasmatica observada individual(i.v.)y media (i.t.)-tiempode RANKL008a (5mg/kgporviai.v.;3,2mg/kgporviai.t.yajustea5mg/kg).
Figura 21: Perfiles de concentracion de LLBA observada media (+D.E.)-tiempo de NB2 de VRS, ALX-0081 y RANKL008a despues de una unicaadministracionintratraquealde NB2 deVRS (3,6mg/kg),ALX-0081 (3,1mg/kg) yRANKL008a (3,2mg/kg)aratasmacho.
Figura22:LosNanobodiesadministradosporviapulmonarsonestablesenelpulmondurantealmenos24htrasla administracion.
Figura23: Biodisponibilidaden plasma de Nanobodies administrados porviapulmonarfrentea administrados por viai.v.
Figura24:EjemplosnolimitativosdeconstructosdeNanobody.
Figura 25: Inmunotransferencia de tipo Western de homogeneizados de pulmon de ratones despues de la administracionintranasaldelNanobody bivalenteRSV101 talcomo sedescribeen elejemplo 32. M: Marcador; 1: controlpos.(100ngdeNB2biv);2-6:ratonesinoculadosconelNanobodyNB2biv.
Figura26:EnsayodeneutralizaciondeLongdeVRS ylosmutantesdeescapeR7C2/1; R7C2/11 yR7.936/4porlos Nanobodies monovalentes 7B2 (A), 15H8, (B) NC41 (C) en un intervalo de concentracion de desde aproximadamente 2|iMhasta6nM ylosNanobodiestrivalentesRSV400 (D),RSV404 (E),RSV407 (F)yRSV403 (G)en un intervalodeconcentraciondeaproximadamente20nM a 100pM.Solamente se realizoelajustede una curvaparalosdatosdeNanobodiesmonovalentes.
Figura27:DemostraciondelapresenciadeNanobodiesneutralizantesdevirusfuncionalesenloshomogeneizados de pulmon de ratonestalcomo se describe en elejemplo 26. A: 8|ilde homogeneizado de pulmon; B: 2|ilde homogeneizado de pulmon; C:0,5|ilde homogeneizado de pulmon; D:0,125|ilde homogeneizado de pulmon; E: 0,03125|il de homogeneizado de pulmon; F: 0,0078|il de homogeneizado de pulmon; G: 0,00019|il de homogeneizado de pulmon; H: 0|ilde homogeneizado de pulmon (dilucion en PBS). LGB1 es elconstructo de NanobodyRSV101. LGB2 eselconstructodeNanobodydecontrol12B2biv.
Figura 28: Inmunotransferencias de tipoWestern de homogeneizados de pulmon de ratones inoculados con el NanobodyRSV101 (A-C)o12B2biv(D-E).LasinmunotransferenciasdetipoWesternsebarrieronconunsistemade obtencion de imagenes de infrarrojoOdyssey (LicorBiosciences)yse realizaron losanalisis(determinaciones de concentraciones) con elsoftware Odyssey v3.0. Patrones: 50ng, 20ng, 10ng y 5ng del mismo Nanobody en tampondehomogeneizacion; D3:tresdfasdespuesdelainfeccion;D5:cincodfasdespuesdelainfeccion;m1-m5: raton1-5.
Figura29: Constructo de polipeptidocon cuatro dominiosvariables individualesy cuatro dominios constantes. El constructode cadena de polipeptido comprende dos cadenas de polipeptido(1)y(2)que comprenden, cada una, dos dominios constantes (3)y (4), un “primer” dominio variable individual(5)y un “segundo”dominio variable individual(6). El primerdominiovariable individual(5)se liga,opcionalmente mediante una region bisagra o un ligadoradecuado (7)aldominio constante (3). Elsegundo dominio variable individual(6)se liga, opcionalmente medianteuna regionbisagraoun ligadoradecuado (8)aldominioconstante(4).Losdominiosconstantes(3)y(4) delacadenadepolipeptido(1)ylosdominiosconstantescorrespondientes(3)y(4)delacadenadepolipeptido(2) formanconjuntamentelapartedeFc(9).
Figura 30: Constructo de polipeptidocon cuatro dominiosvariables individualesy cuatro dominios constantes. El constructode cadena de polipeptido comprende dos cadenas de polipeptido(1)y(2)que comprenden, cada una, dos dominios constantes (3)y (4), un “primer” dominio variable individual(5)y un “segundo”dominio variable individual (6). El primer dominio variable individual (5) se liga, opcionalmente mediante un ligador adecuado (7), al segundo dominio variable individual (6), y tambien se liga a los dominios constantes, opcionalmente (y de manera habitual) mediante una region bisagra o un ligador adecuado (8). Los dominios constantes (3) y (4) de la cadena de polipeptido (1) y los dominios constantes correspondientes (3) y (4) de la cadena de polipeptido (2) forman conjuntamente la parte de Fc (9).
Figura 31: Constructo de polipeptido con seis dominios variables individuales y cuatro dominios constantes. El constructo de cadena de polipeptido comprende dos cadenas de polipeptido (1) y (2) que comprenden, cada una, dos dominios constantes (3) y (4), un “primer” dominio variable individual (5), un “segundo” dominio variable individual (6) y un “tercer” dominio variable individual (10). El primer dominio variable individual (5) se liga, opcionalmente mediante un ligador adecuado (7), al segundo dominio variable individual (6), y tambien se liga a los dominios constantes, opcionalmente (y de manera habitual) mediante una region bisagra o un ligador adecuado (8). El tercer dominio variable individual (11) se liga, opcionalmente mediante un ligador adecuado (12), al segundo dominio variable individual (6). Los dominios constantes (3) y (4) de la cadena de polipeptido (1) y los dominios constantes correspondientes (3) y (4) de la cadena de polipeptido (2) forman conjuntamente la parte de Fc (9).
Figura 32: Constructo de cadena de polipeptido con ocho dominios variables individuales y cuatro dominios constantes. El constructo de cadena de polipeptido comprende dos cadenas de polipeptido (1) y (2) que comprenden, cada una, dos dominios constantes (3) y (4), un “primer” dominio variable individual (5), un “segundo” dominio variable individual (6), un “tercer” dominio variable individual (10) y un “cuarto” dominio variable individual (13) . El primer dominio variable individual (5) se liga, opcionalmente mediante un ligador adecuado (7), al segundo dominio variable individual (6), y tambien se liga al dominio constante (3), opcionalmente (y de manera habitual) mediante una region bisagra o un ligador adecuado (8). El tercer dominio variable individual (10) se liga, opcionalmente mediante un ligador adecuado (12), al cuarto dominio variable individual (13), y tambien se liga al dominio constante (4), opcionalmente (y de manera habitual) mediante una region bisagra o un ligador adecuado (14) . Los dominios constantes (3) y (4) de la cadena de polipeptido (1) y los dominios constantes correspondientes (3) y (4) de la cadena de polipeptido (2) forman conjuntamente la parte de Fc (9).
Figura 33: Constructo de cadena de polipeptido con seis dominios variables individuales y cuatro dominios constantes. El constructo de cadena de polipeptido comprende dos cadenas de polipeptido (1) y (2) que comprenden, cada una, dos dominios constantes (3) y (4), un “primer” dominio variable individual (5), un “segundo” dominio variable individual (6) y un “tercer” dominio variable individual (10). El primer dominio variable individual (5) se liga, opcionalmente mediante un ligador adecuado (7), al segundo dominio variable individual (6), y tambien se liga al dominio constante (3), opcionalmente (y de manera habitual) mediante una region bisagra o un ligador adecuado (8). El tercer dominio variable individual (10) se liga al dominio constante (4), opcionalmente (y de manera habitual) mediante una region bisagra o un ligador adecuado (14). Los dominios constantes (3) y (4) de la cadena de polipeptido (1) y los dominios constantes correspondientes (3) y (4) de la cadena de polipeptido (2) forman conjuntamente la parte de Fc (9).
Figura 34: Neutralizacion de cepas Long de VRS y B-1 de VRS por el Nanobody NC41 trivalente con diferentes longitudes de ligador tal como se describe en el ejemplo 34.
Figura 35: Vision general esquematica de los residuos humanizados introducidos en variantes de NC41 seleccionadas. Los puntos indican la presencia del residuo de tipo natural; las letras corresponden al residuo humanizado. La numeracion es segun Kabat.
Figura 36: Neutralizacion de la cepa Long y la cepa B-1 de VRSh por variantes de NC41 humanizadas monovalentes y trivalentes.
Ejemplos
Ejemplo 1: Inmunizaciones
Se inmunizaron dos llamas (156 y 157) segun protocolos convencionales con 6 dosis de refuerzo de Ftm- de VRSh (forma que carece de anclaje a la membrana de la protema de fusion, 70 kDa; Corrall T. et al. 2007, BMC Biotechnol. 7: 17). Se extrajo sangre de estos animales 7 dfas despues de la dosis de refuerzo 6 y 10 dfas despues de dosis de refuerzo 6.
Ejemplo 2: Construccion de bibliotecas
Se prepararon celulas mononucleares de sangre periferica a partir de muestras de sangre usando Ficoll-Hipaque segun las instrucciones del fabricante. A continuacion, se extrajo el ARN total de estas celulas asf como de celulas en arco de ganglio linfatico y se uso como material de partida para RT-PCR para amplificar Nanobody que codifica fragmentos genicos. Se clonaron estos fragmentos en vector de fagemido derivado de pUC119 que contema el promotor LacZ, una secuencia codificante de protema pill de colifago, un gen de resistencia para ampicilina o carbenicilina, un sitio de clonacion multiple y la secuencia lfder gen3. En marco con la secuencia codificante del Nanobody, el vector codifica una cola de (His)6 y una etiqueta c-myc C-terminal. Se preparo el fago segun metodos convencionales y se almaceno a 4 °C para uso adicional, produciendo las bibliotecas de fagos 156, 157.
Ejemplo 3: Selecciones contra VRSh
VRSh es un miembro de la familia Paramyxoviridae y es un virus con envuelta con dos glicoprotemas de superficie principales que constituyen las espigas de la partmula viral. Una de estas glicoprotemas (protema G) es la protema de fijacion que media en la union del virus a la superficie celular. La otra glicoprotema (protema F o fusion) media en la fusion de las membranas viral y celular, permitiendo la entrada de la nucleocapside viral en el citoplasma celular. La inhibicion de las etapas mediadas por glicoprotemas o bien G o bien F bloquea las fases iniciales del ciclo infeccioso y neutraliza la infectividad viral. Por tanto, los anticuerpos dirigidos contra o bien G o bien F, y que inhiben sus actividades respectivas, neutralizan la infectividad viral y pueden proteger frente a una infeccion por VRSh. La protema F esta altamente conservada y forma espigas trimericas que experimentan cambios conformacionales tras su activacion.
El virus respiratorio sincitial humano (VRSh) es la principal causa de infecciones graves de las vfas respiratorias bajas (bronquiolitis y neumoma) en lactantes y ninos muy pequenos y provoca epidemias anuales durante los meses invernales. El virus tambien provoca una carga de enfermedad sustancial entre los ancianos y los adultos con estados inmunosupresores y/o trastornos cardiopulmonares subyacentes tambien corren el riesgo de presentar una enfermedad grave por VRSh. La respuesta inmunitaria no previene las reinfecciones.
No existe una vacuna disponible para prevenir infecciones por VRSh. El unico producto terminado disponible en el mercado es un anticuerpo monoclonal humanizado (Synagis®) dirigido contra una de las glicoprotemas virales (protema F) que se usa de manera profilactica en ninos que corren un riesgo muy alto de padecer una infeccion grave por VRSh. El uso restringido de Synagis® se debe, al menos en parte, al alto coste de este producto.
Para identificar Nanobodies que reconocen F t m - (forma que carece de anclaje a la membrana de la protema de fusion, 70 kDa, Corrall T. et al. 2007, BMC Biotechnol. 7: 17), se usaron las bibliotecas 156 y 157. Se uso el mismo antígeno para las selecciones asf como para las inmunizaciones. Se inmovilizo la protema F t m - (25 ng/pocillo) sobre placas para ELISA Nunc Maxisorp. Se incluyo un control con F t m - 0 |ig/ml. Se eluyeron los fagos unidos de F t m -usando tripsina y Synagis® (palivizumab, Medlmmune, anticuerpo monoclonal humanizado, descrito en Zhao & Sullender 2005, J. Virol. 79: 3962) en la primera y la segunda tandas de selecciones. Se uso Remicade (infliximab, anticuerpo anti-TNF; Centorcor) como control para Synagis®. Se uso un exceso molar de 100 veces de Synagis® para identificar Nanobodies que se unen espedficamente en el sitio de union en VRS. Se usaron los resultados de las selecciones de primera tanda, eluidos con Synagis® para las selecciones de la segunda tanda.
Se analizaron los resultados de ambas tandas de selecciones para determinar el factor de enriquecimiento (fago presente en el eluato con relacion a los controles). Basandose en estos parametros, se eligieron las mejores selecciones para analisis adicional. Se escogieron colonias individuales y se hicieron crecer en placas de 96 pocillos profundos (volumen de 1 ml) y se indujeron anadiendo IPTG para la expresion del Nanobody. Se prepararon extractos periplasmicos (volumen: ~ 80 |il) segun metodos convencionales.
Ejemplo 4: Examen para determinar la union
Para determinar la especificidad de union a las protemas de la envuelta viral, se sometieron a prueba los clones en una configuracion de ensayo de union ELISA.
ELISA de union a fago mostro agentes de union tanto para la biblioteca 156 (61 %) como para la 157 (59 %) despues de la primera tanda de selecciones y eluciones con Synagis®.
ELISA de union a fago mostro agentes de union tanto para la biblioteca 156 (85 %) como para la 157 (50 %) despues de la primera tanda de selecciones y eluciones con tripsina.
ELISA de union a fraccion periplasmica mostro agentes de union tanto para la biblioteca 156 (83 %) como para la 157 (78 %) despues de la segunda tanda de selecciones y eluciones con tripsina.
ELISA de union a fraccion periplasmica mostro agentes de union tanto para la biblioteca 156 (87 %) como para la 157 (68 %) despues de la segunda tanda de selecciones y eluciones con Synagis®.
Ejemplo 5: Examen para determinar competencia
Se configuraron ensayos de competencia con los Nanobodies que competfan con anticuerpos monoclonales neutralizantes, Synagis® por VRSh. Se ejecuto un ELISA con diseno de tablero de ajedrez para determinar la mejor concentracion de recubrimiento de antígeno y la concentracion de anticuerpo que proporcionaba la CI50.
Brevemente, se inmovilizo el antígeno sobre placas de microtitulacion Maxisorp (Nunc) y se bloquearon los sitios de union libres usando Marvel al 4 % en PBS. A continuacion, se preincubo 100 ng/ml de Synagis® (dilucion 1/106) con 20 |il de extracto periplasmico que contema Nanobody de los diferentes clones. Se incluyeron fracciones periplasmicas de control seleccionadas contra otras protemas de la cubierta viral. Se permitio que se uniese el anticuerpo en competencia al antígeno inmovilizado con o sin Nanobody. Despues de incubacion y una etapa de lavado, se revelo la union al anticuerpo usando un anticuerpo de cabra anti-Fc humano conjugado con HRP (ahFcHRP; Synagis®). Se determino la especificidad de union basandose en valores de DO en comparacion con controles que no han recibido Nanobody. Todas las dianas teman fracciones periplasmicas que competfan con los anticuerpos neutralizantes. A partir de estos clones, basandose en su secuencia, volvieron a clonarse los clones en un vector de expresion derivado de pUC119 que contema el promotor LacZ, un gen de resistencia para ampicilina o carbenicilina, un sitio de clonacion multiple y la secuencia ftder gen3. En marco con la secuencia codificante del Nanobody, el vector codifica una cola de (His)6 y una etiqueta c-myc C-terminal. Se produjeron Nanobodies y se purificaron mediante la cola de His en perlas Talon. Se mostro que los Nanobodies purificados se uman a su antigeno respectivo tal como se muestra en la figura 2.
Ejemplo 6: Determinacion de la eficiencia de competencia mediante titulacion de Nanobody purificado
Para determinar la eficiencia de competencia de Nanobodies que se unen a Ft m - de VRSh, se sometieron a prueba los clones positivos del ensayo de union en una configuracion de ensayo de competencia ELISA.
Brevemente, se inmovilizo Ft m - 2 |ig/ml o HA 2,5 |ig/ml sobre placas de microtitulacion Maxisorp (Nunc) y se bloquearon los sitios de union libres usando Marvel al 4 % en PBS. A continuacion, se permitio que se uniese una serie de dilucion de Nanobodies purificados al antígeno durante 30 minutos antes de incubarse Synagis® 100 ng/ml (0,67 nM). Se usaron Nanobodies irrelevantes contra otras protemas de la cubierta viral como controles negativos (202 contra H5N1 para la competencia por VRSh, 191). Se muestran los resultados en la figura 3. Se hallo que los Nanobodies competfan por VRSh con anticuerpos monoclonales.
Ejemplo 7: Experimentos basados en celulas y con animales
Para investigar si Nanobodies seleccionados reconocen diferentes epítopos, pudo realizarse un mapeo de epítopos usando anticuerpos monoclonales que reconocen epítopos conocidos. Ejemplos de anticuerpos contra VRSh que pueden usarse son:
- Synagis® (palivizumab, Medlmmune, anticuerpo monoclonal humanizado, tal como se describe en Zhao & Sullender 2005, J. Virol. 79: 3962), dirigido a un epítopo en el sitio antigenico A de la protema F, no compite con 9C5.
- 9C5 (HyTest Ltd) (descrito en Krivitskaia et al. 1999, Vopr. Virusol 44: 279), anticuerpo monoclonal de raton neutralizante, obstaculiza la penetracion del virus en la celula, reconoce el epítopo F1a de la protema F de VRS, no compite con Synagis®.
- 101F (documento WO 06/050280), anticuerpo monoclonal de raton humanizado, dirigido a un epítopo de la protema F de VRS que comprende los aminoacidos 423-436 como peptido mmimo, no compite con Synagis® y 9C5. Se usan ensayos de neutralizacion in vitro de Nanobodies seleccionados contra virus para investigar la capacidad neutralizante de los Nanobodies.
Ejemplo 8: Nanobodies bi y trivalentes
Se han observado una funcion y avidez aumentada para Nanobodies que son bi o trivalentes con o bien homo o bien heteromeros de Nanobodies seleccionados. Esta es una opcion para seleccionar como diana espigas trimericas virales, o bien diferentes epítopos o bien los mismos epítopos en la espiga. Estan disponibles protocolos para la construccion de un Nanobody trivalente conectado mediante ligadores de Gly-Ser de cualquier longitud y composicion deseadas. Se basa en las reacciones PCR independientes (1 para la subunidad de Vh h N-terminal, 1 para la central (si es trivalente) y 1 para la C-terminal) usando diferentes conjuntos de cebadores. Tambien pueden introducirse diferentes longitudes de ligador mediante los cebadores.
Ejemplo 9: Examen para determinar Nanobodies de union a diferentes epítopos de las protemas de espigas trimericas
Para VRSh, estan disponibles diferentes anticuerpos monoclonales que reconocen diferentes epítopos de la protema Ft m -. Para examinar y determinar Nanobodies que reconocen tres epítopos diferentes, se usaron los siguientes anticuerpos o fragmentos Fab: anticuerpo monoclonal de raton 9C5 (3ReS21, Hytest), Fab de 101F (documento WO 2006/050280) y Synagis® (Medinmune). Todos ellos se unen a diferentes epítopos en la protema Ft m - y se usaron para determinar la competencia con Nanobodies seleccionados. Se cree que 9C5 se une a un epítopo alrededor del aminoacido 389, 101F en los aminoacidos 422-438 y Synagis® en los aminoacidos 255-280 (vease la figura 4).
Para determinar la competencia con 9C5, se recubrio protema Ft m - 2 |ig/ml en una placa de 96 pocillos, se bloqueo y luego se anadieron 20 |il de fracciones periplasmicas durante 30 minutos antes de anadirse el competidor, 9C5 (100 ng/ml). Estuvieron compitiendo durante 1 hora antes de anadirse anticuerpo de conejo anti-raton conjugado con HRP 1/5000 y se incubo durante 1 hora. Se determino la especificidad de union basandose en valores de DO en comparacion con controles que no han recibido Nanobody. Se hallo que varias fracciones periplasmicas competian con 9C5 indicando el reconocimiento de otro epítopo distinto de Synagis® y 101F (figura 5).
Para determinar la competencia con Fab de 101F, se recubrio la protema Ft m - de VRSh a una concentracion de 1 |ig/ml. Se bloqueo la placa con casema al 1 % y se anadieron los Nanobodies purificados empezando en 500 nM y luego se diluyeron 1/3. Se uso 3 nM de Fab de 101F para la competencia durante 1 hora antes de anadirse la adicion de anticuerpo de raton anti-HA (1/2000). Despues de 1 hora, se anadio anticuerpo de conejo anti-raton conjugado con HRP (0,65 |ig/ml). Se determino la especificidad de union basandose en valores de DO en comparacion con controles que no han recibido Nanobody. Se hallo que dos Nanobodies compiten con Fab de 101F, NB6 (191-E4) y NB4 (192-H1) (figura 6).
Ejemplo 10: Resonancia de plasmon superficial para mediciones de afinidad
Para medir la afinidad de Nanobodies seleccionados, se uso resonancia de plasmon superficial. Para la preincubacion del chip sensor CM5, se dejaron en reposo 10 |ig/ml de protema Ft m - de VRSh durante 120 segundos. Para la inmovilizacion mediante acoplamiento de amina, se uso EDC/NHS para la activacion y etanolamina HCl para la desactivacion (Biacore, kit de acoplamiento de amina). Se anadio Synagis® 100 nM y luego 100 nM de los Nanobodies. Se realizo la evaluacion de las velocidades de disociacion mediante ajuste de un modelo de interaccion 1:1 (modelo de union de Langmuir) mediante el software Biacore T100 v1.1. Se muestran las velocidades de disociacion y las constantes de afinidad en la tabla C-2. NB6 (191-E4) muestra una alta velocidad de disociacion y la Kd era de 700 pM. NB2 (191-D3) tema una Kd de 2,05 nM. Se ha mostrado que NB6 (191-E4) se une al epítopo de 101F y NB2 (191-D3) al epítopo de Synagis®. Observese que NB4 tambien compite con Synagis® y aun puede reconocer por tanto un epítopo diferente.
Ejemplo 11: Neutralizacion in vitro de la infeccion por VRSh
Se uso el ensayo de microneutralizacion de VRSh para investigar la capacidad de neutralizacion in vitro de Nanobodies contra VRSh purificados seleccionados. En este caso, se sembraron celulas Hep2 a una concentracion de 1,5 x 104 celulas/pocillo en placas de 96 pocillos en medio DMEM que contema suero de ternero fetal (FCS) al 10 % complementado con penicilina y estreptomicina (100 U/ml y 100 |ig/ml, respectivamente) y se incubo durante 24 horas a 37 °C en una atmosfera con el 5 % de CO2. La reserva viral usada se denomina cepa larga de VRSh, Long LM-2 y Long M2 (usados de manera intercambiable) que hacen todos referencia a una reserva viral derivada de ATCC v R-26 cuya secuencia de la protema F corresponde a P12568 o M22643. La reserva viral se ha sometido a pases varias veces a partir de la reserva de ATCC. Se confirmo que la secuencia de la protema F era identica a P12568 (vease el ejemplo 19). Se preincubo una cantidad convencional de la cepa Long de VRSh con diluciones en serie de Nanobodies purificados en un volumen total de 50 |il durante 30 minutos a 37 °C. Se reemplazo el medio de las celulas Hep2 por la premezcla para permitir la infeccion durante 2 horas, despues de que se anadieron 0,1 ml del medio de ensayo. Se realizo el ensayo en medio DMEM complementado con suero de ternero fetal al 2,5 % y penicilina y estreptomicina (100 U/ml y 100 |ig/ml, respectivamente). Se incubaron las celulas durante 72 horas mas a 37 °C en una atmosfera con el 5 % de CO2, despues de que se lavaran las celulas dos veces con Tween-20 al 0,05 % en PBS y una vez con PBS solo, despues de que se fijasen las celulas con acetona fria al 80 % (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) en PBS (100 |il/pocillo) durante 20 minutos a 4 °C y se dejo que se secasen por completo. A continuacion, se detecto la presencia de la protema F en la superficie celular en un ensayo de tipo ELISA. Para ello, se bloquearon las celulas Hep2 fijadas con disolucion de albumina serica bovina (BSA) al 2 % en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente, que se incubo durante 1 hora con antisuero policlonal de conejo anti-protema F (Corral et al. 2007, BMC Biotechnol. 7: 17) o Synagis® (2 |ig/ml). Para la deteccion se uso anticuerpos de cabra anticonejo conjugados con HRP o anticuerpos de cabra espedficos anti-fragmento Fcy de IgG humana-HRP (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), despues de desarrollarse el ELISA segun procedimientos convencionales.
Se analizo la potencia de neutralizacion de VRSh in vitro de un panel de 15 Nanobodies identificados en ejemplos anteriores. Los Nanobodies consistfan en 4 grupos:
• El grupo 1 consistfa en Nanobodies espedficos de protema F de VRSh (192C4; SEQ ID NO: 163, 191D3; SEQ ID NO: 159, 192F2; SEQ ID NO: 167, 192C6; SEQ ID NO: 164, 192H2; SEQ ID NO: 169, 192A8; SEQ ID NO: 160, 192C10; SEQ ID NO: 162) que reconocen el sitio antigenico II de la protema F. El sitio antigenico II (tambien denominado sitio A) se identifico mediante mutaciones halladas en la protema F en mutantes de escape virales y aunque a menudo se encuentra que el sitio antigenico II se denomina la region de aa 250-275, los anticuerpos normalmente no pueden reconocer peptidos lineales que representan esta region (Arbiza et al. 1992, J. Gen. Virol. 73: 2225-2234). Los anticuerpos espedficos para el sitio antigenico II pueden ser neutralizantes o no (Garcia-Barreno et al. 1989, J. Virol. 63: 925-932). Palivizumab (Synagis®) es un ejemplo tfpico de un AcM que se une al sitio antigenico II (Zhao y Sullender 2005, J. Virol. 79: 3962-3968). Se uso la competencia con palivizumab para asignar el sitio antigenico para los Nanobodies (vease el ejemplo 5).
• El grupo 2 consistfa en Nanobodies espedficos para la protema F de VRSh (191E4; SEQ ID NO: 166, 192B1;
SEQ ID NO: 161, 192C10; SEQ ID NO: 162) que reconocen el sitio antigenico IV-VI de la protema F (Lopez et al.
1998, J. Virol. 72: 6922). El sitio antigenico IV-VI se identifico mediante mutaciones halladas en la protema F en mutantes de escape virales y puede encontrarse que este sitio se denomina la region de aa 423-436. Para este sitio antigenico se ha mostrado que los anticuerpos pueden reconocer peptidos lineales (Arbiza et al. 1992, J. Gen. Vir. 73: 2225-2234). Los anticuerpos espedficos para el sitio antigenico IV-VI pueden ser neutralizantes o no (Garcia-Barreno et al. 1989, J. Virol. 63: 925-932). 101F es un ejemplo tfpico de un AcM que se une al sitio antigenico IV-VI (Wu et al. 2007, J. Gen. Virol. 88: 2719-2723). Se uso la competencia con un Fab de 101F para asignar el sitio antigenico para los Nanobodies (vease el ejemplo 9).
• El grupo 3 consistfa en Nanobodies espedficos para la protema F de VRSh (192H1; SEQ ID NO: 168, 192D3;
SEQ ID NO: 165, 192B1; SEQ ID NO: 161) para los que no pudo atribuirse el sitio antigenico, o bien porque los Nanobodies no competfan con 101F o palivizumab o bien porque mostraban competencia tanto con 101F como con palivizumab.
• Como controles, se usaron 3 Nanobodies espedficos para hemaglutinina H5 de influenza (202A5; SEQ ID NO:
128, 202G3; SEQ ID NO: 154, 202E5; SEQ ID NO: 145).
El ensayo de neutralizacion mostro que los Nanobodies 191D3, 192C4 y 192F2 pueden neutralizar la infeccion por Long de VRS, siendo 191D3 el mas potente que Fab de Synagis® y Fab de 101F (figura 9). Los otros Nanobodies que reconocen el sitio antigenico II no pudieron inhibir la infeccion viral a la mayor concentracion sometida a prueba (3 |iM).
Ejemplo 12: Inmunizaciones
Se inmunizaron dos llamas (212 y 213) por via intramuscular en el cuello con 1 mg de la cepa long A de VRS con ARN inactivado (Hytest, Turku, Finlandia; #8RSV79), seguido por 4 dosis de refuerzo de 0,5 mg de VRS en un regimen quincenal. Se inmunizaron dos llamas (206 y 207) por via intramuscular con 1 mg de la cepa long A de VRS con ARN inactivado, se reforzaron con 0,25 mg de VRS despues de 2 semanas, seguido por 3 dosis de refuerzo con 50 |ig de Ft m -NN de VRSh recombinante (forma que carece de anclaje a la membrana de la protema de fusion, 70 kDa: Corral et al. 2007; BMC Biotechnol. 7: 17) en un regimen quincenal. Para todas las inmunizaciones, se prepararon los antígenos como emulsiones en aceite-PBS con Stimune como adyuvante.
Para la construccion de bibliotecas, se extrajo sangre de todos los animales 4 dfas y 10 dfas despues de la cuarta inmunizacion, al tiempo que tambien se realizo una biopsia de ganglio linfatico 4 dfas despues de la cuarta inmunizacion. Para el procedimiento con Nanoclone, se extrajeron 100 ml de sangre 11 dfas despues de la dosis de refuerzo final de las llamas 206 y 207.
Ejemplo 13: Construccion de bibliotecas
Se construyeron bibliotecas de fagos a partir de tejidos inmunitarios de las llamas 206, 207, 212 y 213 tal como se describe en el ejemplo 2. Se preparo el fago segun metodos convencionales y se almaceno a 4 °C para uso adicional, produciendo las bibliotecas de fagos 206, 207, 212 y 213.
Ejemplo 14: Seleccion de Nanobody con la protema F de VRSh
Para identificar Nanobodies que reconocen la proteina de fusion de VRS, se usaron las bibliotecas 156, 157, 206, 207, 212 y 213 para la seleccion con Ft m -NN (forma que carece de anclaje a la membrana de la proteina de fusion Long, 70 kDa; Corral T. et al. 2007, BMC Biotechnol. 7: 17) tal como se describe en el ejemplo 3. Ademas, se realizaron las selecciones usando la cepa Long de VRSh inactivado (Hytest #8RSV79). Se inmovilizo la proteina Ft m -NN (25 ng/pocillo) o VRS (5 a 50 |ig/pocillo) sobre placas para ELISA Nunc Maxisorp, junto a un control con antígeno 0 |ig/ml. Se eluyeron los fagos unidos de Ft m -NN usando tripsina, Synagis® (palivizumab, anticuerpo monoclonal humanizado, descrito en Zhao y Sullender 2005, J. Virol. 79: 396), o Fab de 101F (documento WO 06/050280, anticuerpo monoclonal humanizado) en la primera tanda de seleccion. Se usaron los resultados de las selecciones de primera tanda eluidos con Synagis® o Fab de 101F para las selecciones de la segunda tanda, usando o bien Fab de Numax (motavizumab o MEDI524, un producto de anticuerpo monoclonal humanizado de tercera generacion evolucionado a partir de palivizumab; documento WO 06/050166), Synagis® o Fab de 101F para la elucion. Se uso Remicade (infliximab, anti-TNF) como control para Synagis®, mientras que Fab de Omnitarg (anticuerpo anti-Her2; documento PCT/EP2008/066363) sirvio como control para Fab de Numax y Fab de 101F. Se uso un exceso molar de 100 veces de Synagis®, Fab de Numax o Fab de 101F para identificar Nanobodies que se unen espedficamente a epítopos de los sitios antigenicos II o IV-VI en la proteina F de VRS. Para obtener Nanobodies espedficos para el sitio antigenico IV-VI, se realizaron las selecciones de la segunda tanda usando dos peptidos biotinilados: en primer lugar, un peptido que comprende los residuos 422-436 de la proteina F (Long) (Abgent, San Diego, CA) que engloba el epttopo de union a 101F (Wu et al. 2007, J. Gen. Virol. 88: 2719-2723), en segundo lugar, un peptidomimetico del epítopo de Mab19 (HWSISKPQ-PEG4-K-biotina) (Chargelegue et al. 1998, J. Virol.72: 2040-2056).
Se analizaron los resultados de ambas tandas de selecciones para determinar el factor de enriquecimiento (fago presente en el eluato con relacion a los controles). Basandose en estos parametros, se eligieron las mejores selecciones para analisis adicional. Se escogieron colonias individuales y se hicieron crecer en placas de 96 pocillos profundos (volumen de 1 ml) y se indujeron anadiendo IPTG para la expresion del Nanobody. Se prepararon extractos periplasmicos (volumen: ~ 80 |il) segun metodos convencionales.
Para las pruebas de clones seleccionados en ensayos de neutralizacion de VRS, se purificaron parcialmente extractos periplasmaticos de cultivos de 10 ml usando IMAC PhyTips (Phynexus Inc, San Jose, CA). En este caso, se cargaron 800 |il de extractos periplasmaticos sobre columnas Phytips 200+ rellenas previamente con resina para cromatograffa de afinidad por metal inmovilizado, seguido por la elucion de Nanobodies con cola de His en 30 |il de glicina-HCl 0,1 M/NaCl 0,15 M (pH 3), despues de que se neutralizasen los eluatos con 5 |il de Tris-HCl 0,5 M, pH 8,5.
Ejemplo 15: Seleccion de Nanobody con Ft m -NN de VRS usando la tecnologia Nanoclone
Se prepararon celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) a partir de muestras de sangre usando Ficoll-Hipaque segun las instrucciones del fabricante. Se aislaron celulas B espedficas de antígeno que expresan anticuerpos de cadena pesada en su superficie de las PBMC mediante clasificacion por FACS (para una descripcion de la tecnologfa Nanoclone se hace referencia al documento WO 06/079372). Para ello, se marco protema Ft m -NN con colorante Alexa Fluor 488 (Invitrogen, Carlsbad, CA; n.° de cat. A20000) y se desalo posteriormente para retirar el colorante Alexa Fluor 488 no conjugado residual segun las instrucciones del fabricante.
Se tineron PBMC preinmunitarias (control de fondo) e inmunitarias de una llama con anticuerpos monoclonales de raton espedficos de IgG1 (inmunoglobulinas de cadenas pesadas+ligeras convencionales), IgG2 e IgG3 (clases de inmunoglobulinas de cadenas pesadas) conjugados con colorante fluorescente, anticuerpo DH59B marcado de manera fluorescente (CD172a) (VMRD, Inc. Pullman, WA; n.° de cat. DH59B; Davis et al. 1987, Vet. Immunol. Immunopathol. 15: 337-376) y antígeno marcado con Alexa 488. Se incluyo TOPRO3 como colorante discriminador de celulas vivas/muertas. Se separaron los linfocitos B IgG1+, monocitos, neutrofilos y celulas muertas y, por tanto, se rechazaron de la clasificacion. Las celulas B positivas para IgG2 o IgG3 espedficas de antígeno (A488+) eran celulas individuales clasificadas individualmente en pocillos de placas para PCR independientes que conteman tampon para RT-PCR. Para la llama 206, se obtuvo el 1,9 % celulas positivas para antígeno de la cantidad total de celulas vivas positivas para IgG2/IgG3 (el 1,0 % en la muestra de referencia preinmunitaria), para la llama 207 se obtuvo el 4,2 % de celulas positivas (el 0,7 % en la muestra de referencia preinmunitaria). Se amplificaron genes de region variable de cadena pesada directamente a partir de estas celulas B mediante RT-PCR de celulas individual y PCR anidada. Posteriormente se clonaron los productos de PCR en un vector de expresion adaptado segun TOPO derivado de pUC119 que contema el promotor LacZ, un gen de resistencia para ampicilina o carbenicilina, un sitio de clonacion multiple y la secuencia lfder gen3. En marco con la secuencia codificante del Nanobody®, el vector codificaba una cola de (His)6 y una etiqueta c-myc C-terminal. Se transformaron los constructos resultantes en celulas de Escherichia coli TOP10 mediante electroporacion de alto rendimiento. Se hicieron crecer clones individuales en placas de 96 pocillos profundos (volumen de 1 ml) y se indujeron anadiendo IPTG para la expresion del Nanobody. Se prepararon extractos periplasmicos (volumen: ~ 80 |il) mediante choque osmotico y se analizaron para determinar la union a Ft m - en un ELISA de union tal como se describe en el ejemplo 4. En total, se obtuvieron 8 agentes de union a Ft m - NN positivos (4 de la llama 206, 4 de la llama 207) de 52 Vh h clonados.
Ejemplo 16: Examen para determinar Nanobodies que se unen al sitio antigenico II o IV-VI
Se analizaron extractos periplasmicos que conteman Nanobodies individuales para determinar la union al sitio antigenico II o IV-VI, usando un ensayo Alphascreen® (Perkin Elmer; Waltham, MA) (Garcia-Barreno et al. 1989, J. Virol. 63: 925-932). En esta configuracion, se une Ft m -NN simultaneamente por Fab de Synagis® y 101F, permitiendo la deteccion de Nanobodies que interfieren en la union de cada uno de los sitios antigenicos II y IV-VI respectivos. En este caso, se anadieron extractos periplasmicos a protema Ft m - NN (0,3 nM) y se incubo durante 15 minutos. Posteriormente se anadieron perlas aceptoras conjugadas con Fab de Synagis® biotinilado (0,3 nM) y Fab de 101F (10 |ig/ml) y se incubo esta mezcla durante 1 hora. Finalmente se anadieron perlas donadoras recubiertas con estreptavidina (10 |ig/ml) y despues de incubacion durante 1 hora se leyo la placa en el lector de microplacas Envision. Se diluyeron extractos periplasmicos 25 veces, lo que corresponde aproximadamente a una concentracion final de 40 nM. Se valido el ensayo mediante titulacion de los competitores conocidos de Synagis®, los AcM 18B2 (Argene, Varilhes, Francia; 18042 N1902) y 2F7 (Abcam, Cambridge, R.U.; ab43812). Tambien se analizaron Fab de Synagis®, Fab de Numax y Fab de 101F, teniendo Fab de Numax el menor valor de CI50 (8,6 E-11 M) seguido por Fab de Synagis® (5,97 E-10M) y Fab de 101F (1,12 E-9 M). Para el examen de extractos periplasmaticos (a una dilucion 1/25) se usaron tanto Fab de Numax (40 nM) como Fab de 101F (40 nM) como controles positivos, mientras que extractos periplasmaticos irrelevantes sirvieron como controles negativos. Se identificaroncomo coincidenciaslosclonesqueinterfirieronenlaunionaprotemaFt m -NN enAlphascreen®enmas del 75% con relacion a los controles negativos. En total, se identificaron 341 coincidencias de 1856 clones, derivadasde las6 llamasperoprocediendo lamayona de lasllamas206y207.Ademas, de8clonesobtenidosa partirdelasseleccionesconNanoclone,3clonesmostraroncompetencia.
Se deconvoluciono el sitio antigenico correcto (II o IV-VI) de los competidores por medio de un ELISA de competencia con Fab de Synagis® biotinilado(2nM) o Fab de 101F biotinilado(3nM) paradeterminarlauniona protema Ft m - NN (1 |ig/ml). El protocolo es esencialmente igual aldescrito en elejemplo 5, con las siguientes modificaciones.Se diluyeronextractosperiplasmaticos1/10ysemezclaronconelFabbiotiniladoantesdelaunion a la protema Ft m -NN inmovilizada. La deteccion tuvo lugar mediante anticuerpos secundarios conjugados con extravidina-HRP(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO; n.°decat.E2886).
Sesometierontodaslascoincidenciasaanalisisdesecuenciayseclasificaronenfamiliassegunsussecuenciasde CDR3. En total,derivaron 133 secuencias unicas de lasllamas 206, 207, 212 y213, clasificadasen 34 familias diferentes(tablaC-4). Solamente se clasificaron6familiasque conteman 15 secuencias unicascomo de unional sitioantigenicoI.Todos losclonesrestantesseunieronalsitioantigenicoIV-VI.Ocho secuenciaseranagentesde union sincompetencia identificadosen ELISA de union aVRSh. Tambien se identificaroncinco nuevas familiasa partirde lasbibliotecas156y157,de lasque unaseidentificocomo de unionalsitioantigenicoI,ylasrestantes como de union al sitio antigenico IV-VI. Tambien se identificaron nuevos miembros de la familia de familias identificadaspreviamentedelasllamas156y157.
Ejemplo17:Examen paradeterminarNanobodiesneutralizantesdeVRS
De lasseisbibliotecasdeVRSh, seanalizaron163secuenciasunicas(160identificadasapartirdelasbibliotecasde fagos,3derivadasdeNanoclone)paradeterminarlacapacidadneutralizantedeLongdeVRS enunmicroensayode neutralizacioncomo protemasparcialmentepurificadas.Serealizoelexamen esencialmentetalcomo sedescribeen elejemplo 11,usando unvolumen fijode Nanobodies purificadosen Phytips(20|il).Se realizoladeteccion de la protemaFen lasuperficiecelularde Hep2 usando Synagis®(2|ig/ml),seguido poranticuerpodecabraespedfico anti-fragmentoFcydeIgGhumana-HRP (JacksonImmunoResearch,WestGrove,PA).
Ademas de los Nanobodies neutralizantes de VRS identificados anteriormente, LG191D3 y LG192C4, que se incluyeron como controles positivos en elexamen, 5 nuevos clones de sitioantigenico I mostraron una fuerte actividad neutralizantede Long de VRS: 1E4 (tambien denominado 207D1; SEQ ID NO: 211), un miembro de la familiarecien identificadode 191D3 (SEQ ID NO: 159), 7B2 (SEQ ID NO: 364), NC23 (SEQ ID NO: 380),y dos miembrosdelamismafamilia15H8 (SEQ IDNO: 371)yNC41 (SEQ IDNO: 372)(tablasA-1,C-4).Ningunodelos Nanobodies espedficos paraelsitioantigenicoIV-VImostromas que una actividadneutralizantemuy debilparala cepaLongLM-2deVRSh.
Ejemplo18:Construccion,produccionycaracterizaciondeNanobodiescontraVRSh
CinconuevosNanobodiesneutralizantesseleccionadosapartirdelexamen descritoanteriormente(1E4,7B2,15H8, NC23 yNC41) asfcomo 2 Nanobodies paraelsitioantigenicoIV-VI(NC39; SEQ IDNO: 359, 15B3; SEQ ID NO: 286) se expresaron, purificaron y caracterizaron adicionalmente. Para ello,volvieron a clonarse las secuencias codificantesen unvectorde expresion derivadode pUC119 que contema elpromotorLacZ, un gen de resistencia parakanamicina, un sitiodeclonacionmultipleylasecuenciade peptidosenalOmpA. En marco con lasecuencia codificantedelNanobody, elvectorcodificabaunacolade(His)6yunaetiquetac-mycC-terminal.
Laexpresiontuvolugarencelulasde E .c o li TG-1 como protemascon etiquetac-myc, colade His6en unvolumen de cultivode 1l.Se indujolaexpresion mediante laadicionde IPTG 1mM yse permitioque continuase durante 3horas a 37°C. Despues de centrifugar los cultivos celulares, se prepararon extractos periplasmicos mediante congelacion-descongelacion de lossedimentosyresuspension en dPBS. Se usaron estosextractoscomo material de partidapara cromatograffa de afinidad pormetal inmovilizado(IMAC) usando columnas HistrapFF Crude (GE Healthcare,Uppsala,Suecia).Se eluyeronlosNanobodiesdelacolumnaconimidazol250mM yposteriormentese desalaronhaciadPBS.
Se mostroquetodoslosNanobodiespurificadosseunenalaprotemaFenunELISAdeunionaprotemaFt m -NN y aVRSh. Se muestranlosresultadosparalaunionaVRSh enlatablaC-5.Brevemente,seinmovilizaron1|ig/mlde Ft m -NN o VRSh 5|ig/ml (Hytest Turku, Finlandia) directamente sobre placas de microtitulacion Maxisorp. Se bloquearon los sitios de union libres con casema al 1%. Se permitio que diluciones en serie de Nanobodies purificadosseuniesenalantfgenodurante1hora.Se revelolaunionalNanobodyusandounanticuerposecundario de conejoanti-Vm, ydeteccionfinalcon un anticuerpode cabra anti-conejoconjugado con HRP. Se determino la especificidaddeunionbasandoseenvaloresdeDO encomparacionconcontrolesdeNanobodyirrelevante.
Para determinar las afinidades de union precisas de los Nanobodies purificados, se realizo un analisis cinetico usando analisisporresonanciade plasmon superficialcon laprotema Ft m -NN, siguiendoelprocedimientodescrito en el ejemplo 10. Se muestran los resultados en la tabla C-5.
Se determino la capacidad de los Nanobodies purificados para competir con AcM Synagis® o Fab de Synagis® biotinilado por la union a Ft m -NN en ELISA siguiendo el procedimiento descrito en los ejemplos 6 y 16. La figura 10 muestra un ejemplo representativo de un ELISA de competencia en el que Nanobodies purificados compiten con Fab de Synagis® biotinilado por la union a Ft m -NN. Tal como se resume en la tabla C-5, los seis Nanobodies neutralizantes de VRS compitieron todos con Synagis®, aunque en diferentes grados. Los Nanobodies 15H8 y NC41 compitieron en menos grado, lo que puede indicar un epttopo de union alterada dentro del sitio antigenico II que en los otros Nanobodies.
Los Nanobodies 15H8 y NC41 tambien teman afinidades relativamente bajas (valores de Kd de 16 y 8,1 nM, respectivamente). Los Nanobodies 7B2 y NC23 mostraron velocidades de disociacion en el rango de 10"4 (1/s), dando como resultado valores de Kd de aproximadamente 1 nM, lo que confirma la fuerte union a VRSh observada en ELISA. Los Nanobodies 191D3 y 1E4 mostraron bajas afinidades de nM debido a velocidades de asociacion muy altas. Los agentes de union del sitio antigenico IV-VI, 15B3 y 191E4, muestran las mayores afinidades por Ft m -NN del panel con afinidades subnanomolares.
Ejemplo 19: Microneutralizacion in vitro de distintas cepas de VRSh
Se sometio a prueba la potencia de los Nanobodies purificados en la neutralizacion de diferentes cepas de VRS de tipo A y B mediante el microensayo de neutralizacion in vitro (vease el ejemplo 11). Se prepararon reservas virales de Long de VRS (n.° de registro P12568; ATCC VR-26; vease el ejemplo 11), A-2 de VRS (ATCC VR-1540; n.° de lote 3199840) y B-1 de VRS (ATCC VR-1580; n.° de lote 5271356) en celulas Hep2 y posteriormente se titularon para determinar la dosis infecciosa optima para su uso en el microensayo de neutralizacion. Se muestran los resultados de las potencias de neutralizacion de los diferentes Nanobodies purificados en la tabla C-5. Aunque los seis Nanobodies que reconocen el epttopo de Synagis® pudieron neutralizar eficazmente las cepas de tipo A Long y A-2, no pudieron neutralizar la infeccion con la cepa B-1 o lo hicieron en concentraciones >1 |iM. Los competidores de 101F, 15B3 y 191E4, mostraron una potencia de neutralizacion muy debil con la cepa B-1 solamente cuando se administraron en concentraciones |iM.
Se verificaron las secuencias de las protemas F respectivas de las diferentes cepas de VRS por medio de PCR-transcriptasa inversa y posterior analisis de secuencia. Brevemente, se aislo el ARN total de celulas Hep2 infectadas con VRS usando el minikit RNeasy (Qiagen, Venlo, Pafses Bajos), despues de que se preparase ADN complementario usando el kit de transcriptasa inversa Superscript III (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se amplifico la protema F de cepas A de VRS y se secuencio usando los cebadores descritos en Kimura et al. 2004 (Antiviral Research 61: 165-171). Para la amplificacion de la protema F de la cepa B-1 de VRS, se usaron los siguientes cebadores: FB1_outer_for: cttagcagaaaaccgtga (SEQ ID NO: 2419); FB1_outer_rev: tgggttgatttgggattg (SEQ ID NO: 2420); FB1_seq_1123-for: ggactgatagaggatggta (SEQ ID NO: 2421); FB1_seq_1526-rev: gctgacttcacttggtaa (SEQ ID NO: 2422). La secuencia de la cepa B-1 de VRS correspondfa al n.° de registro P13843, con una mutacion puntual adicional, Ser540Leu. La secuencia para la cepa Long M2 de VRS correspondfa por completo a la secuencia notificada (n.° de registro M22643). La secuencia para la cepa A-2 de VRS correspondfa al registro M11486. Vease tambien la tabla A-3.
Ejemplo 20: Construccion, produccion y caracterizacion de Nanobodies contra VRSh multivalentes
Se generaron constructos de Nanobody multivalentes conectados mediante ligadores de Gly-Ser de diferentes longitudes y composicion por medio de reacciones PCR independientes (1 para la subunidad de Nanobody N-terminal, 1 para la central (en caso de ser trivalentes) y 1 para la C-terminal) usando diferentes conjuntos de cebadores que abarcan sitios de restriccion espedficos. De manera similar, se generaron constructos de Nanobody multivalentes conectados mediante el ligador Ala-Ala-Ala. Se clonaron todos los constructos en un vector de expresion derivado de pUC119 que contema el promotor LacZ, un gen de resistencia para kanamicina, un sitio de clonacion multiple y la secuencia de peptido senal OmpA. En marco con la secuencia codificante del Nanobody, el vector codificaba una cola de (His)6 y una etiqueta c-myc C-terminal. En caso de que estuviera presente un ligador de 35Gly-Ser en el constructo multivalente, se uso un vector de expresion derivado de pUC119 que contema el promotor LacZ, un gen de resistencia para kanamicina y la secuencia de peptido senal OmpA. Directamente en el sentido de 3' del peptido senal, estaba presente un sitio de clonacion multiple para la insercion del Nanobody, seguido por una secuencia de ADN que codificada el ligador de 35Gly-Ser y un segundo sitio de clonacion multiple para la clonacion de una segunda secuencia de Nanobody. En marco con la secuencia codificante de Nanobody-35Gly-Ser-Nanobody resultante, el vector codificaba una cola de (His)6 y una etiqueta c-myc C-terminal. La tabla C-6 enumera los constructos multivalentes generados con Nanobodies espedficos de VRS. Se muestran las secuencias de los constructos multivalentes en la tabla A-2.
Se expresaron constructos de Nanobody contra VRS multivalentes, purificaron y caracterizaron adicionalmente. Se realizo la produccion en celulas de E.coli TG1, seguido por la purificacion de la fraccion periplasmica mediante la cola de His mediante IMAC y desalacion, esencialmente tal como se describe en el ejemplo 18. Para determinados constructos trivalentes (por ejemplo, RSV401, RSV404, RSV406) se realizo la produccion en P. pastoris seguido por purificacion de la fraccion de medio. Se sometieron todos los Nanobodies trivalentes a filtracion en gel como etapa final para retirar posibles productos de degradacion bivalentes y monovalentes.
Se confirmo la union de Nanobodies multivalentes purificados a la protema F de VRSh en ELISA tanto protema con Ftm- como con VRSh (vease el ejemplo 18). Para la mayona de Nanobodies, el formateo a constructos bivalentes y trivalentes dio como resultado un efecto de avidez claro pero limitado (un aumento de hasta 10 veces), con la excepcion de los constructos multivalentes de 7B2 y NC23 que mostraron valores de CE50 similares a los homologos monovalentes (figura 11).
Ejemplo 21: Potencia de constructos bi y trivalentes para neutralizar VRSh
Se evaluo la potencia de los constructos de Nanobody en el ensayo de neutralizacion de VRS con diferentes cepas de VRS (veanse los ejemplos 11 y 19). Los Nanobodies bivalentes que se unen al sitio antigenico II mostraron un aumento marcado de las potencias de 100 a 1000 veces (es decir, mucho mayor que el aumento de afinidad) en la neutralizacion de Long con relacion a sus homologos monovalentes, oscilando los valores de CI50 entre 50-380 pM, siendo mejores o similares a los de Fab de Numax. Sin embargo, en las cepas B-1 de VRS el aumento de potencia fue mucho menos intenso, y ninguno de los constructos dimericos era mas potente que Synagis®. Sorprendentemente, esto pudo superarse mediante la generacion de constructos trivalentes, tal como se muestra en la figura 12. Los constructos trivalentes con tres Nanobodies que se unen al sitio antigenico II fueron neutralizadores al menos 1000 veces mas potentes con cepas B-1 de VRS que sus homologos monovalentes.
La figura 13 ilustra que la longitud de ligador no tuvo un claro efecto sobre el aumento de potencia de constructos 191D3 bivalentes en comparacion con 191D3 monovalentes.
Ejemplo 22: Potencia de constructos biparatopicos, bi y trivalentes para neutralizar VRSh
Se analizaron constructos biparatopicos que consistfan en un Nanobody que se une al sitio antigenico II y un Nanobody que se une al sitio antigenico IV-VI para determinar la neutralizacion. Los constructos biparatopicosbivalentes mostraron generalmente una curva aplanada en el ensayo de neutralizacion, dificultando una determinacion precisa de los valores de CI50 (figuras 12, 14). A pesar de esto, la neutralizacion mejoro significativamente en ambas cepas (vease, por ejemplo, RSV205; figura 12). Este aumento notable de funcion tambien se observo para un segundo par de agentes de union de sitio antigenico II y IV-VI, 191D3-191E4. Para este par, se compararon diferentes longitudes de ligador y orientaciones, mostrando que el acortamiento de la longitud del ligador potencia claramente la CI50 , pero solamente para una orientacion (figura 14).
Tambien se analizaron constructos biparatopicos con dos Nanobodies diferentes que se unen al sitio antigenico II, 7B2 y 15H8, para determinar la neutralizacion (RSV204 y 206). Tambien en este caso se observo una mejora significativa de la potencia especialmente para la cepa B-1 en la que aumento la potencia al menos 1000 veces frente a los Nanobodies monomericos.
Los constructos biparatopicos trivalentes de 7B2 y 15B3 fueron neutralizadores incluso mas potentes tanto de cepas Long como B-1 y no mostraron las curvas aplanadas observadas con constructos biparatopicos bivalentes (figura 12).
Ejemplo 23: Reactividad de Nanobodies monovalentes con mutantes de escape de la cepa Long
Se seleccionaron varios mutantes de escape, descritos en Lopez et al. 1998 (J. Virol. 72: 6922-6928), y espedficos para el sitio antigenico II (R47F/4, R47F/7, RAK13/4, R7C2/11, R7C2/1) o IV-VI (R7.936/1, R7.936/4, R7.936/6, R7.432/1) o la combinacion de ambos (RRA3), para someter a prueba su reactividad con 10 Nanobodies monovalentes, incluyendo el Nanobody 191C7 (EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSSGVINAMAWHRQAPGKERELVAHISSGGSTYYGDFVKGRFTISRDNAKD TVILQMNSLKPEDTAVYYCHVPWMDYNRRDYWGQGTQVTVSS; SEQ ID NO: 2423) identificado anteriormente como que no se une a los sitios antigenicos II o IV-VI.
Se realizo este ensayo segun Lopez et al. 1998 (J. Virol. 72: 6922-6928). Brevemente, se sometio a prueba cada Nanobody en 0,2 |ig/ml en ELISA usando extractos de antígeno de celulas HEp-2 infectadas con los diferentes mutantes de escape. Se normalizaron los resultados de absorbancia para la reactividad con respecto a la cepa viral de referencia (Long de tipo natural) asf como con respecto al Nanobody de control 191C7. Se muestran los resultados en la tabla C-7.
Una reactividad de >75 % se indica como un cuadrado negro relleno, los cuadrados con sombreado oscuro corresponden a una reactividad de entre el 75 y el 50 %, los cuadrados con sombreado claro corresponden a una reactividad del 25-50 % y una reactividad menor del 25 % se indica mediante un cuadrado blanco. En general, se hallo que los Nanobodies ya identificados como agentes de union al sitio antigenico II en ejemplos anteriores (192c 4, 191D3, 191F2, NC23, 15H8, 7B2 y NC41) eran sensibles a mutaciones tfpicas en el sitio antigenico II, mientras que los otros Nanobodies ya identificados como agentes de union al sitio antigenico IV-VI eran sensibles en efecto a mutaciones en estos sitios.
Ejemplo 24: Reactividad de Nanobodies multivalentes con mutantes de escape de la cepa Long Posteriormente se analizaron varios constructos multivalentes en un panel limitado de virus de escape para evaluar la union. Se realizo este ensayo segun Lopez et al. 1998 (J. Virol. 72: 6922-6928). Brevemente, se sometio a prueba cada Nanobody en 0,1 |ig/ml para Nanobodies monovalentes y en 0,05 |ig/ml para Nanobodies bi y trivalentes en ELISA usando extractos de antígeno de celulas HEp-2 infectadas con los diferentes mutantes de escape. Se normalizaron los resultados de absorbancia para la reactividad con respecto a la cepa viral de referencia (Long de tipo natural) asf como con respecto al Nanobody de control (191E4; SEQ ID NO: 166, en este particular ensayo). Se muestran los resultados en la tabla C-8.
Una reactividad de >75 % se indica como un cuadrado negro relleno, los cuadrados con sombreado oscuro corresponden a una reactividad de entre el 75 y el 50 %, los cuadrados con sombreado claro corresponden a una reactividad del 25-50 % y una reactividad menor del 25 % se indica mediante un cuadrado blanco. Notablemente, los constructos multivalentes mostraron una union mejorada en comparacion con su homologo monovalente, al virus mutante R7C2/11. Ademas el constructo biparatopico RSV403 no era sensible a ninguno de los mutantes.
Ejemplo 25: Administracion intranasal del Nanobody bivalente RSV101
Para someter a prueba la capacidad del Nanobody RSV101 (SEQ ID NO: 2382) para neutralizar virus in vivo, se uso un modelo de raton. En este modelo, se inocularon ratones Balb/c hembra (de 9-10semanas de edad) por via intranasal con 100 |ig de RSV101 purificado disuelto en 50 |il de PBS. Como control de Nanobody irrelevante, se uso el Nanobody bivalente 12D2biv. Ademas, un grupo de ratones recibio 100 |ig de palivizumab (Synagis®) y un cuarto grupo recibio PBS solamente. Cinco horas despues, se administraron 106 unidades infecciosas de la cepa A2 de VRS por via intranasal. Cuatro dfas y 1 dfa antes de la infeccion viral y 1 y 4 dfas despues de la infeccion, se trataron los ratones con ciclofosfamida (primera dosificacion a 3 mg/kg; posterior dosificacion a 2 mg/kg todas administradas por via s.c.) para suprimir el sistema inmunitario y como tal para aumentar la replicacion viral.
Tres y 5 dfas despues de la exposicion viral, se sacrificaron los ratones; se extirparon los pulmones, se homogeneizaron y se limpiaron de tejido mediante centrifugacion. Se infectaron celulas Hep-2 subconfluentes, incubadas en medio libre de suero, con diluciones en serie de homogeneizados de pulmon limpios. Cuatro horas despues de la infeccion, se retiro el medio y se reemplazo por nuevo medio que contema FCS al 1 % y agarosa al 0,5 %. De dos a tres dfas despues de la infeccion, se retiro el recubrimiento de agarosa para permitir la tincion de las placas de lisis de VRS mediante un anticuerpo anti-VRS.
Se recupero el virus infeccioso (ufp/pulmon) de todos los animales en los grupos de control negativo (PBS y 12D2biv) en los homogeneizados de pulmon en los dfas 3 (figura 15A) y 5 (figura 15B) despues de la exposicion. En la figura 15C, se representa la media de los tttulos de virus infeccioso (ufp/pulmon). Ninguno de los animales en los grupos tratados con RSV101 y Synagis tuvo virus infeccioso detectable en los dfas 3 y 5 tras la exposicion. La administracion intranasal del Nanobody bivalente RSV101 protegio frente a la infeccion y replicacion de la cepa A2 de VRS en ratones.
Ejemplo 26: Funcionalidad del Nanobody RSV101 despues de administracion intranasal
Para someter a prueba si los Nanobodies o anticuerpos de palivizumab podnan estar presentes todavfa en los pulmones 3 y 5 dfas despues de la inoculacion, se preincubaron homogeneizados de pulmon de ratones tratados con PBS durante 1 h con el mismo volumen de los homogeneizados de pulmon de los diferentes grupos experimentales descritos en el ejemplo 29, preparados o bien tres o bien cinco dfas tras la infeccion.
Tal como se muestra en la figura 16A, la incubacion de los homogeneizados de pulmon de ratones tratados con PBS con los homogeneizados de pulmon preparados tres dfas despues de la infeccion a partir de o bien RSV101 o bien palivizumab, pero no de ratones tratados con 12D2biv, neutralizo el virus presente en los homogeneizados de pulmon de ratones tratados con PBS. En cambio, ninguno de los homogeneizados de pulmon de ratones tratados con RSV101 o Synagis preparados cinco dfas despues de la infeccion pudo neutralizar de manera intensa el virus presente en los homogeneizados de pulmon de ratones tratados con PBS (figura 16B).
Tomados conjuntamente, estos datos muestran que el Nanobody bivalente RSV101 funcional sigue estando presente y es funcionalmente activo en los pulmones durante al menos 72 horas despues de la administracion. Para demostrar ademas la presencia de Nanobodies neutralizantes de virus funcionales en los homogeneizados de pulmon, se incubaron 500 unidades formadoras de placas de lisis (ufp) de VRS con diferentes cantidades de los homogeneizados de pulmon. Se incubaron estas mezclas durante 90 minutos a temperatura ambiente. A continuacion, se pusieron las mezclas sobre celulas HepG2 hechas crecer en una placa de 96 pocillos. Despues de 2 horas, se lavaron las celulas y se anadio un recubrimiento de medio de cultivo con agarosa al 0,5 %. Despues de tres dfas, se visualizaron placas de lisis de VRS (figura 27). A partir de los datos (figura 27) queda claro que los homogeneizadosdepulmondelos5ratonesquerecibieronelNanobodyRSV101 tresdfasantesdesacrificarselos ratones, neutralizaron las 500ufp de VRS cuando se usaron 8 y 2|ilde homogeneizados. Esto no se observo usandoloshomogeneizadosdepulmondelosratonestratadosconNanobodydecontrol(12B2biv).
Ejemplo27:NosedetectaARN viralenlospulmonesderatonespretratadosporviaintranasalconRSV101.
Losresultadosdescritosenelejemplo29demostraronque noestabapresentevirusinfecciosoenlospulmonesde ratonestratadosconRSV101. Sinembargo,todavfaexistfalaposibilidaddequeelvirushubieseinfectadocelulasy que elARN genomicoviralse replicasecon laliberacionde partfculasviralesno infecciosasosinlaliberacionde partfculasvirales.Parainvestigarestaposibilidad,sedeterminolapresenciadeARN viralmedianteqPCR. Se aislo ARN de100|ildecadahomogeneizadodeLong(1000|il)preparado5dfastraslainfeccion.Medianteelusodeun cebadorespedfico delgen M, se sintetizoADNc espedfico de ARN genomico de VRS y se cuantificomediante qPCR (porduplicado).Se calculoelniveldeARN genomicoviralencadahomogeneizadodepulmonconrelaciona unamuestradepulmonquemostrolamenorsenaldeqRT-PCR (normalizadoaunvalorde 1).Talcomo semuestra en latablaC-9, lapresencia deARN genomico viralrelativoen lospulmones de ratonestratadoscon RSV101 y Synagis®seredujofuertementeencomparacionconratonestratadosconPBS o12D2biv.
Ejemplo 28: Farmacocinetica de 191D3, ALX-0081 y RANKL008A en larataWistarmacho despues de una unica administracionintratraquealointravenosa
28.1:Artfculosdeprueba:
SedescribenlosartfculosdepruebaenlatablaC-12.
28.2Metodos
M o d e l o a n i m a l
Seusaron101 ratasWistarmacho(deaproximadamente300gramosy11semanasdeedad)paraesteestudio,una cepa producida porCharles RiverLaboratories,Alemania. Se mantuvieron losanimales durante almenos 6 dfas para su adaptacion. Tras larevision de salud inicial,se pesaron los animales y se asignaron por medio de un programadealeatorizacioncomputerizadoalosgruposdeprueba;solamenteseusaronanimalessanos.
Se descongelaron lassustanciasde pruebaesterilesen unbano deaguaa25°Cmientrasseagitabasuavemente durante 10minutos. Para la dosificacion intratraqueal, no se requirieron diluciones adicionales. Para la administracionintravenosa,sediluyolacantidadrequeridadesustanciadepruebaenDPBS esteril(solucionsalina tamponadaconfosfato(modificadaporDulbecco))hastalasconcentracionesdeseadas.Seprepararondenuevolas formulacionesdeartfculosdepruebaenelplazode4horasantesdeladosificacion.
D o s i s y v ^ a d e a d m i n i s t r a c i o n
SefacilitanlosdiferentesgruposdepruebaylosnivelesdedosisenlatablaC-13.Seadministroladosisenboloi.v. en lavenade lacola.Seajustolacantidaddeartfculodepruebaparaadministracioni.v.alpesocorporalactualde cadaanimal.Se administroladosisi.t.porviaintratraquealcon unajeringaconunaagujadedosificaciondeacero inoxidableroma,despuesdeanestesiardemanera profundaconisoflurano.Sefijolacantidaddeartfculodeprueba para administracion a 100|il/animal, independientemente del peso corporal. Basandose en los pesos corporales reales de los animales, pudo calcularse una dosis aproximada en mg/kg a partir de los pesos corporales promediadosparalacomparacionconlaviai.v.:4mg/kg paraNB2 deVRS, 5mg/kg paraALX-0081 y5mg/kg para RANKL008a.
El peso corporal promedio de losanimales a losque se lesdosifico porvia intratraquealfue, en promedio, de 0,315kg (grupo de NB2 de VRS), 0,317kg (grupo de ALX-0081), 0,323kg (grupo de RANKL008a). Como estos animalesrecibieronuna dosificacionfijade 100|il/animal,secalcularonlasdosismediascorrespondientesporp.c. comode3,6mg/kg(grupodeNB2 deVrS),3,1mg/kg(grupodeALX-0081),3,2mg/kg(grupodeRANKL008a).
T o m a d e m u e s t r a s d e s a n g r e y L L B A y p r o c e s a m i e n t o d e l a s m i s m a s .
Despuesdeladosificacioni.v.,setomaronmuestrasdesangre(aproximadamente300|il)alas0,05,0,25,0,5,1,2, 4,6y 24horasde lavena de lacolade animalesalosque se lesdosificoNB2 deVRS yALX-0081 yalas0,05, 0,25,0,5,1,2,4,8,24y48horasdeanimalesalosqueselesdosificoRANKL008a. Se pusierontodaslasmuestras de sangre en hielofundente. En elplazo de aproximadamente 30minutos despues de latoma de muestras, se centrifugaronlasmuestrasdesangrea5°C durante 10minutos(1500g).Se almaceno elplasma citradoentubos depolipropilenoaaproximadamente<-75°Chastaqueseenvfoenhielosecoalpromotor.
Despues de ladosificacion intratraqueal, se extrajo sangre, los pulmones y LLBA (en laautopsiatras anestesia profundaconisoflurano)alas0,05,0,333,1,2,4,6y24horasderatasalasqueselesdosificoNB2 deVRS yratas a lasque se lesdosificoALX-0081 yalas0,05,0,333, 1,2,4,8y24horasde animalesalosque se lesdosifico RANKL008a. Por medio de una puncion en laaorta, se extrajeron 4ml de sangre. En elplazo de 42minutos despues de latoma de muestras, secentrifugaronlasmuestrasdesangrea5°C durante 10minutos(1500g).Se almacenoelplasmacitradoentubosdepolipropilenoaaproximadamente<-75°C hastaqueseenvm enhieloseco alpromotor. Tras laretiradade sangre, se extrajeron lospulmones. En primerlugar,se enjuagaron lospulmones incluyendolatraqueacon DPBS heladoysepesaron. Luego, seextrajoLLBA. Se pusieroncuidadosamentecinco ml de lfquidode lavado (DPBS) en lospulmones. Despues de aproximadamente 10segundos, se devolviotanto lfquido como fue posible a lajeringa. Se transfirio LLBA a un tubo vacm y se almaceno directamente en hielo fundente. Se repitioeste procedimiento. Se anadio lasegunda extraccion de LLBA a laprimera extraccion. Se documento ynotificoelvolumen de LLBA que se extrajo.Posteriormente, sealmaceno LLBA aproximadamente a <-75°Chastaqueseenvmenhielosecoalpromotor.
D e t e r m i n a c i o n d e N B 2 d e V R S e n p l a s m a o L L B A d e r a t a
Se recubrieronplacasdemicrotitulacionde96 pocillos(Maxisorp,Nunc,Wiesbaden, Alemania)durantelanochea 4°C con 100|ilde VRSh (12,5|ig/ml, Hytest. Turku, Finlandia). Despues de eso, se aspiraron los pocillos, se bloquearon(T.A.,1h,PBS-casema al0,1%) yse lavaron.Se prepararon lospatrones,QC ypredilucionesde las muestrasdepruebaenunaplacanorecubierta(polipropileno)enel100% deplasmaoLLBAderatayseincubaron durante 30min a T.A. mientras se agitaba a 600rpm. Se transfirio una dilucion 1/10 de las muestras en PBS-casema al0,1% (laconcentracionfinalde plasma o LLBA de rataesdel 10%) a laplacarecubiertayse incubo durante 1haT.A.mientrasseagitabaa600rpm. Despuesdetresetapasde lavadocon PBS-Tween20 al0,05%, seincubaronlasplacasconanticuerpopoliclonaldeconejoanti-NanobodyK1 monoclonal(1/2000enPBS-casema al0,1%, interno)durante 1h a T.A. mientras se agitaba a 600rpm. Despues de 3 etapas de lavado con PBS-Tween20 al0,05%, seincubaron 100|ildeanticuerpodecabraanti-conejopoliclonalmarcado con peroxidasadel rabano(HRP)(1/2000enPBS-casemaal0,1%, DakoCytomation,Glostrup,Dinamarca)durante1haT.A.mientras se agitaba a 600rpm. Se realizo lavisualizacion protegida de la luz durante 20min con 100|ilde 3,3',5,5'-tetrametilbencidina(esTMB,SDT, diluido1/3).Despuesde20min,sedetuvolareacciondecoloracioncon100|ilde HCl 1N.Sedeterminolaabsorbanciaa450nm,ysecorrigioparalaabsorbanciadefondoa620nm.Sedetermino laconcentracion en cada muestra basandose en una curva patron sigmoidea. Ellfmitede cuantificacion inferior (LLOQ)yellfmitedecuantificacionsuperior(ULOQ)delosdiferentesensayosseenumeran enlatablaC-14.
D e t e r m i n a c i o n d e A L X - 0081 e n p l a s m a o L L B A d e r a t a
Se recubrieronplacasdemicrotitulacionde96pocillos(Maxisorp,Nunc)durantelanochea4°Ccon 100|ildevWF en PBS (2,5|ig/ml,Haemate P1200/500-ZLB Behring). Despues de eso, seaspiraron lospocillos,se bloquearon (T.A.,1h,PBS-casema al0,1%) yselavaron.Se prepararon lospatrones,QC ypredilucionesde lasmuestrasde prueba en una placa no recubierta(polipropileno)en el100% de plasma o LLBA de ratayse incubaron durante 30minaT.A.mientrasseagitabaa600rpm.Setransfiriounadilucion1/5delasmuestrasenPBS-casemaal0,1% (laconcentracionfinalde plasma oLLBA de rataesdel20%) alaplacarecubiertayseincubodurante 1haT.A. mientrasseagitabaa600rpm. Despues detresetapasde lavadocon PBS-Tween20 al0,05%, se incubaron las placas con elanticuerpo anti-ALX0081 NB vWF12B2-GS9-12B2-BIO (1|ig/mlen PBS-casema al0,1%, interno) durante30minaT.A.mientrasseagitabaa600rpm.Despuesde3etapasdelavadoconPBS-Tween20al0,05%, se incubaron 100|ilde estreptavidina-HRP (1/2000 en PBS-casema al0,1%, DakoCytomation) durante 30min a T.A. mientras se agitaba a600rpm. Se realizolavisualizacion protegida de laluzdurante 15min con 100|ilde 3,3',5,5'-tetrametilbencidina(esTMB, SDT, diluido1/3).Despuesde15min,sedetuvolareacciondecoloracioncon 100|ildeHCl 1N.Sedeterminolaabsorbanciaa450nm,ysecorrigioparalaabsorbanciadefondoa620 nm.Se determinolaconcentracionencadamuestrabasandoseenunacurvapatronsigmoidea.ElLLOQ yelULOQ delos diferentesensayosseenumeran enlatablaC-15.
D e t e r m i n a c i o n d e R A N K L 008 a e n p l a s m a o L L B A d e r a t a
Se recubrieron placas de microtitulacion de 96 pocillos(Maxisorp, Nunc) durante lanoche a 4°C con 100|ilde neutravidinaenPBS (2|ig/ml,Pierce,Rockford,IL).Se aspiraronlospocillosysebloquearon.Despuesde3etapas de lavado con PBS-Tween20 al 0,05%, se capturo RANKL biotinilado (0,5|ig/ml en PBS-casema al 0,1%) incubando 100|ildurante 1h a T.A. mientras se agitaba a 600rpm. Despues de esta etapa de incubacion, se lavaron lospocillos.Se prepararon lospatrones, QC y predilucionesde lasmuestras de prueba en una placa no recubierta(polipropileno)enel100% de plasma oLLBa deratayseincubarondurante30 min aT.A.mientrasse agitabaa600rpm.Setransfiriounadilucion1/10delasmuestrasenPBS-casemaal0,1% (laconcentracionfinalde plasmaoLLBAderataesdel10%) alaplacarecubiertayseincubodurante1haT.A.mientrasseagitabaa600 rpm. Despues de tres etapas de lavado con PBS-Tween20 al0,05%, se incubaron las placas con anticuerpo policlonaldeconejoanti-Nanobody®R23 monoclonal(1/2000en PBS-casema al0,1%, interno)durante 1haT.A. mientrasseagitabaa600rpm.Despuesde3etapasdelavadoconPBS-Tween20al0,05%, seincubaron100|ilde anticuerpo de cabra anti-conejo policlonalmarcado con peroxidasa delrabano (HRP) (1/5000 en PBS-casema al 0,1%, DakoCytomation, Glostrup, Dinamarca) durante 1h a T.A. mientras se agitaba a 600rpm. Se realizo la visualizacionprotegidadelaluzdurante10mincon 100|ilde3,3',5,5'-tetrametilbencidina(esTMB,SDT,diluido1/3). Despues de 10min, se detuvo lareaccion de coloracion con 100|ilde HCl 1N. Se determino laabsorbancia a 450nm, y se corrigio para laabsorbancia de fondo a 620nm. Se determino laconcentracion en cada muestra basandose en unacurvapatronsigmoidea. ElLLOQ yelULOQ de losdiferentesensayos seenumeran en latabla C-16.
A n a l i s i s n o c o m p a r t i m e n t a l d e d a t o s f a r m a c o c i n e t i c o s
Se sometieron perfilesde concentracion de LLBA media y plasmatica individual-tiempo de todas las ratas a un analisisfarmacocineticonocompartimental(NCA)usandoelsoftwareWinNonlinProfessionalversion5.1(Pharsight Corporation,MountainViewCalifornia,EE.UU.).Se usaronlosmodelospreprogramados200y201 paraanalizarlos datosporviaintratraquealeintravenosa,respectivamente.Se usolareglatrapezoidallinealhaciaarriba,logantmica haciaabajoparacalcularelareabajolosdatosdeconcentracion-tiempo.
1.3Resultados
C o n c e n t r a c i o n e s p l a s m a t i c a s d e N B 2 d e V R S , A L X - 0081 y R A N K L 008 a
Los datos de concentracion plasmatica observada-tiempo de los animales individuales despues de una unica administracion i.v.y de losdatos de concentracion plasmatica media (n=4 animales/punto de tiempo; toma de muestrasdestructiva)-tiempodespuesdeunaunicaadministracioni.t.deNB2 deVRS,ALX-0081 yRANKL008a se muestran en lasfiguras17(i.v;datos paratodosloscompuestos), 37 (datosporviai.v.yi.t.de NB2 deVRS), 38 (datosporviai.v.yi.t.deALX-0081),y39(datosporviai.v.yi.t.deRANKL008a). Lasconcentracionesplasmaticas individuales (i.v.) y tanto individuales como medias (i.t.) se enumeran en las tablas C-17, C-18 y C-19, respectivamente.
A n a l i s i s f a r m a c o c i n e t i c o e n p l a s m a d e N B 2 d e V R S , A L X - 0081 y R A N K L 008 a
Se facilita una vision general de los parametros farmacocineticos basicos obtenidos mediante analisis PK no compartimentaldeNB2 deVRS (4mg/kg i.v.y3,6mg/kgi.t.),ALX-0081 (5mg/kg i.v.y3,1mg/kg i.t.)yRANKL008a (5mg/kgi.v.y3,2mg/kg i.t.)enlastablasC-20,C-21 yC-22.
LosparametrosPK comentadosenelpresentedocumentoseobtuvieronusandoanalisisnocompartimental(NCA). Para las ratas 1 y 2 (NB2 de VRS i.v.), la rata 6 (ALX-0081 i.v.)y la rata 9 (RANKL008a i.v.)se produjeron dificultadesen latoma de muestras de sangre, y debido a losdatos limitados, se excluyeron estos animales de posteriores calculos farmacocineticos. Se calcularon los parametros terminales para algunos de los animales basandosesolamenteendospuntosdedatosenlafaseterminal.
Despuesdelaadministracioni.v.de4mg/kgdeNB2 deVRS y5mg/kgdeALX-0081, seobservaronperfilesPK en plasmacomparable(figura17).EstosereflejotambienenparametrosfarmacocineticossimilaresparaNB2 deVRS monovalenteyALX-0081 bivalente.Seestimoqueelaclaramientoerade363ml/h/kgy337ml/h/kgpararatasalas queselesdosificoNB2 deVRS yALX-0081. LosvaloresdeVssmedioscorrespondientesfueronde250ml/kg(NB2 de VRS) y 252ml/kg (ALX-0081). Las concentraciones plasmaticas de estos Nanobodies solamente fueron detectablesdurantehastaseishoras(lfmitededeteccionde4ng/mlparaNB2 deVRS y3,75ng/mlparaALX-0081) ysecalculoquelassemividasterminaleserande0,926horasparaNB2 deVRS y2,06horasparaALX-0081. Para laRANKL008a trivalenteadministradoporviaintravenosa(5mg/kg),secalcularonvaloresmediossustancialmente menores de aclaramiento (9,00ml/h/kg) y Vdss. Las semividas terminales eran apreciablemente mas largas (12,6horas).EstoseexplicaporelhechodequeRANKL008a esun Nanobodydesemividaextendida(atravesde launionalcomponente ALB8) que produce reaccion cruzada con albumina de rata,pero con menor afinidadcon relacionaalbuminasericahumana.
Despues de laadministracioni.t.de NB2 deVRS (3,6mg/kg),ALX-0081 (3,1mg/kg)yRANKL008a (3,2mg/kg),se observaron semividasterminalescomparables en elplasma para lostresNanobodies (NB2 deVRS: 9,48h,ALX-0081: 10,5hyRANKL008a: 13,0h).Para NB2 deVRS yALX-0081, lassemividasson mas largasdespues de la administracion i.t. que despues de la administracion i.v. Resulta concebible que para estos compuestos de aclaramientorapido,laabsorcioneslaetapalimitantedelavelocidad,loquedacomo resultadounacineticadetipo f l i p - f l o p (esdecir,lacineticaestacontroladaporlavelocidaddeabsorcion)ylafaseterminalseimpulsaporlalenta absorciondesdeelsitiodeadministracion(elpulmon)alacirculacionsistemica.
Laexposiciondespues de laadministracioni.t.fuemenor paratodoslosNanobodies encomparacion condespues de laadministracion i.v.Estas biodisponibilidadesresultantesfuerondel22,1%, el13,9% yel6,9% para NB2 de VRS (16,6kD),ALX-0081 (27,9kD)yRANKL008a (40,9kD),respectivamente.
Para lasaplicacionestopicasen pulmon (NB2 deVRS), se desea una altaexposicion pulmonar. Podfa esperarse queunaabsorcionmas rapidaymas completa(quedacomo resultadounamayorbiodisponibilidad)nobeneficiana laexposicion pulmonar. Portanto,losNanobodies de VRS con un mayor peso molecular(p.ej.,un Nanobody de VR S trivalente) podnan conducir posiblemente a exposiciones locales (pulmonares) aumentadas.
Los datos actuales indican que puede lograrse la exposicion sistemica a Nanobodies despues de la administracion intratraqueal, lo que sugiere que la via pulmonar puede ser viable como metodo no invasivo de administracion de 5 Nanobodies. En particular, el uso de formulaciones y/o dispositivos de administracion espedficos podna mejorar significativamente la biodisponibilidad despues de la aplicacion pulmonar. Se sugiere que puede mejorarse la biodisponibilidad aproximadamente 5 veces (via i.t. frente a aerosol, vease por ejemplo la tabla 2 en Patton J., Fishburn S., Weers J. 2004, The Lung as a Portal of Entry for Systemic Drug Delivery. Proc. Am. Thorac. Soc. 1: 338-344).
10
C o n c e n t r a c i o n e s e n L L B A d e N B 2 d e V R S , A L X - 0081 y R A N K L 008 a
Los perfiles de concentracion en LLBA media observada-tiempo despues de una unica administracion intratraqueal de NB2 de VRS, ALX-0081 y RANKL008a a ratas macho se muestran en lafigura 21. Las concentraciones en LLBA 15 individuales y medias se enumeran en las tablas C-23 y C-24, respectivamente.
Las semividas terminales de los tres Nanobodies en LLBA se basaron en los dos ultimos puntos de datos solamente. Tambien es de interes que hubo bastante variabilidad interindividual tal como se indica mediante las grandes desviaciones estandar (vease la tabla C-24). Despues de la administracion i.t.,se observaron semividas terminales 20 comparables en plasma (NB2 de VRS 9,48 h, ALX-0081 10,5 h y RANKL008a 13,0 h) y en LLBA (NB2 de VRS 16,0 h, ALX-0081 9,21 h y RANKL008a 11,6 h), lo que respalda la nocion de que es probable que la cinetica plasmatica este controlada por lavelocidad de absorcion.
Tras la administracion intratraqueal, se observo la exposicion a Nanobody NB2 de VRS, ALX-0081, RANKL008a en 25 LLBA durante al menos 24 horas (es decir, el ultimo tiempo de toma de muestras para LLBA).
C a n t i d a d e s d e N B 2 d e V R S , A L X - 0081 y R A N K L 008 a e n L L B A
Despues de la dosificacion intratraqueal, se extrajo lfquido de lavado broncoalveolar (LLBA) en la autopsia tal como 30 se describio anteriormente en detalle.
Teoricamente, la cantidad de Nanobody en el pulmon en un punto de tiempo dado puede obtenerse multiplicando la concentracion medida de cada muestra de LLBA por el volumen de DPBS anadido (10 ml), siempre que el Nanobody se retire eficazmente por lavado. Estas cantidades calculadas individuales y sus valores medios 35 correspondientes (+D.E.) se enumeran en las tablas C-25 y C-26, respectivamente.
Observese sin embargo que se produjeron grandes variaciones en la recuperacion del LLBA. Para algunos animales, fue posible recuperar 9,5 ml de lfquido despues de inyectar 10 ml de DPBS, mientras que para otros animales solamente se recuperaron 3 ml. Ademas, puesto que se realiza dos veces el lavado y se combinan, en un 40 unico vial, es imposible determinar cuanto volumen se recupero del primer o el segundo lavado por separado.
Ademas, tambien se desconoce si existen diferencias en laconcentracion del primer y el segundo lavados.
El resultado es que pueden producirse sobreestimaciones de la verdadera cantidad de Nanobody cuando simplemente se multiplican las concentraciones en LLBA medidas por elvolumen teorico de 10 ml de DPBS.
45
Alternativamente, si se estima la cantidad de Nanobody multiplicando la concentracion medida de cada muestra de LLBA por el volumen realmente recuperado de LLBA, esto puede dar como resultado subestimaciones de la cantidad real de Nanobody en caso de que esten presentes cantidades significativas de Nanobody en LLBA no recuperado.
50
Por tanto, la verdadera cantidad de Nanobody en LLBA debe estar comprendida teoricamente entre la cantidad calculada mediante el volumen teorico de LLBa o el volumen real de LLBA. Es importante observar que cuanto mayor es elvolumen recuperado, mas precisos se espera que sean los calculos. Puesto que elvolumen recuperado promedio es, en promedio, de aprox. 7 ml (tabla C-27), ambos metodos de calculo no deben proporcionar resultados 55 muy diferentes. Los valores medios (+D.E.) y las cantidades calculadas individuales basadas en volumenes recuperados reales se enumeran en lastablas C-28 y C-29, respectivamente.
Dividiendo la cantidad calculada de Nanobody entre la cantidad real dosificada (NB2 de VRS: 1,14 mg, ALX-0081: 0,985 mg, RANKL008a: 1,03 mg), se calculo la fraccion recuperada de la dosis. Expresadas como porcentaje, las 60 cantidades calculadas individuales normalizadas para la dosis y sus valores medios correspondientes (+D.E.) basados en elvolumen teorico de LLBA (10 ml) y los volumenes recuperados reales se enumeran en lastablas C-30 a C-33.
Dividiendo la cantidad calculada de Nanobody entre la cantidad real dosificada, pudo compararse la fraccion 65 recuperada de la dosis a lo largo del tiempo: la mayor cantidad media con respecto a porcentajes de dosis a traves del volumen real y teorico son del 35,7 % y el 49,5 % para NB2 de VRS (despues de 20 minutos), el 74,0 % y el 98,3% para ALX-0081 (despues de 4 minutes) y el 47,1 % y el 67,4% para RANKL008A (despues de 1 hora), respectivamente. Por tanto, para ALX-0081 pudo recuperarse casi la fraccion total de la dosis en el LLBA, mientras que para NB2 de VRS y RANKL008a, la fraccion fue menor: aproximadamente el 50 % de la dosis. La mayor cantidad individual con respecto a porcentajes de dosis a traves del volumen real y teorico son del 76,6 % y el 117.3 % para NB2 de VRS, el 145 % y el 182 % para ALX-0081 y el 84,1 % y el 120 % para RANKL008a en el punto de tiempo de 1 hora tras la dosis. Tal como se esperaba, la variabilidad fue apreciable.
Despues de 24 horas, la fraccion de la dosis recuperada en LLBA fue menor para todos los Nanobodies que en los puntos de tiempo anteriores. La fraccion media recuperada oscilo entre el 12,4 % y el 16,5 % a traves del volumen teorico y oscilo entre el 8,46 % y el 12,5 % a traves de los volumenes reales para los tres Nanobodies sometidos a prueba.
28.3 Conclusiones
Despues de la administracion i.v. a ratas, se observaron caractensticas PK similares para NB2 de VRS y ALX-0081. Para RANKL008a, se observaron valores sustancialmente menores de aclaramiento y semividas terminales mas largas. Esto puede explicarse por la union del Nanobody anti-HSA de RANKL008a a albumina de rata.
Los datos actuales indican que puede lograrse la exposicion sistemica a Nanobodies despues de la administracion intratraqueal, lo que sugiere que la via pulmonar puede ser viable como metodo no invasivo para la administracion de Nanobodies. Los datos limitados tambien sugirieron que la biodisponibilidad sistemica parece disminuir con el peso molecular creciente.
Despues de la administracion i.t., se observaron semividas terminales comparables para los tres Nanobodies. Para NB2 de VRS y ALX-0081, las semividas son mas largas despues de la administracion i.t. que despues de la administracion i.v., lo que sugiere que la absorcion es la etapa limitante de la velocidad porque el farmaco se absorbe lentamente desde su sitio de dosificacion (es decir, el pulmon) a la circulacion. Se observan semividas terminales comparables tanto en plasma como en LLBA. Esta observacion aumenta ademas la posibilidad de que la cinetica pueda estar controlada por la velocidad de absorcion.
Tras la administracion intratraqueal, se observo exposicion a Nanobody NB2 de VRS, ALX-0081, RANKL008a en LLBA durante al menos 24 horas (es decir, el ultimo tiempo de toma de muestras para LLBA).
Tras la administracion intratraqueal, se observo exposicion sistemica a Nanobody NB2 de VRS, ALX-0081 Nanobody en plasma durante al menos 24 horas (es decir, el ultimo tiempo de toma de muestras de plasma despues de la administracion intratraqueal. Tras la administracion i.v. ambos de estos Nanobodies sin actividad anti-HSA ya no se pudieron detectar a las 24 horas.
La figura 22 y la figura 23 ilustran adicionalmente los resultados experimentales.
Ejemplo 29: Estudios adicionales con un constructo de Nanobody anti-VRS
Ejemplo 29.1:- estudio profilactico con RSV407 en rata algodonera
En este estudio, se tratan ratas algodoneras o bien por via i.m. o bien por via intranasal con constructos de Nanobody neutralizantes de VRS (RSV407; SEQ ID NO: 2415) o control (p Bs ). Se administra la exposicion viral a VRS por via intranasal 1 hora mas tarde. En el dfa 4, se sacrifican los animales y se determinan los tttulos de VRS mediante Q-PCR en lavados nasales y de pulmon asf como en tejido nasal y de pulmon.
Ejemplo 29.2 - estudio terapeutico con RSV407 en rata algodonera
Se han descrito estudios terapeuticos con VRS en el pasado; por ejemplo por Crowe y colaboradores (1994, Proc. Nat. Ac. Sci.; 91: 1386-1390) y Prince y colaboradores (1987, Journal of Virology 61:1851-1854).
En este estudio, se infectan ratas algodoneras por via intranasal con VRS. Veinticuatro horas despues de la infeccion, se trata un primer grupo de animales con constructos de Nanobody neutralizantes de VRS (RSV407) o control (PBS). Se administra el tratamiento al tejido pulmonar mediante administracion intranasal o en aerosol. Se repite el tratamiento a las 48 y 72 horas. En el dfa 4 se sacrifican los animales y se determinan los tftulos de VRS mediante Q-PCR en lavados nasales y de pulmon asf como en tejido nasal y de pulmon.
En el segundo grupo, solamente se inicia el tratamiento 3 dfas despues de la infeccion y se repite en los dfas 4 y 5. Finalmente, en dfa 6 se sacrifican los animales y se determinan los tftulos de VRS mediante Q-PCR en lavados nasales y de pulmon asf como en tejido nasal y de pulmon.
Ejemplo 29.3 - Pulmon a sistemico
En esteestudio,seexpone eltejidode pulmon de ratasaun Nanobody neutralizantedeVRS (RSV407) mediante administracionintratraquealoen aerosol.Setoman muestrasdesueroyLBA en puntosdetiemporegulareshasta 3dfas despues de laadministracion. Se mide laconcentracion de Nanobody pormedio de ELISA y se someten muestrasamicroneutralizaciondeVRS talcomosedescribeenelejemplo11.Combinando lainformaciondeELISA yelensayodeneutralizaciondelVRS, puededeterminarselaCI50 decadamuestraparaevaluarlabiodisponibilidad sistemicadeNanobodycontraVRS funcional.
Ejemplo30:Procedimientosdeexamen paracelulasHep2 infectadasconB-1deVRS
Ademas de laidentificacion de Nanobodies que son potentes neutralizadores de lacepa Long de VRS en un microensayo de neutralizacion, los Nanobodies tambien pueden examinarse para determinar su capacidad para neutralizar B-1 de VRS. Se sometieron los clones obtenidos de selecciones contra la protema F y VRS, espedficamente de elucionescontripsina,elucioncompetitivacon Fab de 101F ocon peptidoslineales(veaseel ejemplo14),aunprocedimientodeexamen alternativoqueincluyolaunionalaprotemaFdeB-1deVRS.
Como primeretapa, se analizaron aproximadamente 1000 extractos periplasmaticos para determinarlaunion a la protemaFt m -NN (1|ig/ml)enELISA(veaseelejemplo16).En promedio,el44% detodoslosclonesseidentificaron como agentesdeunion(>2vecesporencimadelfondo),identificandoseel27% comofuertesagentesdeunion(>3 veces).Solamenteel10% detodoslosagentesdeunionseoriginaronapartirdelasllamas212y213.
SesometieronlosagentesdeunionaunELISAdecompetenciaconSynagis®(67pM)porlaunionaLongdeVRS (10|ig/ml;Hytest#8RSV79) paraidentificarclonesde laclase Ide epftopos.Se realizoladeteccionde Synagis® usando IgG de cabra anti-humano conjugado con HRP (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., n.°de cat.
109-035-098).Esteensayodiocomo resultado9coincidencias(tablaC-34).
De manera similar,se analizaron extractos periplasmaticos en un ELISA de competencia con Fab de 101F para identificarclonesde lasclases IV-VIde epftopos(veaseelejemplo 16).Se realizoladeteccion usando anticuerpo monoclonalanti-HA(Zymed,32-6700,1389267),seguidoporanticuerpoanti-ratonconjugadoconHRP (Dako,n.°de cat. P0260). De los 90 competidores identificados, los mejores competidores de Fab de 101F se sometieron a prueba adicionalmente en dilucionesque oscilaronentre 1/100-1/1000 para permitirladiferenciacionentreclones (tablaC-34).
Como terceraetapa,seanalizaronlosclonesdeepftopodeclasesIyIV-VIparadeterminarlaunionacelulasHep2 infectadas con cepas B-1 de VRS. En este ensayo, se sembraron celulas Hep2 en placas de 96 pocillosy se infectaron con una cepa B-1 de VRS, esencialmente siguiendo el procedimiento descrito para el ensayo de neutralizacion(veaseelejemplo11).Despuesdetresdfas,sefijaronlascelulasconacetonaenfriadaconhieloyse usaron las placas en un ensayo ELISA usando extractos periplasmicos preparados a diferentes diluciones. Se detecto la union de Nanobody a celulas infectadas Hep2-B1 usando anticuerpo policlonal de conejo anti-VH H, seguidoporanticuerposdecabraanti-conejoconjugadosconHRP, despuesdequesedesarrollaseunELISAsegun procedimientosconvencionales.Engeneral,losclonesdeepftopodeclaseIdemostraronseragentesdeunionmas debilesacelulasHep2-B1 quelosclonesdelasclasesIV-VIdeepftopos(tablaC-34).
ElanalisisdesecuenciaredujoelnumerototaldeNanobodiesencompetencia.Se hallaronlosclones8A1 (SEQ ID NO:249), 8B10 (SEQ IDNO: 342)y1B2 (SEQ IDNO: 166)como multiplescopiasque seclasificarontodasentre losagentes de union mas fuertesa celulasinfectadascon Hep2 B-1. Elclon 1B2 era identicoa lasecuencia del 191E4identificadopreviamente.19E2desecuenciaunica(SEQ IDNO: 301)pertenecealagranfamilia4.Delgrupo decompetidoresdeSynagis®, losclones 19C4(tambiendenominado 15h8;SEQ IDNO: 371)y1G8 (SEQ IDNO: 2578)fueronlosmejoresagentesdeunionaB-1 deVRS. Basandoseenlauniontantoalongcomo aB-1deVRS, en lasecuencia, yen lacompetencia con 101F, se realizouna seleccion de competidores de 101F para analisis adicionalcomo protemaspurificadas(tablaC-34).
Ejemplo31:GeneraciondeconstructosdeNanobody
Para laexpresion de losconstructosde Nanobody, se usa elGS Gene Expression System™ de Lonza (Basilea, Suiza), que comprende la lmea celular CHOK1SV adaptada a suspension y libre de suero y el plasmido de expresionpEE12.4. ElpuntodepartidadelaconstrucciondelosconstructosdeNanobodyeslatraduccioninversa delasecuenciadeaminoacidosparadarlasecuenciadenucleotidoscorrespondiente,optimizadaparalaexpresion en una lmea celular CHO. Esta optimizacion para la expresion puede realizarse, por ejemplo, por GeneArt (Ratisbona, Alemania) o por otras empresas especializadas en smtesis de genes. En elextremo N-terminal del constructo de Nanobody, se anade una senal de secrecion generica, que permite que se exporte la protema endogena al medio de crecimiento y que se escinda tras lasecrecion fuera de lacelula. Tal secuencia senal generica puede ser,porejemplo, lasecuencia ftderde cadena pesada murina, lasecuencia ftderde cadena ligera murina,cualquierotrasecuencia ftderdecadena pesada oligeradeanticuerpo, lasenalde secrecionde IL-2,etc., talcomo seconocenenlatecnica.Opcionalmente,en5'conrespectoalextremodelasenaldesecrecionseanade una secuencia Kozak optimizada, que inicialatraduccion eficaz a partirdeltranscrito de ARNm. La secuencia consenso recomendada por Lonza consiste en 9 meros (5'-GCCGCCACC-3'; SEQ ID NO: 2638), y precede directamente al codon de iniciacion ATG. El constructo de Nanobody esta terminado por un doble codon de terminacionparaaumentarlaeficienciadetraducciondelconstructo.
Elconstructode Nanobody que incluyatodaslascaractensticasmencionados anteriormenteseclonanormalmente en los sitios de clonacion H i n dlll/E c o Rl; lo que requiere la ausencia de estos sitios dentro del constructo de Nanobody. La clonacion en lossitios H i n dlll/E c o RI en elplasmido pEE12.4 da como resultado laretirada de la mayor parte del sitio de clonacion multiple. Se transforma el plasmido recombinante en una cepa de E . c o l i apropiada(porejemplo,TOP10), yseseleccionanclonespositivosmedianteampicilinaocarbenicilinaen elmedio decrecimiento.Seamplificaelplasmidoyseafslausandounkitdeaislamientodeplasmidos.
Paratransfectarlascelulas,selinealizaelADN deplasmidorecombinante,porejemplo,mediantedigestionconuna endonucleasaderestriccion(porejemplo, P v u l) quecortaelADN solamenteunavez; estofacilitalarecombinacion delADN deplasmidoenelgenomadelascelulas.Se mantienencelulasCHOK1SV reciendescongeladasencultivo (por ejemplo, en medio CD CHO, lnvitrogen) y se expanden. Se somete a electroporacion una alfcuota de aproximadamente 2*107celulas con 40|ig de plasmido linealizado, usando por ejemplo, el dispositivo de electroporacion BioRad (Bio-Rad Gene Pulser, Hercules,CA). Se resuspenden lascelulastransfectadasen medio CD CHO ydespues de 1dfaseponen bajopresionselectiva,porejemplo, en medio deficienteen glutamina. Para aumentar lapresion selectiva, se complementa elmedio con metionina-sulfoximina66,6|iM despues de 1dfade cultivo. Se mantienen las celulas bajo presion selectiva, y se permite que se expandan, o bien como clones monocelulares(despuesde dilucionlimitante),obiencomo cultivodiscontinuo.Luego sedeterminanlosnivelesde expresiondelaprotemarecombinantemediante,porejemplo,unELlSAdeunion.
La region bisagra de lgG1 entre elNanobody y eldominio constante CH2-CH3 de inmunoglobulina lgG1 puede extenderseopcionalmentemediante un ligador9GS (GGGGSGGGS; SEQ lDNO: 2639)o intercambiarseporotra region bisagra, por ejemplo, como la derivada de lgG3 (ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCP RCP; SEQ lDNO: 2640). En unformatoenelqueunNanobody precedeyotroNanobodysiguealdominioFcde lgG,elsegundoNanobody C-terminal puede fusionarse al dominio Fc o bien directamente (sin ligador) o bien, por ejemplo, mediante un ligador9GS.
LasrealizacionesnolimitativasdelconstructodefusiondeNanobody-Fcincluyen:
(1)NC41:15GS:NC41:G1-region bisagra:lgG1-Fc
(2)NC41:15GS:NC41:9GS-G1-regionbisagra:lgG1-Fc
(3)NC41:15GS:NC41:G3-region bisagra:lgG1-Fc
(4)NC41:G1-regionbisagra:lgG1-Fc:NC41
(5)NC41:9GS-G1-region bisagra:lgG1-Fc:NC41
(6)NC41:G3-regionbisagra:lgG1-Fc:NC41
(7)NC41:G1-regionbisagra:lgG1-Fc:9GS:NC41
(8)NC41:9GS-G1-region bisagra:lgG1-Fc:9GS:NC41
(9)NC41:G3-regionbisagra:lgG1-Fc:9GS:NC41
(10)NC41:G1-regionbisagra:lgG1-Fc:15B3
(11)NC41:9GS-G1-region bisagra:lgG1-Fc:15B3
(12)NC41 G3-regionbisagra:lgG1-Fc:15B3
(13)NC41:G1-regionbisagra:lgG1-Fc:9GS:15B3
(14)NC41:9GS-G1-region bisagra:lgG1-Fc:9GS:15B3
(15)NC41:G3-regionbisagra:lgG1-Fc:9GS:15B3
(16)NC41:NC41:lgG1-Fc
(17)NC41:lgG1-Fc:NC41
(18)191D3:15GS:191E4:G1-regionbisagra:IgG1-Fc
(19)191D3:15GS: 191E4:9GS-G1-regionbisagra:IgG1-Fc
(20)191D3:15GS: 191E4:G3-regionbisagra:IgG1-Fc
(21)191D3:G1-regionbisagra:IgG1-Fc:NC41
(22)191D3:9GS-G1-regionbisagra:IgG1-Fc:191E4
(23)191D3:G3-regionbisagra:IgG1-Fc:191E4
(24)191D3:G1-regionbisagra:IgG1-Fc:9GS: 191E4
(25)191D3:9GS-G1-regionbisagra:IgG1-Fc:9GS: 191E4
(26)191D3:G3-regionbisagra:IgG1-Fc:9GS: 191E4
(27)191D3: 191E4:IgG1-Fc
(28)191D3:IgG1-Fc:191E4
Se proporcionan ejemplos no limitativosde constructosde Nanobody de lainvenciontambien en lafigura24. Las secuencias de los constructos (1)-(28) anteriores se proporcionan en latabla A-4 a continuacion. Tambien se muestraunasecuenciadeacidonucleicocorrespondientea(16)y(17)conunusodecodonesalazarenlatablaA-4a continuacion.
Ejemplo32:EvaluaciondelaresistenciaproteoliticadeNanobodycontraVRS bivalenteenpulmonesderaton SeevaluolaresistenciaproteolfticadelRSV101 bivalente(191D3-15GS-191D3; SEQ IDNO:2382)enpulmonesde raton mediante analisis de homogeneizados de pulmon de raton y se compararon con elNanobody de control 12B2biv.
Se administroelNanobody a ratones5horasantesde lasinfeccionescon VRS. Se extirparonlospulmonesyse homogeneizaron 3o5dfasdespues de lainfeccionconVRS. Brevemente, sehomogeneizaron lospulmones de5 ratones y se anadieron 40|il de SDS-tampon de muestra (6x Laemli / p-mercapto al 20%) a 200|il de homogeneizado. Como control positivo, se usaron 100ng de RSV101 (0,1mg/ml) en PBS para obtener una disolucion 10|ig/ml (5|ilde NB2biv 45|ilde PBS 25|ilde SB (Invitrogen NP0008; lote 401488) DTT (10mg/ml)).
Secargaron24|il(=20|ildehomogeneizadodepulmon)demuestrasy15|ildecontrolpositivoenungelal12% (NuPAGE Bis-Tris Invitrogen NP0341BOX; lote 8031371) y se hicieron correr durante 45min a 200V. Como marcador, se uso Precision Plus Dual Color Protein Standard (Biorad; 161-0374). Despues de laejecucion, se transfirioelgela una membrana de nitrocelulosa(sistemade transferencia en seco Invitrogen iblot;programa 2: 6min a23V)yse bloqueo contampon de bloqueo Odyssey (Li-cor927-40000; lote2782) durante 1haT.A. Se realizarontodas lasetapas de incubacion ylavado en una placagiratoria(100rpm). Se incubo lamembrana con antisueropoliclonaldeconejoK1 (comoanticuerpoprimariodiluido1/1000entampon debloqueoOdyssey)durante 1h aT.A.Se llevoacaboellavado3vecesdurante5minconPBS /Tween20 al0,1%. Se realizoladeteccioncon IgG de cabra anti-conejo (H+L)-Dilight800 (Pierce 35571; lote IH112638; diluido 1/10000 en tampon de bloqueo Odyssey)durante1haT.A.Se llevoacaboellavadoposterior3vecesdurante5minconPBS /Tween20al0,1%. Se barriolamembrana con elsistemaOdyssey Infrared Imager(enelcanal800)(sensibilidaden Odyssey: lineal manual4;LicorBiosciences).
Se muestran losresultadosde lainmunotransferenciadetipoWestern en lafigura25. Se detecto bienelcontrol positivomedianteelantisueroK1.TambiensedetectoRSV101 enloshomogeneizadosdepulmon,sinembargocon menorintensidad.
SerealizoladeterminaciondelaconcentracionconelsoftwareOdysseyv3.0(figura28ytablaC-51).
Ejemplo33:NeutralizaciondemutantesdeescapedelacepaLongporNanobodiesformateados
En losejemplos23 y24, se ha descritolaunion de Nanobodies monovalentes amutantes de escape de VRS de sitioantigenicoIy/oIV-VItfpicos.LauniondeNanobodies quereconocenespedficamenteestossitiosantigenicos casiseperdiooseredujosignificativamente.ElformateodeestosNanobodiesparadarconstructosbiotrivalentes restauroparcialmentelaactividaddeunionperonoparalostresvirusdemutantesde escape. Launionalmutante de escape R7C2/1 (mutacion K272E en el sitio antigenico II)permanecio por debajo del nivel del 25% para cualquier constructo bi o trivalente que consistfa solamente en Nanobodies que se unen al sitio antigenico II. Los Nanobodies 15B3 y 191E4, que se unen al sitio antigenico IV-VI, fueron los unicos Nanobodies (tal cual o en constructos biparatopicos) capaces de unirse a este mutante en un nivel del 75 % o mas.
Analisis mas detallados de los datos indicaron que aumento ligeramente la union a R7C2/1 cuando aumento la Valencia del Nanobody. La union de constructos 7B2 fue del 0, el 4,4 y el 13 %, respectivamente, para los formatos monovalente, bivalente (RSV106) y trivalente (RSV400). Se espera que un nivel tan bajo de union residual de como resultado una perdida muy alta de potencia para neutralizar VRS.
Se evaluo la potencia neutralizante de los Nanobodies en el mismo conjunto seleccionado de mutantes de escape tal como se describe en el ejemplo 24. Con este proposito, se compararon los Nanobodies monovalentes 7B2, 15H8 y NC41 con sus respectivos homologos trivalentes, SRV400, SRV404 y SRV407. Cabe observar que en el ejemplo 24 solamente se evaluo RSV400 para determinar la union de estos mutantes de escape. Ademas tambien se analizo la molecula biparatopica trivalente RSV403 (7B2-15B3-7B2) para determinar su capacidad neutralizante.
Se realizo esencialmente el microensayo de neutralizacion de VRSh tal como se describe en el ejemplo 11. Brevemente, se sembraron celulas Hep2 a una concentracion de 1,5 * 104 celulas/pocillo en placas de 96 pocillos en medio DMEM que contema suero de ternero fetal (FCS) al 10% complementado con penicilina y estreptomicina (100 U/ml y 100 |ig/ml, respectivamente) y se incubo durante 24 horas a 37 °C en una atmosfera con el 5 % de CO2. Se prepararon reservas virales de diferentes virus en celulas Hep2 y posteriormente se titularon para determinar la dosis infecciosa optima para su uso en el microensayo de neutralizacion. Se preincubo una cantidad convencional de la cepa de VRSh espedfica con diluciones en serie de Nanobodies purificados en un volumen total de 50 |il durante 30 minutos a 37 °C. Se reemplazo el medio de las celulas Hep2 por la premezcla para permitir la infeccion durante 2 horas, despues de que se anadieron 0,1 ml del medio de ensayo. Se realizo el ensayo en medio DMEM complementado con suero de ternero fetal al 2,5% y penicilina y estreptomicina (100 U/ml y 100 |ig/ml, respectivamente). Se incubaron las celulas durante 72 horas mas a 37 °C en una atmosfera con el 5 % de CO2 , despues de que se lavaran las celulas dos veces con Tween-20 al 0,05 % en PBS y una vez con PBS solo, despues de que se fijasen las celulas con acetona fria al 80 % (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) en PBS (100 |il/pocillo) durante 20 minutos a 4 °C y se dejo que se secasen por completo. A continuacion, se detecto la presencia de la protema F en la superficie celular en un ensayo de tipo ELISA. Para ello, se bloquearon las celulas Hep2 fijadas con disolucion de albumina serica porcina al 5 % en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente, luego se incubo durante 1 hora con suero policlonal de conejo anti-protema F (Corral et al. 2007, BMC Biotechnol. 7: 17) o Synagis® (2 |ig/ml). Para la deteccion, se usaron anticuerpos de cabra anti-conejo conjugados con HRP o anticuerpos de cabra espedficos anti-fragmento Fcy de IgG humana-HRP (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), despues de lo cual se desarrollo un ELISA segun procedimientos convencionales.
Tal como se muestra en las figuras 26 A-C, los Nanobodies monovalentes no teman casi potencial neutralizante hacia los virus de mutante de escape de sitio antigenico II, R7C2/11 y R7C2/1. La potencia para neutralizar la variante de sitio antigenico IV-V, R7.936/4, fue comparable a la potencia para neutralizar la cepa Long de tipo natural. Estos datos estan en lmea con los datos de union del ejemplo 23 y el mapeo de epítopos tal como se describe para estos Nanobodies en el ejemplo 16.
Sin embargo, las moleculas trivalentes eran neutralizantes de manera potente para los 3 mutantes de escape (figuras 26D-G). Se observo la inhibicion maxima a concentraciones de tan solo aproximadamente 20 nM mientras que no se observo este nivel de inhibicion para los Nb monovalentes a concentraciones de hasta 2 |iM. La potente neutralizacion de R7C2/1, casi equivalente a la neutralizacion de R7C2/11, es lo mas sorprendente puesto que el ejemplo 24 mostro una perdida muy significativa de actividad de union para la molecula trivalente RSV400 que se esperaba que diese como resultado una perdida muy alta de potencia de neutralizacion.
La IgG bivalente palivizumab (Synagis®), que tambien reconoce el sitio antigenico II no fue capaz de bloquear la replicacion de R7C2/1 o R7C2/11 significativamente a concentraciones de aproximadamente 0,2 |iM. A esta concentracion, no se alcanzo la CI50 mientras que el virus Long de tipo natural y R7.936/4 se neutralizaron con una CI50 de unos pocos nM (datos no mostrados).
Ejemplo 34: Optimizacion de la longitud de ligador de constructos trivalentes de NC41
Para determinar el impacto de la longitud de ligador de constructos trivalentes de NC41, se generaron diferentes constructos con ligadores que iban de 3Ala, 9GS, 15GS, a ligadores 20GS (RSV408, RSV409, RSV407 y RSV410 resp.). Los cuatro constructos trivalentes de NC41 fueron capaces de neutralizar por completo tanto cepas B-1 como Long de VRS (figuras 34A y B). No se observo ningun efecto de la longitud de ligador sobre la neutralizacion de Long de VRS, ya que todos los constructos eran igualmente potentes. En cambio, los constructos con ligadores 9GS y 3Ala teman valores aumentados de CI50 en la cepa B-1, lo que indica que se requiere una longitud de ligador minima de 15GS para una potencia maxima. Esto puede explicarse por la observacion de que los constructos bivalentes de NC41 ya son neutralizadores muy potentes con Long, mientras que con la cepa B-1 la diferencia de potencia entre constructos bivalentes y trivalentes de NC41 es mucho mayor (vease el ejemplo 21). En RSV408 y RSV409, la accesibilidad del Nanobody central puede ser menos optima.
Ejemplo 35: Humanizacion del Nanobody NC41
5 Se alineo la secuencia de Nanobody NC41 con la lmea germinal humana VH3-23. para permitir la seleccion de residuos adecuados para la humanizacion adicional de la secuencia de Nanobody. Ademas, se realizo un analisis i n s i l i c o para identificar residuos que son potencialmente propensos a modificaciones postraduccionales, tales como isomerizacion de Asp, y para identificar mutaciones que podnan mejorar la estabilidad qmmica. Las regiones C D R y los denominados residuos distintivos, que se sabe que son esenciales para la estabilidad y potencia de Nanobodies 10 se excluyeron de la modificacion.
Para NC41, se seleccionaron en total 11 posiciones para la mutacion al residuo humano correspondiente: se introdujeron simultaneamente cuatro mutaciones (Val5Leu, Ala14Pro, Glu44Gly, Gln108Leu), ya que no se esperaba que estos residuos afectaran drasticamente a la funcion del Nanobody (basandose en datos de otros Nanobodies).
15 En esta variante basica, se mutaron siete residuos de los que se desconoda si estaba permitida la mutacion al homologo humano (Ser19Arg, Ile20leu, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Arg105Gln) usando un enfoque de biblioteca, permitiendo o bien el aminoacido de tipo natural o bien el humano correspondiente en cada posicion. Se genero la biblioteca resultante, con una diversidad teorica de 128, mediante ensamblaje genico usando secuencias de oligonucleotidos solapantes que conteman un uso de codones degenerado, y posteriormente se 20 clonaron en un vector de expresion derivado de pUC119 que contema el promotor LacZ, un gen de resistencia para kanamicina, un sitio de clonacion multiple y la secuencia lfder OmpA. En marco con la secuencia codificante del Nanobody, elvector codificaba una cola de (His)6 y una etiqueta c-myc C-terminal. Se produjeron Nanobodies en el periplasma de E . c o l i (vease el ejemplo 18). Se confirmo la diversidad de la biblioteca mediante analisis de secuencia.
25
Se prepararon extractos periplasmicos a partir de 368 variantes de NC41 individuales y NC41 de tipo natural y se sometieron a una cascada de examen funcional para identificar la mejor variante de NC41 humanizada, en cuanto tanto a potencia como estabilidad.
30 En una primera etapa, se determino la union de VR S de variantes de NC41 humanizadas a Long de VR S en ELISA (Hytest, Turku Finlandia; #8RSV79)(vease el ejemplo 18).
Ademas, se analizaron los agentes de union positivos para determinar la union a celulas Hep2 infectadas con la cepa B-1 de VRS. En este caso, se sembraron celulas Hep2 en placas de 96 pocillos y se infectaron con la cepa B-1 35 de VRS, esencialmente siguiendo el procedimiento descrito para el ensayo de neutralizacion (veanse los ejemplos 11 y 17). Tres dfas mas tarde, se fijaron las celulas con acetona enfriada con hielo y se usaron las placas en un ensayo ELISA usando extractos periplasmicos preparados a diferentes diluciones. Se detecto la union de Nanobody a celulas infectadas Hep2-B1 usando anticuerpo policlonal de conejo anti-VHH, seguido por anticuerpos de cabra anti-conejo conjugados con HRP, despues de que se desarrollase un ELISA segun procedimientos convencionales.
40
Adicionalmente, para verificar si las mutaciones introducidas afectaban a la estabilidad frente a la temperatura, se calentaron extractos periplasmaticos de todos los agentes de union hasta 74 °C durante 2 horas, es decir 5 °C por encima de latemperatura de fusion de NC41 de tipo natural. Se analizo la union a long de VR S antes y despues del calentamiento en ELISA, y se tomo la razon de senal de union despues frente a antes del calentamiento como 45 medida para la estabilidad frente a latemperatura.
Finalmente, se determinaron las velocidades de disociacion cinetica de las variantes en un ensayo Biacore con la protema Ftm-NN, tal como se describe en los ejemplos 10 y 18.
50 Se secuenciaron todos los agentes de union y se clasificaron segun su capacidad para unirse a la protema F de VRS. Cuando se analizaron las secuencias de los agentes de union mas fuertes, se observo en todos los casos una clara preferencia por Gln105 (residuo humano). Mientras que la mutacion Ile20Leu pareda estar subrepresentada, para todas las demas posiciones no hubo una clara preferencia por o bien la secuencia de tipo natural o bien la secuencia humana, conteniendo las variantes hasta 10 mutaciones en comparacion con NC41 de tipo natural. En 55 particular, en una variante se observo una mutacion puntual adicional (Gly54Asp) dentro de la region CDR2. Esta variante, variante 6 de NC41, mostro la menor velocidad de disociacion de todas las variantes y NC41 de tipo natural, dando como resultado un aumento de afinidad.
Basandose en los datos de secuencia y funcionales, se seleccionaron 18 variantes (tabla A-6) para la 60 caracterizacion adicional como protemas purificadas (figura 35). Se produjeron y purificaron todas las variantes, y se determinaron las potencias para la neutralizacion de Long y B-1 de VRS en los microensayos de neutralizacion. Aunque la mayor parte de las variantes mostraron una actividad muy similar a NC41 de tipo natural, varias variantes mostraron una potencia aumentada tanto con Long (2 veces) como con B-1 (6 veces), siendo los neutralizadores mas fuertes las variantes 6, 8, 9 17 y 18 de NC41. En particular, la variante 18 se humanizo al maximo en las 11 65 posiciones, con la introduccion adicional de Asp54 en la region CDR2. Las variantes 10 y 11 fueron mas potentes en la neutralizacion de lacepa B-1 que NC41, pero no con la cepa Long.
Para un panel seleccionado de variantes de NC41, se determinaron los parametros de union cineticos en Biacore con la protema Ftm-NN (tabla C-52) tal como se describe en los ejemplos 10 y 18. No se observaron diferencias significativas en los datos calculados para NC41 y las variantes de NC41 humanizadas 6, 8 y 17. Debe indicarse que 5 las velocidades de asociacion de todas las variantes de NC41 estaban en el lfmite de deteccion del instrumento, pero las velocidades de disociacion pudieron clasificarse como v06 < v17<NC41<v08. Pudo demostrarse claramente el impacto de la mutacion de Gly a Asp en CDR2 (posicion 54) cuando se compararon v17 y v18 ya que esta es la unica diferencia en estas variantes humanizadas al maximo. Se sometio a prueba la neutralizacion tanto para la cepa Long como para lacepa B-1 en dos ensayos independiente en comparacion con NC41 de tipo natural tal como 10 se muestra en la tabla B-5. En ambos ensayos NC41v18 fue mas potente que NC41 con ambos virus y en ambos ensayos NC41v18 fue mas potente que NC41v17 con la cepa Long. Tambien se observo la neutralizacion mejorada de NC41v18 para la cepa B-1 en el segundo ensayo.
Se sometieron todas las variantes de NC41 a desplegamiento inducido por calor para evaluar el efecto de las 15 mutaciones introducidas sobre la estabilidad de la protema. Para ello, se determino la temperatura de fusion (Tm) mediante aumento escalonado de latemperatura en presencia de Sypro Orange, un colorante que se une a residuos de Trp que quedan expuestos tras el desplegamiento de la protema. Todas las variantes mostraron tener una T m aumentada con relacion a NC41 de tipo natural (69 °C), hasta 9 °C para lavariante 18.
20 Se formatearon tres variantes de NC41 como constructos trivalentes usando ligadores 15GS, lavariante 3 de NC41 (RSV414), la variante 6 (RSV426) y la variante 18 (RSV427). Se muestran las secuencias en la tabla A-7. Se produjeron y se purificaron todos los constructos trivalentes tal como se describe en el ejemplo 18. La figura 36 muestra la neutralizacion tanto con cepas Long como B-1 de VRS de dos de las variantes trivalentes de NC41 humanizadas con sus Nanobodies monovalentes correspondientes. Los constructos trivalentes de las variantes 3 y 6 25 fueron neutralizadores 81-91 veces mas potentes de Long que Synagis®, y similares al NC41 trivalente de tipo natural. Con la cepa B-1, RSV414 y RSV426 fueron neutralizadores ~16 veces mas potentes que Synagis, pero en este caso ambos tambien se vieron ligeramente potenciados en comparacion con el constructo trivalente de NC41 de tipo natural, RSV407. La potencia aumentada de las variantes 3 y 6 monovalentes para B-1 parece dar como resultado por tanto constructos trivalentes ligeramente mejorados.
30
Tablas
Tabla A-2: Secuencia de aminoacidos de constructos multivalentes que se unen a VRSh (incluyendo etiqueta Myc-His
Figure imgf000163_0001
Figure imgf000164_0001
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Figure imgf000167_0002
Tabla A-3: Secuencias de proteina F
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Tabla A-4: Secuencias de constructos de Fc multivalentes
Figure imgf000169_0001
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Figure imgf000175_0001
Tabla A-5: Secuencias de ligador
Figure imgf000175_0002
Tabla A-6 Secuencias de variantes de NC41 humanizadas
Figure imgf000176_0001
Figure imgf000176_0002
Tabla A-7: Secuencia de aminoacidos de constructos multivalentes humanizados que se unen a VRSh
Figure imgf000177_0001
Tabla A-8: Secuencia de aminoacidos de constructos multivalentes que se unen a VRSh
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Figure imgf000179_0001
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Figure imgf000181_0001
Figure imgf000182_0001
Tabla C-1: Union de Nanobodies seleccionados a protema Ft m - immovilizada en resonancia de plasmon superficial.
Figure imgf000182_0002
Figure imgf000183_0002
Tabla C-2 Clasificacion de proteinas de fusion viral basandose en los motivos estructurales de sus conformaciones tras la fusion
Figure imgf000183_0001
Tabla C-3: Analisis de secuencia de Nanobodies contra VRSh a partir de nuevas bibliotecas
Figure imgf000184_0002
Tabla C-4: Caracteristicas de Nanobodies que se unen a la protema F de VRSh
Figure imgf000184_0001
Tabla C-5: Nomenclatura para Nanobodies multivalentes dirigidos contra la protema F de VRSh
Figure imgf000185_0001
Tabla C-6 : Reactividad de Nanobodies monovalentes con extractos de antigeno de celulas HEp-2 infectadas con diferentes mutantes de escape de la cepa Long
Figure imgf000186_0001
Tabla C-7: Reactividad de Nanobodies monovalentes y Nanobodies bivalentes con extractos de antigeno de celulas HEp-2 infectadas con diferentes mutantes de escape de la cepa Long
Figure imgf000187_0001
Tabla C-8 : ARN genomico viral relativo en pulmones de ratones tratados 3 y 5 dias tras la inoculacion viral
Figure imgf000187_0002
Figure imgf000188_0007
Tabla C-9: Articulos de prueba para su uso en el estudio descrito en el ejemplo 28
Figure imgf000188_0005
Tabla C-10: Diseno del estudio para el estudio descrito en el ejemplo 28
Figure imgf000188_0006
Tabla C-11: LLOQ y ULOQ para determinacion de NB2 de VRS en muestras de plasma y LLBA de rata tal como se describe en el ejemplo 28
Figure imgf000188_0001
Tabla C-12: LLOQ y ULOQ para determinacion de ALX-0081 en muestras de plasma y LLBA de rata tal como se describe en el ejemplo 28
Figure imgf000188_0002
Tabla C-13: LLOQ y ULOQ para determinacion de RANKL008A en muestras de plasma y LLBA de rata tal como se describe en el ejemplo 28
Figure imgf000188_0003
Tabla C-14: Datos de concentracion plasmatica individual-tiempo de NB2 de VRS, ALX-0081 y RANKL008A despues de una unica dosis en bolo i.v. de NB2 de VRS (4 mg/kg), ALX-0081 (5 mg/kg) y RANKL008A (5 mg/kg), respectivamente a ratas Wistar macho
Figure imgf000188_0004
Figure imgf000189_0003
Tabla C-15: Datos de concentracion plasmatica individual-tiempo de NB2 de VRS, ALX-0081 y RANKL008A despues de una unica dosis i.t. de n B2 de VRS (3,6 mg/kg), AlX-0081 (3,1 mg/kg) y RANKL008A (3,2 mg/kg), respectivamente a ratas Wistar macho. Punto de tiempo de 6/8 h: 6 h para NB2 de VRS y ALX-0081, 8 h para RANKL008A
Figure imgf000189_0001
Tabla C-16: Datos de concentracion plasmatica media-tiempo de NB2 de VRS, ALX-0081 y RANKL008A despues de una unica dosis i.t. de Nb2 de VRS (3,6 mg/kg), ALX-0081 (3,1 mg/kg) y RANKL008A (3,2 mg/kg), respectivamente a ratas Wistar macho
Figure imgf000189_0002
Tabla C-17: Parametros farmacocineticos basicos individuales de NB2 de VRS, ALX-0081 y RANKL008A despues de una unica dosis i.v. de NB2 de VRS (4 mg/kg), ALX-0081 (5 mg/kg) y RANKL008A (5 mg/kg) a ratas Wistar.
Figure imgf000190_0001
Tabla C-18: Parametros farmacocineticos basicos medios de NB2 de VRS, ALX-0081 y RANKL008A despues de una unica dosis i.v. de NB2 de VRS (4 mg/kg), ALX-0081 (5 mg/kg) y RANKL008A (5 mg/kg) a ratas Wistar
Figure imgf000190_0002
Tabla C-19: Parametros farmacocineticos basicos de NB2 de VRS, ALX-0081 y RANKL008A despues de una unica dosis i.v. de NB2 de VRS (3,6 mg/kg), ALX-0081 (3,1 mg/kg) y RANKL008A (3,2 mg/kg) a ratas Wistar
Figure imgf000190_0003
Tabla C-20: Concentraciones en LLBA observadas individuales de NB2 de VRS, ALX-0081 y RANKL008A despues de una unica administracion intratraqueal de NB2 de VRS (3,6 mg/kg), ALX-0081 (3,1 mg/kg) y RANKL008A (3,2 mg/kg) a ratas macho
Figure imgf000191_0002
Tabla C-21: Concentraciones en LLBA observadas medias de NB2 de VRS, ALX-0081 y RANKL008A despues de una unica administracion intratraqueal de NB2 de VRS (3,6 mg/kg), ALX-0081 (3,1 mg/kg) y RANKLO08A (3,2 mg/kg) a ratas macho
Figure imgf000191_0001
Tabla C-22: Cantidad teorica individual (concentracion en LLBA x 10 ml) de NB2 de VRS, ALX-0081 y RANKL008A en LLBA despues de una unica administracion intratraqueal de NB2 de VRS (3,6 mg/kg), ALX-0081 (3,1 mg/kg) y RANKL008A (3,2 mg/kg) a ratas macho
Figure imgf000191_0003
Figure imgf000192_0003
Tabla C-23: Cantidad teorica media (+D.E.) (concentracion en LLBA x 10 ml) de NB2 de VRS (3,6 mg/kg), ALX-0081 (3,1 mg/kg) y RANKL008A (3,2 mg/kg) en LLBA despues de administracion intratraqueal
Figure imgf000192_0001
Tabla C-24: Volumen recuperado individual de LLBA despues de dos lavados con DPBS ( 2x5 ml) despues de una unica administracion intratraqueal de NB2 de VRS (3,6 mg/kg), ALX-0081 (3,1 mg/kg) y RANKLO08A (3,2 mg/kg) a ratas macho
Figure imgf000192_0002
Figure imgf000193_0002
Tabla C-25: Cantidad real individual (concentracion en LLBA x volumen recuperado) de NB2 de VRS, ALX-0081 y RANKL008A en LLBA despues de una unica administracion intratraqueal de NB2 de VRS (3,6 mg/kg), ALX-0081 (3,1 mg/kg) y RANKL008A (3,2 mg/kg) a ratas macho
Figure imgf000193_0003
Tabla C-26: Cantidad real media (concentracion en LLBA x volumen recuperado) de NB2 de VRS, ALX-0081 y RANKL008A en LLBA despues de una unica administracion intratraqueal NB2 de VRS (3,6 mg/kg), ALX-0081 (3,1 mg/kg) y RANKL008A (3,2 mg/kg) a ratas macho
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Tabla C-27: Cantidad teorica individual (concentracion en LLBA x 10 ml) normalizada segun la dosis (%) de NB2 de VRS, ALX-0081 y RANKL008A en LLBA despues de una unica administracion intratraqueal de Nb2 de VRS (3,6 mg/kg), ALX-0081 (3,1 mg/kg) y RANKL008A (3,2 mg/kg) a ratas macho
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Tabla C-28: Cantidad real individual (concentracion en LLBA x volumen recuperado) normalizada segun la dosis (%) de NB2 de VRS (3,6 mg/kg), ALX-0081 (3,1 mg/kg) y RANKL008A (3,2 mg/kg) en LLBA despues de administracion intratraqueal
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Figure imgf000195_0003
Tabla C-29: Cantidad teorica media (+D.E.) (concentracion en LLBA x 10 ml) normalizada segun la dosis (%) de NB2 de VRS (3,6 mg/kg), ALX-0081 (3,1 mg/kg) y RANKL008A (3,2 mg/kg) en LLBA despues de administracion intratraqueal
Figure imgf000195_0001
Tabla C-30: Cantidad real media (concentracion en LLBA x volumen recuperado) normalizada segun la dosis (%) de NB2 de VRS (3,6 mg/kg), ALX-0081 (3,1 mg/kg) y RANKL008A (3,2 mg/kg) en LLBA despues de administracion intratraqueal
Figure imgf000195_0002
Figure imgf000196_0001
Tabla C-32: Concentracion (ng) de Nanobody RSV101 o 12B2biv en los homogeneizados de pulmon de ratones inoculados con el Nanobody 3 y 5 dias despues de administrar el Nanobody e infeccion con VRS tal como se describe en el ejemplo 32.
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Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    Constructo trivalente que consiste esencialmente en tres dominios variables individuals de inmunoglobulina que pueden unirse espedficamente a la protema F de VRS, en el que los dominios 5 variables individuales de inmunoglobulina se unen espedficamente al mismo determinante antigenico, epttopo, parte o dominio de la protema F de VRS y consisten esencialmente en 4 regiones de entramado (FR1 a FR4, respectivamente) y 3 regiones determinantes de complementariedad (CDR1 a CDR3, respectivamente), en el que:
    10 (A)
    -CDR1 es lasecuencia de aminoacidos NYVLG (SEQ ID NO: 2595); y
    -CDR2 es lasecuencia de aminoacidos AINWRGDITIGPPNVEG (SEQ ID NO: 2611); y
    15
    -CDR3 es la secuencia de aminoacidos GTPLNPGAYIY DWSYD Y (SEQ ID NO: 2627); o
    (B)
    20 -CDR1 es lasecuencia de aminoacidos NYVLG (SEQ ID NO: 935); y
    -CDR2 es lasecuencia de aminoacidos AISFRGDSAIGAPSVEG (SEQ ID NO: 1499); y
    -CDR3 es la secuencia de aminoacidos GTPLNPGAYIY DWSYD Y (SEQ ID NO: 2063); o
    25
    (C)
    -CDR1 es lasecuencia de aminoacidos S Y A M G (SEQ ID NO: 918); y
    30 -CDR2 es lasecuencia de aminoacidos AIS WSDG ST YY ADS VK G (SEQ ID NO: 1482); y
    -CDR3 es lasecuencia de aminoacidos DLTSTNPGSYIYIWAYDY (SEQ ID NO: 2046).
    Constructo trivalente segun la reivindicacion 1, en el que los dominios variables individuales de 35 inmunoglobulina consisten esencialmente en 4 regiones de entramado (FR1 a FR4, respectivamente) y 3 regiones determinantes de complementariedad (CDR1 a CDR3, respectivamente), en el que CDR1 es la secuencia de aminoacidos NYVLG (SEQ ID NO: 2595), CDR2 es la secuencia de aminoacidos AINWRGDI TIGPPNVEG (SEQ ID NO: 2611) y CDR3 es la secuencia de aminoacidos GTPLN P GAYIY DWSYD Y (SEQ ID NO: 2627).
    40
    Constructo trivalente segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, que consiste esencialmente en tres dominios variables individuales de inmunoglobulina que consisten esencialmente en un anticuerpo de dominios, en un anticuerpo de un solo dominio, en un V hh,un V hh humanizado o un V h camelizado.
    45 Constructo trivalente segun cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, que consiste esencialmente en tres dominios variables individuales de inmunoglobulina que consisten esencialmente en un V hh, un V hh humanizado o un V h camelizado que tiene una identidad de aminoacidos de al menos el 80 % con al menos una de las secuencias de aminoacidos de las SE Q ID NO: 1 a 22, 158 a 236, 248 a 407, 2448 y 2574 a 2581, en el que con los propositos de determinar el grado de identidad de aminoacidos, no se tienen en 50 cuenta los residuos de aminoacido que forman las secuencias de CDR;
    y en el que:
    preferiblemente uno o mas de los residuos de aminoacido en las posiciones 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 55 104 y 108 segun la numeracion de Kabat se eligen de
    en la posicion 11: L, M, S, V, W,
    en la posicion 37: F, Y, H, I,L, V,
    60
    en la posicion 44: G, E, A, D, Q, R, S, L,
    en la posicion 45: L, R, C, I,L, P, Q, V,
    65 en la posicion 47: W, L, F, A, G, I,M, R, S, V, Y,
    en la posicion 83: R, K, N, E, G, I,M, Q, T,
    en la posicion 84: P, A, L, R, S, T, D, V,
    5 en la posicion 103: W, P, R, S,
    en el que la posicion 103 puede serW con tanto G L E W en las posiciones 44-47 como KERE o K QR E en las posiciones 43-46,
    10 en la posicion 104: G, D, y
    en la posicion 108: Q, L, R, con la condicion de que cuando las posiciones 44-47 son GLEW, la posicion 108 es siempre Q en secuencias de VH H (no humanizadas) que tambien contienen una W en la posicion 103.
    15
    5. Constructo trivalente segun cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, que comprende uno o mas dominios variables individuales de inmunoglobulina seleccionados de las S E Q ID NO: 2579, 354 y 371.
    6. Constructo trivalente segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende uno o mas dominios 20 variables individuales de inmunoglobulina que consisten esencialmente en un V hh humanizado.
    7. Polipeptido, compuesto o constructo que consiste esencialmente en tres dominios variables individuales de inmunoglobulina segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, y que comprende ademas uno o mas de otros grupos, residuos, restos o unidades de union, opcionalmente unidos mediante uno o mas ligadores.
    25
    8. Polipeptido, compuesto o constructo segun la reivindicacion 7, en el que dicho uno o mas de otros grupos, residuos, restos o unidades de union se eligen del grupo que consiste en anticuerpos de dominios, anticuerpos de un solo dominio, V hh,V hh humanizados o V h camelizados.
    30 9. Polipeptido, compuesto o constructo segun la reivindicacion 1, que comprende o que se elige del grupo que consiste en las S EQ ID NO: 2408, 2412, 2415, 2989 a 2991, 2996 a 2998, 3042, 3046, 3049 a 3052.
    10. Acido nucleico o secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido, compuesto o constructo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
    35
    11. Huesped o celula huesped que expresa un polipeptido, compuesto o constructo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que es tal que puede obtenerse mediante la expresion de un acido nucleico o una secuencia de nucleotidos que codifica el mismo, y/o que comprende un acido nucleico o una secuencia de nucleotidos segun la reivindicacion 10.
    40
    12. Composicion que comprende al menos un polipeptido, compuesto o constructo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o acido nucleico o secuencia de nucleotidos segun la reivindicacion 10.
    13. Composicion segun la reivindicacion 12, que es una composicion farmaceutica, que comprende ademas al 45 menos un portador, diluyente o excipiente y/o adyuvante farmaceuticamente aceptable, y que opcionalmente comprende uno o mas polipeptidos y/o compuestos farmaceuticamente activos adicionales.
    14. Metodo para producir un polipeptido, compuesto o constructo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o una composicion segun la reivindicacion 12 o 13, comprendiendo dicho metodo al menos las etapas 50 de:
    a. expresar, en una celula huesped o un organismo huesped adecuados o en otro sistema de expresion adecuado, un acido nucleico o una secuencia de nucleotidos segun la reivindicacion 10, o
    55 a. cultivar y/o mantener un huesped o una celula huesped segun la reivindicacion 11 en condiciones que son tales que dicho huesped o celula huesped expresa y/o produce al menos un polipeptido, compuesto o constructo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o una composicion segun la reivindicacion 12 o 13,
    60 opcionalmente seguido por:
    b. aislary/o purificarel polipeptido, compuesto o constructo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o la composicion segun la reivindicacion 12 o 13, asf obtenidos.
    65 15. Metodo para preparar y/o generar un constructo trivalente segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, comprendiendo dicho metodo al menos las etapas de ligar secuencias de aminoacidos monovalentes comprendidas en el polipeptido, el compuesto o constructo segun cualquiera de las reivindicaciones reivindicacion 1 a 9 y, por ejemplo uno o mas ligadores.
    16. Metodo segun la reivindicacion 15, que comprende las etapas de:
    5
    a. ligar dos o mas secuencias de acido nucleico, que codifican una secuencia de aminoacidos comprendida en el polipeptido, el compuesto o constructo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9;
    b. expresar, en una celula huesped o un organismo huesped adecuados o en otro sistema de expresion 10 adecuado, el constructo genetico obtenido en a) opcionalmente seguido por:
    c. aislary/o purificar el constructo trivalente segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 asf obtenido.
    17. Polipeptido, compuesto o constructo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y/o composicion segun 15 la reivindicacion 12 o 13, para su uso en la prevencion y/o el tratamiento de al menos una enfermedad o un trastorno.
    18. Polipeptido, compuesto o constructo segun la reivindicacion 17 para su uso en la prevencion y/o el tratamiento de infeccion por VRS.
    20
    19. Composicion farmaceutica que comprende un polipeptido, un compuesto o constructo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, y un portador adecuado para administracion pulmonar.
    20. Dispositivo farmaceutico que es un inhalador para lfquidos, un aerosol o un inhalador de polvo seco que 25 comprende el polipeptido, el compuesto o constructo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
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WO (1) WO2009147248A2 (es)
ZA (1) ZA201009135B (es)

Families Citing this family (103)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9023352B2 (en) 2007-02-20 2015-05-05 Tufts University Methods, compositions and kits for treating a subject using a recombinant heteromultimeric neutralizing binding protein
ES2713864T3 (es) * 2008-06-05 2019-05-24 Ablynx Nv Secuencias de aminoácidos dirigidas contra proteínas de la envuelta de un virus y polipéptidos que comprenden las mismas para el tratamiento de enfermedades virales
WO2010066836A2 (en) * 2008-12-10 2010-06-17 Ablynx Nv Amino acid sequences directed against the angiopoietin/tie system and polypeptides comprising the same for the treatment of diseases and disorders related to angiogenesis
AU2015200057B9 (en) * 2009-06-05 2017-03-09 Ablynx Nv Monovalent, bivalent and trivalent anti human respiratory syncytial virus (hRSV) Nanobody constructs for the prevention and/or treatment of respiratory tract infections
EP2438087B1 (en) 2009-06-05 2017-05-10 Ablynx N.V. Trivalent anti human respiratory syncytial virus (hrsv) nanobody constructs for the prevention and/or treatment of respiratory tract infections
WO2011064382A1 (en) 2009-11-30 2011-06-03 Ablynx N.V. Improved amino acid sequences directed against human respiratory syncytial virus (hrsv) and polypeptides comprising the same for the prevention and/or treatment of respiratory tract infections
EP2533761B1 (en) 2010-02-11 2019-03-27 Ablynx N.V. Methods and compositions for the preparation of aerosols
GB201014715D0 (en) 2010-09-06 2010-10-20 Vib Vzw Nanobodies stabilizing functional conformational states of GPCRS
WO2012042026A1 (en) 2010-09-30 2012-04-05 Ablynx Nv Biological materials related to c-met
US11644471B2 (en) 2010-09-30 2023-05-09 Ablynx N.V. Techniques for predicting, detecting and reducing aspecific protein interference in assays involving immunoglobulin single variable domains
US20120195900A1 (en) * 2010-12-22 2012-08-02 Abbott Laboratories Tri-variable domain binding proteins and uses thereof
US9527925B2 (en) 2011-04-01 2016-12-27 Boehringer Ingelheim International Gmbh Bispecific binding molecules binding to VEGF and ANG2
EP3466972B1 (en) 2011-06-23 2026-03-04 Ablynx NV Serum albumin binding proteins
AU2012273928A1 (en) 2011-06-23 2014-02-06 Ablynx Nv Immunoglobulin single variable domains directed against IgE
PH12022550313A1 (en) 2011-06-23 2023-01-23 Ablynx Nv Techniques for predicting, detecting and reducing aspecific protein interference in assays involving immunoglobulin single variable domains
AU2012289926A1 (en) * 2011-08-03 2014-03-13 Children's Medical Center Corporation A broadly neutralizing human antibody that recognizes the receptor-binding pocket of influenza hemagglutinin
US9346884B2 (en) 2011-09-30 2016-05-24 Ablynx N.V. Biological materials related to c-Met
PH12021553014A1 (en) 2012-02-27 2022-09-05 Ablynx Nv Cx3cr1-binding polypeptides
HUE044263T2 (hu) * 2012-03-30 2019-10-28 Boehringer Ingelheim Int ANG2-kötõ molekulák
US9969794B2 (en) 2012-05-10 2018-05-15 Visterra, Inc. HA binding agents
US11339208B1 (en) 2012-05-31 2022-05-24 United States Of America As Represented By The Secretary Of The Air Force Camelidae single-domain antibodies against Yersinia pestis and methods of use
WO2014087010A1 (en) 2012-12-07 2014-06-12 Ablynx N.V. IMPROVED POLYPEPTIDES DIRECTED AGAINST IgE
US9624272B2 (en) 2013-03-14 2017-04-18 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Polypeptides for treating and/or limiting influenza infection
SI2970449T1 (sl) * 2013-03-15 2019-11-29 Amgen Res Munich Gmbh Enoverižne vezavne molekule, ki vsebujejo N-terminalni ABP
WO2014165771A2 (en) * 2013-04-05 2014-10-09 Genentech, Inc. Anti-il-4 antibodies and bispecific antibodies and uses thereof
WO2015026884A1 (en) * 2013-08-21 2015-02-26 Boehringer Ingelheim International Gmbh Cx3cr1-targeting imaging agents and their use in the diagnosis and treatment of disease
JP2016538852A (ja) * 2013-11-25 2016-12-15 オックスフォード バイオセラピューティックス リミテッドＯｘｆｏｒｄ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｌｔｄ がん治療のための抗体抗マトリプターゼ
WO2016055656A1 (en) * 2014-10-10 2016-04-14 Ablynx N.V. Methods of treating rsv infections
US11001625B2 (en) 2014-12-10 2021-05-11 Tufts University VHH based binding antibodies for anthrax and botulinum toxins and methods of making and using therefor
AU2016209247B2 (en) 2015-01-21 2021-02-25 Inhibrx Biosciences, Inc. Non-immunogenic single domain antibodies
PH12017501216B1 (en) * 2015-02-05 2023-05-24 Janssen Vaccines And Prevention B V Binding molecules directed against influenza hemagglutinin and uses thereof
WO2016150845A1 (en) * 2015-03-20 2016-09-29 Ablynx Nv Glycosylated immunoglobulin single variable domains
CN107454905B (zh) 2015-03-31 2023-04-28 索里索制药公司 多肽
CN107427577A (zh) 2015-03-31 2017-12-01 韦斯夸尔德有限公司 具有蛋白酶可切割接头的肽构建体
EP3277706A1 (en) * 2015-03-31 2018-02-07 VHsquared Limited Polypeptide comprising an immunoglobulin chain variable domain which binds to clostridium difficile toxin b
WO2016156468A1 (en) 2015-03-31 2016-10-06 Vhsquared Limited Polypeptides
ES2889906T3 (es) 2015-05-21 2022-01-14 Harpoon Therapeutics Inc Proteínas de unión triespecíficas y usos médicos
HK1254779A1 (zh) 2015-06-18 2019-07-26 Vib Vzw 抗rsv融合前f蛋白的免疫球蛋白单可变结构域抗体
EP3124042A1 (en) 2015-07-28 2017-02-01 VIB, vzw Immunoglobulin single variable domain antibody against rsv prefusion f protein
EP3322734B1 (en) 2015-07-16 2020-09-09 Inhibrx, Inc. Multivalent and multispecific dr5-binding fusion proteins
JP2017036258A (ja) * 2015-08-07 2017-02-16 パナソニックＩｐマネジメント株式会社 インフルエンザウィルスに結合する抗体
AU2016316723B2 (en) * 2015-09-02 2021-03-25 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilized viral class I fusion proteins
WO2017083627A1 (en) 2015-11-13 2017-05-18 Visterra, Inc. Compositions and methods for treating and preventing influenza
EP3419663A1 (en) 2016-02-24 2019-01-02 Visterra, Inc. Formulations of antibody molecules to influenza virus
PT3461261T (pt) 2016-05-20 2025-07-31 Harpoon Therapeutics Inc Proteínas de ligação ao cd3 de fragmento variável de cadeia única
CA3024723A1 (en) 2016-05-20 2017-11-23 Robert B. Dubridge Single domain serum albumin binding protein
US11623958B2 (en) 2016-05-20 2023-04-11 Harpoon Therapeutics, Inc. Single chain variable fragment CD3 binding proteins
EP3544997A4 (en) 2016-11-23 2020-07-01 Harpoon Therapeutics, Inc. PROSTATE SPECIFIC MEMBRANE ANTIGEN BINDING PROTEIN
KR20190087539A (ko) 2016-11-23 2019-07-24 하푼 테라퓨틱스, 인크. Psma 표적화 삼중특이성 단백질 및 사용 방법
US11535668B2 (en) 2017-02-28 2022-12-27 Harpoon Therapeutics, Inc. Inducible monovalent antigen binding protein
BR112019023855B1 (pt) 2017-05-12 2021-11-30 Harpoon Therapeutics, Inc Proteínas de ligação à mesotelina
CN115028727A (zh) * 2017-05-12 2022-09-09 哈普恩治疗公司 靶向msln的三特异性蛋白质及使用方法
SG11202002873XA (en) * 2017-10-11 2020-04-29 Nanjing Legend Biotech Co Ltd Compositions and methods for increasing protein half-life in a serum
JP7084990B2 (ja) 2017-10-13 2022-06-15 ハープーン セラピューティクス，インク． 三重特異性タンパク質と使用方法
IL315737A (en) 2017-10-13 2024-11-01 Harpoon Therapeutics Inc B-cell maturation antigen-binding proteins
TWI848944B (zh) * 2018-04-23 2024-07-21 美國衛生與公眾服務部 嵌合載體
WO2019222283A1 (en) 2018-05-14 2019-11-21 Harpoon Therapeutics, Inc. Binding moiety for conditional activation of immunoglobulin molecules
CN108794626B (zh) * 2018-06-18 2021-10-12 上海大学 一种多肽以及能靶向HIV包膜蛋白gp120的金纳米抗体
CN108640978A (zh) * 2018-06-20 2018-10-12 上海大学 特异性结合HIV病毒上蛋白gp120的多肽及其应用
US11773155B2 (en) 2018-08-09 2023-10-03 Beijing Wisdomab Biotechnology Co., Ltd Bispecific antibody against rabies virus, and application thereof
JP7190675B2 (ja) 2018-08-23 2022-12-16 パナソニックＩｐマネジメント株式会社 ノロウイルスに結合する抗体、複合体、それを用いた検出装置及び検出方法
JP7190674B2 (ja) 2018-08-23 2022-12-16 パナソニックＩｐマネジメント株式会社 ノロウイルスに結合する抗体、複合体、それを用いた検出装置及び検出方法
CN109097341B (zh) * 2018-08-28 2021-09-24 青岛农业大学 一种同时表达ha和hef的复制缺陷型重组流感病毒
US12195544B2 (en) 2018-09-21 2025-01-14 Harpoon Therapeutics, Inc. EGFR binding proteins and methods of use
CN113286817B (zh) 2018-09-25 2025-01-28 哈普恩治疗公司 Dll3结合蛋白及使用方法
JP7546485B2 (ja) 2018-10-25 2024-09-06 Ｋｍバイオロジクス株式会社 改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質及びこれを含むＣＭＶワクチン
WO2020144164A1 (en) 2019-01-07 2020-07-16 Bactolife Aps Pathogen binding proteins
CN113924147A (zh) 2019-03-25 2022-01-11 威特拉公司 用于治疗和预防流感的组合物和方法
US12516128B2 (en) 2019-05-14 2026-01-06 Harpoon Therapeutics, Inc. EpCAM binding proteins and methods of use
AU2020296979A1 (en) 2019-06-21 2022-02-24 Sorriso Pharmaceuticals, Inc. Polypeptides
MX2021015761A (es) 2019-06-21 2022-04-18 Sorriso Pharmaceuticals Inc Polipeptidos.
MX2021015762A (es) 2019-06-21 2022-04-18 Sorriso Pharmaceuticals Inc Composiciones.
CA3166967A1 (en) * 2020-02-06 2021-08-12 Bert Schepens Corona virus binders
IL295448A (en) 2020-02-21 2022-10-01 Harpoon Therapeutics Inc flt3 binding proteins and methods of use
CN111393512B (zh) * 2020-03-24 2021-03-02 北京中科微盾生物科技有限责任公司 一种抑制流感病毒的多肽及其在制备预防和治疗流感病毒感染药物中的应用
JP7512413B2 (ja) * 2020-03-31 2024-07-08 ビオテウス・インコーポレイテッド 抗ｐｄ－ｌ１およびｐｄ－ｌ２抗体ならびにその誘導体および用途
WO2021216537A1 (en) * 2020-04-20 2021-10-28 Ab Studio Inc. Anti-coronavirus antibodies and uses thereof
US20210330700A1 (en) * 2020-04-23 2021-10-28 Johnson & Johnson Consumer Inc. Methods and compositions for inhibiting influenza viruses using low molecular weight hydrophobically modified polymers and polyalkylene glycols
MX2022014224A (es) * 2020-05-12 2023-02-23 Univ California Construcciones de anticuerpos de dominio individual neutralizantes contra sars-cov2.
WO2022006219A2 (en) 2020-07-02 2022-01-06 Trustees Of Tufts College Vhh polypeptides that bind to clostridium difficile toxin b and methods of use thereof
EP4200329A4 (en) * 2020-08-19 2025-01-22 University of Pittsburgh - of the Commonwealth System of Higher Education CORONAVIRUS NANOBODIES AND METHODS OF USE AND IDENTIFICATION THEREOF
EP4221747A4 (en) * 2020-09-29 2024-11-27 Academia Sinica Clec2 fusion protein and uses thereof
WO2022104267A1 (en) * 2020-11-16 2022-05-19 Ab Therapeutics, Inc. Multispecific antibodies and uses thereof
CN112851811B (zh) * 2021-01-28 2022-08-09 姜国胜 一种cd44v6纳米抗体及其作为白血病研究试剂的应用
JP2022165899A (ja) * 2021-04-20 2022-11-01 株式会社デンソー 融合体
CN113234151B (zh) * 2021-06-08 2022-02-15 皖南医学院第一附属医院（皖南医学院弋矶山医院） 一种基于靶向SARS-CoV2病毒S蛋白的三聚体纳米抗体的CAR-NK的研制
US11970548B2 (en) * 2021-08-27 2024-04-30 Innovative Cellular Therapeutics Holdings, Ltd. Nanobody target GCC and uses in chimeric antigen receptor cell therapy
WO2023039528A1 (en) * 2021-09-10 2023-03-16 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Nanobody-mediated control of gene expression and epigenetic memory
WO2023177821A2 (en) * 2022-03-16 2023-09-21 Myeloid Therapeutics, Inc. Binding domains and methods of use thereof
EP4594348A1 (en) * 2022-09-27 2025-08-06 Vib Vzw Antivirals against human parainfluenza virus
AR131494A1 (es) 2022-12-23 2025-03-26 Ablynx Nv Vehículos de conjugación a base de proteína
EP4665755A1 (en) 2023-02-17 2025-12-24 Ablynx N.V. Polypeptides binding to the neonatal fc receptor
CN116375852B (zh) * 2023-03-10 2024-02-02 华南农业大学 重组荧光纳米抗体及其在制备狂犬病病毒检测试剂中的应用
CN116751284B (zh) * 2023-06-13 2024-06-04 康元医疗科技(大连)有限公司 一种纳米抗体、包含该纳米抗体的多肽及其应用
WO2024259305A1 (en) 2023-06-14 2024-12-19 The Broad Institute, Inc. Vhh polypeptides that bind to mesothelin, compositions and methods of use thereof
CN116987194B (zh) * 2023-09-26 2023-12-26 江西乐成欣生生物技术研究有限责任公司 人st2抗原的模拟表位肽的抗独特型纳米抗体及应用
CN117683137B (zh) * 2023-12-04 2024-09-17 江苏省农业科学院 靶向新城疫病毒和h9亚型禽流感病毒的重组双特异性纳米抗体及其制备方法和应用
WO2025133253A2 (en) 2023-12-22 2025-06-26 Ablynx Nv Protein-based conjugation carriers for intranuclear delivery
CN117843801B (zh) * 2023-12-29 2024-08-02 北京贝来药业有限公司 以白介素家族成员为靶点的新型抗体以及下游产品
CN117986360B (zh) * 2024-02-01 2024-08-27 生物岛实验室 Il18蛋白的特异性抗体及其制备方法与应用
WO2025262150A2 (en) 2024-06-18 2025-12-26 Ablynx Nv Antibody-recruiting molecules
CN119978135B (zh) * 2025-01-02 2025-11-21 生物岛实验室 Sumo标签蛋白的特异性抗体及其制备方法与应用
CN120623329A (zh) * 2025-01-15 2025-09-12 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 抗埃博拉病毒vp40蛋白的纳米抗体3e07及在病毒检测中的应用

Family Cites Families (64)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1120945A (en) 1964-08-11 1968-07-24 Fisons Pharmaceuticals Ltd Applicator in combination with a pressurised aerosol dispensing container
FI903489A0 (fi) 1988-11-11 1990-07-10 Medical Res Council Ligander med en enda sektion, receptorer innehaollande naemnda ligander, foerfaranden foer deras framstaellning samt anvaendning av liganderna och receptorerna.
SE509359C2 (sv) 1989-08-01 1999-01-18 Cemu Bioteknik Ab Användning av stabiliserade protein- eller peptidkonjugat för framställning av ett läkemedel
WO1992002551A1 (en) 1990-08-02 1992-02-20 B.R. Centre Limited Methods for the production of proteins with a desired function
US5824307A (en) * 1991-12-23 1998-10-20 Medimmune, Inc. Human-murine chimeric antibodies against respiratory syncytial virus
DE69318016D1 (de) 1992-05-08 1998-05-20 Creative Biomolecules Inc Mehrwertige Chimäre Proteine Anologe und Verfahren zu deren Anwendungen
US5811524A (en) 1995-06-07 1998-09-22 Idec Pharmaceuticals Corporation Neutralizing high affinity human monoclonal antibodies specific to RSV F-protein and methods for their manufacture and therapeutic use thereof
US6020182A (en) 1996-07-12 2000-02-01 Connaught Laboratories Limited Subunit respiratory syncytial virus vaccine preparation
CA2270288A1 (en) 1996-11-01 1998-05-14 Smithkline Beecham Corporation Human monoclonal antibodies
US7122636B1 (en) * 1997-02-21 2006-10-17 Genentech, Inc. Antibody fragment-polymer conjugates and uses of same
BR9907241A (pt) 1998-01-26 2000-10-17 Unilever Nv Biblioteca de expressão, processo para preparar a mesma, uso de uma fonte não imunizada de sequências de ácido nucleico, e, processos para preparar fragmentos de anticorpos e, para preparar um anticorpo
WO2000043507A1 (en) 1999-01-19 2000-07-27 Unilever Plc Method for producing antibody fragments
ID30380A (id) * 1999-04-22 2001-11-29 Unilever Nv Penghambatan infeksi virus menggunakan protein pengikat antigen bervalensi tunggal
US6133571A (en) * 1999-04-26 2000-10-17 Lockheed Martin Corporation Resonant cavity field enhancing boundary
US7550143B2 (en) * 2005-04-06 2009-06-23 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Methods for generating stably linked complexes composed of homodimers, homotetramers or dimers of dimers and uses
AR030019A1 (es) 1999-05-18 2003-08-13 Smithkline Beecham Corp Anticuerpos monoclonales humanos y fragmentos funcionales del mismo, un procedimiento para su produccion, composiciones farmaceuticas que los comprenden, una molecula aislada de acido nucleico, un plasmido recombinante, una celula hospedante y el uso de dichos anticuerpos para la manufactura de un m
ES2270893T3 (es) 1999-12-24 2007-04-16 Genentech, Inc. Procedimiento y composiciones para prolongar la vida media de compuestos bioactivos.
CA2380443C (en) 2000-05-26 2013-03-12 Ginette Dubuc Single-domain antigen-binding antibody fragments derived from llama antibodies
US7943129B2 (en) 2000-05-26 2011-05-17 National Research Council Of Canada Single-domain brain-targeting antibody fragments derived from llama antibodies
US6818216B2 (en) * 2000-11-28 2004-11-16 Medimmune, Inc. Anti-RSV antibodies
CA2440582A1 (en) 2001-03-09 2002-10-03 Dyax Corp. Serum albumin binding moieties
GB0110029D0 (en) 2001-04-24 2001-06-13 Grosveld Frank Transgenic animal
US20060073141A1 (en) 2001-06-28 2006-04-06 Domantis Limited Compositions and methods for treating inflammatory disorders
EP1433793A4 (en) 2001-09-13 2006-01-25 Inst Antibodies Co Ltd METHOD FOR CREATING A CAMEL ANTIBODY LIBRARY
JP2005289809A (ja) 2001-10-24 2005-10-20 Vlaams Interuniversitair Inst Voor Biotechnologie Vzw (Vib Vzw) 突然変異重鎖抗体
AU2002351896A1 (en) 2001-12-11 2003-06-23 Ablynx N.V. Method for displaying loops from immunoglobulin domains in different contexts
RU2319505C2 (ru) * 2001-12-18 2008-03-20 Иннодженетикс Н.В. Очищенные оболочечные белки вируса гепатита с для диагностического и терапевтического применения
AU2002360068B2 (en) 2001-12-21 2009-09-03 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Method for cloning of variable domain sequences
CN1305905C (zh) 2002-03-22 2007-03-21 Aprogen株式会社 人源化抗体及其制备方法
US7132100B2 (en) 2002-06-14 2006-11-07 Medimmune, Inc. Stabilized liquid anti-RSV antibody formulations
EP1517921B1 (en) 2002-06-28 2006-06-07 Domantis Limited Dual specific ligands with increased serum half-life
WO2010081856A1 (en) 2009-01-14 2010-07-22 Ablynx Nv Pulmonary administration of immunoglobulin single variable domains and constructs thereof
JP4603894B2 (ja) 2002-12-03 2010-12-22 ユセベ ファルマ ソシエテ アノニム 抗体産生細胞を同定するためのアッセイ
GB0228210D0 (en) 2002-12-03 2003-01-08 Babraham Inst Single chain antibodies
GB0312481D0 (en) 2003-05-30 2003-07-09 Celltech R&D Ltd Antibodies
EP2395016A3 (en) * 2003-05-30 2012-12-19 Merus B.V. Design and use of paired variable regions of specific binding molecules
US7070786B2 (en) 2003-06-06 2006-07-04 Centocor, Inc. RSV proteins, antibodies, compositions, methods and uses
JP2007521234A (ja) 2003-08-12 2007-08-02 ウィリアム エム ヤーブロー 尋常性ざ瘡の治療薬及び使用方法
ATE554390T1 (de) 2003-08-20 2012-05-15 Ucb Pharma Sa Verfahren zur gewinnung von antikörpern
JP5912211B2 (ja) * 2004-01-20 2016-04-27 メルス ビー．ヴィー． 結合タンパク質の混合物
WO2005079479A2 (en) * 2004-02-17 2005-09-01 Absalus, Inc. Super-humanized antibodies against respiratory syncytial virus
KR101699142B1 (ko) 2004-06-18 2017-01-23 암브룩스, 인코포레이티드 신규 항원-결합 폴리펩티드 및 이의 용도
US20050279676A1 (en) 2004-06-21 2005-12-22 Izzy Zuhair A Fluid filter assembly for a dispensing faucet
EP4353819A3 (en) 2004-07-22 2024-07-17 Erasmus University Medical Center Rotterdam Binding molecules
US7563443B2 (en) 2004-09-17 2009-07-21 Domantis Limited Monovalent anti-CD40L antibody polypeptides and compositions thereof
US7700720B2 (en) * 2004-09-21 2010-04-20 Medimmune, Llc Antibodies against and methods for producing vaccines for respiratory syncytial virus
AU2005293752A1 (en) 2004-10-13 2006-04-20 Ablynx N.V. Single domain camelide anti-amyloid beta antibodies and polypeptides comprising the same for the treatment and diagnosis of degenarative neural diseases such as Alzheimer's disease
WO2006040154A2 (en) 2004-10-14 2006-04-20 Dublin City University Prokaryotic two hybrid system
TW200636064A (en) 2004-10-28 2006-10-16 Centocor Inc Anti-respiratory syncytial virus antibodies, antigens and uses thereof
AU2005302453A1 (en) 2004-10-29 2006-05-11 Medimmune, Llc Methods of preventing and treating RSV infections and related conditions
AU2005325801A1 (en) 2005-01-31 2006-08-03 Ablynx N.V. Method for generating variable domain sequences of heavy chain antibodies
EP1874824A4 (en) 2005-04-06 2009-12-30 Ibc Pharmaceuticals Inc METHODS OF GENERATING STABLE COMPOUND RELATED COMPLEXES OF HOMODIMERS, HOMOTRATEERS OR DIMER SIZES AND USES THEREOF
WO2006110214A2 (en) * 2005-04-08 2006-10-19 Medimmune, Inc. Antibodies against mammalian metapneumovirus
EP2010568A1 (en) 2006-04-14 2009-01-07 Ablynx N.V. Dp-78-like nanobodies
WO2008000279A1 (en) 2006-06-26 2008-01-03 Aida Centre, S.L. Blister package integrating rfid based tags
AU2007285695B2 (en) 2006-08-18 2012-05-24 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against IL-6R and polypeptides comprising the same for the treatment of diseases and disorders associated with IL-6-mediated signalling
WO2008049897A1 (en) 2006-10-27 2008-05-02 Ablynx N.V. Intranasal delivery of polypeptides and proteins
US20080267949A1 (en) 2006-12-05 2008-10-30 Ablynx N.V. Peptides capable of binding to serum proteins
EP2097451A2 (en) * 2006-12-22 2009-09-09 Ablynx N.V. Anti-chemokine (ccl2, ccl3, ccl5, cxcl11, cxcl12) single-domain antibodies
EP2096121A1 (en) * 2008-02-29 2009-09-02 Institut Pasteur Of Shanghai Antiviral peptides comprising lipid attachment signals and methods of use
ES2713864T3 (es) * 2008-06-05 2019-05-24 Ablynx Nv Secuencias de aminoácidos dirigidas contra proteínas de la envuelta de un virus y polipéptidos que comprenden las mismas para el tratamiento de enfermedades virales
AU2010243551B2 (en) 2009-04-30 2015-03-26 Ablynx Nv Method for the production of domain antibodies
EP2438087B1 (en) 2009-06-05 2017-05-10 Ablynx N.V. Trivalent anti human respiratory syncytial virus (hrsv) nanobody constructs for the prevention and/or treatment of respiratory tract infections
WO2011064382A1 (en) 2009-11-30 2011-06-03 Ablynx N.V. Improved amino acid sequences directed against human respiratory syncytial virus (hrsv) and polypeptides comprising the same for the prevention and/or treatment of respiratory tract infections

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